JPWO2011070791A1

JPWO2011070791A1 - 細胞または微生物の培養方法

Info

Publication number: JPWO2011070791A1
Application number: JP2011545095A
Authority: JP
Inventors: 大成奥村; 守沼田; 秀藏小島; 靖久長田; 直樹田原; 泰至黒木; 久木崎　雅人; 雅人久木崎; 智博田中
Original assignee: JGC Corp; Miyazaki Prefecture
Current assignee: JGC Corp; Miyazaki Prefecture
Priority date: 2009-12-10
Filing date: 2010-12-10
Publication date: 2013-04-22
Also published as: US20120244602A1; CN102725392A; KR20120104219A; WO2011070791A1; CN102725392B; EP2511364A9; KR20140101886A; EP2511364A1; EP2511364A4; TW201129698A

Abstract

【課題】栄養分を含む培養液中に酸素または二酸化炭素を溶解させて細胞または微生物の培養を行うにあたり、培養液の撹拌を穏やかに抑えながら当該培養液中に酸素または二酸化炭素を速やかに溶解させること。【解決手段】多孔質体１１に酸素または二酸化炭素を含むガスを供給して体積基準の粒度分布における５０％径が２００μｍ以下の気泡１２を培養液１３中に発生させると共に、前記培養液１３中には、タンパク質加水分解物と細胞を保護するための細胞保護剤との少なくとも一方が添加剤として含まれるようにする。【選択図】図２

Description

本発明は、栄養分を含む培養液中に酸素または二酸化炭素を溶解させて当該培養液中の細胞または微生物の培養を行う培養方法に関する。

例えば動物や植物などの細胞または微生物を培養する方法として、栄養分を含む培養液中に例えば空気などの酸素または二酸化炭素を含む気体を供給することにより、細胞や微生物を培養する方法が知られている。この栄養分は、例えば予め培養液中に所定量混入されたり、あるいは培養を行う間に亘って適宜培養液中に供給されたりするが空気は培養している間に亘って培養液中に供給され続ける必要がある。培養液中に空気を供給する方法としては、例えば先端側に多数のガス吐出口が形成された管状のスパージャー（例えば、Ｕ字スパージャーなど）を培養液中に浸漬しておき、培養液中に直径が例えば数ｍｍ程度の気泡をバブリングする方法が知られている。

この方法においては、培養液中への空気の溶解量を稼ぐためには、例えばタービン型の撹拌羽根により培養液を撹拌してスパージャーからバブリングされる空気の気泡を小さくする（破砕する）ことによって、気液（空気及び培養液）の接触面積を大きくして、培養液中に空気が溶解しやすくする必要がある。そのため、酸素溶解速度（量）を稼ごうとする程、培養液を激しく撹拌することになるので、撹拌のために大きなエネルギーが必要になってしまうし、培養を行う装置（撹拌装置）も大型化したり高コスト化したりしてしまう。また、撹拌によって培養液の温度が上昇する場合には、培養液の温度を低下させるための冷却エネルギーが必要になる。更に、細胞を培養する場合には、撹拌羽根の撹拌により細胞が物理的にダメージを受けてしまうおそれがある。更に撹拌によって気泡が破砕（破裂）される時の衝撃により、細胞がダメージを受けてしまう場合もある。

特許文献１には、多孔質体を介して液体中に微小な気泡を生成させ、この気泡を水耕栽培、魚介類の養殖、食品、マイクロカプセル、医薬製剤及び化粧品などに利用する技術や、上記の微小な気泡を利用して微生物の増殖を抑制する技術などについて記載されているが、細胞や微生物の培養については検討されていない。

特開２００５−１６９３５９（段落００４５）

本発明はこのような事情の下になされたものであり、その目的は、栄養分を含む培養液中に酸素または二酸化炭素を溶解させて細胞または微生物の培養を行うにあたり、培養液の撹拌を穏やかに抑えながら、あるいは撹拌を行うことなく、培養液中に酸素または二酸化炭素を速やかに溶解させることができる細胞または微生物の培養方法を提供することにある。

本発明の細胞または微生物の培養方法は、
栄養分を含む培養液中に酸素または二酸化炭素を溶解させて細胞または微生物の培養を行う培養方法において、
多孔質体に酸素または二酸化炭素を含むガスを供給して体積基準の粒度分布における５０％径が２００μｍ以下の気泡を培養液中に発生させることにより、前記培養液に酸素または二酸化炭素を溶解させて細胞または微生物の培養を行う工程を含み、
前記培養液中には、タンパク質加水分解物と細胞を保護するための細胞保護剤との少なくとも一方が含まれていることを特徴とする。

前記培養液の表面張力は、５１．５ｄｙｎｅ／ｃｍ以下であることが好ましい。
前記多孔質体の細孔径は、５０μｍ以下であることが好ましい。

本発明は、栄養分を含む培養液中に酸素または二酸化炭素を含むガスを供給することによって細胞または酵母、カビ、細菌および微細藻類である微生物の培養を行うにあたり、多孔質体に酸素または二酸化炭素を含むガスを供給して体積基準の粒度分布における５０％径が２００μｍ以下の気泡を培養液中に発生させると共に、前記培養液中には、タンパク質加水分解物と細胞を保護するための細胞保護剤との少なくとも一方が含まれるようにしている。そのため、タンパク質加水分解物あるいは細胞保護剤の界面活性作用によって培養液中における気泡の合一（凝集）を抑えて極めて微細な粒径の気泡を得ることができるので、気液（気泡及び培養液）の接触面積を稼ぐことができる。また、気泡の浮力を極めて小さく抑えることができるので、従来の浮力を受けて上昇する例えば３００μｍ以上の粒径の気泡と比べて、培養液中において気泡をいわば静止状態に保つことができる。従って、前記ガスと培養液とを長時間に亘って接触させることができるので、培養液中に酸素または二酸化炭素を速やかに溶解させることができる。更に、気泡を破砕するまでの激しい撹拌が不要になるので、撹拌を穏やかに抑えることができるか、あるいは撹拌を行わずに済む。従って、装置全体の大きさや培養に要する消費エネルギーを小さくすることができ、特に細胞を培養する場合には、撹拌による細胞への物理的なダメージを抑えることができる。

本発明の細胞又は微生物の培養方法を実施するための培養装置の一例を示す模式図である。上記の培養装置において培養液中に気泡が発生する様子を示す模式図である。従来の方法により培養液中に気泡を発生させた時の様子を示す模式図である。本発明の実施例にて得られる結果を示す特性図である。本発明の実施例にて得られる結果を示す特性図である。本発明の実施例にて得られる結果を示す特性図である。本発明の実施例にて得られる結果を示す特性図である。本発明の実施例にて得られる結果を示す特性図である。本発明の実施例にて用いた装置における撹拌羽根及び消泡羽根の設置位置を示す概略図である。本発明の実施例にて得られる結果を示す特性図である。本発明の実施例にて得られる結果を示す特性図である。本発明の実施例にて得られる結果を示す特性図である。本発明の実施例にて得られる結果を示す特性図である。本発明の実施例にて得られる結果を示す特性図である。本発明の実施例にて得られる結果を示す特性図である。

本発明の細胞または酵母、カビ、細菌および微細藻類である微生物を培養する培養方法の実施の形態の一例について、図１及び図２を参照して説明する。先ず、この培養方法を実施するために用いる培養装置の一例について簡単に説明すると、この培養装置は、栄養分を含む培養液１３を貯留するための培養槽２１と、酸素を含むガスこの例では空気を極めて微小な気泡（マイクロバブル）１２として培養槽２１内の培養液１３に供給するための酸素供給部であるスパージャー２２と、を備えており、空気や酸素が貯留された酸素貯留部２３から酸素供給路２４を介してスパージャー２２に空気を供給し、培養槽２１の上面に接続された排気路２５を介して培養槽２１内から発生するガス（二酸化炭素や上記の空気など）を排出するように構成されている。図１中３１、３２、３３、３４は、夫々ニードルバルブ、圧力計、流量計及びボールバルブであり、例えば図示しない制御部により、培養槽２１への空気の給断と、培養槽２１へ供給する空気の圧力及び流量と、を制御できるように構成されている。また、図１中２７は、既述のスパージャー２２から培養液１３中に供給される気泡１２を培養液１３中に拡散させるために、培養槽２１内に挿入された撹拌羽根２６を軸回りに回転させて培養液１３を穏やかに撹拌するためのモーターである。

上記のスパージャー２２は、例えば内部領域１１ａが空洞となるように概略円筒形状に形成された多孔質体（多孔質膜）１１により構成されたポーラス体であり、培養液１３中に浸漬されている。この多孔質体１１は、上端側に既述の酸素供給路２４が気密に接続され、下端側は例えば図示しないシール部材などによりシールされている。この多孔質体１１には、図１の下側に拡大して示すように、細孔径ｄが例えば５０μｍ以下の微小な細孔１が全面に亘って均一に多数形成されており、多孔質体１１の内部領域１１ａとスパージャー２２の外部領域（培養液１３）とが細孔１を介して多数箇所において連通するように構成されている。この多孔質体１１は、例えば火山灰シラスと石灰（ＣａＯあるいはＣａＣＯ_３）や硼酸（Ｈ₃ＢＯ₃）などのガラス原料とを混合して高温で溶解し、その後７００℃程度で熱処理を行った後に酸処理して得られるものである。即ち、上記の熱処理により、多孔質体１１中のガラス成分がシリカ（ＳｉＯ₂）及びアルミナ（Ａｌ₂Ｏ₃）を主成分とする第１ガラス相と、酸化ホウ素（Ｂ₂Ｏ₃）及び酸化カルシウム（ＣａＯ）を主成分とする第２ガラス相とに極めて均一に分離するので、熱処理の温度や時間あるいは成分の添加量などを調整することにより、酸処理後には極めて微細な細孔１が均一に形成された多孔質体１１が得られることになる。この多孔質体１１は、例えばＳＰＧ（シラスポーラスガラス）膜などと呼ばれており、ＳＰＧテクノ株式会社により製造されている。

培養槽２１内の培養液１３には、培養を行う細胞２または微生物この例では細胞２と、この細胞２の栄養となる栄養分と、が含まれている。この栄養分は、例えば所定の割合で混合された複数種類のアミノ酸、ビタミン、無機塩及び糖などで構成された基礎培地である。また、培養液１３には、タンパク質加水分解物と、細胞２を保護するための細胞保護剤と、の少なくとも一方が添加剤として含まれている。これらの添加剤は、いずれも界面活性作用を持っており、後述の実施例にて説明するように、当該界面活性作用によって既述のスパージャー２２から培養液１３中に供給される微細な気泡１２の合一（凝集）を抑制するためのものである。これらの添加剤について、各々の具体的な成分について以下に詳述する。

タンパク質加水分解物は、タンパク質をアミノ酸及び低分子量のペプチドまで加水分解したものであり、例えば牛乳に由来するタンパク質であるカゼインの加水分解物、ポリペプトン、ペプトン、酵母エキス、肉エキス及びカザミノ酸などである。この加水分解の方法としては、例えば酸分解、酵素分解、自己消化などが挙げられる。ペプトンは、動物性タンパク質や植物性タンパク質をアミノ酸及び低分子量のペプチドまで加水分解した化合物の総称である。ペプトンの一例であるポリペプトンは、日本製薬株式会社の製品であり、牛乳カゼインを動物由来の酵素にて分解した後、精製及び乾燥した粉末である。また、酵母エキスは、ビール酵母（ＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓＣｅｒｅｖｉｓｉａｅＭｅｙｅｎ）の水溶性成分を抽出し、乾燥した粉末であり、日本製薬株式会社の製品（製品名：粉末酵母エキスＤ−３）などがある。また、カザミノ酸は、ペプチド以外のものであって、タンパク質を塩酸を用いて全てアミノ酸まで加水分解したものである。尚、既述の栄養分に代えて、このタンパク質加水分解物を用いても良い。

細胞保護剤としては、プルロニックＦ６８、ダイゴＧＦ２１（増殖促進因子）及び血清などが挙げられる。プルロニックＦ６８は、ＢＡＳＦジャパン株式会社の製品（ＣＡＳ番号：９００３−１１−６）であり、栄養成分や細胞成長因子としての作用を持たず、細胞２を保護する作用を持つ界面活性剤の一種である。ダイゴＧＦ２１は、日本製薬株式会社の製品であり、牛血清の精製によりγグロブリンを取り除いたＧＦＳ（ＧｒｏｗｔｈＦａｃｔｏｒｉｎＳｅｒｕｍ）を主成分とする細胞増殖促進因子である。血清は、例えば牛胎児血清や子牛血清であり、栄養成分及び細胞成長因子の供給という作用の他に、細胞培養時の培養液１３の撹拌や通気などで受ける物理的なストレスから細胞２を保護する細胞保護剤としての機能がある。以上の各添加剤において、培養液１３中において界面活性作用により微細な気泡１２を得るために必要な添加量については後述の実施例にて説明する。

次に、本発明の細胞２の培養方法について説明する。先ず、上記の培養液１３と共に、細胞２、栄養分及び既述のタンパク質加水分解物と細胞保護剤との少なくとも一方を培養槽２１に投入する。即ち、血清培養の場合には、細胞２に加えて、例えば既述の基礎培地と、血清もしくはダイゴＧＦ２１と、が培養液１３中に投入されることになり、無血清培養の場合には、細胞２と共に、例えば基礎培地と細胞成長因子とプルロニックＦ６８とが投入されることになる。この培養液１３に添加されるタンパク質加水分解物や細胞保護剤の添加量は、後述するように、当該タンパク質加水分解物や細胞保護剤の界面活性作用により気泡１２の合一（凝集）が抑えられる程度の量であり、具体的には培養液１３の表面張力が５１．５ｄｙｎｅ／ｃｍ以下となる添加量である。尚、既述のように、栄養分として上記のタンパク質加水分解物を用いても良い。

そして、図示しないヒーターやジャケットなどにより培養槽２１中の培養液１３を所定の温度に制御しながら、酸素供給路２４からスパージャー２２に酸素を含むガスこの例では空気を供給する。また、モーター２７により、撹拌羽根２６を穏やかに回転させ、スパージャー２２から培養液１３中に供給される気泡１２を培養液１３中に拡散させる。

スパージャー２２から培養液１３中に供給される空気は、図２に示すように、多孔質体１１の内部領域１１ａを介して、細孔１から培養液１３中に粒径が例えば２００μｍ以下の極めて小さい多数の気泡（マイクロバブル）１２として押し出されて来て、例えば当該多孔質体１１の外表面に付着する。これらの気泡１２は、例えば培養液１３の表面張力により多孔質体１１の表面上で互いに合一（凝集）しようとするが、培養液１３中には既述のように界面活性作用を持つ添加剤が含まれているので、上記の表面張力の働きが小さく抑制されるために合一が抑えられて、既述の微細な大きさのまま培養液１３中へと放出されることになる。また、既述のように多孔質体１１がガラスにより構成されており、培養液１３との濡れ性が高いので、当該多孔質体１１の表面における気泡１２の合一がより一層抑えられることになる。尚、上記の図２は、図示を簡略化するため多孔質体１１の片側にだけ気泡１２を描画している。

そして、培養液１３中においても、添加剤の界面活性作用により、同様に気泡１２同士の合一が抑えられることになる。従って、培養液１３における気泡１２の粒径（気泡径）は、例えば後述の図４に示すように、極めて微小で均一な大きさとなり、体積基準の粒度分布における５０％径（メジアン径）が２００μｍ以下のマイクロバブルとなる。そのため、例えば従来の数ｍｍ程度あるいは３００μｍ以上の大きさの気泡を培養液１３中にバブリングした場合と比べて、気泡１２の比表面積が増加して空気（気泡１２）と培養液１３との接触面積が大きくなる。尚、上記の体積基準の粒度分布とは、気泡１２の個数をカウントして求めた粒度分布ではなく、気泡１２の体積を基準として求めた粒度分布を表している。

この時、気泡１２の粒径が例えば２００μｍ以下と極めて小さいことから、当該気泡１２はほとんど浮力を受けず、いわば培養液１３中において概略静止した状態となる。従って、培養液１３中において気泡１２は極めて穏やかに上昇していき、上記の粒径の大きな場合よりも培養液１３との接触時間が長く取られることになる。また、上記のように気泡１２の粒径が極めて小さいので、３００μｍ以上の粒径の気泡と比較して、気泡１２の内圧（内部の空気が培養液１３中に溶け出ようとする力）が大きくなる。以上のことから、培養液１３中において発生した気泡１２は、培養液１３中に速やかに溶けていくことになる。

ここで、培養液１３中の細胞２は、栄養分と共に培養液１３中の酸素を消費して、例えば生成物と二酸化炭素とを生成する。そして、時間の経過と共に、培養液１３中の細胞２の数量（個体数）が増加していくので、細胞２による酸素の消費量は、細胞２の培養を続ける程多くなっていく。従って、培養液１３中に溶けている酸素（溶存酸素）は、時間の経過と共に減少しようとする。しかし、上記のようにスパージャー２２から気泡１２を培養液１３中に供給しており、またこの気泡１２が既述のように培養液１３中に溶けていくことから、細胞２による酸素の消費分が補充されていくことになる。つまり、培養液１３中に微小な気泡１２を供給することにより、粒径の大きな気泡を供給する場合と比べて、培養液１３中の溶存酸素濃度の減少速度が緩やかになるか、あるいは溶存酸素の減少が抑えられることになる。そして、培養液１３において生成した二酸化炭素は、排気路２５から排気されていくことになる。こうして細胞２による栄養分及び酸素の消費と細胞２の増加（培養）とが所定の時間行われて栄養分がなくなると、細胞２が酸素を消費しなくなるので、培養液１３中の溶存酸素濃度が急激に増加することになる。

上述の実施の形態によれば、培養液１３中において細胞２の培養を行うにあたって、多孔質体１１に空気を供給して体積基準の粒度分布における５０％径が２００μｍ以下の極めて微小な気泡１２を発生させると共に、タンパク質加水分解物と細胞保護剤との少なくとも一方を添加剤として培養液１３中に含まれるようにしている。そのため、この添加剤の界面活性作用によって、培養液１３中における気泡１２の合一（凝集）を抑えて、極めて微細な粒径の気泡１２を得ることができるので、例えば３００μｍ以上の粒径の気泡と比較して、気液（気泡１２及び培養液１３）の接触面積を稼ぐことができる。また、気泡１２の浮力を極めて小さく抑えることができるので、上記の粒径の大きな気泡と比較して、培養液１３中において気泡１２をいわば静止状態に保つことができる。そのため、気泡１２と培養液１３とを長時間に亘って接触させることができるので、培養液１３中に酸素を速やかに溶解させることができる。また、微小な気泡１２においては、粒径の大きな気泡と比べて、内部の空気が気泡１２の外側に溶け出ようとする圧力が高くなるので、培養液１３に酸素をより一層速やかに溶解させることができる。

更に、上記の気泡１２を得るためには大きな気泡を破砕するための激しい撹拌が不要であり、撹拌羽根２６による撹拌は培養液１３中に気泡１２を分散させるための穏やかな撹拌で済む。そのため、モーター２７の消費エネルギーや大きさを抑えることができるので、細胞２の培養に要するコスト（運転コスト及び装置のコスト）を抑えることができる。また、撹拌により生じる熱を抑えることができるので、例えば培養槽２１や培養液１３を冷却するための設備を小さくすることができる。更に、穏やかな撹拌で済むことから、撹拌による細胞２への物理的なダメージを抑えることができる。また、気泡１２を破砕する必要がないことから、気泡１２が破裂する時の衝撃による細胞２へのダメージを抑えることができる。
また、培養液１３に添加剤を添加するにあたり、培養液１３が細胞２を培養するために用いる液体であるため、上記のタンパク質加水分解物や細胞保護剤以外に、例えば細胞２あるいは細胞２の培養に対して有害な物質を培養液１３に投入できないが、この発明では、細胞２の培養に有益な添加剤を用いることができる。そのため、細胞２の培養に悪影響を及ぼすことなく、培養液１３に酸素を速やかに供給することができる。

ここで、従来の例えば３００μｍ以上の粒径の気泡の場合には、培養液１３中において大きな浮力を受けて速やかに上昇することになり、培養液１３との接触時間を長く取ることができない。また、培養液１３中に上記の添加剤が含まれていない場合には、上記のスパージャー２２を用いて微小な気泡１２を発生させたとしても、図３に示すように、培養液１３の表面張力により例えば多孔質体１１の表面において気泡１２が直ぐに合一してしまい、大きな気泡が生成してしまうことになる。この場合には、培養液１３に酸素を速やかに溶解させるためには、大きな気泡を破砕するための激しい撹拌が必要になり、モーター２７の消費エネルギーや大きさが増大すると共に、細胞２にダメージを与えてしまうおそれが生じることになる。尚、この図３においても、多孔質体１１の片側だけに気泡を描画している。

上記の例では、撹拌羽根２６により撹拌することによって培養液１３に気泡１２を拡散させたが、例えば気泡１２が多孔質体１１から離れた後直ぐに溶解する場合などには、撹拌を行わなくても良い。
また、上記の例では、空気などの酸素を含むガスを供給して細胞２の培養を行ったが、二酸化炭素を含むガスを供給して植物細胞または微細藻類などの植物を培養する場合に本発明を適用しても良い。この場合においても、二酸化炭素を含むガスの微小な気泡１２がスパージャー２２を介して培養液１３中に発生するので、既述の例と同様に培養液１３に二酸化炭素を速やかに溶解させることができる。この場合においては、気泡１２の粒径を小さくするため（培養液１３の表面張力を下げるため）に添加する添加剤としては、タンパク質加水分解物や細胞保護剤が使用される。この添加剤の添加量は例えば実験などにより適宜設定されることになる。

次に、微細な気泡１２について行った実験について説明する。
（実施例１）
先ず、動物細胞を培養する培養液１３に細胞保護剤（ダイゴＧＦ２１）を添加した場合において、既述のスパージャー２２（細孔径ｄが１μｍの多孔質体１１）から生成する気泡１２の粒度分布を測定した。この粒径は、レーザー回折散乱式粒度分布計を用いて、スパージャー２２により気泡１２を発生させた培養液１３をこの粒度分布計内のフローセルに連続的に供給し、この培養液１３にレーザー光を照射して当該レーザー光の回折や散乱を評価することによって測定した。

その結果、細胞保護剤の添加量が１体積％の場合には、図４に示すように、体積基準の粒度分布における５０％径が２００μｍ以下（１２４μｍ）となっていた。従って、この大きさの気泡１２では、既述のように浮力の影響が極めて小さくなると考えられる。一方、細胞保護剤の添加量が０．５％の場合には、図５に示すように、５０％径が２３８μｍとなることが分かった。このような添加剤の添加量と得られる気泡１２の粒径との関係について、ダイゴＧＦ２１の添加量を種々変えて気泡１２の粒径を測定したところ、図６に示す結果が得られた。従って、浮力の影響が小さいと考えられる２００μｍ以下の粒径の気泡１２を発生させるためには、１体積％以上のダイゴＧＦ２１を添加する必要のあることが分かった。

（実施例２）
上記の実施例１と同様に、添加剤の添加量と生成する気泡１２の粒径との相関関係ついて、添加する添加剤の種類及び添加量を変えて実験を行った。
先ず、既述のように培養液１３の表面張力に応じて発生する気泡１２の粒径が変化することから、粒径が２００μｍ以下の微小な気泡１２を発生させるために必要な培養液１３の表面張力がどの程度なのか確認した。具体的には、添加剤としてダイゴＧＦ２１を用いると共に、この添加剤の添加量を種々変えた培養液１３中において既述のスパージャー２２によって気泡１２を発生させ、この培養液１３の表面張力と発生した気泡１２の粒径とを測定した。その結果、図７に示すように、培養液１３の表面張力と発生する気泡１２の粒径とには直線的な相関関係が見られ、この関係は以下の（１）式により表されることが分かった。
ｙ＝２８．９８ｘ−１２９２・・・（１）
この（１）式から、既述のように２００μｍ以下の微小な粒径の気泡１２を発生させるためには、培養液１３の表面張力を５１．５ｄｙｎｅ／ｃｍ以下にする必要のあることが分かった。
そこで、以下の表１〜３に示す添加剤について、夫々の濃度を変えて添加した時の培養液１３について表面張力を評価した。そして、このような微小な気泡１２が生成すると考えられる場合（表面張力が５１．５ｄｙｎｅ／ｃｍ以下）を○とし、これよりも大きな粒径の場合（表面張力が５１．５ｄｙｎｅ／ｃｍより大きい）には×とした。この結果を以下の表１〜３に示す。

（表１）

（表２）

（表３）

この結果から、浮力の影響の小さいと考えられる粒径が２００μｍ以下の気泡１２を得るためには、添加剤の種類に応じて添加量を調整する必要のあることが分かった。

（実施例３）
次に、微生物を培養する培地（表面張力：４８．６ｄｙｎｅ／ｃｍ）において、気泡１２の気泡径と多孔質体１１の細孔径ｄとの対応関係を測定したところ、図８に示す結果が得られた。この結果に基づいて上記の対応関係を近似する１次式を算出したところ、
ｙ＝３．４ｘ＋１７．５・・・（２）
が得られた（ｘ：多孔質体１１の細孔径、ｙ：気泡１２の粒径（５０％径））。この時のＲ^２値は１．０であり、従ってこの（２）式により、培養液１３中の気泡１２の粒径から多孔質体１１の細孔径ｄを極めて高い精度で算出できることが分かる。そこで、上記の浮力の影響が極めて少ないと考えられる気泡１２の粒径（２００μｍ）に対応する多孔質体１１の細孔径ｄを算出すると、５０μｍとなることが分かった。従って、細孔径ｄが５０μｍ以下の多孔質体１１を用いることにより、浮力の影響の極めて小さい微細な気泡１２を得られることになる。

（実施例４）
続いて、本発明のスパージャー２２と、従来のスパージャー（Ｕ字スパージャー）とにより培養液１３中に夫々気泡１２を発生させた場合に、夫々の培養液１３中への酸素供給性能を確認する実験を行った。具体的には、培養槽には株式会社高杉製作所製の3 L ミニジャーファーメンター、内径１３０ｍｍ、高さ２６０ｍｍ（型式：ＴＳＣ−Ｍ３Ｌ）を使用し、図９に示すように外径５５ｍｍの６枚羽根平羽根タービンの撹拌羽根および消泡羽根を培養槽に設置した。夫々のスパージャーを用いて１５０ｍｌ／ｍｉｎの流量で空気を培養液１３中に供給し、酸素溶解能力を示す指標であるＫ_Ｌａ値（総括酸素移動容量係数）を測定した。その結果、図１０に示すように、多孔質体１１（ＳＰＧ膜）を用いた場合には、穏やかな撹拌でも高い溶存酸素濃度が得られていたが、従来のスパージャー（Ｕ字型）では、培養液１３を激しく撹拌しても高い溶存酸素濃度は得られず、多孔質体１１を用いた場合の１０分の１以下となっていた。そのため、従来のスパージャーでは、高い溶存酸素濃度を得るためには、撹拌により気泡を破砕する必要のあることが分かる。例えば３０ｈ^−１のＫ_Ｌａ値を得るためには、多孔質体１１では撹拌羽根２６の回転数は２５０ｒｐｍで十分だったが、従来のスパージャーでは５５０ｒｐｍもの激しい撹拌が必要だった。従って、多孔質体１１を用いることで撹拌羽根２６の回転数を半分以下に低減できると言える。

（実施例５）
本発明のスパージャー２２（多孔質体１１）を用いた場合と、従来のスパージャー（Ｕ字型）を用いた場合とにおいて、実際に微生物である大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ，ＮＢＲＣ３３０１）を培養した時に、菌体濃度（ＯＤ６００）がどのようになるか確認する実験を行った。空気の供給量については、夫々１５０ｍｌ／ｍｉｎとした。その結果、図１１に示すように、従来のスパージャーを用いた場合と比較して、多孔質体１１を用いた場合には、培養８時間後には菌体濃度が５０％程度多くなることが分かった。この結果は、培養液１３に供給される気泡１２の粒径に対応していると考えられ、つまり気泡１２の比表面積が大きく酸素供給速度が速い程、菌体濃度を増やすことができると言える。

（実施例６）
また、同様に多孔質体１１及び従来のスパージャーを用いて実際に大腸菌を培養した時の溶存酸素濃度を測定した。その結果、図１２に示すように、従来のスパージャーでは、培養の開始に伴って直ぐに溶存酸素濃度が減少していたが、多孔質体１１を用いた場合には、溶存酸素濃度の低下が抑制されていることが分かった。

（実施例７）
上記の実施例６では、培養液１３中の溶存酸素濃度を測定したが、この実施例７では、大腸菌を培養している時に培養液１３から放出（排出）されるガス中の酸素濃度を測定した。即ち、供給した空気中の酸素が培養液１３中に溶解して大腸菌により消費されると、排気される酸素量が少なくなるが、培養液１３に酸素が溶解しない場合には、酸素がそのまま培養液１３から排出されることになるので、排ガス中の酸素濃度を測定することによって酸素が有効に利用されているかどうかを確認した。

その結果、図１３に示すように、多孔質体１１を用いた場合には排気ガス中の酸素濃度が低くなっており、培養液１３に酸素が溶解し、また大腸菌によりこの酸素が消費されていることが分かる。一方、従来のスパージャーでは、それほど酸素が培養液１３に溶解せずに、酸素の大部分が排気されていることが分かる。この結果を酸素の有効利用率（消費された酸素量÷供給した酸素量）として計算すると、酸素の有効利用率は、多孔質体１１では８６％、従来のスパージャーでは３０％となっていた。従って、多孔質体１１を用いることによって気泡１２の粒径が小さくなって空気が培養液１３中に溶解しやすくなるが、従来のスパージャーでは気泡の粒径が大きいために供給した酸素の大部分が培養液１３から排出されてしまっていることが分かる。

（実施例８）
続いて、本発明のスパージャー２２（多孔質体１１）を用いた場合と、従来のスパージャー（焼結金属）を用いた場合とにおいて、実際に動物細胞であるＣｈｉｎｅｓｅ
ｈａｍｓｔｅｒｏｖａｒｙ細胞（ライフテクノロジーズジャパン株式会社、カタログ番号：１１６１９‐０１２）を培養した時に、生細胞濃度およびグルコース濃度がどのようになるか確認する実験を行った。具体的には、エイブル株式会社製の全容７Ｌ動物細胞培養槽（型式：ＢＣＰ‐０７ＮＰ３）にライフテクノロジーズジャパン株式会社製の無血清培地であるＣＨＯ−Ｓ−ＳＦＭＩＩを５Ｌ張り込んで（収容して）、Ｃｈｉｎｅｓｅ
ｈａｍｓｔｅｒｏｖａｒｙ細胞を培養した。生細胞濃度は、上記培養槽より採取した培養液に、細胞の生死判定用の試薬である０．０５ｗｔ（重量）％ニグロシン溶液を添加して、サンリード硝子有限会社製のトーマ血球計算盤（型番：Ａ１０５）を用いて測定した。一方、グルコース濃度は、株式会社島津製作所製の高速液体クロマトグラフ（カラム型番：Ｓｈｉｍ−ｐａｃｋＳＰＲ−Ｐｂ２５０Ｌ×７．８）を用いて測定した。また、培養液の溶存酸素濃度については、本発明の場合及び従来の場合のいずれにおいても夫々６．３１ｍｇ／Ｌとなるようにスパージャー２２（スパージャー）の空気供給量を制御した。その結果、生細胞濃度については図１４に示すように、従来のスパージャーを用いた場合と比較して、多孔質体１１を用いた場合には、最大生細胞濃度が５７７５％程度高くなることが分かった。また、グルコース濃度については図１５に示すように、初期値は同等であり、培養中の濃度の減少傾向もほぼ同様であった。即ち、多孔質体１１から発生する気泡１２が培養液１３中に存在し酸素を供給することで、従来のスパージャーから発生する気泡と比較して、細胞２がより効率的にグルコースを消費して増殖できることが分かった。

１細孔
１１多孔質体
１２気泡
１３培養液
２１培養槽
２２スパージャー
２３酸素貯留部

Claims

栄養分を含む培養液中に酸素または二酸化炭素を溶解させて細胞または微生物の培養を行う培養方法において、
多孔質体に酸素または二酸化炭素を含むガスを供給して体積基準の粒度分布における５０％径が２００μｍ以下の気泡を培養液中に発生させることにより、前記培養液に酸素または二酸化炭素を溶解させて細胞または微生物の培養を行う工程を含み、
前記培養液中には、タンパク質加水分解物と細胞を保護するための細胞保護剤との少なくとも一方が含まれていることを特徴とする細胞または微生物の培養方法。
前記培養液の表面張力は、５１．５ｄｙｎｅ／ｃｍ以下であることを特徴とする請求項１に記載の細胞または微生物の培養方法。
前記多孔質体の細孔径は、５０μｍ以下であることを特徴とする請求項１に記載の細胞または微生物の培養方法。