BR122022010169B1 - Agentes terapêuticos para uso no tratamento de câncer de próstata e composição farmacêutica - Google Patents

Abstract

A presente invenção fornece um agente que compreende ou consiste de uma porção de ligação com especificidade para uma proteína de calicreína (por exemplo, PSA ou hK2) para utilização no tratamento do câncer da próstata, e um método para o tratamento do câncer da próstata em um paciente, o método que compreende a etapa de administrar uma quantidade terapeuticamente eficaz de um agente que compreende ou consiste de uma porção de ligação com especificidade para uma proteína calicreína ao paciente.

Description

Campo da Invenção

[0001] Esta invenção se refere, de uma forma geral, ao campo de métodos e agentes terapêuticos, particularmente, no campo do câncer da próstata.

Antecedentes da Invenção

[0002] A listagem ou discussão de um documento aparentemente- publicado antes no presente relatório descritivo não deve ser necessariamente tomada como um reconhecimento de que o documento faz parte do estado da arte ou de conhecimento geral comum.

[0003] O câncer de próstata é no presente momento a forma mais comum de câncer entre os homens. A próstata é uma glândula do tamanho de uma noz em homens que produz o líquido que é um componente de sêmen. A próstata tem dois, ou mais, lobos, ou seções, fechado por uma camada exterior de tecido. A próstata está localizada na frente do reto e logo abaixo da bexiga urinária, e envolve a uretra.

[0004] A ocorrência de câncer de próstata é maior na parte noroeste da Europa e nos Estados Unidos. O crescimento do tumor é geralmente um processo que tem lugar durante um longo período de tempo. O câncer de próstata é normalmente uma forma leve de câncer. Na verdade, a maioria dos homens diagnosticados com câncer da próstata sobrevivem, e apenas uma minoria dos homens encontra uma forma mais agressiva do câncer da próstata, que forma metástases em uma fase precoce. Essa forma de câncer de próstata só pode ser curável se for diagnosticado em um estágio inicial, antes que o câncer se espalhe para tecidos extracap- sulares.

[0005] Hoje o diagnóstico e monitoração do câncer da próstata po- dem ser realizados através da medição da concentração de um antígeno específico da próstata (PSA), no sangue do paciente. Se a concentração de PSA é marcadamente elevada em várias medições consecutivas, realizados em diferentes pontos do tempo, a avaliação é de que existe uma probabilidade de câncer da próstata. Neste ponto de tempo, uma biopsia pode ser realizada para verificar a câncer da próstata.

[0006] PSA (também conhecido como calicreína III) é uma proteína, constituída por uma única cadeia de 237 aminoácidos, que é produzido nas células secretoras da próstata. Estas células secretoras podem ser encontradas em toda a glândula da próstata. PSA é bem estabelecida e exaustivamente pesquisadoa como marcador em indivíduos de câncer de próstata. Por comparação com as células saudáveis a produção de PSA é inferior em células malignas e maior em células hiperplásicas. Por con-seguinte, contrariando-se que, de fato, a concentração de PSA no sangue é maior em homens que sofrem de câncer da próstata. No entanto, uma explicação pode ser que as células malignas têm uma estrutura de célula deteriorada, e são, portanto, mais permeável ao PSA.

[0007] Outra importante protease serina, o que pode ser adequado para uma futura terapia de câncer da próstata é a calicreína glandular humana 2 (hK2). O gene de codificação de hK2 situa-se no cromossoma 19, juntamente com o gene que codifica para a PSA. hK2 é expressa principalmente no tecido da próstata, tal como PSA. Na próstata, o PSA está presente como uma forma pro inativa e é ativada através da ação de peptidase de hK2. Pesquisa imuno-histoquímica relativamente a hK2 revelou que a hK2 é expressa ao nível de diferenciação. Isto significa que a hK2 é expressa com um rendimento mais elevado em tecidos de baixa diferenciação, tal como o tecido submetido a câncer da próstata, e com um rendimento inferior em tecido de alta diferenciação, tal como o tecido submetido a hiperplasia prostática benigna (BPH), que é um outro comum problema da próstata.

[0008] Terapias atuais de câncer de próstata são a cirurgia (por exemplo, prostatectomia radical), radioterapia (incluindo, braquiterapia e radioterapia externa, intensidadede de alta ultrassom focalizado (HIFU), quimioterapia, os medicamentos quimioterápicos orais, criocirurgia (congelamento do tumor), a terapia hormonal (tal como, a terapia anti- androgênio), castração ou combinações dos anteriores.

[0009] A maior parte destas terapêuticas (cirurgia e terapia de radiação externa) são, no entanto, somente (ou predominantemente) útil para o tratamento de tumores primários e de metástases de grandes dimensões. A quimioterapia é utilizada para disseminada do câncer, mas para a maioria destes pacientes, que é um efeito paliativo e / ou sobrevivência prolongada. Outras modalidades de tratamento ou complementares são, portanto, necessárias para alcançar melhorias consideráveis das doenças malignas disseminadas, nomeadamente, em casos de micrometásta- ses.

[0010] Terapia, tais como a imunoterapia ou radioimunoterapia, usando moléculas de direcionamento, tais como anticorpos e fragmentos poderia dar a possibilidade da terapia de doença disseminada.

[0011] Assim, existe uma necessidade de novos agentes terapêuticos e métodos para o tratamento do câncer da próstata, em particular, em casos de doença disseminada, metástases e micrometástases.

Sumario da Invenção

[0012] Por conseguinte, a presente invenção visa mitigar, aliviar ou eliminar uma ou mais das deficiências acima identificadas no estado da técnica e desvantagens isoladamente ou em qualquer combinação e resolver, pelo menos, os problemas acima mencionados, fornecendo um método de terapia, de acordo com as reivindicações anexas da patente.

[0013] Um primeiro aspecto, a presente invenção proporciona um agente que compreende ou consiste de uma porção de ligação com especificidade para uma proteína calicreína para uso no tratamento do cân- cer da próstata.

[0014] Para colocar de outra forma, o primeiro aspecto da presente invenção relaciona-se com o uso de um agente compreendendo ou consistindo de uma porção de ligação com especificidade para uma proteína calicreína na fabricação de um medicamento para o tratamento de câncer da próstata.

[0015] Por conseguinte, o primeiro aspecto também proporciona um método para o tratamento de câncer da próstata em um paciente, o método compreendendo a etapa de administrar uma quantidade terapeuti- camente eficaz de um agente que compreende ou consiste de uma porção de ligação com especificidade para uma proteína de calicreína.

[0016] Por "porção de ligação" que incluem todos os tipos de entidade química (por exemplo, oligonnucleotídeos, polipeptídeos, polinucleotí- deo, e compostos peptidomiméticos pequenos) que são capazes de se ligar especificamente a uma proteína de calicreína. Vantajosamente, a porção de ligação é capaz de se ligar seletivamente (isto é, de preferência) a uma proteína de calicreína sob condições fisiológicas.

[0017] Como indicado acima, os agentes da invenção podem compreender ou consistir em qualquer entidade química adequada que constitui uma porção de ligação com especificidade para uma proteína de ca- licreína.

[0018] Métodos adequados para a detecção de interacções entre uma entidade química de ensaio e uma proteína de calicreína são bem conhecidos no estado da técnica. Por exemplo, métodos de ultrafiltração com espectroscopia de pulverização de massa iônica / HPLC ou outros métodos físicos e analíticos podem ser utilizados. Além disso, pode ser utilizado método de transferência ressonante de energia por fluorescência (FRET), em que a ligação de duas entidades de marcação fluorescente pode ser medida através da medição da interação dos marcadores fluorescentes, quando em estreita proximidade uns dos outros.

[0019] Os métodos alternativos de detecção da ligação de uma proteína de calicreína de macromoléculas, por exemplo, DNA, RNA, proteínas e fosfolipídeos, incluem um ensaio de ressonância de plasmon de superfície, por exemplo, como descrito em Plant et al., 1995, Analyt Biochem 226 (2), 342 -348. Tais métodos podem fazer uso de um polipeptídeo que é marcado, por exemplo, com um marcador radioativo ou fluorescente.

[0020] Um outro método de identificação de uma entidade química que é capaz de se ligar a uma proteína calicreína é aquele em que a proteína é exposta a calicreína do composto e de qualquer ligação do composto à referida proteína calicreína é detectado e / ou medida. A constante de ligação para a ligação do composto à proteína da calicreína pode ser determinada. Os métodos adequados para a detecção e / ou medição (quantificação) da ligação de um composto a uma proteína calicreína são bem conhecidos dos técnicos versados no assunto e pode ser realizada, por exemplo, utilizando um método capaz de operação de alto rendimento, por exemplo, um método baseado em chip. Nova tecnologia, chamada VLSIPS ™, permitiu a produção de chips extremamente pequenos que contêm centenas de milhares ou mais de diferentes sondas moleculares. Esses chips biológicos têm sondas dispostas em matrizes, cada sonda atribuída a um local específico. Chips biológicos têm sido produzidos em que cada localização tendo uma escala de, por exemplo, dez mícrons. Os chips podem ser utilizados para determinar se as moléculas alvo interagem com qualquer uma das sondas sobre o chip. Após a exposição da matriz a moléculas alvo, sob condições de teste selecionadas, dispositivos de digitalização podem examinar cada localização na matriz e determinar se uma molécula alvo interagiu com a sonda nesse local.

[0021] Um outro método de identificação de compostos com afinidade de ligação para uma proteína de calicreína é o sistema de leveduras duplamente híbrido, em que os polipeptídeos da invenção pode ser utilizado para "capturar" proteínas que se ligam à proteína calicreína. O sis- tema de dois híbridos de levedura está descrito em Fields e Song, Nature 340: 245-246 (1989).

[0022] Em uma concretização, a porção de ligação pode compreender ou consistir de um polipeptídeo.

[0023] Por exemplo, a porção de ligação pode compreender ou consistir de um anticorpo ou um fragmento de ligação de antígeno com especificidade de ligação para uma proteína de calicreína, ou uma variante, fusão, ou derivado do referido anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno, ou uma fusão de um referido variante ou derivado, que retém a especificidade de ligação para a proteína de calicreína.

[0024] Assim, em uma concretização do primeiro aspecto da presente invenção, a porção de ligação pode ser um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno.

[0025] Por "anticorpo", incluímos moléculas substancialmente intactas de anticorpos, bem como anticorpos quiméricos, anticorpos humanizados, anticorpos humanos (em que pelo menos um aminoácido é muta- do em relação aos anticorpos humanos de ocorrência natural), anticorpos de cadeia simples, diacorpos, anticorpos biespecíficos, anticorpos cadeias pesadas, cadeias leves de anticorpos, homodímeros e heterodímeros de anticorpo de cadeias pesadas e / ou leves, e fragmentos de antígeno de ligação e seus derivados do mesmo.

[0026] Por "fragmento de ligação ao antígeno" significa um fragmento funcional de um anticorpo que é capaz de se ligar a uma proteína de cali- creína. A afinidade de ligação dos diferentes derivados de anticorpos acima mencionados pode ser determinada com o método de Scatchard utilizando uma concentração fixa de fragmento de anticorpo imobilizado e variando as concentrações de Eu-PSA traçador. Alternativamente, a afinidade de ligação pode ser determinada utilizando tecnologia de ressonância de Plasmon Superfície (SPR) em um instrumento Biacore. Os métodos de análise são adicionalmente descritos no Exemplo 8.

[0027] Em particular, o fragmento de ligação ao antígeno é selecionado a partir do grupo que consiste em fragmentos de Fv (por exemplo, Fv de cadeia simples e fragmentos Fv ligado por persulfeto), fragmentos semelhantes a Fab (por exemplo, fragmentos Fab, fragmentos Fab' e fragmentos F(ab)2), domínios variáveis individuais (por exemplo, V H e V L domínios) e anticorpos de domínio (dAb, incluindo formatos simples e dupla [isto é, dAb-ligante-dAb]).

[0028] As vantagens de utilizar fragmentos de anticorpo, em vez de anticorpos inteiros, são várias vezes. O menor tamanho dos fragmentos pode levar a propriedades farmacológicas melhoradas, tais como uma melhor penetração de tecido sólido e / ou mais rápida depuração do sangue que pode permitir razões terapêuticas mais elevadas. Além disso, os fragmentos de ligação ao antígeno, tais como fragmentos Fab, Fv, ScFv e dAb de anticorpos podem ser expressos em, e segregados por microrganismos, tais como E. coli, permitindo, assim, a fácil produção de grandes quantidades dos referidos fragmentos.

[0029] Também incluídos dentro do escopo da invenção são as versões de anticorpos e fragmentos de ligação ao antígeno modificada, por exemplo, modificada pela ligação covalente de polietilenoglicol ou outro polímero apropriado (ver abaixo).

[0030] Métodos de produção de anticorpos e fragmentos de anticorpos são bem conhecidos no estado da técnica. Por exemplo, os anticorpos podem ser gerados por meio de qualquer um dos vários métodos que empregam a indução da produção in vivo de moléculas de anticorpos, o rastreio de bibliotecas de imunoglobulinas (Orlandi et al, 1989, Proc Natl Acad Sci EUA 86: 3833-3837. .; Winter et al, 1991, Nature 349: 293 299) ou da produção de moléculas de anticorpo monoclonal de linhas celulares em cultura. Estes incluem, mas não estão limitadas a, a técnica de hibridoma, a técnica de hibridoma de células B humanas, e o vírus de Epstein-Barr (EBV) -hybridoma técnica (Kohler et al, 1975. Nature 256: 4.950.497; Kozbor et al.,. , J. 1985. Immunol Methods. 81: 31-42; Cote et al, 1983. Proc Natl Acad Sci EUA 80: 2026-2030; Cole et al, 1984. Mol Cell Biol 62 : 109-120).

[0031] Os anticorpos monoclonais adequados para antígenos selecionados podem ser preparados por técnicas conhecidas, por exemplo, as divulgadas em "Monoclonal Antibodies: A Manual de técnicas", H Zola (CRC Press, 1988) e em "monoclonais de hibridoma Antibodies: Techniques and Applications", JGR Hurrell (CRC Press, 1982).

[0032] Do mesmo modo, os fragmentos de anticorpos podem ser obtidos utilizando métodos bem conhecidos no estado da técnica(ver, por exemplo, Harlow @ Lane, 1988, "Antibodies: A ManuaT Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory, Nova Iorque). Por exemplo, fragmentos de anticorpo, de acordo com a presente invenção podem ser preparados por hidrólise proteolítica do anticorpo ou por expressão em E. coli ou células de mamífero (por exemplo, ovário de hamster chinês de cultura celular ou outros sistemas de expressão de proteína) de DNA que codifica para o fragmento. Alternativamente, os fragmentos de anticorpo podem ser obtidos por pepsina ou digestão com papaína de anticorpos inteiros através de métodos convencionais.

[0033] Será apreciado por técnicos versados no assunto que, para a terapia humana ou de diagnóstico, anticorpos humanizados ou humanos podem ser utilizados. Formas humanizadas de anticorpos não humanos (por exemplo, anticorpos de murino) são anticorpos geneticamente modificados quiméricos ou fragmentos de anticorpo possuindo Minimal- porções derivadas de anticorpos não humanos. Os anticorpos humanizados incluem anticorpos em que as regiões determinantes de complementaridade de um anticorpo humano (o anticorpo receptor) são substituídos por resíduos de uma região determinante de complementaridade de uma espécie não humana (anticorpo dador) tal como ratinho, rato de coelho, possuindo a funcionalidade desejada. Em alguns casos, resíduos de es- trutura Fv da anticorpo humano são substituídos pelos correspondentes resíduos não humanos. Os anticorpos humanizados podem também compreender resíduos que não são encontrados nem no anticorpo receptor nem nas sequências de determinação complementaridade importado região ou estrutura. Em geral, o anticorpo humanizado compreenderá substancialmente a totalidade de pelo menos um, e tipicamente dois, domínios variáveis, em que todas ou substancialmente todas as regiões determinantes de complementaridade correspondem às de um anticorpo não humana e todas, ou substancialmente todas, as regiões estruturais correspondem às de uma sequência de consenso humana relevante. . Os anticorpos humanizados incluem também optimamente pelo menos uma porção de uma região constante de anticorpo, tal como uma região Fc, tipicamente derivada de um anticorpo humano (ver, por exemplo, Jones et al, 1986. Nature 321: 522-525; Riechmann et al, 1988, Nature 332:. 323-329; Presta, 1992, Curr Op Struct Biol 2: 593-596).

[0034] Os métodos para humanizar anticorpos não humanos são bem conhecidos no estado na técnica. Em geral, o anticorpo humanizado possui um ou mais resíduos de aminoácidos introduzidos nele de uma fonte que é não humana. Estes resíduos de aminoácidos não humanos, frequentemente referidos como resíduos importados são tipicamente retirados de um domínio variável importado. A humanização pode ser realizada essencialmente como descrita (ver, por exemplo, Jones et al, 1986, Nature 321: 522-525; Reichmann et al, 1988. Nature 332: 323-327; Verhoeyen et al, 1988, Science 239: 534- 5361; US 4816567), substituindo as regiões determinantes de complementaridade correspondentes de roedor humanos com regiões determinantes de complementaridade. Assim, tais anticorpos humanizados são anticorpos quiméricos, em que substancialmente menos do que um domínio variável humano intacto foi substituído pela sequência correspondente de uma espécie não humana. Na prática, os anticorpos humanizados podem ser tipicamente anticorpos hu- manos em que alguns resíduos da região determinantes de complemen-taridade e possivelmente alguns resíduos estruturais estão substituídos por resíduos de locais análogos em anticorpos de roedores.

[0035] Os anticorpos humanos também podem ser identificados utilizando várias técnicas conhecidas no estado da técnica, incluindo bibliotecas de exibição em fagos (ver, por exemplo, Hoogenboom & Winter, 1991, J. Mol Biol 227:. 381; Marks et al, 1991, J. Mol. .. Biol 222:. 581; al ef Cole, 1985, In: Os anticorpos monoclonais e Terapia do Câncer, Alan R. Liss, pp 77; Boerner et al, 1991. J. Immunol 147:.86-95).

[0036] Uma vez que são obtidos anticorpos adequados, eles podem ser testados quanto à atividade, por exemplo, por ELISA.

[0037] Em uma concretização alternativa do primeiro aspecto da invenção, a porção de ligação compreende ou é constituído por uma porção de ligação que não uma imunoglobulina, por exemplo, como descrito em Skerra, Curr Opin Biotechnol. Ago 2007; 18 (4): 295-304.

[0038] Em uma outra concretização alternativa, a porção de ligação compreende ou consiste de um aptâmero. Por exemplo, o agente pode compreender ou consistir de um aptâmero ou um aptâmero peptídeo ácido nucleico (Hoppe-Seyler ver & Butz, 2000, J Mol Med 78 (8): 426-30; Bunka DH & Stockley PG, 2006, Nat. Rev. Microbiol 4 (8): 588-96 e Dra- bovich et al, 2006, Anal Chem 78 (9): 3171-8).

[0039] Em ainda uma outra concretização alternativa, a porção de ligação compreende ou consiste de uma entidade química pequena. Tais entidades com propriedades de ligação calicreína podem ser identificados por rastreio de bibliotecas de compostos pequenos comerciais (por exemplo, tal como disponível a partir da ChemBridge Corporation, San Diego, EUA).

[0040] Deste modo, a porção de ligação presente no agente de acordo com o primeiro aspecto da presente invenção se liga com especificidade para uma proteína de calicreína. Neste contexto, a frase "liga-se com especificidade" significa que a porção de ligação liga-se seletivamente à proteína alvo calicreína de preferência a outras proteínas, incluindo, opcionalmente, outras proteínas calicreína. O técnico versado no assunto está bem ciente de enumerosos métodos para avaliar a especificidade de ligação de uma molécula de ligação a um alvo. Por exemplo, onde a molécula de ligação é, ou baseia-se, de um anticorpo, a sua capacidade de se ligar especificamente a uma proteína calicreína pode ser avaliada por um imunoensaio, tais como um ELISA, radioimunoensaio ou semelhantes.

[0041] Em uma concretização, a porção de ligação pode-se dizer que se ligam com especificidade para uma proteína calicreína se liga à proteína calicreína em um imunoensaio e / ou em condições fisiológicas (tal como condições encontradas na próstata ou outros locais de tratamento, tal como aqui discutido) com uma afinidade de ligação superior a 1x10 5, 1x106, 1x107, 2x107, 1x108, 2x108, 1x109, 2x109, 1x1010, 2x1010, 3x10 10, 1x1011 ou mais, tal como dentro da faixa de 1x105 a 3x1010, ou mais.

[0042] A porção de ligação tal como utilizada no primeiro aspecto da presente invenção pode ter especificidade para uma proteína calicreína humana. Uma proteína de calicreína humana é uma serina-protease que pertence à família do gene da calicreína tecidular humano que foi encontrado para consistir de pelo menos 15 membros (Hsieh ML, Cancer Res 1997; 57; 2651-6). Calicreínas são glicoproteínas estáveis ao calor com uma única cadeia de polipeptídeo, com uma massa molecular variando entre 27-40 kDa.

[0043] A porção de ligação, tal como utilizada no primeiro aspecto da presente invenção pode ter especificidade para uma proteína calicreína selecionado a partir do grupo que consiste de antígeno específico da próstata (PSA; hK3, calicreína humana 3) e a calicreína glandular humana (hK2).

[0044] Em uma concretização, a porção de ligação tem especificida- de para o PSA. O termo PSA destina-se a incluir todas as formas conhecidas de PSA, tal como o PSA livre, formas precursoras de PSA, formas com entalhe internamente do PSA, de baixo peso molecular PSA livre, o PSA livre peso padrão, PSA maduro inactivo, formas truncadas de PSA, glicosilação variantes de PSA, BPSA, inativo pró-PSA, e cada complexo de PSA, tais como PSA ligado a cc1-antiquimotripsina (ACT), o inibidor de protease-1 (API) e a2-macroglobulina (AMG). Um exemplar de amino- ácidos primária de PSA é fornecida na Fig. 14 (ver SEQ ID NO: 16).

[0045] PSA, segregado a partir de células de câncer, é de um estado mais ativo em comparação com o PSA, segregado a partir de tecido de BPH. No PSA fluido extracelular pode ser submetida à degradação pro- teolítica, conduzindo, assim, a perda de atividade e de formação de complexos. Assim, está também dentro do escopo da presente invenção os compostos de marcação ou entidades, tal como o ACT, API, e AMG, ligado ou complexado de / com PSA.

[0046] Em uma concretização preferida, a porção de ligação tem es-pecificidade para a isoforma livre (isto é, não-complexada) do PSA em relação à isoforma do PSA complexado. Porções de ligação com especificidade para a isoforma livre de PSA pode ter especificidade de ligação para um epitopo que está exposto na isoforma livre do PSA, mas é não exposta na isoforma complexada de PSA, tal como um epítopo confor- macional (isto é, não-linear). Um exemplo de um tal epitopo conformacio- nal é formado a partir de resíduos de aminoácidos que fazem parte da calicreína-circuito em torno da fenda catalítica de PSA, e pode incluir o local activo da tríade His41, Asn96, e Ser189). Ver Leinonen et al, Clinicai Chemistry AM, 2208-2216 (2002) para uma discussão mais aprofundada e divulgação de vários epítopos adequados à PSA, que são aqui incorporadas por referência.

[0047] Sempre que a porção de ligação, tal como utilizado no primeiro aspecto da presente invenção tem especificidade para o PSA, em se- guida, a porção de ligação pode competir para a ligação a PSA (tal como a isoforma livre de PSA), ou um peptídeo que compreende o epitopo re- activo de PSA como limite por a porção de ligação, com um anticorpo selecionado a partir do grupo que consiste em PSA30, 4D4, 5C3 e 5A10, e um fragmento de ligação ao antígeno. Uma discussão mais detalhada de tais anticorpos pode ser encontrado em Pettersson et al, Clin. Chem, 41: 10, 1480-1488 (1995); Nilsson et al, Brit. J. Câncer, 75: 6, 789-797 (1997); Leinonen et al, Clinicai Chemistry 48:12, 2.208-2.216 (2002); Vai- sanen et al, Anal. Chem., 78: 7.809-7.815 (2006); Evans-Axelsson et al., Câncer Biother. Radiopharm. 27: 4, 243-51, EP 1 320 756 B1; e US 2004/101914, o conteúdo de cada um dos quais são aqui incorporadas por referência.

[0048] A sequência de aminoácidos das cadeias pesadas e leves constituintes do anticorpo anti-PSA exemplificativa 5A10 é mostrada a seguir (em que as sequências CDR estão sublinhadas). cadeia pesada 5A10 EVQLVESGPGILQPSQTLSLTCSFSGFSLSTTGMGVSWIRQPSGKGLEWLAHLYWDED KRYNPSLKSRLTISEDSSRNQVFLKITSVGPADSATYYCARKGYYGYFDYWGQGTALTV SS [SEQ ID NO:1] Cadeia leve 5A10 DIVMTQSQKFMSTSVGDRVSVTCKASQNVNTDVAWYQQKPGQSPKALIFSTSYRSSG VPDRFTGSGSGTDFTLTITNVQSEDLAEYFCQQYSNYPLTFGAGTKVDI N [SEQ ID N0:2]

[0049] Neste contexto, o termo "competir" inclui o significado de que a presença do agente que compreende a porção de ligação em um ensaio competitivo, juntamente com um anticorpo de referência selecionado a partir de PSA30, 4D4, 5C3 e 5A10 pode reduzir o nível de ligação de- tectável do anticorpo de referência para PSA (tal como PSA livre) por 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99% ou 100% (por exemplo, quando o agente e o anticorpo de refe- rência estão presentes no ensaio em quantidades equimolares, e, opcio-nalmente, em que o teste é realizado em condições fisiológicas). Tal análise pode ser feita por um imuno ensaio (IRMA), como descrito no Exemplo 9.

[0050] Sempre que a porção de ligação, tal como utilizado no primeiro aspecto da presente invenção tem especificidade para o PSA, em seguida, a porção de ligação pode compreender uma ou mais regiões determinantes de complementaridade (CDR) de um anticorpo selecionado a partir do grupo que consiste em PSA30, 4D4, 5C3, e 5A10 (como mostrado pelas sequências sublinhadas na SEQ ID NOS: 1 a 8 acima).

[0051] Como está bem estabelecido no estado da técnica, os anticorpos compreendem seis CDRs completas, três das quais estão presentes na variável leve (V L) mudança, e o outro dos quais três estão presentes na cadeia (variável pesada VH).

[0052] Não é necessário que as moléculas de ligação para a contenção de todos as seis CDRs de qualquer um destes anticorpos, a fim de reter a actividade de ligação ao antígeno, embora em uma concretização a molécula de ligação pode compreender todas as seis CDR de um anticorpo selecionado a partir do grupo que consiste em PSA30 , 4D4, 5C3 e 5A10.

[0053] Alternativamente, a porção de ligação pode compreender menos do que seis das CDRs, tais como: • cinco CDRs (isto é, 3 CDR de região V H ou V L, 2 CDR da outra região variável); • quatro CDRs (isto é, 3 CDR de região V H ou V L, uma CDR da outra região variável ou ; cada uma das 2 regiões CDR de V H e V L); • Três CDRs (isto é, todas as três CDR de um das regiões V H ou V L, e nenhum do outro; ou 2 CDR das regiões V H ou V L, uma CDR da outra região variável); • duas CDRs (isto é, duas CDRs de um das regiões V H ou V L, e nenhum do outro; ou 1 CDRs de cada um das regiões V H e V L); ou • Uma CDR de um das regiões VH ou VL, a partir de um anticorpo selecionado a partir do grupo que consiste em PSA30, 4D4, 5C3 e 5A10.

[0054] É bem conhecido na técnica que três ou menos regiões CDR (em alguns casos, até mesmo apenas um único CDR ou uma parte do mesmo) são capazes de reter a actividade de ligação ao antígeno do anticorpo a partir do qual o CDR (s) são derivados:

[0055] Laune et al. (1997), JBC, 272: 30.937-44 - demonstra que uma gama de hexapeptídeos a partir de um derivado de exibição CDR activi- dade de ligação ao antígeno (ver resumo) e nota que peptídeos sintéticos de um único, o CDR exibe uma forte actividade completa, de ligação (ver página 30942, coluna da direita-mão).

[0056] Monnet et al. (1999), JBC, 274: 3789-96 - mostra que uma variedade de peptídeos 12-mer e regiões estruturais associados têm activi- dade de ligação ao antígeno (ver resumo) e comenta que um peptídeo semelhante a CDR3 sozinho é capaz de ligação ao antígeno (ver página 3785, coluna da esquerda).

[0057] Qiu et al. (2007), Nature Biotechnology, 25: 921-9 - demonstra que uma molécula composta de dois CDRs ligados são capazes de antí- geno (veja resumo e página 926, coluna da direita) vinculativo.

[0058] LDNAer et al. (2007), Nature Biotechnology, 25: 875-7 - é um artigo de revisão relatando Qiu et al. (acima) e comenta que as moléculas que contêm dois CDRs são capazes de reter a atividade de ligação ao antígeno (ver página 875, coluna da direita).

[0059] Heap et al. (2005), J. Gen. Virol, 86:. 1791-1800 - relatórios que um "anticorpo micro" (uma molécula contendo um único CDR) é capaz de ligação ao antígeno (ver resumo e página 791, coluna da esquerda) e mostra que um peptídeo cíclico de um anticorpo anti-HIV tem activi- dade e a função de ligação ao antígeno.

[0060] Ef al Nicaise. (2004) Protein Science, 13: 1882-1891 - mostra que um único CDR pode conferir uma actividade de ligação ao antígeno e a afinidade para o seu antígeno lisozima

[0061] Vaughan e Sollazzo (2001), Química Combinatória & High Throughput Triagem, 4: 417-430 - é um artigo de revisão descrevendo minicorpos que contenham menos de três CDR regiões. Por exemplo, na página 418 (coluna da direita - 3 Nossa Estratégia para o projeto) uma minicorpo incluindo apenas o H1 e H2 CDR regiões hipervariáveis intercalados dentro de regiões de estrutura é descrita. O minicorpo é descrito como sendo capaz de se ligar a um alvo.

[0062] Quiocho (1993), Nature, 362: 293-4 - é um outro tipo de artigo de revisão que fornece um resumo da tecnologia minicorpo (isto é, anticorpos miniaturizados - neste caso, com menos de três CDR).

[0063] Pessi ef al (1993), Nature, 362: 367-9 e Bianchi et al (1994), J. Mol. Biol, 236:. 649-59 - são artigos referenciados na revisão por Vaughan e Sollazzo e descrevem um minicorpo H1 e H2 e suas propriedades em mais detalhes.

[0064] Gao ef al (1994), J. Biol. Chem., 269: 32389-93, que descreve um todo cadeia V L (incluindo todos as três CDRs) que tem alta afinidade para o seu substrato, o peptídeo intestinal vasoactivo, como evidência de que não é necessário ter ambos as cadeias V H e V L.

[0065] Estes documentos foram publicados antes da data de prioridade do presente pedido de patente e, por conseguinte, têm estado disponível para o técnico versado no assunto quando implementar a presente invenção. Eles fornecem uma evidência clara de que as moléculas possuindo menos do que todos as seis CDR pode ser capaz de reter as propriedades de anticorpos para os quais elas são derivadas de ligação ao antígeno.

[0066] Em uma concretização preferida, onde a porção de ligação tal como utilizado no primeiro aspecto da presente invenção tem especifici- dade para o PSA, em seguida, a porção de ligação é um anticorpo, ou seu fragmento ou derivado, que compreende as seis CDR exemplificativa de anti-PSA de ligação ao antígeno anticorpo 5A10.

[0067] Em uma concretização alternativa, onde a porção de ligação, tal como utilizado no primeiro aspecto da presente invenção tem especificidade para o PSA, em seguida, a porção de ligação pode compreender ou consistir de um anticorpo selecionado a partir do grupo que consiste em PSA30, 4D4, 5C3 e 5A10, e fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos.

[0068] Em outra concretização do primeiro aspecto da presente invenção, a porção de ligação tem especificidade para a calicreína glandular humana (hK2).

[0069] O termo hK2 pretende incluir todas as formas isoméricas de hK2, e qualquer molécula ou em complexo com proteínas hK2. Uma sequência de hK2 exemplar é descrito como Transcrição: KLK2-201 (ENST00000325321), um produto de ENSG00000167751 gene, tal como consta no banco de dados conjunto que pode ser encontrado no seguinte endereço World Wide Web em: en- sembl.org/Homo_sapiens/Transcript/Sequence_Protein?g=ENSG000001 67751; R = 19: 5 376.689-51.383.822; t = ENST00000325321 e tem a seguinte sequência: MWDLVLSIAL SVGCTGAVPL IQSRIVGGWE CEKHSQPWQV AVYSHGWAHC IGGVLVHPQWV LTAAHCLKKN SQVWLGRHNL FEPEDTGQRV PVSHSFPHPL YNMSLLKHQS LRPDEDSSHD LMLLRLSEPA KITDWKVLG LPTQEPALGT TCYASGWGSI EPEEFLRPRS LQCVSLHLLS NDMCARAYSE KVTEFMLCAG LWTGGKDTCG GDSGGPLVCN GVLQGITSWG PEPCALPEKP AVYTKWHYR KWIKDTIAAN P [SEQ ID NO:3]

[0070] A maior parte do hK2 encontrados no plasma seminal, é inativa e complexada com o inibidor da proteína C (PCI). É também possível que a hK2 forma complexos com outros inibidores de protease extracelu- lar. Estudos in vitro mostram que hK2 pode ligar-se a a2-antiplasmina (A2-PA), ACT, AMG, anti-trombina III (ATIII), o inactivador-C1 e inibidor do ativador do plasminogênio-1 (PAI-1).

[0071] Assim, está também dentro do escopo da presente invenção os compostos de marcação, moléculas, proteínas ou qualquer outra entidade, tal como PCI, cc2-antiplasmina (A2-PA), ACT, AMG, anti-trombina III (ATIII), C1 inibidor-1 do activador de plasminogénio e -inativator (PAI- 1), ligado ou complexado de / com hK2.

[0072] Em uma concretização, a porção de ligação pode ter especificidade para a isoforma livre (isto é, não-complexada) de hK2 em comparação com a isoforma de hK2 complexada. Binding porções com especificidade para a isoforma livre de hK2 podem ter especificidade de ligação para um epitopo que está exposto na isoforma livre de hK2, mas é não exposta na isoforma complexada de hK2, e esta pode ser uma cadeia linear ou uma conformacional (isto é, não-linear) epitopo. Por exemplo, a porção de ligação pode ter especificidade para um epítopo que inclui um ou mais resíduos de aminoácidos que fazem parte da fenda catalítica de hK2 que é exposta em hK2 livres e não exposta em uma isoforma com- plexado, tais como a forma presente no fluido seminal quando hK2 é complexado com PCI. Mapeamento de epítopos de hK2 é descrito em Vaisanen et al, Clinicai Chemistry 50: 9, 1607-1617 (2004), as divulgações das quais são aqui incorporadas por referência.

[0073] Sempre que a porção de ligação, tal como utilizado no primeiro aspecto da presente invenção tem especificidade para hK2, em seguida, a porção de ligação pode completar para a ligação a hK2, ou um pep- tídeo que compreende o epitopo reactivo de H2K como ligada pela porção de ligação, com um anticorpo selecionado a partir do grupo que consiste em 11 B6, e 7G1. Uma discussão mais detalhada de tais anticorpos pode ser encontrado em Vaisanen et al, Clinicai Chemistry, 50: 9, 16071617 (2004); e Vaisanen et al, Anal. Chem., 78: 7.809-7.815 (2006), o conteúdo de cada um dos quais são aqui incorporadas por referência.

[0074] A sequência de aminoácidos das cadeias pesadas e leves constituintes do anticorpo anti-hK2 exemplar 11 B6 é mostrado a seguir (em que as sequências CDR estão sublinhadas). Cadeia pesada 11B6 DVQLQESGPGLVKPSQSLSLTCTVTGNSITSDYAWNWIRQFPGNRLEWMGYISYSGST TYSPSLKSRFSITRDTSKNQFFLQLNSVTPEDTATYFCATGYYYGSGFWGQGTLVTVSS [SEQ ID N0:4] Cadeia leve 11 B6 DIVLTQSPASLAVSLGQRATISCRASESVEYFGTSLMHWYRQKPGQPPKLLIYAASNVES GVPARFSGSGSGTDFSLNIQPVEEDDFSMYFCQQTRKVPYTFGGGTKLEIK [SEQ ID N0:5]

[0075] Neste contexto, o termo "competir" inclui o significado de que a presença do agente que compreende a porção de ligação em um ensaio competitivo, juntamente com um anticorpo de referência selecionado a partir de 11 B6, e 7G1 podem reduzir o nível de ligação detectável do anticorpo de referência para hK2 por 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50% , 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99% ou 100% (por exemplo, quando o agente e o anticorpo de referência estão presentes no ensaio em quantidades equimolares, e, opcionalmente, em que o teste é realizado sob condições fisiológicas). Tal análise pode ser feita por um ensaio imuno-radiométrico (IRMA), como descrito no Exemplo 9.

[0076] Sempre que a porção de ligação, tal como utilizado no primeiro aspecto da presente invenção tem especificidade para hK2, em seguida, a porção de ligação pode compreender uma ou mais regiões determinantes de complementaridade (CDR) de um anticorpo selecionado a partir do grupo que consiste em 11 B6, e 7G1 (conforme mostrado pelas sequências sublinhadas na SEQ ID NOS: 10 a 13 acima).

[0077] Não é necessário que as moléculas de ligação para a contenção de todos as seis CDRs de qualquer um destes anticorpos, a fim de reter a atividade de ligação ao antígeno, embora em uma concretização a molécula de ligação pode compreender todas as seis CDR de um anti- corpo selecionado a partir do grupo que consiste em 11 B6, e 7G1.

[0078] Alternativamente, a porção de ligação pode compreender menos do que seis das CDRs, tais como - • cinco CDRs (isto é, 3 CDR de região V H ou V L, 2 CDR da outra região variável); • quatro CDRs (isto é, 3 CDR de região V H ou V L, uma CDR da outra região variável ou 2; cada um das regiões CDR de V H e V L); • três CDRs (isto é, todas as três CDR de um das regiões V H ou V L, e nenhum do outro; ou 2 CDR de região V H ou V L r, uma CDR da outra região variável); • duas CDRs (isto é, duas CDRs de um das regiões V H ou V L, e nenhum do outro; ou 1 CDRs de cada um das regiões V H e V L); ou • uma CDR de um das regiões V H V ou L, a partir de um anticorpo selecionado a partir do grupo que consiste em 1B6 e 7G1.

[0079] Em uma concretização preferida, onde a porção de ligação tal como utilizado no primeiro aspecto da presente invenção tem especificidade para hK2, em seguida, a porção de ligação é um anticorpo, ou seu fragmento ou derivado, que compreende as seis CDR de anticorpos anti- hK2 exemplar de ligação ao antígeno anticorpo 11B6 (ver sequências sublinhadas de SEQ ID NOs: 4 e 5).

[0080] Em uma concretização alternativa, onde a porção de ligação, tal como utilizado no primeiro aspecto da presente invenção tem especificidade para hK2, em seguida, a porção de ligação pode compreender ou consistir de um anticorpo selecionado a partir do grupo que consiste de 11B6, e 7G1, e fragmentos de ligação de antígeno.

[0081] Opcionalmente, o agente usado no primeiro aspecto da presente invenção pode ainda compreender uma porção terapêutica. Por conseguinte, o agente pode compreender ou consistir de uma porção de ligação, tal como descrito acima e uma porção terapêutica. A porção de ligação pode ser ligada diretamente ou indiretamente à porção terapêutica.

[0082] No caso em que o agente pode compreendee ou consistir de uma porção de ligação, tal como descrito acima e uma porção terapêutica, em seguida, o agente pode características de absorção exibe tumo- rais, por exemplo, como testado sob as condições utilizadas nos exemplos a seguir, substancialmente equivalente ao tumor, características de absorção de um agente que consiste em a porção de ligação sozinho. Neste contexto, inclui substancialmente equivalente do significado de maior do que 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99% ou substancialmente 100%.

[0083] Qualquer grupo terapêutico adequado pode ser utilizado. Um grupo terapêutico adequado é aquele que é capaz de reduzir ou inibir o crescimento de, ou matar, em especial, uma célula de câncer da próstata. Por exemplo, o agente terapêutico pode ser uma parte citotóxica. Uma porção citotóxica pode compreender ou consistir de uma ou mais radioi- sótopos. Por exemplo, os um ou mais radioisótopos podem cada um independentemente selecionados a partir do grupo que consiste em beta- emissores Auger, emissores de elétrons de conversão, emissores, alfa- emissores, e de baixa energia do fotão-emissores. Pode ser desejável que as uma ou mais, cada um independentemente radioisótopos tem ou têm um padrão de emissão de energia absorvida localmente que cria uma alta dose absorvida na vizinhança do agente. Radioisótopos exemplares podem incluir beta-emissores de longo alcance, tais como 90 Y, 32 P, 86 Re / 88 Re; 66 Ho, A como / A As, 89 Sr, 153 Sm; beta-emissores de médio alcance, tais como 31 l, 177 Lu, 67 Cu, 161 Tb, 105 Rh; beta-emissores de baixa energia, tais como 45 Ca ou 35 S; conversão ou Auger emissores, como 51 Cr, 67 Ga ", Tc m, 111 ln, 11 m ln, 123 l, 25 l, 20 TI; e alfa-emissores, como 12 Bi, 213 Bi, 223 Ac, 225 Ac, 212 Pb, 55 Fm, 223 Ra, 149 Tb e 221 At. Outros exemplos de radionuclidos terapêuticos pode ser visto na Fig. 9. Ou- tros radionuclídeos estão disponíveis e será possível utilizar para a terapia. Em outra concretização, pode ser desejado que a fracção terapêutica ou porção citotóxica não é uma porção tal como descrito como um "marcador" no documento WO 2006/087374 A1, em particular, na página 11, linhas 7-15 do mesmo.

[0084] Em uma concretização preferida, a fração terapêutica é 177 Lu. Por exemplo, o agente pode ser uma forma 177 Lu-marcada de anticorpo anti-hK2 11B6, ou de um seu fragmento de ligação ao antígeno ou um seu derivado.

[0085] Alternativamente, a fração terapêutica compreende ou consiste em um ou mais terapêutico (tais como fármacos citotóxicas), por exemplo, uma fármaco citostática; uma fármaco anti-andrógeno; cortiso- na e seus derivados; um fosfonato; um inibidor da testosterona-5- reductase um; um adendo boro; uma citocina; tapsigargina e seus meta- bólitos; uma toxina (tal como, caliqueamicina ou saporina); um agente quimioterapêutico (tal como, um antimetabólito); ou qualquer outro fárma- co terapêutica ou citotóxica úteis no tratamento de carcinoma prostático.

[0086] Fármacos citotóxicos / terapêuticos exemplificativos podem, por exemplo, incluem: • citostáticos, em particular, aqueles com efeitos colaterais, incluindo mas não se limitando a ciclofosamida, clorambucil, ifosfamida, busulphane, lomustina, taxanos, fosfato de estramustina e outras mostardas de azoto, antibióticos (incluindo doxorubicina, calicheamicines e es- peramicine), alcalóides da vinca dose-limitante , azaridines, compostos, endostatina, sulfonatos de alquilo, nitrosoureias, triazenos, análogos de ácido fólico, análogos de pirimidina, análogos de purina, enzimas, derivados de ureia substituída, metil-hidrazina, daunorubicina, aminas anfipáti- cos contendo platina, • Anti-andrógenos, tais como flutamida e bicalutamida e seus metabólitos; • A cortisona e seus derivados; • fosfonatos tais como diphophonate e buphosphonate; • Testosterona-5-a-reductaseinhibitors; • adendos boro; • As citocinas; • tapsigargina e seus metabólitos; • outros agentes utilizados no tratamento do carcinoma pros- tático.

[0087] Alternativamente, a porção citotóxica compreende ou consiste em uma ou mais porções adequadas para utilização em terapia de acti- vação, tais como a terapia de fótons ativação, terapia de activação de neutrons, de neutrons induzida Auger terapia de elétrons, terapia de radiação ou terapia de fótons de energia de sincrotrão de raios-X de baixa ativação.

[0088] Por exemplo, com o tumor, agentes de direcionamento de acordo com a presente invenção, não haverá a possibilidade de utilizar a radiação sincrotrão (ou baixa energia de raios X) para o avanço da radioterapia, centrado principalmente na chamada radioterapia foto-ativação (PAT), em que a deposição de energia local a partir de irradiação de raios X externo é reforçada no tecido de câncer através da interacção com um Z de alta agente de direcionamento de tumor pré-administrado, ver fig. 10.

[0089] A modalidade de tratamento PAT utiliza raios X monocromáticos de uma fonte de luz síncrotron, tais como fornecidos pela beamline biomédica ID17 no European Synchrotron Radiation Facility (ESRF) em Grenoble, e como previsto para estar disponível em outras instalações no futuro, como o novo instalação síncrotron sueco, Max-IV.

[0090] Como uma outra modalidade de tratamento potencial, a investigação sobre a "terapia induzida tumor elétron Auger" é a vinda Europeia Spallation Fonte (ESS) em Lund, e espero uma estação experimental médica. Nêutrons térmicos e semi-térmicos produzidos em reatores têm sido há tempos usado para Boron-Neutron-Capture-Terapia, BNCT, tanto para experimentos pré-clínicos e para o tratamento de tumores cerebrais com as partículas alfa induzida e o núcleo recuo (7L), que dão uma energia absorvida localmente elevada. Uma abordagem semelhante é a utilização de neutrons e moléculas-alvo de tumor marcados com núcleos adequados estáveis com elevada seção transversal para neutrons. Os anticorpos ou peptídeos, por exemplo, pode ser marcado com estável de gadolínio (157Gd) e agem como uma molécula alvo para os neutrons que são capturadas pela Gd-núcleo, chamada terapia captura de neutrons por gadolínio (GdNCT). Por técnicas de Monte Carlo, a distribuição da dose no tumor e os tecidos circundantes é calculado tal como resulta das y- fótons, nêutrons recuos nucleares, bem como os raios X característicos, conversão interna e Auger-elétrons de gadolínio ou outros elementos potenciais .

[0091] Como discutido acima, a porção terapêutica (por exemplo, um radioisótopo, porção citotóxica ou semelhantes) podem ser ligadas dire-tamente, ou indiretamente, para a porção de ligação (tal como um anticorpo ou um seu fragmento). Os ligantes adequados são conhecidos no estado da técnicae incluem, por exemplo, grupos prostéticos, ligantes não-fenólicos (derivados de N-benzoatos succimidil-; dodecaborate), que- lantes de porções de ambos os quelantes macrocíclicos e acíclicos, tais como os derivados de 1, 4,7 , 10-tetraazaciclododecano-1,4,7,10, ácido tetra-acético (DOTA), derivados de ávido dietilenotriaminopentacético (DTPA), derivados de S-2- (4-lsothiocyanatobenzyl) -1, 4,7- triazaciclononano-1,4, ácido 7-triacético (NOTA) e derivados de 1, 4,8,11- tetraazacyclodocedan-1, 4,8,11-tetra-acético ácido (TETA) e outras porções quelantes. O uso de tais ligantes pode ser particularmente apropriado em circunstâncias em que o agente compreende ou consiste de um anticorpo ou fragmento, como a porção de ligação ligada, através de um ligante, a um radioisótopo como o grupo terapêutico.

[0092] Um ligante preferido é o DTPA, por exemplo, como utilizado em 177 Lu-DTPA-11 B6.

[0093] Opcionalmente, o agente usado no primeiro aspecto da presente invenção pode (ou não) compreender ainda uma porção detectável. Por exemplo, uma porção detectável pode compreender ou consistir de um radioisótopo, tal como um radioisótopo selecionado de entre o grupo que consiste em: Tecnécio-99m; lndium-111; Gálio-67; Gálio-68; Arsêni- co-72; Zircônio-89; O iodo-123, Iodo-124, Iodo-125; Tálio-201. Opcionalmente, o agente pode compreender um par de radionuclidos detectáveis e citotóxicos, tais como86 Y /90 Y ou 12 l /211 At- Alternativamente, o agente pode compreender um radioisótopo que é capaz de actuar simultaneamente em uma forma multi-modais como uma porção detectável e também como uma parte citotóxica para proporcionar os chamados "Terag- nóstico multimodalidade". As porções de ligação podem, assim, ser acoplado a nanopartículas que têm a capacidade de multi-imagem latente (por exemplo, SPECT, PET, ressonância magnética, óptica, ou ultrassom), juntamente com a capacidade de terapêutica com fármacos citotó- xicos, tais como radionuclidos ou agentes de quimioterapia. Também incluído no presente invenção é a possibilidade de tratamento por hiper- termia de alta frequência utilizando campos magnéticos alternados e ul- tra-sonografia acompanhada. Por exemplo, ver a Fig. 11.

[0094] Alternativamente, a porção detectável pode compreender ou consistir de um isótopo paramagnético, tal como um isótopo paramagné- tico é selecionado a partir do grupo que consiste de gadolínio-157; man- ganês-55, disprósio-162, o cromo-52; ferro-56.

[0095] No caso em que o agente usado no primeiro aspecto da presente invenção compreende uma porção detectável, em seguida, a porção detectável pode ser detectado por uma técnica de imagiologia, tais como SPECT, PET, MRI, imagiologia óptica ou ultrassom.

[0096] Porções terapêuticas e detectáveis podem ser conjugados ou associados de outra forma com os métodos porção usando de ligação bem conhecidos no estado da técnica(por exemplo, a terapia com imu- noconjugado existente, gemtuzumab ozogamicina [nome comercial: Mylotarcfi)], compreende um anticorpo monoclonal ligado a caliqueamici- na citotoxina).

[0097] Em uma outra concretização, o agente utilizado de acordo com o primeiro aspecto da invenção é utilizado para tratar o câncer da próstata, sob a forma de uma formulação que compreende uma população de moléculas de agente. Em uma opção, todas (ou praticamente todos, tais como maior do que 90%, 95%, 99%, 99,9% ou mais, em peso) das moléculas de agente na população utilizada para o tratamento compreendem a mesma substância terapêutica. Em uma outra opção, a população compreende uma mistura de outros agentes terapêuticos com diferentes porções. Esta opção dará possibilidades para melhorar os efeitos da terapia de radionuclidos alvo utilizando vários agentes tais agentes de quimioterapia, agentes de terapia hormonal ou outra combinação de terapias em que o agente de direccionamento não só proporciona radio- nuclídeos terapeuticamente activas para antígenos associados a tumores, mas também, simultaneamente, radiosensitizes o tumor-alvo células por desencadear uma cascata de sinalização intracelular. Esta opção é também útil no tratamento do câncer da próstata com uma mistura de agentes citotóxicos, por exemplo, utilizando um cocktail de alfa- e diferentes intervalos de emissores beta, ou um coquetel de radionuclídeos com faixa diferente, LET (transferência linear de energia) e RBE (efeito biológico relativa), para o tratamento combinado de tumores grandes, micro- metástases e células tumorais individuais. Em uma concretização, os emissores de longo alcance podem ser utilizados para o tratamento de tumores grandes, e emissores de curto alcance podem ser utilizados para o tratamento de tumores menores, tais como, micrometástases e células tumorais individuais.

[0098] Opcionalmente, o agente usado no primeiro aspecto da presente invenção pode (ou não) compreender ainda uma unidade para o aumento da meia-vida in vivo do agente. Exemplos de porções para o aumento da meia-vida in vivo de que o agente pode incluir polietileno gli- col (PEG), albumina de soro humano, grupos de glicosilação, ácidos gordos e dextrano. PEG pode ser particularmente contemplada.

[0099] Em uma concretização da invenção, os agentes compreendendo um agente de ligação (por exemplo, anticorpo ou seu fragmento) que são específicos para uma proteína da calicreína, tal como PSA ou hK2, e um agente terapêutico são então injectadas / infundido no corpo. Em seguida, o agente liga-se aos tecidos que produzem antígenos correspondentes, tais como PSA ou hK2. As estruturas biológicas, para as quais o agente fica ligada, pode ser subsequentemente tratado com um agente adequado e / ou dosimetria e / ou métodos de avaliação por imagem, incluindo a terapia de PET / SPECT / CT / MR / óptica / ultrassom podem ser usadas.

[00100] Em algumas circunstâncias, as variações no grau de atenuação das células prostáticas cancerosas por o agente poderá corresponder directamente a produção e concentração relações da calicreína alvo (tais como, PSA e hK2) nas células de câncer da próstata do paciente. Essas variações podem ser determinadas, por exemplo, pelos métodos do documento WO 2006/08734, os métodos dos quais são aqui incorporados por referência, e utilizados para se obter informação terapêutica.

[00101] Por exemplo, as visualizações pré-terapia de PSA e hK2 de anticorpos emparelhados, obtidos a partir dos métodos de imagem acima mencionados, podem ser combinados com os métodos e utilizações da presente invenção. A partir da medida de atenuação é possível determinar diretamente se o tecido investigado é produtor de PSA, a produção de hK2, ou ambos. À luz desta determinação será possível adaptar a te rapia para ser mais eficiente. Assim, a terapia do paciente individualizada pode ser conseguida com o planeamento de dose pré-terapia. Orientações para a terapia do paciente individualizada pode ser feita a partir de terapias conhecidas no estado da técnica, tais como aqueles discutidas em (1) Garkavij, et al. (2010) Câncer, 116: 1084-1092; (2) de Linden et al. (1999) Clin.Cancer Res, 5: 3287s-3291s;. (3) Ljungberg et al. (2003) Câncer Biother.Radiopharm, 18: 99-107;. (4) Minarik, et al, (2010) J.Nucl.Med, 51:. 974-1978; (5) Sjogreen-Gleisner, et al. (2011) Nucl QJ. Med. Mol. Imaging, 55: 126-154; e (6) Sjogreen, et al. (2005) Câncer Bio- ther.Radiopharm, 20: 92-97; o conteúdo de cada um dos quais são aqui incorporadas por referência.

[00102] Por conseguinte, em uma concretização, o primeiro aspecto da invenção envolve o tratamento de um paciente determinado a possuir células de câncer da próstata produtoras de PSA com um agente, de acordo com o primeiro aspecto da presente invenção que tem especificidade para o PSA.

[00103] Em uma outra concretização, o primeiro aspecto da invenção envolve o tratamento de um paciente determinado possuir hK2 produtoras de células cancerosas da próstata com um agente de acordo com o primeiro aspecto da presente invenção que tem especificidade para a ca- licreína glandular humana (hK2).

[00104] Em uma outra concretização, o primeiro aspecto da invenção envolve o tratamento de um paciente determinado a possuir células de câncer da próstata que sejam ao mesmo tempo e hK2 produtora, com um agente de acordo com o primeiro aspecto da presente invenção que tem especificidade para ambos PSA produtoras de PSA e calicreína glandular humana (hK2), ou uma combinação de agentes uma das quais possui especificidade para o PSA e o outro possuindo especificidade para hK2. No caso da terapia de combinação, os agentes podem ser administrados ao paciente separadamente, sequencialmente, simultaneamente, ou for- mulado como uma mistura na mesma composição farmacêutica.

[00105] A administração de um agente, de acordo com o primeiro aspecto do presente invenção a um doente com câncer da próstata pode, portanto, resultar na ligação de uma proteína de calicreína, antígeno específico da próstata tal (PSA; hK3, gene de calicreina humana 3) e / ou humana calicreína glandular (hK2), presente na ou nas células de câncer da próstata, e resultar na inibição do crescimento e / ou a morte de células de câncer da próstata no paciente. Por exemplo, o agente pode reduzir a taxa de crescimento, e / ou a presença, de células de câncer da próstata no paciente em pelo menos 10%, em particular, pelo menos 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70% , 80% ou 90%, e, mais particularmente, de 100% em comparação com a taxa observada de crescimento, e / ou a presença, de células de câncer da próstata no paciente antes do tratamento. Os métodos de medição da taxa de crescimento, e / ou presença de células, câncer da próstata em um sujeito são conhecidos no estado da técnica.

[00106] Assim, a invenção proporciona métodos para o tratamento do câncer da próstata.

[00107] Por "tratamento", incluímos tanto o tratamento terapêutico e profiláctico do paciente. O termo "profiláticos" é utilizada para abranger a utilização de um agente, ou sua formulação, tal como aqui descrito que ou evita ou reduz a probabilidade de câncer da próstata, ou a propagação, disseminação ou metástase de câncer de próstata localizado em um paciente ou sujeito. O termo "profiláticos" também abrange a utilização de um agente, ou sua formulação, tal como descrito na presente invenção para prevenir a recorrência de câncer da próstata em um paciente que tenha sido previamente tratada para o câncer da próstata.

[00108] O câncer da próstata a ser tratado pelo primeiro aspecto da presente invenção pode ser localizado na próstata, ou pode ser um (ou seja, disseminada) do câncer da próstata não localizada. O câncer da próstata localizada na próstata pode, por exemplo, ser classificada como câncers T1 clínica ou T2 de acordo com o sistema TNM (abreviado de Tumor / nodes / metástases) Considerando localizada não cancerosa / disseminada da próstata pode, por exemplo, ser classificada como clínica T3 ou T4 cânceres.

[00109] O câncer da próstata a ser tratada pelo primeiro aspecto da presente invenção pode ser câncer da próstata metastático. Metástase refere-se a propagação de um câncer de seu local original para outras partes do corpo. Por exemplo, o câncer da próstata metastático a ser tratado pode ser uma metástase presente no sistema linfático; no osso (incluindo espinha, vértebras, costelas, pélvis); metástases dentro pélvis, recto, bexiga, uretra ou. Metástases presentes em outros locais menos comuns podem também ser tratadas com a presente invenção. As metás- tases podem ser micrometástases. Metástase em é uma forma de metás- tases em que os tumores formados de novo são geralmente demasiado pequenas para serem detectados, ou detectado com dificuldade. Por exemplo, a presente invenção proporciona o técnico versado no assunto- com meios para tratar à única célula cancerosa ou de agregados de células, mesmo se a presença de tais células ou cachos não é possível diagnosticar mas existem, por exemplo, como a doença disseminada oculto.

[00110] Por conseguinte, antecipa-se que uma vantagem técnica particularmente importante do tratamento proporcionado pela presente invenção em comparação com os tratamentos do estado da técnica de câncer de próstata é a eficácia melhorada no tratamento de câncer de próstata disseminada e / ou metastático (incluindo micrometastática).

[00111] Assim, em uma concretização, a invenção proporciona métodos e agentes para a prevenção ou tratamento de metástases de um tumor da próstata primário.

[00112] O câncer de próstata tende a se desenvolver em homens com idade superior a cinquenta, mais comumente em homens acima de 60, 64 ou 70, e, embora seja um dos tipos mais prevalentes de câncer em homens, muitos nunca têm sintomas, são submetidos a nenhuma terapia, e, eventualmente, morrer de outras causas. Isso ocorre porque o câncer da próstata é, na maioria dos casos, de crescimento lento, sem sintomas, e desde que os homens com a doença são mais velhos que muitas vezes morrem de causas não relacionadas ao câncer de próstata, como o coração / doença circulatória, pneumonia, outro câncers desconectados, ou velhice. Cerca de dois terços dos casos de câncer da próstata são de crescimento lento, o outro terço desenvolvimento mais agressivo e rápido.

[00113] Por conseguinte, o desenvolvimento de tratamentos eficazes para o câncer da próstata é particularmente importante para a gestão de formas mais agressivas e rápido desenvolvimento do câncer, particularmente em pacientes mais jovens. Por conseguinte, em uma concretização, o primeiro aspecto da invenção relaciona-se com o tratamento de câncer da próstata em um paciente isto é menos do que 70, 65, 60, 55, 50, 45, 40 ou menos anos de idade no momento do diagnóstico do câncer da próstata câncer e / ou no momento do tratamento.

[00114] Homens que têm um parente de primeiro grau (pai ou irmão) com câncer de próstata são pensados para ter o dobro do risco de câncer de próstata em desenvolvimento, e aqueles com dois parentes de primeiro grau afetados são pensados para ter cinco vezes maior risco, em comparação com os homens sem história familiar. Consequentemente, o primeiro aspecto da invenção pode se relaciona com o tratamento do câncer da próstata em um doente que se caracteriza pelo facto de uma, duas, ou mais, os membros da família, nomeadamente os familiares de primeiro grau (tais como um pai ou irmão), foi sido previamente diagnosticado com câncer de próstata.

[00115] O primeiro aspecto da invenção também se relaciona com o tratamento do câncer da próstata em um paciente, em que o câncer da próstata a ser tratado é o câncer da próstata resistente à castração (CRPC). CRPC pode ser caracterizada por tipicamente tornando-se refratária ao tratamento hormonal após um a três anos, e retomar o crescimento, apesar da terapia hormonal.

[00116] A presente invenção também proporciona uma composição farmacêutica compreendendo uma quantidade terapeuticamente eficaz de um agente tal como definido acima em relação ao primeiro aspecto da presente invenção e um diluente, transportador ou excipiente farmaceuti- camente aceitável.

[00117] Os compostos adicionais podem também ser incluídos nas composições farmacêuticas, incluindo, agentes de ligação tais como EDTA, citrato, EGTA ou glutationa quelantes.

[00118] As composições farmacêuticas podem ser preparadas de um modo conhecido na técnica, que seja suficientemente estável em armazenamento e adequada para administração a seres humanos e animais. Por exemplo, as composições farmacêuticas podem ser liofilizados, por exemplo, através de secagem por congelação, secagem por pulverização, refrigeração por pulverização, ou através da utilização de formação de partículas de formação de partículas supercrítico.

[00119] Por "farmaceuticamente aceitável" significa um material não tóxico que não diminui a eficácia da actividade de proteína de ligação a calicreína do agente da invenção. Os tampões aceitáveis, transportadores ou excipientes, tais farmaceuticamente são bem conhecidos na técnica (ver Remington 's Pharmaceutical Sciences, 18a edição, AR Gennaro, Ed., Mack Publishing Company (1990) e Handbook of Pharmaceutical Excipients, 3rd edition, A. Kibbe, Ed ., Pharmaceutical Press (2000), ele revelações das quais são aqui incorporadas por referência).

[00120] O termo "tampão" é entendido significar uma solução aquosa contendo uma mistura de ácido-base com a finalidade de estabilizar o pH. Exemplos de tampões são de Trizma, Bicina, Tricina, MOPS, MOP- SO, MOBS, Tris, HEPES, HEPBS, MES, fosfato, carbonato, acetato, citrato, glicolato, lactato, borato, ACES, ADA, tartarato, AMP, AMPD, AMP- SO, BES, CABS, cacodilato, CHES, DIPSO, EPPS, etanolamina, glicina, HEPPSO, imidazol, ácido imidazolelactic, tubulações, SSC, SSPE, POP- SO, torneiras, separadores, TAPSO e TES.

[00121] O termo "diluente" é entendido significar uma solução aquosa ou não-aquosa, com a finalidade de diluição do agente na preparação farmacêutica. O diluente pode ser um ou mais de solução salina, água, polietilenoglicol, propilenoglicol, etanol ou óleos (tais como óleo de cár- tamo, óleo de milho, óleo de amendoim, óleo de semente de algodão ou óleo de sésamo).

[00122] O termo "adjuvante" pretende significar qualquer composto adicionado à formulação para aumentar o efeito biológico do agente da invenção. O adjuvante pode ser um ou mais de zinco, sais de cobre ou de prata com diferentes aniões, por exemplo, mas não se limitando ao fluoreto, cloreto, brometo, iodeto, tiocyanate, sulfito, hidróxido, fosfato, carbonato, lactato, glicolato, citrato, borato, tartarato, e os acetatos de composição acilo diferente. O adjuvante pode também ser polímeros ca- tiônicos, como éteres catiônicos de celulose, ésteres de celulose catióni- cos, ácido hialurônico desacetilado, quitosano, dendrímeros catiónicos, polímeros sintéticos catiónicos, tais como polivinil imidazol), e polipeptí- deos catiônicos, tais como poli-histidina, polilisina, poliarginina, e peptí- deos contendo esses aminoácidos.

[00123] O excipiente pode ser um ou mais dos carboidratos, lipídeos, polímeros e sais minerais. Exemplos de carboidratos incluem lactose, glicose, sacarose, manitol, ciclodextrinas e, os quais são adicionados à composição, por exemplo, para facilitar a liofilização. Exemplos de polímeros são de amido, éteres de celulose, carboximetilcelulose de celulose, hidroxipropilmetil celulose, hidroxietilcelulose, etillhidroxietilcelulose, alginatos, carageenans, ácido hialurónico e os seus derivados, ácido po- liacrílico, polysulphonate, óxido de polietilenoglicol / polietileno, copolíme- ros de óxido de polietileno / polipropileno, álcool polivinílico / acetato de polivinilo de diferente grau de hidrólise, e polivinilpirrolidona, todos de peso molecular diferente, os quais são adicionados à composição, por exemplo, para controlo da viscosidade, para alcançar a bioadesão, ou para proteger o lípido da degradação química e proteolítica. Exemplos de lipídeos são ácidos graxos, fosfolipídeos, mono-, di-, e triglicerídeos, ce- ramidas, esfingolipídeos e glicolipídeos, tudo de diferente comprimento de cadeia de acilo e saturação, lecitina de ovo, lecitina de soja, hidroge- nado ovo e lecitina de soja, que são adicionadas a composição por razões semelhantes às dos polímeros. Exemplos de minerais são o talco, óxido de magnésio, óxido de zinco e óxido de titânio, os quais são adicionados à composição para se obter vantagens tais como a redução da acumulação de líquido ou propriedades vantajosas de pigmento.

[00124] Os agentes da invenção podem ser formulados em qualquer tipo de composição farmacêutica conhecidas na técnica como sendo adequado para a entrega dos mesmos.

[00125] Em uma concretização, as composições farmacêuticas da invenção podem estar na forma de um lipossoma, em que o agente é combinado, para além de outros transportadores farmaceuticamente aceitáveis, com agentes anfipáticos, tais como lipídeos, que existem em formas agregadas tais como micelas, insolúveis As monocamadas e cristais líquidos. Os lipídeos adequados para a formulação lipossomal incluem, sem limitação, monoglicerídeos, diglicerídeos, sulfatidos, lisolecitina, fos- folipídeos, saponina, ácidos biliares, e outros semelhantes. Os lipídeos adequados incluem os lipídeos acima modificados por poli (etileno glicol) no headgroup polar para prolongar o tempo de circulação sanguínea. A preparação de tais formulações lipossômicas pode ser encontrada em, por exemplo, US 4,235,871, cujas descrições são aqui incorporadas por referência.

[00126] As composições farmacêuticas da invenção podem também estar na forma de microesferas biodegradáveis. Poliésteres alifáticos, tais como poli (ácido láctico) (PLA), poli (ácido glicólico) (PGA), copolímeros de PLA e PGA (PLGA) ou poli (carprolactone) (PCL), e polianidridos têm sido amplamente utilizados como polímeros biodegradáveis em a produção de microesferas. As preparações de tais microesferas podem ser encontradas no documento US 5,851,451 e na EP 0 213 303, as revelações das quais são aqui incorporadas por referência.

[00127] Em uma outra concretização, as composições farmacêuticas da invenção são proporcionados sob a forma de géis de polímero, onde os polímeros, tais como amido, éteres de celulose, carboximetilcelulose, hidroxipropilcelulose, hidroxietilcelulose, etilhidroxietilcelulose, alginatos, carageenans, ácido hialurónico e derivados do mesmo, ácido poliacrílico, polivinil imidazole, polysulphonate, óxido de polietilenoglicol / polietileno, copolímeros de óxido de polietileno / óxido de polipropileno, álcool polivi- nílico / acetato de polivinilo de diferente grau de hidrólise, e polivinilpirro- lidona são usados para espessamento da solução que contém o agente. Os polímeros podem também compreender gelatina ou colágeno.

[00128] Alternativamente, os agentes podem ser simplesmente dissolvidos em solução salina, água, polietilenoglicol, propilenoglicol, etanol ou óleos (tais como óleo de cártamo, óleo de milho, óleo de amendoim, óleo de semente de algodão ou óleo de sésamo), goma de tragacanto, e / ou vários tampões.

[00129] Faz-se observar que as composições farmacêuticas da invenção podem incluir íons e um pH definidos para a potenciação da ação do agente ativo. Além disso, as composições podem ser sujeitas a operações farmacêuticas convencionais, tais como esterilização e / ou podem conter adjuvantes convencionais, tais como conservantes, estabilizantes, agentes molhantes, emulsionantes, tampões, agentes de enchimento, etc.

[00130] As composições farmacêuticas, de acordo com a invenção podem ser administradas através de qualquer via adequada conhecida pelos peritos no estado da técnica. Assim, as possíveis vias de administração incluem parentérica (intravenosa, subcutânea, e intramuscular), tópica, ocular, nasal, pulmonar, bucal, por via oral, parentérica, rectal e. Também a administração de implantes é possível. A infusão pode ser um percurso desejado por causa do elevado potencial de citotoxicidade do agente administrado.

[00131] Em uma concretização, as composições farmacêuticas são administradas parentericamente, por exemplo, por via intravenosa, por via intracerebroventricular, intra-articular, intra-arterial, intraperitoneal, intratecal, intraventricular, intrastemally, intracranialmente, intramuscularmente ou subcutaneamente, ou eles podem ser administrados por técnicas de infusão. Eles são utilizados convenientemente sob a forma de uma solução aquosa estéril que pode conter outras substâncias, por exemplo, sais ou glucose suficientes para tornar a solução isotónica com o sangue. As soluções aquosas devem ser adequadamente tamponadas (por exemplo, a um pH de desde 3 a 9), se necessário. A preparação de formulações parentéricas adequadas sob condições estéreis é prontamente realizada por técnicas farmacêuticas padrão bem conhecidas dos peritos no estado da técnica.

[00132] As formulações adequadas para administração parentérica incluem soluções para injecção estéreis aquosas e não-aquosas que podem conter anti-oxidantes, tampões, bacteriostatos e solutos que tornam a formulação isotónica com o sangue do receptor pretendido; e aquosa e não-aquosa suspensões estéreis que podem incluir agentes de suspensão e agentes espessantes. As formulações podem ser apresentadas em recipientes uni-dose ou multi-dose, por exemplo, ampolas seladas e frascos, e podem ser armazenadas em um (liofilizado) condição liofilizada requerendo apenas a adição do veículo líquido estéril, por exemplo água para injecções, imediatamente antes da utilização. As soluções e suspensões injetáveis extemporâneas podem ser preparadas a partir de pós estéreis, grânulos e comprimidos do tipo previamente descrito.

[00133] Assim, as composições farmacêuticas da presente invenção são, particularmente, adequados para administração parentérica, por exemplo, por via intravenosa, a administração.

[00134] Alternativamente, as composições farmacêuticas podem ser administradas por via intranasal ou por inalação (por exemplo, sob a forma de uma apresentação de spray de aerossol a partir de um recipiente pressurizado, bomba, pulverizador ou nebulizador com a utilização de um propulsor adequado, tais como diclorodifluorometano, trichlorofluoro- metano, dichlorotetrafluoro-etano, um hidrofluoroalcano tais como 1, 1, 1, 2-tetrafluoroetano (HFA 134A3 ou 1, 1, 1, 2,3,3,3-heptafluoropropano (HFA 227EA3), dióxido de carbono ou outro gás adequado). No caso de um aerossol pressurizado, a unidade de dosagem pode ser determinada proporcionando uma válvula para entregar uma quantidade medida. O recipiente pressurizado, bomba, pulverizador ou nebulizador pode conter uma solução ou suspensão do polipeptídeo activo, por exemplo, utilizando uma mistura de etanol e o propulsor como solvente, que pode adicionalmente conter um lubrificante, por exemplo, trioleato de sorbitano. Cápsulas e cartuchos (feitos, por exemplo, a partir de gelatina) para uso em um inalador ou insuflador podem ser formulados para conter uma mistura em pó de um composto de o invenção e uma base em pó adequada tal como lactose ou amido.

[00135] As composições farmacêuticas serão administradas a um paciente em uma dose farmaceuticamente eficaz. Uma "quantidade tera- peuticamente eficaz" ou "quantidade eficaz" ou "terapeuticamente eficaz", tal como aqui utilizado, refere-se à quantidade que proporciona um efeito terapêutico para uma dada condição e regime de administração. Esta é uma quantidade pré-determinada de material activo calculada para pro- duzir o efeito terapêutico desejado em associação com o aditivo e o dilu- ente requerido, isto é, um transportador ou veículo de administração. Além disso, pretende-se significar uma quantidade suficiente para reduzir e / ou prevenir, um défice clinicamente significativo na atividade, função e resposta do hospedeiro. Alternativamente, uma quantidade terapeutica- mente eficaz é suficiente para causar uma melhoria clinicamente significativa uma condição em um hospedeiro. Como é apreciado pelos técnicos versados no assunto, a quantidade de um composto pode variar em função da sua actividade específica. As quantidades de dosagem adequada pode conter uma quantidade predeterminada de composição ativa calculada para produzir o efeito terapêutico desejado em associação com o diluente requerido. Nos métodos e utilização para a fabricação de composições de acordo com a invenção, uma quantidade terapeuticamente eficaz do componente activo é proporcionado. Uma quantidade terapeuti- camente eficaz pode ser determinada pelo médico trabalhador comum especialista com base em características do doente, tais como idade, peso, sexo, condição, complicações, de outras doenças, etc, como é bem conhecido no estado da técnica. A administração da dose farmaceutica- mente eficaz pode ser efectuada tanto através de administração única sob a forma de uma unidade de dose individual ou então várias unidades de dosagem menores e também por administração múltipla de doses subdivididas em intervalos específicos. Alternativamente, pode ser fornecida como uma infusão contínua ao longo de um período prolongado.

[00136] O agente definido acima em relação ao primeiro aspecto da presente invenção pode ser formulado em várias concentrações, dependendo da eficácia / toxicidade do composto a ser utilizado. A formulação pode compreender o agente activo a uma concentração de entre 0,1 μM e 1 M, entre 1 μM e 500 μM, entre 500 μM e 1 m, entre 300 μM e 700 μM, entre 1 μM e 100 μM, entre 100 μM e 200 μM, entre 200 e 300 μM μM, entre 300 e 400 μM μM, entre 400 μM e 500 μM e cerca de 500 μM.

[00137] Será apreciado ppelos técnicos versados no assunto que as composições farmacêuticas da invenção podem ser administradas sozinhos ou em combinação com outros agentes terapêuticos utilizados no tratamento de um câncer da próstata, ou antes, depois ou ao mesmo tempo que

[00138] No tratamento do paciente com outras modalidades terapêuticas para o tratamento do câncer da próstata, tais como a cirurgia (por exemplo, a prostatectomia radical), terapia de radiação, braquiterapia, terapia de radiação com feixe externo, de alta intensidade ultra-som focalizado (HIFU), quimioterapia, fármacos quimioterapêuticas orais , crioci- rurgia (congelamento do tumor), a terapia hormonal (por exemplo, a terapia anti-androgénio), castração ou combinações dos anteriores.

[00139] A presente invenção também proporciona um kit compreendendo um agente tal como definido acima em relação ao primeiro aspecto da presente invenção ou uma composição farmacêutica tal como definida acima.

[00140] A presente invenção também proporciona um agente para utilização em medicina, substancialmente tal como aqui descrito.

[00141] A presente invenção também proporciona uma composição farmacêutica substancialmente como aqui descrita.

[00142] A presente invenção também proporciona a utilização de um agente substancialmente como aqui descrito.

[00143] A presente invenção também fornece um método de tratamen to substancialmente como aqui descrito.

[00144] A presente invenção também proporciona um kit substancialmente como aqui definido.

[00145] De acordo com um aspecto da invenção, um método terapêutico é fornecido, o qual método de tratar o câncer da próstata primário e disseminada, com um agente tal como definido acima.

[00146] De acordo com outro aspecto da invenção, um método de te rapia é fornecido, o qual método pode ser utilizado para o tratamento de metástases, tais como a metástase gânglio linfático e / ou metástases ósseas, incluindo micrometástases.

[00147] De acordo com ainda outro aspecto da invenção, um método terapêutico é fornecido, método esse que pode ser utilizado para em conjunto com ou depois da radioterapia externa, citostática, e tratamentos de androgénio, ou outros tratamentos não acopladas a anticorpos terapêuticos do tumor alvo / fragmentos.

[00148] De acordo com aspectos específicos da presente invenção, anticorpos marcados com terapia, que são específicos para o PSA e / ou a hK2, são fornecidos, os anticorpos marcados com que são usados para tratar o câncer da próstata, isto é, de PSA e / ou produção de tecido de hK2.

[00149] De acordo com outro aspecto da invenção, as utilizações dos referidos métodos são fornecidos.

[00150] O método de terapia de acordo com a presente invenção tem a vantagem sobre a arte anterior que permite a terapia do câncer da próstata, e o referido método de terapia também pode ser utilizado para tratar metástases, incluindo micrometástases, tais como gânglio linfático metástase, ou qualquer um dos outros formas de metástases, como descrito acima, e ser utilizado em conjunto com ou depois do pós procedimento operatório, e durante ou após os tratamentos de radiação, citostá- ticos, e de androgénio.

[00151] A descrição anterior de formas de realização de foca a presente invenção aplicável a um método terapêutico do câncer da próstata. No entanto, será apreciado que o invenção não está limitada a esta aplicação, mas pode ser aplicada a muitas outras combinações de terapias, incluindo, por exemplo, metástases, exames pós-operatórias, e exames durante ou após os tratamentos de radiação, citostáticos, e de androgé- nio. Em relação a terapia de metástase as metástases serão tratados em glândulas linfáticas.

[00152] Em uma outra concretização cirurgia radioguiada (RGS) ou cirurgia guiada por imagem (IGS) pode ser utilizado para identificar porções de ligação específica anti-calicreína marcado com traçadores como descrito acima (tais como PSA e / ou hK2-anticorpos) durante e / ou antes da cirurgia . Assim, um agente que compreende uma fracção de ligação e uma porção detectável tal como discutido acima pode ser administrada durante e / ou antes da cirurgia. Nesta concretização o agente, tal como um ligante marcado anti-PSA e / ou anticorpo anti-hK2-, pode ser infundido em primeiro lugar. Em seguida, RGS / IGS podem ser usadas para identificar PSA / hK2 produzir tecido com um instrumento de detecção sensível à porção detectável, antes ou durante a cirurgia. A porção detectável pode ser, por exemplo, ser um emissor de radiação ou porção detectável magnética-sensível; ele pode, por exemplo, ser um emissor de radiação de Cerenkov e / ou Bremsstrahlung; pode ser um marcador fluorescente e / ou uma etiqueta magnética ou magentizable. Por conseguinte, o RGS / IGS de acordo com a presente invenção podem, por exemplo, ser um método que se baseia na detecção de óptica, de Cerenkov, Bremsstrahlung, ou radiação beta; a detecção de um marcador de radio- nuclidos, e / ou pode envolver magnetometria. RGS é bem conhecido para o técnico versado no assuntocomo uma técnica cirúrgica que permite ao cirurgião identificar tecido "marcados" por a porção detectável.

[00153] As visualizações obtidas de acordo com o acima pode ser combinado com outros métodos de visualização radiológicas, tais como SPECT / PET, a tomografia computadorizada (TC), ultra-sons (US), e a tomografia de ressonância magnética (MRT).

[00154] Assim, em um segundo aspecto, a presente invenção também proporcionam um agente compreendendo ou consistindo de uma porção de ligação com especificidade para uma proteína de calicreína (tal como, descrito acima em relação ao primeiro aspecto da presente invenção) e uma porção detectável, tal como discutido acima no que diz respeito ao primeiro aspecto da presente invenção para utilização em medicina, por administração a um paciente com câncer da próstata antes ou durante a cirurgia, tais como cirurgia radioguiada ou cirurgia guiada por imagem.

[00155] Assim, o segundo aspecto também proporciona a utilização de um agente que compreende ou consiste de uma porção de ligação com especificidade para uma proteína de calicreína e uma porção detectável na fabricação de um medicamento para administração a um paciente com câncer da próstata antes ou durante a cirurgia, tais como radioguia- da ou cirurgia guiada por imagem.

[00156] O segundo aspecto da presente invenção também fornece uma cirurgia método, tal como radioguiada ou cirurgia guiada por imagem, isto é realizado em um paciente com câncer da próstata, o método compreendendo o etapa de administrar uma quantidade eficaz de um agente que compreende ou que consiste em um porção com especificidade de ligação para uma proteína de calicreína e uma porção detectável ao paciente antes ou durante a cirurgia.

[00157] Contempla-se que qualquer método, o agente ou composição aqui descrita pode ser implementada com respeito a qualquer outro método, o agente ou composição aqui descrita.

[00158] A utilização da palavra "um" ou "uma", quando utilizado em conjunção com o termo "compreendendo" nas reivindicações e / ou no relatório descritivo pode significar "um", mas também é consistente com o significado de "um ou mais, "pelo menos um" e "um ou mais do que um".

[00159] Estas, e outras, concretizações da invenção será melhor apreciado e compreendido, quando considerada em conjunto com a descrição acima e os desenhos que a acompanham. Deve ser entendido, no entanto, que a descrição acima, embora indicando concretizações diferentes da presente invenção e eumerosos detalhes específicos da mesma, é dada a título de ilustração e não de limitação. Muitas substituições, modi- ficações, adições e / ou rearranjos podem ser feitas dentro do escopo de aplicação da invenção, sem nos afastarmos do espírito da mesma, e a invenção inclui todas essas modificações, substituições, adições e / ou rearranjos.

[00160] Os desenhos seguintes formam parte do presente relatório descritivo e estão incluídos para demonstrar adicionalmente certos aspectos da presente invenção. A invenção pode ser melhor compreendida por referência a um ou mais destes desenhos em combinação com a descrição detalhada das concretizações específicas aqui apresentadas.

Breve Descrição dos Desenhos

[00161] A Fig. 1 mostra a cinética de 125I marcado com anticorpo PSA30 em vários tecidos após administração intravenosa em camundongos normais.

[00162] A Fig. 2 mostra a cinética de 125I marcado com l anticorpo PSA30 em vários tecidos após administração intravenosa em camundongos implantados com células do tumor de xenoenxerto de próstata me- tastático, e isso mostra que as células de tumor da próstata metastático mostram uma forte assumir a PSA30 anticorpo.

[00163] A Fig. 3 mostra proporções tumoral-a-Órgãos de 125I-PSA30 após injeção intravenosa em camundongos nus portadores de tumores subcutâneos baseados em LNCaP em vários tempos após a injecção (n = 34). Os valores mais elevados indicam uma proporção maior especificidade de captação no tumor do que no tecido identificado.

[00164] As Figs. 4A-H mostra os resultados da auto-radiografia digital: absorção individualmente normalizada de 125I-PSA30 (Fig. 4A) e 8 F- colina (Figura 4B.), 48 h pós-injecção de 125I-PSA30 mais 1h após a in- jecção de labeled- colina, na mesma secção do tumor separados por isótopo. A análise histológica através de H & E (Fig. 4C, as Figs. 4E-F) e a expressão do PSA utilizando anticorpo 2E9 PSA total (Fig. 4D, as Figs. 4G-H) foram verificadas utilizando seções adjacentes. Não há associação direta entre áreas de alta absorção PSA30 mAb e alta absorção de colina. Nota: este rato foi permitido a livre circulação após a injeção de 18F- colina. 209x297mm (300 x 300 dpi)

[00165] A Fig. 5 mostra a cinética de 125I marcado com 5A10 anticorpo em vários tecidos após administração intravenosa em camundongos normais.

[00166] A Fig. 6 mostra a cinética de 125I marcado com anticorpo 11B6 em vários tecidos após administração intravenosa em camundongos normais.

[00167] A Fig. 7 mostra a cinética de 125I marcado com anticorpo 11B6 em vários tecidos após administração intravenosa em camundongos implantados com células do tumor de xenoenxerto de próstata metastático. Absorção órgão expresso como % IA / g ao longo do tempo.

[00168] A Fig. 8 mostra a biodistribuição de 111LN-11 em xenoenxertos de LnCAP B6. A acumulação de radioatividade atingiu um pico após 48 hpi com 16,4 ± 1,92% IA / g (cento actividade injectada por grama). A absorção em órgãos normais (fígado, baço, rins, ossos, próstata, testículos) estão a um nível inferior. Uma pouca absorção elevada foi observada nas glândulas salivares, provavelmente, devido a uma certa expressão normal de expressão de hK2.

[00169] A Fig. 9 mostra alguns exemplos de radionuclidos terapêuticos.

[00170] A Fig. 10 mostra uma ilustração do princípio do PAT. Na presença de radiação externa em dose baixa, um agente de Z elevado tumor-alvo produz um grande aumento da dose absorvida local em células tumorais alvo.

[00171] A Fig. 11 mostra um exemplo de como as nanopartículas podem ser utilizadas para imagiologia e terapia multimodal por ligação ao agentes de direcionamento de tumor como anticorpos.

[00172] A Fig. 12 mostra as relações tumor / sangue. Os proporção aumenta ao longo do tempo, indicando uma segmentação ativa de hK2 com 111 LN 1 B6 em tumores LnCAP.

[00173] A Fig. 13 mostra a biodistribuição comparativa de 111 LN-11 B6 em hK2-expressam xenotransplantes (LnCAP) e hK2-negativos xeno- transplantes (DU145) às 48 hpi. Os resultados mostraram uma diferença estatisticamente significativa (P <0,005) entre os dois xenoenxertos na acumulação do tumor, enquanto que a acumulação de radioactividade na maioria dos órgãos normais permaneceu no mesmo nível. LnCAP tinha absorção do tumor mais de 3 vezes maior do que o DU145. Isto indica que a 111LN-11 B6 é específica de hK2.

[00174] A Fig. 14 mostra a sequência e estrutura de aminoácidos epi- topo de PSA, de acordo com Leinonen, J. et al. Clin Chem 2002; 48: 2208-22 6.

[00175] A Fig. 15 mostra uma trama de Scatchard de um exemplar 5A10-Fab.

[00176] A Fig. 16 mostra a cinética de rotulagem de 177 Lu-1 1 B6.

[00177] A Fig. 17 mostra a estabilidade in vitro de 177Lu-11B6 em PBS e EDTA.

[00178] A Fig. 18 mostra imagens representativas de SPECT de 77Lu- 11 B6 em xenoenxertos LnCAP.

[00179] A Figo. 19 mostra a biodistribuição de 177 Lu-1 1 em xenoen- xertos LnCAP B6.

[00180] A Fig. 20 mostra a biodistribuição detalhada às 72h pi de 177Lu-11B6 em xenoenxertos LnCAP

[00181] A Fig. 21 mostra os in vivo biocinética de 77Lu-11B6 em xeno- enxertos LnCAP.

[00182] A Fig. 22 mostra fotografias representativas de tamanho do tumor antes (imagem à esquerda) e depois (imagem à direita) tratamento com 77Lu-11B6.

[00183] Figo. 23 mostra um resumo do efeito de (a) uma dose única 177Lu-11B6, (b) dose dupla 177Lu-11B6 e (c) tratamento de controle no tamanho do tumor em xenoenxertos LnCAP.

[00184] A Fig. 24 mostra (A) os dados de crescimento do tumor e (b) uma imagem SPECT para um LnCAP xenoenxertos de camundongo tratado com uma dose única de 77Lu-11B6

[00185] Os exemplos seguintes são incluídos para demonstrar as con-cretizações particulares da invenção. Deve ser apreciado por técnicos versados no assunto que as técnicas divulgadas nos exemplos que se seguem representam técnicas descobertas pela invenção para funcionar bem na prática da invenção, e, assim, podem ser consideradas como constituindo de modos específicos para a sua prática. No entanto, os especialistas na técnica devem, à luz da presente descrição, apreciar que muitas alterações podem ser feitas nas concretizações específicas que são reveladas e ainda assim obter um resultado igual ou semelhante sem se afastar do espírito e escopo da invenção.

Exemplo 1 - Biodistribuição de 125l-PSA30 e 125I-11B6

[00186] Material e Método: O PSA30 e anticorpo 11B6 foram marcados com 125I (PerkinElmer, EUA), utilizando o método lodogen. Resumidamente, em um tubo de ensaio revestida com 150 g de 1,3,4,6- tetracloro-3a,6a-difenil glicolurilo foi utilizado para a marcação de 200 g de PSA30. Depois da mistura ter sido incubada durante 15 min à temperatura ambiente, os componentes de baixo peso molecular foram removidos por filtração em gel (PD-10 coluna, GE Healthcare, Reino Unido). A pureza radioquímica foi de 95% depois de filtração em gel.

[00187] Resultados e discussão: Veja as Figs. 2 e 3. Os tumores LNCaP apresentaram maior em comparação com a absorção de outros órgãos investigados na maioria dos pontos de tempo e atingiu o pico (4,32% IA / g) em 24 h após a injecção intravenosa de 25 formulações I- PSA30. Ao contrário de todos os outros órgãos que mostrem uma diminuição de actividade, os tumores LNCaP mostrou um aumento marcante da atividade (32%) durante as primeiras 24 horas após a injecção Em comparação com camundongos não portadores de tumor, a acumulação de tireóide foi grandemente aumentada. A captação 25I- PSA30 mAb em tumores LNCaP picos a 24 h após a injeção, com uma forte queda subsequente na captação de tumor observado por 72 horas após a injecção. É importante ressaltar, neste mesmo ponto de tempo, há um grande aumento na captação da tireóide. Esta correlação inversa é um indicador de probabilidade de que um efeito de desalogenação ocorreu. Em conclusão, 125 I-PSA30 pode efetivamente atingir o fPSA xenoenxerto em camundongos baseados em LNCaP.

Exemplo 2 - Biodistribuição de 111LN-DTPA-11B6

[00188] Material e Método: As experiências com animais foram realizadas em conformidade com a legislação nacional relativa à proteção de animais de laboratório. O estudo animal foi aprovado pelo Comitê de Ética local para Pesquisa Animal. camundongos masculino nus imunodefici- entes (6-8 semanas de idade) comprados na Taconic Europa (Bomholt, Dinamarca) foram usados para este estudo. Os xenoenxertos de carcinoma da próstata hK2 células que expressam LNCaP foram implantadas subcutaneamente no flanco direito. Para xeno, células LNCaP, 5,2 x 106 células / ratinho em 100 pL meio celular e 100 pL de Matrigel (Ciências da BD, Bedford, EUA). Células DU145 (uma linha celular de hK2- negativa), 1-2 x 10 6, foram implantadas SC no flanco direito para servir como um controlo negativo. Três e seis semanas após a injeção de células LNCaP, 5 grupos de ratos (4-5 animais / grupo) transportando xeno- enxertos de LNCaP e um grupo (3 animais / grupo) que transportam xenografts DU145 foram cada iv. injectados com 100 μl111 ln-DTPA-11 B6 (~ 200 kBq em 100 μl e 22,5 pg de proteína). Os animais foram saqueadas em um momento diferente, 4h, 24h, 48h, 72h ou 168 horas pi e do grupo de controlo em Órgãos 48h pi de interesse (ver tabela) foram colocados em 20 ml frascos para contagem de cintilação (Zinsser Analytic, Frankfurt, Alemanha) pesados e medidos em um contador gama Automated com 3 polegadas Nal (TI) detector (1480 Assistente OY, Wallac, Turku, Finlândia). Todos os órgãos foram medidos duas vezes após a dissecação, e após o último ponto de tempo. A medição da radioactividade foi realizada como um protocolo padrão abaixo.

[00189] Utilizou-se um protocolo padrão para a medição de um radio- nuclídeo: Medição da radioactividade. As contagens por minuto corrigido com o nível de fundo foram usadas para a avaliação. O valor de absorção de tecido, expressa como percentagem da dose injectada por grama de tecido (% ID / g), foi calculado como:

[00190] Em

[00191] % ID / g = (radioatividade tecido / radioatividade injetada) / pe so do órgão x 100 em que para injeções iv:

[00192] Radioatividade injetada = radioatividade média em seringas de controle - radioactividade na seringa usada - radioactividade na cauda

[00193] Resultados e discussão: Veja as Figs. 8, 12 e 13. Os resultados preliminares mostraram que 1 1 In- 11 B6 foi efetivamente acumulação no tumor ao longo do tempo, atingindo um máximo de 48 hpi com 16,4 ± 1,92% IA / g (cento actividade injectada por grama). Absorção de radioactividade em órgãos normais (fígado, baço, rins, ossos, próstata, testículos) estão a um nível inferior. Um pouco absorção elevada foi observada nas glândulas salivares, provavelmente devido a uma certa expressão normal de expressão de hK2 (Fig. 8). Isso vai ser investigado em estudos futuros. Além disso, o 1 1 B6 LN-DTPA-11 era específica de hK2, desde que foi significativamente menor absorção no controlo negativo xenoenxertos DU145 (Fig. 13). A razão tumor / sangue foi aumentando ao longo do tempo, indicando que mais e mais de 1 1 ln-DTPA-11 B6 retomado no tumor (Figura 12). Em conclusão, os dados de biodistribuição 11 LN-11 B6 mostra propriedades de direccionamento de tumor promissores no câncer da próstata, indicando o potencial para a terapia de carci- noma da próstata utilizando outros radionuclídeos.

Exemplo 3 - Autorradiografia por imagem digital

[00194] Materiais e métodos: PRA foi realizada em animais injectados com 125 I-PSA e 18 F- colina. Os animais foram sacrificados uma injeção de pós hora de sondas metabólicas e tumores foram removidos imediatamente, garantiu em Cryomount (produtos HistoLab AB, Suécia), rapidamente congelados em nitrogênio líquido e cortadas em seções de 100 μm para DAR ou 20 seções PM para histopatologia e imuno-histoquímica (IHQ ) análise. Um sistema detector base de silício tira, (Biomolex 700 Imager; Bimolex AS, Oslo) foi utilizado para a imagem da distribuição de radioactividade nas secções mais espessas. Diferenças em ambos os espectros e velocidade de decaimento de emissão foram usadas para produzir imagens separadas de cada um radionuclídeo em animais injec- tados com mais do que um radionuclídeo, neste caso, 125I e 18F.

[00195] Resultados e discussão: Ver resultados nas Figs. 4A-H. Com base nestes dados, que demonstram que a absorção PSA30 mAb em tumores excisados atingiu um máximo de 24 horas após a injecção intravenosa, e é mantido no tumor, em comparação com tecidos normais. As razões de E / S relativamente baixas T (ver quadro na Fig. 3) pode ser atribuída a fatores; tais como: uma barreira de local de ligação, visto que uma baixa dose de anticorpo é saturado por os antígenos fPSA no espaço perivascular evitando assim a penetração mais profunda no interior do tumor sólido; permeabilidade vascular insuficiente no interior do tumor; ou desiodação do anticorpo (tal como sugerido pelo elevado acumulação de iodo na tiróide). Duas maneiras de melhorar os índices T / O seria aumentar a dose de anticorpo e testar diferentes radiomarcadores. Apesar desta desvantagem, encontramos um acúmulo da atividade de 125I- PSA30 no tecido tumoral.

[00196] A imuno-histoquímica e histopatologia (ver resultados nas Figs. 4A-H), para estudar PSA, 20 pm (criocortes tumorais congelados e fixados como descrito acima) foram analisados utilizando IHC. A imunor- reactividade contra o PSA ou hK2 foi visualizada por utilização do kit DA- KO EnVision sistema Flex / HRP (DAKO Corporation). Seções de tumores adjacentes também foram coradas com hematoxilina (núcleos mancha) e eosina (mancha citoplasmática) (H & E) ea morfologia geral analisada sob um microscópio transillumination padrão. Com coloração H & E, regiões viáveis das seções de tumor e áreas de necrose foram coradas. Como um controle positivo, as seções tumorais LNCaP foram incubadas com o mAb 2E9 PSA, a uma diluição de 1:1000 e visualizada como descrito acima. Como controlo negativo, a secção do tumor de um ratinho que recebeu uma injecção intravenosa de PSA30 foi visualizada sem incubação de um anticorpo secundário, mas incluindo todos os outros etapas de IHC. Os cortes corados foram escaneados usando um scanner de microscópio Zeiss Carl MIRAX Scan e visualizados com o software MIRAX Viewer (Carl Zeiss Imaging Solutions GmbH, Alemanha).

Exemplo 4 - Radiomarcação

[00197] Lodinação direta (125 1/1241/31 de 1): Proteínas (10 pi, 1 mg / ml em PBS) foram misturados com 25 L de solução de Nal (4 MBq) usando o Cloramina T (CAT, Sigma St. Louis, método MO, EUA). A reacção foi iniciada pela adição de CAT em PBS (10 μl, 2 mg / ml) e incubou-se durante 1 min durante a agitação vigorosa e, em seguida, terminada pela adição de metabissulfito de sódio (20 μl, 2 mg / mL). Proteínas marcadas foram separadas a partir de não-reagido de 125 I e baixo peso molecular, componentes da reacção por cromatografia de exclusão de tamanho em uma coluna NAP-5 (Sephadex G-25, GE Healthcare) pré-equilibrada com PBS.

[00198] Iodação Indireta (125 I /124 I /31 I /11 A): marcação do precursor, p- de N-succinimidilo (trimetilestanil) benzoato de metila (SPMB), foi preparado de acordo com Orlova et al em Nucl Med Biol 27: 827-835 (2000 ), e 5 pg de SPMB foi adicionado a 5 MBq de 125 um ou 211 no em uma solução a 5% de ácido acético. Para iniciar a reacção, foi adicionado 40 pg de cloramina T (Sigma, St. Louis, Mo.) em solução aquosa. A mistura de reacção foi agitada durante 5 min, e 80 pg de sódio-meta-bissulfato de (Aldrich, Steinheim, Alemanha) na solução aquosa foi adicionado para parar a reacção. O precursor marcado radioactivamente foi adicionado a 40 pg de proteína em solução tampão de borato 0,07 M, pH 9,2. A reação de acoplamento foi realizada à temperatura ambiente durante 45 minutos com agitação contínua. Variantes proteicas marcadas foram separados dos produtos de baixo peso molecular utilizando uma coluna de exclusão de tamanho NAP -5 ™ (GE Healthcare), equilibrada com PBS. As variantes de proteínas marcadas radioactivamente foram então analisadas uma IR Um teste (de acordo com Evans et al, submetido para CBR) para verificar que o procedimento de marcação não tinha afetado a afinidade de ligação para o seu objetivo.

[00199] Radiomarcação com 177LU: Conjugação de isotiocianato- benzil-CHX-A "-DTPA (130 nM) para proteína (60 n / Vf) foi realizada em 220 | iL de borato 0,7 M, pH 9,2 durante a noite em um banho de água a 37 C ° O. conjugado CHX-proteína foi purificada em um tamanho de NAP-5 coluna de exclusão (GE Healthcare, Uppsala, Suécia), utilizando tampão de acetato de sódio 0,2 M pH 5,5 como eluente, e, em seguida, dividido em dez lotes que foram usados mais tarde para o tempo de que- lação de quelação. Foi optimizado por amostragem, a uma processo de quelação em curso e verificar a pureza do quelato em cromatografia de camada fina instantânea (ITLC) placas SG (Biodex) com 0,2 M de citrato tampão de corrida. As placas foram analisadas em um Phosphorimager ciclone (Perkin Elmer, Wellesley, MA , EUA). quelação foi considerada completa após 30 minutos à temperatura ambiente. A quantidade de luté- cio radioativo foi variada dependendo das necessidades de experiências individuais.

[00200] Para testar a presença de 77Lu fracamente quelatado foram realizados desafios com EDTA. Amostras em triplicado de o produto que- lado foram desafiados com 200:1 ou 1.000:1 excesso molar de EDTA quelante em contra uma incubação durante a noite a 37 ° C. A concentração de EDTA foi calculada com a suposição de que a conjugação foi quantitativa, obtendo-se assim um valor médio de duas moléculas-CHX- DTPA por um anticorpo. Amostras das soluções foram então analisadas por ITLC, como acima. Como um controlo, as amostras em triplicado de [177 Lu] -protein também foram mantidos em PBS a 37 ° C ou 4 ° C durante a noite.

Exemplo 5 - Estabilidade in vivo

[00201] Para analisar a estabilidade in vivo dos conjugados marcados radioativamente, os camundongos normais são injetados I.V. com radio- marcadores e sacrificados após diferentes intervalos de tempo. O sangue é então recolhido, centrifugado a 5.000 g. As amostras de sangue são então separados em colunas NAP-5 (corte, 5 kDa) equilibrada com PBS, e a quantidade relativa de radioactividade presente no-fracção de elevado peso molecular é determinado.

Exemplo 6 - Sobrevivência celular para efeitos de monitoramento de terapia

[00202] As células são semeadas em placas de Petri (diâmetro de 6 cm, aproximadamente 2 x 10 5 células / prato). Após 48 horas, as proteínas marcadas radioactivamente (57 ng / prato, ou 287 ng / placa, que corresponde a cerca de 1: 1 e 5: 1 por anticorpos antígeno) são adicionados às células. A fim de determinar o efeito de 125 131 l / 177 Lu nos meios de comunicação, alguns dos pratos são pré-incubados com uma quantidade em excesso de proteína não marcada (29 pg / prato). Pratos extras são usados para estimar o número de decaimentos por célula (DPC). Nestes pratos, a absorção celular de proteína radiomarcada é medida a seis pontos de tempo durante a incubação de 24 horas. As células são, então, lavadas seis vezes com meio isento de soro a frio, e a incubação é continuada em meio de cultura fresco. As células são contadas aproxi-madamente uma vez por semana, e são re-semeadas a cada 2 semanas. O DPC são estimados através do cálculo da área sob a curva de absorção para as duas concentrações de anticorpos, bem como para os pratos bloqueados. Para a menor concentração de proteína marcada radioacti- vamente, as células recebem aproximadamente 56 DPC, e o mais elevado de aproximadamente 150 DPC, enquanto que as células bloqueadas receber cerca de 2 DPC. Os resultados obtidos são analisados por regressão não linear (crescimento exponencial), usando 1 / Y2, como o factor de ponderação

Exemplo 7 - Estudos in vivo

[00203] Os seguintes modelos de xenoenxerto são utilizados: LnCAP, DU145, PC-3 modelos tumorais. O PSA é expresso por todas as três linhas de células enquanto que hK2 é expressa por LnCAP e não expresso em DU145 ou PC-3.

[00204] Para xeno, LNCaP, DU145 ou células (2-10 milhões de células), colhidas em 0,02% de tripsina PC-3 / PBS foram novamente suspensas em mídia e injectados no flanco direito com 200 μl_ de suspensão de células contendo uma quantidade igual de Matrigen ( BD Biosciences, Bedford, MA). A formação de tumores foi monitorado visualmente ou por palpação.

[00205] Experimento de bloqueio: A experiência de bloqueio em Biodistribution Experimento I foi realizada a fim de estabelecer se a absorção de proteínas em tumores radiomarcados foi hK2 específica ou não. Antes da injecção intravenosa de grande proteína radiomarcada, 0,8 - 3,0 mg de proteína não marcada foi injectado iv no grupo bloqueado do rato. Captação de radioatividade em 24-72 h após a injecção entre os grupos desbloqueados e bloqueados foram comparados.

[00206] Optimização da atividade específica: Esta experiência é conduzida para determinar a influência da actividade específica (isto é, a do- se de proteína injectada do conjugado radiomarcado) na W captação tumoral. Uma série de proteína-Lu marcado com várias actividades específicas pré-determinadas são preparados. Uma alíquota da proteína 77Lu- marcada é diluída com uma solução de estoque de proteína não marcada para proporcionar doses de injeção variando de 10 pg a 500 g por rato LnCAP- rolamento. Dois ou três dias após a injeção, os animais são sacrificados. Órgãos e tumores são removidos e medidos para a absorção de radioactividade. A atividade específica que prevê a captação tumor mais ideal é ainda considerado para dosimetria.

[00207] Exemplo de determinação dosimetria: camundongos portadores LnCAP (4 ratos / grupos) são injectados com 177 proteína Lu-rotulado. Os animais são sacrificados 4 hpi - 2 semanas pós-injecções. Dose absorvida a diferentes órgãos é calculado usando esquema MIRD. As curvas de tempo-actividade será obtido para todos os órgãos de tecidos de interesse no corpo (animal). Os estudos irão se basear na imagiologia quantitativa de SPECT e / ou PET. Integração das curvas dará atividade acumulada. Usando o formalismo de MIRD com base na próprio calculo (com base em geometrias específicas e técnicas de Monte Carlo para valores frações absorvidos) de S vai ser utilizado para converter a activi- dade acumulada dose absorvida. Em muitos casos, a dose transversal tem de ser cuidadosamente calculados o que significa que os cálculos de Monte Carlo de dosimetria com base irá ser feito (Hindorf, et al (2004) J. Nucl Med, 45: 1960-1965; Larsson, et al (2007) Cancer & Biotherapy ra- diofármacos, 22: 438-442; Larsson, et al (201)> CCPA Oncol, 50: 973980).

[00208] Exemplo de SPECT e PET imaging: PET-CT e SPECT-CT é uma parte integrante da terapia de radionuclídeo. Isso dá uma ideia da extensão em que o material radioactivo se acumula nos tecidos e ajuda a fornecer uma estimativa da dose terapêutica necessária e os seus efeitos. Para bons resultados de tratamento, uma dose suficiente de radiação deve ser entregue ao tumor. Isto é confirmado por imagiologia, tal como discutido nas referências acima mencionadas no que respeita a dose de planeamento, o conteúdo do qual está aqui incorporada por referência.

[00209] Radiobiologia: Os métodos de dosimetria específicos baseados em paciente / laboratoriais geometrias animais individuais serão utilizados para uma dosimetria adequada e pode estar relacionada com os efeitos biológicos e dá a possibilidade de correlação com efeitos radiobio- lógicos e optimizado para a terapia de pacientes individuais.

Exemplo 8 - Determinação da afinidade de ligação Método de Scatchard

[00210] A afinidade de ligação (Kd) das variantes de anticorpos produzidas foram determinadas usando o método para uma de Scatchard de acordo com Scatchard, Ann NY Acad Sei 51: 660-72 (1949).

[00211] Em breve, uma concentração fixa de anticorpo (ou, neste caso, um fragmento de anticorpo Fab) e variando as concentrações de Eu 3+ "foram usadas PSA marcadores marcados.

Ressonância de Plasma de Superfície

[00212] A cinética de ligação e afinidade das variantes de anticorpos pode também ser determinada por análise de interacção bioespecífica em tempo real em um instrumento Biacore. Em breve, o PSA ou hK2 é imobilizada em um chip sensor CM5 por acoplamento de amina e os níveis de imobilização alcançado 1000-2000 unidades de resposta. O anticorpo anti-PSA ou derivados de anticorpos anti-hK2 (ambos mAb e o Fab diferente) são diluídos em concentrações que variam entre 0,1-10 nM em tampão HBS-EP. A cinética de ligação são estudados de 5 m em fase de associação e uma fase de dissociação de 30 min com um caudal de 50 L / min, seguido por regeneração. As constantes cinéticas são calculados usando um 1: modelo de ligação 1 Langmuir com correção para a transferência de massa.

Exemplo 9 - Ensaios imunorradiométricos (IRMA)

[00213] Anticorpos monoclonais baseados em ensaios imunorradiomé- tricos (IRMA) para mAb radiomarcado ou de qualidade de ligação do Fab foram realizados em triplicata como um ensaio em sanduíche de quatro etapas, com etapas de lavagem entre as incubações (tampão de lavagem: 10 mM Tris-HCl pH 8,0, 0,15 M NaCl, 0,05% de Tween 20). O ensaio foi construído e otimizado, de acordo com as recomendações estabelecidas. Placas de microtitulação fracionáveis foram revestidas com H1 17 (0,2 g / poço), um anticorpo monoclonal que reconhece o PSA livre ou total e calicreína humana 2 (hK2) com a mesma afinidade, 30 diluída em tampão de revestimento (75 mM de carbonato de sódio a pH 9,6) e incubadas durante a noite a 4 ° C. Os poços foram então incubados com 0,2 g / poço de tampão de têmpera (3% de gelatina de peixe em tampão de lavagem) durante duas horas à temperatura ambiente. Em seguida, os poços foram revestidos com 200 de plasma μl (fêmea) contendo 3 ng / μT. f PSA e incubou-se durante duas horas à temperatura ambiente. Radio- marcado e não marcado PSA30 foram então misturados em tampão de ensaio (50 mM Tris-HCl pH 7,5, 0,1 M NaCl, 5 mM de EDTA, 0,25% de BSA e 0,05% de Tween 20) em concentrações descendente e adicionadas aos poços (Volume total: 50 l / poço). A percentagem de anticorpo marcado por poço foi como se segue: 100, 92, 84, 68, 50, 30 e 0 por cento. As placas foram incubadas durante duas horas à temperatura ambiente, lavou-se e medida em um Nal (TI) - bem contador (1282 Compugam- ma CS; LKB Wallac, Turku, Finlândia). A diferença na capacidade de detecção de <25% em relação ao desvio teórico foi aceito para posterior aplicação. As estimativas de pós marcação qualidade detecção mostrou que o anticorpo radiomarcado manteve 70-90% da afinidade capacidade do anticorpo não marcado ligado.

Exemplo 10 - Radioimunoterapia com 177Lu-m11B6 em um modelo do rato com câncer da próstata

[00214] O câncer de próstata é o câncer mais comumente diagnosti- cado entre os homens no mundo ocidental, representando 25% de todos os novos casos de câncer e por 14% das mortes por câncer (22.700.443). Estratégias de tratamento curativo atuais (cirurgia e irradiação) só são bem sucedidas quando a doença é localizada à próstata. A estratégia terapêutica no caso de doença disseminada está limitado à castração, que muitas vezes só suprime o crescimento durante 12-18 meses antes de se tornar refractário, apesar de o meio privado de hormonas (Scher HI et al, Câncer da próstata. In: DeVita VT Jr , Hellman S, Rosenberg SA, eds 7 ed Philadelphia, PA: Lippincott Williams & Wilkins, 2005). Por causa da falta de terapias que têm sido provado a ter um efeito para além de uma resposta transitória, as novas terapias molecularmente direcionados são urgentemente necessários. Porque o câncer de próstata é radiossensível, apresenta-se um alvo ideal para radioimunote- rapia. Além disso, a radioimunoterapia tipicamente oferece elevados níveis de anticorpos circulantes de medula óssea e gânglios linfáticos, locais em que o câncer geralmente se espalha. Além disso, a radioimuno- terapia emprega um "efeito de fogo cruzado", o que, dependendo da gama de partícula emitida do radioisótopo escolhido, pode matar células espectadoras antígeno-negativa em torno sem ligação directa do anticorpo (16.029.058).

[00215] Calicreína humana 2 (hK2) é uma enzima que é conduzido androgénio unicamente expresso, em concentrações muito elevadas, em tecido prostático maligno e saudável. Uma vez que tem sido demonstrado hK2 para clivar a forma de zimogénio do Prostate Specific Antigen (PSA), acredita-se que uma das suas funções fisiológicas é actuar como um regulador da referida enzima. Tomados em conjunto, estes recursos biológicos fazer hK2 um alvo ideal em um sistema theragnostic (terapia e diagnóstico).

[00216] O objetivo deste estudo foi confirmar a utilidade de um B6, um mAb que se destina especificamente a um epitopo dentro da fenda catalí- tica de hK2, tal como um veículo para entregar radionuclídeos altamente tóxicos especificamente aos locais de crescimento de câncer da próstata. Neste estudo de prova de conceito, que escolheu para marcar o mAb com 177Lu, uma baixa de partículas beta de energia que também emprega emissão gama, permitindo-SPECT de imagem a ser executada.

Materiais e Métodos Materiais

[00217] 177Lu foi adquirida a partir de Mallinckrodt Medical BV, Petten, Holanda. O ciclone ™ de armazenamento de fósforo do sistema e o software de análise de imagem OptiQuant ™ (Perkin Elmer, Wellesley, MA, EUA) foi utilizado para medir a radioactividade no ITLC (cromatografia de camada fina instantânea) barretas (Biodex, EUA) para a determinação cinética de marcação e pureza radioquímica. Todos os produtos químicos foram obtidos a partir de Sigma Alchrich e os tampões foram preparados em casa utilizando água de grau analítico, se não indicado de outra maneira. O mAb B6 11 é um anticorpo específico para a calicreína humana com uma afinidade 2 para esse antígeno de cerca de 1,2 nM; veja-se SEQ ID NOs: 4 e 5 acima (obtido a partir da Universidade de Turku, Finlândia). Para os estudos in vivo, foram utilizadas as linhas celulares de carcinoma da próstata LNCaP que expressam hK2 (ATCC, Manassas, VA, EUA). As células foram cultivadas em meio RPMI 1640 suplementado com 10% de soro fetal de bovino e de pragas (penicilina 100 IU / ml e 100 mg / ml de estreptomicina). As células foram mantidas a 37 ° C em uma incubadora humidificada com 5% de C0 2 e foram destacadas com solução tripsina-EDTA (tripsina a 0,25%, EDTA a 0,02% em tampão, Thermo Scientific).

Conjugação e radiomarcação

[00218] Conjugação de CHX-A "-DTPA com 11 B6: Uma solução do mAb B6 1 em PBS foi ajustada para pH 9,2 utilizando tampão borato de sódio 0,07 M A amostra foi concentrada em um ultra-filtro centrífugo Ami- con 2 (2 ml, 100. . K) A solução de proteína foi conjugado com o agente quelante CHX-A "-DTPA (Macrocyclics, EUA) em uma razão molar de 3: 1 de quelante de anticorpo a 40 ° C. A reação foi terminada após 4 horas e CHX-A "-DTPA-11B6, de agora em diante chamado DTPA-B6 11, foi separado do livre por cromatografia de quelato de exclusão de tamanho em uma coluna NAP-5 (GE Healthcare), equilibrada com 20 ml de 0,2 M tampão acetato de amónio, pH 5.5. Conjugado 11 B6 e 5A10 foi eluída com tampão de acetato de amónio 1 ml.

[00219] A radiomarcação de DTPA-11B6: B6 DTPA- 1 em tampão de acetato de amônio pH 5,5 foram misturados com uma quantidade pré- determinada de 177 LuCI 3. Após incubação à temperatura ambiente durante 2h, a marcação foi terminada e purificada sobre uma coluna NAP-5, equilibrada com PBS. Rotulagem e etiquetagem de eficiência cinética foram monitorada com tiras ITLC, diluídos com ácido cítrico 0,2 M. Neste sistema, o conjugado radiomarcado permanece na linha de origem, enquanto livre Lu-177 migra com a frente do solvente. A distribuição da radioactividade foi determinada com um sistema de Phosphorlmager (Perkin Elmer, Wellesley, MA, EUA) utilizando o software de quantificação Optiquant como (Perkin Elmer, Wellesley, MA, EUA).

Superfície Ressonance Plasmon

[00220] A proteína hK2 (Departamento de Biotecnologia, Turku, Finlândia) em 10 mM de tampão de NaAc-, pH 4,0, foi imobilizado em um chip de grau de investigação CM4 comprado de Biacore por amino acoplamento utilizando N-hidroxissuccinimida (NHS), 1-Etil-3- ( 3- dimetilaminopropil) carbodiimida (EDC) e de cloridrato de etanolamina 1 M NaOH pH 8,5 em um sistema Biacore 2000. O mAb 11B6, seu conjugado DTPA-11B6 e Herceptin como uma referência inespecífica mAb, tudo em tampão Biacore foi voado mais de duas células de fluxo em cinco diferentes concentrações (0,5 nM, 5 nm, 10 nm, 50 nm e 100 nM) para detectar eventual ligação. Uma das duas células de fluxo continha hK2 imobilizado e o outro era uma referência em branco. O chip foi regenerado utilizando tampão de 25 mM de Glicina, pH 2,7.

Estudos de estabilidade in vitro

[00221] Estabilidade dos conjugados marcados foi testado em PBS e em um excesso de EDTA, mais de 500x em seguida EDTA DTPA conjugado em m11B6, incubou-se a 4 ° C durante 1 semana e 2 semanas e foram analisados por meio de tiras de ITLC, ver acima.

Estudos em animais

[00222] Todos os experimentos com animais foram realizados em con-formidade com a legislação nacional relativa à protecção de animais de laboratório. O estudo animal foi aprovado pelo Comitê de Ética local para Pesquisa Animal. Se murganhos machos imunodeficientes nus, NMRI, (68 semanas de idade) comprados na Taconic Europa (Bomholt, Dinamarca) foram usados para este estudo.

[00223] Os xenoenxertos de hK2 que expressam as células de carcinoma da próstata LNCaP foram implantadas subcutaneamente no flanco direito e / ou flanco esquerdo a cerca de 10 * 10 6 culas por injeção.

[00224] Os animais que desenvolveram tumores LNCaP foram divididos em grupos e injectados com o agente terapêutico 177Lu-DTP-11B6 ou com um controlo, ver Tabela 1 abaixo: Tabela 1

[00225] Todos os animais incluídos foram continuamente medidos e pesados dentro de um intervalo de 3-4 dias.

[00226] Inicialmente alguns animais com uma actividade mais baixa (8MBq) de 177Lu-DTPA-11B6 para investigação da localização do agente terapêutico utilizando SPECT. Um rato do grupo 8 também foi estudada com SPECT. Estes animais tinham os seus órgãos removidos e um automatizado Nal (TI), bem com um contador de 3 polegadas Nal (Tl) detector (1480 Wizard, Wallac Oy, Turku, Finlândia) foi utilizada para quantificar a radioactividade nestas amostras de tecido.

[00227] Para estudar o efeito sobre as amostras de sangue de medula óssea (10 μl) foram tomados regularmente. Amostras de sangue foram coletadas duas vezes por semana, durante 8 semanas após a injecção e contagem de glóbulos brancos, contagens de eritrócitos, contagem de plaquetas e foram analisadas em um Vet celular Medonic Analyzer-Vet CA530 (Boule Medical, Estocolmo, Suécia). No momento da amostragem de sangue, o peso e o estado físico dos animais foram monitorados. A toxicidade foi avaliada através da monitorização de animais para a perda de peso corporal, a diminuição da condição geral, e a toxicidade hematológica.

[00228] O volume do tumor foi medido com um cometapa de calibre. O comprimento I, com w e espessura t foram medidos e o volume foi calculado.

Farmacocinética

[00229] Para o estudo de biocinética de 111LN-M11B6, os camundongos foram injetados na veia da cauda com um radionuclídeo rotulado a 25 g de anticorpo m11B6. Os animais foram sacrificados em intervalos de tempo regulares.

[00230] Em resumo, o mAb de murganho conjugado com o 11B6 foi CHX-A "e -DTPA marcado com 111 LN formando 111 LN-CHX-A" -DTPA-11 B6 (111 LN-DTPA-1 1 B6). Os estudos de biodistribuição foram realizados em um modelo de xenotransplante hK2- e AR-positivo (LNCaP) APC. DU- 145 (xenoenxertos de hK2 e AR negativo) foram usadas como controle. Animais, NMRI nu, foram sacrificados em intervalos de tempo designados, dissecados e teve órgãos removidos para a medição de atividade. Micro-SPECT foi realizada. Os tumores foram seccionados, corados e autorradiografia foi realizada. Alguns animais foram injectados com Acm rato frio 11 B6 antes da injecção de 111 LN-DTPA-11B6 de bloquear a captação de radiomarcado 11 B6.

[00231] A biocinética de 177Lu M11-B6 foi obtido do mesmo modo como para o estudo 111LN-M11B6.

Aquisição de dados e dosimetria

[00232] Para determinar a dose absorvida para os diferentes órgãos- alvo, o esquema MIRD (1) foi aplicado em conjunto com S-fatores específicos do rato. O número de desintegrações (actividade acumulada) foi derivada a partir dos dados cinéticos com 111 LN-m11B6. Funções biexpo- nencial foram ajustadas para os pontos de dados através de um algoritmo de mínimos quadrados, e os números de desintegrações foram calculadas como o integral dessas expressões multiplicada com o factor de decaimento. A actividade acumulada para a medula óssea foi baseado no método de sangue (2), onde a concentração de actividade na medula vermelha é suposto ser proporcional à concentração de atividade no sangue. Este medula vermelha à relação de sangue (RMBLR) tem sido sugerida para ser 0,36 (2), que também foi utilizado neste estudo.

[00233] Para determinar os seus S-factores específicos de ratinho, foi utilizada uma versão do MOBY (3) fantasma na qual os tamanhos de órgãos pode ser especificado. O peso médio dos órgãos dissecados a partir do estudo da cinética foi-especificado em conjunto com o peso total médio. A prestação das superfícies NURBS flexíveis, em seguida, gera um fantasma específico da estirpe. O fantasma é voxelized em 160 * 160 * 400 voxels. Um tumor subcutâneo foram adicionados no flanco esquerdo, pela representação de uma esfera fora da pele contorno normal, mas como um elipsóide com uma curta meia eixo para o raio da esfera perpendicular à pele do contorno, e o eixo longo a ser como a raio da esfera. A glândula salivar e da próstata foram adicionados manualmente ao fantasma e representados como esferas com raios correlacionada com os pesos médios dos órgãos.

[00234] O fantasma, em seguida, atuou como entrada para simulações de Monte Carlo de S-fatores para 177 Lu e 1 1 ln com o código MCNPX 2.6 conforme descrito em trabalho anterior (4).

[00235] Terapia de Planejamento (Larsson et al, 2012, Phys Med 39 (7)..: 4434-43) com base na relação entre a dose absorvida e efeito biológico sobre a medula óssea em ratos submetidos a radioimunoterapia com 90Y e 77Lu pode-se estimar que o DL50 para a medula óssea seria na ordem de 12 Gy. Na literatura DL50 para irradiação aguda de ratos e murganhos são o mesmo, cerca de 9 Gy (por exemplo, ver Radiobiology para o radiologista, Hall & Giacca (Eds), 2006, 6 th edition).

[00236] As terapias foram, então, concebidas a partir do pressuposto de uma dose absorvida tolerável de 12 Gy a medula óssea. Em seguida, a partir dos cálculos de dosimetria a atividade correspondente a esta dose absorvida foi calculada. Os grupos de terapia foram então concebido como dando-lhes A / 4, A / 2, A, 2XA e 3XA. Actividades correspondentes foram utilizadas para os controlos.

Resultados Marcação radioativa de 177Lu-DTPA-m11B6

[00237] O resultado da cinética de marcação na Figura 16 mostra que a eficiência de marcação é muito elevada, alcançando 90% após 2 horas de incubação. Isso garante uma probabilidade de excelente eficácia terapêutica com efeitos menores de unconjugated 177Lu.

[00238] Os resultados in vitro de estabilidade em PBS e EDTA apresentam boa estabilidade ao longo do tempo, com quase sem alteração com o tempo dentro de duas semanas (ver Figura 17). Além disso, não houve diferença pode ser observada entre PBS e o EDTA de incubação, o que indica uma muito boa conjugação química assegurar a estabilidade in vivo com retenção e longos tempos de circulação.

Imagem

[00239] As imagens SPECT na Figura 18 mostram a distribuição de 77 Lu-DTPA-m 1B6 em camundongos nus xenoenxertados, (8MBq injecta- do).

[00240] As imagens diferentes da Figura 18 são como descritos na Tabela 2. Tabela 2

[00241] A primeira coluna de rato S1 mostra a excelente absorção no tumor em rato S1 com um aumento da absorção com tempo de 48, 72 e 168 h pi. A segunda coluna mostra S2 rato a 72 e 168 h sagacidade mesma elevada absorção de tumor. Coluna 3, linha 2 mostra S3 rato às 72 horas pi com elevada absorção de tumor semelhante. Linha 3, coluna 3 mostra S8 rato em 168 h pi sem captação tumoral após o bloqueio com anticorpos frios que mostra a especificidade do m11 B6 para o tumor alvo. Resultados semelhantes para rato S9 na coluna 4, linha 3. Finalmente rato S11 na coluna 4, linha 2 mostra nenhuma captação no tumor de linha de células DU 145 não é específico para o anticorpo 1B6 ml.

[00242] Estes resultados demonstram a elevada especificidade de m11B6 resultando na acumulação tumoral elevada.

Biodistribuição

[00243] Os resultados do estudo biocinética da LN-111 1B6 m são discutidos no Exemplo 2 acima. Uma acumulação é visto no tecido do tumor com um máximo de 16% IA / g a 48 horas; todos os outros órgãos mostram um declínio da actividade, com excepção das glândulas salivares (ver Figura 8). Assim, um elevado rácio tumor para órgão normal é obtido, o qual é um pré-requisito para a eficácia terapêutica elevada.

[00244] Dados de biodistribuição para 177Lu-m11B6 (at72h e 168 horas) é mostrado na Figura 19. Aqui, uma quantidade muito maior de acumulação de actividade pode ser vista em comparação com 111 LN- m11B6, com quase 30% IA g em 168 h. Isto sublinha ainda mais a viabilidade de alta eficácia terapêutica com anticorpo 11B6 marcado.

[00245] Os resultados detalhados às 72 horas pi de bloqueio em conjunto com a utilização de células de tumor DU linha-145 é mostrado na Figura 20. Aqui, a distribuição da 77 Lu-DTPA-m11B6 do estudo SPECT mostrado acima em camundongos com LnCaP ou DU-145 e bloqueando a hK2 Ag com a pré-injecção de não-conjugada 11 B6 são dadas. Como se pode ver em detalhe o bloqueio e a linha de células de tumor DU-145 resultado na ausência de captação nos tumores que mostram a elevada especificidade de m11B6.

Dosimetria

[00246] A Figura 21 mostra os resultados do estudo de biocinética de 111LN-M11B6 usado para os cálculos de dosimetria. Em cada gráfico na figura composta, a linha a tracejado superior representa os resultados do estudo cinético com um desvio padrão, a curva a cheio é um função bi- exponencial adaptado e a curva inferior ponteada se encontra quando o decaimento de 111Ln é considerado. A área sob a curva inferior ponteada representa a actividade acumulada usada nos cálculos de dosimetria.

[00247] Com base nos biocinética como mostrado na Figura 21, as atividades acumuladas foram calculadas. Usando os valores 111Ln S, a dose absorvida por unidade de atividade (Gy / MBq) foram calculadas. Na Tabela 3 a seguir são dados os resultados para 111Ln.

[00248] Com base no pressuposto de que os mesmos biocinética pode ser usado para 177Lu-m11B6, as atividades correspondentes acumuladas foram calculadas com a sua metade do tempo físico. Quando se utiliza os valores de S para 177Lu, a dose absorvida por unidade de actividade foi calculada. A suposição de biocinética semelhantes é justificada pelos resultados da captação de 177Lu-m11 B6 mostram valores de absorção semelhantes como para 111 ln-m11B6 (ver Figuras 8 e 19). Tabela 3 Dose total de dose total de órgãos de auto-dose de auto-doses

[00249] Com base em um valor de LD50 de 12 Gy de medula óssea, uma dose de 26,7 MBq pode ser injetado. Isto significa que uma dose absorvida para o tumor de 60 Gy.

[00250] Voltando a calcular a dose absorvida de tumor (assumindo que a cinética de 111-ln-m11B6 é o mesmo que para 177Lu-m11B6) e alterando os valores de absorção em 72 h pi (16% IA / g até 20% IA / g) e a 168 horas pi ( 15% IA / g a 28% IA / g) resulta em as doses absorvidas como indicados no Quadro 4 abaixo. Pode então ser visto que a dose absorvida de tumor irá aumentar a partir de 60 Gy a 120 Gy Tabela 4

[00251] Os cálculos de dosimetria acima são baseados em um modelo de dosimetria adequada; o biocinética revela que uma dose terapêutica absorvida pode ser entregue para os tumores dentro de limites seguros para a toxicidade da medula óssea.

Redução do tumor animal

[00252] A Figura 22 mostra como o tumor em um dos ratos (visíveis no flanco do animal, por baixo da pele) diminui de volume a seguir ao tratamento.

Resultados da radioimunoterapia

[00253] A Figura 23 mostra os resultados para os grupos de estudo com actividades administradas (a) D, (b) 2 x D e (c) um grupo de controle (em que D = 26,7 MBq).

[00254] Há uma clara tendência de diminuição do volume de tumor em ambos os grupos de tratamento. O início da redução do tumor é visto já alguns dias após a injecção de 177Lu-m11 B6. No grupo de controlo, há um aumento do volume do tumor depois da injecção de solução de Nal.

[00255] A Figura 24 (a) mostra os resultados para um dos camundongos no grupo injectado com actividade A. Aqui, o tumor cresce constantemente desde o primeiro dia até ao dia seis, quando a actividade do 177Lu A M11-B6 é administrada. A seguir ao tratamento, uma rápida queda no volume de tumor é observado.

[00256] No estudo SPECT (8 d pi) o volume do tumor é mostrada com atividade ainda presente; ver Figura 24 (b).

Conclusão

[00257] O presente estudo exemplificativo com anticorpo 177Lu-m11B6 demonstra claramente uma eficácia terapêutica contra tumores de câncer de próstata in vivo.

[00258] Ambos os cálculos teóricos baseados no modelo de dosimetria especial e a biocinética in vivo medida mostram dosimetria favorável originando uma razão terapêutica elevada. Este é, então, verificado no estudo realizado em animais com bons resultados terapia mostrando rápido encolhimento do volume tumoral. Referências 1. Bolch WE, Eckerman KF, Sgouros G, Thomas SR. MIRD pamphlet No. 21: a generalized schema for radiopharmaceutical dosimetry-standardization of nomenclature. J Nucl Med. 2009;50:477-484. 2. Sgouros G. Bone marrow dosimetry for radioimmunotherapy: theoretical considerations. J Nucl Med. 1993;34:689-694. 3. Segars WP, Tsui BM, Frey EC, Johnson GA, Berr SS. De-velopment of a 4-D digital mouse phantom for molecular imaging research. Mol Imaging Biol. 2004; 6:149-159. 4. Larsson E, Strand SE, Ljungberg M, Jonsson BA. Mouse S- factors based on Monte Carlo simulations in the anatomical realistic Moby phantom for internal dosimetry. Cancer Biother Radiopharm. 2007; 22:438-442. 5. Erik Larsson, Michael Ljungberg, Linda Martensson, Rune Nilsson, and Jan Tennvall, Sven-Erik Strand and Bo-Anders JonssonUse of Monte Carlo simulations with a realistic rat phantom for examining the correlation between hematopoietic system response and red marrow absorbed dose in Brown Norway rats undergoing radionuclide therapy with 177Lu- and 90Y-BR96 mAbs Medical. 6. Linda Martensson, Zhongmin Wang, Rune Nilsson, Tomas Ohlsson, Peter Senter, Hans-Olov Sjo gren, Sven-Erik Strand, Jan Tenn- vall, DeterminingMaximal Tolerable Dose of theMonoclonal Antibody BR96 Labeled with 90Yor 177Lu in Rats: Establishment of a Syngeneic- TumorModel to EvaluateMeans to Improve Radioimmunotherapy. Clin Cancer Res 2005; 11:7104s-7108s. 2005.

Claims (14)

1. Agente para uso no tratamento de câncer de próstata, caracterizado pelo fato de que compreende (a) um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno com especificidade para calicreína glandular humana (hK2) compreendendo: regiões determinantes de complementaridade (CDRs) de cadeia pesada com as SEQ ID NOs: 17, 18 e 19, e CDRs de cadeia leve com aminoácidos das SEQ ID NOs: 20, 21 e 22; e (b) uma fração citotóxica compreendendo 177Lu.

2. Agente, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno com especificidade para hK2 está indiretamente ligado à porção citotóxica.

3. Agente, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno com especificidade para hK2 está diretamente ligado à porção citotóxica.

4. Agente, de acordo com a reivindicação 2 ou 3, caracterizado pelo fato de que o agente exibe características de absorção tumoral substancialmente equivalentes às características de absorção tumoral do anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno com especificidade para hK2 sozinho.

5. Agente, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que o agente compreende ainda um radioisótopo que é capaz de atuar simultaneamente de maneira multimodal como uma fração detectável e também como uma fração citotóxica.

6. Agente, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que o agente compreende ainda uma fração para aumentar a meia-vida in vivo do agente.

7. Agente, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que a fração para aumentar a meia-vida in vivo é selecionada dentre o grupo que consiste em polietilenoglicol (PEG), albumina de soro humano, grupos de glicosilação, ácidos graxos e dextrano.

8. Agente, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que o câncer de próstata a ser tratado é câncer de próstata não localizado (isto é, disseminado).

9. Agente, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo fato de que o câncer de próstata a ser tratado é câncer de próstata metastático, opcionalmente câncer de próstata micrometastático.

10. Agente, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que o câncer de próstata metastático a ser tratado é metástase do sistema linfático; metástases do osso (incluindo coluna, vértebras, pelve, costelas); metástase na pelve, reto, bexiga, uretra.

11. Agente, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizado pelo fato de que o paciente tem câncer de próstata e tem menos de 70, 65, 60, 55, 50, 45, 40 ou menos anos de idade no momento do diagnóstico de câncer de próstata e/ou no momento do tratamento.

12. Agente, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, caracterizado pelo fato de que o paciente é definido por um membro da família, como pai ou irmão, que foi previamente diagnosticado com câncer de próstata.

13. Agente, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12, caracterizado pelo fato de que o câncer de próstata a ser tratado é câncer de próstata resistente à castração (CRPC).

14. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende uma quantidade terapeuticamente eficaz de um agente, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 13, e um diluente, veículo ou excipiente farmaceuticamente aceitável.