KR20140101886A - 세포 또는 미생물의 배양 방법 - Google Patents

세포 또는 미생물의 배양 방법 Download PDF

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KR20140101886A
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타이세이 오쿠무라
마모루 누마타
슈조 코지마
야스히사 나가타
나오키 타하라
히로유키 쿠로키
마사토 쿠키자키
토모히로 타나카
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닛끼 가부시끼가이샤
미야자끼껭
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Abstract

본 방법은 영양분 함유 배양액에 산소 또는 이산화탄소를 용해시키고, 당해 배양액 중에서 세포 또는 미생물을 배양하는 단계를 포함하며, 여기서 상기 산소 또는 이산화탄소는 상기 배양액의 교반을 온화하게 억제하면서 상기 배양액 중에 신속하게 용해된다.
상기 다공질체(11)에 산소 또는 이산화탄소를 포함하는 가스를 공급하여 용적기준의 입자 크기 분포에 있어 50% 지름이 200 ㎛ 이하의 기포(12)를 배양액(13) 중에 발생시킴과 동시에, 상기 배양액(13) 중에는, 단백질 가수분해물과 세포를 보호하기 위한 세포보호제 중 적어도 하나가 첨가제로서 포함되도록 한다.

Description

세포 또는 미생물의 배양 방법 {METHOD FOR CULTURING CELLS OR MICROORGANISMS}
본 발명은, 영양분을 포함하는 배양액 중에 산소 또는 이산화탄소를 용해시키는 단계 및 상기 배양액 중에서 세포 또는 미생물을 배양하는 단계를 포함하는 세포 또는 미생물의 배양 방법에 관한 것이다.
예를 들어, 동물이나 식물 등의 세포 또는 미생물을 배양하는 방법으로, 영양분을 포함하는 배양액 중에 예를 들어 공기 등의 산소 또는 이산화탄소를 포함하는 기체를 공급함으로써, 세포 또는 미생물을 배양하는 방법이 공지되어 있다. 이러한 영양분은, 예를 들어 미리 배양액 중에 소정량 혼입되거나, 또는 배양을 수행하는 동안에 걸쳐 배양액 중에 적당하게 공급되기도 하지만, 공기는 배양하고 있는 동안 배양액 중에 계속하여 공급될 필요가 있다. 배양액 중에 공기를 공급하는 방법으로는, 예를 들어 선단측에 다수의 가스 배출구가 형성된 관 형태의 스파저(sparger) (예를 들어, U자 스파저 등)를 배양액 중에 침지해 두고, 배양액 중에 입경이 예를 들어 수 mm 정도인 기포를 버블링하는 방법이 알려져 있다.
상기 방법에 있어서는, 배양액 중에의 공기의 용해량을 증가시키기 위해서는, 예를 들어 터빈형의 교반날개에 의해 배양액을 교반하여 스파저로부터 버블링되는 공기의 기포를 작게함(파쇄함)으로써, 기체와 액체(공기 및 배양액) 사이의 접촉면적을 크게 하여, 배양액 중에 공기가 용해되기 쉽게 할 필요가 있다. 따라서, 산소 용해 속도(양)를 증가시키려고 할수록, 배양액을 더욱 격렬하게 교반하게 되므로, 교반을 위하여 큰 에너지가 필요하게 된다. 또한, 배양을 실시하는 장치(교반장치)도 대형화되거나 고비용화된다. 또한, 교반에 의해 배양액의 온도가 상승하는 경우에는, 배양액의 온도를 저하시키기 위한 냉각 에너지가 필요하게 된다. 더욱이, 세포를 배양하는 경우에는, 교반날개의 교반에 의해 세포가 물리적으로 데미지를 받을 염려가 있다. 더욱이 교반에 의해 기포가 파쇄(파열)될 때의 충격에 의해, 세포가 데미지를 받게 되는 경우도 있다.
특허문헌 1에는 다공질체를 통하여 액체 중에 미소한 기포를 생성시켜, 상기 기포를 수경재배, 어패류의 양식, 식품, 마이크로캅셀, 의약제제 및 화장품 등에 이용하는 기술, 혹은 상기의 미소한 기포를 이용하여 미생물의 증식을 억제하는 기술 등에 대하여 기재되어 있으나, 세포 및 미생물의 배양에 관해서는 검토되어 있지 않다.
일본 특허 공개 제2005-169359호 (단락 번호 0045)
없음
본 발명은 상기와 같은 상황에서 도출된 것으로, 그 목적은, 영양분을 포함하는 배양액 중에 산소 또는 이산화탄소를 용해시켜 세포 또는 미생물의 배양을 수행함에 있어, 배양액의 교반을 온화하게 억제하면서, 또는 교반을 행하지 않고, 배양액 중에 산소 또는 이산화탄소를 빠르게 용해시킬 수 있는 세포 또는 미생물의 배양 방법을 제공하는 것에 있다.
본 발명의 세포 또는 미생물의 배양 방법은,
영양분을 포함하는 배양액 중에 산소 또는 이산화탄소를 용해시켜 세포 또는 미생물을 배양하는 배양방법에 있어서,
다공질체에 산소 또는 이산화탄소를 포함하는 가스를 공급하여 용적 기준의 입자 크기 분포에 있어 50% 지름이 200 ㎛ 이하인 기포를 배양액 중에 발생시킴에 의하여, 상기 배양액에 산소 또는 이산화 탄소를 용해시켜 세포 또는 미생물의 배양하는 공정을 포함하고,
상기 배양액 중에는, 단백질 가수분해물 및 세포를 보호하기 위한 세포 보호제 중의 적어도 하나가 포함되어 있는 것을 특징으로 한다.
상기 배양액의 표면장력은, 51.5 dyne/cm 이하인 것이 바람직하다.
상기 다공질체의 세공지름은, 50 ㎛ 이하인 것이 바람직하다.
본 발명은, 영양분을 포함하는 배양액 중에 산소 또는 이산화탄소를 포함하는 가스를 공급함으로써 세포 또는 효모, 곰팡이, 세균 및 미세조류인 미생물의 배양을 수행함에 있어, 다공질체에 산소 또는 이산화탄소를 포함하는 가스를 공급하여 용적 기준의 입자 크기 분포에 있어서 50% 지름이 200 ㎛ 이하인 기포를 배양액 중에 발생시킴과 동시에, 상기 배양액 중에는, 단백질 가수분해물과 세포를 보호하기 위한 세포보호제 중의 적어도 하나가 포함될 수 있도록 한다. 따라서, 단백질 가수분해물 또는 세포보호제의 계면활성작용에 의해 배양액 중에 기포의 합일(응집)을 억제시켜 극히 미세한 입경의 기포를 얻을 수 있다. 따라서, 기체와 액체(기포 및 배양액)의 접촉면적을 증가시킬 수 있다. 또한, 기포의 부력을 극히 작게 억제시킬 수 있으므로, 부력을 받아 상승하는 예를 들어 300 ㎛ 이상의 입경을 갖는 종래 기포와 비교하여, 배양액 중에 있어서 기포를 말하자면 정지상태로 유지할 수 있다. 따라서, 상기 가스와 배양액을 장시간에 걸쳐 접촉시킬 수 있으므로, 배양액 중에 산소 또는 이산화탄소를 빠르게 용해시킬 수 있다. 더욱이, 기포를 파쇄하기까지 격렬한 교반이 필요하지 않게 되므로, 교반을 온화하게 억제할 수 있거나, 또는 교반을 수행하지 않아도 된다. 따라서, 장치 전체의 크기나 배양에 필요한 소비에너지를 작게 할 수 있다. 특히, 세포를 배양하는 경우에는, 교반에 의한 세포에의 물리적인 데미지를 억제할 수 있다.
도 1은 본 발명의 세포 또는 미생물의 배양 방법을 실시하기 위한 배양장치의 일례를 도시하는 모식도이다.
도 2는 상기 배양장치에 있어서 배양액 중에 기포가 발생하는 모습을 도시하는 모식도이다.
도 3은 종래의 방법에 의해 배양액중에 기포를 발생시킨 경우의 모습을 도시하는 모식도이다.
도 4는 본 발명의 실시예에서 얻은 결과를 도시하는 특성도이다.
도 5는 본 발명의 실시예에서 얻은 결과를 도시하는 특성도이다.
도 6은 본 발명의 실시예에서 얻은 결과를 도시하는 특성도이다.
도 7은 본 발명의 실시예에서 얻은 결과를 도시하는 특성도이다.
도 8은 본 발명의 실시예에서 얻은 결과를 도시하는 특성도이다.
도 9는 본 발명의 실시예에서 이용한 배양 장치에 있어서 교반날개 및 거품제거날개의 설치 위치를 도시하는 개략도이다.
도 10은 본 발명의 실시예에서 얻은 결과를 도시하는 특성도이다.
도 11은 본 발명의 실시예에서 얻은 결과를 도시하는 특성도이다.
도 12는 본 발명의 실시예에서 얻은 결과를 도시하는 특성도이다.
도 13은 본 발명의 실시예에서 얻은 결과를 도시하는 특성도이다.
도 14는 본 발명의 실시예에서 얻은 결과를 도시하는 특성도이다.
도 15는 본 발명의 실시예에서 얻은 결과를 도시하는 특성도이다.
본 발명의 세포, 또는 효모, 곰팡이, 세균 및 미세조류와 같은 미생물을 배양하는 방법의 실시 형태의 일례에 관하여, 도 1 및 도 2를 참조하여 설명한다. 먼저, 본 배양방법을 실시하기 위해 이용한 배양장치의 일례에 관하여 간단히 설명하면, 상기 배양장치는, 영양분을 함유하는 배양액(13)을 저장하기 위한 배양조(21)와, 산소를 포함하는 가스, 특히, 본 예에서는 공기를 극히 미소한 기포(마이크로버블)(12)로써 배양조(21)내의 배양액(13)에 공급하기 위한 산소 공급부인 스파저(22)를 구비하고 있다. 상기 배양장치는, 공기나 산소가 저장된 산소 저장부(23)로부터 산소 공급로(24)를 통해 스파저(22)에 공기를 공급하여, 배양조(21)의 윗면에 접속된 배기로(25)를 통해 배양조(21) 내로부터 발생하는 가스(이산화탄소 및 상기의 공기 등)를 배출하도록 구성되어 있다. 도 1에서 도면부호 31, 32, 33, 34는, 각각 니들밸브, 압력계, 유량계 및 볼밸브를 나타낸다. 이들 구성들은 예를 들어 도시하지 않은 제어부에 의해, 배양조(21)에의 공기의 공급 및 단절과, 배양조(21)에 공급하는 공기의 압력 및 유량을 제어할 수 있게 배열되어 있다. 또한, 도 1 중 도면부호 27은, 상기 서술한 스파저(22)로부터 배양액(13) 중에 공급되는 기포(12)를 배양액(13) 중에 분산시키기 위해서, 배양조(21) 내에 투입된 교반날개(26)를 축 둘레로 회전시켜 배양액(13)을 온화하게 교반하기 위한 모터이다.
상기의 스파저(22)는, 예를 들어, 내부영역(11a)이 공동(hollow)이 되도록 실질적으로 원통형으로 형성된 다공질체(다공질막)(11)를 포함하며, 배양액(13) 중에 침지되어 있다. 상기 다공질체(11)는, 상단측에 상술한 산소공급로(24)가 밀폐(hermetically)되어 접속되고, 하단측은 예를 들어 도시하지 않은 실(seal) 부재 등에 의해 봉인되어 있다. 상기 다공질체(11)에는, 도 1의 아래측에 확대하여 나타낸 것과 같이, 세공 지름(PD) d가 예를 들어 50 ㎛ 이하인 다수의 미소한 세공(1)이 전면에 걸쳐 균일하게 형성되어 있어, 다공질체(11)의 내부 영역(11a)과 스파저(22)의 외부 영역(배양액(13))이 세공(1)을 통해 다수 개소에 있어 연통하도록 구성되어 있다. 상기 다공질체(11)는 예를 들어 화산재 시라스 (volcanic ash shirasu)와 석회(CaO 또는 CaCO3)나 붕산(H3BO3) 등의 유리 원료를 혼합하고 고온에서 용해하고, 그 후 700℃ 정도에서 열처리를 수행한 후에 산처리하여 얻은 것이다. 즉, 상기 열처리에 의해, 다공질체(11) 중의 유리 성분이 실리카(SiO2) 및 알루미나(Al2O3)를 주성분으로 함유하는 제1 유리상과, 산화 붕소(B2O3) 및 산화 칼슘(CaO)을 주성분으로 함유하는 제2 유리상으로 극히 균일하게 분리되므로, 열처리의 온도나 시간, 또는 성분의 첨가량 등을 조정함으로써, 산처리 후에는 극히 미세한 세공(1)이 균일하게 형성된 다공질체(11)가 얻어지게 된다. 상기 다공질체(11)는, 예를 들어 SPG(shirasu porous glass)막 등으로 불려지고 있으며, SPG 테크노 주식회사에 의해 제조되고 있다.
배양조(21) 내의 배양액(13)에는, 배양되는 세포(2) 또는 미생물, 본 예에서는 세포(2)와, 상기 세포(2)의 영양이 되는 영양분이 포함되어 있다. 상기 영양분은, 예를 들어 소정의 비율로 혼합된 복수 종류의 아미노산, 비타민, 무기염 및 당 등으로 구성된 기초 배지이다. 또한, 배양액(13)에는, 단백질 가수분해물 및, 세포(2)를 보호하기 위한 세포보호제 중의 적어도 하나가 첨가제로써 포함되어 있다. 이들 첨가제 각각은 계면활성작용을 갖고 있어, 후술하는 실시예에서 설명하는 것과 같이, 당해 계면활성 작용에 의해 상술한 스파저(22)로부터의 배양액(13) 중에 공급되는 미세한 기포(12)의 합일(응집)을 억제한다. 이들 첨가제에 관하여, 각각의 구체적인 성분에 대해서는 이하에 자세히 서술한다.
단백질 가수분해물은, 단백질을 아미노산 및 저분자량의 펩티드로 가수분해하여 수득된 생성물로, 예를 들어 우유로부터 유래하는 단백질인 카제인의 가수분해물, 폴리펩톤, 펩톤, 효모 엑기스, 고기 엑기스 및 카자미노산 등이다. 상기 가수분해의 방법으로는, 예를 들어 산분해, 효소분해, 자기소화 등을 들수 있다. 펩톤은, 동물성 단백질이나 식물성 단백질을 아미노산 및 저분자량의 펩티드로 가수분해하여 수득된 화합물의 총칭이다. 펩톤의 일례인 폴리펩톤은, 일본제약주식회사의 제품으로, 우유 카제인을 동물 유래의 효소로 분해한 후, 정제 및 건조한 분말이다. 또한, 효모 엑기스는, 맥주효모 (Saccharomyces Cerevisiae Meyen)의 수용성 성분을 추출하고, 건조하여 수득된 분말로, 일본제약주식회사의 제품 (제품명: 분말효모엑기스 D-3) 등이 있다. 또한 카자미노산은, 펩티드 이외의 것으로, 단백질을 염산을 이용해 전부 아미노산으로 가수분해한 것이다. 또한, 상술한 영양분을 대신하여, 상기 단백질 가수분해물을 사용해도 무방하다.
세포보호제로는, 플루로닉 F68, 다이고 GF21(증식 촉진인자) 및 혈청 등을 들수 있다. 플루로닉 F68은, BASF 일본주식회사의 제품 (CAS번호: 9003-11-6)으로, 영양성분이나 세포 성장 인자로서의 작용을 갖지 않고, 세포(2)를 보호하는 작용을 갖는 계면활성제의 일종이다. 다이고 GF21은, 일본제약주식회사의 제품으로, 우혈청의 정제에 의해 γ글로블린을 제거한 GFS (혈청 중 성장인자)를 주성분으로 함유하는 세포 증식 촉진인자이다. 상기 혈청은, 예를 들어 우태아혈청(fetal calf serum)이나 자우혈청(calf serum)으로, 영양성분 및 세포 성장 인자의 공급이라는 작용 외에, 세포배양시의 배양액(13)의 교반 및 통기 등에서 받는 물리적인 스트레스로부터 세포(2)를 보호하는 세포보호제로서의 기능이 있다. 이상의 각 첨가제에 있어, 배양액(13) 중에 있어서 계면활성작용에 의한 미세한 기포(12)를 얻기 위해 필요한 첨가량에 대해서는 후술하는 실시예에서 설명한다.
다음으로, 본 발명의 세포(2)의 배양방법에 대하여 설명한다. 먼저, 상기 배양액(13)과 함께, 세포(2), 영양분 및 상술한 단백질 가수분해물과 세포보호제 중의 적어도 하나를 배양조(21)에 투입한다. 즉, 혈청배양의 경우에는, 세포(2)에 더하여, 예를 들어 상술한 기초 배지와, 혈청 또는 다이고 GF21 중 어느 하나가 배양액(13) 중에 투입되게 되고, 무혈청배양의 경우에는, 세포(2)와 함께, 예를 들어 기초 배지와 세포 성장 인자와 플루로닉 F68이 투입되게 된다. 상기 배양액(13)에 첨가되는 단백질 가수분해물 및 세포보호제의 첨가량은, 후술하는 바와 같이, 당해 단백질 가수분해물 및 세포보호제의 계면활성작용에 의해 기포(12)의 합일(응집)이 억제될 정도의 양으로, 구체적으로는 첨가량은 배양액(13)의 표면장력이 51.5 dyne/cm 이하가 되도록 결정된다. 또한 상술한 바와 같이, 영양분으로 상기 단백질 가수분해물을 사용하여도 무방하다.
그리고, 도시하지 않은 히터나 자켓 등을 사용하여 배양조(21) 중의 배양액(13)을 소정의 온도로 제어하면서, 산소공급로(24)로부터 스파저(22)에 산소를 포함하는 가스, 본 예에서는 공기를 공급한다. 또한, 모터(27)에 의해 교반날개(26)를 서서히 회전시켜, 스파저(22)로부터 배양액(13) 중에 공급되는 기포(12)를 배양액(13) 중에 확산시킨다.
스파저(22)로부터 배양액(13) 중에 공급되는 공기는, 도 2에 나타내듯이, 다공질체(11)의 내부 영역(11a)을 통하여, 세공(1)으로부터 배양액(13) 중에 입경이 예를 들어 200 ㎛ 이하의 극히 작은 다수의 기포(마이크로버블)(12)로서 배출되어, 예를 들어 당해 다공질체(11)의 외부표면에 부착된다. 이들 기포(12)는, 예를 들어 배양액(13)의 표면장력에 의해 다공질체(11)의 표면상에 서로 합일(응집)하려하나, 배양액(13) 중에는 상술한 것과 같이 계면활성작용을 갖는 첨가제가 포함되어 있으므로, 상기의 표면장력의 움직임이 작게 억제되므로 합일이 억제되어, 상술한 미세한 크기 그대로 배양액(13) 중으로 방출되게 된다. 또한, 상술한 바와 같이 다공질체(11)가 유리로 구성되어 있어, 배양액(13)과의 젖는 성질이 높으므로, 당해 다공질체(11)의 표면에 있어 기포(12)의 합일이 더욱더 억제되게 된다. 또한 상기 도 2는, 도시를 간략화 하기 위해 다공질체(11)의 한쪽에만 기포(12)를 도시하고 있다.
그리고, 배양액(13) 중에 있어서도 첨가제의 계면활성 작용에 의해, 마찬가지로 기포(12) 사이의 합일이 억제되게 된다. 따라서, 배양액(13)에 있어서의 기포(12)의 입경(기포 지름)은, 예를 들면 후술하는 도 4에 나타내는 바와 같이, 극히 미소하고 균일한 크기가 되어, 용적 기준의 입자 크기 분포에 있어서의 50% 지름(중앙값 지름)이 200 ㎛ 이하의 마이크로버블이 된다. 따라서, 예를 들어 종래의 수 mm 정도 또는 300 ㎛ 이상의 크기의 기포를 배양액(13) 중에 버블링한 경우와 비교하여, 기포(12)의 비표면적이 증가하여 공기(기포(12))와 배양액(13)과의 접촉면적이 크게 된다. 또한, 상기 용적기준의 입자 크기 분포라는 것은, 기포(12)의 개수를 카운트하여 구한 입자 크기 분포가 아니라, 기포(12)의 용적을 기준으로 하여 구한 입자 크기 분포를 나타낸다.
이때, 기포(12)의 입경이 예를 들어 200 ㎛ 이하로 극히 작다는 것으로부터, 당해 기포(12)는 거의 부력을 받지 않고, 말하자면 배양액(13) 중에서 대략 정지된 상태가 된다. 따라서, 배양액(13) 중에 있어 기포(12)는 극히 서서히 상승하며, 따라서 상기의 입경이 큰 경우보다도 배양액(13)과의 접촉시간이 길게 된다. 또한, 상기한 바와 같이 기포(12)의 입경이 극히 작으므로, 300 ㎛ 이상의 입경의 기포와 비교하여, 기포(12)의 내압(내부의 공기가 배양액(13) 중에 녹아나오려고 하는 힘)이 크게 된다. 그 결과, 배양액(13) 중에 있어 발생한 기포(12)는, 배양액(13) 중에 빠르게 용해된다.
여기서, 배양액(13) 중의 세포(2)는 영양분과 함께 배양액(13) 중의 산소를 소비하여, 예를 들어 생성물과 이산화탄소를 생성한다. 그리고, 시간의 경과와 함께, 배양액(13) 중의 세포(2)의 수량(개체수)이 증가하므로, 세포(2)에 의한 산소의 소비량은, 세포(2)의 배양을 계속할수록 많아진다. 따라서, 배양액(13) 중에 녹아 있는 산소(용존산소)는, 시간의 경과와 함께 감소된다. 그러나, 상기한 바와 같이 스파저(22)로부터 기포(12)를 배양액(13) 중에 공급하고 있고, 또한 이 기포(12)가 상술한 바와 같이 배양액(13) 중에 용해됨에 따라, 세포(2)에 의한 산소의 소비분이 보충된다. 즉, 배양액(13) 중에 미소한 기포(12)를 공급함으로써, 입경이 큰 기포를 공급하는 경우와 비교하여, 배양액(13) 중의 용존산소 농도의 감소 속도가 느려지거나 용존산소의 감소가 억제되게 된다. 그리고, 배양액(13)에 있어 생성된 이산화탄소는, 배기로(25)로부터 배기되어 나가게 된다. 이리하여 세포(2)에 의한 영양분 및 산소의 소비와 세포(2)의 증가(배양)가 소정의 시간동안 수행되어 영양분이 없어지면, 세포(2)가 산소를 더이상 소비하지 않게 되므로, 배양액(13) 중의 용존산소농도가 급격하게 증가하게 된다.
상술한 실시의 형태에 의하면, 배양액(13) 중에 있어 세포(2)의 배양을 실시함에 있어, 다공질체(11)에 공기를 공급하여 용적기준의 입자 크기 분포에 있어 50% 지름이 200 ㎛ 이하인 극히 미소한 기포(12)를 발생시킴과 동시에, 단백질 가수분해물과 세포보호제 중의 적어도 하나를 첨가제로써 배양액(13) 중에 포함하도록 하고 있다. 그로 인해, 상기 첨가제의 계면활성작용에 의해, 배양액(13) 중에 있어서의 기포(12)의 합일(응집)을 억제하여, 극히 미세한 입경의 기포(12)를 얻을 수 있으므로, 예를 들어 300 ㎛ 이상의 입경의 기포와 비교하여, 기체와 액체(기포(12) 및 배양액(13))의 접촉면적을 증가시킬 수 있다. 또한, 기포(12)의 부력을 극히 작게 억제할 수 있으므로, 상기 입경이 큰 기포와 비교하여, 배양액(13) 중에 있어 기포(12)를 말하자면 정지상태로 유지할 수 있다. 그로 인해, 기포(12)와 배양액(13)을 장시간에 걸쳐 접촉시킬 수 있으므로, 배양액(13) 중에 산소를 빠르게 용해시킬 수 있다. 또한, 미소한 기포(12)에 있어서는, 입경이 큰 기포와 비교하여, 내부의 공기가 기포(12)의 외측에 녹아나가려고 하는 압력이 높아지므로, 배양액(13)에 산소를 더욱더 빠르게 용해시킬 수 있다.
더욱이, 상기 기포(12)를 얻기 위해서는 큰 기포를 파쇄하기 위한 격렬한 교반이 불필요하여, 교반날개(26)에 의한 교반은 배양액(13) 중에 기포(12)를 분산시키기 위한 온화한 교반으로 족하다. 그로 인해, 모터(27)의 소비에너지나 크기를 감소시킬 수 있으므로, 세포(2)의 배양에 필요한 비용(운전비용 및 장치의 비용)을 낮출 수 있다. 또한, 교반에 의해 발생하는 열을 낮출 수 있으므로, 예를 들어 배양조(21)나 배양액(13)을 냉각하기 위한 설비의 크기를 작게할 수 있다. 더욱이, 온화한 교반으로 족하므로, 교반에 의한 세포(2)에의 물리적인 데미지를 억제할 수 있다. 또한, 기포(12)를 파쇄할 필요가 없으므로, 기포(12)가 파열할 때의 충격에 의한 세포(2)에의 데미지를 억제할 수 있다.
또한, 배양액(13)에 첨가제를 첨가함에 있어, 배양액(13)이 세포(2)를 배양하기 위하여 사용하는 액체이므로, 상기 단백질 가수분해물이나 세포보호제 이외에, 예를 들어 세포(2) 또는 세포(2)의 배양에 대하여 유해한 물질을 배양액(13)에 투입할 수 없으나, 본 발명에서는, 세포(2)의 배양에 유익한 첨가제를 사용할 수 있다. 그로 인해, 세포(2)의 배양에 악영향을 미치지 않고, 배양액(13)에 산소를 빠르게 공급할 수 있다.
여기서, 종래의 예를 들어 300 ㎛ 이상의 입경의 기포의 경우에는, 배양액(13) 중에 있어서 큰 부력을 받아 빠르게 상승하게 되어, 배양액(13)과의 접촉시간을 길게 가질 수 없다. 또한, 배양액(13) 중에 상기 첨가제가 포함되어 있지 않은 경우에는, 상기의 스파저(22)를 사용하여 미소한 기포(12)를 발생시켰다고 하더라도, 도 3에 나타낸 것과 같이, 배양액(13)의 표면장력에 의해 예를 들어 다공질체(11)의 표면에 기포(12)가 곧바로 합일해 버리므로, 큰 기포가 생성되게 된다. 이 경우에는, 배양액(13)에 산소를 빠르게 용해시키기 위해서는, 큰 기포를 파쇄하기 위한 격렬한 교반이 필요하게 되어, 모터(27)의 소비에너지나 크기가 증대함과 동시에, 세포(2)에 데미지를 입힐 위험성이 발생하게 된다. 또한, 도 3에 있어서도, 다공질체(11)의 한 측면에 기포를 도시한다.
상기 예에서는, 교반날개(26)에 의해 교반함에 의해 배양액(13) 중 기포(12)를 분산시켰으나, 예를 들어 기포(12)가 다공질체(11)로부터 떨어진 후 곧 용해하는 경우 등에는, 교반을 수행하지 않아도 좋다.
또한, 상기 예에서는 공기 등의 산소를 포함하는 가스를 공급하여 세포(2)의 배양을 수행하였으나, 이산화탄소를 포함하는 가스를 공급하여 식물세포 또는 미세조류 등의 식물을 배양하는 경우에 본 발명을 적용하여도 좋다. 이런 경우에 있어서도 이산화탄소를 포함하는 가스의 미소한 기포(12)가 스파저(22)를 통하여 배양액(13) 중에 발생하므로, 상술한 예와 같이 배양액(13)에 이산화탄소를 빠르게 용해시킬 수 있다. 이 경우에 있어서는, 기포(12)의 입경을 작게 하기 위해(배양액(13)의 표면장력을 낮추기 위해)서 첨가하는 첨가제로써는, 단백질 가수분해물이나 세포보호제가 사용된다. 이 첨가제의 첨가량은 예를 들어 실험 등에 의해 적당히 설정되게 된다.
실시예
다음으로, 미세한 기포(12)에 대하여 수행한 실험에 대하여 설명한다.
(실시예 1)
먼저, 동물세포를 배양하는 배양액(13)에 세포보호제(다이고 GF21)를 첨가한 경우에 있어, 상술한 스파저(22)(세공지름 d가 1 ㎛ 인 다공질체(11))로부터 생성되는 기포(12)의 입자 크기 분포를 측정하였다. 상기 입경은, 레이저 회절산란식 입자 크기 분포계를 이용하여, 스파저(22)에 의해 기포(12)를 발생시킨 배양액(13)을 입자 크기 분포계 내의 플로우 셀에 연속적으로 공급하고, 이 배양액(13)에 레이저광을 조사하여 당해 레이저광의 회절이나 산란을 평가함으로써 측정하였다.
그 결과, 세포보호제의 첨가량이 1 용적%인 경우에는, 도 4에 나타낸 것과 같이, 용적기준의 입자 크기 분포에 있어 50% 지름이 200 ㎛ 이하(124 ㎛)로 되어 있다. 따라서, 이 크기의 기포(12)에서는, 상술한 바와 같이 부력의 영향이 극히 작게 될 것으로 생각된다. 한편, 세포보호제의 첨가량이 0.5%인 경우에는, 도 5에 나타낸 것과 같이, 50% 지름이 238 ㎛ 이었다. 이러한 첨가제의 첨가량과 얻어지는 기포(12)의 입경의 관계에 대하여, 다이고 GF21의 첨가량을 종류별로 바꾸어 기포(12)의 입경을 측정한 결과, 도 6에 나타낸 결과를 얻었다. 따라서, 부력의 영향이 작다고 생각되는 200 ㎛ 이하의 입경의 기포(12)를 발생시키기 위해서는, 1 용적% 이상의 다이고 GF21을 첨가할 필요가 있다는 것을 알았다.
(실시예 2)
상기 실시예 1과 마찬가지로, 첨가제의 첨가량과 생성하는 기포(12)의 입경의 상관관계를 조사하기 위해, 첨가하는 첨가제의 종류 및 첨가량을 바꾸어 실험을 수행하였다.
먼저, 상술한 바와 같이 배양액(13)의 표면장력에 대응하여 발생하는 기포(12)의 입경이 변화하는 것으로부터, 입경이 200 ㎛ 이하의 미소한 기포(12)를 발생시키기 위하여 필요한 배양액(13)의 표면장력이 어느 정도인지 확인하였다. 구체적으로는, 첨가제로서 다이고 GF21을 이용하는 것과 동시에, 상기 첨가제의 첨가량을 종류별로 바꾸어 배양액(13) 중에 있어 상술한 스파저(22)에 의해 기포(12)를 발생시켜, 당해 배양액(13)의 표면장력과 발생한 기포(12)의 입경을 측정하였다. 그 결과, 도 7에 나타낸 바와 같이, 배양액(13)의 표면장력과 발생하는 기포(12)의 입경에는 직선적인 상관관계가 보였고, 이 관계는 이하의 (1)식에 의해 나타낼 수 있음을 밝혀내었다.
y = 28.98x - 1292 … (1)
상기 (1)식으로부터, 상술하는 바와 같이 200 ㎛ 이하의 미소한 입경의 기포(12)를 발생시키기 위해서는, 배양액(13)의 표면장력을 51.5 dyne/cm 이하로 할 필요가 있음을 알았다.
여기서, 이하의 표 1 내지 3에 나타내는 첨가제에 대하여, 각각의 농도를 바꾸어 첨가한 때의 배양액(13)에 대하여 표면장력을 평가하였다. 그리고, 이러한 미소한 기포(12)가 생성할 것으로 생각되는 경우(표면장력이 51.5 dyne/cm 이하)를 ○ 로, 이보다 더 큰 입경의 경우(표면장력이 51.5 dyne/cm 초과)에는 ×로 표시하였다. 이 결과를 이하의 표 1 내지 3에 나타내었다.
Figure pat00001
Figure pat00002
Figure pat00003
상기 결과로부터 부력의 영향이 작은 것으로 생각되는 입경이 200 ㎛ 이하인 기포(12)를 얻기 위해서는, 첨가제의 종류에 대응하여 첨가량을 조정할 필요가 있다는 것을 밝혀내었다.
(실시예 3)
다음으로, 미생물을 배양하는 배지(표면장력: 48.6 dyne/cm)에 있어, 기포(12)의 기포 지름과 다공질체(11)의 세공지름 d 와의 대응관계를 측정한 결과를 도 8에 나타내었다. 상기 결과에 근거하여 상기 대응관계에 근접한 1차식을 산출한 결과,
y = 3.4x + 17.5 … (2)
를 얻었다 (여기서, x: 다공질체(11)의 세공지름, y: 기포(12)의 입경 (50% 지름)). 이때 R2 값은 1.0이고, 따라서 이 (2) 식에 의해, 배양액(13) 중의 기포(12)의 입경으로부터 다공질체(11)의 세공지름 d를 극히 높은 정확도로 산출할 수 있다는 것을 알았다. 여기서, 상기 부력의 영향이 극히 적다고 생각되는 기포(12)의 입경 (200 ㎛)에 대응하는 다공질체(11)의 세공지름 d를 산출하면, 50 ㎛가 됨을 알았다. 따라서, 세공지름 d가 50 ㎛ 이하인 다공질체(11)를 사용함으로써, 부력의 영향을 거의 받지 않는 미세한 기포(12)를 얻을 수 있다.
(실시예 4)
계속하여, 본 발명의 스파저(22)와, 종래의 스파저(U자 스파저)에 의해 배양액(13) 중에 각각 기포(12)를 발생시킨 경우에 각각의 배양액(13) 중에의 산소 공급 성능을 확인하는 실험을 수행하였다. 구체적으로는, 배양조에는 주식회사 타카스기 제작소제의 3 L 미니 쟈 발효조 (mini jar fermenter), 안쪽지름 130 mm, 높이 260 mm (형식: TSC-M3L)를 사용하여, 도 9에 나타낸 것과 같이 외측지름 55 mm 의 6매-평날개-터빈의 교반날개 및 기포제거 날개를 배양조에 설치하였다. 각각의 스파저를 이용하여 150 ml/min의 유량으로 공기를 배양액(13) 중에 공급하여, 산소용해능력을 나타내는 지표인 KLa 값(총 산소 이동 용적계수)을 측정하였다. 그 결과, 도 10에 나타내듯이, 다공질체(11)(SPG막)를 이용한 경우에는, 온화한 교반에도 높은 용존산소농도가 얻어졌으나, 종래의 스파저(U자형)에서는, 배양액(13)을 격렬하게 교반하여도 높은 용존산소농도를 얻을 수 없고, 다공질체(11)를 사용한 경우의 10분의 1 이하로 되었다. 그로 인해, 종래의 스파저에서는, 높은 용존산소농도를 얻기 위해서는, 교반에 의해 기포를 파쇄할 필요가 있다는 것을 알았다. 예를 들어 30 h-1의 KLa 값을 얻기 위해서는, 다공질체(11)에서는 교반날개(26)의 회전수는 250 rpm으로 충분하였으나, 종래의 스파저에서는 550 rpm의 격렬한 교반이 필요하였다. 따라서, 다공질체(11)를 사용함으로써 교반날개(26)의 회전수를 반 이하로 저감시킬 수 있다고 말할 수 있다.
(실시예 5)
본 발명의 스파저(22)(다공질체(11))를 이용한 경우와, 종래의 스파저(U자형)를 이용한 경우에 있어, 실제로 미생물인 대장균(Escherichia coli, NBRC3301)을 배양한 경우, 균체농도(OD600)가 어떻게 되는지 확인하는 실험을 수행하였다. 공기의 공급량에 대해서는, 각각 150 ml/min으로 하였다. 그 결과, 도 11에 나타낸 바와 같이, 종래의 스파저를 이용한 경우와 비교하여, 다공질체(11)를 이용한 경우에는, 배양 8 시간 후에는 균체 농도가 50% 정도 많아지는 것을 알았다. 이 결과는, 배양액(13)에 공급되는 기포(12)의 입경에 대응하는 것으로 생각되며, 즉, 기포(12)의 비표면적이 크고 산소공급속도가 빠를수록, 균체농도를 증가시킬 수 있다고 말할 수 있다.
(실시예 6)
또한, 마찬가지로 다공질체(11) 및 종래의 스파저를 이용하여 실제로 대장균을 배양한 경우의 용존산소농도를 측정하였다. 그 결과, 도 12에 나타낸 바와 같이, 종래의 스파저에서는, 배양의 개시에 수반하여 곧바로 용존산소농도가 감소되어갔지만, 다공질체(11)를 이용한 경우에는, 용존산소농도의 저하가 억제되었다.
(실시예 7)
상기 실시예 6에서는, 배양액(13) 중의 용존산소농도를 측정하였으나, 이 실시예 7 에서는, 대장균을 배양하고 있을 때에 배양액(13)으로부터 방출(배출)되는 가스 중의 산소농도를 측정하였다. 즉, 공급한 공기중의 산소가 배양액(13) 중에 용해하여 대장균에 의해 소비되면, 배기되는 산소량이 적어지는데, 배양액(13)에 산소가 용해되지 않는 경우에는, 산소가 그대로 배양액(13)으로부터 배출되게 되므로, 배기가스 중의 산소농도를 측정함으로써 산소가 유효하게 이용되고 있는지 여부를 확인하였다.
그 결과, 도 13에 나타낸 바와 같이, 다공질체(11)를 이용한 경우에는 배기가스 중의 산소농도가 낮아져 있어, 배양액(13)에 산소가 용해되고, 또한 대장균에의해 이 산소가 소비되고 있음을 확인하였다. 한편, 종래의 스파저에서는 그정도로 산소가 배양액(13)에 용해되지 않고, 산소의 대부분이 배기되고 있음을 알았다. 이 결과를 산소의 유효이용률(소비된 산소량 ÷ 공급한 산소량)로 계산하면, 산소의 유효이용률은, 다공질체(11)에서는 86%, 종래의 스파저에서는 30% 였다. 따라서, 다공질체(11)를 이용하면 기포(12)의 입경이 작아져 공기가 배양액(13) 중에 용해되기 쉬워지나, 종래의 스파저에서는 기포의 입경이 크기 때문에 공급한 산소의 대부분이 배양액(13)으로부터 배출되고 만다는 것을 알았다.
(실시예 8)
이어서, 본 발명의 스파저(22)(다공질체(11))를 이용한 경우와, 종래의 스파저(소결금속)를 이용한 경우에 있어, 실제로 동물세포인 Chinese hamster ovary 세포(라이프 테크놀로지즈 재팬 주식회사, 카탈로그번호: 11619-012)를 배양한 경우에, 살아있는 세포농도 및 글루코오스 농도가 어떻게 되는지 확인하는 실험을 수행하였다. 구체적으로는, 에이블주식회사제의 총 7 L 동물 세포 배양조(형식: BCP-07NP3)에 라이프 테크놀로지즈 재팬 주식회사제의 무혈청 배지인 CHO-S-SFM Ⅱ를 5 L 가득채워(수용하여), 상기 Chinese hamster ovary 세포를 배양하였다. 살아있는 세포 농도는, 상기 배양조에서 채용한 배양액에, 세포의 생사판정용 시약인 0.05 중량% 니그로신 용액을 첨가하여, 선리드 글라스 유한회사제의 토마 혈구계산판(형번: A105)을 이용하여 측정하였다. 한편, 글루코오스 농도는, 주식회사 시마츠 제작소제의 고속액체크로마토그래프(컬럼 모델 번호: Shim-pack SPR-Pb 250L×7.8)를 이용하여 측정하였다. 또한, 배양액의 용존산소농도에 대해서는, 본 발명의 경우 및 종래의 경우의 어느 경우에 있어서도 각각 6.31 mg/L 가 되도록 스파저(22)(스파저)의 공기 공급량을 제어하였다. 그 결과, 살아있는 세포 농도에 대해서는 도 14에 나타내는 바와 같이, 종래의 스파저를 이용한 경우와 비교하여, 다공질체(11)를 이용한 경우에는, 최대 살아있는 세포 농도가 75% 정도 높아지는 것을 알았다. 또한, 글루코오스 농도에 대해서는 도 15에 나타내는 바와 같이, 초기 값은 동등하며, 배양 중의 농도의 감소경향도 거의 마찬가지였다. 즉, 다공질체(11)로부터 발생하는 기포(12)가 배양액(13) 중에 존재하여 산소를 공급함으로써, 종래의 스파저로부터 발생하는 기포와 비교하여, 세포(2)가 보다 효율적으로 글루코오스를 소비하여 증식할 수 있음을 밝혀냈다.
1 세공
11 다공질체
12 기포
13 배양액
21 배양조
22 스파저
23 산소저장부

Claims (8)

  1. 영양분을 포함하는 배양액 중에 산소 또는 이산화탄소를 용해시켜 세포 또는 미생물을 배양하는 방법에 있어서,
    한쪽 단면(端面)을 막은 기둥형태이고 또한 균일한 구멍지름을 갖는 다공질 유리체의 내부에, 다른 단면으로부터 산소 또는 이산화탄소를 포함하는 가스를 공급하고,
    용적기준의 입자 크기 분포에 있어 50% 지름이 200 ㎛ 이하인 기포를 상기 다공질 유리체의 외주면으로부터 발생시키고,
    상기 배양액 중에 포함되는 단백질 가수분해물 및 세포를 보호하기 위한 세포보호제 중 적어도 하나에 의해 상기 기포의 응집을 억제하여,
    상기 기포내의 산소 또는 이산화탄소를 상기 배양액에 용해시키는 것을 특징으로 하는 세포 또는 미생물의 배양 방법.
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 배양액의 표면장력이, 51.5 dyne/cm 이하인 것을 특징으로 하는 세포 또는 미생물의 배양 방법.
  3. 청구항 1 또는 2에 있어서, 상기 다공질 유리체의 세공지름이, 50 ㎛ 이하인 것을 특징으로 하는 세포 또는 미생물의 배양 방법.
  4. 청구항 1 내지 3 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 기포가 용해된 배양액에 있어, 세포 또는 미생물의 배양을 수행하는 공정을 더 포함하는 세포 또는 미생물의 배양 방법.
  5. 영양분을 포함하는 배양액 중에 산소 또는 이산화탄소를 용해시켜 세포 또는 미생물의 배양을 수행하는 배양장치에 있어서,
    단백질 가수분해물 및 세포를 보호하기 위한 세포보호제 중 적어도 하나를 포함하여 기포의 응집을 억제하는 배양액과,
    한쪽 단면(端面)으로부터 산소 또는 이산화탄소를 포함하는 가스를 공급하여, 용적기준의 입자 크기 분포에 있어 50% 지름이 200 ㎛ 이하인 기포로서 외주면으로부터 발생시켜 상기 배양액에 산소 또는 이산화탄소를 용해시킴과 동시에, 다른 쪽은 단면을 막은 기둥형태이고 균일한 구멍 지름을 가지는 다공질 유리체를 포함하는 것을 특징으로 하는 세포 또는 미생물의 배양 장치.
  6. 청구항 5에 있어서, 상기 배양액의 표면장력이, 51.5 dyne/cm 이하인 것을 특징으로 하는 세포 또는 미생물의 배양 장치.
  7. 청구항 5 또는 6에 있어서, 상기 시라스 다공질 유리막의 세공지름이, 50 ㎛ 이하인 것을 특징으로 하는 세포 또는 미생물의 배양 장치.
  8. 청구항 5 내지 7 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 배양액이, 세포 또는 미생물을 포함하는 세포 또는 미생물의 배양 장치.
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