KR20140084244A - 항-cd20 항체와 인간 il-15를 사용한 병용치료 - Google Patents

항-cd20 항체와 인간 il-15를 사용한 병용치료 Download PDF

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Abstract

본 발명은 암의 치료를 위한, 종양 항원에 특이적으로 결합하는 어푸코실화된 항-CD20 항체와 인간 IL-15의 병용치료에 관한 것이다.

Description

항-CD20 항체와 인간 IL-15를 사용한 병용치료{COMBINATION THERAPY USING ANTI-CD20 ANTIBODY AND HUMAN IL-15}
본 발명은 항-CD20 항체 및 사이토카인 인간 IL-15를 사용한 암 환자의 병용치료, 특히 혈액 악성 종양, 예컨대, 백혈병, 예를 들면, 만성 림프구성 백혈병(CLL)을 앓고 있는 환자의 병용치료에 관한 것이다.
어푸코실화 ( Afucosylating )된 항체
단일클론 항체의 세포-매개 이펙터 기능은 문헌(Umana, P., et al., Nature Biotechnol. 17 (1999) 176-180) 및 미국 특허 제6,602,684호에 기재된 바와 같이 상기 항체의 올리고사카라이드 성분을 조작함으로써 향상될 수 있다. 암 면역치료에서 가장 통상적으로 사용되는 항체인 IgG1 유형 항체는 각각의 CH2 도메인 내의 Asn297에서 보존된 N-연결 글리코실화 부위를 갖는 당단백질이다. Asn297에 부착된 2개의 복합 바이안테나리(biantennary) 올리고사카라이드는 CH2 도메인들 사이에 묻혀 폴리펩티드 골격과 광범위한 접촉을 형성하고, 이들의 존재는 항체가 이펙터 기능, 예컨대, 항체-의존적 세포-매개 세포독성(ADCC)을 매개하는 데에 필수적이다(Lifely, M.R., et al., Glycobiology 5 (1995) 813-822; Jefferis, R., et al., Immunol. Rev. 163 (1998) 59-76; Wright, A. and Morrison, S.L., Trends Biotechnol. 15 (1997) 26-32). 문헌(Umana, P., et al., Nature Biotechnol. 17 (1999) 176-180) 및 국제 특허출원 공개 제WO 99/54342호는 이등분된 올리고사카라이드의 형성을 촉진하는 글리코실트랜스퍼라제인 β(1,4)-N-아세틸글루코스아미닐트랜스퍼라제 III("GnTIII")을 중국 햄스터 난소(CHO) 세포에서 과다발현시키는 것이 항체의 시험관내 ADCC 활성을 유의하게 증가시킨다는 것을 보여주었다. N297 탄수화물의 조성에서의 변경 또는 이의 제거 효과도 Fc와 FcγR 및 C1q의 결합에 영향을 미친다(Umana, P., et al., Nature Biotechnol. 17 (1999) 176-180; Davies, J., et al., Biotechnol. Bioeng. 74 (2001) 288-294; Mimura, Y., et al., J. Biol. Chem. 276 (2001) 45539-45547; Radaev, S., et al., J. Biol. Chem. 276 (2001) 16478-16483; Shields, R.L., et al., J. Biol. Chem. 276 (2001) 6591-6604; Shields, R.L., et al., J. Biol. Chem. 277 (2002) 26733-26740; Simmons, L.C., et al., J. Immunol. Methods 263 (2002) 133-147).
문헌(Iida, S., et al., Clin. Cancer Res. 12 (2006) 2879-2887)은 어푸코실화된 항-CD20 항체의 효능이 푸코실화된 항-CD20의 첨가에 의해 억제되었다는 것을 보여준다. 어푸코실화된 항-CD20과 푸코실화된 항-CD20의 1:9 혼합물(10 ㎍/㎖)의 효능은 어푸코실화된 항-CD20 단독의 1,000배 희석(0.01 ㎍/㎖)의 효능보다 더 낮았다. 상기 문헌의 저자들은 푸코실화된 대응물을 포함하지 않는 어푸코실화된 IgG1이 그의 높은 FcγRIIIa 결합을 통해 ADCC에 대한 혈장 IgG의 억제 효과를 피할 수 있다는 결론을 내린다. 문헌(Natsume, A., et al., shows in J. Immunol. Methods 306 (2005) 93-103)은 인간 IgG1 유형 항체의 복합체 유형 올리고사카라이드로부터의 푸코스의 제거가 항체-의존적 세포-매개 세포독성(ADCC)을 크게 향상시킨다는 것을 보여주었다. 문헌(Satoh, M., et al., Expert Opin. Biol. Ther. 6 (2006) 1161-1173)은 어푸코실화된 치료 항체를 차세대 치료 항체로서 논의한다. 이 문헌의 저자들은 어푸코실화된 인간 IgG1 형태만으로 구성된 항체가 이상적인 것으로 생각된다는 결론을 내린다. 문헌(Kanda, Y., et al., Biotechnol. Bioeng. 94 (2006) 680-688)은 푸코실화된 CD20 항체(96% 푸코실화, CHO/DG44 1H5)와 어푸코실화된 CD20 항체를 비교하였다. 문헌(Davies, J., et al., Biotechnol. Bioeng. 74 (2001) 288-294)은 CD20 항체의 경우 증가된 ADCC가 FcγRIII과의 증가된 결합과 상관관계를 갖는다고 보고한다.
푸코스의 양을 감소시킴으로써 단일클론 항체의 세포-매개 이펙터 기능을 향상시키는 방법은 예를 들면, 국제 특허출원 공개 제WO 2005/018572호, 국제 특허출원 공개 제WO 2006/116260호, 국제 특허출원 공개 제WO 2006/114700호, 국제 특허출원 공개 제WO 2004/065540호, 국제 특허출원 공개 제WO 2005/011735호, 국제 특허출원 공개 제WO 2005/027966호, 국제 특허출원 공개 제WO 1997/028267호, 미국 특허출원 공개 제2006/0134709호, 미국 특허출원 공개 제2005/0054048호, 미국 특허출원 공개 제2005/0152894호, 국제 특허출원 공개 제WO 2003/035835호, 국제 특허출원 공개 제WO 2000/061739호, 문헌(Niwa, R., et al., J. Immunol. Methods 306 (2005) 151-160), 문헌(Shinkawa, T. et al, J Biol Chem, 278 (2003) 3466-3473), 국제 특허출원 공개 제WO 03/055993호 또는 미국 특허출원 공개 제2005/0249722호에 기재되어 있다.
CD20 및 항-CD20 항체
CD20 분자(인간 B 림프구-제한된 분화 항원 또는 Bp35로도 지칭됨)는 전구 B 림프구 및 성숙 B 림프구 상에 위치한 약 35 kD의 분자량을 갖는 소수성 경막 단백질이다(Valentine, M.A., et al. J. Biol. Chem. 264(19) (1989) 11282-11287; and Einfield, D.A., et al. (1988) EMBO J. 7(3):711-717; Tedder, T.F., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85 (1988) 208-12; Stamenkovic, I., et al., J. Exp. Med. 167 (1988) 1975-80; Tedder, T.F., et al., J. Immunol. 142 (1989) 2560-8). CD20은 말초 혈액 또는 림프 장기로부터 유래된 B 세포들 중 90% 초과의 B 세포들의 표면 상에서 발견되고 초기 전구 B 세포 발생 동안 발현되고, 혈장 세포 분화까지 남아있다. CD20은 정상 B 세포 및 악성 B 세포 둘다 상에 존재한다. 특히, CD20은 B 세포 비-호지킨 림프종(NHL) 중 90% 초과의 NHL 상에서 발현되지만(Anderson, K.C., et al., Blood 63(6) (1984) 1424-1433)), 조혈 줄기 세포, 전구 B 세포, 정상 혈장 세포 또는 다른 정상 조직 상에서 발견되지 않는다(Tedder, T.F., et al., J, Immunol. 135(2) (1985) 973-979).
CD20 단백질의 85 아미노산 카복실-말단 영역은 세포질 내에 위치한다. 이 영역의 길이는 각각 3개, 3개, 28개, 15개 및 16개의 아미노산으로 구성된 상대적으로 짧은 세포질내 영역을 갖는 다른 B 세포 특이적 표면 구조물, 예컨대, IgM, IgD 및 IgG 중쇄, 또는 조직적합성 항원 클래스 II 또는 β 쇄의 길이와 대비된다(Komaromy, M., et al., NAR 11 (1983) 6775-6785). 마지막 61개의 카복실-말단 아미노산들 중 21개의 아미노산들은 산성 잔기인 반면, 2개의 잔기들만이 염기성 잔기인데, 이는 이 영역이 강한 순 음전하를 갖는다는 것을 암시한다. 진뱅크 등록번호는 NP-690605이다. CD20은 B 세포의 활성화 및 분화 과정에서 초기 단계를 조절하는 데에 관여할 것이고(Tedder, T.F., et al., Eur. J. Immunol.16 (8) (1986) 881-887) 칼슘 이온 채널로서 작용할 수 있다(Tedder, T.F., et al., J. Cell. Biochem. 14D (1990) 195)고 생각된다.
그들의 CD20 결합 및 생물학적 활성 방식에서 유의하게 상이한 2종의 상이한 유형의 항-CD20 항체들이 존재한다(Cragg, M.S., et al,, Blood, 103 (2004) 2738-2743; and Cragg, M.S., et al., Blood, 101 (2003) 1045-1052). I형 항체, 예를 들면, 리툭시맙(정상적인 글리코실화 패턴을 갖는 비-어푸코실화된 비-당조작된 항체, "RTX"로도 지칭됨)은 보체-매개 세포독성에 있어서 강력한 반면, II형 항체, 예를 들면, 토시투모맙(B1), 11B8, AT80 또는 인간화된 B-Ly1 항체는 동반되는 포스파티딜세린 노출과 함께 캐스파제(caspase) 비-의존적 아폽토시스를 통해 표적 세포 사멸을 효과적으로 개시한다.
I형 항-CD20 항체와 II형 항-CD20 항체의 공유하는 공통된 특징은 표 1에 요약되어 있다.
Figure pct00001
미국 특허 제5,736,137호는 정상적인 글리코실화 패턴을 갖는 비-어푸코실화된 비-당조작된 항체인 리툭시맙에 관한 것이다. 국제 특허출원 공개 제WO 2005/044859호 및 제WO 2007/031875호는 상응하는 모 항체에 비해 감소된 양의 푸코스를 갖는 어푸코실화된 항-CD20 항체에 관한 것이다. 국제 특허출원 공개 제WO 2008/121876호(A2,A3)는 상응하는 모 항체에 비해 감소된 양의 푸코스를 갖는 어푸코실화된 항-CD20 항체에 관한 것이다.
사이토카인:
사이토카인의 성질
사이토카인은 면역, 염증 및 조혈을 매개하고 조절하는 작은 분비된 단백질이다. 사이토카인은 면역 자극에 반응하여 드 노보(de novo)로 생성되어야 한다. 사이토카인은 일반적으로 (항상은 아니지만) 짧은 거리 및 짧은 시간에 걸쳐 매우 낮은 농도에서 작용한다. 사이토카인은 특이적 막 수용체에 결합함으로써 작용한 후, 제2 메신저(종종, 티로신 키나제)를 통해 세포에 신호를 전달하여 그의 거동(유전자 발현)을 변경시킨다. 사이토카인에 대한 반응은 (사이토카인 수용체를 비롯한) 막 단백질의 증가하는 또는 감소하는 발현, 증식 및 이펙터 분자의 분비를 포함한다.
사이토카인은 일반적인 명칭이고, 다른 명칭은 림포카인(림프구에 의해 제조된 사이토카인), 모노카인(단핵세포에 의해 제조된 사이토카인), 케모카인(화학주성 활성을 갖는 사이토카인), 및 인터류킨(1개의 백혈구에 의해 제조되고 다른 백혈구에 작용하는 사이토카인)을 포함한다. 사이토카인은 그 자신을 분비하는 세포에 작용할 수 있거나(자가분비 작용), 근처 세포에 작용할 수 있거나(측분비 작용), 몇몇 경우 멀리 떨어져 있는 세포에 작용할 수 있다(내분비 작용).
상이한 유형의 세포들이 동일한 사이토카인을 분비하거나 단일 사이토카인이 여러 상이한 유형의 세포에 작용하는 것은 흔하다(다면발현). 사이토카인들은 그들의 활성에 있어서 중복되는데, 이것은 유사한 기능이 상이한 사이토카인들에 의해 자극될 수 있다는 것을 의미한다. 한 사이토카인이 추가 사이토카인을 제조하도록 그의 표적 세포를 자극하기 때문에 사이토카인은 종종 캐스케이드(cascade)로 생성된다. 또한, 사이토카인은 상승작용적으로 작용할 수 있거나(함께 작용하는 2개 이상의 사이토카인들) 길항적으로 작용할 수 있다(반대 활성을 야기하는 사이토카인들).
그들의 짧은 반감기, 낮은 혈장 농도, 다면발현 및 중복성은 모두 사이토카인의 단리 및 특징규명을 복잡하게 하였다. 신규 사이토카인에 대한 검색은 현재 종종 DNA 수준에서 수행되어 공지된 사이토카인 유전자와 유사한 유전자를 확인시켜준다.
사이토카인 활성
사이토카인 활성은 시험관내에서 재조합 사이토카인 및 정제된 세포 집단을 사용함으로써, 또는 생체내 사이토카인 기능을 특징규명하기 위해 개별 사이토카인 유전자에 대한 넉아웃(knock-out) 마우스를 사용함으로써 특징규명된다. 사이토카인은 많은 세포 집단들에 의해 제조되지만, 우세한 생산자는 헬퍼 T 세포(Th) 및 대식세포이다.
인터류킨(IL)-15는 IL-2, IL-4, IL-7, IL-9 및 IL-21을 포함하는 큰 사이토카인 패밀리에 속한다. 이들 사이토카인들이 동일한 감마 쇄(γc) 수용체를 공유하지만, IL-2 및 IL-15는 IL-2R 및 IL-15R의 α 쇄에 대한 그들의 결합 성질뿐만 아니라 그들의 세포 활성화 기작과도 관련되어 있는 특정 기능을 갖는다. IL-15 작용의 기작은 여전히 논쟁되고 있지만, 세포 파트너, 예컨대, 생체내에서 IL-15의 주요 생산자인 단핵세포 및/또는 수지상 세포에 의한 트랜스-제시(trans-presentation)인 듯하다.
IL-15는 선천성 면역 및 후천성 면역을 용이하게 하는 중요한 생리학적 기능을 나타내고, 면역 세포, 예컨대, 천연 살해(NK) 또는 T 림프구 세포의 발생, 항상성 및 활성화에 있어서 중요한 역할을 갖는다. IL-15는 주로 보조 세포에 의해 트랜스-제시되고, NK 세포에 대한 다면발현 활성; 생존; 증식; 분화; 세포독성 기능의 증가; 사이토카인, 예컨대, IFN-γ, TNF-α 및 GM-CSF의 생성의 자극; 및 NK/대식세포 상호작용의 조절을 갖는다. IL-15는 단핵세포 및 대식세포도 활성화시켜 이들이 항-감염성 면역에 관여하게 한다. 또한, IL-15는 항-아폽토시스 단백질의 상향조절을 통해 호중구 및 호산구의 아폽토시스뿐만 아니라 B 또는 T 세포의 Fas 매개 아폽토시스를 억제한다는 것이 발견되었다. 감염 또는 질환에 있어서 IL-15의 역할은 보고되어 있다.
본 발명은 암의 치료를 위한, 사이토카인 인간 IL-15와 병용되는 어푸코실화된 항체, 바람직하게는 60% 이하의 양으로 푸코스를 가지면서 종양 항원에 특이적으로 결합하는 항체의 용도를 포함한다.
바람직한 실시양태에서, 어푸코실화된 항체는 인간 IL-15와 병용으로 암을 치료하기 위한 항-CD20 항체이다.
바람직하게는, 항-CD20 항체는 60% 이하의 양으로 푸코스를 갖는 어푸코실화된 항체인 것을 특징으로 하고, 상기 암은 CD20 발현 암이다.
바람직하게는, 상기 항-CD20 항체는 인간화된 B-Ly1 항체이고, 상기 암은 CD20 발현 암, 바람직하게는 백혈병, 보다 바람직하게는 만성 림프구성 백혈병(CLL)이다.
본 발명의 한 실시양태는 IL-15만이 사이토카인으로서 상기 병용치료에서 공-투여된다는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 한 실시양태는 어푸코실화된 항체가 증가된 ADCC를 나타내는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 한 실시양태는 항-CD20 항체 및 인간 IL-15를 포함하는, 암의 치료를 위한 조성물이다.
사이토카인 IL-15와 병용되는 항-CD20 항체의 병용치료는 상응하는 비-어푸코실화된 비-당조작된 항체와 사이토카인 IL-15의 병용에 비해 향상된 항종양 억제 활성을 보인다. 병용치료는 보조 세포에 의한 트랜스-제시를 통해 항종양 효능을 매개하고 암, 예컨대, 혈액 악성 종양, 예컨대, CLL의 치료에 있어서 특히 귀중하다.
바람직하게는, 항-CD20 항체는 하나 이상의 추가 다른 세포독성, 화학치료 또는 항암 약제, 또는 이러한 약제들의 효과를 향상시키는 화합물 또는 이온화 방사선이 투여되는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 또 다른 실시양태는 (i) 제1 유효량의 항-CD20 항체; 및 (ii) 제2 유효량의 인간 IL-15를 암의 치료가 필요한 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, 암을 치료하는 방법에 관한 것이다.
도 1: CLL 샘플에서 단일클론 항체 및 IL-15에 의해 유도된 NK 세포 활성화. CLL 환자의 PBMC를 7일 동안 IL-15(10 ng/㎖)와 함께 또는 IL-15 없이 RTX(10 ㎍/㎖) 또는 GA101(10 ㎍/㎖)로 처리하였거나 처리하지 않은 후, 유세포측정으로 분석하였다. 결과는 단일클론 항체 및 IL-15의 존재 또는 부재 하에서 7일 동안 배양한 후 총 NK 세포들 중 CD69+ NK 세포의 백분율을 표시한다(n=26). 수평 막대는 중간 값(**p<0.01 및 ***p<0.001)을 표시한다.
도 2: CLL 샘플에서 단일클론 항체 및 IL-15에 의해 유도된 NK 세포 증식. CLL 환자의 PBMC를 7일 동안 IL-15(10 ng/㎖)와 함께 또는 IL-15 없이 RTX(10 ㎍/㎖) 또는 GA101(10 ㎍/㎖)로 처리하였거나 처리하지 않은 후, 유세포측정으로 분석하였다. (A) 단일클론 항체 및 IL-15의 존재 또는 부재 하에서 NK 세포에 대한 CFSE 희석의 대표적인 실험(n=19). (B) 항-CD20 단일클론 항체 및 IL-15의 존재 또는 부재 하에서 7일 동안 배양한 후 총 NK 세포들 중 증식하는 NK 세포의 백분율(n=17). 수평 막대는 중간 값(**p<0.01 및 ***p<0.001)을 표시한다.
도 3: IL-15와 함께 또는 IL-15 없이 B 백혈병 세포 상청액 및 단일클론 항체에 의한 건강한 공여자의 정제된 NK 세포의 증식. 결과는 7일 동안 RTX(10 ㎍/㎖) 또는 GA101(10 ㎍/㎖)의 존재 또는 부재 하에서 NK 세포에 대한 CFSE 희석을 수행한 후 유세포측정으로 분석한 대표적인 실험을 보여준다(n=5). (A) 건강한 공여자의 CFSE-표지된 정제된 NK 세포를 IL-15(10 ng/㎖)와 함께 또는 IL-15(10 ng/㎖) 없이 배양 배지에서 배양하였다. (B) 정제된 B 백혈병 세포를 7일 동안 IL-15로 자극하였거나 자극하지 않았다. 상청액을 CFSE-표지된 정제된 NK 세포 증식의 분석을 위한 배양 배지로서 사용하였다.
도 4: 총 샘플 대 단핵세포-고갈된 또는 단핵세포/CD3+-고갈된 CLL 샘플에서 단일클론 항체 및 IL-15에 의해 유도된 NK 세포 증식. 전체적으로, CLL 환자의 단핵세포-고갈된 또는 단핵세포/CD3+-고갈된 샘플을 7일 동안 IL-15(10 ng/㎖)와 함께 또는 IL-15 없이 RTX(10 ㎍/㎖) 또는 GA101(10 ㎍/㎖)로 처리하였거나 처리하지 않은 후 유세포측정으로 분석하였다. (A) 단일클론 항체 및 IL-15의 존재 또는 부재 하에서 NK 세포에 대한 CFSE 희석의 대표적인 실험(n=9). (B) 단일클론 항체 및 IL-15의 존재 또는 부재 하에서 7일의 배양 후 총 샘플(●), 단핵세포-고갈된 샘플(○) 및 단핵세포/CD3+-고갈된 샘플(*)에서 총 NK 세포들 중 증식하는 NK 세포의 백분율의 평균 및 SEM(평균의 표준 오차)(n=9).
도 5: CLL 샘플에서 단일클론 항체 및 IL-15에 의해 유도된 B 백혈병 세포 고갈. 전체적으로, CLL 환자의 단핵세포-고갈된 샘플 및 단핵세포/CD3+-고갈된 샘플을 7일 동안 IL-15(10 ng/㎖)와 함께 IL-15 없이 RTX(10 ㎍/㎖) 또는 GA101(10 ㎍/㎖)로 처리하거나 처리하지 않은 후 유세포측정으로 분석하였다. 7일의 처리 후 비-처리된 세포에 비해 CD19+/CD5+ 생존 세포의 백분율을 재료 및 방법에 기재된 바와 같이 평가하였다. (A) 총 샘플에서 7일의 처리 후 CD19+/CD5+ 생존 세포의 절대 수(n=35). 수평 막대는 중간 값을 표시한다(***p<0.001). (B) 총 샘플(●), 단핵세포-고갈된 샘플(○) 및 단핵세포/CD3+-고갈된 샘플(*)에서 7일의 처리 후 CD19+/CD5+ 생존 세포의 절대 수의 평균 및 SEM(평균의 표준 오차)(n=7).
도 6: CLL 샘플에서 단일클론 항체 및 IL-15에 의해 유도된 B 백혈병 세포 고갈. CLL 환자의 PBMC를 7일 동안 RTX(10 ㎍/㎖), GA101(10 ㎍/㎖), RTX F(ab')2(10 ㎍/㎖) 또는 GA101 F(ab')2(10 ㎍/㎖)로 처리하거나 처리하지 않은 후 유세포측정으로 분석하였다. 7일의 처리 후 비-처리된 세포에 비해 CD19+/CD5+ 생존 세포의 백분율을 재료 및 방법에 기재된 바와 같이 평가하였다(n=7). 수평 막대는 중간 값을 표시한다(*p<0.05; **p<0.01).
본 발명은 암 치료용 약제의 제조를 위한, 사이토카인 인간 IL-15와 병용되는 어푸코실화된 항체의 용도로서, 상기 어푸코실화된 항체가 Asn297에서 올리고사카라이드(당)의 총량의 60% 이하의 양으로 푸코스를 가지면서 종양 항원에 특이적으로 결합하는 IgG1 또는 IgG3 이소타입(isotype)(바람직하게는 IgG1 이소타입)의 어푸코실화된 항체인, 용도를 포함하고, 이때 상기 암은 상기 종양 항원을 발현한다.
한 실시양태에서, 푸코스의 양은 Asn297에서 올리고사카라이드(당)의 총량의 20% 내지 60%이다.
용어 "항체"는, 본 발명에 따른 특징적인 성질이 보유되는 한, 전체 항체, 인간 항체, 인간화된 항체 및 유전공학적으로 조작된 항체, 예컨대, 단일클론 항체, 키메라 항체 또는 재조합 항체뿐만 아니라 이러한 항체들의 단편들을 포함하나 이들로 한정되지 않는 다양한 형태의 항체들을 포괄한다. 본원에서 사용될 때 용어 "단일클론 항체" 또는 "단일클론 항체 조성물"은 단일 아미노산 조성의 항체 분자의 제제를 지칭한다. 따라서, 용어 "인간 단일클론 항체"는 인간 생식세포주 면역글로불린 서열로부터 유래된 가변 영역 및 불변 영역을 갖는 단일 결합 특이성을 나타내는 항체를 지칭한다. 한 실시양태에서, 인간 단일클론 항체는 불멸화된 세포에 융합된, 인간 중쇄 이식유전자(transgene) 및 인간 경쇄 형질전이유전자를 포함하는 게놈을 갖는 유전자이식 비-인간 동물, 예를 들면, 유전자이식 마우스로부터 수득된 B 세포를 포함하는 하이브리도마에 의해 생성된다.
용어 "키메라 항체"는 한 공급원 또는 종으로부터 유래된 가변 영역, 즉 결합 영역 및 상이한 공급원 또는 종으로부터 유래된 불변 영역의 적어도 일부를 포함하는, 통상적으로 재조합 DNA 기법에 의해 제조된 단일클론 항체를 지칭한다. 뮤린 가변 영역 및 인간 불변 영역을 포함하는 키메라 항체가 특히 바람직하다. 이러한 뮤린/인간 키메라 항체는 뮤린 면역글로불린 가변 영역을 코딩하는 DNA 분절 및 인간 면역글로불린 불변 영역을 코딩하는 DNA 분절을 포함하는 발현된 면역글로불린 유전자의 생성물이다. 본 발명에 의해 포괄되는 다른 형태의 "키메라 항체"는 원래의 항체의 클래스 또는 서브클래스로부터 변경된 클래스 또는 서브클래스의 키메라 항체이다. 이러한 "키메라" 항체는 "클래스-전환된 항체"로도 지칭된다. 키메라 항체를 제조하는 방법은 당분야에서 현재 잘 공지된 통상적인 재조합 DNA 및 유전자 형질감염 기법을 포함한다. 예를 들면, 문헌(Morrison, S.L., et al., Proc. Natl. Acad Sci. USA 81 (1984) 6851-6855), 미국 특허 제5,202,238호 및 미국 특허 제5,204,244호를 참조한다.
용어 "인간화된 항체"는 골격 또는 "상보성 결정 영역"(CDR)이 모 면역글로불린의 CDR에 비해 상이한 특이성의 면역글로불린의 CDR을 포함하도록 변경되어 있는 항체를 지칭한다. 바람직한 실시양태에서, 뮤린 CDR을 인간 항체의 골격 영역 내로 이식하여 "인간화된 항체"를 제조한다. 예를 들면, 문헌(Riechmann, L., et al., Nature 332 (1988) 323-327) 및 문헌(Neuberger, M.S., et al., Nature 314 (1985) 268-270)을 참조한다. 특히 바람직한 CDR은 키메라 항체 및 이기능성 항체에 대해 상기 인지된 항원을 인식하는 서열들을 나타내는 CDR에 상응한다.
본원에서 사용될 때 용어 "인간 항체"는 인간 생식세포주 면역글로불린 서열로부터 유래된 가변 영역 및 불변 영역을 갖는 항체를 포함하기 위한 것이다. 인간 항체는 최신 기술 수준에서 잘 공지되어 있다(van Dijk, M.A., and van de Winkel, J.G., Curr. Opin. Chem Biol 5 (2001) 368-374). 이러한 기술에 근거하여, 다양한 표적들에 대한 인간 항체들을 생성할 수 있다. 인간 항체의 예는 예를 들면, 문헌(Kellermann, S.A., et al., Curr Opin Biotechnol. 13 (2002) 593-597)에 기재되어 있다.
본원에서 사용될 때 용어 "재조합 인간 항체"는 재조합 수단에 의해 제조되거나, 발현되거나, 생성되거나 단리된 모든 인간 항체들, 예컨대, 숙주 세포, 예컨대, NS0 또는 CHO 세포로부터, 또는 인간 면역글로불린 유전자에 대한 유전자이식 동물인 동물(예를 들면, 마우스)로부터 단리된 항체, 또는 숙주 세포 내로 형질감염된 재조합 발현 벡터의 사용을 통해 발현된 항체를 포함하기 위한 것이다. 이러한 재조합 인간 항체는 인간 생식세포주 면역글로불린 서열로부터 유래된 가변 영역 및 불변 영역을 재배열된 형태로 갖는다. 본 발명에 따른 재조합 인간 항체는 생체내 체세포 과다돌연변이를 받았다. 따라서, 재조합 항체의 VH 영역 및 VL 영역의 아미노산 서열은 인간 생식세포주 VH 및 VL 서열들로부터 유래되었고 이러한 서열들과 관련되어 있지만 생체내에서 인간 항체 생식세포주 레퍼토리 내에 천연적으로 존재할 수 없는 서열이다.
본원에서 사용될 때 용어 "결합" 또는 "특이적 결합"은 정제된 야생형 항원을 사용한 시험관내 분석, 바람직하게는 플라스몬 공명 분석(비아코어(BIAcore), 지이-헬쓰케어(GE-Healthcare), 스웨덴 업살라 소재)에서 항체와 종양 항원의 에피토프의 결합을 지칭한다. 상기 결합의 친화성은 용어 ka(항체/항원 복합체로부터의 항체의 결합에 대한 속도 상수), kD(해리 상수) 및 KD(kD/ka)에 의해 정의된다. 결합 또는 특이적 결합은 10-8 mol/ℓ 이하, 바람직하게는 10-9 M 내지 10-13 mol/ℓ의 결합 친화성(KD)을 의미한다. 따라서, 본 발명에 따른 어푸코실화된 항체는 10-8 mol/ℓ 이하, 바람직하게는 10-9 M 내지 10-13 mol/ℓ의 결합 친화성(KD)으로 종양 항원에 특이적으로 결합한다.
본원에서 사용될 때 용어 "핵산 분자"는 DNA 분자 및 RNA 분자를 포함하기 위한 것이다. 핵산 분자는 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있지만, 바람직하게는 이중 가닥 DNA이다.
"불변 도메인"은 항체와 항원의 결합에 직접적으로 관여하지 않지만 이펙터 기능(ADCC, 보체 결합 및 CDC)에 관여한다.
본원에서 사용될 때 "가변 영역"(경쇄의 가변 영역(VL) 및 중쇄의 가변 영역 (VH))은 항체와 항원의 결합에 직접적으로 관여하는 경쇄 및 중쇄의 쌍 각각을 의미한다. 가변 인간 경쇄 및 중쇄의 도메인들은 동일한 일반 구조를 갖고, 각각의 도메인은 3개의 "초가변 영역"(또는 상보성 결정 영역, CDR)에 의해 연결된, 널리 보존된 서열을 갖는 4개의 골격(FR) 영역을 포함한다. 골격 영역은 b-시트 입체구조를 채택하고 CDR은 b-시트 구조를 연결하는 루프를 형성할 수 있다. 각각의 쇄에서 CDR들은 골격 영역에 의해 그들의 3차원 구조를 유지하고 다른 쇄의 CDR과 함께 항원 결합 부위를 형성한다.
본원에서 사용될 때 용어 "초가변 영역" 또는 "항체의 항원 결합 부분"은 항원 결합을 담당하는 항체의 아미노산 잔기를 지칭한다. 초가변 영역은 "상보성 결정 영역" 또는 "CDR"의 아미노산 잔기를 포함한다. "골격" 또는 "FR" 영역은 본원에서 정의된 초가변 영역 잔기 이외의 가변 도메인 영역이다. 따라서, 항체의 경쇄 및 중쇄는 N-말단에서 C-말단으로 도메인 FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 및 FR4를 포함한다. 특히, 중쇄의 CDR3은 항원 결합에 가장 기여하는 영역이다. CDR 및 FR 영역은 문헌(Kabat, et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991))의 표준 정의에 따라 결정되고/되거나 "초가변 루프"의 잔기이다.
용어 "어푸코실화된 항체"는 감소된 수준의 푸코스 잔기를 갖는, Asn297에서 Fc 영역 내의 변경된 글리코실화 패턴을 갖는 IgG1 또는 IgG3 이소타입(바람직하게는 IgG1 이소타입)의 항체를 지칭한다. 코어 푸코실화된 바이안테나리 복합체 올리고사카라이드 글리코실화가 2개 이하의 Gal 잔기로 종결되기 때문에 인간 IgG1 또는 IgG3의 글리코실화는 Asn297에서 일어난다. 이들 구조물들은 말단 Gal 잔기의 양에 따라 G0, G1(α1,6 또는 α1,3) 또는 G2 글리칸 잔기로서 표기된다(Raju, T.S., BioProcess Int. 1 (2003) 44-53). 항체 Fc 부분의 CHO 유형 글리코실화는 예를 들면, 문헌(Routier, F.H., Glycoconjugate J. 14 (1997) 201-207)에 기재되어 있다. 비-당변경된 CHO 숙주 세포에서 재조합적으로 발현되는 항체는 통상적으로 85% 이상의 양으로 Asn297에서 푸코실화된다.
따라서, 본 발명에 따른 어푸코실화된 항체는 IgG1 또는 IgG3 이소타입(바람직하게는 IgG1 이소타입)의 항체를 의미하고, 이때 푸코스의 양은 Asn297에서 올리고사카라이드(당)의 총량의 60% 이하이다(이것은 Asn297에서 Fc 영역의 올리고사카라이드의 40% 이상이 어푸코실화된다는 것을 의미한다. 한 실시양태에서, 푸코스의 양은 Asn297에서 Fc 영역의 올리고사카라이드의 20% 내지 60%이다. 한 실시양태에서, 푸코스의 양은 Asn297에서 Fc 영역의 올리고사카라이드의 40% 내지 60%이다. 또 다른 실시양태에서, 푸코스의 양은 50% 이하이고, 또 다른 실시양태에서 푸코스의 양은 Asn297에서 Fc 영역의 올리고사카라이드의 30% 이하이다. 본 발명에 따라, "푸코스의 양"은 MALDI-TOF 질량 분광측정에 의해 측정되고 평균 값으로서 계산된, Asn297에 부착된 모든 올리고사카라이드(당)(예를 들면, 복합체 구조물, 하이브리드 구조물 및 고 만노스 구조물)의 합과 관련된, Asn297에서 올리고사카라이드(당) 내의 상기 올리고사카라이드(푸코스)의 양을 의미한다(푸코스의 양을 측정하는 상세한 절차에 대해서는 실시예 8 참조).
나아가, Fc 영역의 올리고사카라이드는 바람직하게는 이등분된다. 본 발명에 따른 어푸코실화된 항체는 Fc 영역 내의 올리고사카라이드를 부분적으로 푸코실화시키기에 충분한 양으로 GnTIII 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 하나 이상의 핵산을 발현하도록 조작된 당변경된 숙주 세포에서 발현될 수 있다. 한 실시양태에서, GnTIII 활성을 갖는 폴리펩티드는 융합 폴리펩티드이다. 대안적으로, 숙주 세포의 α1,6-푸코실트랜스퍼라제 활성을 미국 특허 제6,946,292호에 따라 감소시키거나 제거하여 당변경된 숙주 세포를 발생시킬 수 있다. 항체 푸코실화의 양은 예를 들면, 발효 조건(예를 들면, 발효 시간)에 의해, 또는 상이한 푸코실화 양을 갖는 2개 이상의 항체들의 병용에 의해 예정될 수 있다. 이러한 어푸코실화된 항체 및 각각의 당조작 방법은 국제 특허출원 공개 제WO 2005/044859호, 국제 특허출원 공개 제WO 2004/065540호, 국제 특허출원 공개 제WO2007/031875호, 문헌(Umana, P., et al., Nature Biotechnol. 17 (1999) 176-180), 국제 특허출원 공개 제WO 99/154342호, 국제 특허출원 공개 제WO 2005/018572호, 국제 특허출원 공개 제WO 2006/116260호, 국제 특허출원 공개 제WO 2006/114700호, 국제 특허출원 공개 제WO 2005/011735호, 국제 특허출원 공개 제WO 2005/027966호, 국제 특허출원 공개 제WO 97/028267호, 미국 특허출원 공개 제2006/0134709호, 미국 특허출원 공개 제2005/0054048호, 미국 특허출원 공개 제2005/0152894호, 국제 특허출원 공개 제WO 2003/035835호 및 국제 특허출원 공개 제WO 2000/061739호에 기재되어 있다. 이들 당조작된 항체들은 증가된 ADCC를 갖는다. 본 발명에 따른 어푸코실화된 항체를 제공하는 다른 당조작 방법은 예를 들면, 문헌(Niwa, R., et al., J. Immunol. Methods 306 (2005) 151-160), 문헌(Shinkawa, T. et al, J Biol Chem, 278 (2003) 3466-3473), 국제 특허출원 공개 제WO 03/055993호 또는 미국 특허출원 공개 제2005/0249722호에 기재되어 있다.
본 발명의 한 실시양태는 어푸코실화된 항체가 (상응하는 비-어푸코실화된 모 항체에 비해) 증가된 ADCC를 보인다는 것을 특징으로 한다. 한 실시양태에서, 즉석 단리된 PBMC를 이펙터 세포로서 사용하고 적합한 항원 발현 종양 세포(예를 들면, CD20의 경우 Raji)를 사용할 때 어푸코실화된 항체는 (10 ng/㎖ 항체 농도 및 25:1의 이펙터 세포/종양 세포 E:T 비에서) 상응하는 비-어푸코실화된 모 항체에 비해 50% 이상 증가된 ADCC를 갖는다.
본 발명에 따른 어푸코실화된 항체, 예를 들면, 항-CD20 항체는 증가된 항체-의존적 세포-매개 세포독성(ADCC)을 갖는다.
"증가된 항체-의존적 세포-매개 세포독성(ADCC)을 갖는 어푸코실화된 항체(예를 들면, 항-CD20 항체)"는 이 용어가 본원에서 정의된 바와 같이 당분야에서 통상의 기술을 가진 자에게 공지된 임의의 적합한 방법에 의해 측정되었을 때 증가된 ADCC를 갖는 어푸코실화된 항체(예를 들면, 항-CD20 항체)를 의미한다.
상응하는 야생형 모 항체에 비해 어푸코실화된 항체의 증가된 ADCC를 측정하는 인정된 한 시험관내 ADCC 분석은 국제 특허출원 공개 제WO 2005/044859호에 기재되어 있다:
1) 상기 분석은 항체의 항원 결합 영역에 의해 인식되는 표적 항원을 발현하는 것으로 공지된 표적 세포를 사용하고;
2) 상기 분석은 무작위적으로 선택된 건강한 공여자의 혈액으로부터 단리된 인간 말초 혈액 단핵세포(PBMC)를 이펙터 세포로서 사용하고;
3) 상기 분석은 하기 프로토콜에 따라 수행되고:
i) 표준 밀도 원심분리 절차를 이용하여 PBMC를 단리하고 RPMI 세포 배양 배지에 5 x 106개 세포/㎖로 현탁하고;
ii) 90% 초과의 생존력을 갖는 대수생장기로부터 회수된 표적 세포를 표준 조직 배양 방법으로 생장시키고 RPMI 세포 배양 배지로 세척하고 100 마이크로큐리의 51Cr로 표지하고, 세포 배양 배지로 2회 세척하고 105개 세포/㎖의 밀도로 세포 배양 배지에 재현탁하고;
iii) 100 ㎕의 상기 최종 표적 세포 현탁액을 96웰 마이크로타이터 플레이트의 각각의 웰로 옮기고;
iv) 항체를 세포 배양 배지에 4000 ng/㎖부터 0.04 ng/㎖까지 연속적으로 희석하고, 50 ㎕의 발생된 항체 용액을 96웰 마이크로타이터 플레이트 내의 표적 세포에 첨가하여 상기 전체 농도 범위를 커버하는 다양한 항체 농도를 삼중으로 시험하고;
v) 최대 방출(MR) 대조군을 위해, 항체 용액(상기 iv) 대신에 50 ㎕의 2%(VN) 비-이온성 세제 수용액(노니뎃(Nonidet), 시그마, 미국 세인트루이스 소재)을, 표지된 표적 세포를 함유하는 플레이트 내의 3개 추가 웰에 공급하고;
vi) 자발적 방출(SR) 대조군을 위해, 항체 용액(상기 iv) 대신에 50 ㎕의 RPMI 세포 배양 배지를, 표지된 표적 세포를 함유하는 플레이트 내의 3개 추가 웰에 공급하고;
vii) 그 다음, 상기 96웰 마이크로타이터 플레이트를 50 x g에서 1분 동안 원심분리하고 4℃에서 1시간 동안 항온처리하고;
viii) 50 ㎕의 PBMC 현탁액(상기 i)을 각각의 웰에 첨가하여 25:1의 이펙터:표적 세포 비를 제공하고, 상기 플레이트를 37℃에서 5% CO2 대기 하에서 항온처리기 내에서 4시간 동안 넣어 두고;
ix) 각각의 웰로부터 세포 무함유 상청액을 회수하고, 감마 카운터를 이용하여 실험적으로 방출된 방사성(ER)을 정량하고;
x) 수학식 (ER-MR)/(MR-SR) x 100에 따라 각각의 항체 농도에 대한 특이적 용해의 백분율을 계산하는데, 이때 ER은 그 항체 농도에 대해 정량된 평균 방사성이고(상기 ix 참조), MR은 MR 대조군(상기 v 참조)에 대해 정량된 평균 방사성이고(상기 ix 참조), SR은 SR 대조군(상기 vi 참조)에 대해 정량된 평균 방사성이다(상기 ix 참조);
4) "증가된 ADCC"는 상기 시험된 항체 농도 범위 내에서 관찰된 특이적 용해의 최대 백분율의 증가, 및/또는 상기 시험된 항체 농도 범위 내에서 관찰된 특이적 용해의 최대 백분율의 절반을 달성하는 데에 요구되는 항체 농도의 감소로서 정의된다. 바람직한 실시양태에서, 증가된 ADCC는 즉석 단리된 PBMC를 이펙터 세포로서 사용하고 적합한 항원 발현 종양 세포(예를 들면, 4시간 후 CD20의 경우 Raji)를 사용할 때 10 ng/㎖ 항체 농도 및 25:1의 이펙터 세포/종양 세포 E:T 비에서 관찰된 특이적 용해의 백분율의 증가로서 정의된다.
ADCC의 증가는 당업자에게 공지된 동일한 표준 제조, 정제, 제형화 및 저장 방법을 이용함으로써 동일한 유형의 숙주 세포에 의해 생성되되, GnTIII을 과다발현하도록 조작된 숙주 세포에 의해 제조되지 않은 동일한 항체에 의해 매개된, 상기 분석에 의해 측정된 ADCC에 비해 상대적인 증가이다.
상기 "증가된 ADCC"는 문헌(Umana, P., et al., Nature Biotechnol. 17 (1999) 176-180) 및 미국 특허 제6,602,684호에 기재된 바와 같이 항체의 올리고사카라이드 성분을 조작함으로써 단일클론 항체의 상기 천연 세포-매개 이펙터 기능을 향상시킨다는 것을 의미하는, 상기 항체의 당조작에 의해 수득될 수 있다. 이러한 당조작된 항체에서 푸코스의 양은 60% 이하인 반면, (당구조물이 조작되어 있지 않은) 상응하는 야생형 모 항체에서 푸코스의 양은 통상적으로 85% 이상이다.
용어 "보체-의존적 세포독성(CDC)"은 보체의 존재 하에서 본 발명에 따른 항체에 의한 인간 종양 표적 세포의 용해를 지칭한다. CDC는 바람직하게는 CD20 발현 세포의 제제를 보체의 존재 하에서 본 발명에 따른 항-CD20 항체로 처리함으로써 측정된다. CDC는 항체가 100 nM의 농도에서 4시간 후 20% 이상의 종양 세포의 용해(세포 사멸)를 유도하는 경우 발견된다. 바람직하게는 51Cr 또는 Eu로 표지된 종양 세포를 사용하고 방출된 51Cr 또는 Eu를 측정함으로써 상기 분석을 수행한다. 대조군은 종양 표적 세포를 항체 없이 보체와 함께 항온처리하는 것을 포함한다.
본원에서 사용될 때 "종양 항원"은 인간으로부터 유래된 종양 항원을 지칭하고, 종양 세포의 종양유발 특성에 기여하는 것으로 공지되어 있거나 생각되는, 종양 세포 상에서 발현된(또는 종양 세포의 발생과 관련된) 임의의 분자를 포함하는, 당분야에서 공지된 의미를 포함한다. 다수의 종양 항원들이 당분야에서 공지되어 있다. 분자가 종양 항원인지 여부는 당업자에게 잘 공지된 기법 및 분석, 예를 들면, 클론유발(clonogenic) 분석, 형질전환 분석, 시험관내 또는 생체내 종양 형성 분석, 겔 이동 분석, 유전자 넉아웃 분석 등에 따라 확인될 수도 있다. 바람직하게는, 본원에서 사용될 때 용어 "종양 항원"은 인간 경막 단백질, 즉 세포의 지질 이중층에 고착된 세포 막 단백질을 지칭한다. 인간 경막 단백질은 일반적으로 본원에서 사용될 때 리간드, 친유성 경막 도메인, 보존된 세포내 도메인, 티로신 키나제 도메인, 및 인산화될 수 있는 여러 티로신 잔기를 보유하는 카복실-말단 신호전달 도메인에 결합할 수 있는 "세포외 도메인"을 포함할 것이다. 종양 항원은 분자, 예컨대, EGFR, HER2/neu, HER3, HER4, Ep-CAM, CEA, TRAIL, TRAIL-수용체 1, TRAIL-수용체 2, 림프독소-베타 수용체, CCR4, CD19, CD20, CD22, CD28, CD33, CD40, CD44, CD80, CSF-1R, CTLA-4, 섬유모세포 활성화 단백질(FAP), 헵신(hepsin), 흑색종 관련 콘드로이틴 설페이트 프로테오글리칸(MCSP), 전립선 특이적 막 항원(PSMA), CDCP1, VEGF 수용체 1, VEGF 수용체 2, IGF1-R, TSLP-R, TIE-1, TIE-2, TNF-알파, TNF와 유사한 약한 아폽토시스 유도제(TWEAK), 또는 IL-1R, 바람직하게는 MCSP, EGFR, CEA, CD20 또는 IGF1-R, 보다 바람직하게는 CD20을 포함한다. 따라서, 본 발명에 따른 상기 어푸코실화된 항체는 바람직하게는 항-CD20 항체이다.
따라서, 본 발명의 한 양태는 암 치료용 약제의 제조를 위한, GM-CSF, M-CSF 및 IL-15로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 사이토카인과 병용되는 어푸코실화된 항체의 용도로서, 상기 어푸코실화된 항체가 Asn297에서 올리고사카라이드(당)의 총량의 60% 이하의 양으로 푸코스를 가지면서 종양 항원에 특이적으로 결합하는 IgG1 또는 IgG3 이소타입(바람직하게는 IgG1 이소타입)의 어푸코실화된 항체인, 용도이고, 이때 상기 종양 항원은 EGFR, HER2/neu, HER3, HER4, Ep-CAM, CEA, TRAIL, TRAIL-수용체 1, TRAIL-수용체 2, 림프독소-베타 수용체, CCR4, CD19, CD20, CD22, CD28, CD33, CD40, CD44, CD80, CSF-1R, CTLA-4, 섬유모세포 활성화 단백질(FAP), 헵신, 흑색종 관련 콘드로이틴 설페이트 프로테오글리칸(MCSP), 전립선 특이적 막 항원(PSMA), CDCP1, VEGF 수용체 1, VEGF 수용체 2, IGF1-R, TSLP-R, TIE-1, TIE-2, TNF-알파, TNF와 유사한 약한 아폽토시스 유도제(TWEAK) 및 IL-1R, 바람직하게는 MCSP, EGFR, CEA, CD20 및 IGF1-R로부터 선택되고, 보다 바람직하게는 CD20이다. 한 실시양태에서, 푸코스의 양은 Asn297에서 올리고사카라이드(당)의 총량의 20% 내지 60%이다. 또 다른 실시양태에서, 푸코스의 양은 Asn297에서 올리고사카라이드(당)의 총량의 40% 내지 60%이다.
따라서, 본 발명의 한 양태는 암 치료용 약제의 제조를 위한, GM-CSF, M-CSF 및 IL-15로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 사이토카인과 병용되는 어푸코실화된 항체의 용도로서, 상기 어푸코실화된 항체가 Asn297에서 올리고사카라이드(당)의 총량의 60% 이하의 양으로 푸코스를 가지면서 종양 항원에 특이적으로 결합하는 IgG1 또는 IgG3 이소타입(바람직하게는 IgG1 이소타입)의 어푸코실화된 항체인, 용도이고, 이때 암은 EGFR, HER2/neu, HER3, HER4, Ep-CAM, CEA, TRAIL, TRAIL-수용체 1, TRAIL-수용체 2, 림프독소-베타 수용체, CCR4, CD19, CD20, CD22, CD28, CD33, CD40, CD44, CD80, CSF-1R, CTLA-4, 섬유모세포 활성화 단백질(FAP), 헵신, 흑색종 관련 콘드로이틴 설페이트 프로테오글리칸(MCSP), 전립선 특이적 막 항원(PSMA), CDCP1, VEGF 수용체 1, VEGF 수용체 2, IGF1-R, TSLP-R, TIE-1, TIE-2, TNF-알파, TNF와 유사한 약한 아폽토시스 유도제(TWEAK) 및 IL-1R, 바람직하게는 MCSP, EGFR, CEA, CD20 및 IGF1-R로부터 선택된, 보다 바람직하게는 CD20인 상기 종양 항원을 발현한다. 한 실시양태에서, 푸코스의 양은 Asn297에서 올리고사카라이드(당)의 총량의 20% 내지 60%이다. 또 다른 실시양태에서, 푸코스의 양은 Asn297에서 올리고사카라이드(당)의 총량의 40% 내지 60%이다.
본원에서 사용될 때 용어 "결합" 또는 "특이적 결합"은 정제된 야생형 항원을 사용한 시험관내 분석, 바람직하게는 플라스몬 공명 분석(비아코어, 지이-헬쓰케어, 스웨덴 업살라 소재)에서 항체와 항원의 에피토프의 결합을 지칭한다. 상기 결합의 친화성은 용어 ka(항체/항원 복합체로부터의 항체의 결합에 대한 속도 상수), kD(해리 상수) 및 KD(kD/ka)에 의해 정의된다. 결합 또는 특이적 결합은 10-8 mol/ℓ 이하, 바람직하게는 10-9 mol/ℓ 내지 10-13 mol/ℓ의 결합 친화성(KD)을 의미한다. 따라서, 본 발명에 따른 어푸코실화된 항체는 10-8 mol/ℓ 이하, 바람직하게는 10-9 mol/ℓ 내지 10-13 mol/ℓ의 결합 친화성(KD)으로 그 자신에 대해 특이적인 종양 항원에 특이적으로 결합한다.
본원에서 사용될 때 "CD20"은 전구 B 림프구 및 성숙 B 림프구 상에 위치한 약 35 kD의 분자량을 갖는 소수성 경막 단백질인 인간 B 림프구 항원 CD20(CD20, B 림프구 표면 항원 B1, Leu-16, Bp35, BM5 및 LF5로도 공지되어 있음; 서열은 스위스프롯(SwissProt) 데이터베이스 엔트리 P11836을 특징으로 함)을 지칭한다(Valentine, M.A., et al., J. Biol. Chem. 264(19) (1989) 11282-11287; Tedder, T.F., et al, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85 (1988) 208-12; Stamenkovic, I., et al., J. Exp. Med. 167 (1988) 1975-80; Einfeld, D.A., et al., EMBO J. 7 (1988) 711-7; Tedder, T.F., et al., J. Immunol. 142 (1989) 2560-8). 상응하는 인간 유전자는 MS4A1로도 공지되어 있는 막 횡단 4-도메인 수퍼패밀리 A 구성원 1이다. 이 유전자는 막 횡단 4A 유전자 패밀리의 구성원을 코딩한다. 이 발생기 단백질 패밀리의 구성원들은 공통된 구조적 특징 및 유사한 인트론/엑손 스플라이스 경계를 특징으로 하고 조혈 세포 및 비-림프 조직 중에서 독특한 발현 패턴을 표시한다. 이 유전자는 혈장 세포로의 B 세포의 발생 및 분화에 있어서 일정한 역할을 수행하는 B 림프구 표면 분자를 코딩한다. 이 패밀리 구성원은 패밀리 구성원들의 클러스터 중에서 11q12에 위치한다. 이 유전자의 대안적인 스플라이싱은 동일한 단백질을 코딩하는 2개의 전사체 변이체를 발생시킨다.
용어 "CD20" 및 "CD20 항원"은 본원에서 상호교환적으로 사용되고 세포에 의해 천연적으로 발현되거나 CD20 유전자로 형질감염된 세포 상에서 발현되는 인간 CD20의 임의의 변이체, 동형체 및 종 상동체를 포함한다. 본 발명의 항체와 CD20 항원의 결합은 CD20을 불활성화시킴으로써 CD20을 발현하는 세포(예를 들면, 종양 세포)의 사멸을 매개한다. CD20을 발현하는 세포의 사멸은 하기 기작들 중 하나 이상의 기작에 의해 일어날 수 있다: 세포 사멸/아폽토시스 유도, ADCC 및 CDC.
당분야에서 인식된 바와 같이 CD20의 동의어는 B 림프구 항원 CD20, B 림프구 표면 항원 B1, Leu-16, Bp35, BM5 및 LF5를 포함한다.
본 발명에 따른 용어 "항-CD20 항체"는 CD20 항원에 특이적으로 결합하는 항체이다. CD20 항원에 대한 항-CD20 항체의 결합 성질 및 생물학적 활성에 따라, 2 유형의 항-CD20 항체들(I형 항-CD20 항체 및 II형 항-CD20 항체)이 문헌(Cragg, M.S., et al., Blood 103 (2004) 2738-2743) 및 문헌(Cragg, M.S., et al., Blood 101 (2003) 1045-1052)에 따라 구별될 수 있다(표 2 참조).
Figure pct00002
II형 항-CD20 항체의 예에는 예를 들면, 인간화된 B-Ly1 항체 IgG1(국제 특허출원 공개 제WO 2005/044859호에 개시된 키메라 인간화된 IgG1 항체), 11B8 IgG1(국제 특허출원 공개 제WO 2004/035607호에 개시됨), 및 AT80 IgG1이 포함된다. 전형적으로, IgG1 이소타입의 II형 항-CD20 항체는 특징적인 CDC 성질을 보인다. II형 항-CD20 항체는 IgG1 이소타입의 I형 항체에 비해 감소된 CDC(IgG1 동형체의 경우)를 갖는다.
I형 항-CD20 항체의 예에는 예를 들면, 리툭시맙, HI47 IgG3(ECACC, 하이브리도마), 2C6 IgG1(국제 특허출원 공개 제WO 2005/103081호에 개시됨), 2F2 IgG1(국제 특허출원 공개 제WO 2004/035607호 및 제WO 2005/103081호에 개시됨) 및 2H7 IgG1(국제 특허출원 공개 제WO 2004/056312호에 개시됨)이 포함된다.
본 발명에 따른 어푸코실화된 항-CD20 항체는 바람직하게는 II형 항-CD20 항체, 보다 바람직하게는 국제 특허출원 공개 제2005/044859호 및 제WO 2007/031875호에 기재된 어푸코실화된 인간화된 B-Ly1 항체이다.
"리툭시맙" 항체(기준 항체; I형 항-CD20 항체의 예)는 인간 CD20 항원에 대해 유도된 유전적으로 조작된 키메라 인간 감마 1 뮤린 불변 도메인 함유 단일클론 항체이다. 그러나, 이 항체는 당조작되어 있지 않고 어푸코실화되어 있지 않으므로, 85% 이상의 양으로 푸코스를 갖는다. 이 키메라 항체는 인간 감마 1 불변 도메인을 함유하고, 아이덱 파마슈티칼스 코포레이션(IDEC Pharmaceuticals Corporation)에 양도된 미국 특허 제5,736,137호(Andersen, et. al.)(1998년 4월 17일 발행)에서 명칭 "C2B8"로 확인된다. 리툭시맙은 재발된 또는 불응성 저등급 또는 소포 CD20 양성 B 세포 비-호지킨 림프종을 갖는 환자의 치료용으로 승인되어 있다. 시험관내 작용 기작 연구는 리툭시맙이 인간 보체-의존적 세포독성(CDC)을 나타낸다는 것을 밝혔다(Reff, M.E., et. al, Blood 83(2) (1994) 435-445). 추가로, 리툭시맙은 항체-의존적 세포-매개 세포독성(ADCC)을 측정하는 분석에서 활성을 나타낸다. 용어 "인간화된 B-Ly1 항체"는 IgG1의 인간 불변 도메인을 사용한 키메라화 및 후속 인간화에 의해 뮤린 단일클론 항-CD20 항체 B-Ly1(뮤린 중쇄의 가변 영역(VH): 서열번호 1; 뮤린 경쇄의 가변 영역(VL): 서열번호 2 - 문헌(Poppema, S. and Visser, L., Biotest Bulletin 3 (1987) 131-139) 참조)로부터 수득된, 국제 특허출원 공개 제WO 2005/044859호 및 제WO 2007/031875호에 개시된 인간화된 B-Ly1 항체를 지칭한다(국제 특허출원 공개 제WO 2005/044859호 및 제WO 2007/031875호 참조). 이들 "인간화된 B-Ly1 항체"는 국제 특허출원 공개 제WO 2005/044859호 및 제WO 2007/031875호에 상세히 개시되어 있다.
바람직하게는, "인간화된 B-Ly1 항체"는 서열번호 3 내지 서열번호 19로 구성된 군으로부터 선택된 중쇄의 가변 영역(VH)을 갖는다(국제 특허출원 공개 제WO 2005/044859호 및 제WO 2007/031875호의 B-HH2 내지 B-HH9 및 B-HL8 내지 B-HL17). 서열번호 3, 4, 7, 9, 11, 13 및 15(국제 특허출원 공개 제WO 2005/044859호 및 제WO 2007/031875호의 B-HH2, BHH-3, B-HH6, B-HH8, B-HL8, B-HL11 및 B-HL13)가 특히 바람직하다. 바람직하게는, "인간화된 B-Ly1 항체"는 서열번호 20의 경쇄의 가변 영역(VL)을 갖는다(국제 특허출원 공개 제WO 2005/044859호 및 제WO 2007/031875호의 B-KV1). 바람직하게는, "인간화된 B-Ly1 항체"는 서열번호 7의 중쇄의 가변 영역(VH)(국제 특허출원 공개 제WO 2005/044859호 및 제WO 2007/031875호의 B-HH6) 및 서열번호 20의 경쇄의 가변 영역(VL)(국제 특허출원 공개 제WO 2005/044859호 및 제WO 2007/031875호의 B-KV1)을 갖는다. 본원에서 사용될 때 이 인간화된 B-Ly1 항체는 "GA101" 또는 "오비누투주맙"(WHO Drug Information, Vol. 25, No. 1, 2011)으로 명명된다. 상기 항체가 바람직하다. 나아가, 인간화된 B-Ly1 항체는 바람직하게는 IgG1 항체이다. 본 발명에 따라 이러한 어푸코실화된 인간화된 B-Ly1 항체는 국제 특허출원 공개 제WO 2005/044859호, 제WO 2004/065540호 및 제WO2007/031875호, 문헌(Umana, P., et al., Nature Biotechnol. 17 (1999) 176-180) 및 국제 특허출원 공개 제WO 99/154342호에 기재된 절차에 따라 Fc 영역에서 당조작된다(GE). 어푸코실화된 당조작된 인간화된 B-Ly1(B-HH6-B-KV1 GE)은 본 발명의 한 실시양태에서 바람직하다. 이러한 당조작된 인간화된 B-Ly1 항체는 바람직하게는 감소된 수준의 푸코스 잔기를 갖는, Fc 영역 내의 변경된 글리코실화 패턴을 갖는다. 바람직하게는, 푸코스의 양은 Asn297에서 올리고사카라이드의 총량의 60% 이하이다(한 실시양태에서, 푸코스의 양은 40% 내지 60%이고, 또 다른 실시양태에서 푸코스의 양은 50% 이하이고, 또 다른 실시양태에서 푸코스의 양은 30% 이하이다). 나아가, Fc 영역의 올리고사카라이드는 바람직하게는 이등분된다. 이들 당조작된 인간화된 B-Ly1 항체는 증가된 ADCC를 갖는다.
올리고사카라이드 성분은 물리적 안정성, 단백질분해효소 공격에 대한 저항성, 면역 시스템과의 상호작용, 약동학 및 특정 생물학적 활성을 비롯한, 치료 당단백질의 효능과 관련된 성질에 유의하게 영향을 미칠 수 있다. 이러한 성질은 올리고사카라이드의 존재 또는 부재뿐만 아니라 특정 구조물에 의해 좌우될 수 있다. 올리고사카라이드 구조물과 당단백질 기능 사이의 어느 정도의 일반화가 만들어질 수 있다. 예를 들면, 일부 올리고사카라이드 구조물은 특정 탄수화물 결합 단백질과의 상호작용을 통해 혈류로부터의 당단백질의 신속한 제거를 매개하는 반면, 다른 구조물은 항체에 의해 결합될 수 있고 원치 않는 면역 반응을 유발할 수 있다(Jenkins, N., et al., Nature Biotechnol. 14 (1996) 975-81).
포유동물 세포들은 인간 적용에 가장 적합한 형태로 단백질을 글리코실화하는 그들의 능력으로 인해 치료 당단백질의 제조에 바람직한 숙주이다(Cumming, D.A., et al., Glycobiology 1 (1991) 115-30; Jenkins, N., et al., Nature Biotechnol. 14 (1996) 975-81). 세균은 단백질을 거의 글리코실화하지 않고, 유사한 다른 유형의 흔한 숙주, 예컨대, 효모, 사상 진균, 곤충 및 식물 세포는 혈류로부터의 신속한 제거, 바람직하지 않은 면역 상호작용 및 몇몇 특정 경우 감소된 생물학적 활성과 관련된 글리코실화 패턴을 제공한다. 포유동물 세포들 중 중국 햄스터 난소(CHO) 세포는 최근 20년 동안 가장 통상적으로 사용되고 있다. 적합한 글리코실화 패턴의 제공 이외에, 이들 세포들은 유전적으로 안정한 고생산성 클론 세포주의 일관된 발생을 가능하게 한다. 이들은 무혈청 배지의 사용을 통해 단순한 생물반응기에서 고밀도로 배양될 수 있고, 안전하고 재현가능한 생물공정의 개발을 가능하게 한다. 다른 통상적으로 사용되는 동물 세포는 새끼 햄스터 신장(BHK) 세포, NSO-마우스 골수종 세포 및 SP2/0-마우스 골수종 세포를 포함한다. 보다 최근에는, 유전자이식 동물로부터의 제조도 시험되었다(Jenkins, N., et al., Nature Biotechnol. 14 (1996) 975-981).
모든 항체들은 중쇄 불변 영역 내의 보존된 위치에서 탄수화물 구조물을 함유하고, 이때 각각의 이소타입은 단백질 조립, 분비 또는 기능적 활성에 가변적으로 영향을 미치는 N-연결 탄수화물 구조물의 상이한 어레이를 보유한다(Wright, A., and Morrison, S.L., Trends Biotech. 15 (1997) 26-32). 부착된 N-연결 탄수화물의 구조는 프로세싱 정도에 따라 상당히 달라지고, 고 만노스 복합체 올리고사카라이드, 다중 분지된 복합체 올리고사카라이드 및 바이안테나리 복합체 사카라이드를 포함할 수 있다(Wright, A., and Morrison, S.L., Trends Biotech. 15 (1997) 26-32). 전형적으로, 단일클론 항체조차도 다수의 당형태로서 존재하도록 특정 글리코실화 부위에 부착된 코어 올리고사카라이드 구조물의 불균질한 프로세싱이 존재한다. 마찬가지로, 항체 글리코실화에서의 주요 차이가 세포주들 사이에 존재한다는 것이 밝혀졌고, 상이한 배양 조건 하에서 생장된 소정의 세포주에 대해 심지어 미미한 차이가 관찰된다(Lifely, M.R., et al., Glycobiology 5(8) (1995) 813-22).
단순한 제조 과정을 유지하고 상당한 원치 않는 부작용을 잠재적으로 피하면서 효능의 큰 증가를 수득하는 한 방식은 문헌(Umana, P., et al., Nature Biotechnol. 17 (1999) 176-180) 및 미국 특허 제6,602,684호에 기재된 바와 같이 단일클론 항체들의 올리고사카라이드 성분을 조작함으로써 상기 단일클론 항체들의 천연 세포-매개 이펙터 기능을 향상시키는 것이다. 암 면역치료에서 가장 통상적으로 사용되는 항체인 IgG1 유형의 항체는 각각의 CH2 도메인 내의 Asn297에서 보존된 N-연결 글리코실화 부위를 갖는 당단백질이다. Asn297에 부착된 2개의 복합체 바이안테나리 올리고사카라이드가 CH2 도메인들 사이에 묻혀 폴리펩티드 골격과의 광범위한 접촉을 형성하고, 이들의 존재는 항체가 이펙터 기능, 예컨대, 항체-의존적 세포-매개 세포독성(ADCC)을 매개하는 데에 필수적이다(Lifely, M.R., et al., Glycobiology 5 (1995) 813-822; Jefferis, R., et al., Immunol. Rev. 163 (1998) 59-76; Wright, A., and Morrison, S.L., Trends Biotechnol. 15 (1997) 26-32).
이등분된 올리고사카라이드의 형성을 촉진하는 글리코실트랜스퍼라제인 β(1,4)-N-아세틸글루코스아미닐트랜스퍼라제 III("GnTII17y")을 중국 햄스터 난소(CHO) 세포에서 과다발현시키는 것은 조작된 CHO 세포에 의해 생성된 항신경모세포종 키메라 단일클론 항체(chCE7)의 시험관내 ADCC 활성을 유의하게 증가시킨다는 것은 이미 밝혀졌다(문헌(Umana, P., et al., Nature Biotechnol. 17 (1999) 176-180) 및 국제 특허출원 공개 제WO 99/154342호 참조, 이들의 전체 내용은 본원에 참고로 도입됨). 항체 chCE7은 높은 종양 친화성 및 특이성을 갖지만 GnTIII 효소를 결여하는 표준 산업용 세포주에서 생성될 때 임상적으로 유용하기에는 너무 작은 효능을 갖는 비-접합된 단일클론 항체의 큰 클래스에 속한다(Umana, P., et al., Nature Biotechnol. 17 (1999) 176-180). 상기 연구는 GnTIII을 발현하도록 항체 생성 세포를 조작하여, 이등분된 비-푸코실화된 올리고사카라이드를 비롯한 불변 영역(Fc) 관련 이등분된 올리고사카라이드의 비율을 천연 항체에서 발견된 수준에 비해 증가시킴으로써 ADCC 활성의 큰 증가를 수득할 수 있다는 것을 보여주는 첫 번째 연구이었다.
인터류킨(IL)-15는 IL-2, IL-4, IL-7, IL-9 및 IL-21을 포함하는 큰 사이토카인 패밀리에 속한다. 이들 사이토카인들은 동일한 감마 쇄(γc) 수용체를 공유하지만, IL-2 및 IL-15는 IL-2R 및 IL-15R 2의 α 쇄에 대한 그들의 결합 성질뿐만 아니라 그들의 세포 활성화 기작과도 관련되어 있는 특정 기능을 갖는다. 재조합 인간 IL-15는 예를 들면, 펩프로텍(테부-바이오(Tebu-bio), 프랑스 르 페라이-엔-이벨린 소재)으로부터 상업적으로 입수될 수 있다.
본원에서 사용될 때 용어 "암"은 어푸코실화된 항체가 특이적으로 결합하는 종양 항원을 발현하는 암 또는 종양을 지칭한다. 이러한 암은 림프종, 림프구성 백혈병, 바람직하게는 급성 또는 만성 림프구성 백혈병, 골수성 백혈병, 바람직하게는 급성 또는 만성 골수성 백혈병, 폐암, 비-소세포 폐암(NSCL), 기관지폐포세포 폐암, 골암, 췌장암, 피부암, 두부 또는 경부의 암, 피부 또는 안구내 흑색종, 자궁암, 난소암, 직장암, 항문부의 암, 위암, 위장암, 결장암, 유방암, 자궁암, 난관암종, 자궁내막암종, 자궁경부암종, 질암종, 음문암종, 호지킨병, 식도암, 소장암, 내분비계암, 갑상선암, 부갑상선암, 부신암, 연질 조직 육종, 요도암, 음경암, 전립선암, 방광암, 신장암 또는 요도암, 신장세포암종, 신우암종, 중피종, 간세포암, 담관암, 중추신경계(CNS)의 신생물, 척추 종양, 뇌간 교세포종, 다형성 교모세포종, 성상세포종, 신경초종, 상의세포종, 수모세포종, 뇌수막종, 편평세포암종, 뇌하수체 선종(상기 암들 중 임의의 암의 불응성 버전, 또는 상기 암들 중 하나 이상의 암의 조합을 포함함)을 포함한다. 바람직하게는, 상기 암은 만성 림프구성 백혈병(CLL)이다.
바람직하게는, 인간 GM-CSF, 인간 M-CSF 및/또는 인간 IL3(이들 모두 인간 단핵세포/주변세포를 대식세포로 분화시킴)으로부터 선택된 사이토카인과 병용되는 본 발명에 따른 어푸코실화된 항체의 병용치료는 단핵세포/주변세포에 의해 침윤되는 암 또는 종양의 치료에 사용되고, 단핵세포/주변세포에 의한 높은 침윤을 갖는 암 또는 종양의 치료에 특히 귀중하다. 암 또는 종양의 단핵세포/주변세포 침윤은 단핵세포 특이적 마커, 예컨대, CD14를 사용한 단핵세포/주변세포 특이적 염색에 의해 (생검 후 종양 조직에서) 검출될 수 있다(Wright S.D. et al., Science 249 (1990) 1431-1433; Bogman M.J. et al., Transplant Proc. 23 (1991) 1293-1294; Andreesen, R, et al., J Leukoc Biol. 47(6) (1990) 490-7). 전형적으로, 당업자는 어푸코실화된 항체가 특이적으로 결합하는 종양 항원을 발현하는 단핵세포/주변세포-침윤된 암 또는 종양의 치료를 위해 인간 GM-CSF, 인간 M-CSF 및/또는 인간 IL3으로부터 선택된 사이토카인과 병용되는 본 발명에 따른 어푸코실화된 항체의 병용치료를 이용할 것이다. 따라서, 한 실시양태에서, 암은 (단핵세포 특이적 CD14 항원에 의해 검출될 수 있는) 단핵세포/주변세포-침윤된 암이다.
용어 "CD20 항원의 발현"은 종양 또는 암, 바람직하게는 비-고형 종양으로부터 유래된 세포, 바람직하게는 T 또는 B 세포, 보다 바람직하게는 B 세포의 세포 표면 상에서의 CD20 항원의 유의한 발현 수준을 표시하기 위한 것이다. "CD20 발현 암"을 갖는 환자는 당분야에서 공지된 표준 분석에 의해 확인될 수 있다. 예를 들면, CD20 항원 발현은 상응하는 mRNA의 면역조직화학(IHC) 검출, FACS 또는 PCR-기초 검출을 이용함으로써 측정된다.
본원에서 사용될 때 용어 "CD20 발현 암"은 암세포가 CD20 항원의 발현을 나타내는 모든 암들을 지칭한다. 바람직하게는, 본원에서 사용될 때 CD20 발현 암은 림프종(바람직하게는 B 세포 비-호지킨 림프종(NHL)) 및 림프구성 백혈병을 지칭한다. 이러한 림프종 및 림프구성 백혈병은 예를 들면, a) 소포 림프종, b) 비-분할된 소세포 림프종/버킷 림프종(풍토성 버킷 림프종, 산발성 버킷 림프종 및 비-버킷 림프종을 포함함), c) 변연부 림프종(림프절외 변연부 B 세포 림프종(점막 관련 림프 조직 림프종, MALT), 림프절 변연부 B 세포 림프종 및 비장 변연부 림프종을 포함함), d) 맨틀 세포 림프종(MCL), e) 대세포 림프종(B 세포 확산 대세포 림프종(DLCL), 확산 혼합 세포 림프종, 면역모세포성 림프종, 원발성 종격 B 세포 림프종, 혈관중심 림프종-폐 B 세포 림프종을 포함함), f) 모발세포 백혈병, g) 림프구성 림프종, 발덴스트롬 마크로글로불린혈증, h) 급성 림프구성 백혈병(ALL), 만성 림프구성 백혈병(CLL)/소림프구성 림프종(SLL), B 세포 전구림프구성 백혈병, i) 혈장 세포 신생물, 혈장 세포 골수종, 다발 골수종, 형질세포종, 및 j) 호지킨병을 포함한다.
보다 바람직하게는, CD20 발현 암은 B 세포 비-호지킨 림프종(NHL)이다. 특히, CD20 발현 암은 맨틀 세포 림프종(MCL), 급성 림프구성 백혈병(ALL), 만성 림프구성 백혈병(CLL), B 세포 확산 대세포 림프종(DLCL), 버킷 림프종, 모발세포 백혈병, 소포 림프종, 다발 골수종, 변연부 림프종, 이식 후 림프증식성 장애(PTLD), HIV 관련 림프종, 발덴스트롬 마크로글로불린혈증 또는 원발성 CNS 림프종이다.
예를 들면, 암에 적용될 때 용어 "치료하는 방법" 또는 이의 등가 용어는 환자에서 암세포의 수를 감소시키거나 제거하도록, 또는 암의 증상을 완화시키도록 디자인된 조치의 절차 또는 과정을 지칭한다. 암 또는 또 다른 증식성 장애를 "치료하는 방법"은 암세포 또는 다른 장애가 실제로 제거될 것, 세포의 수 또는 장애가 실제로 감소될 것, 또는 암 또는 다른 장애의 증상이 실제로 완화될 것임을 반드시 의미하는 것은 아니다. 종종, 암을 치료하는 방법은 성공 확률이 낮음에도 불구하고 환자의 병력 및 평가된 생존 기대수명을 고려할 때 조치의 전체 유리한 과정을 유도하는 것으로 간주되는 경우에도 수행될 것이다.
용어 "공-투여" 또는 "공-투여하는"은 한 단일 제제 또는 2개의 분리된 제제로서 상기 어푸코실화된 항체(바람직하게는, 어푸코실화된 항-CD20 항체) 및 인간 IL-15의 투여를 지칭한다. 공-투여는 동시적일 수 있거나 임의의 순서로 순차적일 수 있고, 이때 바람직하게는 두(또는 모든) 활성 약제들이 그들의 생물학적 활성을 동시에 발휘하는 시간이 존재한다. 상기 어푸코실화된 항체 및 인간 IL-15는 (예를 들면, 정맥내(i.v.)) 연속 주입(항체를 위한 연속 주입 및 최종적으로 인간 IL-15를 위한 연속 주입)를 통해 동시에 또는 순차적으로 공-투여된다. 두 치료제들이 순차적으로 공-투여되는 경우, 용량은 2회의 별도 투여에서 동일한 날에 투여되거나, 약제들 중 하나가 1일째 날에 투여되고 두 번째 약제가 2일째 날 내지 7일째 날, 바람직하게는 2일째 날 내지 4일째 날에 공-투여된다. 따라서, 용어 "순차적으로"는 제1 성분(사이토카인 또는 항체)의 투약 후 7일 이내, 바람직하게는 제1 성분의 투약 후 4일 이내를 의미하고, 용어 "동시에"는 동일한 시간을 의미한다. 상기 어푸코실화된 항체 및 인간 IL-15의 유지 용량과 관련하여 용어 "공-투여"는 치료 주기(예를 들면, 매주)가 두 약물들에 적합한 경우 유지 용량이 동시에 공-투여될 수 있다는 것을 의미한다. 또는, 인간 IL-15는 예를 들면, 1일째 날 내지 3일째 날마다 투여되고, 상기 어푸코실화된 항체는 매주 투여된다. 또는, 유지 용량은 1일 이내 또는 수일 이내에 순차적으로 공-투여된다.
항체는 연구자, 수의사, 의사 또는 다른 임상의가 찾고자 하는 조직, 시스템, 동물 또는 인간의 생물학적 또는 의학적 반응을 이끌어낼 각각의 화합물 또는 조합물의 양인 "치료 유효량"(또는 단순히 "유효량")으로 환자에게 투여된다는 것이 자명하다.
상기 어푸코실화된 항체 및 인간 IL-15의 공-투여의 양, 및 공-투여의 시기는 치료되는 환자의 유형(종, 성별, 연령, 체중 등) 및 상태, 및 치료되는 질환 또는 병태의 중증도에 의해 좌우될 것이다. 상기 어푸코실화된 항체 및 인간 IL-15는 한번에 또는 일련의 치료에 걸쳐 환자에게 적절하게 공-투여된다. 질환의 유형 및 중증도에 따라, 상기 어푸코실화된 항체의 약 1 ㎍/kg 내지 50 mg/kg(예를 들면, 0.1 mg/kg 내지 20 mg/kg) 및 인간 IL-15의 1 ㎍/kg 내지 50 mg/kg(예를 들면, 0.1 mg/kg 내지 20 mg/kg)이 환자에게 공-투여될 두 약물들에 대한 초기 후보 용량이다. 투여가 정맥내 투여인 경우, 상기 어푸코실화된 항체 또는 인간 IL-15에 대한 초기 주입 시간은 후속 주입 시간보다 더 길 수 있는데, 예를 들면, (초기 주입이 우수한 내약성을 나타내는 경우) 초기 주입의 경우 약 90분 및 후속 주입의 경우 약 30분일 수 있다.
상기 어푸코실화된 항체의 바람직한 용량은 약 0.1 mg/kg 내지 약 50 mg/kg의 범위 내에 있을 것이다. 따라서, 약 0.5 mg/kg, 2.0 mg/kg, 4.0 mg/kg, 10 mg/kg 및 30 mg/kg(및 이들의 임의의 조합) 중 하나 이상의 용량이 환자에게 공-투여될 수 있다. 한 실시양태에서, 상기 어푸코실화된 항-CD20 항체(바람직하게는 어푸코실화된 인간화된 B-Ly1 항체)의 바람직한 용량은 약 0.05 mg/kg 내지 약 30 mg/kg의 범위 내에 있을 것이다. 따라서, 약 0.5 mg/kg, 2.0 mg/kg, 4.0 mg/kg, 10 mg/kg 및 30 mg/kg(및 이들의 임의의 조합) 중 하나 이상의 용량이 환자에게 공-투여될 수 있다. 인간 IL-15의 바람직한 용량은 인간 IL-15의 경우 0.01 mg/kg 내지 약 50 mg/kg, 예를 들면, 0.1 mg/kg 내지 10.0 mg/kg의 범위 내에 있을 것이다. 환자의 유형(종, 성별, 연령, 체중 등) 및 상태, 및 어푸코실화된 항체 및 인간 IL-15의 유형에 따라, 상기 어푸코실화된 항체의 용량 및 투여 스케쥴은 인간 IL-15의 용량 및 투여 스케쥴과 상이할 수 있다. 예를 들면, 상기 어푸코실화된 항체는 예를 들면, 1주 내지 3주마다 투여될 수 있고, 인간 IL-15는 매일 또는 2일 내지 10일마다 투여될 수 있다. 초기 보다 높은 적재 용량 후 하나 이상의 보다 낮은 용량이 투여될 수도 있다.
한 실시양태에서, 상기 어푸코실화된 항-CD20 항체(바람직하게는 어푸코실화된 인간화된 B-Ly1 항체)의 바람직한 용량은 3주 내지 6주 용량 주기의 1일째 날, 8일째 날 및 15일째 날 800 mg 내지 1600 mg(한 실시양태에서 800 mg 내지 1200 mg), 이어서 최대 9회의 3주 내지 4주 용량 주기의 1일째 날 400 mg 내지 1200 mg(한 실시양태에서 800 mg 내지 1200 mg)의 용량일 것이다.
바람직한 실시양태에서, 상기 약제는 암, 바람직하게는 단핵세포/주변세포-침윤된 암을 앓고 있는 환자에서 전이 또는 추가 퍼짐을 예방하거나 감소시키는 데에 유용하다. 상기 약제는 생존의 지속기간, 무진행 생존, 반응률 또는 반응의 지속기간에 의해 측정될 때 이러한 환자의 생존의 지속기간을 증가시키거나, 이러한 환자의 무진행 생존을 증가시키거나, 반응의 지속기간을 증가시키거나, 치료된 환자를 통계적으로 유의하게 및 임상적으로 유의하게 개선하는 데에 유용하다. 바람직한 실시양태에서, 상기 약제는 환자 군에서 반응률을 증가시키는 데에 유용하다.
본 발명과 관련하여, 추가 다른 세포독성, 화학치료 또는 항암 약제, 또는 이러한 약제(예를 들면, 사이토카인)의 효과를 향상시키는 화합물이 암의 어푸코실화된 항체 및 인간 IL-15 병용치료에 사용될 수 있다. 이러한 분자는 적절하게는 의도된 목적에 효과적인 양으로 함께 존재한다. 바람직하게는, 상기 어푸코실화된 항체 및 인간 IL-15 병용치료는 이러한 추가 세포독성, 화학치료 또는 항암 약제, 또는 이러한 약제의 효과를 향상시키는 화합물 없이 사용된다.
이러한 약제는 예를 들면, 사이클로포스프아미드(CTX; 예컨대, 사이톡산(cytoxan)®), 클로람부실(CHL; 예를 들면, 류케란(leukeran)®), 시스플라틴(CisP; 예를 들면, 플라티놀(platinol)®), 부설판(예를 들면, 마일레란(myleran)®), 멜팔란, 카무스틴(BCNU), 스트렙토조토신, 트라이에틸렌멜라민(TEM), 미토마이신 C 등과 같은 알킬화제 또는 알킬화 작용을 갖는 약제; 메토트렉세이트(MTX), 에토포사이드(VP16; 예를 들면, 베페시드(vepesid)®), 6-머캅토퓨린(6MP), 6-티옥구아닌(6TG), 사이타라빈(Ara-C), 5-플루오로우라실(5-FU), 카페시타빈(예를 들면, 젤로다(Xeloda)®), 다카바진(DTIC) 등과 같은 항-대사물질; 악티노마이신 D, 독소루비신(DXR; 예컨대, 아드리아마이신(adriamycin)®), 다우노루비신(다우노마이신), 블레오마이신, 미쓰라마이신 등과 같은 항생제; 빈크리스틴(VCR), 빈블라스틴 등과 같은 빈카 알칼로이드 등의 알칼로이드; 및 파클리탁셀(예를 들면, 탁솔(taxol)®) 및 파클리탁셀 유도체, 세포증식 억제제(cytostatic agent), 덱사메타손(DEX; 예컨대, 데카드론(decadron)®)과 같은 글루코코르티코이드, 및 프레드니손과 같은 코르티코스테로이드, 하이드록시우레아와 같은 뉴클레오사이드 효소 억제제, 아스파라기나제, 류코보린 및 다른 엽산 유도체와 같은 아미노산 고갈 효소, 및 유사한 다양한 항종양제와 같은 다른 항종양제를 포함한다. 하기 약제들도 추가 약제로서 사용될 수 있다: 아니포스틴(예를 들면, 에티올(ethyol)®), 닥티노마이신, 메클로레타민(질소 머스타드), 스트렙토조신, 사이클로포스프아미드, 로무스틴(CCNU), 독소루비신 리포(예를 들면, 독실(doxil)®), 겜시타빈(예를 들면, 겜자(gemzar)®), 다우노루비신 리포(예컨대, 다우녹솜(daunoxome)®), 프로카바진, 미토마이신, 독세탁셀(예컨대, 탁소테레(taxotere)®), 알데스류킨, 카보플라틴, 옥살리플라틴, 클라드리빈, 캄프토테신, CPT 11(이리노테칸), 10-하이드록시 7-에틸-캄프토테신(SN38), 플록수리딘, 플루다라빈, 이포스프아미드, 이다루비신, 메스나, 인터페론 베타, 인터페론 알파, 미토잔트론, 토포테칸, 류프롤라이드, 메게스트롤, 멜팔란, 머캅토퓨린, 플리카마이신, 미토탄, 페가스파르가제, 펜토스타틴, 피포브로만, 플리카마이신, 타목시펜, 테니포사이드, 테스톨락톤, 티오구아닌, 티오테파, 우라실 머스타드, 비노렐빈, 클로람부실. 바람직하게는, 어푸코실화된 항체 및 IL-15 병용치료는 이러한 추가 약제 없이 사용된다.
화학치료 요법에서 전술된 세포독성 약제 및 항암 약제뿐만 아니라 항증식성 표적 특이적 항암 약물, 예컨대, 단백질 키나제 억제제의 사용은 일반적으로 암치료 분야에서 잘 특징규명되어 있고, 본원에서 이들의 사용은 약간 조정하면서 내약성 및 효능을 모니터링하고 투여 경로 및 용량을 조절하기 위한 동일한 고려사항에 속한다. 예를 들면, 세포독성 약제의 실제 용량은 조직배양 방법을 이용함으로써 확인된 환자의 배양된 세포 반응에 따라 달라질 수 있다. 일반적으로, 상기 용량은 추가 다른 약제의 부재 하에서 사용된 양에 비해 감소될 것이다.
효과적인 세포독성 약제의 전형적인 용량은 제조자에 의해 권장된 범위 내에 있을 수 있고, 시험관내 반응 또는 동물 모델에서의 반응에 의해 표시되는 경우 약 한 자릿수 농도 또는 양까지 감소될 수 있다. 따라서, 실제 용량은 의사의 판단, 환자의 상태, 및 일차 배양된 악성 세포 또는 조직배양된 조직 샘플의 시험관내 반응 또는 적절한 동물 모델에서 관찰된 반응에 근거한 치료 방법의 효능에 의해 좌우될 것이다.
본 발명과 관련하여, 유효량의 이온화 방사선이 사용될 수 있고/있거나 CD20 발현 암의 어푸코실화된 항체 및 인간 IL-15 병용치료 이외에 방사성의약품이 사용될 수 있다. 방사선의 공급원은 치료되는 환자의 외부 또는 내부에 존재할 수 있다. 상기 공급원이 환자의 외부에 존재하는 경우, 치료는 외부 빔 방사선치료(EBRT)로서 공지되어 있다. 방사선의 공급원이 환자의 내부에 존재하는 경우, 치료는 근접치료(BT)로 지칭된다. 본 발명과 관련하여 사용되는 방사성 원자는 라듐, 세슘-137, 이리듐-192, 아메리슘-241, 금-198, 코발트-57, 구리-67, 테크네튬-99, 요오드-123, 요오드-131 및 인듐-111을 포함하나 이들로 한정되지 않는 군으로부터 선택될 수 있다. 항체를 이러한 방사성 동위원소로 표지하는 것도 가능하다. 바람직하게는, 어푸코실화된 항체 및 인간 IL-15 병용치료는 이러한 이온화 방사선 없이 사용된다.
방사선치료는 절제불가능한 또는 수술불가능한 종양 및/또는 종양 전이를 조절하기 위한 표준 치료이다. 개선된 결과는 방사선치료가 화학치료와 병용될 때 관찰되었다. 방사선치료는 표적 영역에 전달된 고선량 방사선이 종양 조직 및 정상 조직 둘다에서 생식 세포의 사멸을 유발할 것이라는 원리에 근거한다. 방사선량 요법은 일반적으로 방사선 흡수된 선량(Gy), 시간 및 분획화의 관점에서 정의되고, 종양학자에 의해 조심스럽게 한정되어야 한다. 환자가 제공받는 방사선의 양은 다양한 고려사항에 의해 좌우될 것이지만, 2종의 가장 중요한 고려사항은 신체의 다른 중요한 구조물 또는 장기와 관련하여 종양의 위치, 및 종양이 퍼진 정도이다. 방사선치료를 받는 환자에 대한 전형적인 치료 과정은 1주 내지 6주의 기간에 걸친 치료 스케쥴일 것이고, 이때 10 Gy 내지 80 Gy의 총 선량이 약 1.8 Gy 내지 2.0 Gy의 단일 1일 분획으로 주 당 5일 동안 환자에게 투여될 것이다. 본 발명의 바람직한 실시양태에서, 인간 환자 내의 종양이 본 발명의 병용치료 및 방사선으로 치료되는 경우 상승작용이 있다. 다시 말해, 본 발명의 병용을 포함하는 약제들에 의한 종양 성장의 억제는 선택적으로 추가 화학치료 또는 항암 약제와 함께 방사선과 병용될 때 향상된다. 보조 방사선치료의 파라미터는 예를 들면, 국제 특허출원 공개 제WO 99/60023호에 포함되어 있다.
어푸코실화된 항체는 볼루스로서 정맥내 투여에 의해, 일정한 시간에 걸친 연속 주입에 의해, 또는 근육내, 복강내, 뇌척수액내, 피하, 관절내, 활막내 또는 경막내 경로에 의해 공지된 방법에 따라 환자에게 투여된다. 항체의 정맥내 또는 피하 투여가 바람직하다.
인간 IL-15는 예를 들면, 볼루스로서 정맥내 투여에 의해, 일정한 시간에 걸친 연속 주입에 의해, 또는 근육내, 복강내, 뇌척수액내, 피하, 관절내, 활막내, 경막내 또는 경구 경로에 의해 공지된 방법에 따라 환자에게 투여된다. 인간 IL-15의 정맥내, 피하 또는 경구 투여가 바람직하다.
본원에서 사용될 때 "약학적으로 허용가능한 담체"는 약학 투여에 적합한 용매, 분산 매질, 코팅제, 항균제, 항진균제, 등장화제, 흡수 지연제, 및 다른 물질 및 화합물을 비롯한, 약학 투여에 적합한 임의의 모든 물질을 포함하기 위한 것이다. 임의의 통상적인 매질 또는 약제가 활성 화합물과 상용될 수 없는 경우를 제외하고, 본 발명의 조성물에서의 이들의 사용이 고려된다. 보충 활성 화합물도 조성물 내로 도입될 수 있다.
약학 조성물
약학 조성물은 예를 들면, 항-CD20 항체로서 본 발명에 따른 어푸코실화된 항체 및 본 발명에 따른 인간 IL-15를 약학적으로 허용가능한 무기 또는 유기 담체로 프로세싱함으로써 수득될 수 있다. 락토스, 옥수수 전분 또는 이의 유도체, 탈크, 스테아르산 또는 이의 염 등이 예를 들면, 정제, 코팅된 정제, 당의정 및 경질 젤라틴 캡슐을 위한 이러한 담체로서 사용될 수 있다. 연질 젤라틴 캡슐에 적합한 담체는 예를 들면, 식물성 오일, 왁스, 지방, 반고체 및 액체 폴리올 등이다. 그러나, 활성 물질의 성질에 따라 연질 젤라틴 캡슐의 경우 통상적으로 담체가 요구되지 않는다. 용액 및 시럽의 제조에 적합한 담체는 예를 들면, 물, 폴리올, 글리세롤, 식물성 오일 등이다. 좌제에 적합한 담체는 예를 들면, 천연 또는 경화된 오일, 왁스, 지방, 반액체 또는 액체 폴리올 등이다.
나아가, 약학 조성물은 방부제, 가용화제, 안정화제, 습윤제, 유화제, 감미제, 착색제, 풍미제, 삼투압 변경용 염, 완충제, 차폐제 또는 항산화제를 함유할 수 있다. 약학 조성물은 다른 치료적으로 귀중한 물질도 여전히 함유할 수 있다.
본 발명의 한 실시양태는 암, 특히 CD20 발현 암의 치료에 사용되는 조성물로서, 60% 이하의 양으로 푸코스를 갖는 상기 어푸코실화된 항체(바람직하게는 상기 어푸코실화된 항-CD20 항체) 및 인간 IL-15 둘다를 포함하는 조성물이다.
상기 약학 조성물은 하나 이상의 약학적으로 허용가능한 담체를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명은 (i) 60% 이하의 양으로 푸코스를 갖는 제1 유효량의 어푸코실화된 항체(바람직하게는 상기 어푸코실화된 항-CD20 항체), 및 (ii) 제2 유효량의 인간 IL-15를 포함하는, 특히 암의 치료에 사용되는 약학 조성물을 추가로 제공한다. 이러한 조성물은 약학적으로 허용가능한 담체 및/또는 부형제를 선택적으로 포함한다.
본 발명에 따라 사용되는 어푸코실화된 항체만을 포함하는 약학 조성물은 원하는 순도를 갖는 항체를 선택적인 약학적으로 허용가능한 담체, 부형제 또는 안정화제(Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980))와 혼합하여 동결건조된 제형 또는 수용액의 형태로 저장용으로 제조된다. 허용가능한 담체, 부형제 또는 안정화제는 사용되는 용량 및 농도에서 수용자에게 독성을 나타내지 않고 완충제, 예컨대, 포스페이트, 시트레이트 및 다른 유기산; 아스코르브산 및 메티오닌을 포함하는 항산화제; 방부제(예컨대, 옥타데실다이메틸벤질 암모늄 클로라이드, 헥사메토늄 클로라이드, 벤즈알코늄 클로라이드, 벤즈에토늄 클로라이드, 페놀, 부틸 또는 벤질 알코올, 알킬 파라벤, 예컨대, 메틸 또는 프로필 파라벤, 카테콜, 레소르시놀, 사이클로헥산올, 3-펜탄올 및 m-크레졸); 저분자량(약 10개 미만의 잔기를 갖는) 폴리펩티드; 단백질, 예컨대, 혈청 알부민, 젤라틴 또는 면역글로불린; 친수성 중합체, 예컨대, 폴리비닐피롤리돈; 아미노산, 예컨대, 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌 또는 라이신; 모노사카라이드, 다이사카라이드 및 다른 탄수화물(글루코스, 만노스 또는 덱스트린을 포함함); 킬레이팅제, 예컨대, EDTA; 당, 예컨대, 수크로스, 만니톨, 트레할로스 또는 소르비톨; 염 형성 반대이온, 예컨대, 나트륨; 금속 착물(예를 들면, Zn-단백질 착물); 및/또는 비-이온성 계면활성제, 예컨대, TWEENTM, PLURONICSTM 또는 폴리에틸렌 글리콜(PEG)을 포함한다.
인간 IL-15의 약학 조성물은 그의 약학 성질에 의해 좌우된다. 이러한 조성물은 어푸코실화된 항체에 대해 전술된 조성물과 유사할 수 있다.
본 발명의 한 추가 실시양태에서, 본 발명에 따른 약학 조성물은 바람직하게는 상기 어푸코실화된 항체 및 인간 IL-15에 대한 2개의 별도 제형이다.
활성 성분은 예를 들면, 코아세르베이션 기법 또는 계면 중합에 의해 제조된 미세캡슐, 예를 들면, 콜로이드성 약물 전달 시스템(예를 들면, 리포좀, 알부민 마이크로스피어, 마이크로에멀젼, 나노입자 및 나노캡슐) 또는 마크로에멀젼 중의 하이드록시메틸셀룰로스 또는 젤라틴-마이크로캡슐 및 폴리-(메틸메타크릴레이트) 마이크로캡슐 내에 포획될 수도 있다. 이러한 기법들은 문헌(Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980))에 개시되어 있다.
지속 방출 제제가 제조될 수 있다. 지속 방출 제제의 적합한 예에는 항체를 함유하는 고체 소수성 중합체의 반투과성 매트릭스가 포함되고, 상기 매트릭스는 성형된 제품, 예를 들면, 필름 또는 마이크로캡슐의 형태로 존재한다. 지속 방출 매트릭스의 예에는 폴리에스터 하이드로겔(예를 들면, 폴리(2-하이드록시에틸-메타크릴레이트), 또는 폴리(비닐알코올), 폴리락타이드(미국 특허 제3,773,919호), L-글루탐산과 감마-에틸-L-글루타메이트의 공중합체, 비-분해성 에틸렌-비닐 아세테이트, 분해성 락트산-글리콜산 공중합체, 예컨대, LUPRON DEPOTTM(락트산-글리콜산 공중합체 및 류프롤라이드 아세테이트로 구성된 주사가능한 마이크로스피어), 및 폴리-D-(-)-3-하이드록시부티르산이 포함된다.
생체내 투여를 위해 사용될 제형은 멸균되어야 한다. 이것은 멸균 여과 막을 통한 여과에 의해 용이하게 달성된다.
본 발명은 (i) 60% 이하의 양으로 푸코스를 갖는 제1 유효량의 어푸코실화된 항체(바람직하게는 어푸코실화된 항-CD20 항체), 및 (ii) 제2 유효량의 인간 IL-15를 암의 치료가 필요한 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, 암을 치료하는 방법을 추가로 제공한다.
한 실시양태에서, 상기 방법은 어푸코실화된 항체가 증가된 ADCC를 나타내는 것을 특징으로 한다.
한 실시양태에서, 상기 방법은 상기 어푸코실화된 항체가 항-CD20 항체이고 상기 암이 CD20 발현 암인 것을 특징으로 한다.
한 실시양태에서, 상기 방법은 상기 어푸코실화된 항-CD20 항체가 인간화된 B-Ly1 항체인 것을 특징으로 한다.
한 실시양태에서, 상기 방법은 상기 어푸코실화된 항-CD20 항체가 오비누투주맙인 것을 특징으로 한다.
한 실시양태에서, 상기 방법은 상기 암이 단핵세포/주변세포-침윤된 암인 것을 특징으로 한다.
한 실시양태에서, 상기 방법은 사이토카인으로서 IL-15만이 상기 병용치료에서 공-투여된다는 것을 특징으로 한다.
한 실시양태에서, 상기 방법은 하나 이상의 추가 다른 세포독성, 화학치료 또는 항암 약제, 또는 이러한 약제들의 효과를 향상시키는 화합물 또는 이온화 방사선이 투여되는 것을 특징으로 한다.
본원에서 사용될 때 용어 "환자"는 바람직하게는 임의의 목적으로 어푸코실화된 항체, 바람직하게는 어푸코실화된 항-CD20 항체를 사용한 치료가 필요한 인간(예를 들면, CD20 발현 암을 앓고 있는 환자), 보다 바람직하게는 암, 또는 전구암성 병태 또는 병변을 치료하기 위해 이러한 치료가 필요한 인간을 지칭한다. 그러나, 용어 "환자"는 비-인간 동물, 바람직하게는 포유동물, 예컨대, 개, 고양이, 말, 소, 돼지, 양 및 비-인간 영장류를 지칭할 수도 있다.
본 발명은 암의 치료를 위한, 인간 IL-15와 병용되는 어푸코실화된 항체, 바람직하게는 어푸코실화된 항-CD20 항체를 추가로 포함한다.
본 발명은 암의 치료를 위한, 60% 이하의 양으로 푸코스를 가지면서 종양 항원(CD20)에 특이적으로 결합하는 어푸코실화된 항체 및 인간 IL-15를 추가로 포함한다.
한 실시양태에서, 상기 암은 단핵세포/주변세포-침윤된 암이다.
한 실시양태에서, 어푸코실화된 항체는 증가된 ADCC를 보인다.
한 실시양태에서, 상기 어푸코실화된 항체는 항-CD20 항체이고, 상기 암은 CD20 발현 암이다.
한 실시양태에서, 상기 어푸코실화된 항-CD20 항체는 인간화된 B-Ly1 항체이다.
한 실시양태에서, 어푸코실화된 항체(바람직하게는 어푸코실화된 항-CD20 항체)는 IL-15와 병용된다.
바람직하게는, CD20 발현 암은 B 세포 비-호지킨 림프종(NHL)이다. 보다 바람직하게는, CD20 발현 암은 만성 림프구성 백혈병(CLL)이다.
하기 실시예 및 도면은 본 발명의 이해를 돕기 위해 제공되고, 본 발명의 진정한 범위는 첨부된 특허청구범위에 기재되어 있다. 본 발명의 기술적 사상을 벗어나지 않으면서 기재된 절차를 변경할 수 있다는 것이 이해된다.
서열목록
서열번호 1: 뮤린 단일클론 항-CD20 항체 B-Ly1의 중쇄의 가변 영역(VH)의 아미노산 서열
서열번호 2: 뮤린 단일클론 항-CD20 항체 B-Ly1의 경쇄의 가변 영역(VL)의 아미노산 서열
서열번호 3 내지 19: 인간화된 B-Ly1 항체(B-HH2 내지 B-HH9, B-HL8, 및 B-HL10 내지 B-HL17)의 중쇄의 가변 영역(VH)의 아미노산 서열
서열번호 20: 인간화된 B-Ly1 항체 B-KV1의 경쇄의 가변 영역(VL)의 아미노산 서열.
실험 절차
재료 및 방법
세포 및 시약
비-치료된 CLL 환자(n=34, 표 1)로부터 말초 혈액 샘플을 HIMIP 실험실에서 참조된 사전 동의를 받고 수득하였다. 프랑스 법률에 따라, HIMIP는 고등교육연구부에 의해 공표되었고(DC 2008-307 수집 1) 윤리위원회(Comite de Protection des Personnes Sud-Ouest et Outremer II)에 의한 승인 후 전달 동의서(AC 2008-129)를 입수하였다. 샘플의 임상적 및 생물학적 주해는 CNIL(Comite National Informatique et Libertes: 데이터 처리 및 자유 국립위원회)에 의해 공표되었다. 피콜 구배 원심분리에 의한 분리 후, 말초 혈액 단핵세포(PBMC)를 즉시 사용하였다.
제조자의 설명서(스템셀 테크놀로지스(Stemcell Technologies), 프랑스 그레노블 소재)에 따라 이지셉(EasySep)® 인간 B 세포 농축 키트를 사용하여 CD43 고갈 없이 B 백혈병 세포를 자기 분리로 정제하였다. 건강한 공여자의 NK 세포를 (에타블리세먼트 프랑카이스 듀 상(Etablissement Francais du Sang)(프랑스 토울로우스 소재)으로부터 입수된) 신선한 버피 코트로부터 단리하였고, 이지셉® 인간 NK 세포 농축 키트(스템셀 테크놀로지스, 프랑스 그레노블 소재)를 사용하여 정제하였다. B 백혈병 세포 또는 NK 세포의 순도를 유세포측정으로 평가하였고 이 순도는 90% 내지 98%이었다.
제조자의 설명서(스템셀 테크놀로지스, 프랑스 그레노블 소재)에 따라 로셋트셉(RosetteSep)® 인간 단핵세포 고갈 칵테일(CD36) 및 로셋트셉® 인간 CD3 고갈 칵테일 각각을 사용하여 단핵세포 및 T 림프구를 전혈 샘플로부터 고갈시켰다. 단핵세포 및 T 림프구의 고갈을 유세포측정으로 평가하였고, 잔존 세포의 수준은 0.1% 미만이었다.
RTX 및 GA101 단일클론 항체, 및 RTX F(ab')2 및 GA101 F(ab')2 단편은 로슈 파마(Roche Pharma)(스위스 바젤 소재)에 의해 제공되었다. 재조합 인간 IL-15를 펩프로텍(Peprotech)(테부-바이오, 프랑스 르 페라이-엔-이벨린 소재)으로부터 구입하여 종래 연구11,26,27에서 사용된 바와 같이 10 ng/㎖의 최종 농도로 사용하였다.
모든 실험을 위해, 세포를 10% 열-불활성화된 태아 소혈청(FCS), 2 mM L-글루타민, 100 U/㎖ 페니실린 및 100 ㎍/㎖ 스트렙토마이신(인비트로겐(Invitrogen), 프랑스 세르기 퐁또이스 소재)으로 보충된 RPMI에서 37℃ 및 5% CO2에서 배양하였다. 장기간 생존력을 제공하기 위해, CLL 배양을 높은 세포 밀도(10 x 106개 세포/㎖)에서 수행하였다.
유세포측정
세포 염색을 위해 사용된 단일클론 항체는 다음과 같았다: FITC-항-CD3, 파시픽(Pacific) 블루-항-CD3 및 PE-Cy-7-항-CD5(이바이오사이언스(eBioscience), 프랑스 파리 소재); 바이오레전드(BioLegend)로부터 입수된 파시픽 블루-항-CD19 및 PE-Cy-7-항-CD16(오자임(Ozyme), 프랑스 세인트-쿠엥틴-엔-이벨린 소재); PE-항-CD69 및 PE-Cy7-항-CD56(벡만-코울터(Beckman-Coulter), 프랑스 로이시 소재); 및 이소타입-매칭된 대조군 접합체. 요약하건대, 1% FCS를 함유하는 냉각된 PBS를 사용하여 PBMC 또는 정제된 세포를 세척하고 얼음 상에서 적절한 접합된 항체로 30분 동안 염색한 후, 세척하고 BD LSR II 세포측정기(비디 바이오사이언시스(BD Biosciences), 프랑스 퐁 드 클라이 소재) 및 DIVA 소프트웨어를 이용하여 분석하였다.
CLL 샘플로부터의 NK 세포 활성화 분석
비-치료된 CLL 환자의 즉석 단리된 PBMC를 배양 배지에 10 x 106개 세포/㎖의 밀도로 시딩하고 비-치료된 상태로 방치하였거나 RTX(10 ㎍/㎖) 또는 GA101(10 ㎍/㎖)로 7일 동안 처리하였다. 적절한 경우, 재조합 인간 IL-15를 10 ng/㎖의 최종 농도로 첨가하였다. NK 세포의 활성화를, CD3-/CD56+ 게이팅된 세포 상에서의 CD69 발현을 검출하는 유세포측정으로 평가하였다.
NK 세포 증식 분석
CLL 환자의 즉석 단리된 PBMC 및 건강한 공여자의 정제된 NK 세포(5 x 106개 세포/㎖)를 제조자의 설명서에 따라 37℃에서 1 μM CFSE(카복시플루오레세인 다이아세테이트 석신이미딜 에스터)(인비트로겐/몰레큘라 프로브스, 미국 캘리포니아주 칼스바드 소재)로 10분 동안 표지하고 PBS로 세척하였다. 그 다음, 표지된 세포를 RTX(10 ㎍/㎖) 또는 GA101(10 ㎍/㎖), 및/또는 10 ng/㎖ IL-15를 갖거나 갖지 않는 완전 배지에서 7일 동안 배양하였다. 일부 실험을 위해, 건강한 공여자의 CFSE-표지된 정제된 NK 세포를 RTX(10 ㎍/㎖) 또는 GA101(10 ㎍/㎖)로 보충되거나 보충되지 않은 100% B 백혈병 세포 상청액에서 항온처리하였다. 모든 실험에서, CFSE 희석을 유세포측정으로 CD3-/CD56+ 게이팅된 세포에 대해 분석하였다.
CLL 상청액의 제조
정제된 B 백혈병 세포를 배양 배지에서 10 x 106개 세포/㎖로 시딩하고 IL-15(10 ng/㎖)와 함께 또는 IL-15 없이 항온처리하였다. 7일 후, 세포를 원심분리하였다. 상청액을 여과하고 즉시 사용하였거나 -80℃에서 저장하였다.
CLL 샘플로부터의 시험관내 B 백혈병 세포 고갈 분석
비-치료된 CLL 환자의 즉석 단리된 PBMC를 배양 배지에 10 x 106개 세포/㎖의 밀도로 시딩하고 비-치료된 상태로 방치하였거나 RTX(10 ㎍/㎖) 또는 GA101(10 ㎍/㎖)로 7일 동안 처리하였다. 적절한 경우, IL-15를 10 ng/㎖의 최종 농도로 첨가하였다. B 백혈병 세포 고갈은 유세포측정에 의해 측정된 생존 CD19+/CD5+ 림프구의 백분율을 곱한 (트립판 블루 배제에 의한) 총 생존 세포 수 측정치에 근거하였고 다음과 같이 계산되었다:
생존 세포의 CD19+/CD5+ 절대 수: 생존 세포 수 측정치 x % CD19+/CD5+
CD19+/CD5+ 생존 세포의 % = 100 x (처리된 샘플에서의 절대 수/비-처리된 샘플에서의 절대 수).
자가 크로뮴-방출 세포독성 분석
고전적인 크로뮴 방출 분석을 이용하여 4명의 무작위 CLL 환자들의 이펙터 세포의 천연 세포독성을 시험하였다. 요약하건대, 주문제작 로셋트셉® 인간 NK 세포 농축 키트(#R17523, 스템셀 테크놀로지스, 프랑스 그레노블 소재)를 사용하여 PBL 샘플로부터 NK 세포를 정제하고 IL-15(10 ng/㎖)로 자극하였거나 자극하지 않았다. 자가 B 백혈병 세포(표적 세포)를 37℃에서 51Cr(나트륨 크로메이트, 퍼킨 엘머, 프랑스 코우르타보에프 소재)(106개 세포 당 100 μCi)과 함께 RPMI 1% FCS에서 1시간 동안 항온처리하였다. 그 다음, 세포를 세척하고 환저 96웰 플레이트에 104개 세포/웰의 밀도로 플레이팅하였다. 증가하는 양의 이펙터 세포를 0.01/1 내지 0.8/1의 NK/표적 비로 삼중 웰에 첨가하였다. 대조군 웰들은 자발적 방출을 측정하기 위해 표적 세포만을 함유하였거나 최대 방출을 측정하기 위해 0.1% 트리톤 X-100과 함께 표적 세포를 함유하였다. 원심분리 후, 플레이트를 37℃ 및 5% CO2에서 4시간 동안 항온처리하였다. 그 다음, 50 ㎕를 각각의 웰로부터 모아 감마-카운터에서 카운팅하였다. 특이적 용해의 백분율을 다음과 같이 계산하였다: ((샘플 방출 - 자발적 방출)/(최대 방출 - 자발적 방출)) x 100.
B 백혈병 세포 상에서의 CD20 발현의 정량
비디 콴티브라이트(BD QuantiBRITE) 형광 분석(비디 바이오사이언시스, 프랑스 르 퐁 드 클라이 소재)을 이용하여 유세포측정으로 CD19+/CD5+ 게이팅된 세포 상에서의 CD20 발현을 정량하였다. 세포 당 결합된 항체(ABC) 값은 항-CD20 항체에 결합하는 각각의 세포의 최대 성능의 평균 값을 표시하고 제조자의 설명서에 따라 평가되었다.
통계학
적절한 경우 대응표본 또는 비-대응표본 스튜던트 t-검정을 이용하여 샘플들 사이의 차이를 확인하였다. 0.05 미만의 P 값은 통계적으로 유의한 것으로서 간주되었다.
결과
CLL 샘플에서 단일클론 항체 및 IL-15에 의해 유도된 NK 활성화
CD69 발현을 세포 표면 활성화 마커로서 사용하여 NK 활성화를 무작위 CLL 샘플(n=26)에서 평가하였다(도 1). CD69는 그의 발현이 배양 동안 유지된 초기 활성화 마커이다(데이터는 제시되어 있지 않음). 비-처리된 샘플에서, 7일의 배양 후에만 NK 활성화를 관찰하였다. RTX 또는 GA101과의 항온처리는 비-처리된 세포(평균: 35.75%)와 비교될 때 활성화된 NK 세포의 증가를 유발하였다(총 NK 세포들 중 CD69+ 세포의 %는 RTX 및 GA101에 대해 각각 65.25% 및 72.25%의 평균을 가졌다). 이 현상이 RTX보다 GA101을 사용하였을 때 유의하게 더 높았다(p<0.01)는 것은 주목할 만하다. F(ab')2 단편을 사용하였을 때 유의한 활성화가 관찰되지 않았기 때문에(데이터는 제시되어 있지 않음) 관찰된 NK 세포 활성화는 단일클론 항체의 Fc 부분에 의해 좌우되었고, 이것은 (항체-Fc 단편과 그의 수용체의 결합을 통한) CD16 신호전달의 중요성을 강조한다. IL-15의 첨가는 RTX 또는 GA101(평균: 각각 96.75% 및 95.75%)에 의해 유도된 상승작용적 또는 가산적 효과 없이 모든 NK 세포의 활성화(평균: 95.25%)를 이끌어내었다.
CLL 샘플에서 단일클론 항체 및 IL-15에 의해 유도된 NK 증식
NK 세포 증식에 대한 IL-15 및 단일클론 항체의 병용 효과를 7일간의 CLL 배양에서 평가하였다. 결과는 RTX-처리된 샘플보다 GA101-처리된 샘플에서 증식 NK 세포의 유의하게 더 높은 비율과 함께, RTX 및 GA101 단독에 의해 유도되었고 CFSE 희석에 의해 특징규명된 게이팅된 CD3-/CD56+ 세포의 증식을 보여준다(증식 NK 세포의 평균 %: 각각 31.75% 대 14.75%)(도 2). NK 활성화의 경우 관찰된 바와 같이, 이들 결과들은 NK 세포 증식에 있어서 CD16 신호전달의 중요성을 확인시켜준다. 또한, IL-15 처리는 NK 세포의 강한 증식을 유도하였다(평균: 42.25%). 중요하게는, 이 현상은 IL-15/RTX에 비해 IL-15/GA101에 의해 유도된 보다 강한 NK 증식과 함께, IL-15 + 단일클론 항체의 병용 시 유의하게 더 높았다(평균: 각각 67.25% 대 53.75%; p<0.001). 이 효과는 IL-15와 함께 항온처리된 NK 세포에서의 CD16 발현의 증가에 기인하지 않았다(IL-15와 함께 항온처리된 샘플에서의 CD16 발현의 평균 형광 강도는 배지 단독에서 5481 ± 3395 대 6491 ± 2644이었음; p=0.102). 이들 데이터는 IL-15 및 CD16 신호전달의 협력이 NK 세포 증식에 있어서 중요하다는 가설을 뒷받침한다.
IL-15 및 단일클론 항체에 의해 유도된 정제된 NK 세포의 증식 부재
CLL 세포는 측분비 또는 자가분비 활성을 갖는 가용성 인자들을 방출시키는 능력을 가지므로 면역 이펙터 기능을 조절할 수 있다14. B-CLL-방출된 가용성 인자가 NK 증식에 영향을 미칠 수 있는지를 평가하기 위해, 건강한 공여자의 정제된 NK 세포를 단일클론 항체와 함께 또는 단일클론 항체 없이 적절한 배지 또는 IL-15-자극된 CLL 세포 상청액에서 7일 동안 배양하였다. 7일 동안 고밀도로의 배양은 배지 영양분을 감소시킬 수 있고 세포 생존력에 영향을 미칠 수 있다. 본 발명자들의 실험에서, 배지 또는 B-CLL 상청액에서 배양된 NK 생존 세포의 절대 수는 두 조건 하에서 동일하다(p=0.45). 도 3에 나타낸 바와 같이, NK 증식의 부재가 단일클론 항체와 함께 또는 단일클론 항체 없이 배양 배지 단독 또는 IL-15의 존재 하에서 관찰되었다. 비-처리된 또는 IL-15-자극된 정제된 B 백혈병 세포의 B-CLL 상청액의 첨가는 단일클론 항체의 존재 또는 부재 하에서 우수한 NK 증식을 유도하지 못하였는데, 이것은 B-CLL 가용성 인자가 NK 증식에 관여하지 않는다는 것을 암시하고 이 과정에 대한 세포-세포 상호작용의 가설을 뒷받침한다.
단일클론 항체에 의한 CLL 세포-유도된 NK 증식에 의한 IL-15 트랜스-제시
전술된 바와 같이, IL-15 작용의 우세한 기작은 보조 세포, 예컨대, 단핵세포에 의한 트랜스-제시이다. B 세포 축적으로 인해 CLL 샘플 중의 단핵세포의 수가 상대적으로 낮음에도 불구하고(표 1), 본 발명자들은 IL-15Rα-양성 세포의 성공적인 고갈을 이용하여 NK 증식에 있어서 IL-15 트랜스-제시의 기여를 조사하였다. 결과는 총 샘플에 비해 NK 증식이 단핵세포-고갈된 CLL 샘플 및 단핵세포/CD3+-고갈된 CLL 샘플 둘다에서 변화되지 않았다는 것(각각 p=0.602 및 p=0.775)을 보여준다(도 4). 이들 데이터는 B 백혈병 세포와 NK 세포 사이의 상호작용이 IL-15의 존재 하에서 NK 증식을 자극하는 데에 중요하다는 가설을 확인시켜준다. 단일클론 항체의 존재 하에서 관찰된 개선된 증식은 CD20 인식을 통한 B 세포와 NK 세포 사이의 보다 강한 상호작용에 기인할 수 있다. IL-15가 B 백혈병 세포 상에서의 CD20 발현을 조절하지 못하였다는 것은 주목할 만하다(p=0.36). 종합하건대, 이들 결과는 B 백혈병 세포가 IL-15를 NK 세포에 트랜스-제시하기 위한 보조 세포로서 작용한다는 것을 강력히 입증한다.
B 백혈병 세포 고갈에서 IL-15 및 단일클론 항체의 공-활성
IL-15-자극된 NK 세포의 기능적 관련성을 비-치료된 환자의 CLL 샘플에서 B 백혈병 세포 고갈 분석으로 평가하였다(n=34, 표 1). B 세포가 저밀도에서 자발적으로 사멸하기 때문에13,29, B 세포 배양을 높은 세포 밀도(10 x 106개 세포/㎖)로 수행하여 긴 생존을 제공하였다. 이 높은 세포 농도에서, 자발적 CLL 사멸은 7일 후 34%를 초과하지 않았다. 놀랍게도, 결과는 먼저 IL-15 단독이 약간의 B 세포 고갈을 유도하였다는 것을 보여준다(도 5A). 따라서, 본 발명자들은 자가 B 백혈병 세포에 대한 NK 세포독성 기능에 대한 IL-15 자극의 효과를 시험하였다. 0.02/1 NK/B 비((B-CLL 샘플에서 관찰된 NK/B 비와 관련됨, 표 1)에서 IL-15는 NK 세포의 천연 세포독성을 증가시킬 수 있었다(특이적 세포독성의 %: NK 세포의 경우 0.03 ± 0.1%; IL-15-자극된 NK 세포의 경우 8.9 ± 1.9%; p=0.004).
PBMC 전체 샘플에서, GA101은 CD19+/CD5+ 세포 고갈의 관점에서 RTX보다 더 큰 세포독성 활성을 나타내었다(생존 B 백혈병 세포의 평균 각각 39.9% 대 79.5%; p<0.0001)(도 5A). 이 관찰된 B 세포 고갈은 F(ab')2 단편을 사용하였을 때 유의한 고갈이 없다는 것이 관찰되었기 때문에(도 6) 단일클론 항체의 Fc 부분에 의해 좌우되었고, 배양 조건 때문에 CDC와는 관련되어 있지 않았다. 가장 중요하게는, RTX 매개 또는 GA101 매개 B 세포 고갈은 IL-15의 존재 하에서 유의하게 증가하였다(생존 B 백혈병 세포의 평균: RTX 79.5% 대 RTX/IL-15 50.4%, p<0.0001; GA101 39.9% 대 GA101/IL-15 17.8%, p<0.0006)(도 5A). 이들 관찰결과는 CLL 샘플 중의 RTX 매개 또는 GA101 매개 백혈병 세포 고갈에 있어서 IL-15와 CD16 활성화의 협력 역할을 암시하고, 이 과정에서 IL-15/GA101의 병용의 보다 큰 효능을 강조한다.
B 백혈병 세포의 고갈이 엄격히 NK에 의해 좌우되었는지를 확인하기 위해, 단핵세포 및 T 림프구를 CLL 샘플로부터 연속적으로 제거하였다. 결과는 단핵세포의 제거뿐만 아니라 단핵세포/T 림프구 둘다의 제거도 IL-15의 존재 또는 부재 하에서 RTX 또는 GA101에 의해 유도된 B 세포 고갈에 영향을 미치지 않는다는 것을 보여준다(총 샘플에 비해, 단핵세포-고갈된 샘플의 경우 p>0.51; 단핵세포/T 림프구-고갈된 샘플의 경우 p>0.59)(도 5B).
종합하건대, 이들 데이터는 천연 자가 세포독성 및 ADCC 둘다의 증가를 이끌어내는, CLL에서의 NK 세포에 대한 IL-15의 강한 효과를 강조한다.
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Claims (9)

  1. 인간 IL-15와 병용으로 암을 치료하기 위한 항-CD20 항체.
  2. 제1항에 있어서,
    CD20 항체가 60% 이하의 양으로 푸코스를 갖는 어푸코실화(afucosylating)된 항체이고 암이 CD20 발현 암인 것을 특징으로 하는 항-CD20 항체.
  3. 제2항에 있어서,
    항-CD20 항체가 인간화된 B-Ly1 항체인 것을 특징으로 하는 항-CD20 항체.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    항-CD20 항체가 오비누투주맙(obinutuzumab)인 것을 특징으로 하는 항-CD20 항체.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
    암이 백혈병인 것을 특징으로 하는 항-CD20 항체.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
    암이 만성 림프구성 백혈병인 것을 특징으로 하는 항-CD20 항체.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
    항-CD20 항체가 증가된 항체-의존적 세포-매개 세포독성(ADCC)을 나타내는 어푸코실화된 항체인 것을 특징으로 하는 항-CD20 항체.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
    하나 이상의 추가적인 다른 세포독성, 화학치료 또는 항암 약제, 또는 이러한 약제들의 효과를 향상시키는 화합물 또는 이온화 방사선이 투여되는 것을 특징으로 하는 항-CD20 항체.
  9. (i) 제1 유효량의 항-CD20 항체; 및 (ii) 제2 유효량의 인간 IL-15를 암의 치료가 필요한 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, 암을 치료하는 방법.
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