KR20140092593A

KR20140092593A - 설페이트 전분을 포함하는 복막투석액용 삼투압제 및 이를 포함하는 복막투석용 조성물

Info

Publication number: KR20140092593A
Application number: KR1020130004810A
Authority: KR
Inventors: 류혜명; 박선희; 김용림; 허강무; 황준석
Original assignee: 경북대학교병원; 경북대학교 산학협력단; 충남대학교산학협력단
Priority date: 2013-01-16
Filing date: 2013-01-16
Publication date: 2014-07-24
Also published as: KR101444291B1

Abstract

본 발명은 설페이트 전분을 포함하는 복막투석액용 삼투압제 및 이를 포함하는 복막투석용 조성물에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 글루코스 고리 내 하이드록시기의 수소 전부 또는 일부가 설페이트기로 치환된 설페이트 전분을 포함하는 복막투석액용 삼투압제 및 이를 포함하는 복막투석용 조성물에 관한 것이다.
상기 설페이트 전분은 높은 분자량으로 복막 내 흡수가 적어 장시간 동안 일정 수준의 삼투농도를 유지하여 한외여과를 야기한다. 또한, 세포 독성이 적고, 글루코스 분해산물(GDPs, glucose degradation products)의 생성을 최소화해 복막투석액에 의한 부작용을 감소하여 이코덱스트린을 대체하여 복막투석액에 사용할 수 있다.

Description

설페이트 전분을 포함하는 복막투석액용 삼투압제 및 이를 포함하는 복막투석용 조성물{Osmotic agent for peritoneal dialysis comprising starch sulfate and composition for peritoneal dialysis comprising of it}

본 발명은 세포 독성이 없고 체내에 축척된 노폐물 및 과량의 수분을 복막을 통해 효과적으로 제거할 수 있는 설페이트 전분을 포함하는 복막투석액용 삼투압제 및 이를 포함하는 복막투석용 조성물에 관한 것이다.

신장 기능장애 혹은 신부전증은 체내 노폐물과 과다 수분을 체외로 배설할 수 있도록 하는 신장의 기능에 이상이 생긴 것을 말한다.

신부전증은 급성 신부전증과 만성 신부전증 두 가지로 나눌 수 있다. 신장 기능이 몇 시간 안에 또는 며칠 안에 갑자기 저하되는 급성 신부전증의 경우 문제의 원인이 규명되고 치료되면 신장기능이 호전되지만, 신장의 기능이 서서히 잃어 대부분 신장의 기능을 상실한 만성 신부전증의 경우 쉽게 호전되지 않는 질환으로 주기적으로 투석을 해야 한다.

투석은 혈액투석과 복막투석 두 가지로 나뉘는데, 그 중 복막투석은 신대체요법 중 하나로 혈액투석치료에 비해 지속적으로 노폐물을 제거할 수 있으며, 잔여 신기능을 좀 더 오래 보존할 수 있다는 장점이 있다[M.J. Lysaght, et al., ASAIO transactions / American Society for Artificial Internal Organs, 37, 598 (1991); L.M. Moist, et al., Journal of the American Society of Nephrology : JASN, 11, 556 (2000)].

복막투석은 체내에 축척 된 노폐물 및 과량의 수분을 복막을 통해 효과적으로 제거하는 것으로, 이와 같은 능력을 오래도록 유지할 수 있도록 복막에 부담을 주지 않는 복막투석액이 필요하다[박 이은아 추계학술대회초록집 2001, 128 (2001); 도준영 추계학술대회초록집 24, 496 (2005)].

복막투석액은 삼투압제, 완충액 및 전해질로 구성된다. 삼투압제로는 포도당, 포도당 중합체 또는 아미노산이 사용되고, 완충액은 젖산염, 초산염 및 중탄산염이 있고, 전해질은 칼슘 및 나트륨이 사용된다.

이상적인 복막투석액은 장시간의 복강 내 삼투농도와 한외여과를 유지해야 하며, 투석액에 의한 세포의 손상이 없어야 하고, 생체부적합성 물질 등을 생성하지 않아야 한다. 또한, 쉽게 대사되면서 독성물질을 남기지 않고 가능한 흡수가 적으며 복막에 영향을 미치지 않으면서 가격이 저렴하고, 저농도에서 효과적으로 삼투력을 발휘하며 흡수시 대사 장애를 일으키지 않고, 흡수될 경우 영양적으로 가치가 있고, 제조가 쉬고 복강 내 방어기전을 억제하지 않는 물질이 좋다.

포도당은 현재까지 알려진 가장 대표적인 삼투물질이며 이외에 아미노산과 포도당 중합체를 함유하는 투석액이 상품화되어있다.

포도당은 분자량이 180인 소분자 물질로서 고농도로 사용하여도 비교적 안전하고 체내에 흡수되면 에너지원으로 사용될 수 있으며 체내 잔류물질의 축적이 없고 가격이 저렴하다. 현재 시판되는 복막투석액의 대표 물질은 다양한 농도 (1.5%, 2.3%, 4.25%)의 포도당으로 구성된 4.25% 덱스트로즈(Baxter Healthcare, Deerfield, IL, USA)가 있다.

그러나 포도당은 분자량이 작아 복강에서 혈중으로 흡수되어 한외여과가 지속되는 시간이 2∼6시간으로 짧아 오래 지속할 수 없는 단점과 체내에 흡수되어 고인슐린혈증, 고혈당, 고지질혈증 및 체중증가를 야기한다. 또한, 고농도의 포도당 농도 및 산성도는 복강 내 백혈구의 탐식작용 및 살균 능력을 억제하는 등 생체 방어기전에 영향을 줄 수 있다. 이와 같은 부작용을 없애기 위하여 여러 가지 비 포도당 물질들이 삼투물질로 시험 되어져 왔다.

포도당 중합체는 4∼250여개 다양한 포도당 단위의 결합체로서 평균 분자량은 16,200이다. 포도당에서와 같이 단순 확산에 의한 체내 흡수가 불가능하고 복강 내 농도가 지속적으로 유지되어 한외여과가 장시간 유지되는 이점이 있다.

현재 임상에서 사용중인 비포도당 복막투석액으로 포도당 중합체로 이루어진 7.5% EXTRANEL 이코덱스트린(Baxter Healthcare, Deerfield, IL, USA)이 있다.

이코덱스트린은 평균분자량이 16,500인 포도당 중합체로, 장시간 저류시켜도 20∼35%만 흡수되고 삼투농도가 지속적으로 최고 16시간까지 지속적인 여과가 가능한 이점이 있다. 또한, 교질삼투를 일으키고 주로 림프계를 통해 이동하기 때문에 복막의 투과성이 증가된 환자에게도 효과적으로 사용이 가능하고, 흡수된 포도당 중합체는 최종적으로 포도당이 되거나 소변 또는 복강으로 배설된다. 포도당 중합체를 이용한 투석액의 삼투농도는 포도당을 이용한 복막투석액에 비해 낮고, 생체 삼투농도와 유사하다.

이에 이코덱스트린과 관련된 연구가 다각적으로 진행되고 있으며, 일례로 WO 2000/33851호는 이코덱스트린을 가열 멸균하는 동안 알돈산과 포름알데히드로 분해되어 생물상용성으로 인하여 부적합한 문제를 해결하기 위해, 글리콜 또는 글리코실화된 이코덱스트린을 제시하고 있다.

상기 7.5% 이코덱스트린 복막투석액은 포도당 복막투석액에 비해 대사성 질환이 감소하는 경향을 보였으나, 일부 사용 환자에서 피부발진, 박리성 피부염, 과민반응 등의 부작용이 보고되었다.

따라서 포도당, 포도당 중합체, 아미노산의 조성을 바꾸거나 신규한 물질에 대한 관심이 지속되고 있는 가운데, 많은 삼투압 물질들이 복막투석액으로 적합한지, 생체 적합한지에 대한 많은 연구가 이루어지고 있는 실정이다.

일례로, WO 2001/26649호는 의료용, 특히 복막 투석용 용액의 제조에서 삼투제로서의 임의로 약학적으로 허용 가능한 염 형태의 L-카르니틴 및 그의 알카노일 유도체들의 용도를 제시하고 있으며, 대한민국 특허공개 제2010-0075525호는 삼투제, 완충액, 전해질 및 그들의 조합으로 구성된 군에서 선택된 투석 성분 및 치료 유효량의 피로포스페이트를 포함하는 멸균된 투석 용액을 제시하고 있다.

그러나 아직까지 복막투석액이 가지는 다양한 부작용에 대한 문제는 완전히 해결되지 못한 상태이다.

WO 2000/33851호 WO 2001/26649호 대한민국 특허공개 제2010-0075525호

이에 본 발명자들은 장시간 동안 높은 삼투 농도를 유지하면서도 세포 독성이 없어 인체에 무해한 복막투석용 삼투압제를 제조하고자 다각적으로 노력한 결과, 분자량이 크며 생체적합성이 있는 전분을 원료로 사용하고 이를 설페이트로 개질한 결과 높은 수용성을 가지고 독성이 낮을 뿐만 아니라 장시간 동안 삼투 농도를 유지하여 종래 시판되는 이코덱스트린을 대체할 수 있을 뿐만 아니라 복막투석액에 의한 부작용을 감소시킬 수 있음을 확인하여 본 발명을 완성하였다.

따라서 본 발명의 목적은 세포 독성이 없고 체내에 축적된 노폐물 및 과량의 수분을 복막을 통해 효과적으로 제거할 수 있는 설페이트 전분을 포함하는 복막투석액용 삼투압제를 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 다른 목적은 상기 설페이트 전분을 삼투압제로 포함하는 복막투석용 조성물을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 글루코스 고리 내 하이드록시기의 수소 전부 또는 일부가 설페이트기로 치환된 설페이트 전분을 포함하는 복막투석액용 삼투압제를 제공한다.

또한, 본 발명은 삼투압제, 완충액, 및 전해질을 포함하는 복막투석용 조성물에 있어서,

상기 삼투압제가 글루코스 고리 내 하이드록시기의 수소 전부 또는 일부가 설페이트기로 치환된 설페이트 전분을 포함하는 것을 특징으로 하는 복막투석용 조성물을 제공한다.

본 발명에 따른 설페이트 전분은 물에 대해 높은 용해도를 가지며, 체내에 존재하는 각종 효소 분해작용에 의한 분해를 지연시킴으로써 장시간 삼투농도를 유지하여 한외여과를 야기한다.

또한, 분자량이 커 복막을 통한 흡수가 적고 글루코스 분해산물(GDPs, glucose degradation products)의 생성을 최소화해 복막투석액에 의한 부작용을 감소시켜 종래 이코덱스트린을 대체하여 복막투석액에 사용할 수 있다.

도 1은 실시예 3 및 4에서 제조한 설페이트 전분과 출발원료인 전분의 ¹H-NMR 스펙트럼이다.
도 2는 실시예 1에서 제조한 설페이트 전분의 FT-IR 스펙트럼이다.
도 3의 (a)는 출발원료인 전분 현탁액, (b)는 실시예 1의 설페이트 전분 수용액 사진이다.
도 4는 실시예 5의 8% 설페이트 전분 복막투석액, 4.25% 덱스트로즈, 7.5% 이코덱스트린의 농도별 세포독성을 평가한 그래프이다.

이하 본 발명을 더욱 상세히 설명한다.

복막투석용 조성물은 삼투압제, 완충액 및 전해질을 포함하는데 상기 삼투압제는 복막 내 흡수가 적고 세포 독성이 없어야 하며 장시간 동안 삼투농도를 유지하여야 한다.

이에 본 발명에서는 삼투압제로서 분자량이 크고 생체적합성이 우수한 전분을 설페이트로 개질하여 친수성을 향상시킨 설페이트 전분을 사용한다. 바람직하기로, 설페이트 전분은 글루코스 고리에서 하이드록시기의 수소 전부 또는 일부가 설페이트기(SO₄H)로 치환된 것으로, 하기 화학식 1로 표시되는 반복단위를 포함한다.

(상기 화학식 1에서, R은 SO₃H 또는 H이다)

전분은 옥수수 전분(corn starch), 타피오카, 밀 전분(wheat starch), 감자 전분(potato starch)에서 유래된 것을 사용하며, 바람직하기로 옥수수 전분을 사용한다.

설페이트기는 전분의 친수성을 높여 용해도를 향상시킬 수 있으며, 전분의 글루코스 고리 내 하이드록시기의 수소와 치환된다.

이때 설페이트기의 치환도가 증가할수록 전분의 용해도 및 삼투압이 증가하며, 설페이트기로 인해 pH가 낮아져 산성도가 증가한다. 설페이트 전분을 복막투석액으로 적용하기 위해서는 중성 pH를 유지하여야 하는데 상기 설페이트 전분의 산성도가 높을 경우 과도하게 NaOH와 같은 염기를 사용하여야 하므로, 적절한 수준의 pH를 가질 수 있도록 치환도가 제어되어야 한다. 또한, 복막투석액으로 사용하기 위해 증류수에 완전히 용해되고 일정 수준의 삼투 농도를 유지할 수 있도록 일정 수준의 치환도를 가져야 한다. 바람직하기로, 본 발명에서는 설페이트기의 치환도(DS; Degree of substitution)는 10 내지 60%, 더욱 바람직하기로 10 내지 45%를 갖는다.

본 발명에 따른 설페이트 전분의 제조는 공지의 방법을 이용하여 수행할 수 있으며, 술폰화제로는 -SO₃H를 전분에 도입시킬 수 있는 물질이면 특별한 제한이 없다. 바람직하게는 클로로술폰산, 삼산화황, 황산, 발연황산, 아실술페이트 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택된 1종이 가능하며, 본 발명의 실시예에서는 클로로술폰산을 사용하였다.

설페이트화제의 사용량은 최종 얻고자하는 설페이트 전분의 치환도에 따라 달라질 수 있으며, 바람직하기로 전분 1g에 대해 0.1 내지 1.0g으로 사용한다.

이때 반응은 용매 존재하에서 수행하며, 사용 가능한 용매는 디클로로메탄, 트리클로로메탄, 테트라클로로메탄, 톨루엔, 디메틸아세트아마이드, N-메틸피롤리돈, 디메틸술폭사이드, 자이렌, 벤젠, n-부틸아세테이트, 메틸시클로헥산, 디메틸시클로헥산 및 이들의 혼합 용매로 이루어진 군에서 선택된 1종이 가능하다.

또한, 반응 온도 및 시간 등의 반응 조건은 반응 장치나 사용하는 설페이트화제, 용매 등의 종류 등에 따라 달라질 수 있으며, 바람직하기로 -5℃ 내지 200℃에서 30분 내지 24시간 동안 반응시킨다.

최종 얻어지는 설페이트 전분은 흰색의 파우더 상태로 얻어지며, 이때 설페이트 관능기에 의해 설페이트 전분은 강산성을 나타낸다. 강산성 원료를 복막투석액으로 사용하기 위해서는 NaOH로 pH 보정을 해야 하는데, 이때 강산성이 클수록 사용하는 NaOH의 함량 또한 증가하여 결과적으로 복막투석 내 Na 이온 농도가 과도하게 높아질 수 있다. 이에 후처리 공정으로 설페이트 전분을 약염기성 음이온 교환 수지로 처리하여 용액 중에 존재하는 수소 이온의 농도를 감소시켜 pH를 일정 수준, 바람직하기로 1.5 내지 4.0을 갖도록 함으로써 후속에서 복막투석액으로 사용시 pH를 보정하기 위해 사용하는 NaOH의 사용량을 감소할 수 있다.

사용 가능한 이온교환수지는 수소 이온을 효과적으로 제거 할 수 있는 강염기성 또는 약염기성 음이온 교환수지를 사용할 수 있으며, 직접 제조하거나 시판되는 것을 사용한다. 시판 제품으로는 삼양사의 SAR 시리즈(TRILITE SAR10, TRILITE SAR11, TRILITE SAR12, TRILITE SAR20, TRILITE SAR21) 또는 AMP 시리즈(TRILITE AMP14, TRILITE AMP16, TRILITE AMP18, TRILITE AMP24, TRILITE AMP26, TRILITE AMP28)가 가능하고, 약염기성 음이온 교환수지는 WA 시리즈(DIAION WA10, DIAION WA20, TRILITE AW90) 등을 사용할 수 있으며, 바람직하게는 약염기성 음이온 교환수지 중 이온 형태가 프리베이스(free base)인 것을 선택하는 것이 바람직하다.

이러한 본 발명에 따른 설페이트 전분은 물에 용해되었을 때 삼투압을 크게 높여 복막투석용 조성물에서의 삼투압제로 바람직하게 사용할 수 있다.

복막투석용 조성물은 삼투압제, 완충액 및 전해질을 포함하며, 이때 삼투압제는 체내 축적된 수분 및 노폐물을 제거한다.

이때 설페이트 전분을 삼투압제로 사용할 경우 pH의 조절이 용이하여 Na 이온의 농도를 쉽게 조절할 수 있고, 분자량이 종래 포도당이나 포도당 중합체 보다 높아 쉽게 복막 내로 흡수되지 않아 일정 수준의 삼투 농도를 유지할 수 있다. 또한, 원료로 사용하는 전분 자체가 세포독성이 없고 생체적합성이 우수하고 체내에 존재하는 각종 효소 분해작용에 의한 분해를 지연시킬 수 있다. 특히, 장시간 삼투농도를 유지하여 한외여과를 야기시키고, 글루코스 분해산물(GDPs, glucose degradation products)의 발생을 억제하여 복막투석액에 의한 부작용을 감소시킬 수 있어 삼투압제로 바람직하게 사용할 수 있다.

바람직하기로, 설페이트 전분은 5 내지 20%, 바람직하기로 8%의 농도로 용해시켜 복막투석용 조성물의 삼투압제로 사용하고, 이때 복막투석용 조성물은 이온화된 Na 농도가 120∼150mM, 삼투압은 300∼420 mOsmol의 범위를 갖는다. 이러한 수치는 종래 시판되는 이코덱스트린의 이온화된 Na 농도가 132mM, 삼투압이 284 mOsmol인 수치와 유사한 범위를 갖는다.

실험예 7에 따르면, 설페이트 전분과 완충액 및 전해질을 혼합하여 복막투석액을 제조하고 복부수술환자의 복막 중피세포에 대한 독성 실험을 수행한 결과, 세포독성이 없음을 확인하였다.

또한, 실험예 8에서 복막투석액을 이용하여 동물실험을 수행한 결과, 본 발명에 따른 설페이트 전분을 포함하는 복막투석액(8%)이 시판되는 7.5%의 이코덱스트린 대비 높은 투석배액량을 가지고, 혈청의 이온 농도에 큰 차이가 없어 이코덱스트린을 대체할 수 있음을 확인하였다.

한편, 복막투석용 조성물의 다른 구성 성분인 완충액 및 전해질은 본 발명에서 특별히 한정하지 않으며, 이 분야에서 통상적으로 사용하는 것이면 어느 것이든 가능하다.

완충액은 조성물 제조에 사용하고 체내에 생성되어 비휘발성 산을 중화시킬 분만 아니라 복막을 통한 중탄산염의 소실도 보충할 목적으로 사용한다. 이러한 완충액으로는 락테이트, 피루베이트, 아세테이트, 시트레이트, 트리스, 아미노산, 펩티드 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택된 1종이 가능하다.

전해질은 복막투석에 의한 각종 무기질의 손실을 보충하기 위한 것으로, 칼슘, 나트륨, 마그네슘, 나트륨, 칼륨, 염소 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택된 1종이 가능하다.

이때 추가로, 필요할 경우 삼투압제로서 기존 삼투압제를 사용할 수 있다. 사용 가능한 삼투압제로는 포도당, 포도당 중합체(예컨대 말토덱스트린, 아이코덱스트린), 포도당 중합체 유도체, 시클로덱스트린, 히드록시에틸 전분, 폴리올(예컨대 자일리톨), 과당, 아미노산, 펩티드, 단백질, 아미노당, 글리세롤, N-아세틸 글루코사민(NAG) 등이 가능하다.

이하, 본 발명을 실시예를 통하여 더욱 상세히 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

<시약 및 시료>

이 실험에서 사용하는 옥수수 전분(Corn starch), 피리딘(99+%), 클로로술폰산, N,N-디메틸포름아마이드(DMF) 모두 시그마 알드리치사에서 구입하였다. 모든 시약은 별도의 정제과정 없이 사용하였다.

실시예 1: 설페이트 전분(치환도 14%)의 제조

아이스배스에 플라스크를 위치시키고, 피리딘을 7.5ml을 첨가한 후 클로로술폰산 6.2ml을 첨가한 후 15분 동안 반응시켜 황산 트리옥사이드 피리딘(ulfur trioxide pyridine)을 제조한 다음, DMF에 용해시켜 설페이트화제를 제조하였다.

별도의 플라스크에 옥수수 전분(30g), DMF(60ml)를 첨가한 후 70℃를 유지시켰다. 여기에 상기 제조한 설페이트화제를 천천히 적하시킨 후 1시간 동안 반응시켰다. 얻어진 반응액을 3차 증류수에 붇고 에탄올로 세척 후, 얻어진 침전물을 여과하여 24시간 동안 실온에서 진공 건조하였다. 얻어진 건조물을 다시 3차 증류수에 용해시키고 설페이트 전분 중량의 10~50% 중량의 활성탄(흡착제)과 이온교환 수지(TRILITE AW90, 삼양사)를 첨가하고 여과한 후 최종적으로 원심분리(14000 rpm, 30 min)를 통해 투명한 상청액을 분리하였다. 이를 48시간 동안 투석 후 동결 건조하여 흰색의 파우더인 설페이트 전분을 제조하였다.

실시예 2: 설페이트 전분(치환도 27.4%)의 제조

설페이트화제인 피리딘을 15ml을 첨가한 후 클로로술폰산 12.3ml을 첨가하여 25분 동안 반응시킨 것을 제외하고, 상기 실시예 1과 동일하게 수행하여 설페이트 전분을 제조하였다.

실시예 3: 설페이트 전분(치환도 30.9%)의 제조

실시예 4: 설페이트 전분(치환도 43%)의 제조

설페이트화제인 피리딘을 15ml을 첨가한 후 클로로술폰산 12.3ml을 첨가하여 40분 동안 반응시킨 것을 제외하고, 상기 실시예 1과 동일하게 수행하였지만 본 실시예의 경우 이온교환수지 처리를 하지 않고 설페이트 전분을 제조하였다.

실험예 1: 설페이트 전분의 ¹ H-NMR 분석

상기 제조한 실시예 1 내지 4에서 제조한 설페이트 전분의 합성 여부를 확인 하기 위해 ¹H-NMR(JNM-AL400 spectrometer, Jeol Ltd, Akishima, Japan) 분석을 수행하였다.

출발원료로 사용하는 전분의 ¹H-NMR 스펙트럼은 3.2-4.0ppm 범위에서 프로톤의 피크가 나타났고, 전분의 무수글루코스 단위체의 C2, C3, C5, C6 위치와 일치했으며, 4.6-5.5ppm에서 적도부근의 프로톤 변화가 일어났다.

이와 비교하여, 실시예 1 내지 4에서 제조한 설페이트 전분의 프로톤 피크는 전자밀도의 증가에 의해서 더 높은 진동수 쪽으로 이동했다. 3.5-5.5ppm에서 공명 진동수는 감소했고, 전분의 하이드록시기 내 수소가 설페이트기로 치환되었다.

또한, 무수글루코스 고리의 말단부분이 감소됨으로 인하여 α-아노머 탄소(anomer carbon, 5.27 ppm)와 β-아노머 탄소(4.68 ppm)에 해당하는 프로톤 피크가 사라졌다.

도 1은 실시예 3 및 4와 출발원료인 전분의 ¹H-NMR 스펙트럼으로, 도 1을 통해 상기 내용을 확인할 수 있었으며, 이러한 결과로부터 하이드록시기에서 설페이트기의 치환을 확인할 수 있었다.

실험예 2: 설페이트 전분의 FT-IR 분석

실시예 1 내지 4에서 제조한 설페이트 전분의 화학적 조성을 확인하기 위해 FT-IR 분광기(Magna 560 spectrometer, Nicolet, USA)로 측정하였다.

설페이트 전분은 S=O, S-O 결합이 존재하며, 이는 FT-IR 스펙트럼을 통해 확인할 수 있다.

도 2는 실시예 1에서 제조한 설페이트 전분의 FT-IR 스펙트럼이다. 도 2를 보면, S=O와 S-O가 1247 및 819 cm^-1에서 확인되었으며, 이를 통해 설페이트 전분의 합성이 성공적임을 알 수 있다. 이러한 FT-IR 스펙트럼은 다른 실시예 2 내지 4에서도 동일한 결과를 보였다.

실험예 3: 설페이트 전분의 원소 분석(Elemental analysis)

실시예 1 내지 4에서 제조한 설페이트 전분의 설페이트의 치환도를 확인하기 위해 원소분석기(Elemental analysis, Flash EA 1112 series, Thermo Fisher Scientific International Inc.)를 이용하여 각 원소 함량을 측정한 후, 하기 수학식 1에 의거하여 치환도를 계산하였고, 얻어진 결과를 하기 표 1에 나타내었다.

[수학식 1]

[상기 수학식 1에서, [S]는 원소 분석을 통해 설페이트 전분 내 포함된 황 원소의 농도(%)이다]

	설페이트 치환도(DS)
실시예 1	14.0%
실시예 2	27.4%
실시예 3	30.9%
실시예 4	43.0%

실험예 4: 설페이트 전분의 용해도 분석

실시예 1에서 제조한 설페이트 전분을 복막투석액의 삼투압제로 사용하기 위해, 용해도를 측정하였다.

원료로 사용한 옥수수 전분과 실시예 1의 설페이트 전분 각 50mg을 1ml의 증류수에 첨가 후 교반하였다.

도 3의 (a)는 출발원료인 전분 현탁액, (b)는 실시예 1의 설페이트 전분 수용액 사진으로, 출발원료로 사용한 전분의 경우 물에 불용성이며 불투명하였으나, 실시예 1의 설페이트 전분의 경우 물에 용해되어 투명한 용액으로 제조되어 수용성이 크게 향상되었음을 알 수 있다.

실험예 5: 설페이트 전분의 pH 조절 가능성

실시예 1 내지 4에서 제조한 설페이트 전분의 복막투석액으로의 적용 가능성을 확인하기 위해 초기 pH 및 중성 pH 조절을 확인하였다.

먼저, 실시예 1 내지 4의 설페이트 전분(0.2g)을 각각 8 중량%의 수용액으로 제조한 후, 초기 pH를 측정하고, 이를 생체내 투여 가능한 적정 pH (약 6.5- 7.5)로 조절하기 위해서 사용된 NaOH의 함량을 측정하였으며, 얻어진 결과를 하기 표 2에 나타내었다.

	초기 pH	조절 후 pH	설페이트 전분: NaOH 함량
실시예 1	4.02	7.63	0.2g: 0.2ml(1M NaOH)
실시예 2	2.98	7.05	0.2g: 0.4ml(1M NaOH)
실시예 3	3.58	8.5	0.2g: 0.2ml(1M NaOH)
실시예 4	1.53	8.7	0.2g: 0.9ml(1M NaOH)

상기 표 2를 보면, 초기 1 내지 4 범위의 pH를 갖는 설페이트 전분은 NaOH의 첨가로 인해 쉽게 중성 pH를 조절할 수 있다. 이때 실시예 4의 경우 설페이트 치환율이 높고 이온교환 수지 처리를 하지 않아 낮은 pH를 중성화하는데 다량의 NaOH를 첨가해야 했으며, 다른 실시예에서는 소량의 NaOH 첨가만으로 pH 조절이 용이함을 확인할 수 있었다.

실험예 6: 설페이트 전분의 안정성

실시예 1 내지 4에서 제조한 설페이트 전분의 안정성을 확인하기 위해 하기와 같이 수행하였다.

설페이트 전분은 내부에 수분이 존재할 경우 산성을 나타내 더 낮은 분자량을 갖는 덱스트린 형태로 분해된다. 이를 방지하게 위해 동결 건조된 설페이트 전분을 상온에서 하루 동안 진공오븐에서 완전히 수분을 제거 한 후 일정시간 동안 보관하고 이를 1주일 간격으로 샘플을 취하여 8 중량%로 물에 용해시킨 후 이의 pH 변화 및 색상 변화를 관찰하여, 하기 표 3에 나타내었다. 이때 pH는 pH 미터로 측정하였다.

또한, 고형 분말의 설페이트 전분은 데시케이터에서 보관하여 3주일 후 색상 변화를 육안으로 관찰하였고, 그 결과를 하기 표 3에 나타내었다.

	pH 변화				색상 변화
	제조직후	1주일 후	2주일 후	3주일 후	3주일 후
실시예 1	4.02	3.98	3.97	3.96	변화없음
실시예 2	2.98	2.97	2.95	2.94	변화없음
실시예 3	3.58	3.23	3.22	3.35	변화없음
실시예 4	1.53	1.44	1.43	1.38	변화없음

상기 표 3을 보면, 실시예 1 내지 4의 모든 설페이트 전분에서 pH 변화가 거의 없음을 알 수 있다. 또한, 최초 제조된 흰색 파우더 상태를 그대로 유지하여 고형 상태로도 안정성을 유지함을 확인하였다.

이하에서는 상기 실험예 1 내지 6을 통해 제조된 설페이트 전분이 복막투석의 삼투압제로 바람직하게 적용가능함을 확인하기 위해, 복막투석액을 제조하여 세포 독성 및 동물 실험을 수행하였다.

실시예 6 내지 10: 복막투석액의 제조

상기 실시예 1 내지 4에서 제조한 설페이트 전분과 완충액 및 전해질을 첨가하여 복막투석액을 제조하였다. 이때 각 이온 농도 및 최종 제조된 복막투석액의 삼투압을 측정하여 하기 표 4에 나타내었다.

삼투압은 투석액 50ul를 샘플튜브에 분주하고, 삼투측정기 osmometer 030 (GONOTEC GmbH, Berlin, Germany)의 냉장 챔버를 이용하여 빙점을 계산할 수 있다. 투석액에 존재하는 전해질, 삼투압제 등 용질의 농도가 높을수록 빙점은 더 낮아진다. 또한, 복막투석액에 존재하는 이온화된 Na등의 이온농도는 Roche modular DDP(Roche Diagnostics, Indianoplis, USA)를 이용하여 측정하였다.

	설페이트 전분(g), 농도	완충액: 소디엄 락테이트	완충액 내 이온농도 (mM)			전해질 NaCl	삼투압 (mOsmol)
	설페이트 전분(g), 농도	완충액: 소디엄 락테이트	Na	K	Cl	전해질 NaCl	삼투압 (mOsmol)
실시예 5	0.8g, 8%, (실시예 1)	40mM	129	3.1	6	40mM	275
실시예 6	0.8g, 8%, (실시예 2)	60mM	128	4.6	5	40mM	304
실시예 7	0.8g, 8%, (실시예 3)	40mM	130	1.2	6	40mM	305
실시예 8	0.8g, 8%, (실시예 4)	40mM	147	1.8	5	40mM	405
이코덱스트린		40mM	132	-	-	40mM	284

상기 표 4를 참조하면, 실시예 5 내지 8의 복막투석액은 NaOH를 이용한 pH 보정, 완충액으로 소디엄 락테이트를 사용하여 제조한 복막투석액은 이온화된 Na 농도는 128∼147mM, 삼투압은 305∼405mOsmol로 측정되었다. 이는 대조군으로 사용된 포도당 중합체 이코덱스트린의 Na 이온 농도 및 132mM, 삼투압 284mOsmol와 유사한 범위를 갖는다.

실험예 7: 복막중피세포를 이용한 독성 실험

서면 동의를 받은 복부수술환자의 장간막을 0.25% 트립신-EDTA를 첨가하여 37℃, 30분간 효소 반응을 통하여 복막 중피세포를 분리하였다. 분리된 세포는 1500 rpm에서 3분간 원심분리하고, 상층액을 제거한 다음 100U/ml 페니실린, 100mg/ml 스트렙토마이신, 20% 우태아 혈청(FBS)을 함유한 M199 배지를 이용하여 5% CO₂, 37에서 배양하여, 본 실험에 사용하였다.

독성실험은 일차 배양한 복막중피세포를 실시예 1의 8% 복막투석액, 4.25% 덱스트로즈, 7.5% 이코덱스트린을 24시간 동안 처리하여 세포의 사멸 정도를 확인하였다. 이때 대조군으로 사용한 4.25% 덱스트로즈(Baxter Healthcare, Deerfield, IL, USA) 및 7.5% 이코덱스트린(Baxter Healthcare, Deerfield, IL, USA)은 시판되는 포도당 복막투석액이다.

도 4는 실시예 5의 8% 설페이트 전분 복막투석액, 4.25% 덱스트로즈, 7.5% 이코덱스트린의 농도별 세포독성을 평가한 그래프이다. 도 4를 보면, 본 발명에 따른 실시예 8의 복막투석액은 4.25% 덱스트로즈에 비해서 원액의 1:1 비율에서 세포의 성장이 약소 감소하나, 1:3 이후에는 세포에 독성이 전혀 없음을 알 수 있다. 또한, 대표적인 포도당중 합체인 7.5%의 이코덱스트린과 유사한 패턴을 나타내, 본 발명에서 제조한 설페이트 전분을 포함하는 복막투석액이 덱스트로즈나 이코덱스트린을 대체할 수 있음을 알 수 있다.

실험예 8: SD 랫트를 이용한 초여과 실험(Ultrafiltration Test)

실험대상은 체중 250-270mg 백서(Spraque-Dawley rat) 10마리를 무작위로 추출하여 3 그룹으로 나뉜 후, 이소프루란(Isoflurane)으로 흡입 마취 후 각각의 복막투석액 (peritoneal dialysis fluid, PDF) 20ml을 21게이지 니들을 통하여 복강내 주입한 후 2시간째, 8시간째 투석배액을 채취하여 배액된 투석액의 양을 측정하였다. 이때 복막투석액은 실시예 5의 8% 설페이트 전분 복막투석액, 4.25% 덱스트로즈, 7.5% 이코덱스트린를 사용하였다.

(1) 복막투석배액량(drain volume) 측정

하기 표 5는 실시예 5의 8% 설페이트 전분 복막투석액, 4.25% 덱스트로즈, 7.5% 이코덱스트린을 복막투석에 사용 후 배액된 투석액의 양을 보여준다.

	주입량	2시간 후 배액량	8시간 후 투석배액량
실시예 5의 8% 설페이트 전분 복막투석액	20ml	19.0ml	23.5ml
4.25% 덱스트로즈	20ml	30.5ml	24.5ml
7.5% 이코덱스트린	20ml	18.5ml	13.0ml

상기 표 5를 참조하면, 4.25% 덱스트로즈 투석액의 배액량은 주입된 20ml 보다 2시간 복강에 체류 후 배액된 양이 더 많았으며, 시간이 지남에 따라 배액량이 감소하였다. 이는 초반에 저분자량의 덱스트로즈에 의해 초기 배액량은 크게 증가하지만 시간이 지남에 따라 복막을 통해 체내로 흡수되어 삼투압 효과가 감소하는 것에 기인한다.

이와 비교하여 본 발명에 따른 설페이트 전분을 포함하는 복막투석액은 2시간 체류 후 배액된 양보다 8시간 체류 후 배액된 양이 특히 더 많았으며, 이것은 7.5% 이코덱스트린의 8시간 체류 후 배액된 양보다 많았다. 초여과로 인한 배액량의 증가는 본 발명에 따른 설페이트 전분을 포함하는 복막투석액이 오랜 시간 동안 삼투 활성을 가져 만성신부전 환자의 수분과잉 상태를 조절하는데 효과가 있는 것으로 생각할 수 있다. 이러한 결과로부터 설페이트 전분은 이코텍스트린보다 분자량이 크고 도입된 설페이트기에 의해 복강내에서 오랫동안 삼투압의 감소 없이 사용될 수 있어 새로운 복막투석액의 삼투압 기제로서 이코덱스트린보다 더욱 효과적임을 알 수 있다.

(2) 혈청 이온농도 측정

투석액을 복강에 주입하고 8시간째 투석배액을 채취한 후 각각의 실험군에서 혈액을 채취하여 혈청의 염소(Cl), tCO₂, 칼륨(K), 나트륨(Na)을 Roche modular DDP(Roche Diagnostics, Indianoplis, USA)와 Hitachi 7600-110 (HitachiCo.,Japan) 이용하여 측정하였고, 얻어진 결과를 하기 표 6에 나타내었다.

	시간	염소(Cl)	total CO₂	칼륨(K)	나트륨(Na)
실시예 5의 8% 설페이트 전분 복막투석액	2시간 후	87	34	3.5	141
실시예 5의 8% 설페이트 전분 복막투석액	8시간 후	80	29	5.0	137
4.25% 덱스트로즈	2시간 후	99	30	4.2	145
4.25% 덱스트로즈	8시간 후	95	26	4.9	141
7.5% 이코덱스트린	2시간 후	97	26	4.4	141
7.5% 이코덱스트린	8시간 후	96	26	4.9	141

상기 표 6을 참조하면, 본 발명에 따른 실시예 5의 8% 설페이트 전분 복막투석액은 4.25%의 덱스트로즈와 7.5%의 이코덱스트린과 비교하여 혈청 염소 농도가 낮았으며, tCO₂, 칼륨(K), 나트륨(Na)의 이온 농도는 유사함을 알 수 있다.

상기 실험예 1 내지 8의 결과를 통해, 본 발명에 따른 설페이트 전분은 종래 시판되는 4.25% 덱스트로즈 및 7.5% 이코덱스트린과 비교하여 동등 이상의 효과를 가져, 이들을 대체할 수 있는 복막투석용 삼투압제로 사용이 가능함을 알 수 있다.

본 발명에 따른 설페이트 전분은 복막투석용 삼투압제로 바람직하게 사용 가능하다.

Claims

글루코스 고리 내 하이드록시기의 수소 전부 또는 일부가 설페이트기로 치환된 설페이트 전분을 포함하는 복막투석액용 삼투압제.
제1항에 있어서, 상기 설페이트 전분은 설페이트기의 설페이트기의 치환도(DS: degree of substitution)가 10 내지 60%인 것을 특징으로 하는 복막투석액용 삼투압제.
제1항에 있어서, 상기 설페이트 전분은 전분을 설페이트화제와 반응시켜 제조하는 것을 특징으로 하는 복막투석액용 삼투압제.
제3항에 있어서, 상기 설페이트화제는 클로로술폰산, 삼산화황, 황산, 발연황산, 아실술페이트 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택된 1종을 포함하는 것을 특징으로 하는 복막투석액용 삼투압제.
제3항에 있어서, 설페이트화제와 반응 이후 강염기성 또는 약염기성 음이온교환수지로 통과시키는 후처리를 추가로 수행하는 것을 특징으로 하는 복막투석액용 삼투압제.
삼투압제, 완충액, 및 전해질을 포함하는 복막투석용 조성물에 있어서, 상기 삼투압제가 제1항의 설페이트 전분을 포함하는 복막투석액용 삼투압제인 것을 특징으로 하는 복막투석용 조성물.
제6항에 있어서, 상기 복막투석용 조성물은 삼투압제인 설페이트 전분을 1 내지 20%의 농도로 포함하는 것을 특징으로 하는 복막 투석용 조성물.
제6항에 있어서, 상기 복막투석용 조성물은 이온화된 Na 농도가 120∼150mM, 삼투압은 280∼420 mOsmol의 범위를 갖는 것을 특징으로 하는 복막투석용 조성물.