KR20110093646A - 세포 생존률 및 생물학적 생성물 수율의 향상을 위한 포유동물 세포 배양 공정에서 ｐＨ, 삼투몰농도 및 용존 이산화탄소 수준의 조절 방법 - Google Patents

세포 생존률 및 생물학적 생성물 수율의 향상을 위한 포유동물 세포 배양 공정에서 ｐＨ, 삼투몰농도 및 용존 이산화탄소 수준의 조절 방법 Download PDF

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Abstract

세포 성장, 생존률 및 밀도를 향상시키고, 생물학적 생성물의 농도 및 수율을 증가시키기 위한, 포유동물 세포 배양 공정에서 용존 이산화탄소의 수준을 조절하고 삼투몰농도를 제한하는 방법이 제공된다. 포유동물 세포 배양 공정에서 용존 이산화탄소의 수준 및 pH의 이러한 조절 뿐만 아니라, 결과적인 삼투몰농도 제한 능력은, 포유동물 세포 배양 공정 동안 대안적인 pH 조절 전략 및 CO2 스트리핑 기술을 채택함으로써 달성된다. 이러한 pH 조절 기술 및 이산화탄소 스트리핑은 포유동물 세포를 거의 또는 전혀 손상시키지 않고, 거품의 형성없이 수행된다.

Description

세포 생존률 및 생물학적 생성물 수율의 향상을 위한 포유동물 세포 배양 공정에서 ｐＨ, 삼투몰농도 및 용존 이산화탄소 수준의 조절 방법{METHOD FOR CONTROLLING pH, OSMOLALITY AND DISSOLVED CARBON DIOXIDE LEVELS IN A MAMMALIAN CELL CULTURE PROCESS TO ENHANCE CELL VIABILITY AND BIOLOGIC PRODUCT YIELD}
본 발명은 포유동물 세포 배양 공정, 보다 구체적으로는 세포 배양 배지의 pH, 삼투몰농도 및 용존 이산화탄소 수준을 비롯한 공정 파라미터의 개선된 조절을 통한 세포 성장, 세포 밀도, 세포 생존률, 생성물 농도 및 생성물 수율의 향상 방법에 관한 것이다.
단백질 치료제 및 다른 생물학적 생성물, 예컨대 단일클론 항체의 상업적 제조는 현재 일반적으로 유전적으로 최적화된 포유동물, 곤충 또는 다른 세포 유형의 현탁액을 배양하기에 적합화된 생물반응기에서 수행된다. 포유동물 세포 배양 생물반응기는 전형적으로 수백 내지 수천 리터의 작업 부피를 갖는다. 가장 일반적인 풀 스케일(full scale) 제조 공장은 약 1,000 리터 내지 25,000 리터 이하 범위의 작업 부피를 갖는 생물반응기를 갖는다. 임상 실험용 약물 후보물질은 5 리터 내지 수백 리터의 작업 부피를 갖는 실험실 규모의 생물반응기에서 제조된다.
가능한 최소의 시간으로 최고의 생물학적 생성물 수율을 얻기 위한 최적화 및 생물반응기의 규모 증가와 관련된 문제는 인지된 중요한 공정 파라미터, 예컨대 pH, 용존 산소 (DO), 온도, 영양소 조성 및 부산물 프로필, 교반 프로필, 기체 스파징(sparging)법, 영양소 공급 및 생성물 수집 프로필의 조절에 집중되어 왔다. 용존 이산화탄소 (dCO2) 및 삼투몰농도 (즉, 용액 1 kg 당 용존 입자의 농도)와 같은 다른 공정 파라미터의 중요성이 최근 문헌에서 증명되고 있다. 실제로, 다수의 상업용 생물반응기에는 용존 이산화탄소 수준 및/또는 삼투몰농도를 조절하고 최적화하기 위한 수단은 커녕, 이들을 동일계에서 측정하기 위한 수단조차도 설치되어 있지 않다. 상업적 작동 규모 (수백 내지 25,000 리터 이하 범위의 생물반응기 부피)에 따라, 공정의 규모 증가, 최적화 및 조절은 여러가지 문제를 제기한다. 약 1,000 리터 초과의 상업적 규모에서는, 현재 최상의 이용가능한 기술 및 방법으로는 용존 이산화탄소 수준 및 삼투몰농도의 동시적이고 독립적인 조절이, 불가능하지는 않더라도 어렵다.
제조업 규모의 포유동물 세포 배양 공정을 생물반응기에서 개시하기 전에, 시드 배양 접종물이 전형적으로 준비된다. 이것은 제조 생물반응기로 접종을 위한 충분한 세포가 입수될 때까지 부피를 증가시키는 인큐베이터 및/또는 소형 생물반응기 중 일련의 플라스크에서 생성 세포를 배양하는 것을 포함한다. 상기 공정은 세포 집단을 한 배양 용기에서 더 큰 배양 용기로 옮기는 것을 포함한다. 일반적으로, 각각의 전달 또는 계대배향(subculture)을 위하여 세포 집단의 20％ 희석액이 사용한다. 인큐베이터에서, 배양 배지를 갖는 플라스크를 회전 플랫폼(platform)에 클램핑(clamping)하여 배양물이 소용돌이 치게 함으로써 인큐베이터에서 배양 배지와 대기 사이의 기체 전달을 촉진시킨다. 전형적으로, 포유동물 세포 배양 공정을 위한 인큐베이터는 5％ 이산화탄소(CO2) 및 약 80％ 초과의 습도 수준과 함께 37℃로 설정된다. 생물반응기에서 성장한 시드 배양물을 위해 유사한 온도 및 CO2 수준이 사용된다. 시드 배양물이 충분한 부피 및 세포 밀도에 도달했을 때, 제조 생물반응기에 접종시킨다.
시드 배양물을 생물반응기 배지로 접종시킨 후, 세포 배양 공정 동안 pH, 온도 및 용존 산소의 수준과 같은 파라미터를 소정 수준으로 조절한다. pH는 전형적으로 공정 동안 필요할 경우 염기성 용액 또는 산성 용액을 첨가함으로써 조절된다. 일반적으로 사용되는 염기 용액으로는 중탄산나트륨, 탄산나트륨 및 수산화나트륨 용액을 들 수 있다. 보다 산성 pH를 얻기 위하여 이산화탄소(CO2)의 용해가 일반적으로 사용된다. pH를 조절하기 위하여 다른 산이 이용될 수 있지만, 용존 CO2와 중탄산나트륨의 조합이 세포 배양을 위해 가장 안정하고 바람직한 완충제 시스템을 형성한다. 포유동물 세포 배양 공정을 위한 배양 배지 또는 용액의 바람직한 온도는 약 37℃이다. 배양 배지 또는 용액 중 용존 산소의 목적하는 수준은, 전형적으로 큰 공기/산소 버블을 파괴시키는 임펠러(impeller)를 사용하는 배양 배지 또는 용액의 교반과 함께 생물반응기의 하부에 설치된 스파저(sparger)를 사용하는 공기 스파징을 통해 달성되어 산소의 스파징된 공기 버블로부터 세포 배지로의 전달을 향상시킨다. 생물반응기 상부 공간을 커버 기체로 퍼징하여 제한된 표면 기체 교환 정도를 제공한다. 불리하게는, 배양 배지 또는 용액의 공기 스파징 및 교반은 포유동물 세포에 거품형성 및 전단 손상을 일으켜 세포 생존률에 불리한 영향을 미칠 수 있다. 또한, 배양 배지의 표면 상 거품의 축적은 표면 기체 교환을 더 제한하고, 생물반응기의 이용가능한 작업 부피를 감소시키는 작용을 한다.
상업적 규모의 포유동물 세포 배양 공정을 배치 방식 또는 현탁된 세포 배양물을 위한 유가(fed-batch) 방식 및 고정된 세포를 위한 관류 방식의 3가지 상이한 작동 방식으로 수행할 수 있다. 대부분의 상업적 규모의 포유동물 세포 배양 공정은 유가 방식으로 작동된다. 유가 방식에서, 초기 생물반응기 설정 후에 추가의 배지 및 영양소를 세포 배양 공정 동안 상이한 시점에 생물반응기에 첨가하여 탄소 공급원 및 다른 영양소를 보충한다.
임의의 생물반응기는 포유동물 세포 배양을 위해 사용되기 전에, 전형적으로 살균되어야 하며, 다양한 프로브 뿐만 아니라, 보충용 기체 공급 및 추가의 공급물의 도입을 위한 연결부가 장착되어야 한다. 온도 프로브, pH 검출기, 용존 산소 프로브 및 용존 CO2 프로브 또는 센서를 사용하여 세포 배지 또는 용액의 온도, pH, 용존 산소 및 용존 CO2 수준을 실시간으로 모니터링한다. 또한, 세포 배양 배지 또는 용액 샘플을 소정 간격으로 생물반응기로부터 인출하여 세포 밀도 및 세포 생존률을 측정할 뿐만 아니라, 대사산물 및 삼투몰농도와 같은 다른 특성을 분석할 수 있다. 이러한 분석 결과를 바탕으로, 세포 생존률을 연장시키고, 생물학적 생성물의 제조를 증가시키려는 노력의 일환으로 추가의 공급물 또는 다른 첨가제를 세포 배양 배지 또는 용액에 첨가할 수 있다. 세포 생존률이 소정의 하한에 도달했을 경우, 세포 배양 공정을 중단시키거나 멈출 수 있다. 소정의 하한은 종종 하류 회수 및 수집된 생물학적 생성물의 정제의 결과를 바탕으로 실험적으로 결정된다.
배양 공정 동안, 포유동물 세포는 3가지 시기, 즉 지체기, 지수증식기 및 정상기 또는 생산기를 나타낸다. 지체기는 접종 직후에 일어나며, 일반적으로 포유동물 세포의 새로운 환경에 대한 생리학적 적응 기간이다. 지체기 후, 포유동물 세포는 지수증식기인 것으로 생각된다. 지수증식기에서, 포유동물 세포는 증식하고, 세포 밀도는 시간에 따라 기하급수적으로 증가한다. 다수의 세포가 실제로 지수증식기에서 일부 시점 동안 목적하는 단백질, 항체 또는 생물학적 생성물을 생성하기 시작한다. 세포 밀도는 일반적으로 생존 세포 및 비생존 세포의 밀도로 나타낸 배양물 중 세포의 총 수를 의미한다. 포유동물 세포가 정상기 또는 생산기에 도달할 경우, 생존 세포는 하류 수집을 위한 생물학적 생성물을 활발히 생성한다. 이 시기 동안, 전체 세포 밀도는 일반적으로 일정하게 유지될 수 있지만, 세포 생존률 (즉, 생존 세포의 백분율)은 시간에 따라 급격히 감소하는 경향이 있다.
포유동물 세포는 세포 배양 배지 또는 용액 중 용존 이산화탄소의 양에 민감한 것으로 공지되어 있다. 지수증식기 동안 과량의 이산화탄소 수준에 노출되는 포유동물 세포 배양물은 단일클론 항체 또는 다른 목적하는 생물학적 생성물의 생성 감소를 나타낼 수 있다. 접종 전에, 약알칼리성 배양 배지의 pH는 최적의 값으로 조정된 이산화탄소를 사용하여 저하되어야 한다. 이것은 종종 다수의 포유동물 세포 배양 공정의 지체기의 개시시에 용존 이산화탄소의 수준을 상승시킨다.
포유동물 세포 배양 생물반응기 중 용존 이산화탄소는 화학적 공급원 및 생물학적 공급원으로부터 유래된다. 이산화탄소의 화학적 공급원은 중탄산나트륨 및/또는 탄산나트륨을 함유하는 소정량의 완충제 용액을 포함하는 세포 배양 배지 또는 용액내에서 일어나는 평형 화학 반응이다. 또한, 이산화탄소를 약알칼리성 배양 배지 또는 용액으로 직접 스파징하여 브로스(broth)의 pH를 소정 수준, 일반적으로 약 7.0으로 감소시킬 수 있으며, 이는 더 많은 용존 이산화탄소를 생성할 수 있다. 이산화탄소의 생물학적 공급원은 생물반응기내 포유동물 세포의 호흡의 산물이다. 이산화탄소의 이러한 생물학적 공급원은 세포 밀도와 함께 증가하고, 일반적으로 생물반응기내 세포 밀도가 최대화되는 시점과 거의 동시에 그의 최대 값에 도달한다. 그러나, 더 많은 이산화탄소가 생성될수록, 세포 배양 배지의 pH는 산성이 되는 경향이 있어서, 세포 배양 배지 또는 용액의 pH를 목적하는 범위내에 유지시키기 위하여 추가의 중탄산염이 필요하다.
pH를 저하시키는 용존 이산화탄소의 증가의 효과를 상쇄시키기 위하여, 중탄산나트륨을 첨가하여 용액의 pH를 소정 범위내에 유지시킬 수 있다. 증가된 이산화탄소의 효과를 상쇄시키는 이러한 수단 모두 포유동물 세포 배양 공정에 대해 다른 부정적인 결과를 갖는다. 먼저, 용존 이산화탄소 수준의 임의의 증가는 세포 배양 배지 또는 용액의 삼투몰농도의 증가에 기여한다. 유사하게, 이산화탄소를 상쇄시키도록 용액의 pH를 조정하기 위하여 필요한 중탄산나트륨의 첨가 또한 삼투몰농도를 증가시킨다. (삼투몰농도는 용액 1 kg 당 용존 입자의 수를 나타내고, 일반적으로 어는점(freeze-point) 내림에 의해 mOsm/kg으로 보고된다.) 또한, 중탄산나트륨의 첨가는 용액에 허용된 용존 이산화탄소의 평형 포화 수준을 증가시켜 에어레이션(aeration) 공정 동안 이산화탄소가 제거되기 더 어렵게 만들 것이다. 용존 이산화탄소 수준의 증가 또는 삼투몰농도 증가가 세포 밀도 또는 수율에 불리한 영향 또는 악영향을 미친다는 것은 당업계에 공지되어 있다. 그러나, 이산화탄소 수준과 삼투몰농도의 조합된 또는 상승작용적 효과에 대해서는 잘 알려져 있지 않다.
이산화탄소는 물 중 pH 7에서 중탄산 이온으로 해리된다. 이산화탄소의 일정 분율만이 비해리된 상태로 자유 CO2로 남아있다. 따라서, 대부분의 포유동물 세포 배양이 6.5 내지 7.5 범위의 pH에서 일어나기 때문에 세포 배양물로부터 용존 이산화탄소의 제거가 어려워진다. 해리된 중탄산 이온은 쉽게 제거되지 않으며, 일반적으로 용액으로부터 스트리핑(stripping)될 수 있기 전에 자유 이산화탄소로 재조합되어야 한다. 또한, pH의 균형을 이루기 위한 중탄산나트륨의 임의의 첨가는 용액 중 평형 용존 이산화탄소 농도 또는 포화 수준을 증가시켜 이산화탄소를 물리적으로 제거하기 어렵게 만들 것이다.
포유동물 세포 배양 용액으로부터 용존 이산화탄소를 제거 또는 스트리핑하는 통상적인 방법은 세포 배양 용액을 교반되는 탱크에서 공기/산소/질소의 기체 혼합물 또는 공기로 스파징하는 것이다. 그러나, 교반되는 탱크에서 기체 스파징은 세포 배양 공정에 불리한 영향을 초래한다. 특히, 회전 교반기의 팁(tip)에서 기체-버블의 파괴는 포유동물 세포 막을 손상시켜 종종 세포 사멸을 유발하기에 충분한 고 전단 속도의 원인이다. 손상이 치사량 이하일 때에도, 손상된 막이 복원되는 동안 세포 생산성이 저하된다.
또한, 공기 또는 질소를 생물반응기로 스파징하면 생물반응기내 용액의 표면으로 상승하는 기체 버블이 생성되어 기체가 상부 공간으로 방출된다. 세포 배양 용액의 상부 표면에서 기체 버블의 파괴는 종종 교반기에 의해 유발된 손상보다 포유동물 세포를 더 손상시킨다. 교반기 속도의 억제 및 기체 스파징 속도의 제한이 이러한 손상을 방지하고 세포 생존률을 증가시키는 최상의 수단인 것으로 현재 간주되고 있다. 그러나, 이러한 수단은 제거될 수 있는 이산화탄소의 양을 감소시키고, 또한 제거될 수 없는 잉여분이 세포 성장 및 생존률을 억제한다. 이러한 단점은, 전단 속도가 실질적으로 임펠러의 직경과 함께 상승하는 대규모 상업적 규모의 생물반응기에서 극복하기가 특히 어려운 문제이다. 또한, 대규모 생물반응기의 정력학 높이압(hydrostatic head)이 커질수록 이산화탄소의 용해도가 증가하는 경향이 있으며, 이는 용존 CO2 수준을 최적 범위내에서 유지시키기 위하여 더 많이 제거될 필요가 있다는 것을 의미한다.
본 발명은 생물반응기 중 세포 배양 배지의 상부 표면에서 표면 기체 교환을 통해 용존 이산화탄소를 제거함으로써 포유동물 세포 배양 공정의 성장기 및 생산기에 걸쳐 세포 배양 배지에서 용존 이산화탄소를 약 10％ 미만의 농도의 용존 이산화탄소 수준으로 유지시키는 단계를 포함하며, 여기서 세포 배양 배지 중 삼투몰농도는 포유동물 세포 배양 공정 동안 특정 세포에 대한 최적 범위에서 유지되고, 세포 배양 배지의 pH는 포유동물 세포 배양 공정 동안 특정 세포에 대한 최적 범위에서 유지되는, 포유동물 세포 배양 공정에서 생성물 수율의 향상 방법을 특징으로 할 수 있다.
또한, 본 발명은 (i) 생물반응기 중 포유동물 세포 배양물을 용존 이산화탄소와 평형 상태의 소정 수준의 중탄산염 및 초기 수준의 삼투몰농도를 갖는 세포 배양 배지로 접종시키는 단계; (ii) 포유동물 세포 배양 공정의 성장기 동안 영양소를 세포 배양 배지에 주기적으로 첨가하는 단계; (iii) 포유동물 세포 배양 공정의 성장기 또는 생산기 동안 산 또는 염기를 세포 배양 배지에 주기적으로 첨가하여 pH 수준을 이산화탄소 기체의 첨가없이 포유동물 세포에 대한 소정 범위내로 유지시키는 단계; (iv) 포유동물 세포 배양 공정의 성장기 또는 생산기 동안 생물반응기 중 세포 배양 배지의 상부 표면 위 상부 공간에서 산소 함유 스위프(sweep) 기체의 부피 유량을 조정하여 세포 배양 배지의 상부 표면에서 표면 기체 교환을 촉진시키는 단계; 및 (v) 성장기 또는 생산기 동안 생물반응기에서 세포 배양 배지의 상부 표면 아래에 배치된 상향 유동 임펠러의 회전 속도를 조정하는 단계를 포함하는, 유가식 포유동물 세포 배양 공정에서 단백질 생성물 수율의 향상 방법을 특징으로 할 수 있다. 세포 배양 배지 중 용존 이산화탄소는 표면 기체 교환을 통한 이산화탄소의 스트리핑에 의해 포유동물 세포 배양 공정의 성장기 또는 생산기에 걸쳐 약 10％ 미만의 농도의 용존 이산화탄소의 안정한 수준에서 유지된다. 세포 배양 배지 중 삼투몰농도는 포유동물 세포 배양 공정 동안 특정 세포에 대한 최적 범위에서 유지되고, 유가식 포유동물 세포 배양 공정의 생성물 수율은 향상된다.
본 발명은 별법으로 (i) 세포 배양물을 용존 이산화탄소와 평형 상태인 소정 수준의 중탄산염을 갖는 세포 배양 배지로 접종시키는 단계; (ii) 용존 이산화탄소를 제거함으로써 유가식 포유동물 세포 배양 공정의 성장기 또는 생산기에 걸쳐 세포 배양 배지 중 용존 이산화탄소의 농도를 약 10％ 미만으로 유지시키는 단계; 및 (iii) 유가식 포유동물 세포 배양 공정의 성장기의 초기부터 생산기의 말엽까지 세포 배양 배지 중 삼투몰농도의 상승을 400 mOsmol/kg 미만으로 제한하는 단계를 포함하며, 여기서 세포 배양 배지의 pH는 포유동물 세포 배양 공정 동안 특정 세포에 대한 최적 범위에서 유지되는, 유가식 포유동물 세포 배양 공정에서 생성물 수율의 향상 방법을 특징으로 할 수 있다.
또한, 본 발명은 (i) 접종 단계 동안 이산화탄소 및 중탄산나트륨 완충제를 세포 배양 배지에 제공하여 세포 배양 배지 중 중탄산염과 용존 이산화탄소의 소정 평형 수준 및 삼투몰농도의 초기 수준을 확립하는 단계; (ii) 유가식 포유동물 세포 배양 공정의 성장기 및 생산기 동안 세포 배양 배지로부터 용존 이산화탄소를 스트리핑하는 단계; (iii) 성장기 및 임의로는 생산기 동안 영양소를 세포 배양 배지에 첨가하는 단계; 및 (iv) 성장기 및 생산기 동안 산 또는 염기를 세포 배양 배지에 첨가하여 pH 조정을 위한 이산화탄소 기체의 첨가없이 pH 수준을 소정 범위에서 유지시키는 단계를 포함하는, 유가식 포유동물 세포 배양 공정에서 세포 배양 배지의 pH 수준의 조절 방법을 특징으로 할 수 있다. 이러한 공정의 결과로, 세포 배양 배지 중 삼투몰농도 수준은 소정 범위에서 유지되고, 성장기의 초기에서 생산기의 말엽까지의 삼투몰농도 수준의 상승은 400 mOsmol/kg 미만이고, 세포 배양 배지 중 용존 이산화탄소의 농도는 성장기 및 생산기 동안 10％ 이하로 유지된다.
본 발명은 또다른 별법으로 (i) 유가식 포유동물 세포 배양 공정의 생산기 동안 세포 배양 배지를 물로 희석하여 세포 배양 배지 중 폐기물의 독성 효과를 감소시키는 단계; (ii) 유가식 포유동물 세포 배양 공정의 생산기 동안 보충 영양소를 세포 배양 배지에 첨가하여 물의 희석 효과를 보상하는 단계; 및 (iii) 유가식 포유동물 세포 배양 공정의 생산기 동안 세포 배양 배지 중 용존 이산화탄소의 농도를 10％ 이하로 유지시키고, 세포 배양 배지 중 삼투몰농도 수준과 pH 수준을 모두 포유동물 세포에 대한 최적 범위내로 유지시키는 단계를 포함하며, 여기서 유가식 포유동물 세포 배양 공정의 생산기 동안 포유동물 세포의 세포 생존률 연장으로 인하여 단백질 생성물 수율이 증가되는, 유가식 포유동물 세포 배양 공정의 생산기 동안 세포 생존률을 연장시키고 단백질 생성물 수율을 증가시키는 방법을 특징으로 할 수 있다.
본 발명을 특성화하는 또다른 방식은 (i) 생물반응기 중 포유동물 세포 배양물을 용존 이산화탄소와 평형 상태의 소정 수준의 중탄산염 및 초기 수준의 삼투몰농도를 갖는 세포 배양 배지로 접종하는 단계; (ii) 영양소를 세포 배양 배지에 첨가하여 세포 배양 배지의 삼투몰농도 수준을 증가시켜 포유동물 세포로부터 단백질 생산을 촉진시키는 단계; (iii) 산 또는 염기를 세포 배양 배지에 첨가하여 pH 수준을 포유동물 세포를 위한 소정 범위내로 유지시키는 단계; (iv) 유가식 포유동물 세포 배양 공정 전체에 걸쳐 세포 배양 배지로부터 용존 이산화탄소를 스트리핑하는 단계 (여기서, 세포 배양 배지 중 용존 이산화탄소의 농도는 10％ 이하에서 유지되고, 삼투몰농도의 초기 수준으로부터 삼투몰농도 수준의 증가는 약 400 mOsmol/kg 미만으로 제한됨); 및 (v) 유가식 포유동물 세포 배양 공정의 성장기 또는 초기 생산기 동안 생물반응기로부터 단백질 생성물을 수집하는 단계를 포함하는, 유가식 포유동물 세포 배양 공정으로부터 생성된 단백질 생성물의 순도를 개선시키는 방법이다.
마지막으로, 본 발명은 (i) 접종 단계 동안 이산화탄소 및 중탄산나트륨 완충제를 세포 배양 배지에 제공하여 세포 배양 배지에서 중탄산염과 용존 이산화탄소의 소정 평형 수준 및 삼투몰농도의 초기 수준을 확립하는 단계; (ii) 성장기 동안 영양소를 세포 배양 배지에 첨가하여 세포 배양 배지의 삼투몰농도 수준을 증가시키는 단계; (iii) 성장기 동안 산 또는 염기를 세포 배양 배지에 첨가하여 pH 수준을 소정 범위로 유지시키는 단계; (iv) 유가식 포유동물 세포 배양 공정의 성장기 동안 세포 배양 배지로부터 용존 이산화탄소를 스트리핑하는 단계를 포함하며, 여기서 세포 배양 배지 중 용존 이산화탄소의 농도는 성장기 동안 10％ 이하에서 유지되고, 성장기의 일부분 동안 세포 배양 배지 중 삼투몰농도 수준은 감소하고, 성장기의 초기에서 성장기의 말엽까지의 삼투몰농도 수준의 총 상승은 약 400 mOsmol/kg 미만인, 유가식 포유동물 세포 배양 공정에서 세포 배양 배지의 삼투몰농도 수준의 조절 방법을 특징으로 할 수 있다.
본 발명은 포유동물 세포 배양 공정 동안 용존 이산화탄소 수준, pH 및 삼투몰농도를 조절하기 위한 다양한 방법 및 시스템을 제공하여 세포 생존률 및 생물학적 생성물 수율을 향상시킨다.
본 발명의 상기 및 다른 측면, 특성 및 장점은 하기 도면과 함께 제시된 다음의 본 발명의 보다 상세한 설명으로부터 보다 명백해질 것이다.
도 1은 중간 수준의 삼투몰농도를 갖는 공정에서 포유동물 세포주의 3가지 상이한 수행에 대한 용존 이산화탄소의 백분율을 도시한 그래프이며, 여기서 3가지 수행은 고 피크 수준의 용존 이산화탄소를 갖는 제1의 것, 중간 피크 수준의 용존 이산화탄소를 갖는 제2의 것, 및 저 피크 수준의 용존 이산화탄소를 갖는 제3의 것을 포함한다.
도 2a는 중간 삼투몰농도를 갖는 도 1로부터의 공정에서 포유동물 세포주의 3가지 상이한 수행에 대한 포유동물 세포 배양 공정에서 생존 세포 밀도를 시간(일)의 함수로서 도시한 그래프이다.
도 2b는 중간 삼투몰농도를 갖는 도 1로부터의 공정에서 포유동물 세포주의 3가지 상이한 수행에 대한 세포 생존률을 백분율로 시간(일)의 함수로서 도시한 그래프이다.
도 2c는 중간 삼투몰농도를 갖는 도 1로부터의 공정에서 포유동물 세포주의 3가지 상이한 수행에 대한 포유동물 세포 배양 공정에서 총 세포 밀도를 시간(일)의 함수로서 도시한 그래프이다.
도 3a는 중간 삼투몰농도를 갖는 도 1로부터의 공정에서 포유동물 세포주의 3가지 상이한 수행에 대한 포유동물 세포 배양 공정에서 생물학적 생성물의 농도를 시간(일)의 함수로서 도시한 그래프이다.
도 3b는 본 발명의 동적 기체 조절 (DGC) 공정을 사용하여 도 1, 2 및 3a에 기재된 바와 같은 전형적인 저 용존 이산화탄소 포유동물 세포 배양 공정의 삼투몰농도 프로필을 도시한 그래프이다.
도 3c는 도 1, 2 및 3a에 기재된 바와 같은 기준 포유동물 세포 배양 공정의 삼투몰농도 프로필을 도시한 그래프이다.
도 4는 일반적으로 일정한 또는 안정한 삼투몰농도를 갖는 공정에서 포유동물 세포주의 2가지 상이한 수행에 대한 포유동물 세포 배양 공정에서 용존 이산화탄소의 백분율을 시간(일)의 함수로서 도시한 그래프이며, 제1 수행은 저 피크 수준의 용존 이산화탄소를 포함하고, 제2 수행은 총괄적인 중간 피크 수준의 용존 이산화탄소를 포함한다.
도 5는 중간 삼투몰농도 및 일반적으로 일정한 또는 안정한 수준의 용존 이산화탄소를 갖는 도 4로부터의 공정에서 포유동물 세포주의 2가지 상이한 수행에 대한 포유동물 세포 배양 공정에서 생존 세포 밀도를 시간(일)의 함수로서 도시한 그래프이다.
도 6은 중간 삼투몰농도 및 일반적으로 일정한 또는 안정한 수준의 용존 이산화탄소를 갖는 도 4로부터의 공정에서 포유동물 세포주의 2가지 상이한 수행에 대한 포유동물 세포 배양 공정에서 생물학적 생성물 역가(titer) 또는 농도를 시간(일)의 함수로서 도시한 그래프이다.
도 7은 포유동물 세포 배양 공정의 성장기 및 생산기 동안 용존 이산화탄소 프로필을 도시한 그래프이다.
도 8은 상이하지만 일반적으로 일정한 수준의 용존 이산화탄소가 유지되는 포유동물 세포주의 또다른 2가지 상이한 수행에 대한 포유동물 세포 배양 공정에서 생존 세포 밀도를 시간(일)의 함수로서 도시한 그래프이다.
도 9는 상이하지만 일반적으로 일정한 수준의 용존 이산화탄소를 갖는 도 8로부터의 공정에서 포유동물 세포주의 2가지 상이한 수행에 대한 포유동물 세포 배양 공정에서 삼투몰농도를 시간(일)의 함수로서 도시한 그래프이다.
도 10은 상이하지만 일반적으로 일정한 수준의 용존 이산화탄소를 갖는 도 8로부터의 공정에서 포유동물 세포주의 2가지 상이한 수행에 대한 포유동물 세포 배양 공정에서 생존 세포의 백분율을 시간(일)의 함수로서 도시한 그래프이다.
도 11은 상이하지만 일반적으로 일정한 수준의 용존 이산화탄소를 갖는 도 8로부터의 공정에서 포유동물 세포주의 2가지 상이한 수행에 대한 포유동물 세포 배양 공정에서 생물학적 생성물 수율 또는 역가를 시간(일)의 함수로서 도시한 그래프이다.
도 12는 표준 수행과 비교하여 본 발명의 동적 기체 조절 (DGC) 공정을 사용한 2가지 상이한 수행에 대한 포유동물 세포 배양 공정에서 용존 이산화탄소를 시간(일)의 함수로서 도시한 그래프이다.
도 13은 표준 수행과 비교하여 본 발명의 동적 기체 조절 (DGC) 공정을 사용한 2가지 상이한 수행에 대한 포유동물 세포 배양 공정에서 세포 생존률을 시간(일)의 함수로서 도시한 그래프이다.
도 14는 표준 수행과 비교하여 본 발명의 동적 기체 조절 (DGC) 공정을 사용한 2가지 상이한 수행에 대한 포유동물 세포 배양 공정에서 생존 세포 밀도를 시간(일)의 함수로서 도시한 그래프이다.
도 15는 표준 수행과 비교하여 본 발명의 동적 기체 조절 (DGC) 공정을 사용한 2가지 상이한 수행에 대한 포유동물 세포 배양 공정에서 생물학적 생성물 수율 또는 역가를 시간(일)의 함수로서 도시한 그래프이다.
도 16은 다양한 수준의 삼투몰농도를 사용한 세포 배양 공정에서 피크 dCO2에 대한 IgG 역가의 추세를 도시한 차트이다.
도 17은 낮은 수준의 용존 이산화탄소를 사용한 DGC 유형 세포 배양 공정에서 최대 삼투몰농도에 대한 IgG 역가의 추세를 도시한 차트이다.
도 18은 삼투몰농도와 용존 이산화탄소의 다양한 조합으로 다양한 세포 배양 공정 수행 동안 수집된 데이터를 제공하는 표이다.
도 19a는 본 발명의 동적 기체 조절 (DGC) 공정을 사용한 제1 샘플 수행 동안 생물반응기에서 세포 배양 배지의 상부 표면 위 상부 공간에서 산소 함유 스위프 기체의 부피 유량 및 생물반응기에 배치된 상향 유동 임펠러의 회전 속도에 대한 조정을 도시한 그래프이다.
도 19b는 본 발명의 동적 기체 조절 (DGC) 공정을 사용한 제2 샘플 수행 동안 생물반응기에서 세포 배양 배지의 상부 표면 위 상부 공간에서 산소 함유 스위프 기체의 부피 유량 및 생물반응기에 배치된 상향 유동 임펠러의 회전 속도에 대한 조정을 도시한 또다른 그래프이다.
용존 이산화탄소, pH 및 삼투몰농도의 관계
대부분의 상업적 규모의 포유동물 세포 배양 제법을 유가식 공정으로 바꾸면, 비교적 일정한 삼투몰농도, pH 및 용존 이산화탄소 수준을 유지하기 위한 조절이 거의 불가능하다. 유가식 공정 동안 영양소 및 세포 부스터(booster)의 첨가는 항상 세포 배양 삼투몰농도를 증가시키는 경향이 있을 것이며, pH 및 용존 이산화탄소 수준은 공정 전체에 걸쳐 끊임없이 변할 것이다.
예를 들어, 지수증식기 동안 생성된 이산화탄소는 대부분의 기존 생물반응기의 이산화탄소 스트리핑 능력을 능가하여 용존 이산화탄소 수준을 계속 증가시킬 수 있다. 세포 배양 배지의 pH의 조절은 임의의 포유동물 세포 배양 공정에서 관리되어야 하는 가장 중요한 파라미터 중 하나로 간주되기 때문에, 용존 이산화탄소 수준의 이러한 계속된 상승은 pH에 대한 용존 이산화탄소의 효과를 중화시키기 위하여 종종 알칼리성 물질의 첨가를 필요로 한다. 용존 이산화탄소의 증가 및 알칼리성 물질의 첨가는 모두 세포 배양 배지 또는 용액의 삼투몰농도를 더 증가시킨다. 요컨대, 세포 배양 배지 또는 용액에서 pH, 삼투몰농도 및 용존 이산화탄소 수준은 모두 밀접하게 상호 관련되어 있다. 다수의 당업자들은 최저 수준의 용존 이산화탄소 및 삼투몰농도가 포유동물 세포 배양 공정의 최상의 작동 조건을 제공할 것으로 믿고 있다. 그러나, 최근의 연구 및 본원에 개시된 몇가지 실험 데이터는 그와 다르게 최적의 수준의 용존 이산화탄소 및 최적의 삼투몰농도가 여전히 각각의 별도의 포유동물 세포주 및 세포 배양 공정에 대해 결정될 필요가 있다고 제안한다.
이산화탄소가 포유동물 세포 배양 배지에 용해될 때, 세포 성장에 필수적인 이온인 HCO3 -를 형성한다. 용존 이산화탄소는 HCO3 - 이온과 평형을 이루기 때문에, pH는 저하된다. HCO3 -에 대한 필요성은 그의 완충 작용과 상관없지만, 이산화탄소, HCO3 - 및 pH가 친밀하게 상호 관련이 있기 때문에, 세포 성장에 대한 용존 이산화탄소의 최적 수준 및 직접적 효과를 한정하기가 어렵다. 세포를 개방 용기에서 인큐베이션할 경우, 95％의 공기와 5％의 이산화탄소의 기체 혼합물이 전형적으로 사용된다. 이산화탄소의 농도는 원래 폐의 폐포 공간에서 발견되는 것을 기초로 선택되었다. 이러한 이산화탄소의 농도는 폐 섬유아세포에 대한 연구를 위한 것이지만, 이제 포유동물 세포 배양 공정에서 전형적인 이산화탄소 농도가 되었다.
기체 상 이산화탄소 장력은 온도의 함수로서 용존 이산화탄소의 농도를 직접 조절할 것이다. 이러한 조절은 하기 반응식 1에 따라 해리되는 H2CO3를 생성한다:
<반응식 1>
Figure pat00001
HCO3 -는 꽤 낮은 해리 상수를 가져서 단지 낮은 농도의 수소 이온만을 생성하여, 단지 용액의 pH를 약간 저하시킬 수 있다. 대기중 이산화탄소의 증가의 최종 결과는 상기 반응식 1에서 나타낸 일련의 평형을 오른쪽으로 이동시켜 pH를 저하시킨다. 고정된 pH를 유지시키기 위하여, 중탄산나트륨과 같은 알칼리성 물질을 사용하여 상승된 이산화탄소 장력의 효과를 중화시킨다:
<반응식 2>
Figure pat00002
증가된 HCO3 - 농도는 더 높은 용존 이산화탄소 수준의 효과에 대응하여 중탄산염 시스템에 대해 pH 7.4에서 평형이 확립될 수 있을 때까지 상기 반응식 1에서 평형을 왼쪽으로 이동시킨다.
요약하면, 개방 용기 중 세포 배양물은 배지 중 중탄산나트륨과 평형 상태의 농도의 이산화탄소의 분위기에서 인큐베이션될 필요가 있다. 밀봉된 플라스크에서 적당히 높은 농도 (1 x 105 세포/ml)로 증식한 세포는 이산화탄소가 기체 상에 첨가될 필요가 없되, 단 중탄산염 농도는, 특히 세포가 높은 산 생성체일 경우, 낮게 (약 4 mM) 유지되어야 한다. 그러나, (예를 들어, 클로닝 또는 접종 동안) 낮은 세포 농도에서 일부 초대 배양물의 경우, 밀봉된 플라스크의 기체 상으로 이산화탄소를 첨가할 필요가 있다. 이산화탄소의 평형화 또는 그의 배출 (고 산 생성체로서)을 허용하기 위하여 통풍이 필요할 경우, 뚜껑을 느슨하게 하거나, 이산화탄소-투과성 뚜껑을 사용할 필요가 있다. 다수의 인큐베이터는 95％의 공기와 5％의 이산화탄소의 혼합물로 퍼징된다.
잘 조절된 생물반응기에서, 이산화탄소는 적어도 초기에 배지의 pH를 적절한 값으로 조정하기 위하여 필요할 것이다. 인큐베이터 중 작은 용기에서 성장한 접종물을 중화시키기 위하여 추가의 이산화탄소가 필요할 것이며, 이는 이러한 인큐베이터가 생물반응기 설정점보다 더 높은 pH를 갖는 경향이 있기 때문이다. 이산화탄소를 사용한 이러한 초기 pH 조정은 출발 배치의 삼투몰농도를 상승시킬 것이다.
배치 공정에서 배양된 세포가 지수증식기에 도달하면, 최대 대사 활성이 되고, 각각의 세포는 그의 최대 이산화탄소 산출량을 생성한다. 세포 밀도가 낮을 경우, 대부분의 이산화탄소는 브로스를 공기로 스파징하거나 생물반응기의 상부 공간을 커버 기체 또는 공기로 스위핑함으로써 제거될 수 있다. 그러나, 배치 사이클로의 며칠 동안 이산화탄소 발생은 전형적인 생물반응기의 표준 이산화탄소 제거 능력을 초과할 것이다. 세포에 의해 발생된 과량의 이산화탄소는 용존 이산화탄소 수준을 증가시키고, 용액 pH를 감소시킬 것이다. 바람직한 pH를 유지하기 위하여, 추가의 염기가 첨가되어야 하며, 이는 과량의 용존 이산화탄소 및 바람직하지 않은 높은 삼투몰농도를 초래한다.
이산화탄소 발생과 스트리핑 속도의 불균형으로 인한 준최적 조건은 더 큰 크기의 생물반응기로의 규모 증가와 함께 더 심해진다. 먼저, 통상적인 생물반응기의 크기가 증가할수록 표면적 대 부피 비가 감소한다. 반응기 부피에 대한 동일한 커버 기체의 경우, 액체 표면에서 이산화탄소 제거 효과가 크게 감소된다. 바람직한 이산화탄소 스트리핑 시스템 및 방법의 예는 미국 가특허 출원 일련 번호 제61/086665호에 개시되어 있다.
포유동물 세포 배양물에서 pH 최적화
포유동물 세포 배양 공정에서 pH 설정점은 세포 배양 성능에 상당한 영향을 미칠 수 있다. 세포 배양 배지 pH는 다수의 포유동물 세포 유형의 세포내 효소 활성에 영향을 미치는 것으로 알려져 있다. pH의 저하는 특정 글루코스 소비 및 락테이트 생산 속도를 감소시켜 글루코스 고갈 위험 또는 락테이트의 독성 수준을 감소시킨다. 전형적인 포유동물 세포 배양물에서 pH 설정점의 하한은 약 7.0이고; 약 6.8 미만의 pH는 세포 성장을 억제시키는 것으로 공지되어 있다. 또한, 중간 또는 적당한 pH 값은 포유동물 세포의 특정 성장 속도 및 특정 생성 속도에 영향을 미쳐 궁극적으로 전체적인 배양물 생산성에 영향을 미치는 것으로 공지되어 있다. 매우 낮은 또는 매우 높은 pH는 세포를 사멸시킬 수 있다.
약 7.0 내지 7.4의 pH 범위가 포유동물 세포 배양 공정에 일반적으로 사용된다. 공정 동안, 예를 들어, 배지가 보충될 때 종종 일어나는 pH의 넓은 변동은 세포에 불리한 영향을 미친다. 높은 세포 밀도 (>1x106 세포/ml)가 통상적으로 달성되기 때문에, 포유동물 세포 배양 공정에서 pH의 조절은 오늘날 특히 중요하다. 적절한 pH 조절없이, 세포가 너무 집중될 경우 세포 배양 브로스는 급격하게 산성이 될 수 있다.
여러가지 유형의 포유동물 세포는 성장을 위한 여러가지 최적의 pH를 가질 수 있다. 일반적으로 인간 섬유아세포는 확립 세포 (pH 7.0 내지 7.4)보다 높은 pH (7.6 내지 7.8)에서 성장하며, 7.2 내지 7.4의 pH에서 초대 세포를 배양하는 것이 일반적이다. 인간 포피 섬유아세포(예를 들어, FS-4)의 성장을 위한 최적의 pH는 인간 폐 섬유아세포 (예를 들어, MRC-5)의 성장을 위한 최적의 pH보다 더 알칼리성이다. 이러한 세포를 성장기 동안 약 105 세포/ml 이하의 밀도로 배양할 경우, pH는 FS-4 세포의 경우 약 7.7 내지 7.8이고, MRC-5 세포의 경우 약 7.5 내지 7.6이어야 한다. CHO 세포의 경우, 부착 동안 약 7.0의 pH에서 세포를 배양시키는 것이 일반적으로 유리하다. 몇시간 후, CHO 세포 배양 공정에서 pH는 약간 더 높은 값으로 증가할 수 있다.
세포 배양 브로스를 약 7.0 이상의 pH로 유지시키면 용존 이산화탄소 수준을 조절하기 위한 노력에 대해 또다른 문제가 생긴다. 이산화탄소는 물과 반응할 수 있기 때문에, 4가지 형태 CO2, H2CO3, HCO3 - 및 CO3 2- 중 어느 것으로 액체 상에 존재할 수 있다.
상기 반응식 1에서와 같은 평형 관계는 약 5.0 이하의 pH에서 거의 모든 용존 이산화탄소가 CO2 형태라는 것을 지시하였다. 약 7.0 내지 9.0의 pH에서, 중탄산 이온이 탄소의 우세한 형태이다. 마지막으로, 약 11.0 이상의 pH에서는 거의 모두 탄산 이온이다. 대부분의 포유동물 세포 배양물의 pH는 일반적으로 약 pH 7.0 내지 pH 7.4로 조절되기 때문에, pH가 훨씬 더 낮을 수 있는 미생물 발효 공정과 비교했을 때 이산화탄소 제거가 일반적으로 더 어렵다.
약 7.0 내지 7.4의 pH에서 세포 배양 브로스로부터 용존 이산화탄소를 제거하기 위하여, 제한 단계는 화학적 또는 물리적일 수 있다. 단지 용존 이산화탄소 분자만이 기체-액체 계면을 가로질러 운반되기 때문에, 중탄산 이온은 재결합되어 이산화탄소 분자를 형성한다. 상기 반응식 1을 2개의 부분으로 분리하면, 하기 반응식 3 및 4로 기재된 역반응은 일반적으로 빠른 반면, 반응식 5로 나타낸 반응의 제1 부분은 훨씬 더 느리다.
<반응식 3>
Figure pat00003
<반응식 4>
Figure pat00004
<반응식 5>
Figure pat00005
(여기서, k1 = 20 s-1 및 k-1 = 0.03 s-1)
pH가 실질적으로 pH 7.0 내지 pH 7.4 범위 밖에 있을 경우 다수의 유형의 포유동물 세포가 사멸하기 때문에 pH의 조절은 중요한 작동 조건이다. 기존 세포 배양 공정 조절에 고유한 제한과 함께, 주요 표적은 pH 조절이며, 용존 이산화탄소/중탄산 이온 수준 및 삼투몰농도는 배양 사이클 동안 대개 조절되지 않으며 크게 변한다. 일정한 pH, 용존 이산화탄소 및 삼투몰농도를 동시에 유지시키는 것에 대한 이점을 증명하는 몇개의 데이터가 이용가능하다.
배양 배지는 2세트의 세포 성장 조건, 즉 (1) 이산화탄소가 대기중으로 사라져서 pH를 상승시킬 수 있는 작은 개구부의 용기 (예를 들어, 인큐베이터 내부) 및 (2) 높은 세포 농도에 의한 이산화탄소 및 락트산의 최대 생산이 pH를 저하시킬 경우 생물반응기에서 완충되어야 한다. 완충제를 배지에 도입시켜 pH를 안정화시킬 수 있지만, 배지로부터 용존 이산화탄소 및 중탄산 이온의 총 손실을 방지하기 위하여 특히 낮은 세포 농도에서 일부 세포주에 의해 추가의 기체 이산화탄소가 여전히 요구된다.
생리학적 pH에서 불량한 완충 능력에도 불구하고, 중탄산염 완충제는 그의 낮은 독성, 낮은 비용 및 배양물에 대한 영양학적 이점으로 인하여, 임의의 다른 완충제보다 여전히 더 빈번하게 사용된다. 따라서, pH의 조절에 있어서 이산화탄소의 역할은 높은 세포 수율 및 높은 세포 생존률을 위하여 조건을 최적화할 때 여전히 고려되어야 할 가장 중요한 측면이다.
또다른 알칼리성 물질 (예를 들어, NaOH)을 대신 사용할 경우, 최종 결과는 중탄산염과 유사하다:
<반응식 6>
Figure pat00006
다수의 세포 배양 배지 성분이 산 용액에서 제조되고, 완충제를 포함할 수 있기 때문에, 상기 반응식 6에서와 같이 다른 염기가 또한 중탄산 이온 수준에 간접적 으로 기여할 경우, 얼마나 많은 중탄산염이 사용될 지를 예상하는 것은 어렵다.
굳 완충제(Good's buffer) (예를 들어, HEPES, 트리신(Tricine))를 조직 배양물에 도입할 경우, 이산화탄소가 pH를 안정화시키는데 더이상 필요하지 않을 것이고, 따라서 생략될 수 있을 것이라는 추측이 존재한다. 이러한 추측은 특히 낮은 세포 농도에서 적어도 다수의 포유동물 세포 유형에 대해 사실이 아닌 것으로 입증되었다. 20 mM HEPES는 pH를 표준 생리학적 범위내에서 조절하는 것으로 나타났지만, 대기중 이산화탄소의 부재는 반응식 1을 왼쪽으로 이동하게 하여 결국 용존 이산화탄소 및 궁극적으로 HCO3 -를 세포 배양 배지로부터 제거한다. 이러한 일련의 사건은, 제한된 세포 성장이 용존 이산화탄소의 결핍 또는 HCO3 -의 결핍 또는 둘다의 결과인지의 여부는 명확하지 않지만, 세포 성장을 제한하는 것으로 보인다.
또다른 예는 완충을 위해 또는 pH의 조절을 위해 이산화탄소를 사용하지 않는 레이보비츠(Leibovitz) L-15 세포 배양 배지이다. 저 장력의 이산화탄소가 요구될 때 레이보비츠 L-15 세포 배양 배지를 사용하는 것이 바람직하다. 레이보비츠 L-15는 고 농도의 나트륨 피루베이트 (550 mg/L)를 함유하지만, NaHCO3가 부족하고, 기체 상 중 이산화탄소를 필요로 하지 않는다. 배지 중 피루베이트의 포함은 포유동물 세포가 그의 이산화탄소 생산을 증가시킬 수 있게 하여, 외부에서 공급된 이산화탄소 뿐만 아니라, HCO3 -와 독립적이도록 만들 수 있다. 레이보비츠 L-15 세포 배양 배지에서 완충은 비교적 높은 아미노산 농도를 통해 달성된다. 그러나, 세포 배양 배지로부터 중탄산염의 제거는 상기한 굳 완충제에서 알 수 있는 바와 같이, 세포 성장에 유사한 부정적인 영향을 미친다. 이러한 유형의 완충제 시스템은 낮은 세포 밀도를 갖는 작은 개방 접시에 대해서는 잘 작용할 수 있지만, 높은 세포 밀도의 생물반응기에서는 매우 불리할 것이다.
현재, 대부분의 세포 배양 배지는 CO2/HCO3 - 완충제 시스템을 사용하지만, 그의 능력은 소형 배치 공정에서 세포 배양 사이클의 말엽 쯤에 pH의 감소를 방지하기에 종종 충분하지 않다.
생물반응기 중 대규모 포유동물 세포 배양물에서, pH의 작은 변화는 HCO3를 첨가하거나, 이산화탄소 장력을 증가시킴으로써 조절될 수 있다. NaOH 또는 HCl의 첨가는 큰 변화를 조절할 것이지만, 강염기 또는 강산의 첨가로 인해 국소 세포 손상이 초래될 수 있다. 대규모 시스템에 의해 제공되는 끊임없는 모니터링 및 조절 기회는 HEPES가 높은 세포 수율을 위해 더이상 필수적이지 않다는 것을 의미한다. 또한, 세포 배양물의 pH는 새로운 배지로 보충될 때 조절될 수 있다. pH 조절을 위해 완충제를 첨가할 경우, 세포 배양 배지의 삼투몰농도를 유의하게 변화시키지 않도록 주의하여야 한다.
배지 삼투몰농도는 세포-배양 생산성에 상당한 영향을 미친다. 배지의 삼투몰농도 증가는 특정 세포 성장 속도를 감소시키고, 특정 생산 속도를 증가시키는 것으로 나타났다. 초기 배지 삼투몰농도는 배지 제제로부터 예상될 수 있다. 배지 성분들 사이의 상호작용의 양은 전형적으로 삼투몰농도를 각각의 성분의 기여의 합과 상당히 차이나도록 만들지 않는다. 전형적인 배지의 성분에 대한 개별 삼투몰농도는 하기 표에 나타나있다.
Figure pat00007
배양물 중 세포의 성장 및 기능은 배지 중 적절한 삼투몰농도의 유지에 따라 달라진다. 일부 세포 (예를 들어, HeLa 및 다른 확립 세포주)는 삼투몰농도의 광범위한 변동을 견딜 수 있다. 반면, 초대 세포 및 정상 이배체(diploid) 균주는 삼투몰농도의 변화에 매우 민감하며, 좁은 범위내에서 유지될 경우에만 높은 수율이 얻어질 수 있다.
삼투몰농도의 조절은 더 재현성있는 배양물을 제공하는 것으로 보고되어 있다. 특정 배양 배지의 공급원이 변할때마다 삼투몰농도를 확인하여야 한다. 상업적 공급원에 의해 제조된 세포 배양 배지의 삼투몰농도는, 아마도 원래 제제의 해석의 차이로 인하여, 상이할 수 있다. 그러나, 고 수율 배양물은 종종 배양 사이클 동안 배지로의 다양한 첨가를 필요로 한다. 이것은 완충제 (HEPES), 산 (HCl), 염기 (NaOH), 성장 호르몬 및 영양소를 포함할 수 있다. 삼투몰농도를 상승시킬 필요가 있을 경우, NaCl이 첨가될 수 있으며, 특정 삼투몰농도를 달성하기 위하여 필요한 정확한 양은 다음과 같이 계산된다:
예를 들어: 1 mg NaCl/ml = 1 ml 스톡(stock) (mOsm) = 32 mOsm 증가.
<반응식 7>
Figure pat00008
상기 식에서,
Dosm = 목적하는 삼투몰농도 (mOsm)
Mosm = 측정된 삼투몰농도 (mOsm); 및
X = 배지 1 ml 당 첨가된 NaCl (mOsm)의 스톡 ml.
배지의 삼투몰농도는 측정되며, 목적하는 삼투몰농도를 달성하기 위하여 첨가되어야 하는 스톡 NaCl (1 mg/ml)의 양은 계산된다. 어는점 내림에 의한 삼투몰농도의 측정은, 배지 중 영양소를 희석하거나, 큰 부피의 완충제 또는 식염수를 첨가하는 것을 필요로 하지 않기 때문에 가장 실용적인 방법이다. 증기압 내림은 삼투몰농도를 측정하는 또다른 대중적인 방법이다.
pH 조절
포유동물 세포 배양물에서 pH를 유지하기 위한 가장 일반적인 절차는 중탄산나트륨/이산화탄소, 즉 생물반응기에서 pH 변동에 대해 매우 우수한 보호를 제공하는 알맞은 완충제를 사용하는 것이다. 그러나, 용존 이산화탄소에 대한 중탄산염의 농도비가 급속한 산-염기 평형에 의해 설정되기 때문에 중탄산염 수준은 세포 배양 사이클의 개시시의 평형 용존 이산화탄소 수준을 나타낸다. 생물반응기 중 pH는 이후에 중탄산염 또는 이산화탄소의 추가의 첨가로 조절된다. 예를 들어, 세포 배양 공정에 의한 락트산 발생은 중탄산 이온이 이산화탄소로 부분적으로 분해될 경우 약 7.0의 pH가 얻어질 때까지 추가의 중탄산염 첨가를 촉구할 것이다. 세포 배양 공정 동안 세포에 의해 발생된 암모니아는 추가의 이산화탄소 첨가를 촉구할 것이다. 중탄산염 또는 이산화탄소의 계속적인 첨가는 전형적으로 세포 배양 배지에서 과도한 삼투몰농도 뿐만 아니라, 세포 배양 공정 동안 용존 이산화탄소 수준의 계속적인 변동을 초래한다.
포유동물 세포 배양 공정에서 pH를 조절하기 위한 본원에 개시된 시스템 및 방법은 소정의 세포 배양 배지를 위한 목적하는 pH 범위 및 목적하는 수준의 용존 이산화탄소를 규명하고; 초기에 최소량의 중탄산염을 제공하여 세포 배양 배지의 pH를 조정하여 목적하는 pH 범위내에 속하게 하고, 세포 배양 배지내에 목적하는 수준의 용존 이산화탄소를 생성하는 것을 포함한다. 본 발명자들은 용존 이산화탄소 수준과 중탄산염 수준 사이의 이러한 초기 평형이 최종 세포 생존률 및 생성물 수준 및 수율에 상당한 영향을 미친다는 것을 발견하였다. 충분한 중탄산나트륨을 배지에 첨가한 후, 용존 이산화탄소의 평형이 단지 낮은 수준, 10％ 미만, 보다 바람직하게는 약 5％ 미만에서 달성되도록 충분히 접종시킨다.
이후에, pH를 소정 범위내에서 유지시키기 위하여 필요한 만큼 수산화나트륨을 첨가함으로써 pH를 유지시켜 중탄산염의 추가의 증가 및 용존 이산화탄소의 관련 증가를 방지한다. 수산화나트륨 (강염기) 또한, 삼투몰농도의 상당한 증가없이 pH를 소정 범위내에서 유지시키고, 용존 이산화탄소의 수준을 소정 수준에서 또는 그 근처에서 비교적 안정하게 유지시킨다.
세포 배양 공정을 향상시키기 위한 용존 이산화탄소 수준의 조절
일부 선행 기술의 문헌은 세포 배양 용액 중 용존 수준 이산화탄소의 수준이 세포 배양 공정의 지수증식기 또는 생산기 동안 특정 성장 속도 및 세포 밀도에 거의 또는 전혀 영향을 미치지 않는다고 제안하고 있다. 이러한 선행 기술 대부분의 실험은 기체를 사용한 스파징 속도의 증가가 추가의 이산화탄소를 이동시키기 위한 유일한 수단인 통상적인 교반 탱크 생물반응기에서 수행되었다. 거품형성 및 전단으로 인한 세포의 사멸 속도는 이산화탄소 제거의 이점을 가릴 것이다.
본 발명의 시스템 및 방법은 지수증식기의 개시 및 그 동안 모두에 걸쳐 세포 배양 배지 중 용존 이산화탄소 수준의 엄격한 조절을 제공하여 생산기 동안 세포 생존률에 이로운 효과를 제공한다. 따라서, 축적 생성물 수율은 또한 성장기 동안 세포의 소정 수준의 용존 이산화탄소로의 노출에 의해 영향 받는다. 본원에 기재된 바와 같이, 다양한 시험 수행 또는 시험 배치는 지수증식기 동안 용존 이산화탄소의 수준의 엄격한 제어가 생산기 동안 더 높은 축적 생성물 수율을 제공하고, 또한 생산기 동안 더 느린 분해 또는 세포 생존률의 감소를 초래한다는 것을 증명한다.
생물반응기 용기 상부 공간 중 기체와 액체/용액에 용해된 기체 사이의 교환은 세포 배양 용액의 표면에서 일어난다. 이것에 의한 이산화탄소의 제거는 세포에 대한 전단 및 버블 손상을 최소화하고, 거품형성을 감소 또는 제거하기 때문에 스파징된 기체를 통한 스트리핑에 비해 매력적이다. 그러나, 상업적 규모의 생물반응기에서 표면 기체 교환은 현재 이산화탄소 제거에 이용되지 않는데, 이는 현재의 방법 조건하에서는 실용성을 갖기에 너무 제한적이기 때문이다. 이것은 전형적인 통상적인 생물반응기 용기의 제한된 표면 대 부피 비 및 현재 교반기 디자인에 의해 얻어지는 배양물 표면 재생의 느린 속도의 직접적인 결과이다. 이러한 문제는 크고 좁은 형상을 갖는 생물반응기에서 더 악화된다.
상업적 규모의 생물반응기에서 표면 기체 교환의 또다른 단점은 회전 축 교반기의 사용과 함께 발생된다. 이것은 표면 액체가 원으로 소용돌이치게 하며 용기내에서 더 깊은 용액이 그것을 대체하는 경향이 작다. 이것은 표면 기체 교환에 영향을 미치는 적어도 2가지 결과를 갖는다: 첫째, 표면 액체 층은 용존 이산화탄소가 신속하게 고갈되어 후속 CO2 제거를 위한 상부 공간으로의 구동력을 저하시키고; 둘째, 생물 반응기의 하부로부터의 액체 (여기서, 용존 CO2의 농도는 대부분 이 영역에서 더 높은 정력학 압력으로 인한 것임)는 그것이 상부 공간에 용존 기체를 공여할 수 있는 표면으로 단지 드물게 이동된다. 전체적인 효과는 용존 CO2의 제거가 느리고, 생물반응기에서 표면에서의 매우 낮은 것에서 하부에서의 높은 것으로 용존 CO2 농도의 구배가 존재하여 세포 생산성 및 생존률을 감소시키는 수준에 쉽게 도달할 수 있다는 것이다.
용존 CO2 제거를 조절하기 위한 본 발명의 방법은 생물반응기 용기에 배치된 흡출관내에 배치된 상향 유동 임펠러를 갖는 생물반응기 시스템을 사용한다. 상향 펌핑 임펠러는 생물반응기 용기 외부의 모터에 의해 샤프트(shaft)를 통해 구동된다. 임펠러의 상향 유동은 고도로 조절가능한 방식으로 표면 기체 교환을 향상시키는 상부 표면 재생 방법을 제공한다. 상향 펌핑 임펠러는 세포 배양 배지 및 현탁된 포유동물 세포를 생물반응기 용기의 하부로부터 반응기의 상부 부분의 액체/상부 공간 기체 계면으로 이동시킨다. 이렇게 하여, 세포 배양 용액 또는 배지 중 용존 이산화탄소는 계속해서 신속하게 생물반응기 중 액체의 표면으로 제공되어 기체-액체 교환이 일어난다. 표면 액체에서 높은 턴오버(turnover)는 상부 공간에 대한 용존 이산화탄소의 신속한 제거를 허용한다. 상향 유동 임펠러는 포유동물 세포를 손상 또는 사멸시키기에 충분한 전단을 생성하지 않고 높은 펌핑 속도를 허용한다. 산소, 질소, 공기, 이산화탄소 또는 다른 적합한 기체 및 이들의 혼합물로 이루어진 스위핑 기체를 생물반응기 용기 중 상부 공간으로 도입하여 용액의 상부 표면과 상호작용시켜 목적하는 액체 기체 교환을 달성하고, 이후에 생물반응기 용기 중 상부 공간으로부터 배출시킨다.
또한, 바람직한 생물반응기 시스템은 pH 센서, dCO2 센서, 온도 지시기, 용존 산소 분석기 및 배출 기체 분석기를 비롯한 복수의 센서 및 분석기를 포함할 수 있다. 이러한 센서 및 분석기는 입력으로서 생물반응기 용기로의 산소, 질소 및 이산화탄소의 기체 공급을 조절 또는 조정하는 시스템 조절기 (도시되지 않음)와 커플링된다. 또한, 시스템은 배출 서브시스템, 복수의 생물학적 필터 뿐만 아니라, 필요할 경우 생물반응기 용기를 물 및 스팀으로 살균하는 수단을 포함할 수 있다.
상향 펌핑 임펠러는 바람직하게는 주요 생물반응기 용기의 중간 근처에 위치하여 하부 액체 배지 또는 용액 출발 수준에 대해 침지된다. 임펠러 속도는 조정가능하며, 특정 포유동물 세포 배양 공정에 대해 항상 목적하는 수준의 용존 이산화탄소를 유지하도록 세포 배양 공정 전체에 걸쳐 변할 수 있다. 바람직하게는, 임펠러 속도는 생물반응기 용기내의 액체 또는 용액 수준이 낮을 경우 매우 낮은 속도로 유지되고, 액체 또는 용액 수준이 상승하면 증가하여야 한다. 바람직하게는, 흡출관이 부가되어 상향 유동 속도를 증가시켜 높은 기체 교환 속도를 초래한다. 생물반응기 용기 중 액체 또는 용액 수준이 또한 최고일 경우, 임펠러 속도는 바람직하게는 세포 배양 공정의 지수증식기의 말엽 동안 최고이다. 일반적으로, 표면 기체 교환은 이용가능한 표면적이 매우 제한적이기 때문에 비효율적인 방법이다. 상부 공간과 액체 표면 사이에 일어나는 임의의 기체 교환은 기체/액체 계면의 어느 측면 상 기체 농도를 포화 수준으로 신속하게 접근하게 할 것이다. 계면에서 적절한 농도 구동력없이, 수단이 기체 교환에 이용가능한 표면적을 크게 증가시키지 않는다면 표면 에어레이션은 비실용적이다. 불행하게도, 이러한 수단 (예를 들어, 일부 액체의 분무화)은 연약한 포유동물 세포를 손상시키거나 사멸시키는 과도한 전단을 생성한다. 그러나, 동적 기체 조절 공정은 상부 공간 기체를 신속하게 스위핑하여 기체 상 경계 층에서 이산화탄소 구축을 방지함으로써 이러한 한계를 극복한다. 또한, 액체 상 경계 층의 한계는 침지된 임펠러의 상향 펌핑 작용에 의해 제거된다.
임펠러의 상부에 부가된 다수의 수직 배플(baffle)이 기체 교환 속도를 매우 크게 개선시키는 것으로 관찰되었다. 이러한 수직 배플은 회전 속도를 실질적으로 순수한 수직 배향 유동으로 변형시킨다. 액체 표면을 통한 용존 CO2 제거 속도에 대한 흡출관과 수직 배플의 효과를 비교하기 위하여, 본 발명에 기재된 방법을 사용하여 300 L 용기에서 이산화탄소 제거 시험을 수행하였다. 용기 중 용액은 7의 pH에서 유지하고, 상부 공간은 공기로 스위핑하였다. 나선형 임펠러를 주파수 변환기를 사용하여 2개의 상이한 속도에서 작동하도록 설정하였다. 실험 동안 계속해서 용존 CO2 수준을 측정하였다. 결과를 표 1에 부피 물질 전달 계수 (KLa)와 관련하여 보고하였다.
Figure pat00009
상향 유동 나선형 임펠러의 속도에 따라, 결과는 흡출관과 배플이 사용될 경우, 물질 전달 계수가 226％ 내지 678％ 개선되었음을 보여주었다. 이러한 실험에서 표면 기체 교환 현상에 대한 수직 배플의 중요성을 보여주기 위하여 추가의 시험을 수행하고, 나선형 임펠러를 수직 배플이 제거된 300 L 용기의 하부에 설치하였다. 본 발명의 실험 작업으로부터, 표면 액체의 소용돌이 운동을 제거하는 것이 중요하다고 결론내렸다 (표 2 참조). 표면에서 소용돌이 운동을 제거함으로써, 임펠러로부터 상향 유동 액체는 튀지 않고 임펠러 샤프트로부터 신속하게 나오고, 용기의 전표면을 가로질러 확산되어 용기의 연부 근처에서 액체의 본체로 재침지되어 롤링 표면 현상을 생성한다. 수직 배플이 설치되면, 이산화탄소 제거 속도는 상향 유동 나선형 임펠러의 회전 속도에 따라 28％ 내지 128％ 개선되었다. 이러한 실험 결과는 생물반응기의 하부 부분으로부터의 액체가 표면 액체로 신속하게 대체되어 실질적으로 높은 속도의 용존 이산화탄소 제거 및 세포 배양 배지로서의 산소 용해가 초래된다는 것을 보여준다. 수직 배플 없이, 소용돌이치는 표면 액체는 생물반응기내에서 더 깊은 곳의 새로운 액체로 유의하게 대체되지 않는다.
Figure pat00010
상기 논의된 바와 같이, 대형 생물반응기 용기의 하부에서 액체 또는 용액은 상당한 정력학 압력에 노출되고, 포유동물 세포 내부에 트랩된 용존 이산화탄소는 평형화가 느려질 것이다. 현재 개시된 상향 펌핑 임펠러는 이러한 문제를 완화시킨다. 액체 용액 및 포유동물 세포를 생물반응기 용기의 하부로부터 상향로 상부 표면으로 재순환시킴으로써, 포유동물 세포를 낮은 총괄적 평균 정력학 압력 범위에 노출시키고, 따라서 용존 이산화탄소의 우수한 평형 수준을 달성한다. 세포 배양 배지 또는 용액의 연속 축 또는 상향 재순환은 포유동물 세포에 다양한 수준의 정력학 압력을 제공하여 세포가 세포의 플라즈마 내부 깊은 곳의 과량의 용존 이산화탄소를 방출하는 능력을 향상시키는 것으로 생각된다.
생물반응기에 편향 벽 또는 분할기가 없기 때문에, 상향 유동 액체는 매우 신속하게 상부 표면에 도달한 후, 생물반응기 벽을 향해 외부로 롤링할 수 있다. 이것은 액체 표면의 매우 신속한 재생을 제공하여 용존 이산화탄소의 신속한 제거를 촉진한다. 임펠러의 또다른 형태를 사용하여 흡출관과 함께 또는 흡출관 없이 상향 재순환 유동을 제공할 수 있다. 바람직하게는, 상향 펌핑 임펠러는 스크류 임펠러 또는 프로펠러이다. 그러나, 프로펠러로부터의 측방향 또는 방사형 유동이 최소화되어 전단 및 포유동물 세포에 대한 다른 손상을 감소시킬 있는 한, 다른 프로펠러 또한 사용될 수 있다.
신속한 기체-액체 표면 재생 또한 기체를 액체에 용해시키는데 유용하다. 예를 들어, 본원에 개시된 기체-액체 표면 재생 방법을 사용하여 세포를 성장시키는데 필요한 소정량의 산소를 용해시킬 수 있다. 산소에 대한 요구가 높을 경우, 상부 공간에서 스위핑 기체 중 산소 조성을 증가시켜 산소의 재순환 액체의 상부 표면으로의 전달을 증가시킨다. 산소 용해 요구량이 낮을 경우, 상부 공간에서 스위핑 기체 중 산소 조성을 감소시키고, 공기 또는 질소로 대체시킨다. 스위핑 기체의 산소 조성 변화는 이산화탄소 제거 속도에 영향을 거의 또는 전혀 미치지 않는다. 용존 산소 농도는 바람직하게는 다수의 포유동물 세포 배양 공정에서 약 50％로 유지된다. 바이러스 감염된 sf-9 곤충 세포 배양물로부터 재조합 단백질 생산과 같은 일부 경우에, 매우 낮은 산소 농도 (예를 들어, 5％ 미만의 산소 농도)가 세포 배양 용액에 사용되어 세포에 의한 단백질 생산을 향상시킨다.
용존 이산화탄소 수준을 임의의 목적하는 수준으로 조정 또는 유지시킬 수 있다. 세포 배양 공정 동안 임의의 시간에 용존 이산화탄소 수준을 감소시키기 위하여, 생물반응기의 상부 공간으로 향하는 스위핑 기체의 유량을 증가시켜 표면 근처의 액체로부터 CO2를 매우 신속하게 제거할 수 있다. 또한, 임펠러 회전 속도를 증가시켜 표면 액체 재생 속도를 증가시킬 수 있다. 용존 이산화탄소 수준을 증가시키기 위하여, 스위핑 기체 유량을 감소시키고/거나 상향 펌핑 임펠러의 회전 속도를 감소시킬 것이다. 예를 들어, 생산 생물반응기의 접종 직후 공정의 초기 단계에서의 경우와 같이, 추가의 이산화탄소가 필요할 경우, 필요에 따라 상부 공간 중 스위핑 기체 혼합물에 첨가될 수 있다. 전형적인 포유동물 세포 배양 공정에서, 용존 산소 요구량은, 배치가 초기 지체기에서 지수증식기의 말엽으로 진행할수록 증가하는 한편, 세포 호흡으로 인한 용존 이산화탄소 농도 증가는 지수증식기의 말엽 쯤에 최대 농도에 도달하고, 그 후 생산기 동안 점진적으로 감소된다. 따라서, 기체 이산화탄소를 주로 지체기 동안 첨가하여 pH를 조절하고 유지시킨다. 또한, 용존 산소의 일부 소정 수준은 세포 생산기 동안 유지될 필요가 있다.
스위핑 기체 혼합물 중 질소, 산소 및 이산화탄소 농도를 독립적으로 조정 또는 조절하는 것 이외에, 총 상부 공간 기체 유동을 증가시키는 것은 또한, 상부 공간에서 스트리핑된 기체의 축적을 방지할 것이다.
바람직한 실시양태에서, 질소, 산소 및 이산화탄소의 생물반응기 용기로의 기체 공급물은 바람직하게는 생물반응기 용기에서 액체 용액의 롤링 표면에 밀접하게 인접한 상부 공간 중 액체의 상부 표면 위에 도입한다. 이러한 기체 도입은 생물반응기 용기 중 액체 수준이 상승하면 상부 표면에 또는 그 근처에 항상 기체를 주입하도록 기체 주입기를 이동가능하게 함으로써 이루어질 수 있다. 롤링 상부 표면에서 기체의 충돌은 기체 측 상 운동량 경계 층을 감소시키고, 액체와 기체 사이의 총 물질 전달 속도를 개선시킨다. 별법으로, 기체 공급물은 생물반응기 용기에서 도달될 최대 액체 높이 근처의 위치에서 기체를 도입하도록 배치된 고정된 기체 주입기를 사용하여 전달될 수 있다. 대부분의 포유동물 세포 배양 공정에서, 생물반응기 용기 중 최대 액체 높이는 dCO2의 제거가 가장 필요한 지수증식기의 피크 동안 일어난다.
바람직하지는 않지만, (배지 pH의 초기 조정을 위한) 공기, 산소 및 이산화탄소의 기체 공급물의 생물반응기 용기로의 제어된 도입은 생물반응기 용기내에 배치된 하나 이상의 스파저를 사용하여 용액내에 기체를 스파징함으로써 보충될 수 있다. 산소를 용해시키기 위하여 사용된 스파저는, 액체 표면을 파괴시키기 전에 용해 또는 흡수되고, 유량의 제공이 작은 소형 산소 버블을 발생시키는 미세한 노즐 (또는 홀(hole))을 가질 수 있다. 스파저는 생물반응기의 하부에서 기체 버블을 발생시키도록 디자인되어 (pH 조정을 위해) 산소 또는 이산화탄소를 용해시키기에 효과적이다. 그러나, 스파저는 스트리핑된 이산화탄소가 신속하게 기체 버블을 포화시키거나 기체-액체 계면에서 농도 구동력을 특히 낮은 유량으로 감소시킬 수 있기 때문에 용존 이산화탄소의 스트리핑에 있어서 열악하다. 높은 유량에서, 전단 위반 및 거품 형성은 세포를 사멸시킬 것이다. 이러한 침지된 기체 스파저는 상부 공간 기체 교환 방법과 조합된 산소의 독립적 첨가를 보조할 수 있다. 용존 이산화탄소의 제거를 보조하기 위하여 스파저를 사용하는 것은 그다지 바람직하지 않지만, 높은 세포 밀도 동안 소량의 순수한 산소를 용해시키는데 사용될 수 있다. 사용될 경우, 기체 스파저는 바람직하게는 상향 유동 임펠러로부터 떨어져서 배치되어 세포 배양 배지 중 그의 체류 시간을 최대화한다. 소량의 순수한 산소가 액체 표면 상 기체 교환의 상부에서 필요할 경우, 산소 버블은 이러한 특정 경우에 상당한 손상을 유발시키지 않을 것이다. 또한, 임펠러의 전단 작용에 의한 것이 아니라, 단지 스파징에 의해 발생된 기체 버블은 임펠러로 직접 주입되는 것보다 훨씬 더 큰 경향이 있으며, 거품 형성 가능성이 크게 감소된다. 이제 기체 교환은 액체의 표면과 벌크 둘다에서 일어난다. 짧은 시간 동안 작은 부피의 기체를 간헐적으로 스파징하면 스위핑 기체의 매우 높은 유동에 의존하지 않고 또는 급속한 임펠러 속도를 사용하지 않고 산소 흡수가 최대가 될 수 있게 한다. 이러한 스파징은 단지 산소 용해 및 이산화탄소의 제거를 위한 피크 요구량에서만 수행하여 세포 손상을 최소화하는 것이 중요하다. 또한, 이러한 스파징은 dCO2의 스트리핑을 보조할 수 있지만, 영향 또는 기여가 세포 배양 수행 동안 크지 않은 것으로 보였다.
바람직한 상향 펌핑 장치는 최소 방사형 유동으로 큰 부피의 액체를 상향로 이동시킬 수 있는 나선형 임펠러이다. 나선형 임펠러를 사용하여 시뮬레이션된 브로스로부터 이산화탄소 제거 속도를 측정하고, 부피 물질 계수로서 보고하였다. 물질 전달 계수가 클수록, 기체 교환 효율이 우수하다. 상향 펌핑 임펠러를 사용하여도, 이동하는 액체 스트림은 교반기의 회전에 의해 회전될 것이다. 그 결과, 표면 액체는 소용돌이치게 되어 표면 액체가 표면의 평면에서 회전하므로 액체 표면 재생이 크게 감소될 것이다. 소용돌이를 중단시키기 위하여, 수직 배플 시스템이 또한 임펠러의 상부에 사용되어 액체의 회전을 중단시키고, 유동을 직접적으로 표면으로 다시 향하게 한다. 따라서, 표면 액체는 용기의 중심에서 샤프트로부터 밖으로 방사상으로 퍼져서, 용기의 연부를 향해 확산 및 박화되어 침지된다. 그 결과, 표면 기체 교환 및 이산화탄소 스트리핑이 크게 개선된다.
도 1, 2a, 2b, 2c, 3a, 3b 및 3c로 돌아와서, 세포 배양 용액의 삼투몰농도가 중간 값(즉, 436 내지 553 mOsm/kg)에서 유지되는 포유동물 세포 배양 공정의 3가지 상이한 수행에 대한 시험 데이터가 그래프 형태로 도시되어 있다. 시험된 3가지 샘플 중에서, 본원에 개시된 동적 기체 조절 (DGC) 기술을 도입한 DGC8로 표시한 샘플 중 하나는 공정 전체에 걸쳐 약 4％에서 유지되는 용존 이산화탄소의 수준을 가지며, 5일째에 약 5.7％의 용존 이산화탄소로 소량 증가하였다. 제2 샘플 (수행 32로 표시됨)은 약 12％의 용존 이산화탄소의 출발 수준을 갖고, 이후에 성장기의 초기 단계에서 약 6％로 감소한 다음, 용존 이산화탄소의 수준은 약 15％의 최대값으로 증가하였다. 이어서, 용존 이산화탄소의 수준은 생산기에서 약 10％로 점진적으로 감소하였다. 제3 샘플 (수행 40으로 표시됨)은 지체기 동안 약 6％ 내지 10％의 용존 이산화탄소의 출발 수준을 갖고, 세포 배양 공정의 4 내지 11일에 걸쳐 약 5％에서 약 44％ 범위의 높은 수준의 용존 이산화탄소 수준의 가변성을 갖는다.
도 2a에서 보여지는 바와 같이, DGC8은 포유동물 세포 배양 공정의 생산기 동안 수행 30보다 더 높은 생존 세포 밀도 (MC/ml) 및 수행 40보다 상당히 더 높은 생존 세포 밀도를 유지하였다. 도 2b 및 2c의 데이터는 도 2a와 비교할 때 본원에 개시된 DGC 기술과 관련된 이점을 나타내는 기준 수행에 대한 유사한 그래프를 도시한다.
유사하게, 도 3a에서 보여지는 바와 같이, DGC8은 수행 30의 생성물 수율 및 수행 40의 상응하는 생성물 수율보다 더 큰 IgG의 생성물 수율 (mg/l)을 유지하였다. 또한, 낮은 dCO2를 갖는 DGC8의 특정 생산성 (pg/생존 세포 .일)이 상당히 증가되었다. 샘플 공정에 대한 특정 생산성은 각각 약 40 pg/생존 세포-일 (DGC8), 20 pg/생존 세포-일 (수행 32) 및 16 pg/생존 세포-일 (수행 40)이었다. 도 1, 2a, 2b, 2c 및 3a 중 DGC8 데이터에 의해 증명되는 바와 같이, 세포 배양 공정에 걸쳐 안정하고 낮은 수준의 용존 이산화탄소의 유지는 세포 생존률을 향상시키고, 생성물 수율 및 특정 생산성을 증가시킨다.
도 3b 및 3c는 DGC8 수행 뿐만 아니라, 수행 32에서 측정된 삼투몰농도 수준을 나타낸다. 예상되는 바와 같이, 삼투몰농도 수준은 영양소를 유가식 포유동물 세포 배양 공정에 첨가할 때마다 실질적으로 증가한다. 그러나, 도 3b 및 3c의 삼투몰농도 수준을 비교할 때, DGC 공정이 사용될 경우, 영양소 첨가 직후에 삼투몰농도 수준의 감소 또는 조정이 관찰된다. 구체적으로, 수행 DGC8에 대한 출발 삼투몰농도 수준은 370 mOsm/kg이고, 이후에 성장기 및 생산기에서는 약 363 mOsm/kg 내지 475 mOsm/kg의 최대 삼투몰농도 수준 범위이다. 이러한 특정 세포주에 대한 삼투몰농도의 총 상승은 약 112 mOsm/kg으로 제한되었다. 반면, 수행 32에서 삼투몰농도 수준은 약 350 mOsm/kg의 출발점에서 약 511 mOsm/kg의 최대 삼투몰농도 수준으로 세포 배양 공정의 성장기 및 생산기에 걸쳐 계속 상승하며, 이는 161 mOsm/kg의 상승 또는 수행 DGC8보다 약 35％ 더 상승한 것을 나타낸다.
이제 도 4 내지 6을 참조하면, 포유동물 세포 배양 공정의 2가지 추가의 시험 수행의 특징 및 결과를 도시한 그래프가 나타나 있다. 여기서 보여지는 바와 같이, 샘플 수행은 세포 배양 배지의 일반적으로 일정한 또는 안정한 수준의 용존 이산화탄소 및 중간 삼투몰농도를 유지하였다. 구체적으로, 도 4에서 보여지는 바와 같이, 수행 50은 세포 배양 공정의 지수증식기 및 생산기 동안 약 13％ 내지 18％의 중간 수준의 용존 이산화탄소를 유지한 반면, 수행 55는 세포 배양 공정의 지수증식기 및 생산기 동안 약 2％ 내지 6％의 낮은 수준의 용존 이산화탄소를 유지하였다. 도 5에서 보여지는 바와 같이, 일반적으로 안정하지만 낮은 수준의 용존 이산화탄소 및 중간 삼투몰농도를 갖는 샘플 수행 55는, 일반적으로 안정하지만 중간 수준의 용존 이산화탄소 및 중간 삼투몰농도를 갖는 수행 50보다 생산기 동안 더 높은 세포 생존률을 나타내었다. 도 6에서 보여지는 바와 같이, 일반적으로 안정하지만 낮은 수준의 용존 이산화탄소 및 중간 삼투몰농도를 갖는 샘플 수행 55는, 일반적으로 안정하지만 중간 수준의 용존 이산화탄소 및 중간 삼투몰농도를 갖는 수행 50보다 생산기 동안 더 높은 생성물 수율을 나타내었다. 이러한 차트의 결과는 세포 배양 공정에 걸쳐 안정하고 낮은 수준의 용존 이산화탄소를 유지하는 것이 세포 생존률을 향상시키고, 생성물 수율 및 특정 생산성을 증가시킨다는 도 1 내지 3으로부터 유도된 결과를 추가로 확인하였다.
포유동물 세포 배양물 중 용존 이산화탄소 수준의 영향
다시 도 1을 참조하면, DGC8은 수행 32의 개시시 중간 dCO2 수준과 비교하여 수행 초기에 낮은 dCO2 수준을 나타낸다. 세포 지수증식기의 피크에서 2가지 수행의 dCO2는 5.7％로 거의 동일하였다. 그러나, 도 3a는 수행 DGC8 동안 생성된 단백질 생성물 IgG가 수행 32 동안 생성된 단백질 생성물 IgG보다 거의 2배 더 많다는 것을 보여준다. 이것은 IgG 생성물의 초기 수집물을 갖기 원할 경우, 낮은 수준의 출발 dCO2 및 생산기까지 동일한 낮은 dCO2 수준 유지가 또한 중요하다는 것을 제안한다. 낮은 출발 dCO2 수준을 발생하기 위하여, 약 7.0의 pH에서 완충된 용액을 생성하기 위하여 첨가될 적절한 양의 중탄산나트륨과 화학적 평형 상태의 dCO2 수준을 계산하는 것이 필요하다. 물론, DGC 공정 동안 표면 기체 교환은 세포 배양물의 지수증식 동안 발생된 임의의 CO2를 스트리핑한다. 배치의 개시 후, pH 조절은 이후에 산-염기 (예를 들어, 염산-수산화나트륨) 시스템으로 스위칭시켜 세포 배양 배지내에서 pH 수준을 유지 또는 감소시키기 위한 임의의 추가의 CO2의 첨가의 필요성을 방지한다. 대부분의 세포 배양 공정은 세포 배양 공정이 개시되면 배치 사이클 동안 하나의 완충제 시스템에서 또다른 완충제 시스템으로 스위칭되지 않는다는 것에 주의한다.
이제 도 7 내지 11로 돌아와서, 2가지 추가의 포유동물 세포 배양 공정 수행으로부터 수득된 샘플 데이터가 도시되어 있다. 도 7은 지체기 및 지수증식기 동안 약 5％의 낮은 수준의 용존 이산화탄소를 갖는 수행 62 및 세포 배양 공정의 지체기 및 지수증식기 동안 약 10％의 중간 수준의 용존 이산화탄소를 갖는 수행 63의 성장기 및 생산기 동안 용존 이산화탄소 수준을 도시한다. 수행 62와 수행 63 둘다에서, 용존 이산화탄소 수준은 세포 배양 공정이 생산기로 들어간 지 6일 후에 인위적으로 평균 30％로 상승시켰다. 추가의 이산화탄소 기체를 상부 공간에 첨가하는 동안, 상부 공간에 대한 기체 유량 및 교반 속도를 감소시켜 스트리핑 속도를 저하시켰다. 수행 62 및 수행 63의 목적은 단지 생산기 동안만 세포에 대한 용존 이산화탄소의 영향을 시험하는 것이었다. 용존 이산화탄소 수준이 세포 배양 공정에 걸쳐 정확하게 제어되는 수행 DGC8과 비교하여 수행 62와 수행 63 모두로부터 더 낮은 세포 생존률 및 단백질 생성물 IgG 수율이 예상되었다.
도 8 및 도 10은 수행 62와 수행 63 모두에 대한 생존 세포 밀도 및 세포 생존률％이 성장기 동안과 거의 동일하다는 것을 보여준다. 그러나, 성장기 동안 낮은 수준의 용존 이산화탄소를 갖는 수행 62는, 성장기 동안 중간 수준의 용존 이산화탄소를 갖는 수행 63보다 생산기 동안 더 높은 정도의 세포 생존률을 나타내었다. 따라서, 수행 62의 세포는 성장기 동안 낮은 수준의 용존 이산화탄소에 노출되고, 성장기 동안 높은 수준의 용존 이산화탄소에 노출된 수행 63의 세포보다 더 건강하였다.
도 11은 초기의 낮은 수준의 용존 이산화탄소를 갖는 샘플 수행 62가 또한 837 mg/L의 IgG 생성물 수율을 갖는 중간 수준의 용존 이산화탄소를 갖는 수행 63보다 생산기 동안 1,140 mg/L의 더 높은 IgG 생성물 수율을 나타낸다는 것을 보여준다. 용존 이산화탄소 수준이 과도하게 45％로 스파이킹(spiking)되지 않았다면 수행 62는 더 잘 수행될 수 있었을 것이다. 이러한 2가지 수행은 용존 이산화탄소가 세포 배양 공정으로부터 IgG 단백질 생성물 수율에 영향을 미친다는 것을 제안한다. 수행 62 및 63을 용존 이산화탄소 수준의 스파이크가 생산기 동안 도입되지 않은 도 3에 도시된 DGC8과 비교하면, DGC8의 IgG 단백질 생성물 수율이 생산기 동안 높은 용존 이산화탄소 수준을 겪은 수행 62의 것의 2배 이상이다. 명확하게, 성장기 및/또는 생산기에서 용존 이산화탄소 수준의 영향은 세포 생존률 및 생성물 수율에 대해 상이한 효과를 갖는다.
용존 이산화탄소 수준 및 삼투몰농도의 최적화
본원에 개시된 시스템 및 방법은, 지체기 및 지수증식기 동안 약 300 내지 560 mOsmo/kg, 보다 바람직하게는 약 400 내지 500 mOsmo/kg의 중간 수준 삼투몰농도를 유지하면서, 바람직하게는 지체기 및 지수증식기 동안 10％ 미만, 보다 바람직하게는 약 3％ 내지 5％의 일반적으로 일정한 또는 안정한 수준의 용존 이산화탄소를 유지한다 (도 1 및 4 참조). 이러한 조합된 용존 이산화탄소 수준과 삼투몰농도의 공정 조건은 소정의 포유동물 세포 배양 공정에 대한 생산기 동안 더 긴 세포 생존률 및 최고의 생물학적 생성물 수율을 제공한다 (도 2, 3, 5 및 6 참조).
배치 세포 배양 공정에서, 삼투몰농도의 변화는 비교적 작다. 출발 용존 이산화탄소의 화학적 평형 상태 계산과 유사하게, 출발 삼투몰농도는 출발 배지 용액 중 모든 성분으로부터 계산되어야 한다. 통상적인 배치 공정에서, 물질대사 세포 집단으로부터 이산화탄소가 발생되고, 중탄산나트륨이 pH를 재균형화하기 위해 첨가되어야 할 경우 삼투몰농도는 증가할 것이다.
유가식 공정의 경우, 또한, 삼투몰농도는, 성장 및 생산을 연장시키기 위하여 영양소가 간헐적 단계로 첨가되기 때문에 단계 변화를 나타낼 것이다. 상기 논의된 바와 같이, 각각의 g-몰의 염 또는 전해질을 2개의 g-몰의 삼투몰농도로 용해시킬 것이다. 각각의 g-몰의 글루코스, 글루타메이트 및 다른 유기 영양소는 1 g-몰이 총 삼투몰농도에 기여할 것이다. 도 6A는 본 발명의 동적 기체 조절 (DGC) 공정 기술을 사용한 양호한 배양 수행의 전형적인 프로필로서 DGC8의 삼투몰농도 프로필을 나타낸다. 큰 단계 증가는 영양소 첨가의 시간으로 인한 것이다. 각각의 영양소 첨가 후, 삼투몰농도는 실제로 글루코스 및 글루타메이트가 소모됨에 따라 감소하였다. 그러나, 통상적인 유가식 공정에서, 삼투몰농도는 세포 배양 공정 사이클 동안 추가의 영양소가 소정 시간에 브로스로 첨가될 때마다 더 큰 단계 증가를 취할 것이다. pH 및 작동 조건에 따라, 소모되는 글루코스는 락테이트로 전환되어 시스템 삼투몰농도에서 최종적인 변화를 초래하지 않을 수 있다. 그러나, 글루코스는 또한 이산화탄소 기체 및 물로 직접 전환될 수 있다. 본 발명의 DGC 공정 기술을 사용하여 이산화탄소 기체가 효과적으로 스트리핑될 경우, 삼투몰농도의 일시적인 감소가 관찰된다. 그렇지 않을 경우, 세포 배양 배지 중 삼투몰농도 수준은 용존 이산화탄소에 의해 강하된 pH를 중화시키기 위하여 필요한 알칼리성 물질 또는 중탄산염의 첨가로 인해 계속 증가한다.
도 6A에 도시된 바와 같이, DGC8은 유가 사이클 동안 각각의 영양소 첨가 후에 삼투몰농도를 감소 또는 유지시키는 본 발명의 능력을 명확하게 증명하였다. 삼투몰농도 수준을 최소의 또는 바람직한 범위내로 유지시킴으로써, 추가의 염 및/또는 영양소를 첨가하여 삼투몰농도 수준을 바람직한 최적의 프로필 또는 범위로 조정할 수 있다. 포유동물 세포는 생존 및 절도를 위하여 특정 전해질 및 영양소를 필요로 하기 때문에 최적의 삼투몰농도 수준은 최저 삼투몰농도를 필요로 하지 않는다. 그러나, 과도한 용존 이산화탄소로 인한 pH 조정으로부터 연속적인 제공없이, 삼투몰농도 수준의 최적화가 가능하다.
가장 바람직한 삼투몰농도 범위에서 세포 배양 공정을 조절하기 위하여, 계산 또는 실험에 의해 미리 결정된 출발 삼투몰농도 수준 뿐만 아니라, 각각의 영양소 및/또는 배지 첨가에서 삼투몰농도 수준이 고려될 필요가 있으므로 최종 삼투몰농도 수준이 소정 범위내에 속할 수 있다. 상기 논의된 바와 같이, 축적된 이산화탄소를 제거하기 위한 효과적인 용존 이산화탄소 제거 또는 스트리핑 공정 또한 삼투몰농도 수준에 영향을 미친다. 용존 이산화탄소와 삼투몰농도 모두를 소정 수준으로 조절함으로써, 상당한 생성물 수율 및 생성물 순도 개선이 실현될 수 있다.
도 7 및 9는 삼투몰농도의 증가 및 생성물 수율의 감소에 대한 높은 용존 이산화탄소의 효과를 나타낸다. 수행 62 및 수행 63에 대한 전체 성장기 동안, 5％ 내지 10％ 범위의 용존 이산화탄소는 어느 수행의 삼투몰농도 수준에도 큰 영향을 미치지 않았다. 약 350 mOsmo/kg에서 약 400 mOsmo/Kg으로의 삼투몰농도 수준의 증가는 주로 배지 및 영양소 첨가에 의한 것이었다. 생산기의 초기에, 용존 이산화탄소 농도는 상승되고, dCO2 스트리핑 속도는 감소되었다. 도 9에 도시된 바와 같이, 삼투몰농도 수준은 세포에 의해 생성된 과량의 이산화탄소의 존재로 인하여 pH 조절기에 의해 자동으로 주입되는 중탄산나트륨과 함께 급격하게 증가하였다. 도 6A에 도시된 수행 DGC8의 삼투몰농도 수준과 달리, 수행 63의 삼투몰농도 수준은 약 600 mOsmo/kg으로 계속 증가한 반면, 고 피크 용존 이산화탄소를 갖는 수행 62는 약 680 mOsmo/kg으로 훨씬 더 증가하였다. 생산기에서 고 용존 이산화탄소 농도 및 비제어된 삼투몰농도를 가질 경우, 수행 62와 수행 63 모두 동적 기체 조절 공정을 사용한 완전 제어된 DGC8 (2,300 mg/L)보다 훨씬 더 낮은 IgG 생성물 수율 (각각 1,140 mg/L 및 837 mg/L)을 갖는다.
이제 도 12 내지 17로 돌아와서, 동적 기체 조절 (DGC) 공정을 사용하지 않는 세포 배양 공정과 비교하여 동적 기체 조절 (DGC) 공정을 사용하는 세포 배양 공정을 비교하는 데이터를 함유하는 차트가 도시되어 있다. 도시된 차트 상 데이터는 중간 삼투몰농도에서 동적 기체 조절 (DGC) 공정을 사용하는 샘플 수행, 즉 샘플 DGC2 및 DGC3이 DGC 조절을 사용하지 않는 공정 (예를 들어, 수행 32)보다 훨씬 더 높은 생성물 수율을 제공한다는 것을 시사한다.
샘플 공정 DGC2에서, 용존 이산화탄소는 약 8.45％에서 출발하고, 이후에 나머지 세포 배양 공정에 걸쳐 약 7.0％ 내지 7.5％ 범위에서 유지되었다. 샘플 공정 DGC3에서, 용존 이산화탄소는 약 5.5％에서 출발하고, 1일 및 2일 동안 약 5.5％ 내지 6.3％ 범위에서 유지된 후, 3일 및 4일째에 약 4.5％로 감소되고, 4일 내지 15일에 약 4.0％로 더 감소되었다. 마지막으로, 수행 32는 평균 dCO2가 성장기에서 약 6％로 유지된 다음, dCO2가 약 15％로 증가된 후, 생산기에서 약 10％로 점진적으로 저하되는 매우 전형적인 세포 배양 공정의 용존 이산화탄소 프로필을 가졌다.
도 12 내지 17에 함유된 데이터는 용존 이산화탄소 수준이 동적 기체 조절 (DGC) 공정을 사용한 공정을 통해 목적하는 낮은 수준에서 잘 유지될 수 있다는 것을 보여준다. DGC2와 DGC3 샘플 수행 모두는 단백질 생산의 후기 단계 동안 더 높은 생존 세포 밀도 및 생존률을 가졌다. 가장 낮은 제어된 용존 이산화탄소 수준을 갖는 샘플 수행 DGC3은 이러한 3가지 수행 중에서 가장 높은 생성물 역가를 갖고, DGC2 또는 수행 32보다 훨씬 더 초기에 최대 생성물 역가에 도달하였다.
생성물 수율을 개선시키는 배치 시간의 단축 방법
생산기 동안, 영양소가 고갈되고 다른 부산물 및 폐기물, 예컨대 암모니아 및 락테이트가 독성 수준에 이를 경우 세포는 사멸하기 시작한다. 예를 들어, 글루코스의 수크로스로의 단순 대체는 락테이트 생산을 감소시킴으로써 독성 수준의 개시 및 결과적인 세포 사멸의 유도를 지연시킬 수 있다. 세포 사멸의 개시의 지연은 전체적인 세포 생존률을 개선시키고, 더 높은 생성물 수율을 허용한다. 결국, 세포는 사멸할 것이다. 사멸 세포는 전형적으로 부패되고, 프로테아제 및 다른 바람직하지 않은 효소를 방출한다. 이러한 프로테아제는 생존 세포를 죽이고, 심지어 이미 형성된 단백질 생성물을 분해시킬 수 있다. 재조합 단백질을 생성하는 포유동물 세포 배양 공정은 사멸 세포로부터 방출된 프로테아제에 특히 민감하다. 따라서, 재조합 단백질을 생성하는 방법은 일반적으로 세포 생존률이 90％ 미만으로 상당히 저하되기 직전에 중단된다.
다시 도 13 및 도 15로 돌아와서, 수행 32는 생물반응기 중 세포 배양 배지의 상부 표면에서 표면 기체 교환을 촉진시키지 않는 잘 작동된 통상적인 포유동물 세포 배양 공정을 나타낸다. 수행 32와 관련된 배치는 세포 생존률이 40％ 미만으로 저하될 때까지 12일 동안 작동하였다. 수집시, 생성물 수율은 1,250 mg/L이었다. 목적하는 90％ 세포 생존률에서 수행 32를 수집하기 위하여, 배치 시간은 7일로 단축되어야 하며, 생성물 수율은 단지 생성물 650 mg/L이었다. 반면, 표면 기체 교환을 포함하는 본 발명의 동적 기체 조절 공정을 사용한 DGC3은 심지어 성장기 동안에도 훨씬 더 초기에 생성물을 생성하기 시작하였다. 배치가 66％의 세포 생존률을 갖는 12일 째에 수집되었다면, DGC3은 생성물 2,060 mg/L를 생성하였을 것이다. 90％의 세포 생존률에서 7일째에 DGC를 수집하기 위하여, 수율은 생성물 1,050 mg/L로 감소되었다. 생물약제학적 관점으로부터, 높은 생성물 순도를 갖는 단축 처리 시간은 일부 세포주에 대해 상당한 필적할 만한 장점을 제공할 수 있다. 따라서, 본원에 개시된 동적 기체 조절 공정의 사용은, 등가 배치 시간 및 동일한 영양소 함량의 통상적인 세포 배양 공정과 비교하여, 생물약제학적 생산자가 고순도 생성물의 제조 또는 단백질 생성물의 수율의 실질적인 증가를 위하여 단축 세포 배양 공정 사이클을 선택할 수 있게 할 것이다.
동적 기체 조절 (DGC) 공정의 최적화
도 18은 삼투몰농도와 피크 용존 이산화탄소의 다양한 조합에서 다양한 샘플 수행 동안 수집된 세포 배양 공정 데이터를 제공하는 표이다. 도 16은 다양한 피크 이산화탄소 수준을 갖지만, 단지 중간 삼투몰농도를 갖는 표로부터의 소정의 데이터의 플롯이다. 여기서 보여지는 바와 같이, 약 5％ 이하의 최저 피크 용존 이산화탄소 수준은 최고 생성물 수율을 제공한다. 인간 혈류 중 생리학적 이산화탄소는 또한 약 5 내지 6％임을 주의한다. 도 17은 다양한 삼투몰농도 수준을 갖지만, 단지 중간 피크 용존 이산화탄소 수준을 갖는 또다른 세트의 데이터의 플롯이다. 도 17은 이러한 특정 세포주에 대하여 최적의 최대 삼투몰농도 수준이 약 500 mOsmo/kg에 존재한다는 것을 예시한다.
본 발명의 DGC 시스템 및 방법은 또한 생산기 동안 포유동물 세포 배양 배치를 물로 희석하고, 또한, 생산기 동안 소정량의 추가의 영양소를 첨가하는 동안 10％ 미만, 보다 바람직하게는 약 5％ 이하의 낮은 수준의 용존 이산화탄소의 유지를 제공한다. 이러한 희석 및 영양소 보충 절차는 더 높은 포유동물 세포 배양 생물반응기 생성물 수율을 제공하고, 또한 일부 중요한 독성 폐기물 구축을 희석하는 것으로 보인다.
상기 공정 최적화 기술 중 3가지 모두는 단독으로 또는 조합하여, pH, 용존 산소 수준, 온도, 압력, 배지 중 영양소 및 폐기물 생성물 프로필, 교반, 기체 스파징, 영양소 공급 및 생성물 수집의 이미 인식된 공정 파라미터 이외에 용존 이산화탄소의 수준 및 삼투몰농도를 비롯한 복수의 중요한 공정 파라미터를 조절함으로써 전형적인 포유동물 세포 배양 생물반응기 생성물 순도 및 생성물 수율을 향상시킨다.
공정 수율에 대한 상기한 파라미터의 영향은 제공된 세포주에 대해 소규모 생물반응기에서 축소 조건하에 또는 완전한 상업적 생물반응기 규모에서 초기에 확립된다. 상업적 생산에 적합한 세포 배양 배지에서 용존 이산화탄소, 삼투몰농도, pH, 용존 산소, 온도 뿐만 아니라, 영양소 및 생성물 수준의 최적 수준 또는 범위를 확립한 후에, DGC 공정은 상부 공간에서 교반 프로필 및 기체 유동에 대한 엄격한 조절이 이러한 최적 조건을 달성할 수 있게 한다.
광범위하게 기술하면, 본 발명의 최적화 및 조절 방법은 (a) 방법 최적화 단계; 및 (b) 활성 조절 단계를 포함한다. 방법 최적화 단계는 제공된 포유동물 세포 배양 공정, 세포주 및 생물반응기 배열에 대해 목적하는 pH 삼투몰농도 및 용존 이산화탄소 수준을 실험적으로 결정하는 것을 포함한다. 표적화된 출발 삼투몰농도 수준 및 용존 이산화탄소 수준을 바탕으로, 생물반응기 배지는 완충제로서 적절한 양의 중탄산염을 사용하여 제조된다. 이러한 초기에 제조된 배지는 일반적으로 알칼리성 쪽의 pH를 가질 것이다. 용액의 pH는 세포 배양 배지의 개시 또는 제조 동안 이산화탄소 기체의 도입에 의해 목적하는 수준으로 조정된다. 목적하는 pH 수준에 도달되면, 세포 배양 공정 사이클의 나머지 부분 동안 이산화탄소 기체를 끄고, pH 조절을 산-염기 유형 pH 조절 시스템으로 스위칭시킨다. 그러나, 동적 기체 조절 공정이 사용될 경우, pH의 조절을 위한 산 또는 염기의 첨가가 거의 필요하지 않다.
활성 조절 단계는 마이크로프로세서를 바탕으로 하는 조절기를 사용하여 오버레이(overlay) 기체 조성, 오버레이 기체 유량, pH (산 첨가, 염기 첨가), 영양소 첨가 등을 위한 초기 설정 뿐만 아니라, 허용가능한 값 또는 범위를 확립하여, pH를 목적하는 설정점내에 유지시키고, 용존 산소 수준, 교반기 속도, 온도, 압력, 영양소 함량, 폐기물 생성물 함량 등과 같은 다른 공정 파라미터 중 하나 이상을 사양(specification)내에 유지시키면서 생물반응기에서 목적하는 용존 이산화탄소 및 삼투몰농도를 달성한다. 표면 기체를 갖는 세포 배양 생물반응기와 관련된 개별 기체 또는 기체 혼합물을 산소의 첨가 및 이산화탄소의 제거를 위해 교환한다. 보충 기체 스파징을 사용하여 세포 배양 공정의 성장기 동안 추가의 산소를 공급하고, 세포 배양 배지의 제조 동안 이산화탄소를 이용하여 pH를 조정할 수 있다. 제공된 포유동물 세포 배양 공정에 대한 목적하는 pH, 삼투몰농도 및 용존 이산화탄소 수준의 실험적 측정은 바람직하게는 축소 방법 조건을 수행하는 실험실 규모 생물반응기에서 수행되며, 적절한 모델을 바탕으로 하는 연구로 보충될 수 있다.
DGC 공정의 활성 조절 단계는 마이크로프로세서를 바탕으로 하는 조절기에 대한 입력으로서 사용된 복수의 파라미터를 모니터링 또는 측정하는 것을 포함한다. 이러한 입력은 용존 이산화탄소 수준, 삼투몰농도 수준 및 pH 수준 뿐만 아니라, 용존 산소 수준, 온도 및 교반 속도의 전형적인 입력을 포함한다. 이러한 입력을 세포 배양 공정의 생산기 및 성장기에 걸쳐 일정한 간격 또는 연속적인 원칙으로 조절기에 공급한다. 마이크로프로세서를 바탕으로 하는 조절기는 이러한 입력을 수용하고, 상부 공간 기체 조성, 상부 공간 기체 유량, 교반기 속도, 산 첨가, 염기 첨가 또는 영양소 첨가의 군으로부터 선택된 하나 이상의 파라미터의 값 및 설정을 나타내는 하나 이상의 출력 신호를 생성한다. 출력 신호를 사용하여 상부 공간 기체 조성, 상부 공간 기체 유량, 상향 유동 교반기 속도, 산 첨가, 염기 첨가를 조절 또는 조정하여 용존 이산화탄소 수준, 용존 산소 수준, 삼투몰농도 또는 pH를 소정 세포주에 대해 목적하는 값 또는 소정 범위로 능동적으로 조절 또는 유지시킨다.
잔여 영양소, 액체 부피, 생존 세포 밀도, 생성물 농도 등의 오프라인 측정을 사용하여 공정 설정점을 수동으로 또는 자동으로 조정한다. 필요할 경우, 기체 스파저를 또한 사용하여 간헐적으로 용존 산소 수준을 순수한 산소로 보충할 수 있다. 생산기가 진행될수록, 파라미터의 모니터링 및 측정 및 이러한 파라미터의 상응하는 조정 또는 조절을 세포 배양 공정이 생물반응기에서 완결될 때까지 계속한다.
도 19a 및 19b는 동적 기체 조절 (DCP) 공정을 사용한 포유동물 세포 배양 공정 동안 상향 유동 임펠러 또는 교반기의 회전 속도 및 생물반응기 중 세포 배양 배지의 상부 표면 위 상부공간에서 산소 함유 스위프 기체의 부피 흐름에 대한 전형적인 출력 조정을 나타낸다.
이러한 제안된 공정 조절 계획은 거의 일정한 생리학적 온도 및 또한 저온 세포 배양 공정에 적용가능하다. 저온 세포 배양 공정은 적어도 일부분 동안 전형적인 약 37℃ 공정 온도보다 낮은 온도에서 수행된다. 이러한 제안된 공정 조절 계획은 또한 배치 방식, 유가 방식 또는 연속 방식 작동을 비롯한 임의의 방식으로 작동하는 거의 임의의 배열의 생물반응기에 적용가능하다.
따라서, 상기로부터, 본 발명은 포유동물 세포 배양 공정 동안 용존 이산화탄소 수준, pH 및 삼투몰농도를 조절하기 위한 다양한 방법 및 시스템을 제공하여 세포 생존률 및 생물학적 생성물 수율을 향상시킨다는 것을 인지하여야 한다. 본 발명의 방법 및 시스템의 다양한 개질, 변형 및 변경이 당업자에게 명백할 것이며, 이러한 개질, 변형 및 변경이 본원의 범위내에 포함된다는 것을 이해하여야 한다.

Claims (16)

  1. 생물반응기 중 세포 배양 배지의 상부 표면에서 표면 기체 교환을 통해 용존 이산화탄소를 제거함으로써 포유동물 세포 배양 공정의 성장기 및 생산기에 걸쳐 세포 배양 배지에서 용존 이산화탄소를 약 10％ 미만의 농도의 용존 이산화탄소 수준으로 유지시키는 단계를 포함하며,
    여기서, 세포 배양 배지 중 삼투몰농도는 포유동물 세포 배양 공정 동안 특정 세포에 대한 최적 범위에서 유지되고, 세포 배양 배지의 pH는 포유동물 세포 배양 공정 동안 특정 세포에 대한 최적 범위에서 유지되는, 포유동물 세포 배양 공정에서 생성물 수율의 향상 방법.
  2. 생물반응기 중 포유동물 세포 배양물을 용존 이산화탄소와 평형 상태의 소정 수준의 중탄산염 및 초기 수준의 삼투몰농도를 갖는 세포 배양 배지로 접종시키는 단계;
    포유동물 세포 배양 공정의 성장기 동안 영양소를 세포 배양 배지에 주기적으로 첨가하는 단계;
    포유동물 세포 배양 공정의 성장기 또는 생산기 동안 산 또는 염기를 세포 배양 배지에 주기적으로 첨가하여 pH 수준을 이산화탄소 기체의 첨가없이 포유동물 세포에 대한 소정 범위내로 유지시키는 단계;
    포유동물 세포 배양 공정의 성장기 또는 생산기 동안 생물반응기 중 세포 배양 배지의 상부 표면 위 상부 공간에서 산소 함유 스위프(sweep) 기체의 부피 유량을 조정하여 세포 배양 배지의 상부 표면에서 표면 기체 교환을 촉진시키는 단계; 및
    성장기 또는 생산기 동안 생물반응기에서 세포 배양 배지의 상부 표면 아래에 배치된 상향 유동 임펠러의 회전 속도를 조정하는 단계를 포함하며;
    여기서, 세포 배양 배지 중 용존 이산화탄소는 표면 기체 교환을 통해 이산화탄소를 스트리핑(stripping)함으로써 포유동물 세포 배양 공정의 성장기 또는 생산기에 걸쳐 약 10％ 미만의 농도의 용존 이산화탄소의 안정한 수준에서 유지되고;
    세포 배양 배지 중 삼투몰농도는 포유동물 세포 배양 공정 동안 특정 세포에 대한 최적 범위에서 유지되고;
    유가식(fed-batch) 포유동물 세포 배양 공정의 생성물 수율이 향상되는, 유가식 포유동물 세포 배양 공정에서 생성물 수율의 향상 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 포유동물 세포 배양 공정의 성장기 및 생산기 동안 용존 이산화탄소의 농도가 약 3％ 내지 10％로 안정적인 방법.
  4. 제1항 또는 제2항에 있어서, 유가식 포유동물 세포 배양 공정의 성장기 및 생산기 동안 삼투몰농도의 최적 범위가 약 300 mOsmo/kg 내지 700 mOsmo/kg인 방법.
  5. 제1항에 있어서, 접종 단계 동안 세포 배양 배지가 이산화탄소 및 중탄산나트륨 완충제를 포함하고, 산 또는 염기를 세포 배양 배지에 첨가함으로써 성장기 또는 생산기 동안 세포 배양 배지의 pH를 유지시켜 pH 조정을 위한 추가의 이산화탄소의 첨가를 방지하는 방법.
  6. 제1항 또는 제2항에 있어서, 포유동물 세포 배양 공정이 유가식 공정이고, 세포 배양 배지 중 삼투몰농도가 포유동물 세포 배양 공정의 성장기 동안 영양소의 첨가와 함께 증가하고, 그 직후 세포 배양 배지 중 삼투몰농도가 감소하는 방법.
  7. 제1항 또는 제2항에 있어서, 세포 배양 배지 중 용존 산소의 농도가 생물반응기 중 세포 배양 배지의 상부 표면에서 표면 기체 교환을 통해 특정 세포에 대한 최적의 범위에서 유지되는 방법.
  8. 제7항에 있어서, 성장기 및 생산기 동안 생물반응기 중 세포 배양 배지의 상부 표면 위 상부 공간에서 산소 함유 스위프 기체의 부피 유동을 조정함으로써 세포 배양 배지 중 용존 이산화탄소의 농도 및 용존 산소의 농도가 최적의 범위에서 유지되는 방법.
  9. 제7항에 있어서, 성장기 및 생산기 동안 생물반응기 중 세포 배양 배지의 상부 표면 아래에 배치된 상향 유동 임펠러의 회전 속도를 조정함으로써 세포 배양 배지 중 용존 이산화탄소의 농도 및 용존 산소의 농도가 최적의 범위에서 유지되는 방법.
  10. 제1항 또는 제2항에 있어서, 포유동물 세포 배양 공정이 유가식 공정이고, 성장기의 초기에서 생산기의 말엽까지의 세포 배양 배지 중 삼투몰농도의 상승이 약 300 mOsmol/kg 미만인 방법.
  11. 제1항 또는 제2항에 있어서, 세포 배양 배지의 상부 표면이 실질적으로 거품을 갖지 않는 방법.
  12. 제1항 또는 제2항에 있어서, 세포 배양 배지 중 삼투몰농도가 영양소의 첨가와 함께 증가하고, 그 직후에 세포 배양 배지 중 삼투몰농도가 감소하는 방법.
  13. 접종 단계 동안 이산화탄소 및 중탄산나트륨 완충제를 세포 배양 배지에 제공하여 세포 배양 배지 중 중탄산염과 용존 이산화탄소의 소정 평형 수준 및 삼투몰농도의 초기 수준을 확립하는 단계;
    유가식 포유동물 세포 배양 공정의 성장기 및 생산기 동안 세포 배양 배지로부터 용존 이산화탄소를 스트리핑하는 단계;
    성장기 및 임의로는 생산기 동안 영양소를 세포 배양 배지에 첨가하는 단계; 및
    성장기 및 생산기 동안 산 또는 염기를 세포 배양 배지에 첨가하여 pH 조정을 위한 이산화탄소 기체의 첨가없이 pH 수준을 소정 범위에서 유지시키는 단계를 포함하며,
    여기서, 세포 배양 배지 중 삼투몰농도 수준은 소정 범위에서 유지되고, 성장기의 초기에서 생산기의 말엽까지의 삼투몰농도 수준의 상승은 400 mOsmol/kg 미만이고,
    세포 배양 배지 중 용존 이산화탄소의 농도는 성장기 및 생산기 동안 10％ 이하에서 유지되는, 유가식 포유동물 세포 배양 공정에서 세포 배양 배지의 pH 수준의 조절 방법.
  14. 유가식 포유동물 세포 배양 공정의 생산기 동안 세포 배양 배지를 물로 희석하여 세포 배양 배지 중 폐기물의 독성 효과를 감소시키는 단계;
    유가식 포유동물 세포 배양 공정의 생산기 동안 보충 영양소를 세포 배양 배지에 첨가하여 물의 희석 효과를 보상하는 단계; 및
    유가식 포유동물 세포 배양 공정의 생산기 동안 세포 배양 배지 중 용존 이산화탄소의 농도를 10％ 이하로 유지시키고, 세포 배양 배지 중 삼투몰농도 수준과 pH 수준을 모두 포유동물 세포에 대한 최적 범위내로 유지시키는 단계를 포함하며,
    여기서 유가식 포유동물 세포 배양 공정의 생산기 동안 포유동물 세포의 세포 생존률 연장으로 인하여 단백질 생성물 수율이 증가되는, 유가식 포유동물 세포 배양 공정의 생산기 동안 세포 생존률을 연장시키고 단백질 생성물 수율을 증가시키는 방법.
  15. 생물반응기 중 포유동물 세포 배양물을 용존 이산화탄소와 평형 상태의 소정 수준의 중탄산염 및 초기 수준의 삼투몰농도를 갖는 세포 배양 배지로 접종하는 단계;
    영양소를 세포 배양 배지에 첨가하여 세포 배양 배지의 삼투몰농도 수준을 증가시켜 포유동물 세포로부터 단백질 생산을 촉진시키는 단계;
    산 또는 염기를 세포 배양 배지에 첨가하여 pH 수준을 포유동물 세포를 위한 소정 범위내로 유지시키는 단계;
    유가식 포유동물 세포 배양 공정 전체에 걸쳐 세포 배양 배지로부터 용존 이산화탄소를 스트리핑하는 단계 (여기서, 세포 배양 배지 중 용존 이산화탄소의 농도는 10％ 이하에서 유지되고, 삼투몰농도의 초기 수준으로부터 삼투몰농도 수준의 증가는 400 mOsmol/kg 미만으로 제한됨); 및
    유가식 포유동물 세포 배양 공정의 성장기 또는 초기 생산기 동안 생물반응기로부터 단백질 생성물을 수집하는 단계를 포함하는, 유가식 포유동물 세포 배양 공정으로부터 생성된 단백질 생성물의 순도를 개선시키는 방법.
  16. 접종 단계 동안 이산화탄소 및 중탄산나트륨 완충제를 세포 배양 배지에 제공하여 세포 배양 배지에서 중탄산염과 용존 이산화탄소의 소정 평형 수준 및 삼투몰농도의 초기 수준을 확립하는 단계;
    성장기 동안 영양소를 세포 배양 배지에 첨가하여 세포 배양 배지의 삼투몰농도 수준을 증가시키는 단계;
    성장기 동안 산 또는 염기를 세포 배양 배지에 첨가하여 pH 수준을 소정 범위에서 유지시키는 단계;
    유가식 포유동물 세포 배양 공정의 성장기 동안 세포 배양 배지로부터 용존 이산화탄소를 스트리핑하는 단계를 포함하며,
    여기서 성장기 동안 세포 배양 배지 중 용존 이산화탄소의 농도는 10％ 이하에서 유지되고,
    성장기의 일부분 동안 세포 배양 배지 중 삼투몰농도 수준은 감소하고, 성장기의 초기에서 성장기의 말엽까지의 삼투몰농도 수준의 총 상승은 약 300 mOsmol/kg 미만인, 유가식 포유동물 세포 배양 공정에서 세포 배양 배지의 삼투몰농도 수준의 조절 방법.
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