KR20140092226A - 나노입자 조성물에서 방사성 핵종의 포집 - Google Patents

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안카트리네 루이사 페테르센
요나스 로사거 헨릭센
팔레 헤덴그란 라스무센
안드레아스 키예르
토마스 라르스 안드레센
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테크니칼 유니버시티 오브 덴마크
릭스하스피탈렛
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Abstract

본 발명은 대상체의 암 및 다른 질환의 진단에 유용한 이미징 조성물의 기술분야와 관련된다. 특히, 본 발명은 캡슐화된 금속 실체물, 예를 들어, 방사성 핵종, 예를 들어, 61Cu 및 64Cu 구리 동위원소를 갖는 새로운 리포솜 조성물을 포함하는 진단 화합물의 등급과 관련된다. 본 발명은 방사성 핵종과 같은 금속 실체물을 갖는 전달 시스템, 예를 들어, 리포솜 조성물을 로딩하는 새로운 방법, 및 표적화된 진단 및 표적 부위, 예를 들어, 암 조직 및, 일반적으로 누출 혈관과 관련된 병리학적 상태의 치료를 위한 리포솜의 사용과 추가로 관련된다. 본 발명은 양전자 방사 단층 촬영 (PET) 이미징 기술을 활용하는 새로운 진단 기구를 제공한다.

Description

나노입자 조성물에서 방사성 핵종의 포집{ENTRAPMENT OF RADIONUCLIDES IN NANOPARTICLE COMPOSITIONS}
본 발명은 대상체에서 암 및 다른 질환의 진단에 유용한 조성물을 이미징하는 기술분야와 관련된다. 특히, 본 발명은 캡슐화된 방사성 핵종 또는 금속 실체물, 예를 들어, 61Cu 및 64Cu 구리 동위원소가 들어있는 새로운 리포솜 조성물을 포함하는 진단 화합물의 등급과 관련된다. 본 발명은 방사성 핵종과 같은 금속 실체물을, 리포솜 조성물과 같은 전달 시스템에 로딩하는 새로운 방법 및 표적 부위, 예를 들어, 암 조직 및, 일반적으로, 누출 혈관과 관련된 병리학적 상태의 표적화된 진단 및 치료를 위한 방사성 핵종과 같은 금속 실체물을 포함하는 리포솜의 사용과 추가로 관련된다. 본 발명은 양전자 방사 단층 촬영 (positron emission tomography; PET) 이미징 기술을 이용하는 새로운 진단 기구를 제공한다.
리포솜은 다양한 캡슐화된 및/또는 막-통합된 치료 또는 진단의 실체물을 전달하기 위해 소포의 역할을 할 수 있다. 리포솜은 보통 하나 이상의 이중층의 막에 의해 외부 환경으로부터 분리된 내부 코어로 구성된 나노 규모 소포를 특징으로 한다. 이중층 막은 양친매성 분자, 예를 들어, 소수성 및 친수성 도메인을 포함하는 합성 또는 천연 지질에 의해 형성될 수 있다 [Lasic, Trends Biotechnol., 16: 307-321, 1998]. 이중층 막은 또한 입자를 구성하는 양친매성 폴리머 (예를 들어, 폴리머솜 및 폴리머 입자)에 의해 형성될 수 있다.
리포솜은 유용한 성질을 가질 수 있거나 유용한 활성을 제공하는 화학적 화합물, 또는 방사성 핵종과 같지만, 이에 제한되지 않는 실체물의 담체의 역할을 할 수 있다. 이 목적을 위해, 리포솜은 리포솜-통합 형태로 원하는 실체물을 함유하도록 제조된다. 리포솜 통합 실체물은 리포솜 막의 외표면과 결합될 수 있고 리포솜의 내부 코어에 또는 리포솜의 이중층 내에 위치할 수 있다. 리포솜에 방사성 핵종을 포함하는 방법은 예를 들어, 리포솜 제조 후 표면 표지 [Phillips, Adv Drug Deliv Rev., 37: 13-32, 1999], 미리 형성된 리포솜의 지질 이중층으로 표지 포함 [Morgan et al., J Med Microbiol., 14: 213-217, 1981], 제조 중에 지질 킬레이터 접합체에 의해 미리 형성된 리포솜의 표면 표지 [Goto et al., Chem harm Bull. (Tokyo), 37: 1351-1354, 1989; Seo et al., Bioconjucate Chem., 19: 2577-2584, 2008], 및 미리 형성된 리포솜의 수성 단계 로딩 [Hwang et al., Biochim Biophys Acta., 716: 101-109, 1982; Phillips et al., Int J Rad Appl Instrum B, 19: 539-547, 1992; Gabizon et al., J Liposome Res., 1: 123-125, 1988; Henriksen et al., Nucl Med Bio., 31: 441-449, 2004]이다. 미리 형성된 리포솜의 수성 단계 로딩에 의한 실체물의 리포솜으로 통합은 또한 실체물을 "로딩"하고 이로 인해 실체물을 "캡슐화" 또는 "포집"하는 것을 나타낸다.
수성 단계 로딩을 통해 실체물을 리포솜의 내부에 캡슐화하는 것은 리포솜 내부에 실체물의 보호 장소 때문에, 가장 큰 생체 내 안정성을 제공하는 것으로 보인다. 실체물을 리포솜에 캡슐화하는 목적은 종종 실체물을 생체 내 파괴적 환경 및 신속한 분비로부터 보호하기 위한 것이다. 실체물의 포집은 캡슐화된 실체물이 주로 활성이 유리한 부위 또는 환경에서 실체물의 활성을 적용하지만 활성이 쓸모없거나 바람직하지 않은 다른 부위에서는 덜 적용하는 기회를 제공한다. 외표면에 부착된 PEG 사슬을 가진 리포솜은 혈류의 순환시간을 연장하는 것으로 알려져 있다. 이들 리포솜 조성물은 효과적으로 면역 시스템을 회피하며, 그렇지 않으면 이것은 주사 직후 리포솜을 공격할 것이고, 리포솜의 빠른 제거 또는 파열 및 내부에 포집된 약제의 조기 방출을 일으킨다. 혈액 순환시간을 증가시킴으로써, 리포솜에 포집된 약제는 그것이 표적 조직에 도달할 때까지 리포솜 내에 유지된다. 이 현상은 종양 지역 또는 염증 부위에서 장기 순환 나노입자의 누적이 이들 지역의 누출 맥관 구조 및 효과적인 림프 배수 시스템의 결핍 때문인 경우, 수동적 표적화 전달을 나타낸다. 예를 들어, 장기 순환 리포솜 내에 포집된 방사능-진단 실체물은 이들의 진단이 가능한 대상체 내에 병에 걸린 부위를 수동적으로 표적화함으로써 전달될 수 있다. 능동적-또는 리간드 표적화 전달 시스템은 세포 표면 항원 또는 수용체에 대하여 표적화된 표면에 부착된 리간드가 들어있는 리포솜 조성물을 나타낸다 [Allen, Science, 303: 1818-1822, 2004]. 방사성 핵종 캡슐화된 리포솜 조성물을 포함하는 하나의 조제물에서 표적화되고 장기 순환하는 리포솜의 성질을 결합하는 것은 표적 부위, 예를 들어, 종양에서 방사능 위치의 특이성 및 강도를 크게 향상시킨다. 이상적으로, 이러한 리포솜 조성물은 원하는 실체물, 예를 들어, (i) 높은 로딩 효율, 즉, 캡슐화 공정에 사용된 실체물의 총량에 대하여 캡슐화된 실체물의 높은 퍼센트를 갖고, (ii) 안정한 형태, 즉, 저장시 또는 일반적으로 리포솜이 리포솜 포집된 실체물이 그것의 의도된 활성을 적용할 것으로 예상되는 일반적으로 리포솜이 부위 또는 환경에 도달하기 전에 캡슐화된 실체물이 최소한으로 배출 (즉, 누출) 되는 화학적 화합물 또는 방사성 핵종을 포함하도록 제조될 수 있다.
방사성 핵종의 리포솜과 같은 나노입자로 포집은 지질막을 통해 금속 이온을 수송할 수 있는 이온 투과 담체 (ionophore)로 불리는 화학적 화합물의 사용을 통해 얻어질 수 있다. 막 장벽 (barrier)를 통과할 때 방사성 핵종은 바람직하게 거기에 그것의 더 강한 친화도로 인해 바람직하게 리포솜 조성물의 내부에 캡슐화된, 킬레이터에 결합하며, 자유 이온 투과 담체의 방출, 및 리포솜 조성물에서 방사성 핵종의 포집을 허용한다.
구리 동위원소는 진단 및/또는 치료의 적용에 사용에 대하여, 매우 흥미롭다. 진단의 적용을 위해 이것은 양전자-방출기 (positron-emitter) 61Cu 및 64Cu와 관련되며, 이것은 양전자 방사 단층 촬영 (PET) 진단 이미징에 사용될 수 있다. 64Cu는 모든 붕괴 양상을 소유하고, 12.7 h의 반감기를 갖는, 원하는 구리 동위원소이며, 그것은 생물학적 연구에 바람직하다. 약 6-12 h의 반감기가 염증 조직 또는 암 표적에서 리포솜의 충분한 누적을 허용하는 것이 이상적인 것으로 나타나며, 표적의 조기 확인을 허용하는데 충분한 배경 제거를 제공한다 [Gabizon et al., Cancer Res., 50: 6371-6378, 1990]. 게다가, 64Cu는 모든 구리 동위원소의 화학적 성질을 나타내는 모델 핵종으로서 사용될 수 있다.
치료의 적용에 이상적인 방사성 동위원소는 β-, α-및 오거 전자 방출기 (auger electron-emitter)와 같이 낮은 침투성 방사성을 갖는 것들이다. 이러한 방사성 동위원소의 예는 67Cu, 67Ga, 225Ac, 90Y, 177Lu 및 119Sb이다. 낮은 에너지를 방출하는 방사성 동위원소가 방사성 의약품의 형태로 표적 부위에 도달할 때, 방출된 에너지는 표적 부위에만 침착되고 가까운 정상 조직은 방사선 조사되지 않는다. 조직에서 다른 방사성 동위원소로부터 방출된 입자의 에너지 및 그것들의 범위, 뿐만 아니라 그것들의 반감기는 다르고, 가장 적절한 방사성 동위원소는 적용, 질환 및 질환 조직의 접근에 의존적으로 다를 것이다.
진단 적용에 이상적인 방사성 동위원소는 상대적으로 짧은 반감기를 갖는 것들, 및 양전자 방사 단층 촬영 (PET) 및/또는 단일 광자 방출 단층 촬영 (single photon emission computed tomography; SPECT)과 같은 단일 이미징 기술에 의해 검출되는 높고 침투성 방사능을 갖는 것들이다. 방사성 핵종의 반감기는 또한 방사성 의약품을 합성하기 위해 원하는 화학 반응을 수행할 만큼 길어야 하고 환자의 표적 조직에서 누적을 허용하는 한편, 비-표적 기관을 통한 제거를 허용할 만큼 길어야 한다. 방사성 핵종, 64Cu는 이미징 [Dehdashti et al., J Nucl Med. 38: 103P, 1997] 및 치료 [Anderson et al., J Nucl Med., 36: 2315-2325, 1998]에 적용에 관하여 다목적 동위원소인 것으로 증명되었다. 방사성 의약품 및 예를 들어, 61Cu (T½ = 3.33 h) 및 64Cu (T½ = 12.7 h)와 같은 방사성 핵종으로 구성된 방사성 표지된 리포솜 조성물은 단일 광자 방출 단층 촬영 (SPECT)의 주요 이점이 있는, 양전자 방사 단층 촬영 (PET) 기술에 의해 이미징에 이용될 수 있다: a) 검출분야가 (비-발산) 실린더 부피를 한정하고 민감도 및 해상도 둘 다는 검출분야에서 달라지지 않기 때문에, 콜리메이터 (collimator) 대신에, 서로 반대편의 한 쌍의 신틸레이터 (scintillator)에 의해 동시에 검출된 (< 10-9초) 광자들만이 등록되고, 민감도는 현저히 개선되었고 (x 30-40) 공간분해능 (spatial resolution)은 약 2의 인자 (< 5 mm)에 의해 향상되는 소멸 일치 검출 (annihilation coincidence detection; ACD) 기술을 이용 [Kostarelos et al., J 리포솜 Res., 9: 429-460, 1999]; b) PET 스캐너는 광자 감쇠, 산란에 대하여 및 임의로 대한 수정 후 방사능 농도의 단위 (예를 들어, Bq/ml)로 모든 이미지를 제공하고, 이로 인해 PET를 SPECT보다 더 정량적 기술인 것으로 생각된다 [Seo, Curr. Radiopharm., 1: 17-21, 2008].
특허 출원 WO/2001/060417, WO/2004/082627, WO/2004/082626 및 US 20090081121은 방사성 핵종의 리포솜으로 이온 이동성 로딩에 기초한 방법을 설명한다. 게다가, 리포솜으로 로딩되는, 개시된 방사성 핵종은 무거운 방사성 핵종이고 11C, 18F, 76Br, 77Br, 89Zr, 67Ga, 111In, 177Lu, 90Y 및 225Ac이다. 진단적 관점에서, 이들 접근법은 방사성 핵종의 제한된 사용 때문에, PET 이미징 적용에 사용 불가능하지만 SPECT에 사용 가능하다.
특허 EP386 146 B1은 중성자 캡쳐 종양 치료를 위한 리포솜 캡슐화 화합물에 대한 조성물 및 사용 방법을 설명한다. 하지만, 이들 리포솜은 안정 요소 (예를 들어, 붕소)와 함께 로딩되었으며, 활성화 후에만 방사능이 된다.
이론적 연구에서, Kostarelos et al. 은 방사성 핵종 131I, 67Cu, 188Re 또는 211At 중 하나로 표지된 리포솜의 치료적 가능성을 분석하였지만, 표지된 리포솜을 제조하는 화학적 공정은 제안되지 않았다 [Kostarelos et al., J Liposome Res, 9:407-424, 1999].
방사성 구리 동위원서에 기초한 소수의 방사성 의약품이 발견되었고 현재 이용 가능하다. 예는 저산소증 (hypoxia) 마커인 60Cu-ATSM, 및 64Cu-ATSM 및 64Cu-PTSM이며, 이것은 종양 치료용 잠재적 약제로서 제안된다. 물질의 추가 등급은 구리-표지된 펩티드 및 이기능성 킬레이터를 통해 방사성 구리가 생체분자에 결합되는 항체이다. 방사성 의약품으로서 이용 가능한, 구리가 로딩된 리포솜 조성물은 없다.
여러 조사 그룹은 이온 투과 담체를 사용하지 않고 지질 이중층을 통한 음이온 및 양이온의 투과성을 측정하였다. 분야에서 리포솜 조성물과 같은 인지질 이중층의 낮은 이온 투과성 [Paula et al., Biophys. J., 74:319-327, 1998; Hauser et al., Nature, 239:342-344, 1972; Ceh et al., J. Phys. Chem. B, 102:3036-3043, 1998; Mills et al., Biochim. Biophys. Acta, 1716:77-96, 2005; Papahadjopoulos et al., Biochim. Biophys. Acta, 266:561-583, 1971; Puskin, J. Membrane Biol, 35:39-55, 1977]이 전하를 띈 이온 종에 대하여 매우 불리한 로딩 동역학으로 이어진다는 것이 분야에 알려져 있다. 그러므로 트랜스-이중층 확산 속도를 증가시키고, 이로 인해 1가, 2가 및 3가 양이온의 리포솜과 같은 나노입자에 로딩을 향상시키거나 증가시키기 위해 이온 투과 담체를 사용하는 것이 일반적인 방법이다.
특허 출원 WO2006/043083은 방사성 핵종을 로딩하는 방법을 설명하며, 이것은 이온 투과 담체 및 킬레이터를 수반한다. 출원에서 킬레이터는 이온 투과 담체일 수도 있다는 것이 언급된다.
특허 출원 WO03/041682는 리포솜을 둘러싸는 생물학적 약제를 개시한다. 출원에서 이온-구배, 이온 투과 담체, pH 구배 및 금속 복합체 형성 과정이 생물학적 약제가 들어있는 리포솜의 활성 로딩에 사용될 수 있다는 것이 개시된다. 출원은 금속 실체물과 함께 나노입자를 로딩하는 방법을 개시하지 않으며 삼투 구배는 로딩 효율 또는 로딩 속도를 증가시키기 위해 사용된다.
진단 적용의 기술분야에서 다양한 화합물, 예를 들어, 방사능-진단 및 PET에 유용한 이미징 실체물의 전달에 유용한 다양한 리포솜 조성물을 제공하는 것이 필요하다.
본 발명은 리포솜 조성물 또는 나노입자에 캡슐화된 금속 실체물 및/또는 방사성 핵종을 제조하는 새롭고 개선된 방법과 관련된다. 분야에서 공통적 일반상식인 것과 달리, 발명자는 금속 실체물 및/또는 방사성 핵종의 로딩이 이온 투과 담체를 사용하지 않고도 효율적이다. 따라서, 본 발명의 새롭고 창의적인 방법에서, 금속 실체물 또는 방사성 핵종은 수송분자로서 이온 투과 담체를 사용하지 않고 나노입자에 로딩된다.
게다가, 본 발명의 나노 입자의 막에서 삼투성 스트레스의 존재는 발명자에 의해 금속 실체물/방사성 핵종의 나노입자의 내부에 로딩 단계를 개선하는 것으로 발견되었다. 양전자-방출기 64Cu는 모든 구리 동위원소의 화학적 성질을 나타내는 모델 핵종으로서 사용된다.
금속 실체물과 함께 로딩된 나노입자 조성물의 제조 방법은 본 발명에 따라 이온 투과 담체의 사용을 수반하지 않으며
a. 소포 형성 성분 및 상기 소포 형성 성분에 의해 둘러싸인 약제-포집 성분을 포함하는 나노입자 조성물을 제공하는 단계
b. 금속 실체물을 포함하는 용액 중의 나노입자 조성물의 배양에 의해 소포 형성 성분에 의해 형성된 막을 통해 양이온성 금속 실체물의 전이를 가능하게 함으로써 입자 금속 실체물을 나노입자 조성물의 내부에 포집 (로딩) 하는 단계
를 포함하며 상기 포집 단계를 수반하는 배양은 금속 실체물의 나노입자, 예를 들어, 리포솜에 로딩으로 생각된다.
본 발명에 따라, 방사성 핵종의 로딩 효율 또는 포집은 10%보다 더 크다. 이러한 로딩 효율은 10% 내지 100%, 바람직하게 80% 내지 100%, 더 바람직하게 95% 내지 100%의 범위일 수 있다.
본 발명의 한 구체예에 따라, 배양 온도는 100 ℃보다 낮다, 예를 들어, 10 ℃ 내지 80 ℃, 예를 들어, 22 ℃ 내지 80 ℃, 또는 예를 들어, 30 ℃ 내지 80 ℃의 범위이다.
본 발명의 배양시간은 48시간보다 더 짧은 기간, 예를 들어, 1분 내지 240분, 바람직하게 1분 내지 120분 및 더 바람직하게 1분 내지 60분이다.
본 발명의 금속 실체물은 구리 (61Cu, 64Cu, 및 67Cu), 인듐 (111In), 테크네튬 (99 mTc), 레늄 (186Re, 188Re), 갈륨 (67Ga, 68Ga), 루테튬 (177Lu), 악티늄 (225Ac), 이트륨 (90Y), 안티몬 (119Sb), 주석 (117Sn, 113Sn), 디스프로슘 (159Dy), 코발트 (56Co), 철 (59Fe), 루테늄 (97Ru, 103Ru), 팔라듐 (103Pd), 카드뮴 (115Cd), 텔루륨 (118Te, 123Te), 바륨 (131Ba, 140Ba), 가돌리늄 (149Gd, 151Gd), 테르븀 (160Tb), 금 (198Au, 199Au), 란타늄 (140La), 및 라듐 (223Ra, 224Ra)로 구성된 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 방사성 핵종을 포함하거나 이들로 구성될 수도 있다.
본 발명의 금속 실체물은 또한 이들의 2가 또는 3가 이온을 포함하는 Gd, Dy, Ti, Cr, Mn, Fe, Co, Ni의 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 금속 실체물을 포함할 수도 있다.
본 발명의 한 구체예에서, 나노입자의 제조 방법은 배양 중에 나노입자의 외부 및 나노입자의 내부 사이의 삽투압의 차이, 예를 들어, 5-800 mOsm/L의 차이, 또는 바람직하게 5-100 mOsm/L의 차이가 있는 단계를 수반한다.
본 발명의 소포-형성 성분은 인지질, PEG화된 인지질 및 콜레스테롤로 구성된 그룹으로부터 선택된 화합물 중 하나 이상, 예를 들어, HSPC, DSPC, DPPC, POPC, CHOL, DSPE-PEG-2000, DSPE-PEG-2000-RGD 및 DSPE-PEG-2000-TATE의 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 양친매성 화합물을 포함한다.
본 발명의 약제-포집 성분은 킬레이터, 환원제 및 상기 방사성 핵종으로 저 용해도 염을 형성하는 약제, 예를 들어, 1,4,7,10-테트라아자시클로도데칸-1,4,7,10-테트라아세트산 (DOTA), 1,4,8,11-15테트라아자시클로테트라데칸-1,4,8,11-테트라아세트산 (TETA), 1,4,7,10-테트라아자시클로도데칸-1,4,7,10-테트라(메탄포스폰산) (DOTP), 시클람 및 시클렌으로 구성된 그룹으로부터 선택된 킬레이터로 구성된 그룹으로부터 선택된다.
본 발명의 나노입자의 내부 pH는 4 내지 8.5, 예를 들어, 4.0 내지 4.5, 예를 들어, 4.5 내지 5.0, 예를 들어, 5.0 내지 5.5, 예를 들어, 5.5 내지 6.0, 예를 들어, 6.0 내지 6.5, 예를 들어, 6.5 내지 7.0, 예를 들어, 7.0 내지 7.5, 예를 들어, 7.5 내지 8.0, 예를 들어, 8.0 내지 8.5의 범위 내에 있다.
본 발명에 의해 제공된 방사성 표지된 나노입자의 안정성은 방사능의 20% 미만 누출, 예를 들어, 15% 미만 누출, 예를 들어, 12% 미만 누출, 예를 들어, 10% 미만 누출, 예를 들어, 8% 미만 누출, 예를 들어, 6% 미만 누출, 예를 들어, 4% 미만 누출, 예를 들어, 3% 미만 누출, 예를 들어, 2% 미만 누출, 예를 들어, 1% 미만 누출에 대하여 관찰된다.
본 발명은 다음을 포함하는 일부의 키트를 추가로 제공한다:
a. i) 소포 형성 성분, 및 ii) 소포 형성 성분에 의해 둘러싸인 약제-포집 성분을 포함하는 나노입자 조성물; 및
b. 나노입자에 로딩을 위해 금속 실체물을 함유하는 조성물
게다가, 본 발명은 다음을 포함하는 금속 실체물과 함께 로딩된 나노입자 조성물을 제공한다:
i. 소포 형성 성분,
ii. 상기 소포-형성 성분에 의해 둘러싸인 약제-포집 성분;
iii. 나노입자 조성물의 내부 측면에 포집된 금속 실체물.
본 발명의 특정 구체예에서, 나노입자의 내부 pH는 6 내지 8.5, 예를 들어, 6.0 내지 6.5, 예를 들어, 6.5 내지 7.0, 예를 들어, 7.0 내지 7.5, 예를 들어, 7.5 내지 8.0, 예를 들어, 8.0 내지 8.5의 범위이다.
본 발명은 필요한 대상체에서 치료, 관찰 또는 진단하는 방법, 예를 들어, 양전자 방사 단층 촬영 (PET) 스캐닝 또는 단일 광자 방출 단층 촬영 (SPECT) 스캐닝 및 자기 공명 영상 (magnetic resonance imigaing; MRI)로부터 선택될 수도 있는 이미징 방법에 사용되는 나노입자 조성물을 추가로 제공한다.
본 발명은 본 발명에 의해 개시된 방법에 의해 제조된 나노입자 조성물을 추가로 제공한다.
도 1: 64Cu-리포솜의 분리 및 Sephadex G-25 컬럼을 사용하는 크기 배제 크로마토그래피 (size exclusion chromatography; SEC)로 자유 비-포집된 64Cu. 미리 캡슐화된 DOTA와 함께 DSPC/CHOL/DSPE-PEG2000으로 구성된, 미리 형성된 리포솜은 60분의 배양시간 및 50-55 ℃의 배양 온도를 사용하여 64Cu와 함께 로딩되었으며 96.7%만큼 높은 캡슐화 효율을 달성하였다.
도 2: 177Lu-리포솜의 분리 및 Sephadex G-25 컬럼을 사용하는 크기 배제 크로마토그래피 (SEC)로 자유 비-포집된 177Lu. 미리 캡슐화된 DOTA와 함께 DSPC/CHOL/DSPE-PEG2000으로 구성된, 미리 형성된 리포솜은 60분의 배양시간 및 50-55 ℃ 배양 온도를 사용하여 177Lu와 함께 로딩되었으며 81.0%의 캡슐화 효율을 달성하였다.
도 3: 이온 투과 담체 (점선) 없이 및 이온 투과 담체 (2HQ) (실선)가 있는 배양 온도의 함수로서, 64Cu의 리포솜으로 로딩 효율. 50-55 ℃에서 이온 투과 담체 없이 리포솜에 로딩된 64Cu의 로딩 효율은 96.7%였다.
도 4: 표준 곡선 및 DSPC, CHOL 및 DSPE-PEG2000로 구성된 리포솜에 Cu (II)의 원거리 로딩 실험으로부터 얻어진 결과의 플롯. 복합체를 이루지 않은 Cu2 +는 Cu(II)-선택적 전극을 통해 측정되었고 달성된 로딩 효율은
Figure pct00001

였다. 100% > 95%. 빈 사각형은 HEPES 버퍼에서 Cu(II) 표준 곡선을 나타내고, x 표시는 HEPES 10 mM, 150 mM NaN03, pH 6.8을 나타내고, 빈 원은 로딩되지 않은 리포솜 닫힌 원은 로딩된 리포솜을 나타낸다.
도 5: 1,2-디-0-헥사데실-sn-글리세로-3-포스포콜린 (1,2-디-O-DPPC)의 구조.
도 6: 혼합물이 10 mol% DSPE-PEG2000 및 a) 20 mol% 콜레스테롤 및 70 mol% DSPC, b) 25 mol% 콜레스테롤 및 65 mol% DSPC c) 30 mol% 콜레스테롤 및 60 mol%, d) 35 mol% 콜레스테롤 및 55 mol% DSPC, e) 40 mol% 콜레스테롤 및 50 mol% DSPC, f) 50 mol% 콜레스테롤 및 40 mol% DSPC 및 g) 분자비 50:40:10의 DSPC/CHOL/DSPE-PEG2000로 구성된, 정제된 킬레이터-함유 (10 mM DOTA) 리포솜을 함유할 때 HEPES 버퍼에서 DSPC/CHOL/DSPE-PEG2000분산의 시차 주사 열량법 (differential scanning calorimetry; DSC) 스캔.
도 7: 3개의 다른 온도 (50 ℃, 40 ℃ 및 30 ℃)와시간의 함수로서 이온 투과 담체를 사용하지 않고 킬레이터 함유 리포솜에 64Cu2 + 로딩 효율. 리포솜은 분자비 50:40:10의 DSPC/CHOL/DSPE-PEG2000로 구성된다. 리포솜의 내부 및 외부 삼투압 사이의 차이는 Δ(mOsm/L) = +75였다 (내부 삼투압보다 더 높음). 내부 64Cu-DOTA 복합체 및 캡슐화되지 않거나 복합체를 형성하지 않는 자유 64Cu2 + 사이의 비율은 방사능-박층 크로마토그래피 (방사능-TLC)를 사용하여 64Cu-로딩 효율 (%)로서 측정된다.
도 8: 3개의 다른 온도 (50 ℃, 40 ℃ 및 30 ℃)와시간의 함수로서 이온 투과 담체를 사용하지 않고 킬레이터 함유 리포솜에 64Cu2 + 로딩 효율. 리포솜은 분자비 50:40:10의 DSPC/CHOL/DSPE-PEG2000로 구성되고 같은 내부 및 외부 리포솜 삼투압을 갖는다. 내부 64Cu-DOTA 복합체 및 캡슐화되지 않거나 복합체를 형성하지 않는 자유 64Cu2 + 사이의 비율은 방사능-TLC를 사용하여 64Cu-로딩 효율 (%)로서 측정된다.
본 발명은 효율적인 로딩 온도 및 선호하는 리포솜 조성물에 기초하는, 리포솜 조성물 또는 나노입자 내에 캡슐화된 금속 실체물 및/또는 방사성 핵종의 새롭고 개선된 제조 방법과 관련된다. 게다가, 본 발명의 나노입자의 막의 삼투성 스트레스의 존재는 금속 실체물/방사성 핵종의 나노입자의 내부에 로딩하는 단계를 개선하기 위해 발명자에 의해 발견되었다.
발명자는 놀랍게도 막관통 확산 속도를 향상시키는 이온 투과 담체를 추가하지 않고 전하를 띈 종 (이온)을 나노입자에 로딩하는 방법을 발견하였다. 따라서, 본 발명은 어떤 친유성 이온 투과 담체 또는 어떤 다른 담체도 추가하지 않고 방사성 핵종 (예를 들어, 1가, 2가 및 3가 양이온)의 리포솜 조성물 내로 빠르게 포집하는 새로운 방법을 개시한다.
지난 40년 동안 친유성 이온 투과 담체 또는 복합체는 생체 내 신티그래프 이미징 및 내부 방사선 치료의 적용을 위해 나노입자에서 방사성 핵종 (예를 들어, 111In3+, 177Lu3 +, 67/68Ga2 +, 99 mTc04 -)의 캡슐화의 효율을 향상시키기 위해 사용되었다. 친유성 이온 투과 담체를 사용하여 캡슐화 (또는 로딩) 효율은 90-95%의 높은 수준에 도달했다. 본 발명은 어떤 친유성 이온 투과 담체 또는 다른 금속 담체도 사용하지 않고 유사하거나 더 높은, 방사성 핵종의 리포솜 조성물 내로 로딩 효율을 얻을 수 있는 새로운 방법과 관련된다. 이온 투과 담체의 사용을 수반하지 않는, 금속 실체물 및/또는 방사성 핵종을 나노입자 내에 로딩하는 제조 방법은 다수의 이점을 갖고, 이온 투과 담체는 포유동물에, 특히 사람에서 독성일 수도 있다. 그러므로, 이온 투과 담체의 사용으로 제조된 나노입자는 규제 당국의 승인 전에 대규모 독성 테스트를 겪을 필요가 있다. 게다가, 이러한 나노입자는 가능한 많은 이온 투과 담체를 제거하기 위해 사용 전에 정제될 필요가 있을 것이고 이러한 정제의 규모는 이온 투과 담체의 수준이 특정 역치보다 낮다는 것을 확인하기 위해 관찰될 필요가 있다.
본 발명의 나노입자의 제조는 소수의 성분으로 및 대규모 정제에 대한 필요 없이 쉽게 수행된다. 본 발명의 나노입자가 환자에게 투여될 때, 독성과 같은 부작용 또는 다른 부작용의 위험이 감소된다. 게다가, 새로운 제조 방법은 나노입자의 안정성을 개선하는 나노입자의 내부 pH 범위를 허용한다. 이 방법에서, 본 발명의 나노입자, 방법 또는 일부의 키트의 사용은 유효 기간까지 이용 가능하고, 본 발명의 사용과 관련된 저장 요건 및 다른 양태는 선행 기술과 비교하여 개선된다.
또한, 친유성 이온 투과 담체가 방사성 핵종, 예를 들어, 양이온의 리포솜 내로 캡슐화의 효율을 향상시키는 그것의 유용성을 찾는 한편, 극친유성 이온 투과 담체는 또한 리포솜으로부터 포집된 방사성 핵종의 방출을 가능하게 한다. 포집된 물질의 방출은 조기에 생체 내 리포솜의 분포의 잘못된 추정, 뿐만 아니라 진단 이미지의 질의 저하를 일으킬 수 있다.
게다가, 본 발명은 금속 실체물의, 염증 부위 또는 암 조직과 같이 누출 혈관과 관련된 병리학적 상태의 조직으로 전달되는 나노입자를 제공함으로써 진단 적용의 기술분야에서 필요를 해결한다.
로딩 효율 및 로딩 속도
리포솜에 대한 로딩 방법의 로딩 효율은 리포솜 캡슐화된 방사성 핵종으로부터 자유 방사성 금속 이온 또는 자유 방사성 표지된 복합체를 분리할 수 있는 이온-교환 크로마토그래피, 방사능 박층 크로마토그래피 (방사능-TLC), 투석, 또는 크기 배제 크로마토그래피 (SEC)를 포함하는, 업계에서 통상적인 방법의 사용에 의해 측정될 수도 있다. SEC를 사용할 때, 자유 방사성 금속 이온 또는 자유 방사성 표지된 복합체의 양과 비교하여 리포솜에 유지되는 방사능의 양은 SEC 도중에 용출 프로파일을 관찰하고 방사능 검출기로 방사능을 측정하거나, 유도 결합 플라스마 질량분석법 (inductively coupled plasma mass spectroscopy; ICP-MS), 유도 결합 플라스마 원자 방출분석법 (inductively coupled plasma atomic emission spectroscopy; ICP-AES) 또는 유도 결합 플라스마 광 방사분석법 (inductively coupled plasma optical emission spectrometry; ICP-OES)를 사용하여 금속 실체물의 농도를 측정함으로써 결정될 수 있다. 용출된 분획을 함유하지 않은 리포솜과 비교하여 용출된분획을 함유하는 리포솜에서 측정된 방사능은 리포솜에 유지된 방사능의 퍼센트를 계산함으로써 로딩 효율을 결정하기 위해 사용될 수 있다. 유사하게, 리포솜에 결합된 방사능의 양은 업계에 알려진 다른 통상적인 방법을 사용할 때 로딩 효율의 측정값을 얻기 위해 리포솜에 포집되지 않은 방사능의 양과 비교될 수 있다.
본 발명의 방법은 조제물에 사용된 많은 양의 방사성 핵종이 나노입자 내에 포집되는 것을 확인한다. 본 방법의 한 구체예에서, 로딩의 효율은 예를 들어, 10% 이상, 예를 들어, 10%-100%의 범위에서, 예를 들어, 15% 이상, 예를 들어, 20% 이상, 예를 들어, 25% 이상, 예를 들어, 30% 이상, 예를 들어, 35% 이상, 예를 들어, 40% 이상, 예를 들어, 50% 이상, 예를 들어, 60% 이상, 예를 들어, 65% 이상, 예를 들어, 70% 이상, 예를 들어, 75% 이상, 예를 들어, 80% 이상, 예를 들어, 85% 이상, 예를 들어, 90% 이상, 예를 들어, 95% 이상, 또는 예를 들어, 96% 이상, 또는 예를 들어, 97% 이상, 또는 예를 들어, 98% 이상, 또는 예를 들어, 99% 이상 또는 예를 들어, 99.5% 이상 또는 예를 들어, 99.9% 이상이다. 본 발명의 또 다른 구체예에서, 본 발명의 방법을 사용할 때 로딩의 효율은 크기 배제 크로마토그래피 (SEC, 실시예에 설명됨), 이온-교환 크로마토그래피 또는 투석을 사용하여 검정될 때보다 30%, 예를 들어, 30% 내지 100% 더 높고, 55% 내지 100% 로딩 효율, 80% 내지 100% 로딩 효율, 및 95% 내지 100% 로딩 효율을 포함한다.
바람직하게는, 본 발명의 방법의 로딩의 효율은 55% 내지 100%의 범위, 예를 들어, 80% 내지 100%의 범위, 더 바람직하게 95% 내지 100%의 범위, 예를 들어, 95% 내지 97%, 또는 예를 들어, 97% 내지 99.9% 로딩 효율이다.
로딩 속도:
금속 이온의 리포솜에 로딩은 다음을 포함하는 여러 단계로 나누어질 수 있다: (i) 이온의 지질 막에 결합/배위/흡착, (ii) 막관통 이온 확산 및 (iii) 이온의 킬레이터에 결합. 본 발명의 방법에서, 지질 및 킬레이터는, 예를 들어, 64Cu2 +일 수도 있지만, 이에 제한되지 않는 금속 실체물과 비교하여 크게 초과할 수도 있다. 따라서 64Cu2 +의 예에서, 동역학은 64Cu2 + 농도에만 의존한다. Cu2+의 막에 배위/결합 및 Cu2+의 킬레이터 (예를 들어, DOTA)에 결합의 속도는 초 단위로 발생하고 방사능-TLC, 또는 업계의 다른 통상적인 방법에 의해 확인될 수 있다. 금속 실체물의 막에 결합이 빠르기 때문에, 막관통 이온 확산은 가장 가능성이 큰 속도 제한 단계이다.
일반적으로, 막관통 확산의 속도는 수송된 실체물의 농도 구배, 막 단계 상태 (겔, 유동체 또는 액체-순서) 및 수송된 실체물의 물리화학적 성질 (친수성 대 소수성)에 의존할 것이다. 이들 논쟁은 하기 나타난 1차 방정식 (방정식 1)을 입증하며, 이것은 여기에 64Cu2 +에 대해 나타나지만, 다른 금속 실체물에 대해서도 사용할 수 있다. 로딩 동역학 (표 7-8에 나타난 예)은 방정식을 특징으로 할 수 있으며
Figure pct00002
ACu, ACu - 킬레이터 및 ACu (이온 투과 담체 )는 64Cu2 +, 64Cu-킬레이터 및 64Cu-이온 투과 담체 종의 TLC 활성을 나타낸다. 피팅 파라미터 a는 플래토 (plateau) 수준 (로딩이 1차 동역학에 따라 진행되면 a ~ 100%)을 설명하고, b는 t에서 오프셋 (offset) 및 불확실성을 설명하고 (t에서 오프셋 및 불확실성이 작을 때 b = 1) c는 로딩 속도를 설명한다. 방정식 1의 맞춤에 의해, 각각의 로딩 프로파일은 다음을 특징으로 할 수 있다:
(i) 초기 속도:
Figure pct00003
(ii) 95% 로딩에 도달하기 위해 필요한 시간:
Figure pct00004
및 (iii) 60분에 도달되는 로딩의 정도 (%로드1 h). 마지막은 SEC에 기초한 방법을 사용하여 달성된 로딩 정도와 직접적으로 비교 가능하다 (예컨대, 예에서 일어나고 도 3 및 표 1, 2, 6 및 7에 나타난다). 1차 속도 상수 (c)는 로딩이 실행되는 온도 (도 7-8 참조) 및 삼투압 (다음 섹션 참조)과 같은 다른 파라미터에 의존한다. 초기 속도 (vini), t(95%) 및 %로드1 h는 로딩 조건의 세트에 대하여 표 8에 제공된다.
본 발명의 방법의 로딩 속도는 또한 파라미터 초기 속도, 95% 로딩에 도달하기 위해 필요한 시간 및 60분에 도달되는 로딩의 정도에 의해 설명될 수 있다.
따라서 본 발명의 한 구체예에서, 초기 속도는 0.5%/분 내지 100%/분의 범위, 바람직하게 3%/분 내지 100%/분의 범위 및 더 바람직하게 23%/분 내지 100%/분의 범위이다.
본 발명의 한 구체예에서, 95% 로딩에 도달하기 위해 필요한 시간은 0분 내지 360분의 범위, 예를 들어, 1분 내지 240분, 바람직하게 5분 내지 240분, 예를 들어, 5분 내지 20분, 또는 예를 들어, 9분 내지 18분의 범위이다.
본 발명의 한 구체예에서, 60분 후에 도달되는 로딩의 정도는 10% 내지 100%의 범위, 더 바람직하게 55% 내지 100%의 범위, 예를 들어, 80% 내지 100%의 범위, 및 더 바람직하게 95% 내지 100%의 범위, 예를 들어, 95% 내지 99.9%이다.
나노입자 (예를 들어, 리포솜)을 로딩하는 방법은 파라미터 초기 속도, 95% 로딩에 도달하기 위해 필요한 시간 및 60분에 도달되는 로딩의 정도에 의해 설명된 로딩 효율 및 로딩 속도와 같은 파라미터를 측정함으로써 비교될 수 있다. 따라서, 이온 투과 담체의 상기 언급된 로딩 효율 또는 로딩 속도에 기여의 중요성은 여기에 개시된 방법에 의해 결정될 수 있다.
본 발명은 금속 실체물과 함께 로딩된 나노입자 (예를 들어, 리포솜)의 제조 방법을 제공하며, 이온 투과 담체는 나노입자의 로딩에 사용되지 않거나, 하나 이상의 투과 담체는 이러한 방법이 본 발명에 의해 제공된 바와 같이 로딩에 대하여 본질적으로 같은 메카니즘을 사용하기 때문에, 로딩의 로딩 속도 또는 로딩 효율에 크게 기여하지 않는 소량으로 존재한다. 따라서, 이러한 방법은 하나 이상의 이온 투과 담체가 초기 속도, 95% 로딩에 도달하기 위해 필요한 시간, 60분에 도달되는 로딩의 정도의 그룹으로부터 선택된 파라미터에 의해 결정된 바와 같이 로딩 효율 및/또는 로딩 속도의 큰 증가가 없는 양으로 존재하는 방법을 포함할 수 있다. 로딩 속도 또는 로딩 효율의 차이의 유의성은 통상적인 통계 방법, 예를 들어, 스튜던트 t-테스트 (Student t-test)을 사용하여 계산될 수 있다.
나노입자
본 발명의 구체예에 따라, 리포솜 조성물은 소포 형성 성분 및 약제-포집 성분을 포함하는 미크로 크기 또는 나노 크기 입자이다. 소포 형성 성분은 입자의 밀폐 장벽을 형성한다. 약제-포집 성분은 하나 이상의 음전하를 띈 기를 함유하거나 이온을 트래핑할 수 있는 적어도 하나의 화학적 모이어티를 가질 수도 있다. 게다가 약제-포집 성분은 환원제일 수 있다. 약제-포집 성분은 캡슐화제, 예를 들어, 방사능-진단제 또는 방사능-치료제를 포함하는 금속 실체물과 안정한 복합체 또는 낮은 가용성 염을 형성하기 위해, 정전기 상호작용 (electrostatic interaction)에 의해 또는 침전물을 형성하기 위해 환원에 의해 상호작용한다. 캡슐화제, 예를 들어, 방사능-진단제 또는 방사능-치료제의 안정화는 혈액 순환에서 소포로부터 약제의 방출을 방지하거나 최소화한다.
약제 포집 성분은 음전하 또는 양전하를 띌 수도 있고 이온을 트래핑할 수 있는 하나 이상의 전하를 띈 기를 함유하는 적어도 하나의 화학적 모이어티를 추가로 가질 수도 있다.
금속 실체물
본 발명의 나노입자는 금속 실체물을 포함한다. 본 발명의 금속 실체물은 당업자에게 알려져 있고 금속, 예를 들어, 1가 양이온, 2가 양이온, 3가 양이온, 4가 양이온, 5가 양이온, 6가 양이온 및 7가 양이온에 대한 기존의 산화 상태 중 어떤 것도 포함하는 금속으로부터 선택될 수도 있다.
본 발명의 한 구체예에서, 금속 실체물은 1가 양이온, 2가 양이온, 3가 양이온, 4가 양이온, 5가 양이온, 6가 양이온 및 7가 양이온의 그룹으로부터 선택된 양이온이며, 2가 및 3가 양이온이 바람직하다.
본 발명의 한 구체예에서, 금속 실체물은 구리, 예를 들어, Cu(I) 또는 Cu(II)이다.
본 발명의 나노입자는 포집된 금속 실체물을 포함하며, 이것은 구리 (61Cu, 64Cu, 및 67Cu), 인듐 (111In), 테크네튬 (99 mTc), 레늄 (186Re, 188Re), 갈륨 (67Ga, 68Ga), 루테튬 (177Lu), 악티늄 (225Ac), 이트륨 (90Y), 안티몬 (119Sb), 주석 (117Sn, 113Sn), 디스프로슘 (159Dy), 코발트 (56Co), 철 (59Fe), 루테늄 (97Ru, 103Ru), 팔라듐 (103Pd), 카드뮴 (115Cd), 텔루륨 (118Te, 123Te), 바륨 (131Ba, 140Ba), 가돌리늄 (149Gd, 151Gd), 테르븀 (160Tb), 금 (198Au, 199Au), 란타늄 (140La), 및 라듐 (223Ra, 224Ra)으로 구성된 동위원소의 그룹으로부터 선택된 금속 방사성 핵종을 포함하거나 이로 구성될 수도 있고, 금속 방사성 핵종의 상기 동위원소는 금속에 대한 기존의 산화 상태 중 어떤 것에서도 나타날 수 있다. 이들 산화 상태는 1가 양이온, 2가 양이온, 3가 양이온, 4가 양이온, 5가 양이온, 6가 양이온 및 7가 양이온을 포함한다.
또 다른 구체예에서, 포집된 금속 실체물은 레늄 (186Re), 스트론튬 (89Sr), 사마륨 (153Sm), 이테르븀 (169Yb), 탈륨 (201Tl), 아스타틴 (211At)의 그룹으로부터 선택된 동위원소를 포함하며, 금속 방사성 핵종의 상기 동위원소는 금속에 대한 기존의 산화 상태 중 어떤 것에서도 나타날 수 있다. 이들 산화 상태는 1가 양이온, 2가 양이온, 3가 양이온, 4가 양이온, 5가 양이온, 6가 양이온 및 7가 양이온을 포함한다.
또 다른 구체예에서, 포집된 금속 실체물은 구리 (61Cu, 64Cu, 및 67Cu), 인듐 (111In), 테크네튬 (99 mTc), 레늄 (186Re, 188Re), 갈륨 (67Ga, 68Ga), 악티늄 (225Ac), 이트륨 (90Y), 안티몬 (119Sb), 및 루테늄 (97Ru, 103Ru)의 그룹으로부터 선택된 동위원소를 포함하며, 금속 방사성 핵종의 상기 동위원소는 금속에 대한 기존의 산화 상태 중 어떤 것에서도 나타날 수 있다. 이들 산화 상태는 1가 양이온, 2가 양이온, 3가 양이온, 4가 양이온, 5가 양이온, 6가 양이온 및 7가 양이온을 포함한다.
본 발명의 또 다른 구체예에서, 포집된 금속 실체물 중 하나 이상은 Gd, Dy, Ti, Cr, Mn, Fe, Fe, Co, Ni로 구성된 그룹으로부터 선택된 자기 공명 영상 (MRI)에 사용될 수도 있는 금속의 그룹으로부터 선택된다. 상기 금속 실체물은 금속에 대한 기존의 산화 상태 중 어떤 것에서도 나타날 수 있다. 이들 산화 상태는 1가 양이온, 2가 양이온, 3가 양이온, 4가 양이온, 5가 양이온, 6가 양이온 및 7가 양이온을 포함한다.
본 발명의 바람직한 구체예에서, 포집된 금속 실체물 중 하나 이상은 Gd(III), Dy(III), Ti(II), Cr(III), Mn(II), Fe(II), Fe(III), Co(II), Ni(II)로 구성된 그룹으로부터 선택된다.
방사성 핵종의 조합은 암과 같은 다양한 질환의 동시 관찰/이미징 및 치료 및 여러 다른 이미징 방법의 사용에 의한 관찰에 유용하다. 방사성 핵종 및 방사성 핵종의 조합은 방사선, 예를 들어, 알파 입자, 베타+ d입자, 베타-입자, 오거 전자 또는 감마선 중 하나 이상의 타입을 방출할 수도 있다. 방사성 핵종의 조합은 이미징 및/또는 방사선 치료 중 하나 이상의 타입을 추가로 허용할 수도 있다. 따라서, 또 다른 구체예에서, 본 발명은 소포 및 그것들의 제조 방법과 관련되며, 소포는 구리 (61Cu, 64Cu, 및 67Cu), 인듐 (111In), 테크네튬 (99 mTc), 레늄 (186Re, 188Re), 갈륨 (67Ga, 68Ga), 스트론튬 (89Sr), 사마륨 (153Sm), 이테르븀 (169Yb), 탈륨 (201Tl), 아스타틴 (211At), 루테튬 (177Lu), 악티늄 (225Ac), 이트륨 (90Y), 안티몬 (119Sb), 주석 (117Sn, 113Sn), 디스프로슘 (159Dy), 코발트 (56Co), 철 (59Fe), 루테늄 (97Ru, 103Ru), 팔라듐 (103Pd), 카드뮴 (115Cd), 텔루륨 (118Te, 123Te), 바륨 (131Ba, 140Ba), 가돌리늄 (149Gd, 151Gd), 테르븀 (160Tb), 금 (198Au, 199Au), 란타늄 (140La), 및 라듐 (223Ra, 224Ra)의 그룹으로부터 선택된 둘 이상의 방사성 핵종을 포함하는 금속 실체물을 포함하며, 금속 방사성 핵종의 상기 동위원소는 금속에 대한 기존의 산화 상태 중 어떤 것에서도 나타날 수 있다. 이들 산화 상태는 1가 양이온, 2가 양이온, 3가 양이온, 4가 양이온, 5가 양이온, 6가 양이온 및 7가 양이온을 포함한다.
추가의 구체예에서, 금속 실체물의 조합은 이미징 및/또는 방사선 치료 중 하나 이상의 타입을 추가로 허용하는 하나 이상의 금속 및 하나 이상의 방사성 핵종을 포함할 수도 있다. 따라서, 또 다른 구체예에서, 본 발명은 소포 및 그것들의 제조 방법과 관련되며, 소포는 금속에 대한 기존의 산화 상태 중 어떤 것에서도 Gd, Dy, Ti, Cr, Mn, Fe, Fe, Co, Ni의 그룹으로부터 선택된 금속 실체물을 포함하며, 방사성 핵종은 구리 (61Cu, 64Cu, 및 67Cu), 인듐 (111In), 테크네튬 (99 mTc), 레늄 (186Re, 188Re), 갈륨 (67Ga, 68Ga), 스트론튬 (89Sr), 사마륨 (153Sm), 이테르븀 (169Yb), 탈륨 (201Tl), 아스타틴 (211At), 루테튬 (177Lu), 악티늄 (225Ac), 이트륨 (90Y), 안티몬 (119Sb), 주석 (117Sn, 113Sn), 디스프로슘 (159Dy), 코발트 (56Co), 철 (59Fe), 루테늄 (97Ru, 103Ru), 팔라듐 (103Pd), 카드뮴 (115Cd), 텔루륨 (118Te, 123Te), 바륨 (131Ba, 140Ba), 가돌리늄 (149Gd, 151Gd), 테르븀 (160Tb), 금 (198Au, 199Au), 란타늄 (140La), 및 라듐 (223Ra, 224Ra)의 그룹으로부터 선택되며, 금속 방사성 핵종의 상기 동위원소는 금속에 대한 기존의 산화 상태 중 어떤 것에서도 나타날 수 있다. 이들 산화 상태는 1가 양이온, 2가 양이온, 3가 양이온, 4가 양이온, 5가 양이온, 6가 양이온 및 7가 양이온을 포함한다.
따라서, 본 발명에 따라, 소포와 같은 나노입자 조성물은 64Cu 및 Gd(III), 64Cu 및 Dy(III), 64Cu 및 Ti(II), 64Cu 및 Cr(III), 64Cu 및 Mn(II), 64Cu 및 Fe(II), 64Cu 및 Fe(III), 64Cu 및 Co(II), 64Cu 및 Ni(II), 68Ga 및 Gd(III), 68Ga 및 Dy(III), 68Ga 및 Ti(II), 68Ga 및 Cr(III), 68Ga 및 Mn(II), 68Ga 및 Fe(II), 68Ga 및 Fe(III), 68Ga 및 Co(II), 68Ga 및 Ni(II), 111In 및 Gd(III), 111In 및 Dy(III), 111In 및 Ti(II), 111In 및 Cr(III), 111In 및 Mn(II), 111In 및 Fe(II), 111In 및 Fe(III), 111In 및 Co(II), 111In 및 Ni(II), 99 mTc 및 Gd(III), 99 mTc 및 Dy(III), 99 mTc 및 Ti(II), 99 mTc 및 Cr(III), 99 mTc 및 Mn(II), 99 mTc 및 Fe(II), 99 mTc 및 Fe(III), 99 mTc 및 Co(II), 99 mTc 및 Ni(II), 177Lu 및 Gd(III), 177Lu 및 Dy(III), 177Lu 및 Ti(II), 177Lu 및 Cr(III), 177Lu 및 Mn(II), 177Lu 및 Fe(II), 177Lu 및 Fe(III), 177Lu 및 Co(II), 177Lu 및 Ni(II), 67Ga 및 Gd(III), 67Ga 및 Dy(III), 67Ga 및 Ti(II), 67Ga 및 Cr(III), 67Ga 및 Mn(II), 67Ga 및 Fe(II), 67Ga 및 Fe(III), 67Ga 및 Co(II), 67Ga 및 Ni(II), 201Tl 및 Gd(III), 201Tl 및 Dy(III), 201Tl 및 Ti(II), 201Tl 및 Cr(III), 201Tl 및 Mn(II), 201Tl 및 Fe(II), 201Tl 및 Fe(III), 201Tl 및 Co(II), 201Tl 및 Ni(II), 90Y 및 Gd(III), 90Y 및 Dy(III), 90Y 및 Ti(II), 90Y 및 Cr(III), 90Y 및 Mn(II), 90Y 및 Fe(II), 90Y 및 Fe(III), 90Y 및 Co(II) 및 90Y 및 Ni(II)의 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 조합을 포함할 수도 있으며, 금속 방사성 핵종의 상기 동위원소는 금속에 대한 기존의 산화 상태 중 어떤 것에서도 나타날 수 있다. 이들 산화 상태는 1가 양이온, 2가 양이온, 3가 양이온, 4가 양이온, 5가 양이온, 6가 양이온 및 7가 양이온을 포함한다.
바람직한 구체예에서, 소포와 같은 나노입자 조성물은 64Cu 및 Gd(III), 64Cu 및 Dy(III), 64Cu 및 Ti(II), 64Cu 및 Cr(III), 64Cu 및 Mn(II), 64Cu 및 Fe(II), 64Cu 및 Fe(III), 64Cu 및 Co(II), 64Cu 및 Ni(II), 68Ga 및 Gd(III), 68Ga 및 Dy(III), 68Ga 및 Ti(II), 68Ga 및 Cr(III), 68Ga 및 Mn(II), 68Ga 및 Fe(II), 68Ga 및 Fe(III), 68Ga 및 Co(II), 68Ga 및 Ni(II), 177Lu 및 Gd(III), 177Lu 및 Dy(III), 177Lu 및 Ti(II), 177Lu 및 Cr(III), 177Lu 및 Mn(II), 177Lu 및 Fe(II), 177Lu 및 Fe(III), 177Lu 및 Co(II), 177Lu 및 Ni(II)로 구성된 그룹으로부터 선택된 금속 실체물 중 하나 이상의 조합을 포함할 수도 있으며, 금속 방사성 핵종의 상기 동위원소는 금속에 대한 기존의 산화 상태 중 어떤 것에서도 나타날 수 있다. 이들 산화 상태는 1가 양이온, 2가 양이온, 3가 양이온, 4가 양이온, 5가 양이온, 6가 양이온 및 7가 양이온을 포함한다,
더 바람직한 구체예에서, 소포와 같은 나노입자 조성물은 64Cu 및 Gd(III), 68Ga 및 Gd(III), 177Lu 및 Gd(III), 111In 및 Gd(III), 67Ga 및 Gd(III), 90Y 및 Gd(III)로 구성된 그룹으로부터 선택된 금속 실체물 중 하나 이상의 조합을 포함할 수도 있으며, 64Cu 및 Gd(III) 및 68Ga 및 Gd(III)의 조합이 가장 바람직하다.
본 발명의 소포는 이미징을 위해 하나 이상의 방사성 핵종 및 치료를 위해 하나 이상의 방사성 핵종의 조합을 포함할 수도 있다. 이미징을 위한 방사성 핵종은 64Cu, 61Cu, 99 mTc, 68Ga, 89Zr 및 111In과 같은 방사성 핵종을 포함한다.
치료를 위한 방사성 핵종은 64Cu, 67Cu, 111In, 67Ga, 186Re, 188Re, 89Sr, 153Sm, 169Yb, 201Tl, 211At, 177Lu, 225Ac, 90Y, 119Sb, 117Sn, 113Sn, 159Dy, 56Co, 59Fe, 97Ru, 103Ru, 103Pd, 115Cd, 118Te, 123Te, 131Ba, 140Ba, 149Gd, 151Gd, 160Tb, 198Au, 199Au, 140La, 223Ra 및 224Ra와 같은 방사성 핵종을 포함한다.
본 발명의 바람직한 구체예에서, 소포 또는 나노입자는 61Cu, 64Cu, 67Cu, 67Ga, 68Ga, 225Ac, 90Y, 177Lu, 186Re, 188Re 및 119Sb의 그룹으로부터 선택된 둘 이상의 방사성 핵종을 포함한다.
본 발명의 더 바람직한 구체예는 64Cu 및 177Lu, 또는 64Cu 및 67Cu, 또는 61Cu 및 67Cu, 또는 64Cu 및 90Y, 또는 64Cu 및 119Sb, 또는 64Cu 및 225Ac, 또는 64Cu 및 188Re, 또는 64Cu 및 186Re, 또는 64Cu 및 211At, 또는 64Cu 및 67Ga, 또는 61Cu 및 177Lu, 또는 61Cu 및 90Y, 또는 61Cu 및 119Sb, 또는 61Cu 및 225Ac, 또는 61Cu 및 188Re, 또는 61Cu 및 186Re, 또는 61Cu 및 211At, 또는 61Cu 및 67Ga, 또는 67Cu 및 177Lu, 또는 67Cu 및 90Y, 또는 67Cu 및 119Sb, 또는 67Cu 및 225Ac, 또는 67Cu 및 188Re, 또는 67Cu 및 186Re, 또는 67Cu 및 211At, 또는 68Ga 및 177Lu, 또는 68Ga 및 90Y, 또는 68Ga 및 119Sb, 또는 68Ga 및 225Ac, 또는 68Ga 및 188Re, 또는 68Ga 및 186Re, 또는 68Ga 및 211At, 또는 68Ga 및 67Cu를 포함하는 소포 또는 나노입자와 관련된다.
본 발명의 하나 이상의 방사성 핵종을 포함하는 나노입자 또는 소포는 임상적 이미징 및/또는 방사선 치료에 사용될 수도 있다. 임상적 이미징은 진단, 치료의 효과를 관찰, 또는 방사선 치료에 사용된 소포의 위치를 관찰하는 이미징을 포함한다.
바람직한 구체예에서, 본 발명의 소포 또는 나노입자는 결합된 양전자 방사 단층 촬영 (PET) 이미징 및 방사선 치료에 유용한 방사선 핵종의 조합, 예를 들어, 64Cu 및 177Lu, 또는 예를 들어, 64Cu 및 67Cu, 또는 예를 들어, 61Cu 및 67Cu, 또는 예를 들어, 64Cu 및 90Y, 또는 예를 들어, 64Cu 및 119Sb, 또는 예를 들어, 64Cu 및 225Ac, 또는 예를 들어, 64Cu 및 188Re, 또는 예를 들어, 64Cu 및 186Re, 또는 예를 들어, 64Cu 및 211At를 포함한다.
더 바람직한 구체예에서, 본 발명의 소포 또는 나노입자는 결합된 양전자 방사 단층 촬영 (PET) 이미징 및 방사선 치료에 유용한 방사성 핵종의 조합, 예를 들어, 64Cu 및 177Lu를 포함한다.
본 발명에 따라, 나노입자는 킬레이터와 같은 결합자 분자를 통해 나노입자 조성물의 내부 또는 외표면에 결합될 수도 있는 구리와 다른 하나 이상의 동위원소를 포함할 수도 있다. 이러한 동위원소는 인듐 (111In), 테크네튬 (99 mTc), 레늄 (186Re, 188Re), 갈륨 (67Ga, 68Ga), 스트론튬 (89Sr), 사마륨 (153Sm), 이테르븀 (169Yb), 탈륨 (201Tl), 아스타틴 (211At), 루테튬 (177Lu), 악티늄 (225Ac), 이트륨 (90Y), 안티몬 (119Sb), 주석 (117Sn, 113Sn), 디스프로슘 (159Dy), 코발트 (56Co), 철 (59Fe), 루테늄 (97Ru, 103Ru), 팔라듐 (103Pd), 카드뮴 (115Cd), 텔루륨 (118Te, 123Te), 바륨 (131Ba, 140Ba), 가돌리늄 (149Gd, 151Gd), 테르븀 (160Tb), 금 (198Au, 199Au), 란타늄 (140La), 라듐 (223Ra, 224Ra), 레늄 (186Re), 스트론튬 (89Sr), 사마륨 (153Sm), 이테르븀 (169Yb), 탈륨 (201Tl) 및 아스타틴 (211At)의 그룹으로부터 선택될 수도 있으며, 금속 방사성 핵종의 상기 동위원소는 금속에 대한 기존의 산화 상태 중 어떤 것에서도 나타날 수 있다. 이들 산화 상태는 1가 양이온, 2가 양이온, 3가 양이온, 4가 양이온, 5가 양이온, 6가 양이온 및 7가 양이온을 포함한다.
본 발명의 한 구체예에 따라, 금속 실체물은 61Cu, 64Cu, 67Cu, 177Lu, 67Ga, 68Ga, 225Ac, 90Y, 186Re, 188Re, 119Sb 및 111In으로 구성된 그룹으로부터 선택된 방사성 핵종일 수 있으며, 금속 방사성 핵종의 상기 동위원소는 금속에 대한 기존의 산화 상태 중 어떤 것에서도 나타날 수 있다. 이들 산화 상태는 1가 양이온, 2가 양이온, 3가 양이온, 4가 양이온, 5가 양이온, 6가 양이온 및 7가 양이온을 포함한다.
본 발명의 바람직한 구체예에서, 금속 실체물은 61Cu, 64Cu, 67Cu, 111In 및 177Lu로 구성된 그룹으로부터 선택된 방사성 핵종이며, 금속 방사성 핵종의 상기 동위원소는 금속에 대한 기존의 산화 상태 중 어떤 것에서도 나타날 수 있다. 이들 산화 상태는 1가 양이온, 2가 양이온, 3가 양이온, 4가 양이온, 5가 양이온, 6가 양이온 및 7가 양이온을 포함한다.
본 발명의 한 구체예에서, 금속 실체물은 64Cu 및 67Cu, 61Cu 및 67Cu, 64Cu 및 90Y, 64Cu 및 119Sb, 64Cu 및 225Ac, 64Cu 및 188Re, 64Cu 및 186Re, 64Cu 및 211At, 64Cu 및 67Ga, 61Cu 및 177Lu, 61Cu 및 90Y, 61Cu 및 119Sb, 61Cu 및 225Ac, 61Cu 및 188Re, 61Cu 및 186Re, 61Cu 및 211At, 61Cu 및 67Ga, 67Cu 및 177Lu, 67Cu 및 90Y, 67Cu 및 119Sb, 67Cu 및 225Ac, 67Cu 및 188Re, 67Cu 및 186Re, 67Cu 및 211At, 68Ga 및 177Lu, 68Ga 및 90Y, 68Ga 및 119Sb, 68Ga 및 225Ac, 68Ga 및 188Re, 68Ga 및 186Re, 68Ga 및 211At, 및 68Ga 및 67Cu로 구성된 그룹으로부터 선택된 둘 이상의 방사성 핵종이다.
본 발명의 또 다른 구체예에서, 금속 실체물은 구리 (61Cu, 64Cu, 및 67Cu)로 구성된 그룹으로부터 선택된 둘 이상의 방사성 핵종, 예를 들어, 61Cu 및 64Cu, 또는 61Cu 및 67Cu, 또는 64Cu 및 67Cu, 또는 61Cu, 64Cu 및 67Cu이다.
본 발명의 한 구체예에서, 금속 실체물은 여기에 언급된 금속 실체물의 그룹으로부터 선택되며, 양이온 Hg2 + 및 Cu+는 제외된다.
본 발명의 추가의 구체예에서, 방사성 핵종은 또한 또 다른 담체, 예를 들어, 암성 질환 및, 일반적으로 누출 혈관 또는 대상체의 다른 질환과 관련된 병리학적 상태을 진단 및/또는 치료하는데 유용한 나노입자 내에 포집될 수도 있다.
본 발명의 리포솜 조성물을 제조하기 위한 전형적인 소포 형성 성분 및 약제-포집 성분의 상세한 설명은 하기 설명된다.
소포 형성 성분
소포 형성 성분은 친수성 부분 및 소수성 부분을 포함하는 합성 또는 천연-발생한 양친매성 화합물이다. 소포 형성 성분은, 예를 들어, 지방산, 중성 지방, 포스파티드, 당지질, 지방족 알콜, 및 스테로이드를 포함한다. 추가적으로, 소포 형성 성분은 지질, 이블록 (diblock) 및 삼블록 (triblock) 코폴리머 볼라리피드 (bolalipid), 세라미드 (ceramide), 스핑고리피드 (sphingolipid), 인지질, PEG화된 인지질 및 콜레스테롤을 추가로 포함할 수도 있다.
본 발명의 한 구체예에서, 소포 형성 성분은 나노입자의 장기간의 순환시간을 허용한다.
본 발명의 소포 형성 성분 또는 본 발명의 방법은 친수성 폴리머, 예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 성분 또는 이들의 유도체, 또는 다당류를 함유할 수도 있다. 이 경우에, 소포 형성 성분은 친수성 폴리머 (예를 들어, PEG) 또는 다당류로 유도된다고 한다. 한 구체예에서, 폴리머는 단백질 또는 다른 수용체 친화성분자의 폴리머로 유도된 소포 형성 성분에 접합을 가능하게 한다. 또 다른 구체예에서, 폴리머 (예를 들어, PEG)의 리포솜 조성물에 부착은 혈류 내에서 장기간의 순환시간을 허용한다. 외표면에 PEG 사슬을 포함하는 소포는 누출 혈관을 삼출 (extravasate) 시킬 수 있다.
본 발명 또는 본 발명의 방법에 사용된 적합한 소포 형성 지질의 예는 다음을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다: 포스파티딜콜린, 예를 들어, 1,2-디올레오일-포스파티딜콜린, 1,2-디팔미토일-포스파티딜콜린, 1,2-디미리스토일-포스파티딜콜린, 1,2-디스테아로일-포스파티딜콜린, 1-올레오일-2-팔미토일-포스파티딜콜린, 1-올레오일-2-스테아로일-포스파티딜콜린, 1-팔미토일-2-올레오일-포스파티딜콜린 및 1-스테아로일-2-올레오일-포스파티딜콜린; 포스파티딜에탄올아민, 예를 들어, 1,2-디올레오일-포스파티딜에탄올아민, 1,2-디팔미토일-포스파티딜에탄올아민, 1,2-디미리스토일-포스파티딜에탄올아민, 1,2-디스테아로일-포스파티딜에탄올아민, 1-올레오일-2-팔미토일-포스파티딜에탄올아민, 1-올레오일-2-스테아로일-포스파티딜에탄올아민, 1-팔미토일-2-올레오일-포스파티딜에탄올아민, 1-스테아로일-2-올레오일-포스파티딜에탄올아민 및 N-숙시닐-디올레오일-포스파티딜에탄올아민; 포스파티딜세린, 예를 들어, 1,2-디올레오일-포스파티딜세린, 1,2-디팔미토일-포스파티딜세린, 1,2-디미리스토일-포스파티딜세린, 1,2-디스테아로일-포스파티딜세린, 1-올레오일-2-팔미토일-포스파티딜세린, 1-올레오일-2-스테아로일-포스파티딜세린, 1-팔미토일-2-올레오일-포스파티딜세린 및 1-스테아로일-2-올레오일-포스파티딜세린; 포스파티딜글리세롤, 예를 들어, 1,2-디올레오일-포스파티딜글리세롤, 1,2-디팔미토일-포스파티딜글리세롤, 1,2-디미리스토일-포스파티딜글리세롤, 1,2-디스테아로일-포스파티딜글리세롤, 1-올레오일-2-팔미토일-포스파티딜글리세롤, 1-올레오일-2-스테아로일-포스파티딜글리세롤, 1-팔미토일-2-올레오일-포스파티딜글리세롤 및 1-스테아로일-2-올레오일-포스파티딜글리세롤; PEG화된 지질; PEG화된 인지질, 예를 들어, 포스파티딜에탄올아민-N-[메톡시(폴리에틸렌글리콜)-1000], 포스파티딜에탄올아민-N-[메톡시(폴리에틸렌글리콜)-2000], 포스파티딜에탄올아민-N-[메톡시(폴리에틸렌 글리콜)-3000], 포스파티딜에탄올아민-N-[메톡시(폴리에틸렌글리콜)-5000]; PEG화된 세라미드, 예를 들어, N-옥타노일-스핑고신-1-{숙시닐[메톡시(폴리에틸렌글리콜)1000]}, N-옥타노일-스핑고신-1-{숙시닐[메톡시(폴리에틸렌 글리콜)2000]}, N-옥타노일-스핑고신-1-{숙시닐[메톡시(폴리에틸렌글리콜)3000]}, N-옥타노일-스핑고신-1-{숙시닐[메톡시(폴리에틸렌글리콜)5000]}; 리소-포스파티딜콜린, 리소-포스파티딜에탄올아민, 리소-포스파티딜글리세롤, 리소-포스파티딜세린, 세라미드; 스핑고지질; 당지질, 예를 들어, 갱글리오시드 GMI; 글루코리피드; 술파티드; 포스파티드산, 예를 들어, 디-팔미토일-글리세로포스파티드산; 팔미트 지방산; 스테아르 지방산; 아라키돈 지방산; 라우르 지방산; 미리스트 지방산; 라우르올레 지방산; 피세테르 지방산; 미리스트올레 지방산; 팔미트올레 지방산; 페트로셀린 지방산; 올레 지방산; 이소라우르 지방산; 이소미리스트 지방산; 이소스테아르 지방산; 스테롤 및 스테롤 유도체, 예를 들어, 콜레스테롤, 콜레스테롤 헤미숙시네이트, 콜레스테롤 술페이트, 및 콜레스테릴-(4-트리메틸암모니오)-부타노에이트, 에르고스테롤, 라노스테롤; 폴리옥시에틸렌 지방산 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 지방산 알콜; 폴리옥시에틸렌 지방산 알콜 에테르; 폴리옥시에틸화된 소르비탄 지방산 에스테르, 글리세롤 폴리에틸렌 글리콜 옥시-스테아레이트; 글리세롤 폴리에틸렌 글리콜 리시놀레에이트; 에톡실화된 대두 스테롤; 에톡실화된 피마자 오일; 폴리옥시에틸렌 폴리옥시프로필렌 지방산 폴리머; 폴리옥시에틸렌 지방산 스테아레이트; 디-올레오일-sn-글리세롤; 디팔미토일-숙시닐글리세롤; 1,3-디팔미토일-2-숙시닐글리세롤; 1-알킬-2-아실-포스파티딜콜린, 예를 들어, 1-헥사데실-2-팔미토일-포스파티딜콜린; 1-알킬-2-아실-포스파티딜에탄올아민, 예를 들어, 1-헥사데실-2-팔미토일-포스파티딜에탄올아민; 1-알킬-2-아실-포스파티딜세린, 예를 들어, 1-헥사데실-2-팔미토일-포스파티딜세린; 1-알킬-2-아실-포스파티딜글리세롤, 예를 들어, 1-헥사데실-2-팔미토일-포스파티딜글리세롤; 1-알킬-2-알킬-포스파티딜콜린, 예를 들어, 1-헥사데실-2-헥사데실-포스파티딜콜린; 1-알킬-2-알킬-포스파티딜에탄올아민, 예를 들어, 1-헥사데실-2-헥사데실-포스파티딜에탄올아민; 1-알킬-2-알킬-포스파티딜세린, 예를 들어, 1-헥사데실-2-헥사데실-포스파티딜세린; 1-알킬-2-알킬-포스파티딜글리세롤, 예를 들어, 1-헥사데실-2-헥사데실-포스파티딜글리세롤; N-숙시닐-디옥타데실아민; 팔미토일호모시스테인; 라우릴트리메틸암모늄 브로마이드; 세틸트리메틸-암모늄 브로마이드; 미리스틸트리메틸암모늄 브로마이드; N-[1,2,3-디올레오일옥시)-프로필]-N,N,N트리메틸암모늄 클로라이드 (DOTMA); 1,2-디올레오일옥시-3(트리메틸-암모늄)프로판 (DOTAP); 및 1,2-디올레오일-c-(4'-트리메틸암모늄)-부타노일-sn-글리세롤 (DOTB).
본 발명 또는 본 발명의 방법에 사용된 적합한 소포 형성 지질의 예는 수소화된 콩 포스파티딜콜린 (HSPC)을 추가로 포함한다.
한 구체예에서, 소포 형성 성분은 DSPC (1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포콜린), CHOL (콜레스테롤), DSPE-PEG-2000 (1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-[메톡시(폴리에틸렌 글리콜)-2000]), POPC (1-팔미토일-2-올레오일-sn-글리세로-3-포스포콜린), DPPC (1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-포스포콜린), DSPE-PEG2000-TATE, (1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-[메톡시(폴리에틸렌 글리콜)-2000]-TATE)의 그룹으로부터 선택된 화합물을 포함한다.
하나의 바람직한 구체예에서, 소포 형성 성분은 DSPC (1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포콜린), CHOL (콜레스테롤), DSPE-PEG-2000 (1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-[메톡시(폴리에틸렌 글리콜)-2000]), POPC (1-팔미토일-2-올레오일-sn-글리세로-3-포스포콜린), DPPC (1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-포스포콜린), DSPE-PEG2000-TATE, (1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-[메톡시(폴리에틸렌 글리콜)-2000]-TATE) 및 수소화된 콩 포스파티딜콜린 (HSPC)의 그룹으로부터 선택된 화합물을 포함한다.
나노입자 조성물의 한 구체예에서, 소포 형성 성분은 A:B:C의 분자비로 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포콜린 (DSPC) "A", 콜레스테롤 "B", 및 1,2-디스테아로일-SA7-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-[메톡시(폴리에틸렌 글리콜)-2000] (DSPE-PEG-2000) "C"로 구성된 그룹으로부터 선택된 양친매성 화합물로 구성되며, A는 간격 45 내지 65로부터 선택되고, B는 간격 35 내지 45로부터 선택되고, C는 간격 2 내지 20으로부터 선택되고 A+B+C = 100이다.
나노입자 조성물의 또 다른 구체예에서, 소포 형성 성분은 A:B:C의 분자비로 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포콜린 (DSPC) "A", 콜레스테롤 "B", 및 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-[메톡시(폴리에틸렌 글리콜)-2000] (DSPE-PEG-2000) "C"로 구성된 그룹으로부터 선택된 양친매성 화합물로 구성되며, A는 간격 45 내지 65로부터 선택되고, B는 간격 35 내지 45로부터 선택되고, C는 간격 1 내지 20으로부터 선택되고 A+B+C = 100이다.
또 다른 바람직한 구체예에서, 소포 형성 성분은 50:40:10의 분자비로 DSPC (1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포콜린), CHOL (콜레스테롤), DSPE-PEG-2000 (1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-[메톡시(폴리에틸렌 글리콜)-2000])을 포함한다.
개시된 방법의 또 다른 구체예에서, 소포 형성 성분은 분자비 A:B:C:D로 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포콜린 (DSPC) "A", 콜레스테롤 "B", 및 1,2-디스테아로일-SA7-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-[메톡시(폴리에틸렌 글리콜)-2000] (DSPE-PEG-2000) "C", 및 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-[메톡시(폴리에틸렌 글리콜)-2000]-TATE (DSPE-PEG-2000-TATE) "D"로 구성된 그룹으로부터 선택된 양친매성 화합물로 구성되며, A는 간격 45 내지 65로부터 선택되고, B는 간격 35 내지 45로부터 선택되고, C는 간격 5 내지 13으로부터 선택되고, D는 간격 0 내지 3으로부터 선택되고, A+B+C+D = 100이다.
상기 언급된 방사성 표지된 나노입자 조성물은 나노입자가 표적분자를 함유하는 표적 세포에 특이적으로 결합할 수 있게 하거나, 모이어티가 병에 걸린 표적에 특이적으로 결합할 수 있게 하는 표적화 모이어티를 추가로 포함할 수도 있다. 표적화 모이어티는 지질-고정분자 또는 PEG-접합된 지질 성분을 통해 나노입자 조성물의 표면에 부착될 수도 있다.
소포 형성 성분은 또한 항체 또는 어피바디 (affibody)의 지질-접합체 또는 나노입자가 표적분자를 함유하는 표적 세포에 특이적으로 결합할 수 있게 하는 표적화 모이어티로서 작용하는 펩티드를 추가로 포함할 수도 있다.
소포 형성 성분은 또한 항체 또는 어피바디의 지질-접합체 또는 나노입자가 병에 걸린 표적에 특이적으로 결합할 수 있게 하는 표적화 모이어티로서 작용하는 펩티드로 구성된다.
본 발명에 유용한 항체는 단일 특이적, 2중 특이적, 3중 특이적이거나, 더 큰 다중 특이적일 수도 있다. 예를 들어, 다중-특이적 항체는
정상 조직과 비교하여 표적 부위에서 증가된 양으로 존재할 수도 있는 시토킨, 세포, 또는 효소의 다른 에피토프에 대하여 특이적일 수도 있다.
본 명세서에 따르는 "항체"는 에피토프에 특이적으로 결합하는 단백질로서 한정된다. 항체는 다클론성 또는 단클론성일 수도 있다. 본 발명에 유용한 단클론성 항체의 예는 리툭시맙 (Rituximab), 트라스투쥬맙 (Trastuzumab), 세툭시맙 (Cetuximab), LymphoCide, Vitaxin, Lym-1 및 베바시쥬맙 (Bevacizumab)으로 구성된 그룹으로부터 선택되지만, 이에 제한되지 않는다. 바람직한 구체예에서, 단클론성 항체는 리툭시맙, 트라스투쥬맙, 세툭시맙, LymphoCide, Vitaxin, Lym-1, 및 베바시쥬맙으로 구성된 그룹으로부터 선택된다.
"어피바디"는 많은 표적 단백질에 특이적으로 결합하도록 조작될 수 있는 작고 안정한 항원-결합분자로서 한정된다. 어피바디 분자는 많은 방법으로 단클론성 항체를 모방하고, 게다가 많은 적용에 대하여 그것들을 탁월한 선택으로 만드는 여러 독특한 성질을 제공한다. 이들 용도는 신생 혈관 또는 염증 부위의 조직 또는 세포에 대하여 표적화된 리포솜 조성물의 지질-접합체로서 어피바디의 통합을 포함하며, 방사성 핵종, 예를 들어, 구리 동위원소 61Cu, 64Cu 및 67Cu는 이에 제한되지 않고, 진단 및/또는 치료의 적용에 포함된다. 본 발명에 유용한 어피바디 분자의 예는 항-ErbB2 어피바디 분자 및 항-피브리노겐 어피바디 분자로 구성되지만, 이에 제한되지 않는 그룹에 대하여 수거한다.
본 발명에 유용한 펩티드는 나노입자가 병에 걸린 표적에 특이적으로 결합할 수 있게 하는 표적화 모이어티로서 작용하며, 펩티드는 RGD, 소마토스타틴 및 이들의 유사체, 및 세포-침투 펩티드로 구성된 그룹으로부터 선택되지만, 이에 제한되지 않는다. 한 구체예에서, 펩티드는 RGD, 소마토스타틴 및 이들의 유사체, 및 세포-침투 펩티드로 구성된 그룹으로부터 선택된다. 한 구체예에서, 소마토스타틴 유사체는 옥트레오테이트 (TATE)이다.
소포 형성 성분은 유동성 또는 강성의 명시된 정도를 달성하기 위해, 생체 내 리포솜 조성물의 안정성을 조절하기 위해 및 리포솜 조성물 내부에서 포집된 약제의 방출의 속도를 조절하기 위해 선택된다. 소포 형성 성분에 의해 결정된 바와 같이, 리포솜 조성물의 강성은 또한 표적화된 세포에 리포솜의 융합 또는 세포 내 흡수 (endocytosis)의 역할을 할 수도 있다.
소포의 표면 전하는 또한 생체 내 리포솜 조성물의 안정성을 조절하기 위해 및 리포솜 조성물 내부에서 포집된 약제의 방출의 속도를 조절하기 위해, 소포의 로딩에서 중요한 인자일 수도 있다. 따라서 본 발명에 따라, 소포 형성 성분은 형성된 소포의 표면 전하를 조절하기 위해 추가로 선택될 수도 있다.
약제- 포집 성분
본 발명 또는 본 발명의 방법의 약제-포집 성분은 전이 금속 또는 방사성 표지된 약제, 예를 들어, 방사성 핵종과 함께 킬레이트 복합체를 형성하는 킬레이트 시약일 수도 있다.
킬레이터 (예를 들어, DOTA)가 리포솜 내부의 수성 단계에 존재할 때, 킬레이터에 단단한 결합으로 인해 막 장벽을 통과하는 금속 이온이 내막 리플릿 (leaflet)으로부터 효과적으로 제거되기 때문에 리포솜의 외부 및 내부 사이의 평형은 이동된다. 금속 이온의 킬레이터와 매우 효과적인 복합체 형성은 리포솜 내부의 자유 금속 이온 농도를 무시할 수 있게 하고 모든 금속 이온이 리포솜에 로딩되거나 평형에 도달할 때까지 로딩이 진행된다. 킬레이터의 초과량이 사용되는 경우, 리포솜의 금속 이온 농도는 로딩 중인 모든 단계에서 낮을 것이고 막관통 구배는 리포솜의 외부의 자유 금속 이온 농도에 의해 한정될 것이다.
본 발명에 따라, 킬레이터는 1,4,7,10-테트라아자시클로도데칸-1,4,7,10-테트라아세트산 (DOTA) 및 이들의 유도체; 1,4,8,11-테트라아자시클로테트라데칸 (시클람) 및 이들의 유도체; 1,4,7,10-테트라아자시클로도데칸 (시클렌) 및 이들의 유도체; 1,4-에타노-1,4,8,11-테트라아자시클로테트라데칸 (et-시클람) 및 이들의 유도체; 1,4,7,11-테트라아자시클로테트라데칸 (이소시클람) 및 이들의 유도체; 1,4,7,10-테트라아자시클로트리데칸 ([13]아네N4) 및 이들의 유도체; 1,4,7,10-테트라아자시클로도데칸-1,7-디아세트산 (D02A) 및 이들의 유도체; 1,4,7,10-테트라아자시클로도데칸-1,4,7-트리아세트산 (D03A) 및 이들의 유도체; 1,4,7,10-테트라아자시클로도데칸-1,7-디(메탄포스폰산) (D02P) 및 이들의 유도체; 1,4,7,10-테트라아자시클로도데칸-1,4,7-트리(메탄포스폰산) (D03P) 및 이들의 유도체; 1,4,7,10-테트라아자시클로도데칸-1,4,7,10-테트라(메탄포스폰산) (DOTP) 및 이들의 유도체; 에틸렌디아민테트라아세트산 (EDTA) 및 이들의 유도체; 디에틸렌트리아민펜타아세트산 (DTPA) 및 이들의 유도체; 1,4,8,11-테트라아자시클로테트라데칸-1,4,8,11-테트라아세트산 (TETA) 및 이들의 유도체, 또는 다른 아다만잔 및 이들의 유도체를 포함하는 그룹으로부터 선택될 수도 있다.
또 다른 구체예에서, 본 발명의 약제-포집 성분은 다른 물질을 환원시키는 능력을 가진 물질일 수도 있고, 따라서 환원제로 나타난다. 환원제의 예는 아스코르브산, 글루코스, 프럭토스, 글리세르알데히드, 락토스, 아라비노스, 말토스 및 아세톨을 포함한다.
본 발명의 한 구체예에서, Cu(II) 또는 Cu(I) 양이온일 수도 있는, 로딩된 구리 동위원소는 소포 막을 통한 확산에서 더 낮은 산화 상태로 환원되고, 따라서 소포 내의 구리와 다른 방사성 핵종을 트래핑한다.
추가의 구체예에서, 본 발명 또는 본 발명의 방법의 범위 내의 약제-포집 성분은 방사성 핵종 또는 금속 실체물, 예를 들어, 구리 동위원소가 저 용해도 염을 형성하는 물질일 수도 있다. 이러한 것의 예는 구리 포스페이트, 구리 옥살레이트 및 구리 클로라이드이다. 한 구체예에서, 구리 (Cu(II) 또는 Cu(I))로 형성된 저 용해도 염은 구리 포스페이트, 구리 옥살레이트 및 구리 클로라이드로 구성된 그룹으로부터 선택된다.
본 발명 또는 본 발명의 방법의 한 구체예에서, 약제-포집 성분은 아다만잔; 1,4,7,10-테트라아자시클로도데칸 ([12]아네N4) 또는 이들의 유도체; 1,4,7,10-테트라아자시클로트리데칸 ([13]아네N4) 또는 이들의 유도체; 1,4,8,11-테트라아자시클로테트라데칸 ([14]아네N4) 또는 이들의 유도체; 1,4,8,12-테트라아자시클로펜타데칸 ([15]아네N4) 또는 이들의 유도체; 1,5,9,13-테트라아자시클로헥사데칸 ([16]아네N4) 또는 이들의 유도체; 및 금속 이온, 예를 들어, 에틸렌-디아민-테트라아세트산 (EDTA) 또는 이들의 유도체, 디에틸렌-트리아민-펜타아세트산 (DTPA) 또는 이들의 유도체에 결합할 수 있는 다른 킬레이터를 포함하는 거대환형 (macrocyclic) 화합물로 구성된 그룹으로부터 선택된 킬레이터이다.
본 발명 또는 본 발명의 방법의 한 구체예에서, 약제-포집 성분은 1,4-에타노-1,4,8,11-테트라아자시클로테트라데칸 (et-시클람) 또는 이들의 유도체; 1,4,7,11-테트라아자시클로테트라데칸 (이소-시클람) 또는 이들의 유도체; 1,4,7,10-테트라아자시클로도데칸-1,4,7,10-테트라아세트산 (DOTA) 또는 이들의 유도체; 2-(1,4,7,10-테트라아자시클로도데칸-1-일)아세테이트 (D01A) 또는 이들의 유도체; 2,2'-(1,4,7,10-테트라아자시클로도데칸-1,7-디일) 디아세트산 (D02A) 또는 이들의 유도체; 2,2',2"-(1,4,7,10-테트라아자시클로도데칸-1,4,7-트리일) 트리아세트산 (D03A) 또는 이들의 유도체; 1,4,7,10-테트라아자시클로도데칸-1,4,7,10-테트라(메탄포스폰산) (DOTP) 또는 이들의 유도체; 1,4,7,10-테트라아자시클로도데칸-1,7-디(메탄포스폰산) (D02P) 또는 이들의 유도체; 1,4,7,10-테트라아자시클로도데칸-1,4,7-트리(메탄포스폰산) (D03P) 또는 이들의 유도체; 1,4,8,11-15 테트라아자시클로테트라데칸-1,4,8,11-테트라아세트산 (TETA) 또는 이들의 유도체; 2-(1,4,8,11-테트라아자시클로테트라데칸-1-일) 아세트산 (TE1A) 또는 이들의 유도체; 2,2'-(1,4,8,11-테트라아자시클로테트라데칸-1,8-디일) 디아세트산 (TE2A) 또는 이들의 유도체; 및 다른 아다만잔 또는 이들의 유도체로 구성된 그룹으로부터 선택된 킬레이터이다.
본 발명 또는 본 발명의 방법의 한 구체예에서, 약제-포집 성분은 1,4,7,10-테트라아자시클로도데칸-1,4,7,10-테트라아세트산 (DOTA) 또는 이들의 유도체, 1,4,8,11-15 테트라아자시클로테트라데칸-1,4,8,11-테트라아세트산 (TETA) 또는 이들의 유도체, 1,4,7,10-테트라아자시클로도데칸-1,4,7,10-테트라(메탄포스폰산) (DOTP), 시클람 및 시클렌으로 구성된 그룹으로부터 선택된다.
본 발명 또는 본 발명의 방법의 특히 중요한 구체예에서, 약제-포집 성분은 1,4,7,10-테트라아자시클로도데칸-1,4,7,10-테트라아세트산 (DOTA)이다.
이온 투과 담체
이온 투과 담체는 이온-수송자, 친유성 킬레이터, 채널 형성 물질, 친유성 복합체 등으로서 특징지어질 수 있다. 일반적으로, 이온 투과 담체는 세포막 또는 리포솜의 지질 이중층을 통해 이온을 수송하는 지질-가용성 분자로서 한정될 수 있다. 이온 투과 담체는 이온에 대한 지질 막의 삼투성을 증가시키고 막을 통해, 막으로 및 막 밖으로 분자의 수송을 가능하게 하기 위해 사용된다. 이온 투과 담체의 크게 2가지의 분류가 있는데, 하나는 특정 이온 또는 분자에 결합하거나 킬레이트하는 화학적 화합물, 이동성 담체 또는 친유성 킬레이터이며, 주위 환경으로부터 그것의 전하를 보호하고, 따라서 지질 막의 소수성 내부의 그것의 통과를 가능하게 한다. 두 번째 분류는 막으로 친수성 포어 (pore)를 도입하는 채널 형성 물질이며, 분자 또는 금속 이온이 막의 소수성 내부를 통해 통과하는 것을 허용하는 한편, 막의 소수성 내부와 접촉을 방지한다. 이온 투과 담체, 또는 이온의 수송 또는 나노입자의 로딩을 가능하게 하는 다른 성분을 사용하는 통상적인 방법에서, 결과의 나노입자는 로딩 과정에 사용된 소량의 이온-수송자 또는 이온 투과 담체를 포함한다. 본 발명에 의해 제공된 나노입자는 이온 투과 담체와 같은 이온-수송자를 사용하지 않고 제조된다. 따라서, 본 발명은 이온-수송자 또는 이온 투과 담체를 포함하지 않는, 나노입자 조성물과 관련된다. 본 발명의 또 다른 구체예에서, 여기에 한정된 바와 같이 나노입자 조성물은 어떤 추가된 이온 투과 담체도 포함하지 않는다. 본 발명의 나노입자에 포함되지 않는 이온-수송자 또는 이온 투과 담체 화합물은 8-히드록시퀴놀린 (옥신); 8-히드록시퀴놀린 β-D-갈락토피라노시드; 8-히드록시퀴놀린 β-D-글루코피라노시드; 8-히드록시퀴놀린 클루쿠로니드; 8-히드록시퀴놀린-5-술폰산; 8-히드록시퀴놀린-β-D-클루쿠로니드 나트륨 염; 8-퀴놀리놀 헤미술페이트 염; 8-퀴놀리놀 N-옥시드; 2-아미노-8-퀴놀리놀; 5,7-디브로모-8-히드록시퀴놀린; 5,7-디클로로-8-히드록시퀴놀린; 5,7-디이오도-8-히드록시퀴놀린; 5,7-디메틸-8-퀴놀리놀; 5-아미노-8-히드록시퀴놀린 디히드로클로라이드; 5-클로로-8-퀴놀리놀; 5-니트로-8-히드록시퀴놀린; 7-브로모-5-클로로-8-퀴놀리놀; N-부틸-2,2'-이미노-디(8-퀴놀리놀); 8-히드록시퀴놀린 벤조에이트; 2-벤질-8-히드록시퀴놀린; 5-클로로-8-히드록시퀴놀린 히드로클로라이드; 2-메틸-8-퀴놀리놀; 5-클로로-7-이오도-8-퀴놀리놀; 8-히드록시-5-니트로퀴놀린; 8-히드록시-7-이오도-5-퀴놀린술폰산; 5,7-디클로로-8-히드록시-2-메틸퀴놀린, 및 다른 퀴놀린 (1-아자나프탈렌, 1-벤자진)으로 구성된 화학적 화합물 및 이들의 유도체의 그룹으로부터 선택될 수도 있다. 한 구체예에서, 이온 투과 담체 화합물은 8-히드록시퀴놀린 (옥신); 8-히드록시퀴놀린 β-D-갈락토피라노시드; 8-히드록시퀴놀린 β-D-글루코피라노시드; 8-히드록시퀴놀린 클루쿠로니드; 8-히드록시퀴놀린-5-술폰산; 8-히드록시퀴놀린-β-D-클루쿠로니드 나트륨 염; 8-퀴놀리놀 헤미술페이트 염; 8-퀴놀리놀 N-옥시드; 2-아미노-8-퀴놀리놀; 5,7-디브로모-8-히드록시퀴놀린; 5,7-디클로로-8-히드록시퀴놀린; 5,7-디이오도-8-히드록시퀴놀린; 5,7-디메틸-8-퀴놀리놀; 5-아미노-8-히드록시퀴놀린 디히드로클로라이드; 5-클로로-8-퀴놀리놀; 5-니트로-8-히드록시퀴놀린; 7-브로모-5-클로로-8-퀴놀리놀; N-부틸-2,2'-이미노-디(8-퀴놀리놀); 8-히드록시퀴놀린 벤조에이트; 2-벤질-8-히드록시퀴놀린; 5-클로로-8-히드록시퀴놀린 히드로클로라이드; 2-메틸-8-퀴놀리놀; 5-클로로-7-이오도-8-퀴놀리놀; 8-히드록시-5-니트로퀴놀린; 8-히드록시-7-이오도-5-퀴놀린술폰산; 5,7-디클로로-8-히드록시-2-메틸퀴놀린, 및 ㄷ다다른 퀴놀린 (1-아자나프탈렌, 1-벤자진)으로 구성된 화학적 화합물 및 이들의 유도체로 구성된 그룹으로부터 선택된다.
나노입자에 포함되지 않거나 본 발명의 방법에 사용되지 않은 이온-수송자 또는 이온 투과 담체 화합물은 추가적으로 2-히드록시퀴놀린-4-카르복실산; 6-클로로-2-히드록시퀴놀린; 8-클로로-2-히드록시퀴놀린; 카르보스티릴 124; 카르보스티릴 165; 4,6-디메틸-2-히드록시퀴놀린; 4,8-디메틸-2-히드록시퀴놀린; 또는 다른 2-퀴놀리놀 화합물 8-히드록시퀴놀린 (옥신); 8-히드록시퀴놀린 β-D-갈락토피라노시드; 8-히드록시퀴놀린 β-D-글루코피라노시드; 8-히드록시퀴놀린 클루쿠로니드; 8-히드록시퀴놀린-5-술폰산; 8-히드록시퀴놀린-β-D-클루쿠로니드 나트륨 염; 8-퀴놀리놀 헤미술페이트 염; 8-퀴놀리놀 N-옥시드; 2-아미노-8-퀴놀리놀; 5,7-디브로모-8-히드록시퀴놀린; 5,7-디클로로-8-히드록시퀴놀린; 5,7-디이오도-8-히드록시퀴놀린; 5,7-디메틸-8-퀴놀리놀; 5-아미노-8-히드록시퀴놀린 디히드로클로라이드; 5-클로로-8-퀴놀리놀; 5-니트로-8-히드록시퀴놀린; 7-브로모-5-클로로-8-퀴놀리놀; N-부틸-2,2'-이미노-디(8-퀴놀리놀); 8-히드록시퀴놀린 벤조에이트; 2-벤질-8-히드록시퀴놀린; 5-클로로-8-히드록시퀴놀린 히드로클로라이드; 2-메틸-8-퀴놀리놀; 5-클로로-7-이오도-8-퀴놀리놀; 8-히드록시-5-니트로퀴놀린; 8-히드록시-7-이오도-5-퀴놀린술폰산; 5,7-디클로로-8-히드록시-2-메틸퀴놀린, 및 다른 퀴놀린 (1-아자나프탈렌, 1-벤자진)으로 구성된 화학적 화합물 및 이들의 유도체, [6S-[6.알파.(2S*,3S*), 8.베타.(R*),9.베타., 11.알파.]]-5-(메틸아미노)-2-[[3,9,11-트리메틸-8-[1-메틸-2-옥소-2-(1H-피롤2-일)에틸]-1,7-디옥사스피로[5.5]운덱-2-일]메틸]-4-벤족사졸카르복실산 (A23187로도 불림), HMPAO (헥사메틸 프로필렌 아민 옥심), HYNIC (6-히드라지노피리딘-3-카르복실산), BMEDA (N-N-비스 (2-메르캅토에틸)-N',N'-디에틸에틸렌디아민), DISI DA (디이소프로필 이미노디아세트산), 프탈디알데히드 및 이들의 유도체, 2,4-디니트로페놀 및 이들의 유도체, 디-벤조-18-크라운-6 및 이들의 유도체, 옥실렌-비스(N, N-디이소부틸디티오카르바메이트) 및 이들의 유도체, N,N,N',N'-테트라시클로헥실-2,2'-티오디아세트아미드 및 이들의 유도체, 2-(1,4,8,11-테트라티오시클로테트라덱-6-일옥시)헥사노익산, 2-(3,6,10,13-테트라티오시클로테트라덱-1-옥시)헥사노익산 및 이들의 유도체, N,N-비스 (2-메르캅토에틸)-N',N'-디에틸에틸렌디아민 및 이들의 유도체, 뷰베리신, 에니아틴, 그라미시딘, 이오노마이신, 라살로시드, 모네신, 니게리신, 노낙틴, 니스타틴, 살리노마이신, 발리노마이신, 피리독살 이소니코티노일 히드라존 (PIH), 살리실알데히드 이소니코티노일 히드라존 (SIH), 1,4,7-트리스메르캅토에틸-1,4,7-트리아자시클로노난, N,N',N"-트리스(2-메르캅토에틸)-1,4,7-트리아자-시클로노난, 모넨시스, DP-b99, DP-109, BAPTA, 피리독살 이소니코티노일 히드라존 (PIH), 알라메티신, 디-2-피리딜케톤 티오세미카르바존 (HDpT), 카르보닐 시아니드 m-클로로페닐 히드라존 (CCCP), 라살로시드 A (X-537A), 라살로시드의 5-브로모 유도체; 환형 뎁시펩티드; 환형 펩티드; DECYL-2; N,N,N',N'-테트라부틸-3,6-디옥사옥타네디[티오아미드]); N,N,N',N'-테트라시클로헥실-3-옥사-펜탄디아미드; N,N-디시클로헥실-N',N'-디옥타데실-디글리콜릭-디아미드; N,N'-디헵틸-N,N'-디메틸-1,-부탄디아미드; N,N"-옥타메틸렌-비스[N'-헵틸-N'-메틸-말론아미드; N,N-디옥타데실-N',N'-디프로필-3,6-디옥사옥타네디아미드; N-[2-(1H-피롤릴-메틸)]-N'-(4-펜텐-3-온-2)-에탄-1,2-디아민 (MRP20); 및 항진균 독소; 아베나시올리드 또는 상기 언급된 이온 투과 담체, 뿐만 아니라 WO2011/006510에 설명된 이온 투과 담체 및 업계에 설명된 다른 이온 투과 담체의 유도체로 구성된 그룹으로부터 선택될 수도 있다.
pH 구배 로딩 가능한 약제, 즉, 이온화 가능한 모이어티의 중화 형태가 금속 실체물이 리포솜 막을 통과하는 것을 허용하고 모이어티의 전하를 띈 형태로 전환은 금속 실체물이 리포솜 내에 캡슐화된 채로 유지하는 것을 유발하는 하나 이상의 이온화 가능한 모이어티를 갖는 약제는 또한 본 발명의 이온 투과 담체로 생각되고, 이온화 가능한 모이어티는 아민, 카르복실산 및 히드록실 기를 포함할 수도 있지만, 이를 포함하는 것에 제한되지 않는다. 산성 내부에 반응하여 로딩되는 pH 구배 로딩 가능한 약제는 산성 환경에 반응하여 전하를 띈 이온화 가능한 모이어티를 포함할 수도 있는 반면에 염기성 내부에 반응하여 로딩되는 약물은 염기성 환경에 반응하여 전하를 띈 모이어티를 포함한다. 염기성 내부의 경우에서, 카르복실산 또는 히드록실 기를 포함하지만, 이에 제한되지 않는 이온화 가능한 모이어티가 활용될 수도 있다.
내부 pH
본 발명의 나노입자의 내부 pH는 나노입자의 특성이 최적화되는 특정 범위에 놓여 있도록 조절될 수 있다.
본 발명 또는 본 발명의 방법의 한 구체예에서, 리포솜 조성물의 내부 pH는 조절되고, 따라서 약제-포집 성분 및/또는 이온 투과 담체의 원하는 양성자화 상태를 달성하고, 이로 인해 방사성 핵종의 효과적인 로딩 및 포집을 확보한다.
본 발명 또는 본 발명의 바람직한 구체예에서, 리포솜 조성물의 내부 pH는 조절되고, 따라서 약제-포집 성분의 원하는 양성자화 상태를 달성하고, 이로 인해 방사성 핵종의 효과적인 로딩 및 포집을 확보한다.
구리 동위원소와 함께 로딩된 나노입자 조성물을 생산하는, 개시된 방법의 또 다른 구체예에서, 내부 pH는 나노입자의 합성 중에 나노입자의 내부 pH가 1 내지 10, 예를 들어, 1-2, 예를 들어, 2-3, 예를 들어, 3-4, 예를 들어, 4-5, 예를 들어, 5-6, 예를 들어, 6-7, 예를 들어, 7-8, 예를 들어, 8-9, 예를 들어, 9-10의 범위 인 방법으로 조절된다.
본 발명의 바람직한 구체예에서, 나노입자의 내부 pH는 4 내지 8.5, 예를 들어, 4.0 내지 4.5, 예를 들어, 4.5 내지 5.0, 예를 들어, 5.0 내지 5.5 예를 들어, 5.5 내지 6.0, 예를 들어, 6.0 내지 6.5, 예를 들어, 6.5 내지 7.0, 예를 들어, 7.0 내지 7.5, 예를 들어, 7.5 내지 8.0, 예를 들어, 8.0 내지 8.5의 범위에 있다.
본 발명의 또 다른 구체예에서, 본 발명의 나노입자의 내부 pH는 나노입자의 안정성을 연장하기 위해 최적화된다. 이러한 개선된 안정성은 예를 들어, 더 긴 유통 기한 또는 더 넓은 범위의 저장 가능 온도로 이어지고 이로 인해 나노입자의 사용을 가능하게 한다. 개선된 안정성은 예를 들어, 포집된 방사성 핵종의 유무에 상관없이 약제-포집 성분의 증가된 안정성으로 인해 또는 나노입자의 다른 특성의 증가된 안정성으로 인해 내부 pH가 소포를 형성하는 소포 형성 성분의 증가된 안정성으로 이어지기 때문에 얻어질 수 있다. 개선된 안정성에 대해 최적화된 내부 pH는 1 내지 10, 예를 들어, 1-2, 예를 들어, 2-3, 예를 들어, 3-4, 예를 들어, 4-5, 예를 들어, 5-6, 예를 들어, 6-7, 예를 들어, 7-8, 예를 들어, 8-9, 예를 들어, 9-10의 범위 내에 있을 수도 있다.
본 발명의 바람직한 구체예에서, 나노입자의 개선된 안정성으로 이어지는 내부 pH는 4 내지 8.5, 예를 들어, 4.0 내지 4.5, 예를 들어, 4.5 내지 5.0, 예를 들어, 5.0 내지 5.5, 예를 들어, 5.5 내지 6.0, 예를 들어, 6.0 내지 6.5, 예를 들어, 6.5 내지 7.0, 예를 들어, 7.0 내지 7.5, 예를 들어, 7.5 내지 8.0, 예를 들어, 8.0 내지 8.5의 범위에 있다.
삼투압
소포 또는 나노입자 막에서 작은 삼투성 스트레스의 생성은 금속 실체물 및/또는 방사성 핵종의 나노입자에 로딩에 바람직하다. 삼투성 스트레스는 삼투압의 차이, 즉, 내부 및 외부 삼투압 사이의 차이이다. 삼투성 스트레스의 존재는 더 작은 이온, 예를 들어, 금속 이온 또는 방사성 핵종 이온의 막을 통한 이동을 가능하게 하는 반면 킬레이트 시약과 같은 더 큰 전하를 띈 분자가 나노입자 내에 트래핑된 채로 남아있다.
본 발명에 따라, 리포솜에 로딩은 리포솜에 캡슐화된 수용액뿐만 아니라 리포솜의 제작 중에 외부 수용액의 삼투압을 조정함으로써 조절될 수 있다. 삼투압 (Osm)은 물의 활성의 측정값 (화학적 가능성의 함수로서)이며, 이것은 수용액에 킬레이터 또는 다른 삼투성 활성제를 포함하는 용질의 존재에 의해 통제된다. 삼투물질의 막관통 구배는 리포솜의 상태에 영향을 미치고 리포솜이 물의 손실로 인해 이완 (Osm내부 < Osm외부) 되거나 막관통 삼투압 (Osm내부 > Osm외부) 및 막 장력을 형성하는 물의 흡수로 인해 팽팽해지는 것을 유발한다. 일반적으로, 막 장력은 막 늘어남 (stretching)으로 이어질 것이고 따라서 증가된 투과성을 유발하는 이중층의 시닝 (thinning)으로 이어질 것이다. 게다가, 막 장력은 결함 (일시적 포어)의 형성을 유발할 수 있으며, 이것은 또한 증가된 막 투과성 때문이다. 따라서 막 투과성은 더 높은 로딩 속도 및 로딩 효율로 이어지는 증가된 고삼투압 (Osm내부 > Osm외부)에 따라 증가하는 것으로 예상된다. 너무 높은 삼투압 (장력)은 또한 리포솜의 용해를 유발하고 내용물의 점진적 방출 또는 리포솜의 기술적 결함을 유발한다. 예를 들어, 100 nm 소포가 트래핑된 소포 내 배지에 대하여 고삼투압 용액에 배치되면, 그것은 소포가 구형을 가정하는 것을 유발하는 물의 유입을 일으킬 수 있고, 충분한 규모의 삼투압 차이는 소포 내 용질의 부분적 방출을 일으키는 막 파열을 생산할 것이다. 하지만, 막에서 콜레스테롤의 존재는 기계적 안정성을 제공하고 이로 인해 전체적으로 삼투압 불균형에 대한 더 큰 내성을 일으키는 막 용해 장력을 증가시키는 것으로 인식된다.
리포솜 내 삼투압은 리포솜 제조 중에 지질 필름을 수화시키기 위해 사용된 용액의 삼투압을 측정함으로써, 빙점 (freeze-point) 방법과 같은, 하지만 이에 제한되지 않는 업계의 통상적인 방법을 사용함으로써 결정될 수 있으며, 이것은 일반적으로 삼투압을 측정하는 기구에 사용된다.
같은 방법은 외부 리포솜 버퍼의 삼투압을 측정하는데 이용될 수 있다. 중요하게, 버퍼 삼투압은 버퍼 제조 중에 pH 조정에 의해 (예를 들어, NaOH 또는 HCl을 사용하여) 쉽게 영향을 받는다.
본 발명의 바람직한 구체예에서, 삼투압은 빙점 방법의 사용에 의해 측정된다.
삼투압을 조절하는 것은 삼투성 스트레스를 생성하기 위해 사용될 수 있다. 이러한 삼투성 스트레스는 삼투성 약제, 예를 들어, 당, 염, 킬레이트 시약, 이온, 펩티드, 단백질, 약학적 화합물, 버퍼분자 및/또는 나노입자의 용질을 포집함으로써 조절될 수 있다.
본 발명의 한 구체예에서, 나노입자의 내부의 삼투압은 40-800 mOsm/L, 예를 들어, 40-100 mOsm/L, 또는 예를 들어, 100-150 mOsm/L, 또는 예를 들어, 150-200 mOsm/L, 또는 예를 들어, 200-250 mOsm/L, 또는 예를 들어, 250-300 mOsm/L, 또는 예를 들어, 300-350 mOsm/L, 또는 예를 들어, 350-400 mOsm/L, 또는 예를 들어, 400-450 mOsm/L, 또는 예를 들어, 450-500 mOsm/L, 또는 예를 들어, 500-550 mOsm/L, 또는 예를 들어, 550-600 mOsm/L, 또는 예를 들어, 600-650 mOsm/L, 또는 예를 들어, 650-700 mOsm/L 또는 예를 들어, 700-750 mOsm/L, 또는 예를 들어, 750-800 mOsm/L이다.
본 발명의 또 다른 구체예에서, 나노입자의 외부의 삼투압은 40-800 mOsm/L, 예를 들어, 40-100 mOsm/L, 또는 예를 들어, 100-150 mOsm/L, 또는 예를 들어, 150-200 mOsm/L, 또는 예를 들어, 200-250 mOsm/L, 또는 예를 들어, 250-300 mOsm/L, 또는 예를 들어, 300-350 mOsm/L, 또는 예를 들어, 350-400 mOsm/L, 또는 예를 들어, 400-450 mOsm/L, 또는 예를 들어, 450-500 mOsm/L, 또는 예를 들어, 500-550 mOsm/L, 또는 예를 들어, 550-600 mOsm/L, 또는 예를 들어, 600-650 mOsm/L, 또는 예를 들어, 650-700 mOsm/L 또는 예를 들어, 700-750 mOsm/L, 또는 예를 들어, 750-800 mOsm/L이다.
본 발명의 한 구체예에서, 나노입자의 내부 및 나노입자의 외부 사이의 삼투압의 차이는 5-800 mOsm/L, 예를 들어, 5-10 mOsm/L, 예를 들어, 10-20 mOsm/L, 또는 예를 들어, 10-20 mOsm/L, 또는 예를 들어, 20-30 mOsm/L, 또는 예를 들어, 30-40 mOsm/L, 또는 예를 들어, 40-50 mOsm/L, 또는 예를 들어, 50-60 mOsm/L, 또는 예를 들어, 60-70 mOsm/L, 또는 예를 들어, 60-70 mOsm/L, 또는 예를 들어, 70-80 mOsm/L, 또는 예를 들어, 80-90 mOsm/L, 또는 예를 들어, 90-100 mOsm/L, 또는 예를 들어, 100-150 mOsm/L, 또는 예를 들어, 150-200 mOsm/L, 또는 예를 들어, 200-250 mOsm/L, 또는 예를 들어, 250-300 mOsm/L, 또는 예를 들어, 300-350 mOsm/L, 또는 예를 들어, 350-400 mOsm/L, 또는 예를 들어, 400-450 mOsm/L, 또는 예를 들어, 450-500 mOsm/L, 또는 예를 들어, 500-550 mOsm/L, 또는 예를 들어, 550-600 mOsm/L, 또는 예를 들어, 600-650 mOsm/L, 또는 예를 들어, 650-700 mOsm/L, 또는 예를 들어, 700-750 mOsm/L, 또는 예를 들어, 750-800 mOsm/L이다.
본 발명의 한 특정 구체예에서, 나노입자의 내부 및 나노입자의 외부 사이의 삼투압의 차이는 10-100 mOsm/L이다.
안정성
본 발명의 나노입자는 개선된 안정성을 가지며, 이것은 다른 테스트를 사용하여 측정될 수도 있다.
본 발명의 한 구체예에서, 방사성 표지된 나노입자의 안정성은 방사능의 20% 미만의 누출이 버퍼 또는 사람 혈청에서 배양의 특정시간에 따라 관찰되는 것이다. 이러한 누출은 정제 과정, 예를 들어, 크기 배제 크로마토그래피 (SEC), 이온-교환 크로마토그래피 또는 투석을 포함하는, 업계의 통상적인 방법에 의해 측정된 바와 같이 20% 미만, 예를 들어, 15% 미만 누출, 예를 들어, 12% 미만 누출, 예를 들어, 10% 미만 누출, 예를 들어, 8% 미만 누출, 예를 들어, 6% 미만 누출, 예를 들어, 4% 미만 누출, 예를 들어, 3% 미만 누출, 예를 들어, 2% 미만 누출, 예를 들어, 1% 미만 누출일 수 있다. 방사성 핵종과 같은 금속 실체물의 양은 방사능 검출기를 사용하여 방사능으로 또는 유도 결합 플라스마 질량분석법 (ICP-MS), 유도 결합 플라스마 원자 방출분석법 (ICP-AES) 또는 유도 결합 플라스마 광 방사분석법 (ICP-OES)을 사용하여 금속 실체물의 농도를 측정함으로써 측정될 수 있다.
본 발명의 한 구체예에서, 방사성 표지된 나노입자의 안정성은 방사능의 20% 미만의 누출, 예를 들어, 15% 미만 누출, 예를 들어, 12% 미만 누출, 예를 들어, 10% 미만 누출, 예를 들어, 8% 미만 누출, 예를 들어, 6% 미만 누출, 예를 들어, 4% 미만 누출, 예를 들어, 3% 미만 누출, 예를 들어, 2% 미만 누출, 예를 들어, 1% 미만 누출이 누출 방사성 핵종으로부터 방사성 표지된 나노입자를 분리하는 정제 과정 후 이어서 37 ℃의 버퍼 또는 사람 혈청에서 24시간 배양 후 관찰되는 것이다. 상기 정제 과정은 크기 배제 크로마토그래피 (SEC), 이온-교환 크로마토그래피 또는 투석을 포함한다. 방사성 핵종과 같은 금속 실체물의 양은 방사능 검출기를 사용하여 방사능으로 또는 유도 결합 플라스마 질량분석법 (ICP-MS), 유도 결합 플라스마 원자 방출분석법 (ICP-AES) 또는 유도 결합 플라스마 광 방사분석법(ICP-OES)을 사용하여 금속 실체물의 농도를 측정함으로써 측정될 수 있다.
나노입자의 크기
본 발명의 나노입자는 크기가 다를 수도 있다. 나노입자의 크기는 나노입자의 사용을 위해 최적화될 수도 있으며, 나노입자는 예를 들어, 입자의 사람 신체의 부위에 표적화의 개선을 위해, 또는 사람 신체 내의 나노입자의 개선된 관찰을 위해 대상체에 투여된다. 크기는 또한 나노입자의 안정성의 개선을 위해 또는 나노입자의 제조를 개선하거나 가능하게 하기 위해 최적화될 수도 있다.
한 구체예에서, 본 발명의 나노입자 조성물은 30 nm 내지 1000 nm; 예를 들어, 30 nm 내지 300 nm, 예를 들어, 30 nm 내지 60 nm, 예를 들어, 60 nm 내지 80 nm, 예를 들어, 80 nm 내지 100 nm, 예를 들어, 100 nm 내지 120 nm, 예를 들어, 120 nm 내지 150 nm, 예를 들어, 150 nm 내지 180 nm, 예를 들어, 180 nm 내지 210 nm, 예를 들어, 210 nm 내지 240 nm, 예를 들어, 240 nm 내지 270 nm 예를 들어, 270 nm 내지 300 nm, 또는 예를 들어, 300 nm 내지 600 nm, 예를 들어, 300 nm 내지 400 nm, 또는 예를 들어, 400 nm 내지 500 nm, 또는 예를 들어, 500 nm 내지 600 nm, 또는 예를 들어, 600 nm 내지 1000 nm, 예를 들어, 600 nm 내지 700 nm, 또는 예를 들어, 700 nm 내지 800 nm, 또는 예를 들어, 800 nm 내지 900 nm, 또는 예를 들어, 900 nm 내지 1000 nm의 범위의 직경을 갖는다.
한 구체예에서, 방사성 핵종과 함께 로딩된 나노입자를 생산하는, 개시된 방법은 30 nm 내지 1000 nm; 예를 들어, 30 nm 내지 300 nm, 예를 들어, 30 nm 내지 60 nm, 예를 들어, 60 nm 내지 80 nm, 예를 들어, 80 nm 내지 100 nm, 예를 들어, 100 nm 내지 120 nm, 예를 들어, 120 nm 내지 150 nm, 예를 들어, 150 nm 내지 180 nm, 예를 들어, 180 nm 내지 210 nm, 예를 들어, 210 nm 내지 240 nm, 예를 들어, 240 nm 내지 270 nm 예를 들어, 270 nm 내지 300 nm, 또는 예를 들어, 300 nm 내지 600 nm, 예를 들어, 300 nm 내지 400 nm, 또는 예를 들어, 400 nm 내지 500 nm, 또는 예를 들어, 500 nm 내지 600 nm, 또는 예를 들어, 600 nm 내지 1000 nm, 예를 들어, 600 nm 내지 700 nm, 또는 예를 들어, 700 nm 내지 800 nm, 또는 예를 들어, 800 nm 내지 900 nm, 또는 예를 들어, 900 nm 내지 1000 nm의 범위의 직경을 갖는 나노입자를 발생시킨다.
한 구체예에서, 구리와 함께 로딩된 나노입자를 생산하는, 개시된 방법은 30 nm 내지 1000 nm; 예를 들어, 30 nm 내지 300 nm, 예를 들어, 30 nm 내지 60 nm, 예를 들어, 60 nm 내지 80 nm, 예를 들어, 80 nm 내지 100 nm, 예를 들어, 100 nm 내지 120 nm, 예를 들어, 120 nm 내지 150 nm, 예를 들어, 150 nm 내지 180 nm, 예를 들어, 180 nm 내지 210 nm, 예를 들어, 210 nm 내지 240 nm, 예를 들어, 240 nm 내지 270 nm 예를 들어, 270 nm 내지 300 nm, 또는 예를 들어, 300 nm 내지 600 nm, 예를 들어, 300 nm 내지 400 nm, 또는 예를 들어, 400 nm 내지 500 nm, 또는 예를 들어, 500 nm 내지 600 nm, 또는 예를 들어, 600 nm 내지 1000 nm, 예를 들어, 600 nm 내지 700 nm, 또는 예를 들어, 700 nm 내지 800 nm, 또는 예를 들어, 800 nm 내지 900 nm, 또는 예를 들어, 900 nm 내지 1000 nm의 범위의 직경을 갖는 나노입자를 발생시킨다.
바람직한 구체예에서, 본 발명의 나노입자 조성물은 30 nm 내지 300 nm; 예를 들어, 30 nm 내지 60 nm, 예를 들어, 60 nm 내지 80 nm, 예를 들어, 80 nm 내지 100 nm, 예를 들어, 100 nm 내지 120 nm, 예를 들어, 120 nm 내지 150 nm, 예를 들어, 150 nm 내지 180 nm, 예를 들어, 180 nm 내지 210 nm, 예를 들어, 210 nm 내지 240 nm, 예를 들어, 240 nm 내지 270 nm 예를 들어, 270 nm 내지 300 nm의 범위의 직경을 갖는다.
바람직한 구체예에서, 방사성 핵종과 함께 로딩된 나노입자를 생산하는, 개시된 방법은 30 nm 내지 300 nm; 예를 들어, 30 nm 내지 60 nm, 예를 들어, 60 nm 내지 80 nm, 예를 들어, 80 nm 내지 100 nm, 예를 들어, 100 nm 내지 120 nm, 예를 들어, 120 nm 내지 150 nm, 예를 들어, 150 nm 내지 180 nm, 예를 들어, 180 nm 내지 210 nm, 예를 들어, 210 nm 내지 240 nm, 예를 들어, 240 nm 내지 270 nm 예를 들어, 270 nm 내지 300 nm의 범위의 직경을 갖는 나노입자를 발생시킨다.
바람직한 구체예에서, 구리와 함께 로딩된 나노입자를 생산하는, 개시된 방법은 30 nm 내지 300 nm; 예를 들어, 30 nm 내지 60 nm, 예를 들어, 60 nm 내지 80 nm, 예를 들어, 80 nm 내지 100 nm, 예를 들어, 100 nm 내지 120 nm, 예를 들어, 120 nm 내지 150 nm, 예를 들어, 150 nm 내지 180 nm, 예를 들어, 180 nm 내지 210 nm, 예를 들어, 210 nm 내지 240 nm, 예를 들어, 240 nm 내지 270 nm 예를 들어, 270 nm 내지 300 nm의 범위의 직경을 갖는 나노입자를 발생시킨다.
제조 방법
본 발명은 여기에 설명된 바와 같이 소포 형성 성분, 소포 형성 성분에 의해 둘러싸인 약제-포집 성분 소포 형성 성분, 및 나노입자 조성물 내에 포집된 금속 실체물을 포함하는 나노입자 조성물의 제조 방법을 제공한다.
본 발명의 이러한 나노입자의 제조 방법은 다음 단계를 포함한다:
a. 소포 형성 성분 및 상기 소포 형성 성분에 의해 둘러싸인 약제-포집 성분을 포함하는 나노입자 조성물을 제공하는 단계;
b. 22 ℃ 이상의 온도에서 금속 실체물을 포함하는 수용액에서 나노입자 조성물의 배양에 의해 금속 실체물을 나노입자 조성물의 내부에 포집하는 단계.
본 발명의 바람직한 나노입자의 제조 방법은 로딩을 위해 이온 투과 담체의 사용을 수반하지 않으며, 다음 단계를 포함한다:
a. 소포 형성 성분 및 상기 소포 형성 성분에 의해 둘러싸인 약제-포집 성분을 포함하는 나노입자 조성물을 제공하는 단계;
b. 금속 실체물을 포함하는 수용액에서 나노입자 조성물의 배양에 의해 소포 형성 성분의 막을 통해 양이온 금속 실체물의 전이를 가능하게 함으로써 금속 실체물을 나노입자 조성물의 내부에 포집하는 단계.
본 발명의 방법의 한 구체예에서, 나노입자의 로딩을 위한 배양 온도는 22 ℃ 이상, 예를 들어, 30 ℃ 이상, 예를 들어, 35 ℃ 이상, 예를 들어, 40 ℃ 이상, 예를 들어, 45 ℃ 이상, 예를 들어, 50 ℃ 이상, 예를 들어, 55 ℃ 이상, 예를 들어, 60 ℃ 이상, 예를 들어, 65 ℃ 이상, 예를 들어, 70 ℃ 이상, 예를 들어, 75 ℃ 이상이다.
본 발명의 방법의 또 다른 구체예에서, 나노입자의 로딩을 위한 배양 온도는 10 ℃ 이상, 예를 들어, 15 ℃ 이상, 예를 들어, 22 ℃ 이상, 예를 들어, 30 ℃ 이상, 예를 들어, 35 ℃ 이상, 예를 들어, 40 ℃ 이상, 예를 들어, 45 ℃ 이상, 예를 들어, 50 ℃ 이상, 예를 들어, 55 ℃ 이상, 예를 들어, 60 ℃ 이상, 예를 들어, 65 ℃ 이상, 예를 들어, 70 ℃ 이상, 예를 들어, 75 ℃이상이다.
본 발명의 방법에서, 나노입자의 로딩을 위한 배양 온도는 나노입자가 분해되는 경우 임계 온도보다 낮다. 따라서 본 발명에 따라, 나노입자의 로딩을 위한 배양 온도는 100 ℃ 이하, 예를 들어, 90 ℃ 이하, 예를 들어, 85 ℃ 이하, 예를 들어, 80 ℃ 이하이다.
본 발명의 또 다른 구체예에서, 나노입자의 로딩을 위한 배양 온도는 22 ℃ 내지 80 ℃, 예를 들어, 22 ℃ 내지 30 ℃, 또는 30 ℃ 내지 80 ℃의 범위, 예를 들어, 30 ℃ 내지 40 ℃의 범위, 예를 들어, 30 ℃ 내지 35 ℃, 또는 예를 들어, 35 ℃ 내지 40 ℃, 또는 40 ℃ 내지 80 ℃의 범위, 예를 들어, 40 ℃ 내지 45 ℃, 또는 예를 들어, 45 ℃ 내지 50 ℃이고, 50 ℃ 내지 80 ℃의 범위, 예를 들어, 50 ℃ 내지 55 ℃, 또는 예를 들어, 55 ℃ 내지 60 ℃, 또는 예를 들어, 60 ℃ 내지 65 ℃, 또는 예를 들어, 65 ℃ 내지 70 ℃, 또는 예를 들어, 70 ℃ 내지 75 ℃, 또는 예를 들어, 75 ℃ 내지 80 ℃를 포함하며, 30 ℃ 내지 80 ℃의 범위가 바람직하고 40 ℃ 내지 80 ℃의 범위가 더 바람직하다.
본 발명의 또 다른 구체예에서, 나노입자의 로딩을 위한 배양 온도는 10 ℃ 내지 80 ℃, 예를 들어, 15 ℃ 내지 80 ℃, 또는 예를 들어, 15 ℃ 내지 22 ℃, 또는 22 ℃ 내지 80 ℃의 범위, 예를 들어, 22 ℃ 내지 30 ℃, 예를 들어, 30 ℃ 내지 80 ℃의 범위, 예를 들어, 30 ℃ 내지 40 ℃의 범위, 예를 들어, 30 ℃ 내지 35 ℃, 또는 예를 들어, 35 ℃ 내지 40 ℃, 또는 40 ℃ 내지 80 ℃의 범위, 예를 들어, 40 ℃ 내지 45 ℃, 또는 예를 들어, 45 ℃ 내지 50 ℃이고, 50 ℃ 내지 80 ℃의 범위, 예를 들어, 50 ℃ 내지 55 ℃, 또는 예를 들어, 55 ℃ 내지 60 ℃, 또는 예를 들어, 60 ℃ 내지 65 ℃, 또는 예를 들어, 65 ℃ 내지 70 ℃, 또는 예를 들어, 70 ℃ 내지 75 ℃, 또는 예를 들어, 75 ℃ 내지 80 ℃를 포함하며, 30 ℃ 내지 80 ℃의 범위가 바람직하고 40 ℃ 내지 80 ℃의 범위가 더 바람직하다.
본 발명의 방법은 단지 금속 실체물/방사성 핵종의 나노입자로 확산으로부터 예상된 것들보다 나노입자의 더 빠른 로딩을 허용한다.
따라서, 본 발명의 한 구체예에서, 나노입자의 로딩을 위한 배양은 48시간 미만의 기간, 예를 들어, 36-48시간, 또는 예를 들어, 24-36시간, 또는 예를 들어, 18-24시간, 또는 예를 들어, 16-18시간, 또는 예를 들어, 14-16시간, 또는 예를 들어, 12-14시간, 또는 예를 들어, 10-12시간, 또는 예를 들어, 8-10시간, 또는 예를 들어, 6-8시간, 또는 예를 들어, 4-6시간, 또는 예를 들어, 2-4시간, 또는 예를 들어, 1-2시간, 또는 예를 들어, 30분 내지 60분, 또는 5분 내지 30분, 또는 1분 내지 5분에 수행될 수 있다.
본 발명의 배양시간은 48시간보다 더 짧은 기간, 예를 들어, 0분 내지 360분, 예를 들어, 1분 내지 240분, 바람직하게 1분 내지 120분 (3분 내지 120분 및 5분 내지 120분 등) 및 더 바람직하게 1분 내지 60분, 예를 들어, 5분 내지 60분이다.
본 발명의 방법은 삼투성 스트레스가 여기에 한정된 바와 같이 나노입자에서 생성되는 하나 이상의 단계를 포함할 수도 있다. 발명자는 나노입자의 외부와 비교하여 나노입자의 내부의 삼투압의 차이가 나노입자의 로딩을 개선한다는 것을 발견했다. 상기 삼투성 스트레스는 외부 이온 농도와 비교하여 나노입자의 내부 이온 농도 사이의 불균형, 따라서, 소포의 막을 통한 삼투압의 차이가 있다는 것을 확인함으로써 생성될 수 있다.
이러한 삼투성 스트레스 또는 삼투압은 포집된 삼투성 약제, 예를 들어, 염, 당, 이온, 킬레이트, 펩티드, 단백질, 약학적 화합물, 버퍼분자, 및/또는 다른 용질에 의해 조절될 수 있다.
본 발명의 한 구체예에서, 막의 삼투압은 로딩을 향상시키는 삼투압을 갖는 용액을 사용하여 단계 a)의 나노입자 조성물을 제조하여 나노입자의 내부의 삼투압을 조절함으로써 얻어지며, 상기 용액은 여기에 정의된 바와 같이 하나 이상의 삼투성 약제를 포함한다.
본 발명의 또 다른 구체예에서, 막의 삼투압은 로딩을 향상시키는 삼투압을 갖는 용액을 사용하여 단계 b)의 나노입자 조성물을 배양하여 나노입자의 외부의 삼투압을 조절함으로써 얻어지며, 상기 용액은 여기에 정의된 바와 같이 하나 이상의 삼투성 약제를 포함한다.
따라서 본 발명의 한 구체예에서, 배양 용액 (나노입자의 외부)과 비교하여 나노입자의 내부의 삼투압의 차이는 배양의 시작 시점에서 5-800 mOsm/L이다.
본 발명의 방법은 조제물에 사용된 많은 양의 방사성 핵종이 나노입자에 포집되는 것을 확인한다. 본 발명 또는 본 발명의 방법의 한 구체예에서, 로딩의 효율은 크기 배제 크로마토그래피 (SEC, 실시예에 설명됨), 이온-교환 크로마토그래피 또는 투석을 사용하여 검정될 때 90%보다 높다. 본 발명의 또 다른 구체예에서, 로딩의 효율은 35% 이상, 예를 들어, 40% 이상, 예를 들어, 50% 이상, 예를 들어, 60% 이상, 예를 들어, 65% 이상, 예를 들어, 70% 이상, 예를 들어, 75% 이상, 예를 들어, 80% 이상, 예를 들어, 85% 이상, 예를 들어, 90% 이상, 예를 들어, 95%, 또는 예를 들어, 96% 이상, 또는 예를 들어, 97% 이상, 또는 예를 들어, 98% 이상, 또는 예를 들어, 99% 이상이다.
본 발명의 한 구체예에서, 로딩 효율은 1분 내지 240분의 배양시간을 사용할 때 10% 내지 100%의 범위, 바람직하게 80% 내지 100%의 범위 및 더 바람직하게 90% 내지 100%의 범위, 예를 들어, 95%-100%의 범위 (95% 내지 99.9%, 예를 들어, 95%-99% 등)에 있다.
따라서 본 발명의 한 구체예에서, 나노입자의 로딩을 위한 배양 온도는 30 ℃ 내지 80 ℃의 범위에 있고 로딩 효율은 1 내지 240분의 배양시간을 사용할 때 10% 내지 100%의 범위, 바람직하게 80% 내지 100%의 범위 및 더 바람직하게 90% 내지 100%의 범위, 예를 들어, 95%-100%의 범위 (95% 내지 99.9%, 예를 들어, 95%-99% 등)에 있다.
본 발명의 바람직한 구체예에서, 나노입자의 로딩을 위한 배양 온도는 30 ℃ 내지 80 ℃의 범위에 있고 로딩 효율은 1분 내지 60분의 배양시간을 사용할 때 10% 내지 100%의 범위, 바람직하게 80% 내지 100%의 범위, 예를 들어, 90%-100%, 및 더 바람직하게 95% 내지 100%의 범위, 예를 들어, 95% 내지 99.9%, 또는 예를 들어, 95%-99%)에 있다.
본 발명의 방법은 로딩된 나노입자가 단계 b)에서 언급된 바와 같이 배양 용액으로부터 정제되는 단계를 포함할 수도 있다. 따라서, 본 발명, 또는 본 발명의 개시된 방법의 한 구체예에서, 방사성 핵종과 함께 로딩된, 발생한 나노입자는 SEC, 이온-교환 크로마토그래피 또는 투석을 사용하여 정제된다.
본 발명, 또는 본 발명의 개시된 방법의 한 구체예에서, 구리와 함께 로딩된, 발생한 나노입자는 SEC, 이온-교환 크로마토그래피 또는 투석을 사용하여 정제된다.
개시된 방법의 한 구체예에서, 나노입자 조성물의 크기는 구리와 함께 상기 나노입자의 로딩 후에 본질적으로 변하지 않은 채로 유지된다. 개시된 방법의 또 다른 구체예에서, 나노입자 조성물의 크기는 구리 동위원소와 함께 나노입자의 로딩 후에 20% 미만, 예를 들어, 17% 미만, 예를 들어, 14% 미만, 예를 들어, 11% 미만, 예를 들어, 8% 미만, 예를 들어, 5% 미만, 예를 들어, 2% 미만, 예를 들어, 1% 미만으로 변화된다.
개시된 방법의 한 구체예에서, 나노입자 조성물의 크기는 방사성 핵종과 함께 상기 나노입자의 로딩 후에 본질적으로 변하지 않은 채로 유지된다. 개시된 방법의 또 다른 구체예에서, 나노입자 조성물의 크기는 방사성 핵종과 함께 나노입자의 로딩 후에 20% 미만, 예를 들어, 17% 미만, 예를 들어, 14% 미만, 예를 들어, 11% 미만, 예를 들어, 8% 미만, 예를 들어, 5% 미만, 예를 들어, 2% 미만, 예를 들어, 1% 미만으로 변화된다.
개시된 방법의 한 구체예에서, 제타 전위는 구리와 함께 나노입자의 로딩 후에 20% 미만으로 변화된다. 개시된 방법의 또 다른 구체예에서, 제타 전위는 구리와 함께 나노입자의 로딩 후에 18% 미만, 예를 들어, 16% 미만, 예를 들어, 14% 미만, 예를 들어, 12% 미만, 예를 들어, 10% 미만으로 변화된다.
개시된 방법의 한 구체예에서, 제타 전위는 방사성 핵종과 함께 나노입자의 로딩 후에 20% 미만으로 변화된다. 개시된 방법의 또 다른 구체예에서, 제타 전위는 방사성 핵종과 함께 나노입자의 로딩 후에 18% 미만, 예를 들어, 16% 미만, 예를 들어, 14% 미만, 예를 들어, 12% 미만, 예를 들어, 10% 미만으로 변화된다.
추가의 구체예에서, 나노입자 조성물의 제조 방법은 약제-포집 성분을 양성자화 또는 탈양성자화하는 형태로 리포솜 내부 pH를 조정하고, 이로 인해 방사성 핵종의 효과적인 로딩을 유발하는 단계를 포함한다.
설명된 나노입자 조성물의 제조 방법은 모이어티가 암성 질환, 및 일반적으로, 누출 혈관과 관련된 병리학적 상태에 대하여 표적화된 나노입자의 외부 층에 부착되거나 결합되는 단계를 추가로 포함한다. 본 발명의 또 다른 구체예에서, 나노입자 조성물의 제조 방법은 세포 내 표적화 성질을 갖는 화합물, 예를 들어, 핵 위치 서열 펩티드 (NLS 펩티드)가 약제-포집 성분에 접합되고, 및/또는 나노입자 조성물 내에 포집되는 단계를 추가로 포함한다.
개시된 나노입자 조성물의 제조 방법은 나노입자 조성물 내에 포집된 방사성 핵종으로부터 방출되는 방사선의 양을 측정하고 및/또는 검출하는 단계를 추가로 포함할 수도 있다.
본 발명에 의해 제공된 방법은 이온 투과 담체와 같은 이온-수송자의 사용을 포함하지 않는다. 따라서 본 발명의 방법에 의해 제고된 나노입자는 이온-수송자, 친유성 킬레이터 또는 이온 투과 담체를 포함하지 않는다.
성분 키트
본 발명은 나노입자의 제조용 성분 키트를 제공한다.
본 발명에 따라, 이러한 성분 키트는 다음을 포함할 수도 있다:
a. i) 소포 형성 성분, 및 ii) 소포 형성 성분에 의해 둘러싸인 약제-포집 성분을 포함하는 나노입자 조성물; 및
b. 나노입자에 로딩을 위한 금속 실체물을 함유하는 조성물로서, 모든 성분이 여기에 설명되는 조성물.
한 구체예에서, 금속 실체물을 함유하는 조성물은 방사성 핵종을 포함한다.
금속 실체물 또는 방사성 핵종은 저장되거나 특정 방사성 핵종의 특징에 의존하는 제조사로부터 전달된다. 방사성 핵종은 (동결건조된) 염 또는 수용액의 형태로 전달될 수도 있거나 기존의 생산 시설 및 시작 물질을 사용하는 전제로 합성될 수도 있다. 방사성 핵종-함유 나노입자의 투여 전에, 키트의 성분 a 및 b는 혼합되고, 22 ℃ 이상의 온도에서 특정 기간 동안 배양되며, 배양 온도 및 기간은 여기에 한정된 바와 같다.
바람직하게 키트에 제공되는 간단한 테스트 과정을 사용하여, 캡슐화의 효율을 테스트하였다. 캡슐화의 테스트 후에, 약물은 환자에게 투여된다.
본 발명에 따라, 성분 키트는 또한 다음을 포함할 수도 있다:
a) 소포 형성 성분, 및 b) 소포 형성 성분에 의해 둘러싸인 약제-포집 성분; 및 c) 나노입자에 로딩을 위한 금속 실체물을 함유하는 조성물을 포함하는 나노입자 조성물의 혼합물로서, 모든 성분이 본 출원에 설명된 바와 같은 조성물. 방사성 핵종-함유 나노입자의 투여 전에 성분 a, b 및 c의 혼합물은 22 ℃ 이상의 온도에서 특정 기간 동안 배양되었으며, 배양 온도 및 기간은 여기에 한정된 바와 같다.
금속 실체물이 방사성 핵종, 예를 들어, 양전자 방출기 64Cu를 포함하면, 상기 방사성 핵종은 사용 직전에, (동결건조된) 염 또는 수용액의 형태로 시클로트론 설비 (cyclotron facility)로부터 치료 또는 진단의 장소에 직접 전달된다. 방사성 핵종-함유 나노입자의 투여 전에, 키트의 성분 a 및 b는 혼합되고 캡슐화의 효율은 바람직하게 키트에 공급된 간단한 테스트 과정을 사용하여, 테스트된다. 투여 후에 환자는 PET-또는 SPECT 스캔을 받을 수도 있다. 최적의 시각화는 투여 4-48시간 후에 달성될 수도 있다.
본 발명의 또 다른 구체예에서, 환자는 여기에 언급된 나노입자 조성물의 투여 후 자기 공명 영상 (MRI)을 받을 수도 있다. 이러한 MRI는 본 발명에 따라 PET 또는 SPECT 스캐닝과 결합될 수도 있거나 아닐 수도 있다. 따라서, 본 발명에 따라, 성분 키트는
a. i) 소포 형성 성분 ii) 소포 형성 성분에 의해 둘러싸인 약제-포집 성분 및 iii) MRI에 유용한 금속 실체물을 포함하는 나노입자 조성물; 및
b. 나노입자에 로딩을 위한 하나 이상의 금속 실체물을 함유하는 조성물
을 포함할 수도 있으며, 모든 성분은 여기에 설명된 바와 같거나,
성분 키트는
a. i) 소포 형성 성분 및d ii) 소포 형성 성분에 의해 둘러싸인 약제-포집 성분을 포함하는 나노입자 조성물; 및
b. 나노입자에 로딩을 위한 하나 이상의 금속 실체물을 포함하는 조성물
을 포함할 수도 있으며, 모든 성분은 여기에 설명된 바와 같다.
본 발명의 한 구체예에서, 성분 키트는 결합된 양전자 방사 단층 촬영 (PET) 이미징 및 방사선 치료에 유용한 방사성 핵종의 조합, 예를 들어, 2개의 방사성 핵종, 예를 들어, 64Cu 및 177Lu, 또는 예를 들어, 64Cu 및 67Cu, 또는 예를 들어, 61Cu 및 67Cu, 또는 예를 들어, 64Cu 및 90Y, 또는 예를 들어, 64Cu 및 119Sb, 또는 예를 들어, 64Cu 및 225Ac, 또는 예를 들어, 64Cu 및 188Re, 또는 예를 들어, 64Cu 및 186Re, 또는 예를 들어, 64Cu 및 211At의 조합을 포함한다.
본 발명의 바람직한 구체예에서, 성분 키트는 양전자 방사 단층 촬영 (PET) 이미징 및 방사선 치료에 유용한 방사성 핵종의 조합, 예를 들어, 64Cu 및 177Lu를 포함한다.
본 발명의 또 다른 구체예에서, 상기 성분 키트는 방사성 핵종, 예를 들어, 구리의 동위원소 (61Cu, 64Cu, 및 67Cu)을 포함하는 나노입자의 제조를 위한 것이며, 상기 동위원소는 성분 키트의 일부이거나 아닐 수도 있다. 본 발명의 이러한 구체예에서, 이러한 성분 키트는 i) 소포 형성 성분, 및 ii) 소포 형성 성분에 의해 둘러싸인 약제-포집 성분을 포함하는 나노입자 조성물을 포함할 수도 있다. 본 발명의 추가의 구체예에서, 성분 키트는 금속 실체물의 나노입자에 로딩을 위한 배양 버퍼를 추가로 포함한다.
바람직한 구체예에서, 성분 키트 중 어떤 것도 캡슐화의 효율을 평가하는 테스트 과정을 추가로 포함한다.
본 발명의 나노입자의 제조용 성분 키트는 이온 투과 담체와 같은 이온-수송자를 포함하지 않는다.
치료 또는 진단 방법
본 발명의 나노입자는 필요한 동물 대상체, 예를 들어, 필요한 포유동물, 예를 들어, 필요한 사람의 누출 혈관과 관련된 질환 또는 상태를 진단, 관찰 또는 치료에 사용될 수 있다.
누출 혈관은 종종 조직의 혈관 형성 도는 신생물 성장과 관련된다. 암은 누출 혈관을 특징으로 하는 질환의 예이다. 염증은 누출 혈관과 관련된 상태의 또 다른 예이다.
여기에 언급된 바와 같이 암은 누출 혈관을 특징으로 하는 질환이고, 본 발명은 악성 종양 형성, 예를 들어, 입술, 입 또는 목구멍의 악성 신생물, 예를 들어, 혀, 혀의 바닥, 잇몸, 구강저, 구개, 귀밑샘, 주침샘, 편도, 인두, 비인두, 이상와 (piriform sinus), 하인두 또는 입술, 입 또는 목구멍의 다른 부분의 악성 신생물, 소화 기관의 악성 신생물, 예를 들어, 식도, 위, 소장, 결장, 직장 구불 결장 접합부 (rectosigmoid junction), 직장, 항문 및 항문관, 간 및 간내 담관 (intrahepatic bile ducts), 담낭, 담도의 다른 부분, 췌장 및 비장의 악성 신생물, 호흡기 및 흉강 내 기관의 악성 신생물, 예를 들어, 비강 및 중이, 부비강, 후두, 기도, 기관지 및 폐, 가슴샘, 심장, 종격막 및 흉막의 악성 신생물, 뼈 및 관절 연골의 악성 신생물, 예를 들어, 사지의 뼈 및 관절 연골의 악성 신생물, 뼈 및 관절 연골, 피부, 피지샘 및 땀샘의 악성 흑색종, 중피 및 연조직의 악성 신생물, 예를 들어, 중피종의 악성 신생물, 카포시 육종 (Kaposi's sarcoma), 말초 신경계 및 자율신경계의 악성 신생물, 복막후강 및 복막의 악성 신생물, 연결조직 및 연조직, 예를 들어, 혈관, 점액낭, 연골, 근막, 지방, 인대, 림프관, 근육, 활액, 힘줄, 머리, 얼굴 및 목, 복부, 골반 또는 연결조직 및 연조직의 중복 병변의 악성 신생물, 유방 또는 여성 생식 기관의 악성 신생물, 예를 들어, 음문, 질, 자궁 경부, 자궁, 난소, 나팔관, 태반의 악성 신생물 또는 남성 생식 기관의 악성 신생물, 예를 들어, 음경, 전립선, 고환의 악성 신생물, 요로의 악성 신생물, 예를 들어, 신장, 신우, 요관, 방광, 요도 또는 다른 비뇨 기관의 악성 신생물, 눈, 뇌 및 중추 신경계의 다른 부분의 악성 신생물, 예를 들어, 눈 및 부속기, 뇌척수막, 뇌, 척수, 뇌신경 및 중추 신경계의 다른 부분의 악성 신생물, 갑상선 및 다른 내분비샘의 악성 신생물, 예를 들어, 감상선, 부신, 부갑상선, 뇌하수체, 두개인두관, 송과샘, 경동맥체, 대동맥 소체 및 다른 부신경절의 악성 신생물, 머리, 얼굴 및 목, 흉부, 복부 및 골반의 악성 신생물, 림프절, 호흡 기관 및 소화 기관, 신장 및 신우, 방광 및 다른 비뇨 기관의 2차 악성 신생물, 피부, 뇌, 뇌막, 또는 신경계의 다른 부분, 뼈 및 골수, 난소, 부신의 2차 악성 신생물, 림프 조직, 조혈 조직 및 관련 조직의 악성 신생물, 예를 들어, 호지킨 병, 소낭성 비-호지킨 림프종, 분산 비-호지킨 림프종, 말초 및 피부 T-세포 림프종s, 비-호지킨 림프종, 림프육종, 악성 면역증식 질환, 예를 들어, 발덴스트롬 매크로글로불린혈증 (Waldenstrom's macroglobulinaemia), 알파 중쇄 질환, 감마 중쇄 질환, 면역증식 소장 질환, 다발성 골수종 (multiple myeloma) 및 악성 원형질 세포 신생물, 예를 들어, 원형질 세포성 백혈병 (plasma cell leukemia), 원형질 세포종 (plasmacytoma), 고립성 골수종 (solitary myeloma), 림프성 백혈병, 예를 들어, 급성 림프아세포성 백혈병 (acute lymphoblastic leukaemia), 골수성 백혈병 (myeloid leukaemia), 단구성 백혈병 (monocytic leukaemia), 아세포성 백혈병 (blast cell leukaemia), 줄기세포성 백혈병 (stem cell leukaemia), 및 림프 조직, 조혈 조직 및 관련 조직의 다른 및 비특이적 악성 신생물, 예를 들어, 레테러-시웨 병 (Letterer-Siwe disease), 악성 조직구증 (mallignant histiocytosis), 악성 비만 세포 종양 (malignant mast cell tumor), 진성 조직구성 림프종 (true histiocytic lymphoma) 또는 다른 타입의 악성 종양 형성과 관련된 암성 질환의 치료, 관찰 또는 진단과 관련된다.
본 발명에 따라, 누출 혈관 관련된 질환은 또한 구강, 식도, 위, 소화 기관, 중이 및 호흡계의 상피내암 (carcinoma in situ), 상피 내 흑색종 (melanoma in situ), 피부의 상피내암, 유방의 상피내암, 여성 또는 남성 생식기의 상피내암, 방광, 비교 기관 또는 눈, 갑상선 및 다른 내분비샘의 상피내암, 또는 다른 타입의 상피내암일 수도 있다.
본 발명의 나노입자 또는 소포는 바람직하게 사람과 같은 대상체에게 투여용이다.
본 발명에 따라, 나노입자는 나노입자의 누출 혈관을 포함하는 조직으로 전달을 확인하는 방식으로 필요한 대상체에게 투여될 수도 있다. 이러한 투여는 나노입자가 혈액 또는 림프의 순환으로 이동된다는 것을 확인할 수도 있다.
본 발명의 한 구체예에서, 나노입자는 정맥 내 투여에 사용된다.
본 발명의 또 다른 구체예에서, 나노입자는 구강 투여에 사용된다.
본 발명의 소포 또는 나노입자는 하나 이상의 타입의 이미징에 사용될 수도 있다. 이러한 이미징은 질환의 치료, 관찰 또는 진단, 화학 요법 또는 방사선 치료에 의한 치료의 효능 또는 누출 혈관과 관련된 상태의 관찰 방법의 일부일 수도 있다. 본 발명의 이미징은 엑스레이 이미징, 컴퓨터 단층 촬영 (computed tomography; CT) 이미징, 자기 공명 영상 (MRI), 양전자 방사 단층 촬영 (PET) 이미징, 단일 광자 방출 단층 촬영 (SPECT) 이미징 또는 핵 신티그래프 이미징을 포함한다.
본 발명의 한 구체예에서, 다음을 포함하는 필요한 대상체의 치료 효능, 진단 또는 치료를 관찰하는 방법이 제공된다:
a. 소포 형성 성분, 약제-포집 성분, 및 하나 이상의 포집된 금속 실체물을 포함하는 나노입자 조성물을 제공하는 단계
b. 필요한 대상체에게 나노입자 조성물을 투여하는 단계.
본 발명의 또 다른 구체예에서, 다음을 포함하는 필요한 대상체의 치료 효능, 진단 또는 치료를 관찰하는 방법이 제공된다:
a. 소포 형성 성분, 약제-포집 성분, 및 나노입자 내에 포집된 하나 이상의 방사성 핵종을 포함하는 나노입자 조성물을 제공하는 단계
b. 정맥 내 투여에 의해 대상체에게 나노입자 조성물을 투여하는 단계
c. 특정 배양시간 후 리포솜 조성물 내에서 방사성 핵종으로부터 방출된 방사선의 양을 측정하는 단계
또는
a. 소포 형성 성분, 약제-포집 성분, 및 나노입자 내에 포집된 하나 이상의 금속 실체물을 포함하는 나노입자 조성물을 제공하는 단계
b. 정맥 내 투여에 의해 대상체에게 나노입자 조성물을 투여하는 단계
c. 상기 대상체에서 금속 실체물의 존재 및/또는 위치를 측정하는 통상적인 이미징 방법을 사용하는 단계.
본 발명의 한 구체예에서, 다음을 포함하는, 치료 효능을 관찰하거나, 암을 진단 또는 치료하는 방법이 제공된다:
a. 소포 형성 성분, 약제-포집 성분, 및 Cu(II) 양이온 또는 Cu(I) 양이온일 수도 있는 구리 동위원소 61Cu, 64Cu 및 67Cu 중 하나 이상의 방사성 핵종을 포함하는 방사성 표지된 약제를 포함하는 나노입자 조성물을 제공하는 단계
b. 정맥 내 투여에 의해 대상체에게 나노입자 조성물을 투여하는 단계
c. 특정 배양시간 후 리포솜 조성물 내에서 방사성 핵종으로부터 방출된 방사선의 양을 측정하는 단계.
정의
용어 "소포"에 관하여, 여기에 사용된 바와 같이, 우리는 내부 보이드 (void)의 존재를 특징으로 하는 실체물을 나타낸다. 바람직한 소포는 여기에 설명된 다양한 양친매성 성분을 포함하는 지질로부터 조제된다.
다양한 양태에서 용어 "나노입자"는, 여기에 사용된 바와 같이, 리포솜, 폴리머솜 또는 다른 지질 또는 수화한 코어를 둘러싸는 그것의 가장 넓은 용어로 막을 구성하는 폴리머 셸 (shell) 구조물이다.
용어 "킬레이터" 및 "킬레이트 시약"는 여기에 교체 가능하게 사용된 바와 같이 전이 금속 또는 또 다른 실체물로 하나 이상의 배위 결합을 함유하는 복합체를 형성할 수 있는 극성기의 존재를 특징으로 하는 화학적 모이어티, 약제, 화합물, 또는 분자를 나타낸다. 본 발명의 킬레이터는 물 가용성 및/또는 비-친유성 약제이고, 따라서 지질에 의해 형성된 소포와 같이 친유성 막을 통한 금속 실체물의 수송에 사용된 "친유성 킬레이터"와 같지 않다.
용어 "금속 실체물"는 여기에 사용된 바와 같이 금속 이온 또는 방사성 핵종을 의도하며, 후자는 용어 방사성 동위원소와 여기에 교체 가능하게 사용된다.
용어 "포스파티드"는 글리세롤 성분을 포함하는 인지질을 나타낸다.
용어 "양친매성"은 극성 및 비극성 영역 둘 다를 함유하는 분자를 나타낸다.
용어 "결합 친화도" 및 "친화도"는 여기에 교체 가능하게 사용된 바와 같이 분자 실체물 사이의 인력의 수준을 나타낸다. 친화도는 해리 상수 (또는 그것의 반대, 결합 상수)로서 양적으로 표현될 수 있다. 본 발명의 맥락에서 킬레이터 또는 또 다른 약제-포집 성분의 친화도는 전이 금속 이온 또는 또 다른 금속 실체물, 예를 들어, Cu(II) 또는 Cu(I)에 대한 킬레이터 DOTA의 결합 친화도와 관련될 수 있다.
용어 "포집된 약제"는 방사성 핵종 또는 비-방사성 동위원소일 수도 있으며, 여기에 설명된 바와 같이 리포솜 조성물 또는 나노입자 조성물 내에 포집된다.
용어 "약제-포집"은 여기에 사용된 바와 같이, 제한 없이, 금속 이온 또는 방사성 핵종을 리포솜 조성물 내에 트래핑할 수 있는 어떤 화합물도 나타낸다. 바람직한 약제-포집 성분은 킬레이트 시약, 환원제로 나타나는, 다른 물질을 환원시키는 능력을 가진 물질, 또는 방사성 핵종 또는 금속 실체물과 함께 저 용해도 염을 형성하는 물질이다.
용어 "로딩", "캡슐화", 또는 "포집"은 여기에 사용된 바와 같이 방사성 핵종 또는 금속 실체물의 나노입자 조성물의 내부에 통합을 나타낸다. 본 발명의 방법에서, 이 통합은 방사성 핵종 또는 금속 실체물을 포함하는 조성물과 함께 나노입자 조성물의 배양에 의해 수행된다.
용어 "로딩 효율", "포집 효율" 또는 "캡슐화 효율"은 교체 가능하게 여기에 사용된 바와 같이 조제물에 사용된 방사성 핵종 또는 금속 실체물의 총 량의 퍼센트로서 나타나는, 방사성 핵종 또는 금속 실체물의 나노입자 조성물의 내부에 통합의 분획을 나타낸다.
용어 "캡슐화 안정성", "저장 안정성" 또는 "혈청 안정성"은 나노입자 조성물 내에 포집화제의 누출 및/또는 방출의 정도를 측정하기 위한 나노입자 조성물의 안정성 테스트를 나타낸다.
용어 "방사성 표지된 복합체" 등은 복합체를 형성하는 킬레이트 시약 및 방사성 핵종을 나타낸다.
용어 "표적화 모이어티"는 여기에 사용된 바와 같이 당류, 올리고당, 비타민, 펩티드, 단백질, 항체 및 어피바디 및 나노입자를 높은 수준으로 표적 부위 또는 표적 세포 내에 전달하기 위해 지질 또는 폴리머 성분을 통해 나노입자 표면에 부착되는 것을 특징으로 하는 다른 수용체 결합 리간드를 나타낸다.
용어 "약물", "의약", "약제", 또는 "약학적 화합물"은 여기에 사용된 바와 같이 사람 또는 동물 신체에 국부적으로 또는 전신에 작용하는 생물학적, 생리학적, 또는 약학적 활성 물질을 포함한다.
용어 "치료하는", "치료" 및 "요법"은 여기에 사용된 바와 같이 동일하게 치유 요법, 예방 또는 방지 요법 및 개선 요법을 나타낸다. 용어는 유익한 또는 원하는 생리학적 결과를 얻는 방법을 포함하며, 이것은 임상적으로 확립될 수도 있다. 본 발명의 목적에 대하여, 유익한 또는 원하는 임상 결과는 증상의 완화, 질환의 규모의 감소, 안정화된 (즉, 악화되지 않음) 조건, 상태/증상의 진행 또는 악화의 지연 또는 감속, 상태 또는 증상의 개선 또는 완화, 및 검출 가능한 또는 검출 불가능한 관해 (remission) (일부 또는 전체)를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 용어 "완화", 및 이들의 변형은, 여기에 사용된 바와 같이, 본 발명의 조성물을 투여하지 않은 것과 비교하여, 생리학적 질환 또는 증상의 규모 및/또는 원하지 않는 징후 또는 증상이 줄어들고 및/또는 진행의 시간 과정이 느려지거나 길어진다는 것을 의미한다.
용어 "삼투압"은 여기에 사용된 바와 같이 용액의 리터 (I) 당 용질의 오스몰 (Osm)의 수 (Osm/L)로 한정되는, 용질 농도의 측정값을 나타낸다.
실시예
실시예 I
킬레이트 시약을 포함하는 리포솜 내로 64 Cu 및/또는 177 Lu 의 개선된 로딩
킬레이트 시약을 함유하는 리포솜 조성물의 제조:
킬레이트 시약 (DOTA)을 표준 박막 수화 및 및 반복된 압출을 사용하여 분자비 50:40:10으로 1,2-디스테라로일-sn-글리세로-3-포스포콜린 (DSPC), 콜레스테롤 (CHOL) 및 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-[메톡시(폴리에틸렌글리콜)-2000 (DSPE-PEG-2000)으로 구성된 리포솜 내에 트래핑하였다. 간단히 말하면, 간단히 말하면, 지질을 클로로포름에 혼합하였고 질소의 부드러운 흐름 하에 지질막에 건조하였다. 유기 용매 잔류물을 감소된 압력 하에 하룻밤 동안 제거하였다. 지질막을 수용액-킬레이트 시약, DOTA를 함유하는, 10 mM의 농도로 pH 4.0 또는 pH 7.4로 조정된 HEPES 버퍼 (10 mM, 150 mM NaCl, pH 7.4)를 추가함으로써 분산시켰고 삼투압을 325 mOsm/L인 것으로 측정하였다. 용액을 65 ℃에서 60분 동안 수화시켰다. 다중 박층 소포 (Multi-lamellar vesicle; MLV)를 소형 압출기를 사용하여 100 nm 폴리카르보네이트 필터를 통한 다수의 압출에 의해 큰 단일 박층 소포 (unilamellar vesicle; LUV)로 크기를 조정하였다. 포집되지 않은 킬레이트 시약을 HEPES 버퍼 (10 mM, 150 mM NaCl, pH 7.4, 310 mOsm/L)로 용출된 Sephadex G-25 팩 (packed) 1 x 25 cm 컬럼 상의 크기 배제 크로마토그래피 (SEC)에 의해 제거하였다.
방사성 핵종을 갖는 리포솜 로딩:
상기 섹션에서 설명된 바와 같이 제조된 리포솜의 현탁액을 64Cu 및/또는 177Lu와 같은 방사선 핵종을 함유하는 건조된 바이알에 추가하였다. 현탁액을 50-55 ℃에서 60분 동안 배양하였다. 방사성 핵종 로딩 효율은 64Cu에 대하여 90%보다 더 높았고 177Lu에 대하여 80%보다 더 높았다. Sephadex G-25 컬럼을 사용하는 크기 배제 크로마토그래피 (SEC)로 64Cu-리포솜 및 자유 비-포집된 64Cu의 분리는 도 1에 나타난다. Sephadex G-25 컬럼을 사용하는 크기 배제 크로마토그래피 (SEC)로 177Lu-리포솜 및 자유 비-포집된 177Lu의 분리는 도 2에 나타난다.
온도의 작용에 따르는 64Cu의 로딩 효율은 도 3에 나타나고, 2-히드록시퀴놀린 (2HQ)을 사용하여 이온 투과 담체 로딩과 비교하였다. 이온 투과 담체 2HQ를 사용할 때 64Cu의 리포솜 조성물에 로딩 효율은 온도의 작용에 따라 약간 증가하였고, 50-55 ℃에서 최대 로딩 효율 (92.4% ± 1.4%)을 갖는다. 그에 반해, 이온 투과 담체를 사용하지 않는 64Cu의 리포솜 조성물에 로딩 효율은 이온 투과 담체 (2HQ)가 있는 방법과 비교하여 50-55 ℃에서 더 높은 로딩 효율 (96.7% ± 1.0%)에 도달하는 온도가 증가함에 따라 증가하였다.
리포솜 내부 pH 4.0을 갖는 64 Cu -리포솜의 37 ℃에서 24시간 동안 저장 안정성:
정제된 500 μL 64Cu-리포솜 용액을 37 ℃에서 24시간 동안 배양하였고, 64Cu-리포솜의 안정성을 Sephadex G-25 컬럼 상에서 크기 배제 크로마토그래피 (SEC)에 의해 자유 64Cu를 64Cu-리포솜으로부터 분리함으로써 검정하였다. 용출 프로파일을 인라인 (in line) 방사능 검출기 상에서 관찰하였다. 10 mM DOTA (pH 4.0)을 함유하는 64Cu-리포솜은 총 방사능의 95% 이상을 유지하였다. 방사성 핵종은 그것의 강한 친화도로 인해, 바람직하게 리포솜의 내부에 캡슐화된 DOTA에 결합하며, 방사성 핵종의 포집을 허용한다.
리포솜 내부 pH 7.4를 갖는 64 Cu -리포솜의 37 ℃에서 24시간 동안 저장 안정성:
정제된 500 μL 64Cu-리포솜 용액을 37 ℃에서 24시간 동안 배양하였고, 64Cu-리포솜의 안정성을 Sephadex G-25 컬럼 상에서 크기 배제 크로마토그래피 (SEC)에 의해 자유 64Cu를 64Cu-리포솜으로부터 분리함으로써 검정하였다. 용출 프로파일을 인라인 방사능 검출기 상에서 관찰하였다. 10 mM DOTA (pH 7.4)을 함유하는 64Cu-리포솜은 총 방사능의 95% 이상을 유지하였다. 방사성 핵종은 그것의 강한 친화도로 인해, 바람직하게 리포솜의 내부에 캡슐화된 DOTA에 결합하며, 방사성 핵종의 포집을 허용한다.
방사성 핵종과 함께 로딩된 나노입자 조성물을 생산하는, 개시된 방법은 새로운 PET 이미징제의 빠르고 쉬운 제조이다. 빠른 제조는 양전자-방출기, 64Cu의 짧은 반감기로 인해 중요하고, 상품의 제조에 이상적이다. 방법은 매우 강하고 킬레이트 시약을 함유하고, 리포솜 내부에서 조절된 삼투압, 및 4 내지 8의 범위의 pH를 갖는 리포솜 조성물을 사용하여 지속적으로 높은 로딩 효율을 제공한다. 방사성 핵종의 리포솜에 로딩에 사용된 친유성 이온 투과 담체와 같은 담체가 없는 것은 개시된 방법의 이점이다. 방사성 핵종을 함유하는 나노입자를 제조하는, 개시된 방법은 포집된 방사성 핵종의 >95%를 유지하는 나노입자를 생산하며, 이것은 이미징제 및 치료제로서 이들 나노입자 조성물의 이용에 필수적이다.
실시예 II
Cu ( II )-로딩을 위해 킬레이트 시약을 함유하는 리포솜 조성물의 제조:
비-방사성 Cu2 +의 킬레이터-함유 리포솜에 로딩을 테스트하였고, 이온 Cu(II)-선택성 전극을 사용함으로써 평가하였다. 전극은 용액에서 전위로 용해된 Cu2+의 활성을 전환하며, 이것을 전압계 또는 pH 미터로 측정하였다. 따라서, Cu(II)-선택성 전극은 복합체를 형성하지 않은 Cu2_ 이온 활성에 반응한다. 전극의 감지 부분은 표준 전극과 함께, 이온-특이적 막으로서 만들어진다.
킬레이트 시약 (DOTA)을 표준 박막 수화 및 반복 압출을 사용하여 분자비 50:40:10으로 DSPC, 콜레스테롤 및 DSPE-PEG-2000로 구성된 리포솜 내에 트래핑하였다. 간단히 말하면, 지질 클로로포름에 혼합하였고 질소의 부드러운 흐름 하에 지질막에 건조하였다. 유기 용매 잔류물을 감소된 압력 하에 하룻밤 동안 제거하였다. 지질막을 수용액-pH 4.0으로 조정된, 킬레이트 시약, DOTA를 함유하는 HEPES 버퍼 (10 mM, 150 mM NaN03, pH 6.85)를 추가함으로써 분산시켰다. 용액을 65 ℃에서 60분 동안 수화시켰다. 다중 박층 소포 (MLV)를 소형 압출기를 사용하여 100 nm 폴리카르보네이트 필터를 통한 다수의 압출에 의해 큰 단일 박층 소포 (LUV)로 크기를 조정하였다. 포집되지 않은 킬레이트 시약을 HEPES 버퍼 (10 mM, 150 mM NaN03, pH 6.85, 310 mOsm/L)로 용출된 Sephadex G-25 팩 1 x 25 cm 컬럼 상의 크기 배제 크로마토그래피 (SEC)에 의해 제거하였다.
Cu ( II )와 함께 리포솜 로딩:
Cu(N03)2 표준 용액의 시퀀스 (sequence)를 제조하였고 Cu(II)-선택성 전극을 사용하여 측정하였다 (도 4). Cu(II)-선택성 전극은 복합체는 복합체를 형성하지 않은 구리 이온 활성에 반응한다. Cu(N03)2를 리포솜에 추가하였고 (25 ppm의 최종 농도) Cu(II)-전극 반응을 18.1 ppm 복합체를 형성하지 않은 Cu(II)에 해당하는 141 mV로 측정하였다 (도 4). Cu(II)를 리포솜 조성물에 로딩하기 위해 리포솜 현탁액을 50-55 ℃에서 60분 동안 배양하였으며, 1.2 ppm Cu(II)에 해당하는 94 mV의 Cu(II)-전극 반응을 제공한다. 추가된 Cu(II)가 없는 블랭크 (blank) (배경) 측정값 (10 mM HEPES 버퍼, 150 mM NaN03, pH 6.85)은 2.2 ppm Cu(II)에 해당하는 104 mV의 Cu(II)-전극 반응을 제공한다.
로딩 효율을 계산하기 위해, 다음 방정식 (4)을 사용하였다:
Figure pct00005
이들 결과는 개시된 방법을 사용할 때, Cu(II)의 리포솜 조성물에 매우 높은 로딩 효율 (>95%)을 강력하게 나타낸다 (도 4).
실시예 III
이온 투과 담체 자유 로딩 방법이 2가 양이온에 제한되는지 테스트하기 위해, 2개의 방사성 3가 양이온, 177Lu3 + 및 111In3 +을 테스트하였다. 방사성 퍼테크네테이트 (99 mTc)의 로딩을 또한 테스트하였다. 99 mTc는 화학식 TcO4 -의 산소산 음이온 (oxoanion)이다. 이온 투과 담체를 사용하지 않고 177Lu3 + 및 111In3 + 둘 다의 킬레이터-함유 리포솜에 성공적인 로딩을 얻었다. 그에 반해 99 mTc04 -의 로딩은 관찰되지 않았다 (표 1 참조).
킬레이터-함유 리포솜은 분자비 50:40:10으로 DSPC/CHOL/DSPE-PEG2000으로 구성되었다. 등장성 HEPES 버퍼 (10 mM HEPES, 150 mM NaCl, pH 7.4, 300 mOsm/L)를 외부 버퍼로서 사용하였고, 킬레이터를 함유하는 HEPES 버퍼 (10 mM DTPA 또는 DOTA, 10 mM HEPES, 150 mM NaCl, pH 7.4)를 내부 버퍼로 사용하였다. 방사성 177LuCl3, 11 lInCl3 또는 99mTc 퍼테크네테이트의 약 10 μL를 정제된 킬레이터-함유 리포솜 (500 μL)에 추가한 후 이어서 50-55 ℃에서 60분 동안 배양하였다. 177LuCl3 및 11 lInCl3을 Pelkin Elmer, Denmark에서 구입하였고, 99 mTc 퍼테크네테이트는 친절하게도 Koge Hospital, radiology department, Denmark에서 제공받았다.
표 1: 64Cu2 +, 111In3 +, 177Lu3 + 및 99 mTc04 -의 리포솜에 로딩 효율은 포집된 10 mM 킬레이터와 함께 DSPC/CHOL DSPE-PEG2000 (50:40:10)으로 구성된다. 이온 투과 담체를 사용하지 않고 로딩을 50-55 ℃에서 60분 동안 수행하였고 SEC에 의해 평가하였다.
Figure pct00006
*: 65 ℃에서 4시간 동안 로딩
표 1의 결과는 로딩 방법이 매우 바람직한 로딩 동역학을 갖는 리포솜 조성물의 양이온 투과성 (64Cu2+, 177Lu3+ 및 111In3+)으로 이어진다는 것을 나타낸다.
본 발명의 로딩 방법을 특성화하고 최적화하기 위해, 다른 실험을 수행하였고 다음 파라미터를 테스트하였다; (1) 지질 조성물의 효과, (2) 지질 농도 및 포집된 양의 효과, (3) 자유 지방산의 효과, (4) 1가 이온 (Na+, Cl+) 및 경쟁 2가 이온 (Ca2 +)의 효과, (5) 외부에서 킬레이트 성분의 효과, (6) 내부 리포솜 pH의 효과, (7) 단계 행동 (Phase behavior) 및 로딩 온도의 효과, (8) 로딩 동역학 및 온도의 영향, (9) 과-및 저-삼투압 및 (10) 이온 투과 담체가 있거나 없는 Cu2 + 로딩 동역학.
(1) 지질 조성물의 효과
이 연구에서 리포솜 조성물은 1,2-디스테라로일-SA7-글리세로-3-포스포콜린 (DSPC)과 같이 포스파티딜콜린 (PC)으로부터 및 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-[메톡시(폴리에틸렌글리콜)-2000] (DSPE-PEG2000)과 같이 폴리에틸렌글리콜 (PEG) 유도된 포스파티딜 에탄올아민으로부터 형성된다. DSPC 및 DSPE-PEG2000에 비해, 콜레스테롤은 막에 통합된다. 일반적으로, 콜레스테롤은 이중층 두께 및 유동성을 증가시키는 한편, 막 투과성을 감소시키고, 막에 어떤 전하도 추가하지 않는다. DSPE-PEG2000은 음전하를 띈다. 평가된 리포솜은 DSPC, 콜레스테롤 및 DSPE-PEG2000으로 구성되었다. 리포솜 조성물의 전체 막 전위 (제타 전위를 통해 평가됨)는 지질 조성물 DSPC/CHOL/DSPE-PEG2000 50:40:10을 갖는 리포솜에 대해 약간 음전하를 띈다; 300 mM 글루코스가 보충된 10 mM HEPES 버퍼, pH 7.4, 336 mOsm/L에서 측정될 때 약 -15 mV (표 2). 표 2의 다른 리포솜 조성물을 이온 투과 담체를 사용하지 않고 50-55 ℃에서 60분 동안 64Cu2 +와 함께 리포솜 조성물을 배양함으로써 64Cu2 +와 함께 로딩하였고 SEC에 의해 평가하였다.
표 2: 64Cu2 +의 캡슐화된 10 mM DOTA를 함유하는 다른 리포솜 조성물에 로딩 효율. 로딩을 이온 투과 담체를 사용하지 않고 및 50-55 ℃에서 60분 동안 배양함으로써 수행하였고 SEC에 의해 평가하였다.
Figure pct00007
*제타 전위를 300 mM 글루코스가 보충된 10 mM HEPES 버퍼, pH 7.4, 336 mOsm/L에서 측정하였다.
**제타 전위를 300 mM 글루코스 및 1 mM CaCl2가 보충된 10 mM HEPES 버퍼, pH 7.4, 339 mOsm/L에서 측정하였다.
음성 막 전위는 양이온성 금속 이온의 리포솜에 높은 로딩 효율에 영향을 미칠 수 있다 (표 1). 이것을 평가하기 위해, 로딩 실험을 DSPE-PEG2000를 제외하고 분자비 60:40으로 순수한 DSPC 또는 DSPC의 혼합물 및 콜레스테롤로만 구성된 중성 리포솜 조성물에서 수행하였다. 모든 리포솜 조성물은 내부에 높은 킬레이터 농도 (DOTA, 10 mM)를 함유했다. 킬레이터-함유 리포솜을 방사성 64CuCl2가 있는 건조된 바이알에 추가하였고 50-55 ℃에서 60분 동안 배양하였다. 모든 리포솜 조성물로 높은 64Cu2 + 로딩 효율을 관찰하였다 (표 2 참조).
(2) 지질 농도 및 포집된 양의 효과
약물을 리포솜에 포집하는 것 (로딩으로 알려짐)의 고전적 의미는 리포솜의 제조 중에 원하는 약물을 캡슐화하는 것 (수동적 포집)을 수반한다. 수동적 포집 기술은 능동적 로딩 방법과 비교하여 약물 또는 다른 실체물을 캡슐화하는데 덜 효율적이다 (여기에서 금속은 리포솜의 제조 후에 로딩된다). 수동적 포집에서, 약물 또는 방사성 핵종은 단순히 리포솜이 형성된 버퍼 용액에 포함된다. 수동적 포집이 리포솜의 포집된 물의 양에 강력하게 의존하기 때문에, 리포솜 크기는 수동적 로딩에 매우 중요하다.
여기에서, 64Cu2 +의 수동적 포집을 테스트하였다. 다음에 설명된 바와 같이 수동적 포집을 수행하였다: 지질막을 클로로포름에서 지질 (50 mM의 지질 농도로 55:40:5의 분자비의 DSPC, 콜레스테롤 및 DSPE-PEG2000)을 혼합함으로써 만들었고 질소의 부드러운 흐름 하에 건조하였다. 유기 용매 잔류물을 감소된 압력 하에 하룻밤 동안 제거하였다. 지질막을 수용액-10 mM의 농도로 pH 4.0 또는 pH 7.4로 조정된, 64CuCl2와 함께 킬레이트 시약, DOTA를 함유하는 HEPES 버퍼 (10 mM, 150 mM NaCl, pH 7.4)를 추가함으로써 분산시켰다. 용액을 65 ℃에서 60분 동안 수화시킴으로써 64Cu2 +와 함께 수동적으로 로딩하였다. 수동적으로 64Cu-로딩된 다중 박층 소포 (MLV)를 방사성 샘플에 적용 가능한 자동화된 디스펜서 (dispenser) 시스템을 사용하여 100 nm 폴리카르보네이트 필터를 통한 다수의 압출에 의해 64Cu-로딩된 큰 단일 박층 소포 (LUV)로 크기를 조정하였고 로딩 효율을 SEC에 의해 평가하였다. 50 mM의 지질 농도로 55:40:5의 분자비의 DSPC, 콜레스테롤 및 DSPE-PEG2000으로 구성된 100 nm 크기의 리포솜 용액에서 6.25%의 캡슐화 효율을 얻었다. 이것으로부터 다음 결론이 만들어졌다; 100 nm 리포솜에서 mM 지질당 -0.14% 64Cu2 +가 수동적으로 캡슐화되거나 막에 결합된다. 이 가정은 100 nm 크기의 단일 박층 리포솜의 포집된 양 및 캡슐화 정도의 추정값과 일치한다:
Figure pct00008
V포집 및 V총량은 포집되는 양 및 총량이며, Clip은 지질 농도이고, Na는 아보가드로 수이고, alip = 40 Å2는 사용된 지질 조성물의 대략 평균 단면적이고 R은 리포솜 반지름이다.
금속 양이온을 미리 형성된 리포솜에 로딩하는 방법이 지질 농도 및 포집된 양에 비례하는지 테스트하기 위해, 방사성 64Cu2+의 캡슐화된 어떤 킬레이트 시약도 없이 분자비 60:40의 DSPC 및 CHOL의 혼합물로 구성된 중성 막 조성물로 흡수를 관찰하였다. 킬레이터가 없는 리포솜을 다음과 같이 제조하였다: 지질 (DSPC 및 CHOL)을 클로로포름에 혼합하였고 질소의 부드러운 흐름 하에 지질막에 건조하였다. 유기 용매 잔류물을 감소된 압력 하에 하룻밤 동안 제거하였다. 지질막을 수용액-HEPES 버퍼 (10 mM, 150 mM NaCl, pH 7.4)을 추가함으로써 분산시켰고 삼투압을 300 mOsm/L인 것으로 측정하였다 용액을 65 ℃에서 60분 동안 수화시켰다. 다중 박층 소포 (MLV)를 소형 압출기를 사용하여 100 nm 폴리카르보네이트 필터를 통한 다수의 압출에 의해 큰 단일 박층 소포 (LUV)로 크기를 조정하였다. 이 실험에 사용된 버퍼는 모든 다른 실험에 사용된 같은 것이었다; 등장성 HEPES 버퍼 (10 mM HEPES, 150 mM NaCl, pH 7.4, 300 mOsm/L). 리포솜을 64Cu2 +와 함께 50-55 ℃에서 60분 동안 배양하였고 SEC에 의해 평가하였다. 리포솜 로딩된 방사능은 지질 농도가 낮을 때 (5 mM) 0.75%였고 지질 농도가 10배 더 높을 때 (50 mM) 5.3%였다 (도 3 참조).
표 3: 캡슐화된 킬레이터가 없는 리포솜 조성물에 관련된 퍼센트 방사능. 배양을 이온 투과 담체를 사용하지 않고 50-55 ℃에서 60분 동안 수행하였고 담체 SEC에 의해 평가하였다.
Figure pct00009
50-55 ℃의 온도를 사용하는 수동적 로딩의 로딩 효율이 본 발명의 로딩 방법을 사용함으로써 얻어진 로딩 효율보다 훨씬 더 낮은 것은 분명하다 (6.25%) (예를 들어, 표 1 및 2). 표 3의 결과는 또한 본 발명의 방법을 사용하여 캡슐화된 킬레이터 없이 64Cu2 +의 리포솜에 로딩이 포집된 양 및/또는 리포솜의 지질 농도에 비례하며, 포집된 킬레이터에 의해 도움을 받지 않고 Cu2 +의 미리 형성된 리포솜에 로딩/결합이 발생할 수 있다는 것을 나타낸다. 가설을 또한 3가 금속 이온, 111In3+으로 테스트하였으며, 64Cu2 +에 대한 것과 유사한 경향을 나타낸다 (표 3 참조). 금속 이온은 단순한 막관통 이온 평형으로 인해 미리 형성된 리포솜의 수성 단계에서 수동적으로 트래핑되거나 수송되거나 금속 이온은 리포솜의 막에서 지질과 연결된다. 금속 이온은 PC의 극성 헤드 그룹 (polar head group)의 포스페이트 모이어티에 결합하거나 이에 연결될 수 있다. 표 3의 결과는 지질 농도 및/또는 포집된 리포솜 양 및 Cu2+ 및 In3+의 리포솜에 이온 결합 또는 수송 사이의 상관관계를 명백히 입증한다.
(3) 자유 지방산의 효과
자유 지방산 (FFA)은 그것들의 양성자화된 형태로 인지질 이중층에 걸쳐 신속하게 확산 (또는 플립-플롭 (flip-flop))되는 것으로 알려져 있다. 하지만, 이중층의 소수성 코어를 통한 플립-플롭 또는 막에서 수성 단계로 탈착 (desorption)이 막을 통한 FFA 수송의 속도-제한 단계인지는 여전히 논의된다. 그럼에도 불구하고, FFA는 일부 리포솜 막에 대해 막의 투과성을 향상시키고 막을 통해 실체물의 통과를 가능하게 하는 탈안정화 효과를 갖는 것으로 잘 알려져 있다; 하지만, FFA가 완전히 포화된 지질막의 겔 상태를 안정화한다는 예외가 알려져 있다. FFA의 지질 이중층 용액, 예를 들어, 리포솜에 추가는 예를 들어, 팔미트산 및 Ca2 + 이온의 존재시 막투과성을 크게 향상시키는 것으로 나타났다 [Agafonov et al., BBA, 1609:153-160, 2003]. 본 발명에 대하여 발견된 이온 투과 담체를 사용하지 않고 리포솜의 수성 단계에 높은 방사성 핵종 로딩이 자유 금속 이온의 트랜스-이중층 확산 속도를 향상시키는 FFA의 존재에 의존하는지 평가하기 위해 (아실 인지질은 FFA의 작은 불순물을 함유한다), 64Cu2 + 로딩 효율을 비-FFA 함유 리포솜 막에 대해 평가하였다. 1,2-디-O-헥사데실-sn-글리세로-3-포스포콜린 (1,2-디-O-DPPC)를 리포솜 조성물에서 DSPC를 대체하는 FFA 자유 지질 성분으로서 사용하였다 (도 5 참조).
킬레이터-함유 비-FFA를 함유하는 리포솜을 소포-형성 성분으로서 분자비 60:40의 1,2-디-O-헥사데실-sn-글리세로-3-포스포콜린 (1,2-디-O-DPPC) 및 CHOL를 사용하여, 실시예 I: 킬레이트 시약을 함유하는 리포솜 조성물의 제조에 설명된 바와 같이 제조하였다: 킬레이터가 없는 비-FFA 함유 리포솜을 소포-형성 성분으로서 분자비 60:40의 1,2-디-O-헥사데실-sn-글리세로-3-포스포콜린 (1,2-디-O-DPPC) 및 CHOL을 사용하여 상기 섹션 (2)에 설명된 바와 같이 제조하였다.
킬레이터-함유 (10 mM DOTA) 비-FFA를 함유하는 리포솜 또는 킬레이터가 없는 비-FFA를 함유하는 리포솜을 방사성 64CuCl2가 있는 건조된 바이알에 추가하였고 50-55 ℃에서 60분 동안 배양하였고 SEC에 의해 평가하였다. 64Cu2 +의 킬레이터-함유 비-FFA를 함유하는 리포솜의 내부에 높은 로딩을 관찰하였으며 (표 4) 킬레이터가 없는 비-FFA를 함유하는 리포솜은 대조군의 역할을 한다.
표 4: 64Cu2 +의 캡슐화된 10 mM DOTA가 있거나 없이 분자비 60:40의 1,2-디-O-헥사데실-sn-글리세로-3-포스포콜린 (1,2-디-O-DPPC) 및 CHOL을 함유하는 리포솜 조성물에 로딩 효율. 로딩을 이온 투과 담체를 사용하지 않고 50-55 ℃에서 60분 동안 수행하였고 SEC에 의해 평가하였다.
Figure pct00010
1,2-디-O-DPPC: 1,2-디-0-헥사데실-sn-글리세로-3-포스포콜린
이것은 FFA가 자유 금속 이온의 리포솜에 투과성을 유발한다는 가능성을 제외한다. 캡슐화된 킬레이터 없이 비-FFA를 함유하는 리포솜은 대조군의 역할을 하고, 캡슐화된 킬레이터 없이 DSPC/CHOL (60:40)에 대한 것과 유사한 결과를 제공한다 (표 3). 결론은 막에서 FFA가 있거나 없는 리포솜은 본 발명에 사용될 수 있다는 것이다.
(4) 1가 이온 ( Na + , Cl + ) 및 경쟁 2가 이온 ( Ca 2 + )의 효과
Hauser 및 Dawson의 연구에서, Na+ 및 K+같은 1가 이온은 그것들이 Ca2+의 그것의 약 104배의 농도로 존재할 때 Ca2+를 대신할 때만 효과적이며 [Hauser and Dawson, J. Biochem., 1:61-69, 1967], 이것은 이중층 이론 [Lyklema, ISBN:0-12-460530-3, 5:3.208, 1995]의 예측에 동의한다는 것을 관찰하였다. 이중층은 이온을 함유하는 액체에 배치될 때 물체의 표면에 나타나는 구조이다. 물체는 나노입자 또는 리포솜과 같은 고체 입자일 수도 있다. 첫 번째 층에서, 표면 전하 (양성 또는 음성)는 물체에 직접 흡착된 이온을 포함한다. 두 번째 층은 쿨롱 힘 (Coulomb force)을 통해 표면 전하에 부착된 이온으로 구성되고, 이로 인해 전기적으로 첫 번째 층을 선별한다. 이 두 번째 층은 그것이 단단하게 고정되는 대신에 전기 흡인 및 열 운동의 영향 하에 액체에서 움직이는 자유 이온으로 구성되기 때문에, 나노입자와 느슨하게 결합된다.
상기 보고된 바와 같이, 5.3% 방사능은 등장성 HEPES 버퍼 (10 mM HEPES, 150 mM NaCl, pH 7.4, 300 mOsm/L)를 사용할 때, 리포솜에 연결되거나 로딩되었지만 (표 3), 1가 이온 (Na+ 및 Cl-)이 추가되지 않으면 (10 mM HEPES, pH 7.4, 5 mOsm/L), 11% 방사능이 DSPC/CHOL 막 (50 mM)과 결합되었다 (표 5 참조).
표 5: 캡슐화된 킬레이터 없이 64Cu2 +의 리포솜 조성물에 로딩 효율. 리포솜 조성물은 50 mM의 총 지질 농도로 분자비 60:40의 지질 성분 DSPC 및 CHOL로 구성되었다. 배양을 이온 투과 담체를 사용하지 않고 50-55 ℃에서 60분 동안 수행하였고 이후에 SEC에 의해 평가하였다.
Figure pct00011
이것은 스크리닝이 NaCl의 제거에 의해 환원되기 때문에 음전하를 띈 지질 막 및 Cu2 + 사이의 더 강한 상호 작용을 예측하는 이중층 이론과 일치한다. 이 점을 입증하기 위해, 우리는 10 mM의 Ca2 +를 추가하는 (10 mM HEPES, 150 mM NaCl, 10 mM CaCl2, pH 7.4, 315 mOsm/L 사용하여) 더 높은 이온 강도에서 DSPC/CHOL 막 (50 mM)으로 로딩 실험을 반복하였다. 방사능의 큰 감소 (3%)는 막에 결합하였고 (표 5 참조), Na+와 같은 1가 이온 및 Ca2 +와 같은 2가 이온이 막 표면에서 64Cu2 +를 효과적으로 대체하고, 이로 인해 64Cu2 + 로딩 속도를 감소시킨다. 이 관찰은 또한 Ca2 + 및 Zn2 +와 같은 2가 양이온의 인지질막과 상호작용에 대한 선행 조사와 일치한다 [Altenbach and Seelig, Biochemistry, 23:3913-3920, 1984; Binder et al., Bio-phys. Chem., 90:57-74, 2001; Huster et al., Biophys. J., 78:3011-3018, 2000]. 게다가 Binder 및 Zshornig에 의한 연구 [Binder and Zschornig, Chem. Phys. Lipids, 115:39-61, 2002]는 Ca2 +가 순수한 POPC 지질 이중층의 지질 헤드 그룹에 분명히 결합한다는 것을 나타냈다. 여기에 보고된 결과로부터, 금속 양이온, Cu2+의 막에 주요 결합은 1가 및 2가 이온, 예를 들어, Ca2 + 및 Na+에 의한 전하 선별 효과에 의해 감소된다는 것이 제안된다.
중요하게는, 표 5의 결과로부터 본 발명의, Cu2 + (2가 이온, 방사성 및 비-방사성, 뿐만 아니라 방사성 3가 양이온, 177Lu3 + 및 111In3 +)의 킬레이터-함유 리포솜에 로딩 방법은 Ca2 +, Na+ 및 Cl-의 존재시 또는 부재시 둘 다 수행될 수 있다는 것을 볼 수 있다.
(5) 외부에서 킬레이트 성분의 효과
자유 금속 이온 (방사성 핵종) 사이의 분포, 및 이들의 리포솜 외부의 다양한 성분 (예를 들어, 제거되지 않은 킬레이터, 버퍼분자 등)에 결합은 막관통 확산 및 전체 원격 로딩 동역학에 관하여 자유 금속 이온의 화학적 활성을 결정하는데 중요하다. 남은 킬레이터 또는 다른 금속 결합 성분이 리포솜 외부에 존재할 때, 로딩 동역학 및 효율은 크게 낮아진다. 이것은 킬레이터-함유 리포솜 용액이 배양 전에 10-6 M DOTA로 급증할 때 관찰되었다. 로딩 효율은 킬레이터 성분이 외부에 존재하지 않을 때 (>95%)와 비교하여 2% 낮아졌다. 높은 로딩 효율 (테스트된 모든 양이온 (64Cu2 +, 177Lu3 + 및 111In3 +)에 대하여)을 달성하기 위해 남은 킬레이터 (예를 들어, DOTA)를 제조 중에 킬레이터-함유 리포솜의 외부로부터 제거하는 것이 중요하다. 리포솜 외부에서 킬레이트 성분의 존재는 수성 단계의 양이온 (예를 들어, 64Cu2 +, 177Lu3 + 및 111In3 +) 농도를 낮추고 이로 인해 막 결합한 분획의 농도를 낮추며, 이것은 적절한 기간 (시간) 내에 매우 낮은 로딩 효율로 이어진다.
킬레이터 외에, 버퍼 성분은 금속 이온의 복합체를 형성할 수 있다. 버퍼 HEPES (4-(2-히드록시에틸)-1-피페라진에탄술폰산)가 Cu2 +와 상호작용하고 pH 6 이상에서 알칼린 가수분해를 겪는 복합체를 형성하며, Cu(OH)2 침전을 발생시키는 것으로 알려져 있다 [Sokolowska and Bal, J. Inorg. Biochem., 99: 1653-1660, 2005]. HEPES는 Cu2 +에 대하여 상대적으로 높은 친화도를 갖는 작은 불순물을 함유한다는 것이 제안되었다 [Mash and Chin, Anal. Chem., 75: 671-677, 2003]. 가정하면, HEPES는 본 발명의 로딩 방법 내에서 금속 이온의 담체 분자로서 작용할 수 있으며, 바람직하게 전캡슐화 킬레이터에 결합하는 경우 막을 통해 이온을 제거하고 수송한다.
64Cu2+의 킬레이터-함유 리포솜 (DSPC/CHOL/DSPE-PEG2000 분자비 50:40:10으로)에 유사한 높은 로딩 효율 (>95%)을 다른 버퍼, 예를 들어, 포스페이트 완충된 식염수 (PBS) 및 "비-조정" 버퍼 2-(N-모폴리노)에탄술폰산 (MES)을 사용할 때 얻었고, HEPES는 Cu(II)의 담체 분자로서 작용하지 않을 수도 있다 (표 6 참조). HEPES 버퍼가 PBS 또는 MES 버퍼에 의해 대체되는 경우, 리포솜의 제조를 실시예 I: 킬레이터-함유 리포솜의 제조에 설명된 바와 같이 수행하였다. 로딩을 50-55 ℃에서 60분 동안 수행하였고 로딩 효율을 SEC에 의해 평가하였다.
표 6: 64Cu2 +의 외부 버퍼 용액으로 캡슐화된 10 mM DOTA를 함유하는 리포솜 조성물 (DSPC/CHOL/DSPE-PEG2000 분자비 50:40:10으로)에 로딩 효율. 로딩을 이온 투과 담체를 사용하지 않고 50-55 ℃에서 60분 동안 수행하였고 SEC에 의해 평가하였다.
Figure pct00012
본 결과는 높은 로딩 효율은 다른 로딩 버퍼를 포함하는 배양 용액을 가지고 본 발명의 방법을 사용하여 얻어졌다는 것을 나타내지만, 건조된 64CuCl2의 용해도는 pH 7.4에서 22 ℃에서 PBS 및 멸균수와 비교하여 HEPES 버퍼에서 더 높고 더 신속한 것으로 발견되었으며, 이것은 제조 과정에 더 편리하다. 더 높은 온도에서 HEPES, PBS 및 멸균수에서 건조된 64CuCl2의 용해도는 같았다.
(6) 내부 리포솜 pH 의 효과
리포솜 로딩 기술에서 중요한 전달은 막관통 이온 구배가 발생될 수 있고 수성 리포솜 루멘에서 이온화 가능한 약물을 능동적으로 로딩하고 캡슐화하기 위해 이용될 수 있다 [미국 특허 번호 5,736, 155; 5,077,056; 및 5,762,957]. 방법은 리포솜 내에 캡슐화되는 이온화 가능한 약물이 외부 버퍼에서 전하를 띄지 않고 수성 내부 내에서 전하를 띄는 리포솜 이중층에 걸쳐 pH 구배를 확립하는 단계를 수반한다. 이것은 약물이 중화 형태로 리포솜의 이중층 막을 통과하고 전하를 띈 형태로 전환으로 인해 리포솜의 수성 내부 내에 트래핑되는 것을 허용한다. 능동적으로 로딩된 리포솜으로부터 약물의 누출은 또한 양성자 구배의 손실을 따르는 것으로 발견되었다.
이온 투과 담체 2-히드록시퀴놀린 (2 HQ)을 사용하여 리포솜 내로 64Cu2 + 로딩에 대한 선행 연구에서 [Petersen et al., Biomaterials, 32:2334-2341, 2011], 각각 4.0 및 5.9의 내부 pH를 갖는 킬레이터-함유 리포솜에 대하여 >95% 및 70% 로딩 효율을 관찰하였다. pH 5.9에서 얻은 더 낮은 정도의 로딩을 2HQ에서 DOTA로 덜 선호하는 64Cu2 +의 교환에 의해 설명하였다. 또 다른 이온 투과 담체, 옥신을 또한 평가하였지만, 64Cu2 + 유지에 관하여 불안정한 리포솜을 제공하였다. 이 불안정성 (64Cu2+의 방출)은 이온 투과 담체의 막관통 pH 구배를 소멸시키는 능력에 의해 설명되었고, 리포솜 내부 pH가 증가하는 것을 유발하며, 이것은 옥신의 경우에, 여러 차례의 진폭에 의한 리간드 교환의 감소를 일으킨다. 따라서 이온 투과 담체는 리포솜 조성물로부터 포집된 금속 이온의 방출을 가능하게 한다.
내부 리포솜 pH의 로딩 효율 및 금속 이온의 유지에 대한 영향을 본 발명의 로딩 방법으로 테스트하였다. 킬레이트 시약 (CDOTA = 10 mM)을 실시예 I: 킬레이터-함유 리포솜의 제조에 설명된 바와 같이 pH 4.0 또는 pH 7.4로 조정된 리포솜 (DSPC/CHOL/DSPE-PEG2000 분자비 50:40:10으로) 내에 트래핑하였다. 외부 버퍼는 등장성 HEPES 버퍼 (10 mM HEPES, 150 mM NaCl, pH 7.4, 300 mOsm/L)였다. 64Cu2 +와 함께 배양을 50-55 ℃에서 60분 동안 수행하였고 이후에 SEC에 의해 평가하였다. 내부 리포솜 pH (4.0 및 7.4) 둘 다에 대하여 64Cu2 +의 높은 로딩 효율 (>95%)을 얻었다 (표 7 참조).
표 7: 64Cu2 +의 다른 내부 pH (pH 4.0 또는 7.4)로 캡슐화된 10 mM DOTA를 함유하는 리포솜 조성물 (DSPC/CHOL/DSPE-PEG2000 분자비 50:40:10으로)에 로딩 효율. 로딩을 이온 투과 담체를 사용하지 않고 50-55 ℃에서 60분 동안 수행하였고 이후에 SEC에 의해 평가하였다. 외부 버퍼는 등장성 HEPES 버퍼 (10 mM HEPES, 150 mM NaCl, pH 7.4, 300 mOsm/L)였다.
Figure pct00013
게다가, 64Cu2 + 로딩된 리포솜을 24시간 동안 37 ℃ 및 20 ℃에서 리포솜 용액을 배양함으로써 방사성 핵종 유지에 대하여 테스트하였다. 추가적으로 리포솜 용액의 사람 혈청에서 안정성을 37 ℃에서 24시간 동안 사람 혈청과 리포솜 용액을 혼합함으로써 (1:1) 테스트하였다. 포집된 방사성 핵종, 64Cu2 +의 방출은 리포솜 용액 중 어떤 것으로부터 관찰되지 않았다 (표 7 참조).
표 7에 제공된, 얻어진 결과로부터 로딩 효율 또는 방사성 핵종에 대한 어떤 영향도 없이 내부 pH는 쉽게 pH 7.4로 올라갈 수 있다는 것은 분명하다. 따라서 본 발명의 로딩 방법은 막에 걸친 어떤 pH 구배에도 의존적이지 않다. 리포솜의 내부 pH 7.4는 pH 4.0과 같이 낮은 pH에서 가능한 지질 가수분해로 인해 바람직하다. 그러므로 킬레이터-함유 리포솜의 유통 기한은 또한 pH 4.0와 비교하여 내부 pH 7.4를 사용할 때 크게 연장된다.
(7) 단계 행동 및 로딩 온도의 효과
리포솜 조제에 대한 통상적인 접근법은 콜레스테롤 또는 동등한 막 강성화제 (예를 들어, 다른 스테롤)의 실질적인 양 (예를 들어, 30-45 mol%)의 포함을 지시한다. 일반적으로, 콜레스테롤은 이중층 두께 및 유동성을 증가시키는 한편, 리포솜의 막 투과성을 감소시킨다. 예를 들어, 포스파티딜콜린 (PC) 함유 리포솜에서 콜레스테롤의 증가량을 포함하는 것이 삼투성 구배의 존재시 및 부재시 리포솜으로부터 칼세인 (형광 발광 마커 화합물)의 누출을 감소시킨다는 것이 보고되었다 [Allen, et al. Biochim, Biophys. Acta, 597:418-426, 1980]. 콜레스테롤의 지질 이중층에 추가의 또 다른 특징은 액체-결정 단계의 안정성 성질 및 유동체 단계의 이동성을 이어받는 액체-정렬 단계의 형성이다. DSPC 이중층이 ~35 mol% 이상의 콜레스테롤이 보충될 때, 주요 단계 전이는 완벽히 폐지되고, 막은 넓은 온도 범위를 통해 액체-정렬 단계에 존재하는 것으로 생각될 수 있다. 시차 주사 열량법 (DSC) 실험으로부터 50:40:10의 분자비의 DSPC, CHOL 및 DSPE-PEG2000으로 구성된 리포솜 막은 범위 45-60 ℃의 어떤 열 전이도 나타내지 않고 따라서 이 온도 범위 내에서 단일 (액체-정렬 유사) 단계를 나타낸다는 것이 관찰된다 (도 6). 도 3에 나타난 바와 같이, 이온 투과 담체를 사용하지 않는 64Cu2 +의 리포솜 조성물에 로딩 효율은 온도가 증가함에 따라 증가하였고 50-55 ℃에서 60분 동안 높은 로딩 효율 (96.7% ± 1.0%)에 도달하였다. 이온 투과 담체를 사용하지 않는 로딩에 대하여 여기에 제공된 효율은 온도가 증가함에 비례하지만, 리포솜 조성물에서 상 전이 온도 (phase transition temperature)가 발생하지 않기 때문에 (도 6), 증가된 로딩 효율은 상 전이 행동에 의해 유발되지 않는다.
(8) 로딩 동역학 및 온도의 영향
킬레이터-함유 리포솜 (DSPC/CHOL/DSPE-PEG2000 분자비 50:40:10으로)에 64Cu2+ 로딩의 동역학을 시간의 함수로서 복합된 64Cu (예를 들어, 64Cu-DOTA) 및 총 64Cu 양 (복합체를 형성한 것 (64Cu-DOTA) 및 자유 64Cu2 +의 합계) 사이의 비율로 방사능 박층 크로마토그래피 (방사능-TLC)에 의해 검사하였다. 로딩 실험을 반응 바이알에서 30 ℃, 40 ℃ 및 50 ℃에서 수행하였고 2 μL 샘플을 다른 시점에서 TLC 플레이트 상에 스포팅하였다. 따라서 64Cu2 +가 리포솜에 로딩될 때, 금속 이온은 바람직하게 DOTA에 결합되고 64Cu-DOTA 복합체가 형성된다. 64Cu-DOTA 복합체를 자유 64CuCl2로부터 분리하는 경우 TLC 플레이트를 유기 용출액 (10% 암모늄 아세테이트:메탄올 (50:50))에서 수행하였다. 64Cu-DOTA의 유지 인자 (Rf)는 약 0.3인 한편 이온성 64Cu2 +는 기원에 유지되었다 (Rf = 0). 리포솜 샘플이 TLC 플레이트에 스포팅될 때, 리포솜은 즉시 고갈되고 내부 (64Cu-DOTA)는 TLC 플레이트 상에서 실행한다. 내부 64Cu-DOTA 복합체 및 총 64Cu 량 (복합체를 형성한 것 (64Cu-DOTA) 및 자유 64Cu2 +의 합계) 사이의 비율을 로딩 효율로서 계산하였다 (방정식 1에서 한정됨). 대조군으로서, 자유 64Cu2 +를 TLC 플레이트 상에 스포팅한 후 이어서 64Cu2 + 위에 비-방사성 킬레이터-함유 리포솜을 스포팅하였다. 이 대조군을 TLC 플레이트 상에서 발생하는 64Cu2+ 및 DOLTA 복합화의 잘못된 추정을 제거하기 위해 수행하였다. 64Cu-DOTA 피크는 TLC 플레이트 상에 존재하기 때문에, 복합화는 TLC 플레이트 상에서 발생하지 않는다.
금속 이온의 리포솜에 로딩은 다음을 포함하는 여러 단계로 나누어질 수 있다: (i) 이온의 지질 막의 결합/배위/흡착하는 단계, (ii) 트랜스-이중층 이온 확산 단계 및 (iii) 이온의 킬레이터에 결합하는 단계. 현재의 로딩 과정에서 지질 및 킬레이터는 64Cu2 +와 비교하여 과량이고 따라서 동역학은 64Cu2 + 농도에만 의존한다. Cu2 +의 막에 배위/결합하는 속도는 신속하고 (제한된 확산과 같이) Cu2 +의 DOTA에 결합은 막관통 이온 확산을 가장 바람직한 속도 제한 단계로 만드는 초의 기간에서 발생한다 (방사능-TLC에 의해 확인됨). 일반적으로, 막관통 확산의 속도는 수송된 실체물의 농도 구배 (픽의 제 1 법칙에 따라), 막 상 상태 (겔, 유동체 또는 액체-정렬) 및 수송된 실체물의 물리화학적 (친수성 대 소수성) 성질에 의존할 것이다. 이들 논의는 하기 제공된 1차 방정식 (방정식 6)을 입증한다. 로딩 동역학 (도 7-8에 나타난 예)은 다음 방정식을 특징으로 할 수 있으며
Figure pct00014
ACu, ACu _ 킬레이터 및 ACu (이온 투과 담체 )는 64Cu2 +, 64Cu-DOTA 및 64Cu(2HQ)2 종의 TLC 활성을 나타낸다. 피팅 파라미터 a는 플래토 수준 (로딩이 1차 동역학에 따라 진행되면 a ~ 100%)을 설명하고, b는 t에서 오프셋 및 불확실성을 설명하고 (t에서 오프셋 및 불확실성이 작을 때 b = 1) c는 로딩 속도를 설명한다. 방정식 7의 맞춤에 의해, 각각의 로딩 프로파일은 다음을 특징으로 할 수 있다:
(i) 초기 속도:
Figure pct00015
(ii) 95% 로딩에 도달하기 위해 필요한 시간:
Figure pct00016
및 (iii) 60분에 도달되는 로딩의 정도 (%로드1 h). 마지막은 SEC에 기초한 방법을 사용하여 달성된 로딩 정도와 직접적으로 비교 가능하다 (도 3 및 표 1, 2, 6 및 7에 제공됨).
1차 속도 상수 (c)는 로딩이 실행되는 온도 (도 7-8 참조) 및 삼투압 (다음 섹션 참조)과 같은 다른 파라미터에 의존한다. 초기 속도 (vini), t(95%) 및 %로드1 h는 로딩 조건의 세트에 대하여 표 8에 제공된다.
표 8: 이소-삼투성 및 과-삼투성 조건에 대해 이온 투과 담체 없이, 및 이온 투과 담체 (2 HQ)를 가지고 30 ℃, 40 ℃ 및 50 ℃에서 수행된 로딩에 대한 동역학 파라미터. 동역학은 초기 속도, vini, 95% 로딩에 도달하기 위해 필요한 시간, t(95%) 및 60분에 도달되는 로딩 효율, %로드1 h를 특징으로 한다. 모든 파라미터를 도 7-8에 나타난 방사능-TLC 측정값으로부터 유도하였다.
Figure pct00017
* 불가능한 추정
50 ℃에서 이소-삼투성 조건에서 (도 8) 64Cu2 +의 리포솜에 로딩 효율은 신속한 초기 속도를 나타내며, 점점 감소하고 시간의 함수로서 포화한다. 온도의 저하에 따라 초기 속도는 크게 감소되고 (표 8) 95% 로딩에 필요한 시간은 30분부터 몇 시간으로 증가된다 (이소-삼투성 로딩에서). 유사한 온도 효과는 과-삼투성 조건에서 로딩에 대하여 (섹션 9에서 논의됨) 및 이소 투과 담체 지원 로딩에 대하여 (섹션 10에서 논의됨) 관찰된다.
(9) 과-및 저-삼투압
과-삼투성 조건이 금속 이온의 로딩 속도 및 로딩 효율을 증가시키는지 조사하기 위해, 64Cu2 +의 과-삼투성 (Δ(mOsm/L) = +75), 저-삼투성 (Δ(mOsm/L) = -40) 뿐만 아니라 이소-삼투성 구배 (Δ(mOsm/L) = 0) (표 9 참조)를 갖는 킬레이터-함유 리포솜에 로딩 실험을 수행하였다. 리포솜의 제조 및 로딩 실험을 버퍼의 삼투압의 변화를 제외하고, 실시예 I에 설명된 바와 같이 수행하였다 (하기 표 9 참조).
표 9: 다른 리포솜 내 및 리포솜 외 삼투성을 사용하여 64Cu2 +의 DSPC/CHOL/DSPE-PEG2000 (50:40:10)로 구성된 리포솜에 로딩 효율. 로딩을 이온 투과 담체를 사용하지 않고 50-55 ℃에서 60분 동안 수행하였고 이후에 SEC에 의해 평가하였다.
Figure pct00018
*Δ(mOsm/L): 내부 및 외부 삼투압 리포솜 버퍼 용액의 차이. +는 더 높은 내부 삼투압이고 -는 더 낮은 내부 삼투압이다.
#1: 10 mM DOTA, 10 mM HEPES, 140 mM NaCl, pH 7.4, 295 mOsm/L
#2: 10 mM DOTA, 10 mM HEPES, 150 mM NaCl, pH 7.4, 375 mOsm/L
#3: 10 mM HEPES, 150 mM NaCl, pH 7.4, 295 mOsm/L
#4: 10 mM HEPES, 200 mM NaCl, pH 7.4, 415 mOsm/L
#5: 10 mM HEPES, 150 mM NaCl, pH 7.4, 75 mM 수크로스, 375 mOsm/L
리포솜 조성물은 내부에 높은 킬레이터 농도를 함유하는 (DOTA, 10 mM), 분자비 50:40:10의 DSPC/CHOL/DSPE-PEG2000로 구성되었다. 삼투압을 NaCl 농도를 조정함으로써 또는 수크로스를 추가함으로써 조절하였다 (표 9 참조). 50-55 ℃에서 수행된 (결과는 표 9에 나타난다) 로딩 효율 (60분 후 평가됨)은 실험의 기간 내 모든 경우에서 Cu2 +의 높은 로딩 효율 (>94%)을 얻는다는 것을 나타냈다. 하지만, 도 8에 나타난 결과는 다른 삼투압 사이에서 로딩 속도의 차이를 나타낸다.
게다가 64Cu2 + 로딩 동역학을 킬레이터-함유 리포솜 (DSPC/CHOL/DSPE-PEG2000 분자비 50:40:10으로)을 가지고 방사능-TLC를 사용하여 (도 7-8) 3개의 다른 온도 (30 ℃, 40 ℃ 및 50 ℃)에서 및 2개의 삼투성 조건 (이소-및 과-삼투성)에서시간의 함수로서 평가하였다. 이들 데이터 (도 7-8)은 이소-및 과-삼투성 조건 둘 다에 대하여 증가된 온도에 따라 증가된 로딩 속도 (표 8에서 초기 속도 (vini)) 및 로딩 효율 (표 8에서 %로드1 h)을 확인한다. 속도 및 효율을 이소-삼투성 조건과 비교하여 로딩을 과-삼투성 조건에서 수행할 때 추가로 논의하였다. 증가된 삼투압에서 로딩 속도 및 로딩 효율의 가장 큰 변화를 30 ℃ 및 40 ℃에서 관찰되는 반면, 작은 변화가 50 ℃에서 발견되었다.
이들 결과는 로딩 속도 및 효율이 온도 및 삼투압과 같은 파라미터를 맞춤으로써 크게 조절될 수 있다는 것을 입증한다. 이들 파라미터는 로딩 방법의 유효성에 위해 중요하다.
(10) 이온 투과 담체가 있거나 없는 Cu 2 + 로딩 동역학
도 3에 나타난 바와 같이, 64Cu2 +의 리포솜 조성물에 로딩 효율 (SEC에 의해 평가된 %로드1 h)은 이온 투과 담체 2HQ를 사용할 때 온도의 함수로서 약하게 증가하였으며, 50-55 ℃에서 60분 동안 최대 로딩 효율 (92.4% ± 1.4%)을 갖는다. 반대로, 이온 투과 담체를 사용하지 않는 64Cu2 +의 리포솜 조성물에 로딩 효율은 이온 투과 담체가 있는 방법과 비교하여 50-55 ℃에서 60분 동안 더 높은 로딩 효율 (96.7% ± 1.0%)에 도달하는 증가된 온도에 따라 더 큰 증가를 나타냈다. 이들 결과는 이온 투과 담체가 없는 로딩과 비교하여 64Cu2 +, 리포솜 및 이온 투과 담체를 배양할 때, 50 ℃ 이하의 온도에서 로딩 효율의 증가를 나타낸다. 도 3의 로딩 실험에 사용된 이온 투과 담체의 농도는 100 μM였다. 이온 투과 담체는 포유동물에 독성일 수도 있고, 그러므로 로딩된 리포솜은 정맥 내 주사 전에 정제될 필요가 있으며, 이것은 리포솜 생산에서 불리한 점이다.
이온 투과 담체 (C2HQ = 100 μM)를 사용하거나 사용하지 않는, 분자비 50:40:10의 DSPC/CHOL/DSPE-PEG2000로 구성된 리포솜의 수성 단계에 64Cu2 + 로딩 동역학을 비교하였다. 동역학의 결과에 대한 삼투압의 영향을 조사하기 위해, 이소-삼투성 조건을 가진 리포솜을 제조하였다. 용액을 다른 온도 (30 ℃, 40 ℃ 및 50 ℃)에서 배양하였고 시간의 함수로서 방사능-TLC에 의해 평가하였다 (상기 설명된 바와 같이). 도 3의 결과에 의해 입증된 방사능-TLC 결과 (표 8)은 이온 투과 담체의 사용이 (i) 로딩 속도 (초기 속도 (vini)) 및 로딩 효율 (%로드1 h) (50 ℃ 이하)을 증가시키고 (ii) 95%를 로딩하기 위해 필요한 시간을 낮춘다는 것을 나타낸다. 그러므로 이온 투과 담체 지원 로딩 방법은 로딩을 위한 활성화 에너지를 감소시키며, 비-지원된 로딩과 비교할 때 온도 변화의 함수로서 로딩 속도 및 효율의 더 작은 변화를 일으킨다.
이전 연구는 리포솜 조성물과 같은 인지질 이중층의 낮은 이온 투과성을 나타냈으며, 이것은 전하를 띈 이온 종에 대하여 매우 선호하지 않는 로딩 동역학으로 이어졌다 [Paula et al., Biophys. J., 74:319-327, 1998; Hauser et al., Nature, 239:342-344, 1972; Ceh et al., J. Phys. Chem. B, 102:3036-3043, 1998; Mills et al., Biochim. Biophys. Acta, 1716:77-96, 2005; Papahadjopoulos et al., Biochim. Biophys. Acta, 266:561-583, 1971; Puskin, J. Membrane Biol, 35:39-55, 1977]. 본 발명의 로딩 방법을 이용하는 실험의 결과는 64Cu2 +/63Cu2 +, 111In3+ 및 177Lu3 +와 같이 전하를 띈 이온이 킬레이터-함유 리포솜에 빠르고 효율적으로 로딩되는 경우, 반대를 나타낸다. 결과는 트랜스-이중층 확산 속도를 증가시키기 위한 이온 투과 담체 또는 다른 친유성 복합체의 사용이 단지 적당히 이전에 생각된 바와 같이, 2가 및 3가 양이온의 로딩을 개선하거나 증가시킨다는 것을 나타낸다.
요약
본 실시예는 2가 및 3가 이온 (예를 들어, 64Cu2 +, 111In3 + 및 177Lu3 +)이 미리 캡슐화된 킬레이터와 복합체의 형성으로 인해 리포솜 조성물의 내부에서 높은 농도로 캡슐화된 리포솜 막을 통해 수동적으로 수송된다는 것을 나타낸다.
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Claims (61)

  1. 이온 투과 담체의 사용을 수반하지 않고,
    a) 소포 형성 성분 및 상기 소포 형성 성분에 의해 둘러싸인 약제-포집 성분을 포함하는 나노입자 조성물을 제공하는 단계;
    b) 금속 실체물을 포함하는 용액 중의 나노입자 조성물의 배양에 의해 소포 형성 성분에 의해 형성된 막을 통해 양이온 금속 실체물의 전이를 가능하게 함으로써 나노입자 조성물의 내부에 금속 실체물을 포집하는 단계
    를 포함하는, 방사성 핵종과 같은 금속 실체물과 함께 로딩된 나노입자 조성물의 제조 방법.
  2. 제 1항에 있어서, 방사성 핵종의 로딩 효율 또는 포집은 10% 이상, 예를 들어, 40% 이상, 예를 들어, 50% 이상, 예를 들어, 60% 이상, 예를 들어, 70% 이상, 예를 들어, 80% 이상, 예를 들어, 85% 이상, 예를 들어, 90% 이상, 또는 예를 들어, 95% 이상, 또는 예를 들어, 97% 이상, 또는 예를 들어, 99% 이상인 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 나노입자 조성물은 100 ℃보다 낮은 온도에서 배양되는 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항에 있어서, 나노입자 조성물은 10 ℃ 내지 80 ℃, 예를 들어, 22 ℃ 내지 80 ℃, 또는 예를 들어, 30 ℃ 내지 80 ℃의 온도에서 배양되는 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제 1항 내지 제 4항 중 어느 한 항에 있어서, 나노입자 조성물은 48시간보다 짧은 기간 동안 배양되는 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 제 1항 내지 제 5항 중 어느 한 항에 있어서, 나노입자 조성물은 1 내지 240분의 기간 동안 배양되는 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제 1항 내지 제 6항 중 어느 한 항에 있어서, 나노입자 조성물은 1 내지 120분의 기간 동안 배양되는 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 제 1항 내지 제 7항 중 어느 한 항에 있어서, 나노입자 조성물은 1 내지 60분의 기간 동안 배양되는 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 제 1항 내지 제 8항 중 어느 한 항에 있어서, 로딩 효율은 1 내지 240분의 배양시간을 사용할 때 10% 내지 100%의 범위인 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 제 1항 내지 제 9항 중 어느 한 항에 있어서, 로딩 효율은 1 내지 240분의 배양시간을 사용할 때 80% 내지 100%의 범위인 것을 특징으로 하는 방법.
  11. 제 1항 내지 제 10항 중 어느 한 항에 있어서, 로딩 효율은 1 내지 240분의 배양시간을 사용할 때 95% 내지 100%의 범위인 것을 특징으로 하는 방법.
  12. 제 1항 내지 제 11항 중 어느 한 항에 있어서, 나노입자의 로딩을 위한 배양 온도는 30 ℃ 내지 80 ℃의 범위이고 로딩 효율은 1 내지 240분의 배양시간을 사용할 때 10% 내지 100%의 범위인 것을 특징으로 하는 방법.
  13. 제 1항 내지 제 12항 중 어느 한 항에 있어서, 나노입자의 로딩을 위한 배양 온도는 30 ℃ 내지 80 ℃의 범위이고 로딩 효율은 1 내지 60분의 배양시간을 사용할 때 10% 내지 100%의 범위인 것을 특징으로 하는 방법.
  14. 제 1항 내지 제 13항 중 어느 한 항에 있어서, 나노입자의 로딩을 위한 배양 온도는 30 ℃ 내지 80 ℃의 범위이고 로딩 효율은 1 내지 60분의 배양시간을 사용할 때 80% 내지 100%의 범위인 것을 특징으로 하는 방법.
  15. 제 1항 내지 제 14항 중 어느 한 항에 있어서, 나노입자의 로딩을 위한 배양 온도는 40 ℃ 내지 80 ℃의 범위이고 로딩 효율은 1 내지 60분의 배양시간을 사용할 때 95% 내지 100%의 범위인 것을 특징으로 하는 방법.
  16. 제 1항 내지 제 15항 중 어느 한 항에 있어서, 금속 실체물은 양이온인 것을 특징으로 하는 방법.
  17. 제 1항 내지 제 16항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 양이온 금속 실체물은 2가 또는 3가 양이온이고 및/또는 상기 금속 실체물은 2가 또는 3가 양이온인 것을 특징으로 하는 방법.
  18. 제 1항 내지 제 17항 중 어느 한 항에 있어서, 금속 실체물은 구리 (61Cu, 64Cu, 및 67Cu), 인듐 (111In), 테크네튬 (99 mTc), 레늄 (186Re, 188Re), 갈륨 (67Ga, 68Ga), 스트론튬 (89Sr), 사마륨 (153Sm), 이테르븀 (169Yb), 탈륨 (201Tl), 아스타틴 (211At), 루테튬 (177Lu), 악티늄 (225Ac), 이트륨 (90Y), 안티몬 (119Sb), 주석 (117Sn, 113Sn), 디스프로슘 (159Dy), 코발트 (56Co), 철 (59Fe), 루테늄 (97Ru, 103Ru), 팔라듐 (103Pd), 카드뮴 (115Cd), 텔루륨 (118Te, 123Te), 바륨 (131Ba, 140Ba), 가돌리늄 (149Gd, 151Gd), 테르븀 (160Tb), 금 (198Au, 199Au), 란타늄 (140La), 및 라듐 (223Ra, 224Ra)으로 구성된 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 방사성 핵종을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  19. 제 1항 내지 제 18항 중 어느 한 항에 있어서, 금속 실체물은 61Cu, 64Cu, 67Cu, 177Lu, 67Ga, 68Ga, 225Ac, 90Y, 186Re, 188Re, 119Sb 및 111In으로 구성된 그룹으로부터 선택된 방사성 핵종인 것을 특징으로 하는 방법.
  20. 제 1항 내지 제 19항 중 어느 한 항에 있어서, 금속 실체물은 61Cu, 64Cu, 67Cu, 111In으로 구성된 그룹으로부터 선택된 방사성 핵종인 것을 특징으로 하는 방법.
  21. 제 1항 내지 제 20항 중 어느 한 항에 있어서, 금속 실체물은 61Cu, 64Cu 및 67Cu로 구성된 그룹으로부터 선택된 방사성 핵종인 것을 특징으로 하는 방법.
  22. 제 1항 내지 제 21항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 금속 실체물은 Gd, Dy, Ti, Cr, Mn, Fe, Co, Ni의 그룹으로부터 선택되며 이들의 2가 또는 3가 이온을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  23. 제 1항 내지 제 22항 중 어느 한 항에 있어서, 금속 실체물은 64Cu 및 Gd(III), 64Cu 및 Dy(III), 64Cu 및 Ti(II), 64Cu 및 Cr(III), 64Cu 및 Mn(II), 64Cu 및 Fe(II), 64Cu 및 Fe(III), 64Cu 및 Co(II), 64Cu 및 Ni(II), 68Ga 및 Gd(III), 68Ga 및 Dy(III), 68Ga 및 Ti(II), 68Ga 및 Cr(III), 68Ga 및 Mn(II), 68Ga 및 Fe(II), 68Ga 및 Fe(III), 68Ga 및 Co(II), 68Ga 및 Ni(II), 111In 및 Gd(III), 111In 및 Dy(III), 111In 및 Ti(II), 111In 및 Cr(III), 111In 및 Mn(II), 111In 및 Fe(II), 111In 및 Fe(III), 111In 및 Co(II), 111In 및 Ni(II), 99 mTc 및 Gd(III), 99 mTc 및 Dy(III), 99mTc 및 Ti(II), 99 mTc 및 Cr(III), 99 mTc 및 Mn(II), 99 mTc 및 Fe(II), 99 mTc 및 Fe(III), 99 mTc 및 Co(II), 99 mTc 및 Ni(II), 177Lu 및 Gd(III), 177Lu 및 Dy(III), 177Lu 및 Ti(II), 177Lu 및 Cr(III), 177Lu 및 Mn(II), 177Lu 및 Fe(II), 177Lu 및 Fe(III), 177Lu 및 Co(II), 177Lu 및 Ni(II), 67Ga 및 Gd(III), 67Ga 및 Dy(III), 67Ga 및 Ti(II), 67Ga 및 Cr(III), 67Ga 및 Mn(II), 67Ga 및 Fe(II), 67Ga 및 Fe(III), 67Ga 및 Co(II), 67Ga 및 Ni(II), 201Tl 및 Gd(III), 201Tl 및 Dy(III), 201Tl 및 Ti(II), 201Tl 및 Cr(III), 201Tl 및 Mn(II), 201Tl 및 Fe(II), 201Tl 및 Fe(III), 201Tl 및 Co(II), 201Tl 및 Ni(II), 90Y 및 Gd(III), 90Y 및 Dy(III), 90Y 및 Ti(II), 90Y 및 Cr(III), 90Y 및 Mn(II), 90Y 및 Fe(II), 90Y 및 Fe(III), 90Y 및 Co(II) 및 90Y 및 Ni(II)의 그룹으로부터 선택된 조합이며, 금속 방사성 핵종의 상기 동위원소는 1가 양이온, 2가 양이온, 3가 양이온, 4가 양이온, 5가 양이온, 6가 양이온 및 7가 양이온을 포함하는, 금속에 대한 기존의 산화 상태 중 어떤 것으로도 나타날 수 있는 것을 특징으로 하는 방법.
  24. 제 1항 내지 제 23항 중 어느 한 항에 있어서, 금속 실체물은 제 18항에서 한정된 그룹으로부터 선택된 둘 이상의 방사성 핵종인 것을 특징으로 하는 방법.
  25. 제 1항 내지 제 24항 중 어느 한 항에 있어서, 금속 실체물은 64Cu 및 67Cu, 61Cu 및 67Cu, 64Cu 및 90Y, 64Cu 및 119Sb, 64Cu 및 225Ac, 64Cu 및 188Re, 64Cu 및 186Re, 64Cu 및 211At, 64Cu 및 67Ga, 61Cu 및 177Lu, 61Cu 및 90Y, 61Cu 및 119Sb, 61Cu 및 225Ac, 61Cu 및 188Re, 61Cu 및 186Re, 61Cu 및 211At, 61Cu 및 67Ga, 67Cu 및 177Lu, 67Cu 및 90Y, 67Cu 및 119Sb, 67Cu 및 225Ac, 67Cu 및 188Re, 67Cu 및 186Re, 67Cu 및 211At, 68Ga 및 177Lu, 68Ga 및 90Y, 68Ga 및 119Sb, 68Ga 및 225Ac, 68Ga 및 188Re, 68Ga 및 186Re, 68Ga 및 211At, 및 68Ga 및 67Cu로 구성된 그룹으로부터 선택된 둘 이상의 방사성 핵종인 것을 특징으로 하는 방법.
  26. 제 1항 내지 제 25항 중 어느 한 항에 있어서, 금속 실체물은 구리 (61Cu, 64Cu, 및 67Cu), 예를 들어, 61Cu 및 64Cu, 또는 61Cu 및 67Cu, 또는 64Cu 및 67Cu, 또는 61Cu, 64Cu 및 67Cu로 구성된 그룹으로부터 선택된 둘 이상의 방사성 핵종인 것을 특징으로 하는 방법.
  27. 제 1항 내지 제 26항 중 어느 한 항에 있어서, 배양 중에 나노입자의 외부 및 나노입자의 내부 사이에서 삼투압의 차이가 있는 것을 특징으로 하는 방법.
  28. 제 27항에 있어서, 나노입자의 외부 및 나노입자의 내부 사이에서 삼투압의 차이는 5-800 mOsm/L인 것을 특징으로 하는 방법.
  29. 제 27항 또는 제 28항에 있어서, 나노입자의 외부 및 나노입자의 내부 사이에서 삼투압의 차이는 5-100 mOsm/L인 것을 특징으로 하는 방법.
  30. 제 1항 내지 제 29항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 소포 형성 성분은 지질, 세라미드, 스핑고지질, 인지질, PEG화된 인지질로 구성된 그룹으로부터 선택된 화합물 중 하나 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  31. 제 1항 내지 제 30항 중 어느 한 항에 있어서, 소포 형성 성분은 HSPC, DSPC, DPPC, POPC, CHOL, DSPE-PEG-2000 및 DSPE-PEG-2000-TATE의 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 양친매성 화합물을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  32. 제 1항 내지 제 31항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 약제-포집 성분은 킬레이터, 환원제 및 상기 방사성 핵종으로 저 용해도 염을 형성하는 약제로 구성된 그룹으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  33. 제 1항 내지 제 32항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 약제-포집 성분은 1,4,7,10-테트라아자시클로도데칸 ([12]아네N4); 1,4,7,10-테트라아자시클로트리데칸 ([13]아네N4); 1,4,8,11-테트라아자시클로테트라데칸 ([14]아네N4); 1,4,8,12-테트라아자시클로펜타데칸 ([15]아네N4); 1,5,9,13-테트라아자시클로헥사데칸 ([16]아네N4); 에틸렌-디아민-테트라아세트-산 (EDTA); 및 디에틸렌-트리아민-펜타-아세트산 (DTPA)으로 구성된 그룹으로부터 선택된 킬레이터인 것을 특징으로 하는 방법.
  34. 제 1항 내지 제 33항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 약제-포집 성분은 1,4-에타노-1,4,8,11-테트라아자시클로테트라데칸 (et-시클람); 1,4,7,11-테트라아자시클로테트라데칸 (이소-시클람); 1,4,7,10-테트라아자시클로도데칸-1,4,7,10-테트라아세트산 (DOTA); 2-(1,4,7,10-테트라아자시클로도데칸-1-일)아세테이트 (D01A); 2,2'-(1,4,7,10-테트라아자시클로도데칸-1,7-디일) 디아세트산 (D02A); 2,2',2"-(1,4,7,10-테트라아자시클로도데칸-1,4,7-트리일) 트리아세트산 (D03A); 1,4,7,10-테트라아자시클로도데칸-1,4,7,10-테트라(메탄포스폰산) (DOTP); 1,4,7,10-테트라아자시클로도데칸-1,7-디(메탄포스폰산) (D02P); 1,4,7,10-테트라아자시클로도데칸-1,4,7-트리(메탄포스폰산) (D03P); 1,4,8,11-15 테트라아자시클로테트라데칸-1,4,8,11-테트라아세트산 (TETA); 2-(1,4,8,11-테트라아자시클로테트라데칸-1-일) 아세트산 (TE1A); 2,2'-(1,4,8,11-테트라아자시클로테트라데칸-1,8-디일) 디아세트산 (TE2A); 에틸렌-디아민-테트라아세트-산 (EDTA), 및 디에틸렌-트리아민-펜타-아세트산 (DTPA)으로 구성된 그룹으로부터 선택된 킬레이터인 것을 특징으로 하는 방법.
  35. 제 1항 내지 제 34항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 약제-포집 성분은 1,4,7,10-테트라아자시클로도데칸-1,4,7,10-테트라아세트산 (DOTA), 1,4,8,11-15 테트라아자시클로테트라데칸-1,4,8,11-테트라아세트산 (TETA), 1,4,7,10-테트라아자시클로도데칸-1,4,7,10-테트라(메탄포스폰산) (DOTP), 시클람 및 시클렌으로 구성된 그룹으로부터 선택된 킬레이터인 것을 특징으로 하는 방법.
  36. 제 1항 내지 제 35항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 약제-포집 성분은 아스코르브산, 글루코스, 프럭토스, 글리세르알데히드, 락토스, 아라비노스, 말토스 및 아세톨로 구성된 그룹으로부터 선택된 환원제인 것을 특징으로 하는 방법.
  37. 제 1항 내지 제 36항 중 어느 한 항에 있어서, 나노입자의 내부 pH는 4 내지 8.5, 예를 들어, 4.0 내지 4.5, 또는 예를 들어, 4.5 내지 5.0, 또는 예를 들어, 5.0 내지 5.5, 또는 예를 들어, 5.5 내지 6.0, 또는 예를 들어, 6.0 내지 6.5, 또는 예를 들어, 6.5 내지 7.0, 또는 예를 들어, 7.0 내지 7.5, 또는 예를 들어,7.5 내지 8.0, 또는 예를 들어, 8 내지 8.5의 범위인 것을 특징으로 하는 방법.
  38. 제 1항 내지 제 37항 중 어느 한 항에 있어서, 방사성 표지된 나노입자의 안정성은 방사능의 20% 미만 누출, 예를 들어, 15% 미만 누출, 예를 들어, 12% 미만 누출, 예를 들어, 10% 미만 누출, 예를 들어, 8 % 미만 누출, 예를 들어, 6 % 미만 누출, 예를 들어, 4% 미만 누출, 예를 들어, 3% 미만 누출, 예를 들어, 2 % 미만 누출, 예를 들어, 1 % 미만 누출이 관찰되는 것을 특징으로 하는 방법.
  39. a. i) 소포 형성 성분, 및 ii) 소포 형성 성분에 의해 둘러싸인 약제-포집 성분을 포함하는 나노입자 조성물; 및
    b. 나노입자에 로딩용 금속 실체물을 함유하는 조성물
    을 포함하는, 이온 투과 담체를 사용하지 않는 나노입자의 로딩용 성분 키트.
  40. 제 39항에 있어서, 금속 실체물은 제 16항 내지 제 26항에서 한정된 하나 이상의 방사성 핵종을 포함하는 것을 특징으로 하는 성분 키트.
  41. 제 39항 또는 제 40항에 있어서, 금속 실체물은 구리 (61Cu, 64Cu, 및 67Cu)로부터 선택된 하나 이상의 방사성 핵종 동위원소인 것을 특징으로 하는 성분 키트.
  42. 제 1항 내지 제 38항에서 한정된 방법의 사용에 의해 제조된 나노입자 조성물.
  43. 제 42항에 있어서,
    i. 소포 형성 성분,
    ii. 상기 소포 형성 성분에 의해 둘러싸인 약제-포집 성분,
    iii. 나노입자 조성물의 내측면에 포집된 금속 실체물,
    을 포함하는 금속 실체물로 로딩되고, 어떤 미량의 이온 투과 담체도 없는 것을 특징으로 하는 나노입자 조성물.
  44. 제 42항 또는 제 43항에 있어서, 금속 실체물은 제 16항 내지 제 26항에 한정된 하나 이상의 금속 실체물을 포함하는 것을 특징으로 하는 나노입자 조성물.
  45. 제 42항 내지 제 44항 중 어느 한 항에 있어서, PEG로 유도된 양친매성 화합물을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 나노입자 조성물.
  46. 제 42항 내지 제 45항 중 어느 한 항에 있어서, 소포-형성 성분은 하나 이상의 양친매성 화합물을 포함하는 것을 특징으로 하는 나노입자 조성물.
  47. 제 42항 내지 제 46항 중 어느 한 항에 있어서, 소포 형성 성분은 HSPC, DSPC, POPC, DPPC, CHOL, DSPE-PEG-2000 및 DSPE-PEG-2000-TATE의 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 양친매성 화합물을 포함하는 것을 특징으로 하는 나노입자 조성물.
  48. 제 42항 내지 제 47항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 약제-포집 성분은 킬레이터인 것을 특징으로 하는 나노입자 조성물.
  49. 제 42항 내지 제 48항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 약제-포집 성분은 1,4,7,10-테트라아자시클로도데칸-1,4,7,10-테트라아세트산 (DOTA), 1,4,8,11-15 테트라아자시클로테트라데칸-1,4,8,11-테트라아세트산 (TETA), 1,4,7,10-테트라아자시클로도데칸-1,4,7,10-테트라(메탄포스폰산) (DOTP), 시클람 및 시클렌의 그룹으로부터 선택된 킬레이터인 것을 특징으로 하는 나노입자 조성물.
  50. 제 42항 내지 제 49항 중 어느 한 항에 있어서, 금속 실체물은 61Cu, 64Cu, 67Cu, 177Lu, 67Ga, 68Ga, 225Ac, 90Y, 186Re, 188Re, 119Sb로 구성된 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 방사성 핵종을 포함하는 것을 특징으로 하는 나노입자 조성물.
  51. 제 42항 내지 제 50항 중 어느 한 항에 있어서, 금속 실체물은 64Cu 및 67Cu, 61Cu 및 67Cu, 64Cu 및 90Y, 64Cu 및 119Sb, 64Cu 및 225Ac, 64Cu 및 188Re, 64Cu 및 186Re, 64Cu 및 211At, 64Cu 및 67Ga, 61Cu 및 177Lu, 61Cu 및 90Y, 61Cu 및 119Sb, 61Cu 및 225Ac, 61Cu 및 188Re, 61Cu 및 186Re, 61Cu 및 211At, 61Cu 및 67Ga, 67Cu 및 177Lu, 67Cu 및 90Y, 67Cu 및 119Sb, 67Cu 및 225Ac, 67Cu 및 188Re, 67Cu 및 186Re, 67Cu 및 211At, 68Ga 및 177Lu, 68Ga 및 90Y, 68Ga 및 119Sb, 68Ga 및 225Ac, 68Ga 및 188Re, 68Ga 및 186Re, 68Ga 및 211At, 및 68Ga 및 67Cu로 구성된 그룹으로부터 선택된 2개의 방사성 핵종을 포함하는 것을 특징으로 하는 나노입자 조성물.
  52. 제 42항 내지 제 51항 중 어느 한 항에 있어서, 항체, 어피바디, 및 펩티드 성분으로 구성된 그룹으로부터 선택된 표적화 모이어티를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 나노입자 조성물.
  53. 제 42항 내지 제 52항 중 어느 한 항에 있어서, 약제-포집 성분에 접합된 핵 위치 서열 펩티드 (NLS 펩티드)와 같은 세포 내 표적화 성질을 갖는 화합물을 포함하는 것을 특징으로 하는 나노입자 조성물.
  54. 제 42항 내지 제 53항 중 어느 한 항에 있어서, 나노입자의 내부 pH는 4 내지 8.5, 예를 들어, 4.0 내지 4.5, 또는 예를 들어, 4.5 내지 5.0, 예를 들어, 5.0 내지 5.5, 또는 예를 들어, 5.5 내지 6.0, 또는 예를 들어, 6.0 내지 6.5, 또는 예를 들어, 6.5 내지 7.0, 또는 예를 들어, 7.0 내지 7.5, 또는 예를 들어, 7.5 내지 8.0, 또는 예를 들어, 8.0 내지 8.5의 범위인 것을 특징으로 하는 나노입자 조성물.
  55. 제 42항 내지 제 54항 중 어느 한 항에 있어서, 나노입자의 내부 pH는 6 내지 8, 예를 들어, 6.0 내지 6.5, 예를 들어, 6.5 내지 7.0, 예를 들어, 7.0 내지 7.5, 예를 들어, 7.5 내지 8의 범위인 것을 특징으로 하는 나노입자 조성물.
  56. 제 42항 내지 제 55항 중 어느 한 항에 있어서, 나노입자의 직경은 30 nm 내지 1000 nm의 범위인 것을 특징으로 하는 나노입자 조성물.
  57. 제 42항 내지 제 56항 중 어느 한 항에 있어서, 방사성 표지된 나노입자의 안정성은 20% 누출 미만, 예를 들어, 15% 미만 누출, 예를 들어, 12% 미만 누출, 예를 들어, 10% 미만 누출, 예를 들어, 8% 미만 누출, 예를 들어, 6% 미만 누출, 예를 들어, 4% 미만 누출, 예를 들어, 3% 미만 누출, 예를 들어, 2% 미만 누출, 예를 들어, 1% 미만 누출이 관찰되는 것을 특징으로 하는 나노입자 조성물.
  58. 제 42항 내지 제 57항 중 어느 한 항에 있어서, 필요한 대상체에서 치료하거나, 치료 효능을 관찰하거나 진단하는 방법에 사용되는 것을 특징으로 하는 나노입자 조성물.
  59. 제 42항 내지 제 58항 중 어느 한 항에 있어서, 이미징에 사용되는 것을 특징으로 하는 나노입자 조성물.
  60. 제 42항 내지 제 59항 중 어느 한 항에 있어서, 양전자 방사 단층 촬영 (PET) 스캐닝 및/또는 단일 광자 방출 단층 촬영 (SPECT) 스캐닝 및/또는 자기 공명 영상 (MRI)에 사용되는 것을 특징으로 하는 나노입자 조성물.
  61. 제 42항 내지 제 60항 중 어느 한 항에 있어서, 의약품으로서 사용되는 것을 특징으로 하는 나노입자 조성물.
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