KR20140085569A - 치료제 및 이의 용도 - Google Patents

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프레닥스 에이비
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Abstract

본 출원은 전립선암의 치료에 사용되는 칼리크레인 단백질(예, PSA 또는 hK2)에 특이성을 갖는 바인딩부를 포함하거나 이로 구성되는 제제, 및 칼리크레인 단백질에 대해 특이성을 갖는 바인딩부를 포함하거나 이로 구성되는 제제의 치료 유효량을 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, 환자에서 전립선암의 치료 방법을 제공한다.

Description

치료제 및 이의 용도{THERAPEUTIC AGENTS AND USES THEREOF}
본 발명은 일반적으로 치료제 및 치료 방법 분야, 특히 전립선암 분야에서 치료제 및 치료 방법에 관한 것이다.
본 명세서에서 분명하게 이전에 공개된 문헌의 리스트 또는 디스커션은 그 문헌이 당해 기술분야의 상태의 일부이거나 일반적인 공통 지식인 것을 인정하는 것으로 반드시 취해질 필요는 없다.
전립선암은 현재 남성에게 가장 흔한 형태의 암이다. 전립선은 정액에서 한 성분인 유체를 생성하는 남성의 호두 만한 크기의 분비선이다. 전립선은 조직의 외부층에 의해 에워싸인 둘 이상의 로브(lobes) 또는 섹션을 갖는다. 전립선은 직장의 앞에 그리고 소변 방관 바로 아래에 위치하며, 요도를 감싼다.
전립선암의 발생은 유럽의 북서부 및 미국에서 가장 많다. 종양의 성장은 일반적으로 장기간 중에 발생하는 프로세스이다. 전립선암은 보통 가벼운 형태의 암이다. 실제로, 전립선암으로 진단된 남성의 대다수는 생존하며, 단지 소수의 남성만이 초기 단계에서 전이되는 보다 공격적인 형태의 전립선암에 봉착한다. 이러한 형태의 전립선암은 암이 피막 외 조직으로 퍼지기 전에, 초기 단계에서 진단된 경우에만 치유 가능하다.
현재, 전립선암의 진단 및 모니터링은 환자의 혈액에서 전립선 특이 항원(PSA)의 농도를 측정함으로써 수행될 수 있다. PSA의 농도가 다른 시점에서 수행된 여러 연속적 측정시 현저히 높은 경우에, 그 평가는 전립선암의 개연성이 있음을 나타낸다. 이 시점에서, 전립선암을 확인하기 위해 조직 검사가 수행될 수 있다.
PAS(칼리크레인 III으로도 알려짐)는 전립선의 분비 세포에서 생성되는 237 아미노산의 단일 사슬로 구성된 단백질이다. 이러한 분비 세포는 전체 전립선 글랜드에서 발견될 수 있다. PSA는 잘 확립되어 있으며, 전립선암에 대해 완전히 연구된 마커이다. 건강한 세포와 비교하여, PSA의 생성은 악성 세포에서 보다 낮으며, 과형성 세포(hyperplastic cells)에서 보다 높다. 따라서, PSA의 농도는 실제로 전립선에 걸린 남성의 혈액에서 더 높은 것과 상충된다. 그러나, 악성 세포가 악화된 세포 구조를 가져, 이에 따라 PSA에 대해 보다 투과성이라는 설명이 있을 수 있다.
미래의 전립선암의 치료에 적합할 수 있는 또 다른 중요한 세린 프로테아제는 인간 선 칼리크레인 2(hK2)이다. hK2를 암호화하는 유전자는 PSA를 암호화하는 유전자와 함께 염색체 19에 위치한다. hK2는 PSA처럼 전립선 조직에서 주로 발현한다. 전립선에서, PSA는 불활성 프로-폼(pro-form)으로 존재하며, hK2의 펩티다아제 작용을 통해 활성화된다. hK2에 대한 면역 조직화학 검사는, hK2가 분화 수준과 관련하여 발현됨을 보여준다. 이는 hK2가 전립선암을 겪게 되는 조직과 같이 저 분화 조직에서 높은 수율로 발현되며, 그리고 또 다른 일반적인 전립선 문제가 있는 양성 전립선 과형성(BPH)을 겪게 되는 조직과 같이 고 분화 조직에서 보다 낮은 수율로 발현함을 의미한다.
현재의 전립선암 치료는 수술(예, 근치적 전립선절제술), 방사능 요법(근접 치료 및 외부 방사선 치료 포함), 고밀도 초음파 집적술(HIFU), 화학 요법, 경구 화학치료 약물, 냉동 수술(종양 동결), 호르몬 요법(항안드로겐 요법과 같은), 거세 또는 상술한 것들의 조합이다.
그러나, 이러한 치료들의 대부분(수술 및 외부 방사선 치료)은 일차 종양 및 대 전이의 치료에만(또는 주로) 유용할 뿐이다. 화학 요법은 대부분의 이러한 환자들을 제외하고 산재성 암에 사용되며, 이는 일시적인 효과이며 그리고/또는 생존을 지연시킨다. 따라서, 산재성 악성 질병, 특히 미소 전이의 경우에 상당한 개선을 달성하기 위해 이외의 또는 보완적인 치료 양식이 필요하다.
항체 및 프래그먼트와 같은 표적 분자를 이용한 면역 치료 또는 방사 면역 치료와 같은 치료가 산재성 질병의 치료 가능성을 제공할 수 있다.
따라서, 전립선암, 특히 산재성 질병, 전이 및 미소전이의 경우에 전립선암을 치료하는 새로운 치료제 및 치료 방법이 요구된다.
따라서, 본 발명은 당해 기술분야에서 상기한 바와 같은 하나 이상의 결함 및 불리한 점을 단독으로 또는 어느 조합으로 경감, 완화 또는 제거하며, 첨부된 청구범위에 따른 치료 방법을 제공함으로써 상기 언급된 문제들을 해결하고자 한다.
제1견지로, 본 발명은 전립선암의 치료에 사용되는 칼리크레인 단백질에 특이성을 갖는 바인딩부를 포함하거나 이로 구성되는 제제를 제공한다.
바꿔 말하면, 본 발명의 제1견지는 전립선암의 치료를 위한 약제의 제조에 사용되는, 칼리크레인 단백질에 특이성을 갖는 바인딩부를 포함하거나 이로 구성되는 제제의 용도에 관한 것이다.
따라서, 제1견지는 또한 환자에서 전립선암의 치료방법을 제공하며, 상기 방법은 칼리크레인 단백질에 특이성을 갖는 바인딩부를 포함하거나 구성되는 제제의 치료 유효량을 투여하는 단계를 포함한다.
도 1은 정상 마우스에서 정맥내 투여 후 다양한 조직에서 125I-표지된 PSA30 항체의 동역학을 나타낸다.
도 2는 전이성 전립선 종양 세포의 이종 이식으로 이식된 마우스에서 정맥내 투여 후 다양한 조직에서 125I-표지된 PSA30 항체의 동역학을 나타내며, 이는 전이성 전립선 종양 세포가 PSA30 항체를 강하게 차지하는 것을 보여준다.
도 3은 LNCaP-베이즈드 피하 종양을 가진 누드 마우스에서 주사 후 다양한 시간에서 정맥내 주사후 125I-PSA30의 종양-대-장기 비율을 나타낸다(n=34). 보다 높은 비율값은 확인된 조직에서 보다 종양에서 더 높은 흡수 특이성을 나타낸다.
도 4a 내지 4h는 디지털 오토래디오그래피의 결과를 나타낸다: 동위 원소에 의해 분리된 동일한 종양 섹션에서, 125I-PSA30의 48시간 주사 후 그리고 표지된-콜린의 1시간 주사 후, 125I-PSA30(도 4a) 및 18F-콜린(도 4b)의 개별 정규화된 흡수율. H&E를 통한 조직학적 분석(도 4c, 도 4e 내지 4f) 및 2E9 토탈 PSA 항체를 이용한 PSA 발현(도 4d, 도 4g-h)이 인접한 섹션을 이용하여 입증되었다. 높은 PSA30 mAb 흡수율과 높은 콜린 흡수율의 구역 사이에 직접적인 연관은 없었다. 비고: 이 마우스는 18F-콜린의 주사 후 자유롭게 움직이도록 하였다. 209x297mm(300x300DPI)
도 5는 정상 마우스에서 정맥내 투여 후 다양한 조직에서 125I-표지된 5A10 항체의 동역학을 나타낸다.
도 6은 정상 마우스에서 정맥내 투여 후 다양한 조직에서 125I-표지된 11B6 항체의 동역학을 나타낸다.
도 7은 전이성 전립선 종양 세포의 이종 이식으로 이식된 마우스에서 정맥내 투여 후 다양한 조직에서 125I-표지된 11B6 항체의 동역학을 나타낸다. 장기 흡수율은 시간 경과에 따라 %IA/g로 표현되었다.
도 8은 LnCAP 이종이식에서 111In-11B6의 생물학적 분배를 나타낸다. 16.4±1.92%IA/g(그람당 주입된 활성도 퍼센트)으로 48hpi 후에 최고조에 달한 방사능의 축적. 정상 장기(간, 비장, 신장, 뼈, 전립선, 고환)에서 흡수율은 보다 낮은 수준이었다. 다소 증가된 흡수율이 침샘에서 관찰되었으며, 이는 아마도 hK2 발현의 특정 정상 발현에 기인한 것으로 보인다.
도 9는 일부 치료 방사성 핵종의 예를 나타낸다.
도 10은 PAT의 원리를 나타낸다. 저-투여량 외부 방사선의 존재하에서, 고 Z 종양-표적 제제는 표적된 종양 세포에서 큰 국소 흡수된 투여량 증진을 생성한다.
도 11은 나노파티클이 어떻게 항체로서 종양 표적 제제에 대해 부착함으로써 멀티모달리티 화상 및 치료에 사용될 수 있는지 예를 나타낸다.
도 12는 종양/혈액 비를 나타낸다. 이 비율은 시간 경과에 따라 증가하며, 이는 LnCAP 종양에서 111In-11B6를 이용한 hK2의 활성적인 표적화를 나타낸다.
도 13은 48hpi에서 hK2-발현 이종이식 및 hK2-네거티브 이종이식(DU145)을 발현하는 hK2-발현시 111In-11B6의 비교 생물학적 분배를 나타낸다. 결과는 종양 축적시 두 이종이식 사이에 통계학적으로 현저한 차이(p<0.005)를 나타내었으나, 한편 대부분의 정상적인 장기에서 방사능 축적은 동일한 수준으로 유지되었음을 보여주었다. LnCAP는 DU145에 비해 3배 이상 더 높은 종양 흡수율을 가졌다. 이는 111In-11B6가 hK2-특이성임을 나타낸다.
도 14는 Leinonen, J. et al. Clin Chem 2002;48:2208-2216에 따른 PSA의 아미노산 서열 및 에피토프 구조를 나타낸다.
도 15는 예시적인 5A10-Fab의 스캐차드 플롯을 나타낸다.
도 16은 177Lu-11B6의 표지 동역학을 나타낸다.
도 17은 PBS 및 EDTA에서 177Lu-11B6의 시험관내 안정성을 나타낸다.
도 18은 LnCAP 이종이식에서 177Lu-11B6의 대표적인 SPECT 이미지를 나타낸다.
도 19는 LnCAP 이종이식에서 177Lu-11B6의 생물학적 분배를 나타낸다.
도 20은 LnCAP 이종이식에서 177Lu-11B6의 72h pi에서 상세한 생물학적 분배를 나타낸다.
도 21은 LnCAP 이종이식에서 177Lu-11B6의 생체내 생물 동역학을 나타낸다.
도 22는 177Lu-11B6을 이용한 치료 전(좌측 이미지) 및 후(우측 이미지)에 종양 크기의 대표적 사진을 나타낸다.
도 23은 LnCAP 이종이식에서 종양 크기에 대한 (a) 단일 투여 177Lu-11B6, (b) 이중 투여 177Lu-11B6 및 (c) 컨트롤 처리의 효과의 요약을 나타낸다.
도 24는 단일 투여 177Lu-11B6으로 처리된 하나의 LnCAP 이종이식 마우스에 대한 (a) 종양 성장 데이터 및 (b) SPECT 이미지를 나타낸다.
"바인딩부(binding moiety)"란, 칼리크레인 단백질에 특이적으로 바인딩할 수 있는 모든 타입의 화학적 엔티티(예, 올리고뉴클레오타이드, 폴리뉴클레오타이드, 폴리펩타이드, 펩티도미메틱스 및 소 화합물)를 포함한다. 유리하게, 바인딩부는 생리학적 조건하에서 칼리크레인 단백질에 선택적으로(즉, 우선적으로) 바인딩할 수 있다.
상술한 바와 같이, 본 발명의 제제는 칼리크레인 단백질에 특이성을 갖는 바인딩부를 구성하는 어느 적절한 화학부를 포함하거나 또는 이로 구성될 수 있다.
시험 화학 엔티티와 칼리크레인 단백질 사이의 상호작용을 검출하기에 적절한 방법은 당해 기술분야에 잘 알려져 있다. 예를 들어, 이온 스프레이 질량 분석법을 이용한 한외여과/HPLC 방법 또는 이외의 물리적 및 분석적 방법들이 사용될 수 있다. 또한, 형광 공명에너지 전달(FRET, Fluorescence Resonance Energy Transfer) 방법이 사용될 수 있으며, 여기서 두 개의 형광 표지된 엔티티의 바인딩이 서로 아주 근접할 경우에 형광 표지의 상호작용을 측정함으로써 측정될 수 있다.
예를 들어, DNA, RNA, 단백질 및 포스포리피드와 같은 마크로분자에 대한 칼리크레인 단백질의 바인딩을 검출하는 대안적인 방법은, 예를 들어, Plant et al., 1995, Analyt Biochem 226(2), 342-348에 기재된 표면 플라즈몬 공명 어세이를 포함한다. 이러한 방법들은 예를 들어, 방사성 또는 형광 표지로 표지되는 폴리펩타이드를 사용하게 할 수 있다.
칼리크레인 단백질에 바인딩할 수 있는 화학 엔티티를 확인하는 다른 방법은 칼리크레인 단백질이 화합물에 노출되는 곳 및 상기 칼리크레인에 대한 화합물의 어떠한 바인딩을 검출하고 그리고/또는 측정하는 것이다. 칼리크레인 단백질에 대한 화합물의 바인딩에 대한 바인딩 상수가 검출될 수 있다. 칼리크레인 단백질에 대한 화합물의 바인딩을 검출 및/또는 측정(정량화)하는 적절한 방법은 당해 기술분야의 숙련자에게 잘 알려져 있으며, 예를 들어 칩-베이즈드 방법과 같이 고 처리 작업이 가능한 방법을 이용하여 수행될 수 있다. VLSIPSTM이라 불리는 새로운 기술은 수십만 이상의 여러 가지 분자 프로브를 함유하는 극히 작은 칩의 생성이 가능하다. 이러한 생물학적 칩은 어레이에서 각 프로브 할당된 특정 위치에 배열된 프로브를 갖는다. 생물학적 칩은 각 위치가 예를 들어, 10미크론의 스케일을 갖도록 제조된다. 상기 칩은 표적 분자가 칩상의 어느 프로브와 상호작용하는지 검출하는데 사용될 수 있다. 선택된 시험 조건하에서 표적 분자에 대해 배열을 노출한 후에, 스캐닝 장치가 배열내의 각 위치를 조사하고, 표적 분자가 그 위치에서 프로브와 상호작용하는지 검출할 수 있다.
칼리크레인 단백질에 대한 바인딩 친화도를 갖는 화합물을 확인하는 또 다른 방법은 이스트 투-하이브리드 시스템이며, 여기서 본 발명의 폴리펩타이드가 칼리크레인 단백질을 바인딩하는 단백질을 "포획(capture)"하는데 사용될 수 있다. 이스트 투-하이브리드 시스템은 Fields & Song, Nature 340:245-246 (1989)에 기재되어 있다.
일 구현으로, 바인딩부는 폴리펩타이드를 포함하거나 이로 구성될 수 있다.
예를 들어, 바인딩부는 칼리크레인 단백질에 대해 바인딩 특이성을 갖는 항체 또는 이의 항원-바인딩 프래그먼트, 또는 상기 항체 또는 항원-바인딩 프래그먼트의 변이체, 융합체 또는 유도체, 또는 칼리크레인 단백질에 대해 바인딩 특이성을 보유하는 상기 변이체의 융합체 또는 이의 유도체를 포함하거나 이로 구성될 수 있다.
따라서, 본 발명의 제1견지의 일 구현으로, 바인딩부는 항체 또는 이의 항원-바인딩 프래그먼트일 수 있다.
"항체(antibody)"란, 실질적으로 온전한 항체 분자뿐만 아니라, 키메릭 항체, 인간화 항체, 인간 항체(여기서 자연 발생 인간 항체에 비해 적어도 하나의 아미노산이 돌연변이 됨), 단일 사슬 항체, 이중체, 이중특이 항체, 항체 중쇄, 항체 경쇄, 항체 중쇄 및/또는 항체 경쇄의 호모다이머 및 헤테로다이머, 및 항원 바인딩 프래그먼트 및 이의 유도체들을 포함한다.
"항원-바인딩 프래그먼트(antigen-binding fragment)"란, 칼리크레인 단백질에 바인딩할 수 있는 항체의 기능적 프래그먼트를 의미한다. 상기 언급된 다른 항체 유도체의 바인딩 친화도는 고정된 농도의 고정화 항체 프래그먼트 및 변화 농도의 Eu-PSA 트레이서를 사용하여 스캐차드 방법으로 검출될 수 있다. 변형적으로, 바인딩 친화도는 Biacore 인스트루먼트상에서 표면 플라즈몬 공명(SPR) 기술을 이용하여 검출될 수 있다.
특히, 상기 항원-바인딩 프래그먼트는 Fv 프래그먼트(예., 단일쇄 Fv 및 이황화-결합 Fv), Fab-류 프래그먼트(예, Fab 프래그먼트, Fab' 프래그먼트 및 F(ab)2 프래그먼트), 단일 가변 도메인(예., VH 및 VL 도메인) 및 도메인 항체(단일 및 이중 형태를 포함하는 dAbs[즉, dAb-링커-dAb])로 구성되는 그룹으로부터 선택된다.
전 항체보다 항체 프래그먼트를 사용하는 이점은 수배이다. 보다 작은 크기의 프래그먼트는 고형 조직의 보다 많은 침투 및/또는 보다 신속한 혈액 통과와 같은 향상된 약리적 특성을 이끌어, 보다 높은 치료 속도를 가능케 한다. 더욱이, Fab, Fv, ScFv 및 dAb 항체 프래그먼트와 같은 항원-바인딩 프래그먼트가 이. 콜라이(E. coli)와 같은 미생물들에서 그리고 이로부터 선택되어 발현될 수 있으며, 이에 따라 다량의 상기 프래그먼트의 용이한 생성이 가능하다.
예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜 또는 다른 적절한 폴리머(하기 참조)의 공유 결합에 의해 변형된 것과 같은, 변형된 형태의 항체 및 이의 항원-바인딩 프래그먼트가 또한 본 발명의 범위에 포함된다.
항체 및 항체 프래그먼트를 생성하는 방법은 당해 기술분야에 잘 알려져 있다. 예를 들어, 항체는 항체 분자의 생체내 생성의 유도, 면역글로블린 라이브러리의 스크리닝(Orlandi. et al, 1989. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86:3833-3837; Winter et al., 1991, Nature 349:293-299) 또는 배양물에서 세포주에 의한 모노클로날 항체 분자의 생성을 이용하는 여러 가지 방법들 중 어느 하나를 통해 생성될 수 있다. 이로는 이에 한정하는 것은 아니나, 하이브리도마 기술, 인간 B-세포 하이브리도마 기술, 및 엡스테인-바 바이러스(EBV)-하이브리도마 기술을 포함한다(Kohler et al., 1975. Nature 256:4950497; Kozbor et al., 1985. J. Immunol. Methods 81:31-42; Cote et al., 1983. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:2026-2030; Cole et al., 1984. Mol. Cell. Biol. 62:109-120).
선택된 항원에 대해 적절한 모노클로날 항체는 " Monoclonal Antibodies : A manual of techniques ", H Zola (CRC Press, 1988) and in "Monoclonal Hybridoma Antibodies: Techniques and Applications ", J G R Hurrell (CRC Press, 1982)에 기재된 것들과 같이 알려진 기술에 의해 제조될 수 있다.
마찬가지로, 항체 프래그먼트는 당해 기술분야에 잘 알려진 방법들을 이용하여 획득될 수 있다(예, Harlow & Lane, 1988, " Antibodies : A Laboratory Manual " Cold Spring Harbor Laboratory, New York). 예를 들어, 본 발명에 따른 항체 프래그먼트는 상기 항체의 단백질 가수분해에 의해 또는 상기 프래그먼트를 암호화하는 DNA의 이. 콜라이(E. coli) 또는 포유류 세포에서의 발현 시스템(예, 차이니즈 햄스터 난소 세포 배양 또는 다른 단백질 발현 시스템)에 의해 제조될 수 있다. 변형적으로, 항체 프래그먼트는 통상적인 방법에 의해 전 항체의 펩신 또는 파파인 다이제스션에 의해 획득될 수 있다.
인간 치료 또는 진단을 위해, 인간 또는 인간화 항체가 사용될 수 있음이 당해 기술분야의 통상의 기술자에 의해 인식될 것이다. 인간화된 형태의 비-인간(예, 뮤린) 항체는 비인간 항체로부터 유래된 최소 부분을 갖는 유전적으로 합성된 키메릭 항체 또는 항체 프래그먼트이다. 인간화된 항체는 인간 항체(리시피언트 항체)의 상보 결정 부위가 원하는 기능을 가진 마우스, 래트, 또는 토끼와 같은 비인간 종(도너 항체)의 상보 결정 부위의 잔기로 치환된 항체들을 포함한다. 일부 예로, 인간 항체의 Fv 프래임워크 잔기가 이에 상응하는 비-인간 잔기로 치환된다. 또한 인간화된 항체는 리시피언트 항체 또는 외래 상보 결정 부위 또는 프래임워크 서열내에서 모두 발견되지 않는 잔기를 포함할 수 있다. 일반적으로, 인간화된 항체는 실질적으로 모두 적어도 하나의, 그리고 전형적으로 두 개의 가변 도메인을 포함하며, 여기서 상보 결정 부위의 모두 또는 실질적으로 모두는 비인간 항체의 상보 결정 부위에 상응하며, 프래임워크 부위의 모두 또는 실질적으로 모두는 관련 인간 공통 서열의 프래임워크 부위에 상응한다. 또한, 인간화된 항체는 선택적으로 인간 항체로부터 전형적으로 유래되는, Fc 부위와 같은 항체 불변 부위의 적어도 일부를 포함한다(예 Jones et al., 1986. Nature 321:522-525; Riechmann et al., 1988, Nature 332:323-329; Presta, 1992, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 참조).
비-인간 항체를 인간화하는 방법은 당해 기술분야에 잘 알려져 있다. 일반적으로, 인간화된 항체는 비-인간인 공급원으로부터 도입된 하나 이상의 아미노산 잔기를 갖는다. 외래 잔기라고 종종 칭하여지는 이러한 비-인간 아미노산 잔기는 전형적으로 외래 가변 도메인으로부터 취해진다. 인간화는 인간 상보 결정 부위를 이에 상응하는 설치류 상보 결정 부위로 치환함으로써 개시된 바와 같이(예, Jones et al., 1986, Nature 321:522-525; Reichmann et al ., 1988. Nature 332:323-327; Verhoeyen et al., 1988, Science 239:1534-1536l; US 4,816,567) 본질적으로 수행될 수 있다. 따라서, 이러한 인간화된 항체는 본래의 인간 가변 도메인보다 적은 것이 비-인간 종의 이에 상응하는 서열로 치환된 키메릭 항체이다. 실제로, 인간화된 항체는 전형적으로 일부 상보 결정 부위 잔기 및 가능한 일부 프래임워크 잔기가 설치류 항체내 유사 사이트의 잔기로 치환된 인간 항체일 수 있다.
또한, 인간 항체는 파지 디스플래이 라이브러리를 포함하여 당해 기술분야에 알려진 다양한 기술을 이용하여 확인될 수 있다(예, Hoogenboom & Winter, 1991, J. Mol. Biol. 227:381; Marks et al., 1991, J. Mol. Biol. 222:581; Cole et al., 1985, In: Monoclonal antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, pp. 77; Boerner et al., 1991. J. Immunol. 147:86-95 참조).
적절한 항체가 획득되면, 이들은 예를 들어, ELISA에 의해 활성이 시험될 수 있다.
본 발명의 제1견지의 변형적인 구현으로, 바인딩부는 예를 들어, Skerra, Curr Opin Biotechnol. 2007 Aug;18(4):295-304에 기재된 바와 같은 비-면역글로블린 바인딩부를 포함하거나 이로 구성된다.
다른 변형적인 구현으로, 바인딩부는 앱타머를 포함하거나 이로 구성된다. 예를 들어, 제제는 펩타이드 앱타머 또는 핵산 앱타머를 포함하거나 이로 구성될 수 있다(Hoppe-Seyler & Butz, 2000, J Mol Med . 78 (8): 426-30; Bunka DH & Stockley PG, 2006, Nat Rev Microbiol . 4 (8): 588-96 and Drabovich et al., 2006, Anal Chem . 78 (9): 3171-8 참조).
다른 변형적인 구현으로, 바인딩부는 소 화학 엔티티를 포함하거나 이로 구성된다. 칼리크레인 바인딩 특성을 갖는 이러한 엔티티는 소 화합물의 상업적 라이브러리(예, ChemBridge Corporation, San Diego, USA로부터 구입가능함)를 스크리닝함으로써 확인될 수 있다.
따라서, 본 발명의 제1견지에 따른 제제에 존재하는 바인딩부는 칼리크레인 단백질에 대한 특이성으로 바인딩한다. 이러한 정황에서, 구 "특이성으로 바인딩"한다는 것은 바인딩부가 선택적으로 다른 칼리크레인 단백질을 포함하는 다른 단백질에 비해 우선적으로 칼레크레인 단백질을 표적하도록 선택적으로 바인딩하는 것을 의미한다. 통상의 기술자는 표적에 대한 바인딩 분자의 바인딩 특이성을 평가하는 여러 가지 방법들을 잘 알 것이다. 예를 들어, 바인딩 분자가 항체이거나 항체에 기초한 경우에, 이의 칼리크레인 단백질에 대해 특이적으로 바인딩하는 능력은 ELISA, 방사면역분석 등과 같은 면역분석에 의해 평가될 수 있다.
일 구현으로, 바인딩부는 면역분석시 및/또는 (본 명세서에 언급된 바와 같이 전립선 또는 다른 치료 사이트에서 발견되는 조건과 같은) 생리학적 조건에서 칼리크레인 단백질에 바인딩할 경우에 1x105 내지 3x1010 이상의 범위와 같이 1x105, 1x106, 1x107, 2x107, 1x108, 2x108, 1x109, 1x1010, 2x1010, 3x1010, 1x1011 이상의 바인딩 친화도로 칼리크레인 단백질에 대한 특이성으로 바인딩하는 것으로 언급될 수 있다.
본 발명의 제1견지에 사용되는 바인딩부는 인간 칼리크레인 단백질에 대해 특이성을 가질 수 있다. 인간 칼리크레인 단백질은 적어도 15 멤버로 구성되는 것으로 발견된 인간 조직 칼리크레인 유전자과에 속하는 세린 프로테아제이다(Hsieh ML, Cancer Res 1997; 57; 2651-6). 칼리크레인은 27-40kDa 범위의 분자량을 갖는 단일 폴리펩타이스 사슬을 가진 열-안정성 글리코단백질이다.
본 발명의 제1견지에 사용되는 바인딩부는 전립선-특이 항원(PSA; hk3, 인간 칼리크레인 3) 및 인간 선 칼리크레인(hK2)으로 구성되는 그룹으로부터 선택된 칼리크레인 단백질에 대해 특이성을 가질 수 있다.
일 구현으로, 바인딩부는 PSA에 대해 특이성을 갖는다. 용어 PSA는 프리 PSA, PSA의 전구체 형태, PSA의 내부 닉 형태(internally nicked forms), 저분자량 프리 PSA, 표준 중량 프리 PSA, 불활성 성숙 PSA, 트렁케이티드 형태의 PSA, PSA의 글리코실화 변이체, BPSA, 불활성 프로-PSA, 및 α1-안티키모트립신(ACT), α1-프로테아제 인히비터(API) 및 α2-마크로글로블린(AMG)에 바인딩된 PSA와 같은 모든 PSA의 복합체와 같은 모든 알려진 PSA 형태를 포함하는 것으로 의도된다. PSA의 예시적인 일차 아미노산은 도 14에 제공된다(SEQ ID NO: 16 참조).
암 세포로부터 분비된 PSA는 BPH 조직으로부터 분비된 PSA에 비해 더 활성적인 상태로 존재한다. 세포외 유체에서, PSA는 단백질 분해되어 활성이 손실되고 복합체를 형성하게 된다. 이에 따라, 또한 PSA에/와 바인딩되거나 복합된 ACT, API 및 AMG와 같은 화합물 또는 엔티티를 표지하는 것이 본 발명의 범위내에 포함된다.
일 바람직한 구현으로, 바인딩부는 PSA의 복합 아이소폼에 비해 PSA의 프리(즉, 비-복합) 아이소폼에 대해 더 큰 특이성을 갖는다. PSA의 프리 아이소폼에 대한 특이성을 갖는 바인딩부는 PSA의 프리 아이소폼에 노출된 에피토프에 대해 바인딩 특이성을 가질 수 있으나, 배좌(즉, 비-선형) 에피토프와 같은 PSA의 복합 아이소폼에 노출된다. 이러한 배좌 에피토프의 예는 PSA의 촉매 클레프트를 감싸는 칼리크레인-루프의 일부인 아미노산 잔기로부터 형성되며, His41, Asn96 및 Ser189의 활성 사이트 트리아드를 포함할 수 있다. PSA에 대한 다양한 적절한 에피토프의 추가적인 디스커션 및 설명에 대해 See Leinonen et al, Clinical Chemistry 48:12, 2208-2216 를 참조바라며, 이는 본 명세서에 참고문헌으로 편입된다.
본 발명의 제1견지에 사용되는 바인딩부가 PSA에 대해 특이성을 갖는 경우에, 바인딩부는 PSA30, 4D4, 5C3 및 5A10 및 이의 항원-바인딩 프래그먼트로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 항체와 함께, (PSA의 프리 아이소폼과 같이) PSA 또는 바인딩부에 의해 바인딩된 PSA의 반응 에피토프를 포함하는 펩타이드에 대한 바인딩에 경합할 수 있다. 이러한 항체들에 대하 추가 디스커션은 Pettersson et al, Clin. Chem, 41:10, 1480-1488 (1995); Nilsson et al, Brit. J. Cancer, 75:6, 789-797 (1997); Leinonen et al, Clinical Chemistry 48:12, 2208-2216 (2002); Vaissnen et al, Anal. Chem ., 78:7809-7815 (2006); Evans-Axelsson et al., Cancer Biother. Radiopharm. 27:4, 243-51, EP 1 320 756 B1; 및 US 2004/101914에 기재되어 있으며, 이들 문헌은 본 명세서에 참고문헌으로 편입된다.
예시적인 항-PSA 항체 5A10의 구성 요소 중쇄 및 경쇄의 아미노산 서열을 하기에 나타내었다(여기서 CDR 서열은 밑줄친 부분임).
5A10 중쇄
EVQLVESGPGILQPSQTLSLTCSFSGFSLSTTGMGVSWIRQPSGKGLEWLAHLYWDEDKRYNPSLKSRLTI
SEDSSRNQVFLKITSVGPADSATYYCARKGYYGYFDYWGQGTALTVSS
[ SEQ ID NO :1]
5A10 경쇄
DIVMTQSQKFMSTSVGDRVSVTCKASQNVNTDVAWYQQKPGQSPKALIFSTSYRSSGVPDRFTGSGSGTDF
TLTITNVQSEDLAEYFCQQYSNYPLTFGAGTKVDLN
[ SEQ 　 ID 　 NO :2]
본 정황에서, 용어 "경합"한다는 것은 PSA30, 4D4, 5C3 및 5A10으로부터 선택된 레퍼런스 항체와 함께 경합 어세이에서 바인딩부를 포함하는 제제의 존재가 PSA에 대한 레퍼런스 항체의 검출가능한 바인딩의 수준을 (예를 들어, 제제 및 레퍼런스 항체가 등몰량으로 시험에 존재하고, 그리고 선택적으로 시험은 생리학적 조건하에서 수행될 경우에) 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99% 또는 100%로 감소될 수 있음을 의미하는 것을 포함한다. 이러한 분석은 실시예 9에 기재된 바와 같은 면역 방사 측정법(IRMA)에 의해 수행될 수 있다.
본 발명의 제1견지에 사용되는 바인딩부가 PSA에 대해 특이성을 갖는 경우에, 바인딩부는 (상기 SEQ ID NOS: 1 내지 8에 밑줄친 서열로 나타낸 바와 같은) PSA30, 4D4, 5C3 및 5A10 및 이의 항원-바인딩 프래그먼트로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 항체의 하나 이상의 상보 결정 부위(CDRs)를 포함할 수 있다.
당해 기술분야에 잘 확립된 바와 같이, 경합 항체는 6개의 CDRs을 포함하며, 이중 3개는 가변 경쇄(VL)에 존재하며, 이의 나머지 3개는 가변 중쇄(VH)에 존재한다.
항원 바인딩 활성을 유지하기 위해 이러한 어느 항체들의 6개 모두의 CDRs을 함유하는 바인딩 분자가 반드시 필요한 것은 아니나, 일 구현으로 바인딩 분자는 PSA30, 4D4, 5C3 및 5A10으로 구성되는 그룹으로부터 선택된 항체의 6개 모두의 CDRs을 포함할 수 있다.
변형적으로, 바인딩부는
PSA30, 4D4, 5C3 및 5A10으로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 항체로부터 얻어지는,
Figure pct00001
5개의 CDRs(즉, VH 또는 VL 부위의 3 CDRs, 다른 가변 부위의 2 CDRs);
Figure pct00002
4개의 CDRs(즉, VH 또는 VL 부위의 3 CDRs, 다른 가변 부위의 CDRs; 또는 각각의 VH 또는 VL 부위의 2 CDRs);
Figure pct00003
3개의 CDRs(즉, VH 또는 VL 부위 중 하나의 3 모두의 CDRs, 및 다른 나머지 부위로부터는 없음; 또는 VH 또는 VL 부위의 2 CDRs, 다른 가변 부위의 1 CDRs)
Figure pct00004
2개의 CDRs(즉, VH 또는 VL 부위 중 2개의 CDRs, 및 다른 나머지 부위로부터는 없음; 또는 각각의 VH 또는 VL 부위의 1 CDRs); 또는
Figure pct00005
VH 또는 VL 부위 중 하나로부터 1개의 CDR
과 같이, 6개 미만의 CDRs을 포함할 수 있다.
3개 또는 그 이하의 CDR 부위(일부 경우에, 단지 하나의 CDR 또는 이의 일부)가 이로부터 CDR(s)이 유도되는 항체의 항원-바인딩 활성을 보유할 수 있다는 것이 당해 기술분야에 잘 알려져 있다:
Laune et al. (1997), JBC, 272:30937-44 - CDR로부터 유도된 소정 범위의 헥사펩타이드가 항원-바인딩 활성을 나타내며(초록 참조), 완전한, 단일, CDR의 합성 펩타이드가 강한 바인딩 활성을 나타냄을 보여주고 있다(p30942, 우측 컬럼 참조).
Monnet et al. (1999), JBC, 274:3789-96 - 이는 소정 범위의 12-mer 펩타이드 및 관련 프래임워크 부위가 항원-바인딩 활성을 가지며(초록 참조), CDR3-류 펩타이드가 항원을 바인딩할 수 있다고 언급하고 있다(p3785, 좌측 컬럼 참조).
Qiu et al. (2007), Nature Biotechnology, 25:921-9 - 이는 2개의 결합된 CDRs로 구성된 분자가 항원에 바인딩할 수 있음을 보여주고 있다(초록 및 p926, 우측 컬럼 참조).
Ladner et al. (2007), Nature Biotechnology, 25:875-7 - 이는 Qiu et al.(상기 참조)을 리포팅하는 리뷰 문헌이며, 2개의 CDRs을 함유하는 분자가 항원-바인딩 활성을 보유할 수 있음을 언급하고 있다(p875, 우측 컬럼 참조).
Heap et al. (2005), J. Gen. Virol., 86:1791-1800 - 이는 "마이크로 항체"(단일 CDR을 함유하는 분자)가 항원에 바인딩할 수 있으며(초록 및 p1791, 좌측 컬럼 참조), 항-HIV 항체의 시클릭 펩타이드가 항원-바인딩 활성 및 기능을 갖는 것을 보여주고 있다.
Nicaise et al. (2004) Protein Science, 13:1882-91 - 이는 단일 CDR이 항원-바인딩 활성 및 이의 라이소자임 항원에 대한 친화도를 제공할 수 있음을 보여주고 있다.
Vaughan and Sollazzo (2001), Combinatorial Chemistry & High Throughput Screening, 4:417-430 - 이는 3개 미만의 CDR 부위를 함유하는 미니바디에 대해 기술되어 있는 리뷰 문헌이다. 예를 들어, p418(우측 컬럼 - - 3 Our Strategy for Design)에, 프래임워크 부위내에 배치된 단지 H1 및 H2 CDR 초가변 영역을 포함하는 미니바디가 기술되어 있다. 미니바디는 표적에 바인딩할 수 있는 것으로 기술되어 있다.
Quiocho (1993), Nature, 362:293-4 - 이는 미니바디 기술(즉, 미니어처화 항체 - 이 경우에 3개 미만의 CDRs을 가짐)의 요점을 제공하는 추가 리뷰 타입의 문헌이다.
Pessi et al (1993), Nature, 362:367-9 및 Bianchi et al (1994), J. Mol. Biol., 236:649-59 - 이들 문헌은 Vaughan 및 Sollazzo 리뷰에 인용된 논문이며, H1 및 H2 미니바디 및 이의 특성에 대해 보다 상세히 기술되어 있다.
Gao et al (1994), J. Biol. Chem., 269:32389-93은 VH 및 VL 사슬 모두를 가질 필요가 없음을 보여주는 증거로서, VL 사슬의 기질, 혈관활성장내 펩타이드에 대해 높은 친화도를 갖는 (3개의 CDRs을 포함하는) 전 VL 사슬에 대해 기술하고 있다.
이러한 문헌들은 본 출원의 우선일 전에 공개되었으며, 따라서 본 발명을 실행할 경우에 당해 기술분야의 통상의 기술자에게 이용가능한 것들이다. 이들은 6개 모두보다 적은 CDRs을 가진 분자가 이들이 유도되는 항체들의 항원 바인딩 특성을 보유할 수 있음을 분명히 보여주는 증거를 제공한다.
일 바람직한 구현으로, 본 발명의 제1견지에서 사용되는 바인딩부가 PSA에 대해 특이성을 갖는 경우에, 바인딩부는 예시적인 항-PSA 항체 5A10의 6 CDRs을 포함하는 항체이거나, 또는 이의 항원-바인딩 프래그먼트 또는 유도체이다.
변형적인 구현으로, 본 발명의 제1견지에 사용되는 바인딩부가 PSA에 대해 특이성을 갖는 경우에, 바인딩부는 PSA30, 4D4, 5C3 및 5A10, 및 이의 항원-바인딩 프래그먼트로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 항체를 포함하거나 이로 구성될 수 있다.
본 발명의 제1견지의 또 다른 구현으로, 바인딩부는 인간 선 칼리크레인(hK2)에 대한 특이성을 갖는다.
용어 hK2는 hK2의 모든 이성질체 형태, 및 hK2를 갖는 복합체내의 어느 분자 또는 단백질을 포함하는 것으로 의도된다. 예시적인 hK2 서열은 하기 월드-와이드-웹 어드레스에서 발견될 수 있는 전체 데이터 베이스로 주어지는 바와 같이 Transcript: KLK2-201(ENST00000325321), 유전자 ENSG00000167751의 산물로서 나타내어지며:
ensembl.org/Homo_sapiens/Transcript/Sequence_Protein?g=ENSG00000167751;
r=19:51376689-51383822;t=ENST00000325321
하기 서열을 갖는다:
MWDLVLSIAL SVGCTGAVPL IQSRIVGGWE CEKHSQPWQV AVYSHGWAHC
GGVLVHPQWV LTAAHCLKKN SQVWLGRHNL FEPEDTGQRV PVSHSFPHPL
YNMSLLKHQS LRPDEDSSHD LMLLRLSEPA KITDVVKVLG LPTQEPALGT
TCYASGWGSI EPEEFLRPRS LQCVSLHLLS NDMCARAYSE KVTEFMLCAG
LWTGGKDTCG GDSGGPLVCN GVLQGITSWG PEPCALPEKP AVYTKVVHYR
KWIKDTIAAN P [ SEQ ID NO :3]
정장(seminal plasma)에서 발견되는 대부분의 hK2는 불활성적이며, 단백질 C 인히비터(PCI)와 복합된다. 또한, hK2는 다른 세포외 프로테아제 인히비터와 복합체를 형성하는 것이 가능하다. 시험관내 시험에서 hK2는 α2-항플라스민(α2-AP), ACT, AMG, 항-트롬빈 III(ATIII), C1-불활성화제 및 플라스미노겐 활성화제 인히비터-1(PAI-1)에 바인딩될 수 있다.
따라서, hK2에/와 바인딩되거나 복합된, PCI, α2-항플라스민(α2-AP), ACT, AMG, 항트롬빈 III(ATIII), C1-불활성화제 및 플라스미노겐 활성화제 인히비터-1(PAI-1)와 같이 화합물, 분자, 단백질 또는 어느 다른 엔티티를 표지하는 것이 또한 본 발명의 범위에 포함된다.
일 구현으로, 바인딩부는 hK2의 복합 아이소폼에 비해 hK2의 프리(즉, 비-복합) 아이소폼에 대해 특이성을 가질 수 있다. hK2의 프리 아이소폼에 대해 특이성을 갖는 바인딩부는 hK2의 프리 아이소폼에 노출된 에피토프에 대해 바인딩 특이성을 가질 수 있으나, hK2의 복합 아이소폼에 노출되지 않으며, 이는 선형 또는 배좌(즉, 비-선형) 에피토프일 수 있다. 예를 들어, 바인딩부는 hK2가 PCI와 복합되는 경우에 정액에 존재하는 형태와 같이, 프리 hK2에 노출되고 복합 아이소폼에 노출되지 않은 hK2의 촉매 클레프트의 일부인 하나 이상의 아미노산 잔기 중 하나를 포함하는 에피토프에 대해 특이성을 가질 수 있다. hK2의 에피토프 맵핑은 Vaisanen et al, Clinical Chemistry 50:9, 1607-1617 (2004)에 기술되어 있으며, 이는 본 명세서에 참고문헌으로 편입된다.
본 발명의 제1견지에 사용되는 바인딩부가 hK2에 대해 특이성을 갖는 경우에, 바인딩부는 11B6 및 7G1으로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 항체와 함께, 바인딩부에 의해 바인딩된 h2K의 반응 에피토프를 포함하는 hK2, 또는 펩타이드에 바인딩에 대해 완료할 수 있다. 또한, 이러한 항체의 디스커션은 Vaisanen et al, Clinical Chemistry 50:9, 1607-1617 (2004) 및 Vaisanen et al, Anal. Chem ., 78:7809-7815 (2006)에서 발견될 수 있으며, 이들 문헌은 본 명세서에 참고문헌으로 편입된다.
예시적인 항-hK2 항체 11B6의 구성 요소 중쇄 및 경쇄의 아미노산 서열을 하기에 나타내었다(여기서 CDR 서열은 밑줄친 부분임).
11B6 중쇄
DVQLQESGPGLVKPSQSLSLTCTVTGNSITSDYAWNWIRQFPGNRLEWMGYISYSGSTTYSPSLKSRFSIT
RDTSKNQFFLQLNSVTPEDTATYFCATGYYYGSGFWGQGTLVTVSS
[ SEQ ID NO :4]
11B6 경쇄
DIVLTQSPASLAVSLGQRATISCRASESVEYFGTSLMHWYRQKPGQPPKLLIYAASNVES
GVPARFSGSGSGTDFSLNIQPVEEDDFSMYFCQQTRKVPYTFGGGTKLEIK
[ SEQ 　 ID 　 NO :5]
본 정황에서, 용어 "경합"한다는 것은 11B6 및 7G1으로부터 선택된 레퍼런스 항체와 함께 경합 어세이에서 바인딩부를 포함하는 제제의 존재가 hK2에 대한 레퍼런스 항체의 검출가능한 바인딩의 수준을 (예를 들어, 제제 및 레퍼런스 항체가 등몰량으로 시험에 존재하고, 그리고 선택적으로 시험은 생리학적 조건하에서 수행될 경우에) 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99% 또는 100%로 감소될 수 있음을 의미하는 것을 포함한다. 이러한 분석은 실시예 9에 기재된 바와 같은 면역 방사 측정법(IRMA)에 의해 수행될 수 있다.
본 발명의 제1견지에 사용되는 바인딩부가 hK2에 대해 특이성을 갖는 경우에, 바인딩부는 (상기 SEQ ID NOS: 10 내지 13에 밑줄친 서열로 나타낸 바와 같은) 11B6 및 7G1으로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 항체의 하나 이상의 상보 결정 부위(CDRs)를 포함할 수 있다.
항원 바인딩 활성을 유지하기 위해 이러한 어느 항체들의 6개 모두의 CDRs을 함유하는 바인딩 분자가 반드시 필요한 것은 아니나, 일 구현으로 바인딩 분자는 11B6 및 7G1으로 구성되는 그룹으로부터 선택된 항체의 6개 모두의 CDRs을 포함할 수 있다.
변형적으로, 바인딩부는
11B6 및 7G1으로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 항체로부터 얻어지는,
Figure pct00006
5개의 CDRs(즉, VH 또는 VL 부위의 3 CDRs, 다른 가변 부위의 2 CDRs);
Figure pct00007
4개의 CDRs(즉, VH 또는 VL 부위의 3 CDRs, 다른 가변 부위의 CDRs; 또는 각각의 VH 또는 VL 부위의 2 CDRs);
Figure pct00008
3개의 CDRs(즉, VH 또는 VL 부위 중 하나의 3 모두의 CDRs, 및 다른 나머지 부위로부터는 없음; 또는 VH 또는 VL 부위의 2 CDRs, 다른 가변 부위의 1 CDRs)
Figure pct00009
2개의 CDRs(즉, VH 또는 VL 부위 중 2개의 CDRs, 및 다른 나머지 부위로부터는 없음; 또는 각각의 VH 또는 VL 부위의 1 CDRs); 또는
Figure pct00010
VH 또는 VL 부위 중 하나로부터 1개의 CDR
과 같이, 6개 미만의 CDRs을 포함할 수 있다.
일 바람직한 구현으로, 본 발명의 제1견지에서 사용되는 바인딩부가 hK2에 대해 특이성을 갖는 경우에, 바인딩부는 예시적인 항-hK2 항체 11B6의 6 CDRs를 포함하는 항체이거나, 또는 이의 항원-바인딩 프래그먼트 또는 유도체이다(SEQ ID NOs: 4 및 5의 밑줄친 서열 참조).
변형적인 구현으로, 본 발명의 제1견지에 사용되는 바인딩부가 hK2에 대해 특이성을 갖는 경우에, 바인딩부는 11B6 및 7G1, 이의 항원-바인딩 프래그먼트로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 항체를 포함하거나 이로 구성될 수 있다.
선택적으로, 본 발명의 제1견지에 사용되는 제제는 치료부를 더 포함할 수 있다. 따라서, 제제는 상기한 바인딩부 및 치료부를 포함하거나 이로 구성될 수 있다. 바인딩부는 치료부에 직접 또는 간접적으로 연결될 수 있다.
제제가 상기한 바인딩부 및 치료부를 포함하거나 이로 구성되는 경우에, 제제는 예를 들어, 하기 실시예에 사용된 조건하에서 시험시, 바인딩부 단독으로 구성된 제제의 종양 업테이트 특성과 실질적으로 동등한 종양 업테이크 특성을 나타낼 수 있다. 본 정황에서, 실질적으로 동등한이란 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99% 또는 실질적으로 100%이상의 의미를 포함한다.
어느 적절한 치료부가 사용될 수 있다. 적절한 치료부는 전립선 암세포의 성장을 감소 또는 저해하거나, 또는 특히 사멸시킬 수 있는 것이다. 예를 들어, 치료제는 세포독성부일 수 있다. 세포독성부는 하나 이상의 방사성 동위원소를 포함하거나 이로 구성될 수 있다. 예를 들어, 하나 이상의 방사성 동위원소는 베타-에미터, 아우거(Auger)-에미터, 컨버전 전자-에미터, 알파-에미터 및 저 광자 에너지-에미터로 구성되는 그룹으로부터 각각 독립적으로 선택될 수 있다. 하나 이상의 방사능 동위원소는, 제제의 부근에 고 투여량 흡수를 생성하는 국소 흡수된 에너지의 방출 패턴을 각각 독립적으로 갖는 것이 바람직할 수 있다. 예시적인 방사성 동위원소는 90Y, 32P, 186Re/188Re; 166Ho, 76As/77As, 89Sr, 153Sm와 같은 장거리 베타-에미터; 131I, 177Lu, 67Cu, 161Tb, 105Rh와 같은 중거리 베타-에미터; 45Ca 또는 35S와 같은 저-에너지 베타-에미터; 51Cr, 67Ga, 99Tcm, 111In, 114 mIn, 123I, 125I, 201Tl와 같은 컨버전 또는 아우거(Auger)-에미터; 및 212Bi, 213Bi, 223Ac, 225Ac, 212Pb, 255Fm, 223Ra, 149Tb 및 221At와 같은 알파-에미터를 포함할 수 있다. 치료 방사성 핵종의 추가 예는 도 9에 나타내었다. 다른 방사성 핵종이 이용가능하며, 치료용으로 사용가능할 것이다. 다른 구현으로, 치료부 또는 세포독성부는 WO 2006/087374 A1, 특히 이의 p11, 7-15줄에서 "트레이서(tracer)"로 개시된 부가 아닌 것이 바람직할 수 있다.
일 바람직한 구현으로, 치료부는 177Lu이다. 예를 들어, 제제는 항-hK2 항체의 177Lu-표지된 형태, 또는 이의 항원-바인딩 프래그먼트 또는 유도체일 수 있다.
변형적으로, 치료부는 예를 들어, 세포분열 증식 억제 약물; 항-안드로겐 약물; 코르티손 및 이의 유도체; 포스포네이트; 테스토스테론-5-α-환원효소 인히비터; 보론 어덴드(boron addend); 사이토카인; 탭시가긴(thapsigargin) 및 이의 대사물; 독소(사포린 또는 칼리키아미신과 같은); 화학 요법제(안티메타볼라이트와 같은); 또는 전립선 암종의 치료에 유용한 어느 다른 치료 약물 또는 세포독성 약물과 같은 하나 이상의 치료(세포독성과 같은) 약물을 포함하거나 이로 구성된다.
예시적인 치료/세포독성 약물은 예를 들어, 하기를 포함할 수 있다:
세포분열 증식 억제제, 구체적으로 이에 한정하는 것은 아니나, 시클로포스아미드, 클로람부실, 이포스파미드, 부설판, 로머스틴, 탁산, 에스트라머스틴, 포스페이트 및 다른 질소 머스타드, 항생제(독소루비신, 칼리키아미신 및 에스퍼라마이신 포함), 빈카 알칼로이드, 아자리딘, 플라티늄-함유 화합물, 엔도스태틴, 알킬 설포네이트, 니트로소우레아, 트리아젠, 폴릭산 유사체, 피리미딘 유사체, 퓨린 유사체, 효소, 치환된 우레아, 메틸-히드라진 유도체, 다우노루비신, 암피파틱 아민을 포함하는 투여량-제한 부작용을 갖는 것들,
Figure pct00012
플루타미드 및 비칼루타미드 및 이의 대사물과 같은 항-안드로겐;
Figure pct00013
코르티손 및 이의 유도체;
Figure pct00014
디포스포네이트 및 부포스포네이트와 같은 포스포네이트;
Figure pct00015
테스토스테론-5-α-환원효소 인히비터;
Figure pct00016
보론 어덴드;
Figure pct00017
사이토카인;
Figure pct00018
탭시가긴 및 이의 대사물;
Figure pct00019
전립선 암종의 치료에 사용되는 다른 제제들.
변형적으로, 세포독성부는 광자 활성화 치료, 중성자 활성화 치료, 중성자 유도 아우거(Auger) 전자 치료, 싱크로트론 방사 치료 또는 저 에너지 X-선 광자 활성화 치료와 같은 활성화 치료에 사용하기에 적절한 하나 이상의 부를 포함하거나 이로 구성된다.
예를 들어, 본 발명에 따른 종양 표적제제와 함께, 사전-투여된 고-X 종양-표적제제와의 상호작용에 의해 외부 X-선 방사로부터 국소 에너지 디포지션이 암 조직에서 증진되는 소위 광-활성화 방사 치료(PAT)에 주로 초점을 맞춘 방사 치료의 향상을 위해 싱크로트론 방사(또는 저 에너지 X-선)을 이용하는 포텐셜이 존재할 것이다(도 10 참조).
PAT 치료 양상은 그레노블(Grenoble)에 있는 유럽 싱크로트론 방사 설비(ESRF)에서 ID17 바이오메디컬 빔라인에 의해 제공되는 바와 같은 싱크로트론 공급원으로부터 얻어지는 단색 X-선을 이용하며, 앞으로는 새로운 스웨덴식 싱크로트론 설비, Max-IV과 같은 다른 설비에서 이용가능한 것으로 여겨진다.
추가 잠재적인 치료 양상으로서, "유도된 아우거(Auger) 전자 종양 치료"에 대한 연구가 이번 룬드(Lund)에서의 유럽 파쇄 소스(ESS, European Spallation Source)이며, 희망을 가지고 의학 실험 단계에 있다. 리액터-생성된 열 및 반-열 중성자는 보론-중성자-캡쳐-치료(BNCT, Boron-Neutron-Capture-Therapy)에 오랫동안 사용되어 왔으며, 고 국소 흡수 에너지를 제공하는 유도 알파-파티클 및 리코일 핵(7L)으로 사전-임상 실험 및 뇌 종양의 치료 모두에 사용되어 왔다. 유사한 접근법은 중성자를 사용하는 것이며, 중성자에 대한 고 단면적을 갖는 안정한 핵으로 표지된 적절한 종양-표적 분자를 사용하는 것이다. 항체 또는 펩타이드는 예를 들어, 안정한 가돌리늄(157Gd)으로 표지될 수 있으며, 소위 Gadolinium Neutron Capture Therapy ( GdNCT )라 불리는 Gd-핵에 의해 포획되는 중성자에 대한 표적 분자로 작용한다. 몬테 카를로(Monte Carlo) 기술에 의하면, 종양 및 그 주위의 조직에서의 투여량 분포는, γ-광자, 중성자, 핵 리코일 뿐만 아니라 가돌리늄 또는 다른 잠재적 엘리먼트로부터 고유 x-선, 내부 전환 및 아우거-전자로부터 형성됨에 따라 산출된다.
상술한 바와 같이, 치료부(방사성 동위원소, 세포독성부 등과 같은)는 바인딩부(항체 또는 이의 프래그먼트와 같은)에 직접 또는 간접적으로 연결될 수 있다. 적절한 링커는 당해 기술분야에 알려져 있으며, 예를 들어, 보결 분자단, 비-페놀성 링커(N-숙시이미딜- 벤조에이트의 유도체; 도데카보레이트), 1,4,7,10-테트라아자시클로도데칸-1,4,7,10,테트라아세트산(DOTA)의 유도체, 디에틸렌트리아민펜타아세트 아비드(DTPA)의 유도체, S-2-(4-이소티오시아나토벤질)-1,4,7-트리아자시클로노난-1,4,7-트리아세트산(NOTA)의 유도체 및 1,4,8,11-테트라아자시클로도데칸-1,4,8,11-테트라아세트산(TETA)의 유도체와 같은 마크로시클릭 및 아시클릭 킬레이터 모두의 킬레이팅부 및 다른 킬레이팅부를 포함한다. 이러한 링커의 사용은 특히, 제제가 링커를 통해 치료부로서 방사성 동위원소에 결합되는 바인딩부로서 항체 또는 이의 프래그먼트를 포함하거나 이로 구성되는 환경에 적절하다.
일 바람직한 링커는 예를 들어, 177Lu-DTPA-11B6에 사용되는 것과 같은 DTPA이다.
선택적으로, 본 발명의 제1견지에 사용되는 제제는 검출가능한 부를 더 포함할 수 있다(또는 포함하지 않을 수 있다.). 예를 들어, 검출가능한 부는 테크네튬-99m; 인듐-111; 갈륨-67; 갈륨-68; 아르세닉-72; 지르코늄-89; 요오드-123, 요오드-124, 요오드-125; 탈륨-201으로 구성되는 그룹으로부터 선택된 방사성 동위원소와 같은 방사성 동위원소를 포함하거나 이로 구성될 수 있다. 선택적으로, 제제는 86Y/90Y 또는 124I/211At와 같은 한 쌍의 검출가능하며 세포독성을 갖는 방사성 핵종을 포함할 수 있다. 변형적으로, 제제는 소위 "복합성 테라그노스틱(Multimodality theragnostics)"을 제공하기 위해 검출가능한 부로서 그리고 또한 세포독성부로서 다중 모드 방식으로 동시에 작용할 수 있는 방사성 동위원소를 포함할 수 있다. 따라서, 바인딩부는 방사성 핵종 또는 화학 요법제와 같은 세포독성 약물을 이용한 치료 성능과 함께 다중-이미지 성능을 갖는(예, SPECT, PET, MRI, Optical 또는 Ultrasound) 나노파티클에 결합될 수 있다. 또한, 고주파 변환 자계 및 수반된 초음파 화상 진단을 이용한 온열 요법에 의한 치료 가능성이 본 발명에 포함된다. 예, 도 11 참조.
변형적으로, 검출가능한 부는 파라마그네틱 동위원소를 포함하거나 이로 구성될 수 있으며, 이러한 파라마그네틱 동위원소는 가돌리늄-157; 망가니즈-55, 디스프로시움-162, 크롬-52; 철-56으로 구성되는 그룹으로부터 선택된다.
본 발명의 제1견지에 사용되는 제제가 검출가능한 부를 포함하는 경우에, 검출가능한 부는 SPECT, PET, MRI, Optical 또는 Ultrasound imaging과 같은 화상 진단 기술에 의해 검출될 수 있다.
치료 및 검출가능한 부는 당해 기술분야에 잘 알려진 방법을 이용하여 바인딩부와 컨주게이트되거나 결합될 수 있다(예, 현존하는 면역컨주게이트 치료, 젬투주맙 오조가미신[상표명: Mylotarg®]은 세포독성 칼리키아미신에 연결된 모노클로날 항체를 포함한다.).
다른 구현으로, 본 발명의 제1견지에 따라 사용되는 제제는 제제 분자의 집단을 포함하는 제형의 형태로 전립선암을 치료하는데 사용된다. 일 옵션으로, 치료에 사용된 집단에서 모든 (또는 중량%로, 90%, 95%, 99%, 99.9% 이상과 같이 실질적으로 모든) 제제 분자는 동일한 치료부를 포함한다. 다른 옵션으로, 상기 집단은 다른 제제와 다른 치료부의 혼합물을 포함한다. 이 옵션은 화학치료제, 체액성 치료제, 또는 표적 제제가 치료 활성 방사성 핵종을 종양 관련 항원으로 운반할 뿐만 아니라 동시에 세포내 신호전달 캐스케이드를 촉발하여 표적된 종양 세포를 방사선 증감화하는 다른 치료들의 조합과 같은 다양한 제제들을 사용하여 표적된 방사성 핵종 치료의 효과를 증진시키는 가능성을 제공할 것이다. 또한, 이 옵션은 큰 종양, 미소 전이 및 단일 종양 세포의 복합 치료를 위해, 예를 들어, 알파- 및 다른 범위의 베타-에미터의 칵테일, 또는 다른 범위를 갖는 방사성 핵종의 칵테일, LET(선형 에너지 트랜스퍼) 및 RBE(상대적인 생물학적 효과)를 이용하여 세포독성제들의 혼합물로 전립선암을 치료하는데 유용하다. 일 구현으로, 장거리 에미터가 큰 종양의 치료를 위해 사용될 수 있으며, 단거리 에미터가 미소 전이 및 단일 종양 세포와 같은 보다 작은 종양의 치료를 위해 사용될 수 있다.
선택적으로, 본 발명의 제1견지에 사용되는 제제는 제제의 생체내 반감기를 증가시키는 부를 더 포함할 수 있다(또는 포함하지 않을 수 있다.). 제제의 생체내 반감기를 증가시키는 예시적인 부는 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 인간 혈청 알부민, 글리코실화기, 지방산 및 덱스트란을 포함할 수 있다. PEG가 특히 고려될 수 있다.
본 발명의 구현으로, PSA 또는 hK2와 같은 칼리크레인 단백질에 특이적인 바인딩제(예, 항체 또는 이의 프래그먼트) 및 치료제를 포함하는 제제는, 그 다음, 체내로 주사/주입된다. 그 다음, 제제는 PSA 또는 hK2와 같은 이에 상응하는 항원들을 생성하는 조직들에 바인딩한다. 제제가 바인딩되는 생물학적 구조물은 PET/SPECT/CT/MRI/Optical/Ultrasound를 포함하는 적절한 제제 및/또는 선량 측정 및/또는 치료 평가 이미지 진단 방법으로 후속적으로 처리될 수 있다.
일부 환경에서, 상기 제제에 의한 전립선 암세포의 약화 정도의 변화는 환자의 전립선 암세포에서 표적 칼리크레인(PSA 및 hK2와 같은)의 생성 및 농도 관계와 직접적으로 상응할 수 있다. 이러한 변화는 예를 들어, WO 2006/08734의 방법에 의해 검출될 수 있으며, 이 방법은 본 명세서에 참고문헌으로 편입되며, 치료학적 정보를 획득하는데 사용된다.
예를 들어, 상기 언급된 이미지 진단 방법으로부터 획득되는 PSA 및 hK2 항체 바인딩의 전치료 시각화(pretherapy visualisation)가 본 발명의 방법 및 용도와 결합될 수 있다. 약화의 측정으로부터, 조사된 조직이 PSA 생성, hK2 생성인지 또는 모두를 생성하는 것인지 직접 검출하는 것이 가능하다. 이러한 검출에 비추어, 가장 효과적인 치료를 맞추는 것이 가능할 것이다. 따라서, 개별화된 환자 치료가 전치료 투여량 계획으로 달성될 수 있다. 개별화된 환자 치료에 대한 가이드는 당해 기술분야에 알려진 치료로부터 취해질 수 있으며, 이러한 것들은 (1) Garkavij, et al. (2010) Cancer, 116:1084-1092; (2) Linden, et al. (1999) Clin.Cancer Res ., 5:3287s-3291s; (3) Ljungberg, et al. (2003) Cancer Biother.Radiopharm., 18:99-107; (4) Minarik, et al, (2010) J. Nucl . Med ., 51:1974-1978; (5) Sjogreen-Gleisner, et al. (2011) Q. J. Nucl. Med. Mol. Imaging, 55:126-154; and (6) Sjogreen, et al. (2005) Cancer Biother.Radiopharm., 20:92-97에 기술되어 있으며, 이러한 문헌들은 본 명세서에 참고문헌으로 편입된다.
따라서, 일 구현으로, 본 발명의 제1견지는 PSA에 대해 특이성을 갖는 본 발명의 제1견지에 따른 제제로 PSA-생성 전립선 암세포를 소유하는 것으로 검출된 환자를 치료하는 것을 포함한다.
또 다른 구현으로, 본 발명의 제1견지는 인간 선 칼리크레인(hK2)에 대한 특이성을 갖는 본 발명의 제1견지에 따른 제제로 hK2-생성 전립선 암세포를 소유하는 것으로 검출된 환자를 치료하는 것을 포함한다.
또 다른 구현으로, 본 발명의 제1견지는 PSA 및 인간 선 칼리크레인(hK2) 모두에 대해 특이성을 갖는 본 발명의 제1견지에 따른 제제로, 또는 하나는 PSA에 대한 특이성을 가지며, 다른 하나는 hK2에 대해 특이성을 갖는 제제들의 조합으로 PSA-생성 및 hK2-생성을 모두 하는 전립선 암세포를 소유하는 것으로 검출된 환자를 치료하는 것을 포함한다. 조합 치료의 경우에, 상기 제제는 환자에게, 개별적으로, 연속적으로, 동시에 투여되거나 또는 동일한 약학 조성물에 혼합물로서 제형화될 수 있다.
본 발명의 제1견지에 따른 제제를 전립선암을 가진 환자에게 투여하는 것은, 따라서 전립선 암세포상에 또는 내에 존재하는 전립선-특이 항원(PSA; hk3, 인간 칼리크레인 유전자 3) 및/또는 인간 선 칼리크레인(hK2)과 같은 칼리크레인 단백질의 바인딩을 이끌며, 환자에서 전립선 암세포의 성장 저해 및/또는 사멸을 이끈다. 예를 들어, 상기 제제는 환자에서 전립선 암세포의 성장 속도 및/또는 존재를 치료전 환자에서 전립선 암세포의 관찰된 성장 속도 및/또는 존재에 비해, 적어도 10%, 특히 적어도 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% 또는 90% 및 가장 바람직하게 100% 감소시킬 수 있다. 대상자에서 전립선 암세포의 성장 속도 및/또는 존재를 측정하는 방법은 당해 기술분야에 알려져 있다.
따라서, 본 발명은 전립선암의 치료 방법을 제공한다.
'치료'란 환자의 치료적 치료 및 예방적 치료 모두를 포함한다. 용어 '예방적'은 상기한 제제 또는 이의 제형을 환자 또는 대상자에서 전립선암의 가능성 또는 국소화된 전립선암의 확산, 파종 또는 전이를 억제 또는 감소시키는데 사용하는 것을 포함하는 것으로 사용된다. 또한, 예방적'은 상기한 제제 또는 이의 제형을 이전에 전립선암에 대해 치료받은 적이 있는 환자에서 전립선암의 재발을 억제하는데 사용하는 것을 포함한다.
본 발명의 제1견지에 의해 치료되는 전립선암은 전립선에 국소화되거나, 또는 비-국소화된(즉, 파종된) 전립선암일 수 있다. 전립선에 국소화된 전립선암은 예를 들어, TNM 시스템(Tumor/Nodes/Metastases의 약어)에 따라 임상 T1 또는 T2 암으로 분류될 수 있으며, 비-국소화된/파종된 전립선암은 예를 들어, T3 또는 T4 암으로 분류될 수 있다.
본 발명의 제1견지에 의해 치료되는 전립선암은 전이성 전립선일 수 있다. 전이성은 체내에서 이의 본래 위치로부터 다른 부위로의 암 확산을 칭한다. 예를 들어, 치료할 전이성 전립선암은 림프계: 뼈(스파인, 척추, 골반, 갈비 포함)에 존재하는 전이; 골반, 직장, 방광 또는 요도에서의 전이일 수 있다. 다른 덜 일반적인 위치에 존재하는 전이가 또한 본 발명으로 치료될 수 있다. 전이는 미소 전이일 수 있다. 미소 전이는 새로 형성된 종양이 일반적으로 검출하기에 너무 작거나 어렵게 검출되는 형태의 전이이다. 예를 들어, 불가사의한 파종성 질병과 같이, 이러한 세포 또는 세포 무리의 존재가 진단하기에 불가능하지만 존재하는 경우에라도, 예를 들어, 본 발명은 단일 암세포 또는 암세포 무리를 치료하기 위한 수단으로 통상의 기술자에게 제공된다.
따라서, 전립선암의 종래 치료에 비해 본 발명에 의해 제공되는 치료의 특히 중요한 기술적 이점은, 파종성 및/또는 전이성(미소 전이성 포함) 전립선암의 치료에 증가된 효과를 갖는 것으로 예상된다.
따라서, 일 구현으로, 본 발명은 일차 전립선 종양의 전이를 예방 또는 치료하는 제제 및 방법을 제공한다.
전립선암은 50대 이상, 보다 일반적으로 60, 65 또는 70대 이상의 남성에서 발달하는 경향이 있으며, 남성에서 가장 널리 퍼져있는 타입 중 하나임에도 불구하고, 대부분 증상을 가지고 있지 않으며, 치료를 받지 않아, 결국 다른 원인으로 사망하게 된다. 이는 전립선암이 대부분의 경우에, 느리게 성장하며, 증상이 없기 때문이며, 이러한 컨디션을 갖는 남성들은 나이가 많기 때문에 심장/순환기 질병, 폐렴, 다른 무관한 암, 또는 노령과 같이 전립선암과 무관한 원인으로 종종 사망한다. 전립선암 케이스의 약 3분의 2는 느린 성장을 나타내며, 나머지 3분의 1은 보다 공격적이고 빠르게 발달한다.
따라서, 전립선암의 효과적인 치료의 개발은 특히 보다 공격적이고 빠른 발달 형태의 전립선암, 특히 보다 젊은 환자에서 이러한 형태의 전립선암을 관리하는데 중요하다. 따라서, 일 구현으로, 본 발명의 제1견지는 전립선암의 진단시 및/또는 치료시에 70, 65, 60, 55, 50, 45, 40 이하의 연령인 환자에서 전립선암의 치료와 관련된다.
전립선암에 걸린 1촌 근친을 가진 남성(아버지 또는 형제)는 전립선암 발달 위험이 2배인 것으로 여겨지며, 전립선암에 걸린 두 개의 1촌 근친을 가진 남성은 가족력이 없는 남성에 비해 5배 이상의 위험을 갖는 것으로 여겨진다. 따라서, 본 발명의 제1견지는 1, 2 또는 그 이상의 가족원, 특히 1촌 가족원(아버지 또는 형제와 같은)이 전립선암으로 이전에 진단받은 것을 특징으로 하는 환자에서 전립선암을 치료하는 것과 관련될 수 있다.
또한, 본 발명의 제1견지는 환자에서 전립선암의 치료와 관련되며, 여기서 치료될 전립선암은 거세 저항성(castration-resistant) 전립선암(CRPC)이다. CRPC는 전형적으로 1-3년 후 호르몬 치료에 난치성이 되고, 호르몬 치료에도 성장이 재개되는 것을 특징으로 할 수 있다.
또한, 본 발명은 본 발명의 제1견지와 관련하여 상기 정의한 바와 같은 제제의 치료 유효량 및 약학적으로 허용되는 희석제, 담체 또는 부형제를 포함하는 약학 조성물을 제공한다.
또한, EDTA, 시트레이트, EGTA 또는 글루타티온과 같은 킬레이트제를 포함하는 부가적인 화합물이 약학 조성물에 포함될 수 있다.
상기 약학 조성물은 충분히 보관 안정성이 있으며 인간 및 동물에게 투여하기에 적절한 당해 기술분야에 알려진 방식으로 제조될 수 있다. 예를 들어, 상기 약학 조성물은 예를 들어, 냉동 건조, 분무 건조, 분무 냉각을 통해 또는 초임계 파티클 형성으로부터 파티클 형성의 사용에 의한 것과 같이 동결건조될 수 있다.
"약학적으로 허용되는"이란, 본 발명의 제제의 칼리크레인 단백질-바인딩 활성의 효과를 감소시키지 않는 무독성 물질을 의미한다. 이러한 약학적으로 허용되는 버퍼, 담체 또는 부형제는 당해 기술분야에 잘 알려져 있다(Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th edition, A.R Gennaro, Ed., Mack Publishing Company (1990) 및 handbook of Pharmaceutical Excipients, 3rd edition, A. Kibbe, Ed ., Pharmaceutical Press (2000), 이들 문헌은 본 명세서에 참고문헌으로 편입됨).
용어 "버퍼"는 pH를 안정화시킬 목적으로 산-염기 혼합물을 함유하는 수용액을 의미하는 것으로 의도된다. 버퍼의 예는 Trizma, Bicine, Tricine, MOPS, MOPSO, MOBS, Tris, Hepes, HEPBS, MES, phosphate, 카보네이트, 아세테이트, 시트레이트, 글리콜레이트, 락테이트, 보레이트, ACES, ADA, tartrate, AMP, AMPD, AMPSO, BES, CABS, 카코딜레이트, CHES, DIPSO, EPPS, 에탄올아민, 글리신, HEPPSO, 이미다졸, 이미다졸락틱산, PIPES, SSC, SSPE, POPSO, TAPS, TABS, TAPSO 및 TES이다.
용어 "희석제"는 약학 제제에서 제제를 희석시키는 수성 또는 비수성 용액을 의미하는 것으로 의도된다. 희석제는 하나 이상의 염수, 물, 폴리에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜, 에탄올 또는 오일(홍화유, 옥수수유, 땅콩 기름, 면실유 또는 참기름과 같은)일 수 있다.
용어 "보조제(adjuvant)"는 본 발명의 제제의 생물학적 효과를 증가시키는 제형에 첨가되는 어느 화합물을 의미하는 것으로 의도된다. 보조제는 예를 들어, 이에 한정하는 것은 아니나 플루오라이드, 클로라이드, 브로마이드, 요오드, 티오시아네이트, 설피트, 하이드록시드, 포스페이트, 카보네이트, 락테이트, 글리콜레이트, 시트레이트, 보레이트, 타르트레이트 및 다른 아실 조성물의 아세테이트와 같은 여러 음이온을 갖는 하나 이상의 아연, 구리 또는 은염일 수 있다. 또한, 보조제는 양이온 셀룰로즈 에테르, 양이온 셀룰로즈 에스테르, 디아세틸레이티드 히알루로닉산, 키토산과 같은 양이온 폴리머, 양이온 덴트리머, 폴리(비닐 이미다졸)과 같은 양이온 합성 폴리머 및 폴리히스티딘, 폴리리신, 폴리아르기닌 및 이러한 아미노산을 함유하는 펩타이드와 같은 양이온 폴리펩타이드일 수 있다.
부형제는 하나 이상의 카보하이드레이트, 폴리머, 리피드 및 미네랄일 수 있다. 카보하이드레이트의 예는 락토즈, 글루코즈, 수크로즈, 만니톨 및 시클로덱스트린일 수 있으며, 이들은 예를 들어, 동결건조를 촉진하기 위해 조성물에 첨가된다. 폴리머의 예는 전분, 셀룰로즈 에테르, 셀룰로즈 카르복시메틸셀룰로즈, 히드록시프로필메틸 셀룰로즈, 히드록시에틸 셀룰로즈, 에틸히드록시에틸 셀룰로즈, 알기네이트, 카라기난, 히알루로닉산 및 이의 유도체, 폴리아크릴산, 폴리설포네이트, 폴리에틸렌글리콜/폴리에틸렌 옥사이드, 폴리에틸렌옥사이드/폴리프로필렌 옥사이드 코폴리머, 다른 가수분해도의 폴리비닐알코올/폴리비닐아세테이트, 및 폴리비닐피롤리돈이며, 여러 분자량 모두를 포함하며, 이들은 예를 들어, 점도 조절을 위해, 생체 접착 달성을 위해, 또는 화학 및 단백질 분해로부터 리피드를 보호하기 위해서와 같이 조성물에 첨가된다. 리피드의 예는 지방산, 포스포리피드, 모노-, 디-, 및 트리글리세라이드, 세라마이드, 여러 아실 사슬 길이 및 포화도의 스핑고리피드 및 글리코리피드, 에그 레시틴, 소이 레시틴, 하이드로게네이티드 에그 및 소이 레시틴이며, 이들은 폴리머와 유사한 이유로 조성물에 첨가된다. 미네랄의 예는 탤크, 마그네슘 옥사이드, 아연 옥사이드 및 티타늄 옥사이드이며, 이들은 액체 축적의 감소 또는 유리한 안료 특성과 같은 이익을 얻기 위해 조성물에 첨가된다.
본 발명의 제제는 이의 운반에 적절한 당해 기술분야에 알려진 약학 조성물의 어느 타입으로 제형화될 수 있다.
일 구현으로, 본 발명의 약학 조성물은 리포좀의 형태로 존재할 수 있으며, 여기서 제제는 약학적으로 허용되는 담체에 부가적으로, 미셀로서 응집된 형태로 존재하는 리피드, 불용성 모노레이어 및 리피드 크리스탈과 같은 양친매성 제제와 결합된다. 리포좀 제제에 적절한 리피드는 이에 한정하는 것은 아니나, 모노글리세라이드, 디글리세라이드, 설파타이드, 리소레시틴, 포스포리피드, 사포닌, 담즙산 등을 포함한다. 적절한 리피드는 또한 혈류 순환 시간을 연장하기 위해 극성 헤드기내의 폴리(에틸렌 글리콜)에 의해 변형된 상기 리피드를 포함한다. 이러한 리포좀 제형의 제조는 예를 들어, US 4,235,871에 기재되어 있으며, 이는 본 명세서에 참고문헌으로 편입된다.
또한, 본 발명의 약학 조성물은 생분해성 마이크로스피어의 형태로 존재할 수 있다. 폴리(락틱산)(PLA), 폴리(글리콜산)(PGA), PLA와 PGA의 코폴리머(PLGA) 또는 폴리(카프로락톤)(PCL) 및 폴리안하이드리드와 같은 지방족 폴리에스테르가 마이크로스피어의 생성시 생분해성 폴리머로 널리 사용되어 왔다. 이러한 마이크로스피어의 제조는 US 5,851,451 및 EP 0 213 303에 기재되어 있으며, 이들 문헌은 본 명세서에 참고문헌으로 편입된다.
다른 구현으로, 본 발명의 약학 조성물은 폴리머 겔의 형태로 제공되며, 여기서 전분, 셀룰로즈 에테르, 셀룰로즈 카르복시메틸셀룰로즈, 히드록시프로필메틸 셀룰로즈, 히드록시에틸 셀룰로즈, 에틸히드록시에틸 셀룰로즈, 알기네이트, 카라기난, 히알루로닉산 및 이의 유도체, 폴리아크릴산, 폴리비닐 이미다졸, 폴리설포네이트, 폴리에틸렌글리콜/폴리에틸렌 옥사이드, 폴리에틸렌옥사이드/폴리프로필렌 옥사이드 코폴리머, 다른 가수분해도의 폴리비닐알코올/폴리비닐아세테이트, 및 폴리비닐피롤리돈과 같은 폴리머가 상기 제제를 함유하는 용액의 농축을 위해 사용된다.
변형적으로, 상기 제제는 간단히 염수, 물, 폴리에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜, 에탄올 또는 오일(홍화유, 옥수수유, 땅콩 기름, 면실유 또는 참기름과 같은)에 용해될 수 있다.
본 발명의 약학 조성물이 활성제의 강화를 위해 이온 및 정의된 pH를 포함할 수 있는 것으로 인식될 것이다. 또한, 상기 조성물은 멸균과 같은 통상적인 약학 작업에 가해질 수 있으며 그리고/또는 보존제, 안정화제, 습윤제, 에멀젼화제, 버퍼, 필러 등과 같은 통상적인 보조제를 함유할 수 있다.
본 발명에 따른 약학 조성물은 당해 기술분야의 통상의 기술자에게 알려진 어느 적절한 경로를 통해 투여될 수 있다. 따라서, 가능한 투여 경로는 비경구(정맥내, 피하 및 근육내), 경피, 눈, 비강, 폐, 구강, 경구, 비경구 및 직장을 포함한다. 또한, 이식물로부터의 투여가 가능하다. 인퓨전은 투여 제제의 잠재적으로 높은 세포독성 때문에 바람직할 수 있다.
일 구현으로, 상기 약학 조성물은 예를 들어, 정맥내, 뇌혈관내, 관절내, 동맥내, 복강내, 척수내, 심실내, 흉골내, 두개강내, 근육내 또는 피하와 같이 비경구 투여되거나, 또는 이들은 인퓨전 기술에 의해 투여될 수 있다. 이들은 통상적으로, 예를 들어, 혈액과 등장성인 용액을 형성하기 위해 충분한 염 또는 포도당과 같은 다른 물질들을 함유할 수 있는 멸균 수용액 형태로 사용된다. 상기 수용액은 필요에 따라 적절히 완충된다(예, pH 3-9로). 멸균 조건하에서 적절한 비경구 제형의 제조는 당해 기술분야에 잘 알려진 표준 약학 기술에 의해 쉽게 완수된다.
비경구 투여에 적절한 제형은 항산화제, 버퍼, 세균발육 저지제 및 의도된 수용자의 혈액과 등장성인 제형을 제공하는 용질을 함유할 수 있는 수성 및 비수성 멸균 주사액; 및 서스펜션화제 및 농조화제를 포함할 수 있는 수성 및 비수성 멸균 서스펜션을 포함한다. 제형은 예를 들어, 밀봉된 앰플 및 바이얼과 같은 단위-투여량 또는 다중-투여량 용기에 존재할 수 있으며, 예를 들어, 사용 직전에 주사용 물과 같은 멸균 액체 담체의 첨가만을 필요로 하는 동결-건조(lyophilised) 컨디션으로 보관될 수 있다. 즉석 주사액 및 서스펜션은 앞서 언급된 종류의 멸균 분말, 과립 및 정제로부터 제조될 수 있다.
따라서, 본 발명의 약학 조성물은 특히, 예를 들어 정맥내와 같은 비경구 투여에 적절하다.
변형적으로, 상기 약학 조성물은 (예, 가압 용기로부터 에어로졸 분무 프리젠테이션, 펌프, 스프레이 또는 디클로로디플루오로메탄, 트리클로로플루오로-메탄, 디클로로테트라플루오로-에탄, 1,1,1,2-테트라플루오로에탄(HFA 134A3 또는 1,1,1,2,3,3,3-헵타플루오로프로판(HFA 227EA3)과 같은 히드로플루오로알칸, 이산화탄소 또는 다른 적절한 가스와 같은 적절한 추진제의 사용을 갖는 분무기의 형태로) 비강 또는 흡입에 의해 투여될 수 있다. 가압 에어로졸의 경우에, 투여량 단위는 칭량된 양을 운반하기 위한 밸브를 제공함으로써 검출될 수 있다. 가압 용기, 펌프, 스프레이 또는 분무기는 예를 들어, 소르비탄 트리올레이트와 같은 윤활제를 부가적으로 함유할 수 있는 용매로서 에탄올과 추진제의 혼합물을 이용하여 활성 폴리펩타이드의 용액 또는 서스펜션을 함유할 수 있다. 흡입기 또는 취입기에 사용되는 캡슐 및 카트리지(예를 들어, 젤라틴으로 제조된)가 본 발명의 화합물과 락토즈 또는 전분과 같은 적절한 분말 베이스의 분말 믹스를 함유하도록 제형화될 수 있다.
상기 약학 조성물은 약학적으로 효과적인 투여량으로 환자에게 투여될 것이다. 본 명세서에 사용된, '치료 유효량' 또는 '유효량' 또는 '치료 유효'는 주어진 컨디션 및 투여 요법에 치료 효과를 제공하는 양을 칭한다. 이는 필요한 첨가제 및 희석제, 즉 담체 또는 투여 비이클과 관련하여 원하는 치료 효과를 생성하는 것으로 산출된 활성 물질의 사전 결정된 양이다. 또한, 이는 숙주의 활성, 기능 및 반응에서 임상적으로 현저한 결손을 감소 및/또는 억제하는데 충분한 양을 의미하는 것으로 의도된다. 변형적으로, 치료 유효량은 숙주에서 임상적으로 현저한 컨디션의 향상을 일으키기에 충분하다. 당해 기술분야의 통상의 기술자에 의해 인식되는 바와 같이, 화합물의 양은 특정 활성에 따라 상당히 달라질 수 있다. 적절한 투여량은 필요한 희석제와 관련하여 원하는 치료 효과를 생성하는 것으로 산출된 활성 조성물의 사전 결정된 양을 함유할 수 있다. 본 발명의 조성물의 제조 방법 및 용도에서, 활성 성분의 치료 유효량이 제공된다. 치료 유효량은 나이, 체중, 성별, 컨디션, 합병증, 다른 질병 등과 같이 당해 기술분야에 알려져 있듯이 환자 특성에 기초하여 통상의 숙련된 의료인에 의해 결정될 수 있다. 약학적으로 효과적인 투여량의 투여는 개별 투여 단위 그렇지 않으면 여러 보다 작은 투여 단위들의 형태로 단일 투여에 의해 그리고 또한 특정 간격으로 세분화된 투여량의 다중 투여에 의해 수행될 수 있다. 변형적으로, 투여량은 장기간에 걸쳐 연속 인퓨전으로 제공될 수 있다.
본 발명의 제1견지에서 상기 정의된 제제는 사용되는 화합물의 효능/독성에 따라 다양한 농도로 제형화될 수 있다. 제형은 0.1μM-1mM, 1μM-500μM, 500μM-1mM, 300μM-700μM, 1μM-100μM, 100μM-200μM, 200μM-300μM, 300μM-400μM, 400μM-500μM 및 약 500μM의 농도로 활성제를 포함할 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 단독으로 투여되거나 전립선암의 치료에 사용되는 다른 치료제와 함께, 또는 수술(예, 근치적 전립선절제술), 방사성 치료, 근접 치료, 외부 빔 방사성 치료, 고강도 촛점화 초음파(HIFU), 화학치료, 경구 화학치료 약물, 동결 수술(종양 동결), 호르몬 치료(항안트로겐 치료와 같은), 거세 또는 이들의 조합과 같은, 전립선암의 치료를 위한 다른 치료 양상으로 환자의 치료 전, 후 또는 동시에 투여될 수 있다.
또한, 본 발명은 본 발명의 제1견지와 관련하여 상기 정의된 제제 또는 상기 정의된 약학 조성물을 포함하는 키트를 제공한다.
또한, 본 발명은 실질적으로 본 명세서에 기재된 약제에 사용되는 제제를 제공한다.
또한, 본 발명은 실질적으로 본 명세서에 기재된 약학 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 실질적으로 본 명세서에 기재된 제제의 용도를 제공한다.
또한, 본 발명은 실질적으로 본 명세서에 기재된 치료 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 실질적으로 본 명세서에 기재된 키트를 제공한다.
본 발명의 일 견지에 따르면, 상기 정의된 제제로 일차 및 파종성 전립선암을 치료하는 치료 방법이 제공된다.
본 발명의 다른 견지에 따르면, 미소 전이를 포함하는 임파선 전이 및/또는 골 전이와 같은 전이를 치료하는데 사용될 수 있는 치료 방법이 제공된다.
본 발명의 다른 견지에 따르면, 체외 방사선 치료, 세포분열 억제제 및 안드로겐 치료, 또는 종양 표적 치료 항체/프래그먼트에 결합되지 않은 다른 치료와 함께 또는 후에 사용될 수 있는 치료 방법이 제공된다.
본 발명의 특정 견지에 따르면, PSA 및/또는 hK2에 특이적인 치료-표지된 항체가 제공되며, 이 표지된 항체는 전립선암, 즉, PSA 및/또는 hK2 생성 조직을 치료하는데 사용된다.
본 발명의 다른 견지에 따르면, 상기 방법의 용도가 제공된다.
본 발명에 따른 치료 방법은 전립선암의 치료를 가능케 하는 종래 기술에 비해 이점을 가지며, 상기 치료 방법은 또한 임파선 전이 또는 상술한 바와 같은 어느 다른 형태의 전이와 같은 전이를 포함하는 전이를 치료하는데 사용될 수 있으며, 수술후 절차와 함께 또는 후에, 방사선 조사, 세포분열억제 및 안드로겐 치료 중 또는 후에 사용될 수 있다.
상기 설명은 전립선암의 치료방법에 적용가능한 본 발명의 구현에 촛점을 두었다. 하지만, 본 발명은 이에 한정하는 것은 아니나 예를 들어, 전이, 수술후 검사 및 방사선 조사, 세포분열억제 및 안드로겐 치료 중 또는 후 검사를 포함하는 다수의 다른 치료 조합에 적용될 수 있는 것으로 인식될 것이다. 전이의 치료와 관련하여, 전이는 임파선의 치료일 것이다.
다른 구현으로, 방사 유도 수술(RGS) 또는 영상 유도 수술(IGS)이 수술 중 및/또는 전에 상술한 바와 같이(PSA 및/또는 hK2-항체와 같은) 트레이서-표지된 항-칼리크레인 특이 바인딩부를 확인하는데 사용될 수 있다. 따라서, 상술한 바와 같이 바인딩부 및 검출가능한 부를 포함하는 제제가 수술 중 및/또는 전에 투여될 수 있다. 이러한 구현에서, 트레이서 표지된 항-PSA 및/또는 항-hK2-항체와 같은 제제가 우선 인퓨전될 수 있다. 그 후, RGS/IGS가 수술 중 또는 전에 검출가능한 부에 민감한 검출 기구로 PSA/hK2 생성 조직을 확인하는데 사용될 수 있다. 검출가능한 부는 예를 들어, 방사선 방출 또는 자기-민감성 검출가능부일 수 있으며; 이는 예를 들어, 세렌코프(Cerenkov) 방사선 및/또는 브렘스트라렁(Bremsstrahlung)의 방출일 수 있으며; 이는 형광 표지 및/또는 자기 또는 자기화가능한 표지일 수 있다. 따라서, 본 발명에 따른 RGS/IGS는, 예를 들어, 광학, 세렌코프(Cerenkov), 브렘스트라렁(Bremsstrahlung) 또는 베타 방사선의 검출에 기초한 방법일 수 있으며; 방사성 핵종 표지의 검출, 및/또는 자기 측정을 포함할 수 있다. RGS는 외과의사가 검출가능한부에 의해 "마킹된(marked)" 조직을 확인할 수 있는 외과 기술로서 당해 기술분야의 숙련자에게 잘 알려져 있다.
상기에 따라 얻어지는 시각화는 SPECT/PET, 컴퓨터 단층촬영(CT), 초음파(US) 및 자기 공명 단층촬영(MRT)와 같은 다른 방사성 시각화 방법과 조합될 수 있다.
따라서, 제2견지로, 또한 본 발명은 방사 유도 또는 화상 유도 수술과 같은 수술 전 또는 중에 전립선암을 가진 환자에게 투여함으로써 의학에 사용되는, (본 발명의 제1견지에서 상기한 바와 같은) 칼리크레인 단백질에 특이성을 갖는 바인딩부 및 본 발명의 제1견지와 관련하여 상기한 바와 같은 검출가능한부를 포함하거나 이로 구성되는 제제를 제공한다.
따라서, 제2견지는 또한 방사 유도 또는 화상 유도 수술과 같은 수술 전 또는 중에 전립선암을 가진 환자에게 투여하기 위한 약제의 제조에 사용되는, 칼리크레인 단백질에 특이성을 갖는 바인딩부 및 검출가능한부를 포함하거나 이로 구성되는 제제의 용도를 제공한다.
또한, 본 발명의 제2견지는 수술 전 또는 중에 칼리크레인 단백질에 특이성을 갖는 바인딩부 및 검출가능한부를 포함하거나 이로 구성되는 제제의 유효량을 투여하는 단계를 포함하는, 전립선암을 가진 환자에서 수행되는 방사 유도 또는 화상 유도 수술과 같은 수술 방법을 제공한다.
본 명세서에 기재된 어느 방법, 제제 또는 조성물은 본 명세서에 기재된 어느 다른 방법, 제제 또는 조성물과 관련하여 시행될 수 있는 것으로 예견된다.
청구범위 및/또는 명세서에서 용어 "포함하는(comprising)"과 함께 "하나의(a 또는 an)"가 사용될 경우에, 이는 "하나"를 의미할 수도 있고, 또한 "하나 이상", "적어도 하나" 및 "하나 또는 하나 이상"을 의미할 수 있다.
본 발명의 이러한 구현 및 다른 구현들이 상기 설명 및 첨부된 도면을 참조하여 보다 더 잘 인식되고 이해될 것이다. 그러나, 본 발명의 다양한 구현 및 이의 다수 특정 설명을 나타내는 상기 설명은 예시적인 것으로 제공되며 이로 한정되는 것은 아닌 것으로 이해되어야 한다. 다수의 치환, 변형, 부가 및/또는 재배열이 본 발명의 정진을 벗어나지 않고 본 발명의 범위내에서 이루어질 수 있으며, 본 발명은 이러한 모든 치환, 변형, 부가 및/또는 재배열을 포함한다.
하기 도면은 본 명세서의 일부를 형성하며, 본 발명의 특정 견지를 추가 입증하기 위해 포함된다. 본 발명은 본 명세서에 나타낸 특정 구현들의 상세한 설명과 함께 하나 이상의 이러한 도면을 참조하여 더욱 잘 이해될 것이다.
하기 실시예는 본 발명의 특정 구현을 나타내기 위해 포함된다. 본 발명자에 의해 발견된 대표적인 기술에 따른 실시예에 나타낸 기술은 통상의 기술자에 의해 본 발명의 수행에 있어 잘 작용하며, 이에 따라 이의 수행에 대한 특정 방식을 구성하는 것으로 간주될 수 있는 것으로 인식되어야 한다. 그러나, 통상의 기술자는 본 명세서의 견지에서 다수의 변화가 개시된 특정 구현에서 이루어질 수 있으며, 이는 본 발명의 정신 및 범위를 벗어나지 않고 유사하거나 비슷한 결과를 여전히 획득함을 인식할 것이다.
실시예 1 - 125 I- PSA30 및 125 I-11B6의 생물학적 분배
재료 및 방법: PSA30 및 11B6 항체를 로도겐 방법을 이용하여 125I(PerkinElmer, USA)로 표지하였다. 간략히, 150㎍ 1,3,4,6-테트라클로로-3α,6α-디페닐 글리콜우릴을 함유하는 코팅된 시험 튜브를 200㎍ PSA30의 표지를 위해 사용하였다. 그 혼합물을 실온에서 15분간 배양한 후, 저분자량 성분을 겔 여과(PD-10 column, GE Healthcare, UK)에 의해 제거하였다. 방사 화학적 순도는 겔 여과 후 95%이었다.
결과 및 디스커션 : 도 2 및 3 참조. LNCaP 종양은 125I-PSA 제형의 정맥내 주사 후 대부분의 시점에서 다른 조사된 장기들에 비해 더 높은 흡수율을 가졌으며, 주사 후 24시간에 최고조에 달했다(4.32%IA/g). 활성의 감소를 나타내는 다른 장기들에 비해, LNCaP 종양은 비-종양을 가진 마우스에 비해 주사 후 처음 24시간동안 현저한 활성 증가(32%까지)를 나타내었으며, 티로이드 축적은 크게 증가되었다. LNCaP 종양에서 125I-PSA30 mAb 흡수율은 주사 후 24시간에 최고조에 달했으며, 후속적으로 72시간 주사 후에 종양 흡수율의 샤프한 감소가 나타났다. 중요하게도, 이와 동시 시점에서, 티로이드 흡수율의 샤프한 증가가 있었다. 이 역 상관 관계는 디할로겐화 효과가 일어났다는 인디케이터인 것으로 보인다. 결론적으로, 125I-PSA30은 LNCaP-베이즈드 이종이식 마우스에서 fPSA를 효과적으로 표적할 수 있다.
실시예 2 - 111 In - DTPA -11B6의 생물학적 분배
재료 및 방법: 실험실 동물 보호에 대한 국가적 법률에 따라 동물 실험을 수행하였다. 동물 연구는 동물 연구를 위한 지방 윤리 위원회에 의해 승인되었다. Taconic Europe(Bomholt, Denmark)로부터 구입한 수컷 면역결핍 누드 마우스(6-8주령)를 본 시험에 사용하였다. hK2-발현 LnCAP 전립선암세포의 이종이식을 우측 옆구리에 피하 이식하였다. 이종이식을 위해, 100μL 세포 배지 및 100μL Matrigel(BD Sciences, Bedford, USA)에 LNCaP 세포, 5.2 x 106 cells/mouse가 사용되었다. DU145 세포(hK2-네거티브 세포주), 1-2 x 106을 우측 옆구리에 sc 이식하여 음성 컨트롤로서 제공되었다. LNCaP 세포의 주사 후 3-6주에, LNCaP 이종이식을 가진 5그룹의 마우스(4-5마리/그룹) 및 DU145 이종이식을 가진 1그룹(3마리/그룹)에 각각 100μl 111In-DTPA-11B6(100μl내에 ~200kBq 및 22.5μg 단백질)으로 iv 주사하였다. 동물들을 여러 시점, 4h, 24h, 48h, 72h 또는 168h p.i.에서 그리고 컨트롤 그룹은 48h p.i에서 희생시켰다. 관심있는 장기들을 섬광계수용 20ml 바이얼(Zinsser Analytic, Frankfurt, Germany)에 넣고, 무게를 재고, 3-인치 Nal(TI) 디텍터를 가진 자동 감마-카운터(1480 Wizard OY, Wallac, Turku, Finland)에서 측정하였다. 모든 장기들은 절개 후 그리고 마지막 시점 후에 2회 측정되었다. 방사능의 측정은 하기 표준 프로토콜과 같이 수행되었다.
방사능의 측정: 방사성 핵종의 측정을 위한 표준 프로토콜을 사용하였다. 백그라운드 레벨로 보정된 분당 카운트(counts per minute)가 평가를 위해 사용되었다. 그람 조직당 주입된 투여량 퍼센트로 표기되는 조직 흡수율값(% ID/g)을 다음과 같이 산출하였다:
% ID/g = (조직 방사능/주입된 방사능)/장기 중량 x 100
여기서 iv 주사에 있어서,
주입된 방사능 = 컨트롤 주사기 내의 평균 방사능 - 사용된 주사기 내의 방사능 - 꼬리에서의 방사능
이다.
결과 및 디스커션 : 도 8, 12 및 13 참조. 예비시험 결과는 111In-11B6가 시간 경과에 따라 종양에 효과적으로 축적되었으며, 48hpi에서 16.4±1.92 %IA/g(그람당 주입된 활성 퍼센트)으로 최고조에 달하였다. 정상 장기(간, 비장, 신장, 뼈, 전립선, 고환)에서 방사능 흡수율은 보다 낮은 수준이었다. 다소 증가된 흡수율이 침샘에서 관찰되었으며, 이는 아마도 hK2 발현의 특정 정상 발현에 기인한 것으로 보인다(도 8). 이는 다음 연구에서 더욱 조사될 것이다. 또한, 111In-DTPA-11B6는 음성 컨트롤 이종이식 DU145에서 현저히 보다 낮은 흡수율을 나타내었기 때문에 hK2-특이적이었다(도 13). 종양/혈액 비는 시간 경과에 따라 증가하였으며, 이는 종양에서 111In-DTPA-11B6의 흡수율이 점점 더 증가하였음을 나타낸다(도 12). 결론적으로, 111In-DTPA-11B6의 생물학적 분배 데이터는 전립선암에서 유망한 종양-표적 특성을 나타내었으며, 이는 다른 방사성 핵종을 이용한 전립선 암종의 치료에 대한 잠재력을 나타낸다.
실시예 3 - 디지털 오토래디오그래피 화상
재료 및 방법: 125I-PSA 및 18F-콜린을 주사받은 동물에서 DAR을 수행하였다. 동물들은 대사 프로브의 주사 후 1시간에 안락사되고, 종양을 즉시 제거하고, Cryomount(HistoLab products AB, Sweden)에 확보하고, 신속히 액체 질소로 동결하고, DAR를 위해 100㎛ 섹션으로 또는 조직병리학 및 면역조직화학(IHC) 분석을 위해 20㎛ 섹션으로 절단하였다. 실리콘 스트립 디텍터 베이즈드 시스템(Biomolex 700 Imager; Bimolex AS, Oslo)을 사용하여 보다 두꺼운 섹션내에서 방사능의 분포를 이미지화하였다. 방출 스펙트럼 및 붕괴 속도 모두의 차이를 사용하여 하나 이상의 방사성 핵종이 주입된(본 경우에 125I 및 18F) 동물에서 각 방사성 핵종의 개별 이미지를 생성하였다.
결과 및 디스커션 : 도 4a 내지 4h의 결과를 참조바란다. 이러한 데이터에 기초하여, 절제된 종양에서 PSA30 mAb 흡수율이 정맥내 주사 후 24시간에 최고조에 달하였으며, 정상 조직에 비해 종양에서 유지되었음을 입증하였다. 상대적으로 낮은 T/O 비(도 3의 표 참조)가 저 항체 투여량이 혈관주위 공간에서 fPSA 항원에 의해 포화되어, 이에 따라 고형 종양으로의 보다 깊은 침투를 방해하는 것으로 나타나는 바인딩 부위 배리어; 종양 내부의 불충분한 혈관 투과성; 또는 (갑상선에서 고 요오드 축적에 의해 제시되는) 항체의 탈 요오드와 같은 인자에 기여될 수 있다. T/O 비를 향상시키는 2가지 방법은 항체 투여량 및 여러 가지 시험 방사성 표지를 증가시키는 것이 될 수 있다. 이러한 결점에도 불구하고, 본 발명자들은 종양 조직에서 125I-PSA30 활성의 축적을 발견하였다.
면역 조직화학 및 조직병리학(도 4a-h의 결과 참조). PSA를 조사하기 위해, 20㎛ 종양 크리오섹션(상술한 바와 같이 동결 및 확보된)을 IHC를 이용하여 조사하였다. PSA 또는 hK2에 대한 면역 반응성을 DAKO EnVision Flex/HRP system kit (Dako Corporation)를 이용하여 시각화하였다. 인접한 종양 섹션을 또한 헤마톡실린(핵 염색) 및 에오신(세포질 염색)(H&E)으로 염색하고, 표준 투조 현미경하에서 일반적 형태를 분석하였다. H&E 염색으로, 종양 섹션의 생존 부위 및 괴사 영역을 염색하였다. 양성 컨트롤로서, LNCaP 종양 섹션을 1:1000의 희석으로 PSA mAb 2E9와 함께 배양하고, 상술한 바와 같이 시각화하였다. 음성 컨트롤로서, PSA30의 정맥내 주사를 받은 마우스로부터 얻은 종양 섹션을 2차 항체의 배양없이, 하지만 IHC의 다른 모든 단계는 포함하여 시각화하였다. 염색된 섹션을 Carl Zeiss MIRAX Scan 현미경 스캐너를 이용하여 스캔하고, MIRAX Viewer software(Carl Zeiss Imaging Solutions GmbH, Germany)를 이용하여 관찰하였다.
실시예 4 - 방사 표지
직접 요오드화( 125 I/ 124 I/ 131 I/): 단백질(10㎕, PBS에 함유된 1mg/ml)을 클로라민-T(CAT, Sigma St. Louis, MO, USA) 방법을 이용하여 Nal 용액(4 MBq)으로 125I와 혼합하였다. 반응은 PBS에 CAT를 첨가(10㎕, 2mg/ml)하여 시작되었으며고, 격렬한 쉐이킹을 하면서 1시간 동안 배양한 다음, 소듐 메타비설피트(20㎕, 2mg/ml)를 첨가하여 종료되었다. 표지된 단백질을 PBS로 사전-평형된 NAP-5 컬럼(Sephadex G-25, GE Healthcare)에서 크기 배제 크로마토크래피에 의해 미반응된 125I 및 저분자량 반응 성분들로부터 분리하였다.
간접 요오드화( 125 I/ 124 I/ 131 I/ 211 At ): 표지 전구체, N-숙신이미딜 p-(트리메틸스태닐)벤조에이트(SPMB)를 Orlova et al(Nucl Med Biol 27:827-835 (2000))에 따라 제조하였으며, 5㎍의 SPMB를 5% 아세트산 용액에 함유된 5 MBq의 125I 또는 211At에 첨가하였다. 반응을 시작하기 위해, 수용액에 함유된 40㎍의 클로라민-T(Sigma, St. Louis, Mo.)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 5분간 교반하고, 수용액에 함유된 80㎍의 소듐-메타-비설페이트(Aldrich, Steinheim, Germany)를 첨가하여 반응을 정지시켰다. 방사 표지된 전구체를 0.07M 보레이트 버퍼(pH 9.2)에 함유된 40㎍의 단백질 용액에 첨가하였다. 결합 반응을 연속 쉐이킹하면서 실온에서 45분간 수행하였다. 표지된 단백질 변이체들을 PBS로 평형된 NAPTM-5 크기 배제 컬럼(GE Healthcare)를 이용하여 저 분자량 산물로부터 분리하였다. 그 다음, 표지 공정이 이의 표적에 대한 바인딩 친화도에 영향을 미치지 않았음을 입증하기 위해, 방사 표지된 단백질 변이체를 IRMA 테스트(Evans et al, submitted to CBR) 분석하였다.
177 Lu 를 이용한 방사 표지: 이소티오시나네이트-벤질-CHX-A"-DTPA(130nM)의 단백질(60nM)과의 컨주게이션을 37℃ 워터 배스에서 220μL 0.7M 보레이트 버퍼(pH 9.2)에서 밤새 수행하였다. 컨주게이션된 CHX-단백질을 용리액으로서 0.2M 소듐 아세테이트 버퍼를 이용하여 NAP-5 크기 배제 컬럼(GE Healthcare, Uppsala, Sweden)에서 정제한 다음, 10 배치(batches)로 나누었으며, 이는 나중에 킬레이트화를 위해 사용하였다. 킬레이트화 시간은 온고잉 킬레이트화 공정을 샘플링하고, 0.2M 시트레이트 런닝 버퍼를 함유하는 인스탄트 박층 크로마토그래피(ITLC) SG 플래이트(Biodex)에서 킬레이트의 순도를 체크하여 최적화되었다. 플래이트는 Cyclone Phosphorimager(Perkin Elmer, Wellesley, MA, USA)에서 분석되었다. 킬레이트화는 실온에서 30분 후에 완료되는 것으로 발견되었다. 방사능 루티늄의 양은 개별 실험의 요구에 따라 달라졌다.
약하게 킬레이트된 177Lu의 존재에 대해 시험하기 위해, EDTA 챌린지를 수행하였다. 킬레이트된 산물의 삼중 샘플을 200:1 또는 1,000:1 몰 이상의 EDTA 대 킬레이터로 37℃에서 밤새 배양하여 챌린지하였다. EDTA 농도는 컨주게이션이 정량적인 가정에서 산출되었으며, 이에 따라 항체당 2개의 CHX-A-DTPA 분자의 평균값을 생성하였다. 그 다음, 용액의 샘플을 상술한 바와 같이 ITLC에 의해 분석하였다. 컨트롤로서, [177Lu]-단백질의 삼중 샘플을 또한 PBS에서 37℃ 또는 4℃에서 밤새 두었다.
실시예 5 - 생체내 안정성
방사 표지된 컨주게이트의 생체내 안정성을 분석하기 위해, 정상 마우스들에게 장사 표지를 주사하고, 여러 시점 후에 안락사시켰다. 그 다음, 혈액을 수집하여 5,000g에서 원심분리하였다. 그 다음, 혈액 샘플을 PBS로 평형된 NAP-5 컬럼(컷오프, 5 kDa)에서 분리하고, 고분자 분획에 존재하는 방사능의 상대적인 양을 검출하였다.
실시예 6 - 치료 효과를 모니터하기 위한 세포 생존율
세포들을 페트리 디쉬(직경 6cm, 약 2 x 105cells/dish)에 시딩하였다. 48시간 후, 방사표지된 단백질(57ng/dish, 또는 287ng/dish, 항원당 약 1:1 및 5:1 항체에 해당함)을 세포들에 첨가하였다. 배지에서 125/131I/177 Lu의 효과를 측정하기 위해, 일부 디쉬를 과량의 비표지된 단백질(29㎍/dish)로 예비배양하였다. 여분의 디쉬들은 세포당 붕괴(DPC)의 수를 측정하기 위해 사용되었다. 이러한 디쉬에서, 방사 표지된 단백질의 세포성 흡수율을 24-시간 배양 중에 6가지의 시점에서 측정하였다. 그 다음, 세포들을 차가운 무-혈청 배지로 6회 세정하고, 배양을 새 배지에서 계속하였다. 세포들을 약 일주일에 1회 카운팅하고, 2주에 한 번 재시딩하였다. DPC는 두 항체 농도에 대해서뿐만 아니라 블로킹된 디쉬에 대해서 흡수율 곡선하의 영역을 산출함으로써 측정되었다. 가장 낮은 방사 표지된 단백질 농도에 대해서, 세포들은 약 56 DPC를 받았으며, 가장 높은 방사 표지된 단백질 농도에 대해서는 약 150 DPC를 받았으며, 한편 블로킹된 세포들은 약 2 DPC를 받았다. 획득된 결과를 가중 인자로서 1/Y2를 사용하여 비선형 회귀(지수 성장)에 의해 분석하였다.
실시예 7 - 생체내 시험
하기 이종이식 모델이 사용되었다: LnCAP, DU145, PC-3 종양 모델. PSA는 3가지 세포주 모두에 의해 발현되나, hK2는 LnCAP에 의해 발현되고, DU145 또는 PC-3에서는 발현되지 않는다.
이종이식을 위해, 0.02% 트립신/PBS에 수거된, LnCAP, DU145 또는 PC-3 세포(2백만 내지 천만 세포)를 배지에 재부유하고, 동량의 Matrigen(BD Biosciences, Bedford, MA)을 함유하는 200ＢμL의 세포 서스펜션을 우측 옆구리에 sc 주사하였다. 종양 형성을 시각적으로 또는 촉진에 의해 모니터하였다.
블로킹 실험: 종양에서 방사 표지된 단백질의 흡수율이 hK2-특이적인지 아닌지를 확립하기 위해, 생물학적 분배 실험 I에서 블로킹 실험을 수행하였다. 방사 표지된 단백질의 주요 iv 주사 전에, 0.8-3.0mg의 비표지된 단백질을 블로킹된 마우스 그룹에 iv 주사하였다. 블로킹되지 않은 그룹과 블로킹된 그룹 사이의 주사 후 24-72시간에서 방사능의 흡수율을 비교하였다.
특이적 활성의 최적화: 본 실험은 종양 흡수율에 대한 특이적 활성의 영향(즉, 방사 표지된 컨주게이트의 주입된 단백질 투여량)을 검출하기 위해 수행되었다. 다양한 예비측정된 특이적 활성을 가진 일련의 177Lu-표지된 단백질을 준비하였다. 177Lu-표지된 단백질의 분액을 비표지된 단백질의 모액으로 희석하여 LnCAP-함유 마우스당 10-500㎍ 범위의 주사 투여량을 제공하였다. 주사 후 2-3일에, 동물들을 안락사시켰다. 장기 및 종양들을 절제하고 방사능 흡수율에 대해 측정하였다. 가장 최적의 종양 흡수율을 제공하는 특이적 활성은 선량 측정이 더욱 고려되었다.
선량 측정의 예: LnCAP-함유 마우스(4마리/그룹)에 177Lu-표지된 단백질을 주사하였다. 동물들을 주사 후 4 hpi 내지 2주에 안락사시켰다. 다양한 장기들에 대한 흡수된 투여량을 MIRD 스킴을 이용하여 산출하였다. 시간-활성 곡선을 체내(동물)에서 관심있는 모든 장기 조직에 대해 획득하였다. 본 시험은 SPECT 및/또는 PET로부터 정량적 이미징에 기초하였다. 곡선의 적분은 누적 활성을 제공한다. 산출된(흡수된 분획에 대한 특정 기하학 및 Monte Carlo 기술에 기초함) S 값에 기초한 MIRD 포말리즘을 이용하여, 이는 누적된 활성도를 흡수된 투여량으로 전환하는데 사용된다. 다수의 경우에, 교차 선량은 조심스럽게 산출되어야 하며, 이는 Monte Carlo 기초 선량 측정 산출이 수행됨을 의미한다(Hindorf, et al. (2004) J. Nuc. Med., 45:1960-1965; Larsson, et al. (2007) Cancer Biotherapy & Radiopharmaceuticals, 22:438-442; Larsson, et al. (2011) Acta Oncol ., 50:973-980).
SPECT 및 PET 이미징의 예: PET-CT 및 SPECT-CT 이미징은 방사성 핵종 치료의 구성 요소이다. 이는 조직내에서 방사능 물질이 축적되는 정도의 개념을 제공하며, 필요한 치료 투여량 및 이의 효과에 대한 추정값을 제공하는데 도움을 준다. 양호한 치료 결과를 위해, 충분한 방사선 투여량이 종양에 운반되어야 한다. 이는 투여 계획에 대해 상기 언급된 참고문헌에 기술되어 있는 바와 같이 이미징에 의해 확인되며, 이는 본 명세서에 참고문헌으로 편입된다.
방사선 생물학: 각각의 환자/실험실 동물 기하학에 기초한 특정 선량 측정 방법이 적절한 선량 측정을 위해 사용될 것이며, 생물학적 효과와 관련될 수 있으며, 방사선 생물학적 효과와의 상관 관계 가능성을 제공하며, 각 환자의 최적화된 치료를 위해 사용될 것이다.
실시예 8 - 바인딩 친화도의 검출
스캐차드 방법
생성된 항체 변이체의 바인딩 친화도(Kd)를 Scatchard, Ann N Y Acad Sci 51:660-72 (1949)에 따라 스캐차드 방법을 이용하여 검출하였다.
간략히, 고정된 농도의 항체(또는, 본 경우에, Fab 항체 프래그먼트) 및 변화 농도의 Eu3 +-표지된 PSA 트레이서를 사용하였다.
표면 플라즈몬 공명
또한, 항체 변이체의 바인딩 동역학 및 친화도를 Biacore instrument에서 실시간 생체특이적 상호작용 분석에 의해 검출하였다. 간략히, PSA 또는 hK2는 아민 결합에 의해 CM5 센서 칩에 고정되었으며, 고정화 수준은 1000-2000 반응 유닛에 달하였다. 다른 항-PSA 또는 항-hK2 항체 유도체(mAb 및 Fab 모두)를 HBS-EP 버퍼에서 0.1-10nM 범위의 농도로 희석하였다. 바인딩 동역학은 결합상(association phase)에서 5분 분리상(dissociation phase)에서 30분, 50μL/분의 흐름 속도로 조사한 다음, 재생하였다. 동역학 상수는 질량 트랜스퍼에 대한 보정으로 1:1 랭뮤어(Langmuir) 바인딩 모델을 이용하여 산출되었다.
실시예 9 - 면역방사계측 어세이( IRMA )
방사 표지된 mAb 또는 Fab의 바인딩 퀄리티에 대한 모노클로날 항체-기반 면역방사계측 어세이(IRMA)를 배양 사이의 세정 단계(세정 버퍼: 10mM Tris-HCL pH 8.0, 0.15M NaCl, 0.05% Tween 20)와 함께 4-단계 샌드위치 어세이로서 3회 시험하였다. 상기 어세이는 확립된 권고에 따라 구성 및 최적화되었다. 브레이크어파트 마이크로타이터 플래이트를 H117(0.2㎍/well), 모노클로날 항체 인식 프리 또는 토탈 PSA 및 동일한 친화도를 갖는 인간 칼리크레인 2(hK2)로 코팅하고, 코팅 버퍼(75mM 소듐 카보네이트 pH 9.6)에서 30배 희석하고, 4℃에서 밤새 배양하였다. 그 다음, 상기 웰들을 0.2㎍/well 퀀칭 버퍼(세정 버퍼에 함유된 3% 피쉬 젤라틴)로 실온에서 2시간 배양하였다. 그 다음, 상기 웰들을 3ng/μL fPSA를 함유하는 200㎕ 플라즈마(암컷)로 코팅하고, 실온에서 2시간 배양하였다. 방사 표지된 및 미표지된 PSA30을 그 다음 어세이 버퍼(50 mM Tris-HCl pH 7.5, 0.1 M NaCl, 5 mM EDTA, 0.25% BSA and 0.05% Tween 20)에서 내림차순 농도로 함께 혼합하고, 그 웰에 첨가하였다(총 용량: 50μL/well). 웰당 표지된 항체의 퍼센트는 다음과 같았다: 100, 92, 84, 68, 50, 30 및 0 퍼센트. 그 플래이트를 실온에서 2시간 동안 배양하고, 세정하고 Nal(TI)-웰 카운터(1282 Compugamma CS; LKB Wallac, Turku, Finland)에서 측정하였다. 이론적 편차값에 대해 25%미만의 검출 성능 차이가 추가 적용에 수용되었다. 표지 후 검출 퀄리티의 평가는 방사 표지된 항체가 미표지된 0 항체의 친화도/바인딩 성능의 70-90%를 유지한 것으로 나타났다.
실시예 10 - 전립선암 마우스 모델에서 177 Lu -m11B6을 이용한 방사면역 치료
전립선암은 서양에서 남성에게 가장 흔히 진단되는 암이며, 모든 새로운 암 케이스의 25%를 차지하며, 암의 사망률이 14%에 달한다(22700443). 현재의 치유력이 있는 치료 전략(수술 및 방사선)은 악성 종양이 전립선에 국소화된 경우에만 성공적이다. 파종성 질병의 경우에 치료 전략은 거세로 한정되며, 이는 호르몬이 부족한 환경에서도 내화성이 되기 전에 12-18개월간 성장을 억제할 뿐이다(Scher HI et al, Cancer of the prostate. In: DeVita VT Jr, Hellman S, Rosenberg SA, eds. 7th ed. Philadelphia, PA: Lippincott Williams & Wilkins; 2005). 일시적 반응 이상의 효과를 갖는 것으로 입증된 치료가 없기 때문에, 분자적으로 표적되는 새로운 치료가 시급히 요구된다. 전립선암은 방사선 민감성이기 때문에, 방사 면역치료에 이상적인 표적을 제시한다. 또한, 방사 면역치료는 전형적으로 암이 전형적으로 퍼지는 부위인 골수 및 림프절로 고수준의 항체 순환을 운반한다. 또한, 방사 면역치료는 "집중 공격 효과(cross-fire effect)"를 이용하며, 이는 선택된 방사성 아이소토프의 방출 파티클 범위에 따라 달라지며, 항체의 직접적인 바인딩 없이 주변의 항원-네거티브 방관자 세포들을 사멸시킬 수 있다(16029058).
인간 칼리크레인 2(hK2)는 건강한 전립선 조직 및 악성 종양 전립선 조직에서 매우 고농도로 단독 발현되는 안드로겐 유도 효소이다. hK2는 전립선 특이 항원(PSA)의 지모겐 형태를 분할하는 것으로 나타났기 때문에, 이의 생리학적 기능 중 하나는 그 효소의 조절자로서 작용하는 것으로 여겨진다. 이와 함께, 이러한 생물학적 특징은 치료진단 시스템(치료 및 진단)에서 hK2를 최적의 표적으로 만들어준다.
본 시험의 목적은 고 독성 방사성 핵종을 전립선암 성장 부위로 운반하는 비이클로서 hK2의 촉매 클레프트 내부의 에피토프를 특이적으로 표적하는 mAb인 11B6의 유용성을 확인하기 위한 것이다. 이러한 개념 연구의 증거로서, mAb를 감마 방출을 또한 이용하는 저 에너지 베타 파티클인 177Lu로 표지하는 것을 선택하였으며, 이는 SPECT-이미징이 수행가능하였다.
재료 및 방법
재료
177Lu는 Mallinkrodt Medical BV(Petten, Holland)로부터 구입하였다. 표직 동역학 및 방사 화학 순도를 측정하기 위해 CycloneTM Storage Phosphor System 및 OptiQuantTM 이미지 분석 소프트웨어(Perkin Elmer, Wellesley, MA, USA)를 사용하여 ITLC(istant thin layer chromatography) 스트립(Biodex, US)에서 방사능을 측정하였다. 모든 화학물질들은 Sigma Aldrich로부터 구입하였으며, 버퍼는 분석 등급수를 이용하여 내부에서 제조하였으며, 그렇지 않은 경우는 별도 기재하였다. mAb 11B6은 인간 칼리크레인 2에 대해 항체 특이적이며, 이러한 항원에 대해 약 1.2nM의 친화도를 갖는다. 상기 SEQ ID NOs: 4 및 5 참조(University of Turku, Finland로부터 구입함). 생체내 시험을 위해, hK2를 발현하는 전립선암 세포주 LNCaP(ATCC, Manassas, VA, USA)를 사용하였다. 세포들은 10% 소 태아 혈청 및 PEST(페니실린 100 IU/ml 및 100㎍/ml 스트렙토마이신)이 보충된 RPMI 1640 배지에서 배양되었다. 세포들을 5% CO2를 함유하는 가습 배양기에서 37℃에서 유지하였으며, 트립신-EDTA 용액(버퍼에 함유된 0.25% 트립신, 0.02% EDTA, Thermo Scientific)으로 분리되었다.
컨주게이션 및 방사 표지
CHX -A"- DTPA 와 11B6의 컨주게이션: PBS에 함유된 mAb 11B6의 용액을 0.07M 소듐 보레이트 버퍼를 이용하여 pH 9.2로 조절하였다. 샘플을 Amicon Ultra-2 원심분리 필터(2ml, 100K)에서 농축하였다. 그 단백질 용액을 킬레이터 CHX-A"-DTPA(Macrocyclics, USA)와 3:1의 몰비(킬레이터 대 항체)로 40℃에서 컨주게이션하였다. 반응은 4시간 후에 종료되었으며, CHX-A"-DTPA-11B6(이하, DTPA-11B6으로 칭함)를 20ml 0.2M 암모늄 아세테이트 버퍼(pH 5.5)로 평형된 NAP-5 컬럼(GE Healthcare)에서 크기-배제 크로마토그래피에 의해 프리 킬레이트로부터 분리하였다. 컨주게이션된 11B6 및 5A10을 1ml 암모늄 아세테이트 버퍼로 용출하였다.
DTPA -11B6의 방사 표지: 암모늄 아세테이트 버퍼(pH 5.5)에서 DTPA-11B6을 177LuCl3의 미리 결정된 양과 혼합하였다. 실온에서 2시간 배양한 후, 표지를 종료하고, PBS로 평형된 NAP-5 컬럼에서 정제하였다. 표지 효율 및 표지 동역학을 0.2M 시트르산으로 용출된 ITLC 스트립으로 모니터하였다. 이 시스템에서, 방사 표지된 컨주게이트는 본래 라인으로 유지되었으나, 프리 Lu-177은 용매의 앞부분으로 이동하였다. 방사능 분포는 정량 소프트웨어로서 Optiquant(Perkin Elmer, Wellesley, MA, USA)를 이용하여 PhosphorImager system(Perkin Elmer, Wellesley, MA, USA)으로 측정되었다.
표면 플라즈몬 공명
10mM NaAc-버퍼(pH 4.0)에 함유된 단백질 hk2(Department of Biotechnology, Turku, Finland)를 Biacore system에서 N-히드록시숙신이미드(NHS), 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필) 카보디이미드 하이드로클로라이드(EDC) 및 1M 에탄올아민 하이드로클로라이드-NaOH(pH 8.5)를 이용한 아미노 결합에 의해 Biacore로부터 구입한 CM4 연구 등급 칩상에 고정하였다. 상기 mAb 11B6, 이의 컨주게이트 DTPA-11B6 및 비특이적 레퍼런스 mAb로서 헤르셉틴(모두 Biacore 버퍼에 함유됨)을 5가지 다른 농도로(0.5nM, 5nm, 10nM, 50nM 및 100nM) 2개의 흐름 세포에 걸쳐 흐르게 하여 최종적인 바인딩을 검출하였다. 두 흐름 세포 중 하나는 고정된 hK2를 함유하였고, 다른 하나는 블랭크 레퍼런스이었다. 칩은 25mM 글리신 버퍼(pH 2.7)를 이용하여 재생되었다.
시험관내 안정성 시험
표지된 컨주게이트의 안정성을 PBS에서 그리고 과량의 EDTA, 500x 이상의 EDTA에서 시험한 다음, m11B6에 컨주게이션된 DTPA에서 시험하고, 1주 및 2주간 4℃에서 배양하고, 상술한 바와 같이 ITLC 스트립을 이용하여 분석하였다.
동물 시험
동물 실험은 실험실 동물 보호에 대한 국가적 법률에 따라 수행하였다. 동물 연구는 동물 연구를 위한 지방 윤리 위원회에 의해 승인되었다. Taconic Europe(Bomholt, Denmark)로부터 구입한 수컷 면역결핍 누드 마우스(NMRI)(6-8주령)를 본 시험에 사용하였다.
hK2-발현 LnCAP 전립선암세포의 이종이식을 우측 옆구리 및/또는 좌측 옆구리에 주사당 약 10x106 cells로 피하 이식하였다.
LNCaP 종양이 발달된 동물들을 그룹으로 나누고, 치료제 177Lu-DTP-11B6 또는 컨트롤로 주사하였다. 하기 표 1을 참조바란다:
동물들 그룹 번호 처리

5마리/그룹

11그룹

총 = 55마리




 1 NaCl(컨트롤)
2 177Lu로 표지된 비특이적 Ab - 저 흡수 투여량
3 177Lu로 표지된 비특이적 ab - 고 흡수 투여량
4 177Lu 단독 - 저 흡수 투여량
5 177Lu 단독 - 고 흡수 투여량
6 177Lu-DTPA-m11B6: A/4
7 177Lu-DTPA-m11B6: A/2
8 177Lu-DTPA-m11B6: A
9 177Lu-DTPA-m11B6:2*A
10 177Lu-DTPA-m11B6:3*A
11 m11B6 단독
A = 26.7 MBq
포함된 모든 동물들은 3-4일 간격으로 연속적으로 측정 및 무게를 재었다.
초기에 일부 동물들은 SPECT을 이용한 치료 제제의 국소화의 조사에 대해 177Lu-DTPA-11B6의 저 활성(8MBq)을 가졌다. 그룹 8의 한 마리를 또한 SPECT로 조사하였다. 이러한 동물들은 장기 제거되고 3-인치 Nal(TI) 디텍터가 장착된 자동화 Nal(TI) 웰-카운터(1480 WIZARD, Wallac Oy, Turku, Finland)를 가졌다.
골수에 대한 영향을 조사하기 위해, 혈액 샘플(10μL)을 정기적으로 취하였다. 혈액 샘플을 주사 후 8주간 일주일에 2회 수집하고, WBC 카운트, RBC 카운트 및 혈소판 카운트를 Medonic Cell Analyzer-Vet CA530 Vet(Boule Medical, Stockholm, Sweden)에서 분석하였다. 혈액 샘플링시에, 동물의 무게 및 신체적 컨디션을 모니터하였다. 체중 감소, 일반적 컨디션의 감소 및 혈액학적 독성에 대해 동물을 모니터하여 독성을 평가하였다.
종양 부피를 캘리퍼로 측정하였다. 길이 l, 폭 w 및 두께 t를 측정하고, 부피를 산출하였다.
약물 동태학
111In-m11B6의 생물 동역학 시험을 위해, 마우스에 꼬리 정맥에 방사성 핵종 표지된 25㎍ m11B6 항체를 주사하였다. 동물들을 일정 시간 간격으로 희생시켰다.
간략히, 마우스 mAb 11B6을 CHX-A"-DTPA와 컨주게이션하고, 111In으로 표지하여 111In-CHX-A"-DTPA-11B6(111In-DTPA-11B6)을 형성하였다. 생물학적 분배 시험을 hK2- 및 AR-양성(LNCaP) PCa 이종이식 모델에서 수행하였다. DU-145 이종이식(hK2 및 AR 음성)을 컨크롤로 사용하였다. 동물들, NMRI 누드 마우스를 지정된 시간 간격으로 안락사시키고, 해부하고, 장기 제거하여 활성도를 측정하였다. Micro-SPECT 이미징을 수행하였다. 종양들을 섹셔닝하고, 염색하고 오토래디오그래피를 수행하였다. 방사표지된 11B6의 흡수를 차단하기 위해, 111In-DTPA의 주사 전에, 일부 동물들에게 차가운 마우스 mAb 11B6을 주사하였다.
177Lu-m11B6의 생물 동역학을 111In-m11B6 시험에서와 같은 방식으로 획득하였다.
데이터 습득 및 선량 측정
다른 표적 장기에 대해 흡수된 투여량을 측정하기 위해, MIRD-스킴(1)을 마우스-특이 S-팩터와 함께 적용하였다. 111In-m11B6으로부터 상기 동역학 데이터로부터 붕괴수(누적 활성)를 유도하였다. 이중-지수 함수를 최소 자승 알고리즘에 의해 상기 데이터 포인트에 맞추고, 붕괴인자로 곱한 이들 표출의 적분으로서 붕괴수를 산출하였다. 골수에 대한 누적 활성도는 혈액법(2)에 기초하며, 여기서 적색 골수의 활성 농도는 혈액내 활성 농도와 비례하는 것으로 추정된다. 이러한 적색 골수 대 혈액 비(RMBLR)는 0.36(2)인 것으로 제시되었으며, 이는 또한 본 시험에 사용되었다.
마우스-특이 S-팩터를 검출하기 위해, MOBY의 버전(3) 팬텀을 사용하였으며, 여기서 장기 크기는 특정화될 수 있다. 동역학 시험으로부터 절개된 장기의 평균 중량을 평균 총 중량과 함께 특정화하였다. 그 다음 가요성 NURBS 표면의 렌더링은 스트레인-특이적 팬텀을 생성하였다. 상기 팬텀은 160*160*400 복셀(voxels)로 복셀화되었다. 정상 피부-표면 굴곡 외부이나, 피부-표면 굴곡에 수직인 스피어 반지름에 대해 단축 절반을 가지며, 스피어 반지름으로 되는 장축을 가진 타원체로서, 스피어의 재현에 의해 피하 종양을 좌측 옆구리에 부가하였다. 침샘 및 전립선은 상기 팬텀에 수동적으로 부가되었으며, 장기의 평균 중량과 상관성이 있는 반지름을 가진 스피어로서 나타났다.
그 다음, 팬텀은 앞선 수행(4)에서 기재한 바와 같이 MCNPX 2.6 코드를 가지고 177Lu 및 111In에 대한 S-팩터의 Monte Carlo 시뮬레이션을 위한 입력정보(인풋)으로 작용하였다.
치료 계획
90Y 및 177Lu를 이용한 방사 면역 치료를 받은 랫트에서 흡수된 투여량과 골수에 대한 생물학적 효과의 관계에 기초하여(Larsson et al., 2012, Med. Phys. 39(7):4434-43), 골수에 대한 LD50dms 12 Gy의 순서로 존재할 수 있는 것으로 추정될 수 있다. 문헌에서, 랫트 및 마우스의 급성 조사에 대한 LD50은 동일하게 약 9 Gy이다(예, Radiobiology for the radiologist, Hall & Giacca (Eds), 2006, 6th edition 참조).
그 다음, 치료는 골수에 대한 12 Gy의 허용되는 흡수 투여량의 추정으로부터 디자인되었다. 그 다음, 선량 측정 산출로부터, 이러한 흡수 투여량에 상응하는 활성도를 산출하였다. 치료 그룹은 그 다음 A/4, A/2, A, 2xA 및 3xA를 제공하는 것으로 디자인되었다. 이에 상응하는 활성도가 컨트롤에 대해 사용되었다.
결과
177 Lu - DTPA -m11B6의 방사 표지
도 16의 표지 동역학 결과는 표지 효능이 매우 높으며, 2시간 배양 후 90%에 이르렀음을 보여준다. 이는 컨주게이션되지 않은 177Lu의 작은 효과와 함께 뛰어난 치료 효과의 가능성을 확신시켜준다.
PBS 및 EDTA에서 시험관내 안정성 결과는 2주내 시간에 거의 변화가 없어 시간 경과에 따라 우수한 안정성을 나타낸다(도 17 참조). 또한, PBS와 EDTA 배양 사이에 차이가 나타나지 않았으며, 이는 장기 보유 및 순환 시간을 갖는 생체내 안정성을 확실히 나타내는 매우 우수한 컨주게이션 화학을 보여준다.
이미징
도 18의 SPECT 이미지는 이종이식된 (8MBq 주사된) 누드 마우스에서 177Lu-DTPA-m11B6의 분포를 보여준다.
도 18의 다른 이미지들은 표 2에 설명된 바와 같다.
컬럼 1 컬럼 2 컬럼 3 컬럼 4
S1:48h
S1:72h S2:72h S3:72h S11:72h DU 145
S1:168h S2:168h S8:168h 블로킹됨 S9:168h 블로킹됨
마우스 S1의 제1컬럼은 48, 72 및 168h 시간 pi에서 증가된 흡수율로 마우스 S1에서 종양에서의 우수한 흡수율을 나타낸다. 제2컬럼은 72 및 168h에서 동일한 고 종양 흡수율을 갖는 마우스 S2를 나타낸다. 3열의 컬럼 3은 종양 표적에 대해 m11B6의 특이성을 나타내는 냉 항체로 블로킹된 후에 168h pi에서 종양 흡수율을 갖지 않는 마우스 S8을 나타낸다. 유사한 결과가 컬럼 4, 3열의 마우스 S9에 대해 나타났다. 마지막으로, 컬럼 4, 2열의 마우스 S11은 m11B6 항체에 특이적이지 않은 세포주 DU 145의 종양에서 흡수율을 갖지 않음을 나타낸다.
이러한 결과는 m11B6의 고 특이성이 고 종양 축적을 이끄는 것을 입증한다.
생물학적 분배
111In-m11B6의 생물 동역학의 결과를 상기 실시예 2에 기술하였다. 종양 조직에서 48시간에 최대 16 %IA/g를 갖는 축적이 나타났으며; 침샘을 제외한 다른 모든 장기들은 활성도의 감소를 나타내었다(도 8 참조). 따라서, 고 종양 대 정상 장기 비가 획득되었으며, 이는 높은 치료 효과를 위한 전제 조건이다.
177Lu-m11B6(72h 및 168h에서)에 대한 생물학적 분배 데이터를 도 19에 나타내었다. 여기서, 111In-m11B6에 비해, 168h에서 거의 30 %IA/g로 상당히 보다 높은 활성도 축적을 볼 수 있다. 이는 또한 방사 표지된 11B6 항체를 이용한 고 치료 효과의 실행가능성을 분명히 보여준다.
72h pi에서 종양 세포주 DU-145를 함께 이용한 블로킹의 상세한 결과를 도 20에 나타내었다. 여기서, LnCaP 또는 DU-145를 갖는 마우스에서 상기 나타낸 SPECT 시험으로부터 177Lu-DTPA-m11B6의 분포 및 컨주게이션되지 않은 11B6의 사전 주사를 이용한 hK2 Ag 블로킹이 주어진다. 상세히 나타낸 바와 같이, 블로킹 및 종양 세포주 DU-145는 m11B6의 고 특이성을 나타내는 종양에서 흡수율을 나타내지 않는다.
선량 측정
도 21은 선량 측정 산출에 사용되는 111In-m11B6의 생물 동역학 시험 결과를 나타낸다. 복합 도면내의 각 그래프에서, 상부 점선은 단일 표준 편차로 동역학 시험의 결과를 나타내며, 입체 곡선은 조정된 이중 지수 함수이며, 하부 점 곡선은 111In의 붕괴가 간주된 경우이다. 하부 점 곡선 아래의 영역은 선량 측정 산출에 사용된 누적 활성도이다.
도 21에 나타낸 바와 같은 생물 동역학에 기초하여, 누적 활성도를 산출하였다. 111In S 값을 이용하여, 그 다음 활성도 유닛당 흡수 투여량(Gy/MBq)을 산출하였다. 하기 표 3에 111ln에 대한 결과가 주어진다.
동일한 생물 동역학이 177Lu-m11B6에 사용될 수 있다는 가정에 기초하여, 이에 상응하는 누적 활성도가 이의 물리적 반감기로 산출되었다. 177Lu에 대한 S-값을 이용한 경우에, 활성도 유닛당 흡수된 투여량을 산출하였다. 111In-m11B6에 대해 유사한 흡수율 값을 나타내는 177Lu-m11B6의 흡수율의 결과에 의해 유사한 생물 동역학의 추정이 정당화된다(도 8 및 19 참조).
111 In - 및 177 Lu -11B6을 이용한 치료로부터 흡수된 투여량( Gy / MBq )
장기 111In 177Lu
자가-투여량 총-투여량 자가-투여량 총-투여량
나머지 0.072 0.081 0.504 0.516
혈액 0.195 0.235 1.207 1.283
심장 0.076 0.133 0.442 0.622
폐 0.059 0.106 0.396 0.532
간 0.102 0.130 0.636 0.666
비장 0.082 0.115 0.670 0.716
위장관 0.041 0.073 0.246 0.298
신장 0.088 0.122 0.491 0.525
갑상선 0.001 0.041 0.006 0.094
뼈 0.020 0.086 0.131 0.267
뇌 0.003 0.025 0.017 0.039
전립선 0.036 0.075 0.236 0.295
고환 0.031 0.061 0.246 0.294
침샘 0.223 0.249 1.885 1.926
종양 0.294 0.312 2.236 2.252
골수 0.063 0.092 0.386 0.452
골수의 12Gy의 LD50에 기초하여, 26.7 MBq의 투여량이 주사될 수 있다. 이는 60Gy의 종양에 대한 흡수된 투여량을 의미한다.
(111-In-m11B6 동역학이 177Lu-m11B6에 대해 동일한 것으로 가정하여) 종양 흡수된 투여량을 재산출하고, 72h pi에서(16 %IA/에서 20 %IA/g으로) 및 168 pi에서(15 %IA/g에서 28 %IA/g) 흡수율 값 변화는 하기 표 4에 주어진 바와 같은 흡수 투여량을 형성하였다. 종양에 대한 흡수 투여량은 60Gy에서 120Gy로 증가하는 것을 나타냄을 알 수 있다.
장기 자가-투여량 총 흡수 투여량
나머지 0.494456 0.507415
혈액 1.20655 1.23288
심장 0.441901 0.621222
폐 0.396110 0.530831
간 0.636344 0.665149
비장 0.669825 0.715375
위장관 0.245824 0.297540
신장 0.490722 0.524355
갑상선 0.00649596 0.0923319
뼈 0.131186 0.266107
뇌 0.0170275 0.0386855
전립선 0.236380 0.293902
고환 0.246161 0.293579
침샘 1.88491 1.92563
종양 4.48777 4.50278
골수 0.386496 0.451228
상기 선량 측정 산출은 적절한 선량 측정 모델에 기초한 것이며; 생물 동역학은 치료학적 흡수 투여량이 골수 독성에 안전한 한계내에서 종양으로 운반될 수 있음을 보여준다.
동물 종양 수축
도 22는 마우스 한 마리에서 종양(동물의 옆구리에서 가시적인, 피부아래의)이 치료 후 부피가 얼마나 감소되는지 보여준다.
방사 면역 치료 결과
도 23은 투여된 활성도를 갖는 시험 그룹 (a) D, (b) 2 x D 및 (c) 컨트롤 그룹(여기서 D = 26.7 MBq)에 대한 결과를 보여준다.
두 처리 그룹 모두에서 종양 부피의 분명한 감소 경향이 있다. 종양 수축의 시작은 177Lu-m11B6의 주사 후 며칠에 이미 나타났다. 컨트롤 그룹에서는 Nal 용액의 주사 후 종양 부피의 증가가 있었다.
도 24 (a)는 활성도 A로 주사된 그룹에서 마우스 한 마리에 대한 결과를 보여준다. 여기서, 177Lu-m11B6의 활성도 A가 투여된 경우에 종양은 1일부터 6일까지 안정되게 성장하였다. 치료 후, 종양 부피의 신속한 저하가 관찰되었다.
SPECT 시험에서(8d pi), 종양 부피는 활성도가 존재할 때까지 나타났다. 도 24 (b) 참조.
결론
예시적인 항체 177Lu-m11B6을 이용한 본 시험은 생체내에서 전립선암 종양에 대한 치료 효과를 분명히 입증한다.
특정 선량 측정 모델 및 생체내에서 측정된 생물 동역학에 기초한 이론적 산출 모두는 높은 치료율을 제공하는 호의적인 선량 측정을 보여준다. 그 다음, 신속한 종양 부피 수축을 나타내는 우수한 치료 결과가 동물 시험에서 입증되었다.
참고문헌
Figure pct00020
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Val Asn Thr Asp 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Ala Leu Ile 35 40 45 Phe Ser Thr Ser Tyr Arg Ser Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Thr Asn Val Gln Ser 65 70 75 80 Glu Asp Leu Ala Glu Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Ser Asn Tyr Pro Leu 85 90 95 Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Val Asp Leu Asn 100 105 <210> 3 <211> 261 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 Met Trp Asp Leu Val Leu Ser Ile Ala Leu Ser Val Gly Cys Thr Gly 1 5 10 15 Ala Val Pro Leu Ile Gln Ser Arg Ile Val Gly Gly Trp Glu Cys Glu 20 25 30 Lys His Ser Gln Pro Trp Gln Val Ala Val Tyr Ser His Gly Trp Ala 35 40 45 His Cys Gly Gly Val Leu Val His Pro Gln Trp Val Leu Thr Ala Ala 50 55 60 His Cys Leu Lys Lys Asn Ser Gln Val Trp Leu Gly Arg His Asn Leu 65 70 75 80 Phe Glu Pro Glu Asp Thr Gly Gln Arg Val Pro Val Ser His Ser Phe 85 90 95 Pro His Pro Leu Tyr Asn Met Ser Leu Leu Lys His Gln Ser Leu Arg 100 105 110 Pro Asp Glu Asp Ser Ser His Asp Leu Met Leu Leu Arg Leu Ser Glu 115 120 125 Pro Ala Lys Ile Thr Asp Val Val Lys Val Leu Gly Leu Pro Thr Gln 130 135 140 Glu Pro Ala Leu Gly Thr Thr Cys Tyr Ala Ser Gly Trp Gly Ser Ile 145 150 155 160 Glu Pro Glu Glu Phe Leu Arg Pro Arg Ser Leu Gln Cys Val Ser Leu 165 170 175 His Leu Leu Ser Asn Asp Met Cys Ala Arg Ala Tyr Ser Glu Lys Val 180 185 190 Thr Glu Phe Met Leu Cys Ala Gly Leu Trp Thr Gly Gly Lys Asp Thr 195 200 205 Cys Gly Gly Asp Ser Gly Gly Pro Leu Val Cys Asn Gly Val Leu Gln 210 215 220 Gly Ile Thr Ser Trp Gly Pro Glu Pro Cys Ala Leu Pro Glu Lys Pro 225 230 235 240 Ala Val Tyr Thr Lys Val Val His Tyr Arg Lys Trp Ile Lys Asp Thr 245 250 255 Ile Ala Ala Asn Pro 260 <210> 4 <211> 117 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 11B6 Heavy chain <400> 4 Asp Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln 1 5 10 15 Ser Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Thr Gly Asn Ser Ile Thr Ser Asp 20 25 30 Tyr Ala Trp Asn Trp Ile Arg Gln Phe Pro Gly Asn Arg Leu Glu Trp 35 40 45 Met Gly Tyr Ile Ser Tyr Ser Gly Ser Thr Thr Tyr Ser Pro Ser Leu 50 55 60 Lys Ser Arg Phe Ser Ile Thr Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Phe 65 70 75 80 Leu Gln Leu Asn Ser Val Thr Pro Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys 85 90 95 Ala Thr Gly Tyr Tyr Tyr Gly Ser Gly Phe Trp Gly Gln Gly Thr Leu 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 5 <211> 111 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 11B6 Light chain <400> 5 Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Glu Tyr Phe 20 25 30 Gly Thr Ser Leu Met His Trp Tyr Arg Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro 35 40 45 Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Asn Val Glu Ser Gly Val Pro Ala 50 55 60 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Ser Leu Asn Ile Gln 65 70 75 80 Pro Val Glu Glu Asp Asp Phe Ser Met Tyr Phe Cys Gln Gln Thr Arg 85 90 95 Lys Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 6 <211> 13 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 6 Cys His Ser Ala Cys Ser Lys His Cys Phe Val Tyr Cys 1 5 10 <210> 7 <211> 13 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 7 Cys His Ser Ala Cys Ser Lys His Cys Phe Val His Cys 1 5 10 <210> 8 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 8 Cys Lys Ser Met Asp Gly Gly Trp Thr Cys 1 5 10 <210> 9 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 9 Cys Pro Ser Val Asp Gly Gly Trp Thr Cys 1 5 10 <210> 10 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 10 Cys Gly Pro Gly Ile Asp Ser Trp Val Cys 1 5 10 <210> 11 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 11 Cys Thr Trp His Trp Ser Pro Glu Glu Cys 1 5 10 <210> 12 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 12 Cys Pro Ala Asp Phe Glu Phe Leu Cys 1 5 <210> 13 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 13 Cys His Pro Tyr Lys Val Gly Cys 1 5 <210> 14 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 14 Cys Asp Tyr Met Pro Leu Val Asp Asn Cys 1 5 10 <210> 15 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 15 Cys Lys Ser Trp Gly Ser Ser Arg Cys 1 5 <210> 16 <211> 237 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 16 Ile Val Gly Gly Trp Glu Cys Glu Lys His Ser Gln Pro Trp Gln Val 1 5 10 15 Leu Val Ala Ser Arg Gly Arg Ala Val Cys Gly Gly Val Leu Val His 20 25 30 Pro Gln Trp Val Leu Thr Ala Ala His Cys Ile Arg Asn Lys Ser Val 35 40 45 Ile Leu Leu Gly Arg His Ser Leu Phe His Pro Glu Asp Thr Gly Gln 50 55 60 Val Phe Gln Val Ser His Ser Phe Pro His Pro Leu Tyr Asp Met Ser 65 70 75 80 Leu Leu Lys Asn Arg Phe Leu Arg Pro Gly Asp Asp Ser Ser His Asp 85 90 95 Leu Met Leu Leu Arg Leu Ser Glu Pro Ala Glu Leu Thr Asp Ala Val 100 105 110 Lys Val Met Asp Leu Pro Thr Gln Glu Pro Ala Leu Gly Thr Thr Cys 115 120 125 Tyr Ala Ser Gly Trp Gly Ser Ile Glu Pro Glu Glu Phe Leu Thr Pro 130 135 140 Lys Lys Leu Gln Cys Val Asp Leu His Val Ile Ser Asn Asp Val Cys 145 150 155 160 Ala Gln Val His Pro Gln Lys Val Thr Lys Phe Met Leu Cys Ala Gly 165 170 175 Arg Trp Thr Gly Gly Lys Ser Thr Cys Ser Gly Asp Ser Gly Gly Pro 180 185 190 Leu Val Cys Asn Gly Val Leu Gln Gly Ile Thr Ser Trp Gly Ser Glu 195 200 205 Pro Cys Ala Leu Pro Glu Arg Pro Ser Leu Tyr Thr Lys Val Val His 210 215 220 Tyr Arg Lys Trp Ile Lys Asp Thr Ile Val Ala Asn Pro 225 230 235

Claims (56)

  1. 전립선암의 치료에 사용되는 칼리크레인 단백질에 특이성을 갖는 바인딩부를 포함하거나 이로 구성되는 제제.
  2. 전립선암의 치료를 위한 약제의 제조에 사용되는, 칼리크레인 단백질에 특이성을 갖는 바인딩부를 포함하거나 이로 구성되는 제제의 용도.
  3. 칼리크레인 단백질에 특이성을 갖는 바인딩부를 포함하거나 이로 구성되는 제제의 치료 유효량을 투여하는 단계를 포함하는, 환자에서 전립선암의 치료방법.
  4. 제1항의 제제, 제2항의 용도 또는 제3항의 방법에 있어서,
    상기 바인딩부는 항체 또는 이의 항원-바인딩 프래그먼트인, 제제, 용도 또는 방법.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 바인딩부는 인간 칼리크레인 단백질에 대한 특이성을 갖는, 제제, 용도 또는 방법.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 바인딩부는 전립선-특이 항원(PSA; hk3, 인간 칼리크레인 유전자 3) 및 인간 선(human glandular) 칼리크레인(hK2)으로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 칼리크레인에 특이성을 갖는, 제제, 용도 또는 방법.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 바인딩부는 PSA에 대해 특이성을 갖는, 제제, 용도 또는 방법.
  8. 제7항에 있어서,
    상기 바인딩부는 PSA의 프리(즉, 비-복합) 아이소폼에 대해 특이성을 갖는, 제제, 용도 또는 방법.
  9. 제8항에 있어서,
    상기 바인딩부는 PSA의 프리 아이소폼에 노출되나, PSA의 복합 아이소폼에는 노출되지 않는 에피토프에 대해 특이성을 갖는, 제제, 용도 또는 방법.
  10. 제9항에 있어서,
    PSA의 프리 아이소폼에 노출되나, PSA의 복합 아이소폼에는 노출되지 않는 상기 에피토프는 배좌(즉, 비-선형) 에피토프인, 제제, 용도 또는 방법.
  11. 제10항에 있어서,
    상기 배좌 에피토프는 PSA의 촉매 클레프트를 감싸는 칼리크레인-루프의 일부인 아미노산 잔기로부터 형성되며, His41, Asn96 및 Ser189의 활성 사이트 트리아드(active site triad)를 포함할 수 있는, 제제, 용도 또는 방법.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 바인딩부는 PSA30, 4D4, 5C3 및 5A10으로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 항체 및 이의 항원-바인딩 프래그먼트와 PSA에 대한 바인딩에 대해 경합하는, 제제, 용도 또는 방법.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 바인딩부는 PSA30, 4D4, 5C3 및 5A10으로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 항체의 하나 이상의 상보 결정 부위(CDRs)를 포함하는, 제제, 용도 또는 방법.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 바인딩부는 PSA30, 4D4, 5C3 및 5A10로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 항체, 및 이의 항원-바인딩 프래그먼트를 포함하거나 이로 구성되는, 제제, 용도 또는 방법.
  15. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 바인딩부는 인간 선 칼리크레인(hK2)에 대해 특이성을 갖는, 제제, 용도 또는 방법.
  16. 제15항에 있어서,
    상기 바인딩부는 11B6 및 7G1으로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 항체와 hK2에 대한 바인딩에 대해 경합하는, 제제, 용도 또는 방법.
  17. 제15항 또는 제16항에 있어서,
    상기 바인딩부는 11B6 및 7G1으로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 항체의 하나 이상의 상보 결정 부위(CDRs)를 포함하는, 제제, 용도 또는 방법.
  18. 제15항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 바인딩부는 11B6 및 7G1으로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 항체 및 이의 항원-바인딩 프래그먼트를 포함하거나 이로 구성되는, 제제, 용도 또는 방법.
  19. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 제제는 세포독성부와 같은 치료부를 더 포함하는, 제제, 용도 또는 방법.
  20. 제19항에 있어서,
    상기 제제는 상기 치료부에 직접 또는 간접적으로 연결되는 바인딩부를 포함하는, 제제, 용도 또는 방법.
  21. 제19항 또는 제20항에 있어서,
    상기 제제는 바인딩부 단독의 종양 흡수 특성과 실질적으로 동등한 종양 흡수 특성을 나타내는, 제제, 용도 또는 방법.
  22. 제19항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 치료부는 하나 이상의 방사성 동위 원소를 포함하거나 이로 구성되는 세포독성부인, 제제, 용도 또는 방법.
  23. 제22항에 있어서,
    상기 하나 이상의 방사성 동위 원소는 베타-에미터, 아우거(Auger)-에미터, 컨버전 전자-에미터, 알파-에미터 및 저 광자 에너지-에미터로 구성되는 그룹으로부터 각각 독립적으로 선택되는, 제제, 용도 또는 방법.
  24. 제22항 또는 제23항에 있어서,
    하나 이상의 방사성 동위 원소는 상기 제제의 부근에 고 투여량 흡수를 생성하는 국소 흡수된 에너지의 방출 패턴을 각각 독립적으로 갖는, 제제, 용도 또는 방법.
  25. 제22항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서,
    하나 이상의 방사성 동위 원소는 90Y, 32P, 186Re; 166Ho, 76As/77As, 89Sr, 153Sm와 같은 장거리 베타-에미터; 131I, 177Lu, 67Cu, 161Tb, 105Rh와 같은 중거리 베타-에미터; 45Ca 또는 35S와 같은 저-에너지 베타-에미터; 51Cr, 67Ga, 99Tcm, 111In, 114mIn, 123I, 125I, 201Tl와 같은 컨버전 또는 아우거(Auger)-에미터; 및 212Bi, 213Bi, 223Ac, 225Ac, 212Pb, 255Fm, 223Ra, 149Tb 및 221At와 같은 알파-에미터로 구성되는 그룹으로부터 각각 독립적으로 선택되는, 제제, 용도 또는 방법.
  26. 제19항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 치료부는 하나 이상의 세포독성 약물을 포함하거나 이로 구성되는 세포독성부인, 제제, 용도 또는 방법.
  27. 제26항에 있어서,
    상기 하나 이상의 치료부는 세포분열 증식 억제 약물; 항-안드로겐 약물; 코르티손 및 이의 유도체; 포스포네이트; 테스토스테론-5-α-환원효소 인히비터; 보론 어덴드(boron addend); 사이토카인; 탭시가긴(thapsigargin) 및 이의 대사물; 독소(사포린 또는 칼리키아미신과 같은); 화학 요법제(안티메타볼라이트와 같은); 또는 전립선 암종의 치료에 유용한 어느 다른 세포독성 약물로 구성되는 그룹으로부터 각각 독립적으로 선택되는, 제제, 용도 또는 방법.
  28. 제19항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 치료부는 광자 활성화 치료, 중성자 활성화 치료, 중성자 유도 아우거(Auger) 전자 치료, 싱크로트론 방사 치료 또는 저 에너지 X-선 광자 활성화 치료와 같은 활성화 치료에 사용하기에 적절한 하나 이상의 부를 포함하거나 이로 구성되는, 제제, 용도 또는 방법.
  29. 제1항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 제제는 검출가능부를 더 포함하는, 제제, 용도 또는 방법.
  30. 제29항에 있어서,
    상기 검출가능부는 방사성 동위원소를 포함하거나 이로 구성되는, 제제, 용도 또는 방법.
  31. 제30항에 있어서,
    상기 검출가능부는 테크네튬-99m; 인듐-111; 갈륨-67; 갈륨-68; 아르세닉-72; 지르코늄-89; 요오드-125; 탈륨-201로 구성되는 그룹으로부터 선택된 방사성 동위원소를 포함하거나 이로 구성되는, 제제, 용도 또는 방법.
  32. 제30항 또는 제31항에 있어서,
    상기 제제는 86Y/90Y 또는 124I/211At와 같은 한 쌍의 검출가능하고 세포독성적인 방사성 핵종을 포함하는, 제제, 용도 또는 방법.
  33. 제30항에 있어서,
    상기 방사성 동위원소는 검출가능부로서 그리고 또한 세폭독성부로서 다중-모드 방식으로 동시에 작용할 수 있는, 제제, 용도 또는 방법.
  34. 제29항에 있어서,
    상기 검출가능부는 상자성(paramagnetic) 동위원소를 포함하거나 이로 구성되는, 제제, 용도 또는 방법.
  35. 제34항에 있어서,
    상기 상자성 동위원소는 가돌리늄-157; 망간-55, 디스프로슘-162, 크롬-52; 철-56으로 구성되는 그룹으로부터 선택되는, 제제, 용도 또는 방법.
  36. 제30항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 검출가능부는 SPECT, PET, MRI, 광학 또는 초음파 이미징과 같은 이미징 기술에 의해 검출가능한, 제제, 용도 또는 방법.
  37. 제1항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 제제는 상기 제제의 생체내 반감기를 증가시키는 부를 더 포함하는, 제제, 용도 또는 방법.
  38. 제37항에 있어서,
    생체내 반감기를 증가시키는 부는 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 인간 혈청 알부민, 글리코실화기, 지방산 및 덱스트란으로 구성되는 그룹으로부터 선택되는, 제제, 용도 또는 방법.
  39. 제1항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서,
    치료될 전립선암은 비국소화된(즉, 파종성) 전립선암인, 제제, 용도 또는 방법.
  40. 제1항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서,
    치료될 전립선암은 전이성 전립선암, 선택적으로 미소 전이성 전립선암인, 제제, 용도 또는 방법.
  41. 제40항에 있어서,
    치료될 전이성 전립선암은 림프계의 전이; 뼈(스파인, 척추, 골반, 갈비 포함)의 전이; 골반, 직장, 방광, 요도내의 전이인, 제제, 용도 또는 방법.
  42. 제1항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서,
    환자는 전립선암을 가지며, 전립선암의 진단시 및/또는 치료시에 70, 65, 60, 55, 50, 45, 40세 이하인, 제제, 용도 또는 방법.
  43. 제1항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서,
    환자는 아버지 또는 형제와 같은 가족원이 이전에 전립선암으로 진단받은 적인 있는 것을 특징으로 하는, 제제, 용도 또는 방법.
  44. 제1항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서,
    치료될 전립선암은 거세 저항성 전립선암(castration-resistant prostate cancer)(CRPC)인, 제제, 용도 또는 방법.
  45. 칼리크레인 단백질에 특이성을 갖는 바인딩부 및 제1항 내지 제44항에 정의된, 즉, 전립선암의 치료에 적절한 치료부를 포함하는 치료제.
  46. 제1항 내지 제45항 중 어느 한 항에 정의된 제제의 치료 유효량 및 약학적으로-허용되는 희석제, 담체 또는 부형제를 포함하는 약학 조성물.
  47. 제46항에 있어서, 비경구, 정맥내, 피하, 근육내 운반 또는 주사에 의한 운반용으로 조정된 약학 조성물.
  48. 제1항 내지 제45항 중 어느 한 항에 정의된 제제 또는 제46항 또는 제47항에 정의된 약학 조성물을 포함하는 키트.
  49. 칼리크레인 단백질에 특이성을 갖는 바인딩부(예, 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 의해 정의된) 및 검출가능부(예, 제29항 내지 제36항 중 어느 한 항에 의해 정의된)를 포함하거나 이로 구성되며, 무선 유도 수술(RadioGuided Surgery)과 같은 수술 전, 또는 중에 전립선암을 가진 환자에게 투여함으로써 약제로 사용되는 제제.
  50. 무선 유도 수술(RadioGuided Surgery)과 같은 수술 전, 또는 중에 전립선암을 가진 환자에게 투여하기 위한 약제의 제조에 사용되는, 칼리크레인 단백질에 특이성을 갖는 바인딩부(예, 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 의해 정의된) 및 검출가능부(예, 제29항 내지 제36항 중 어느 한 항에 의해 정의된)를 포함하거나 이로 구성되는 제제의 용도.
  51. 칼리크레인 단백질에 특이성을 갖는 바인딩부(예, 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 의해 정의된) 및 검출가능부(예, 제29항 내지 제36항 중 어느 한 항에 의해 정의된)를 포함하거나 이로 구성되는 제제의 유효량을 수술 전 또는 중에 전립선암을 가진 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, 전립선암을 가진 환자에서 수행되는 무선 유도 수술과 같은 수술법.
  52. 상세한 설명을 참조로 실질적으로 본 명세서에 기재된 바와 같은 약제에 사용되는 제제.
  53. 상세한 설명을 참조로 실질적으로 본 명세서에 기재된 바와 같은 약학 조성물.
  54. 상세한 설명을 참조로 실질적으로 본 명세서에 기재된 바와 같은 제제의 용도.
  55. 상세한 설명을 참조로 실질적으로 본 명세서에 기재된 바와 같은 치료 방법.
  56. 상세한 설명을 참조로 실질적으로 본 명세서에 정의된 키트.
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