CN116286345A - 一种细胞悬浮培养的鼓泡床生物反应器及细胞培养方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于动物细胞培养生物反应器领域，具体涉及一种基于鼓泡床的用于动物细胞悬浮培养的反应器及其培养方法，包括反应器罐体、引流管、引流搅拌桨、微孔曝气装置、曝气盘；通过分别设计独立的微泡曝气装置与曝气盘，将培养液中氧气的供给与二氧化碳的移除分成两部分进行，同步提高了氧气和二氧化碳的传质系数，同时满足细胞氧气供给与二氧化碳移除的需求，减少了通气量，降低了通气造成的细胞损伤。相比现有的技术，对相同氧气需求的细胞，平均通气量降低了63.6％，最大通气量降低了60.7％，大幅减少了通气对细胞的损伤。
Description
技术领域
本发明属于动物细胞培养生物反应器领域，具体涉及一种基于鼓泡床的用于动物细胞悬浮培养的反应器及其培养方法。
背景技术
动物细胞被大规模的培养用于生产各种治疗性蛋白、疫苗和抗体。在动物细胞生长繁殖与目标产物合成的过程中需要大量的能量。在此过程中，细胞消耗大量的氧，并产生二氧化碳。在CHO细胞培养中，溶解氧水平通常保持在空气饱和度的10％到80％之间。氧气浓度过高会导致活性氧(ROS)的积累，进而改变线粒体呼吸链和细胞内氧化还原反应，最终导致细胞生长抑制以及比生产力下降。在缺氧条件会会诱导ROS积累，也会促进乳酸的增加。在哺乳动物细胞培养中，溶解的二氧化碳(pCO2)水平通常保持在4％～10％CO2饱和度(30～70mmHg)。高浓度的溶解二氧化碳(150～200mmHg)会对细胞生长和产物的表达产生不利影响。在CHO细胞培养中，高pCO2可抑制细胞生长、产物的表达并改变产品质量。溶解在水中的二氧化碳通过与水反应形成碳酸盐，从而引起酸化，碳酸盐分解成碳酸。当二氧化碳高于一定水平时，细胞内的pH环境受到影响，细胞生长和产物产量都会受到抑制，同时抗体的质量属性(如N糖基化、抗体的电荷异质性、分子大小)也会受到影响。此外，培养液的酸化导致因pH值控制向培养基中添加碱(通常为碳酸氢钠)，从而导致渗透压增加。与正常水平(260～320mOsm/kg)的渗透压相比，渗透压升高(460～500mOsm/kg)会导致细胞密度和活率降低。虽然二氧化碳可能对细胞培养产生不利影响，但它仍然是核酸代谢合成所必需的，因此其浓度不能降得太低。与正常pCO2水平(28～54mmHg)相比，超低pCO2水平(12.5～24.5mmHg)会降低活细胞密度和细胞活力。
大规模动物细胞培养面临着以与消耗氧气大致相同的摩尔速率移除(或解析)细胞产生的二氧化碳的问题。在大型反应器中，顶部曝气通常不足以去除二氧化碳。因此，必须调整底部通气速率和搅拌转速以确保二氧化碳解析。但是，曝气过程中气泡在气液交界面上破裂所产生的剪切应力损伤损伤大量细胞。由于动物细胞缺乏细胞壁，不耐受剪切应力，在培养过程中控制低转速与空气流量。因此，在规模化培养过程中很容易出现供氧不足与二氧化碳积累的情况。当前业界已经采取各种方式减少气泡破裂对细胞造成的损伤。例如使用保护试剂(如PF68等)减少气泡破裂时气泡周围的细胞，使用无气泡的半透膜进行氧气的交换，通过表层通气代替深层通气等等。但是这些方法并不能完全解决曝气过程中的对细胞的损伤，对于特定的剪切敏感细胞曝气导致的细胞损伤依旧不能忽视。
大量的研究表明，小气泡有利于氧气的传质，但不利于二氧化碳的移除；而大气泡更有利于二氧化碳的移除，但不利于氧气的传质。此外，针对气泡破裂过程中的数值模拟与实验观测均表明，较小直径的气泡破裂对细胞的伤害更为严重。氧气的供应、二氧化碳的移除以及气泡破裂产生的细胞损伤对气泡大小需求的差异，导致其调控策略的复杂化。如何避免气泡破裂对细胞损失的同时，既满足细胞对氧气的需求，同时避免二氧化碳的积累成为一个需要解决的问题。
发明内容
本发明的目的是提供一种用于动物细胞悬浮培养的鼓泡床生物反应器及其细胞培养方法，以解决上述技术背景中提出的问题。
为解决上述技术问题，本发明提供如下技术方案：
本发明第一个方面公开了一种鼓泡床生物反应器，包括反应器罐体、引流管、引流搅拌桨、微孔曝气装置、曝气盘；
所述反应器罐体，用于容纳培养液；
所述引流管，设置在反应器罐体内，用于引导反应器罐体内培养液的流动方向；
所述引流搅拌桨，设置在引流管内，用于提供培养液沿引流管向下流动的动力；
所述微孔曝气装置，设置于引流管内，位于引流管下部，用于提供微泡化的纯氧气泡；
所述曝气盘，设置于反应器内部的下方，位于引流管的外部，用于提供便于二氧化碳移除的大气泡。
所述反应器内还设置有圆柱搅拌器，所述圆柱搅拌器位于引流管外部，所述圆柱搅拌器由3-6根实心圆柱组成，用于辅助培养液的混合。
所述引流管位于培养液的液面以下，所述引流管的横截面积从上到下依次减小。
所述微孔曝气装置和引流搅拌桨设置在引流管的中下部。
本发明第二个方面公开了利用上述反应器在用于细胞培养时的具体方法，步骤如下：
S1：将培养基加入至反应器内，通过曝气盘将除菌后的空气或氧气通入反应器内；
S2：将种子细胞接入反应器内，打开微孔曝气装置，在引流管内生成微泡化的纯氧气泡，控制引流搅拌桨转速，将纯氧气泡控制在引流管内；
S3：培养液中的溶氧量关联微孔曝气装置的通气量，培养液中的二氧化碳分压关联曝气盘通气量，在培养过程中，通过微孔曝气装置形成的纯氧气泡供给氧气、曝气盘形成的大气泡移除二氧化碳。
优选地，S1加入培养液之前先对反应器进行蒸汽灭菌，并将培养液进行过滤除菌。
优选地，S1中曝气盘提供0.5～1mm的大气泡。S2中微孔曝气装置提供20～100μm的纯氧气泡。S3中培养液中的溶氧为空气饱和溶氧的(40±20)％。S3中培养液的二氧化碳分压低于100mmHg。
本发明有益效果是：
1.本发明设计的鼓泡床生物反应器，通过引流管及引流搅拌桨的设置，平衡气泡上升的浮力，将富含氧气的微泡截留在液面以下，在提供较高氧传质效率的同时，避免了小气泡破裂对细胞的损伤；通过微孔曝气装置持续或间歇性的通入纯氧，位于引流管下方的搅拌桨促使培养基向下流动，由于引流管上部横截面积小，液体流速更快，下方横截面积大，流体流速缓慢，气泡在上部受到的阻力大于液体浮力，下方气泡无法流出引流管，亦无法从引流管下方逃出引流管，因此气泡不会在气液交界面处破裂；气泡会在引流管中形成一个富含微小气泡的区域，最终气泡会全部溶解在培养基中。
2.通过分别设计独立的微泡曝气装置与曝气盘，将培养液中氧气的供给与二氧化碳的移除分成两部分进行，同步提高了氧气和二氧化碳的传质系数，同时满足细胞氧气供给与二氧化碳移除的需求，减少了通气量，降低了通气造成的细胞损伤。相比现有的技术，对相同氧气需求的细胞，平均通气量降低了63.6％，最大通气量降低了60.7％，大幅减少了通气对细胞的损伤。
3.在动物细胞培养过程中，通过将氧气的供给与二氧化碳的移除分成两部分进行，分别调控培养液中的溶氧与二氧化碳分压，减少了二者调控的相互干扰，简化了调控策略。
附图说明
图1为反应器的示意图；
图2为细胞培养过程中需氧量；
图3为方法改进前后达到图2中的氧气供给并控制pCO2小于100mmHg所需要的气体通入量。
具体实施方式
下面，结合具体实施例对本发明进行详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。
实施例1：
在10L反应器中，加入7L培养基，每天按照初始体积的3％进行补料分批培养，培养期间控制溶氧量在空气饱和溶氧的(40±20)％，体积功率为23W/m3，pH为7.0±0.2，二氧化碳分压100mmHg以内，每天取样测定细胞数、残糖情况。初始细胞的接种密度为(0.5～1.0)×106cells/mL。培养时间为16天。
实施例1中，溶氧关联微孔曝气装置的通气量，通过微孔曝气装置提供20～100μm的气泡，二氧化碳分压关联曝气盘通气量，通过曝气盘提供0.5～1mm的大气泡，控制引流搅拌桨转速，避免微泡逃出引流管(使得纯氧微泡无法上升到液面，截留在液面以下即可)；。
对比例：
使用传统的反应器，只包含反应器罐体、引流管、引流搅拌桨和微孔曝气装置，溶氧关联底部通气通入纯氧，其余条件培养液和细胞接种情况与实施例1相同。
实施例1和对比例在细胞培养过程中，在同时满足相同的氧气供养能力与二氧化碳解析能力的情况下，所需的通气量如图3所示。培养过程中，细胞氧气需求最旺盛的时候(D13)传统的通气方式需要0.154vvm通气量；而本发明的反应器相同孔径的通气量仅为0.060vvm，通气量降低了60.7％；整个培养期间，传统方式的通气量为0.073vvm，新反应器为0.027vvm，新反应器降低了63.6％。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种鼓泡床生物反应器，其特征在于，包括反应器罐体、引流管、引流搅拌桨、微孔曝气装置、曝气盘；
所述反应器罐体，用于容纳培养液；
所述引流管，设置在反应器罐体内，用于引导反应器罐体内培养液的流动方向；
所述引流搅拌桨，设置在引流管内，用于提供培养液沿引流管向下流动的动力；
所述微孔曝气装置，设置于引流管内，位于引流管下部，用于提供微孔化的纯氧气泡；
所述曝气盘，设置于反应器内部的下方，位于引流管的外部，用于提供便于二氧化碳移除的大气泡。
2.根据权利要求1所述的一种鼓泡床生物反应器，其特征在于，所述反应器内还设置有圆柱搅拌器，所述圆柱搅拌器位于引流管外部，所述圆柱搅拌器由3-6根实心圆柱组成。
3.根据权利要求1所述的一种鼓泡床生物反应器，其特征在于，所述引流管位于培养液的液面以下，所述引流管的横截面积从上到下依次减小。
4.根据权利要求1所述的一种鼓泡床生物反应器，其特征在于，所述微孔曝气装置和引流搅拌桨设置在引流管的中部。
5.如权利要求1-4任一项所述的反应器用于细胞培养的方法，具体步骤如下：
S1：将培养液加入至反应器内，通过曝气盘将除菌后的空气或氧气通入反应器内；
S2：将种子细胞接入反应器内，打开微孔曝气装置，在引流管内生成微孔化的纯氧气泡，控制引流搅拌桨转速，将纯氧气泡控制在引流管内；
S3：培养液中的溶氧量关联微孔曝气装置的通气量，培养液中的二氧化碳分压关联曝气盘通气量，在培养过程中，通过微孔曝气装置形成的纯氧气泡供给氧气、曝气盘形成的大气泡移除二氧化碳。
6.根据权利要求5所述的细胞培养的方法，其特征在于，S1加入培养液之前先对反应器进行蒸汽灭菌，并将培养液进行过滤除菌。
7.根据权利要求5所述的细胞培养的方法，其特征在于，S1中曝气盘提供0.5-1mm的大气泡。
8.根据权利要求7所述的细胞培养的方法，其特征在于，S2中微孔曝气装置提供20-100μm的纯氧气泡。
9.根据权利要求8所述的细胞培养的方法，其特征在于，S3中培养液中的溶氧为空气饱和溶氧的40±20％。
10.根据权利要求9所述的细胞培养的方法，其特征在于，S3中培养液的二氧化碳分压低于100mmHg。
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Legal Events
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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