KR20140075986A

KR20140075986A - 다목적 고스트 살모넬라 백신 및 이를 이용한 동물 면역반응 유도방법

Info

Publication number: KR20140075986A
Application number: KR1020120143928A
Authority: KR
Inventors: 김삼웅; 김세원; 노정만; 이존화; 갈상완
Original assignee: 경남과학기술대학교 산학협력단; 노정만
Priority date: 2012-12-11
Filing date: 2012-12-11
Publication date: 2014-06-20
Also published as: KR101478202B1

Abstract

본 발명은 다목적 고스트 살모넬라 백신 및 이를 이용한 동물 면역반응 유도방법에 관한 것으로서, 보다 구체적으로는, 다목적 고스트 살모넬라 백신 및 이를 이용하여 동물의 면역반응을 유도하는 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 다목적 고스트 백신을 이용하면, 다양한 연령의 돼지에 발생하는 대장균증과 살모넬라균증을 안전하고 효과적으로 방어할 수 있고, 사람으로의 교차감염을 미연에 방지할 수 있는 효과가 있다.

Description

다목적 고스트 살모넬라 백신 및 이를 이용한 동물 면역반응 유도방법{Ghost Salmonella Vaccine and Method for inducing immune response using the same}

본 발명은 다목적 고스트 살모넬라 백신 및 이를 이용한 동물 면역반응 유도방법에 관한 것으로서, 보다 구체적으로는, 다목적 고스트 살모넬라 백신 및 이를 이용하여 동물의 면역반응을 유도하는 방법에 관한 것이다.

수의 백신은 현재 동물의 건강증진 제품군 시장에서 약 23%를 점유하고 있지만, 병원성 세균의 저항성 확대, 새로운 질병균의 등장 및 신기술의 개발로 인해 그 시장성이 점차 증가하고 있다. 사람 백신개발에 비교하여 수의 백신 개발에 있어서 불리한 점은 낮은 판매 가격과 상대적으로 작은 시장 규모 등이다. 수의 백신의 장점은 상대적으로 제제가 덜 엄격하고, 전임상 단계에서도 출시가 가능하므로 개발 비용이 적고 단기간 내 출시가 가능하다는 점이며, 또한 새로운 질병에 빠르게 대응할 수 있다는 점이다.

기존의 세균을 이용하는 백신은 대부분 사균이나 약독화 생백신(live attenuated vaccine)이 주류를 이루고 있다. 그러나 약독화 생백신에 대한 안정성의 문제와 병원성 세균에 대한 혐오성에 기인하여 산업화된 제품의 주류를 이루고 있는 것은 사균 백신이다. 사균 백신은 포르말린으로 처리되었거나 열처리 등 화학적 방법이나 물리적 방법에 의해 유도되는 것이 일반적이다. 이와 같은 처리는 면역능력 형성에 주요한 요인으로 작용하는 세포 외부 단백질이나 기타 물질의 누락이나 변질을 초래한다. 변질된 단백질이나 기타 물질들의 누락 또는 변질은 자연적인 면역반응의 유도를 감소시키고, 이와 같은 현상은 전체적인 백신의 효능을 저하시키는 원인이 된다. 일반적인 사균 백신의 효능 저하의 원인을 보완하기 위한 연구 및 개발의 주축이 되는 분야는 고스트 백신이나 약독화 생백신이다. 이들 백신은 자연적인 세포 외부 항원들을 그대로 유지하기 때문에 면역능력의 형성이 뛰어나고 백신의 효능도 우수한 것으로 알려져 있다.

세계인구의 지속적인 증가와 생활수준의 향상으로 전 세계적으로 식량수요가 늘어날 전망이지만 우리나라의 식량 자급률은 54.9%이고 곡물자급률 26.7%로 매우 저조한 편이다(농림수산식품부, 2011 보도자료). 우리나라 축산물은 전체 농업생산액 중 30%를 차지할 만큼 중요한 필수 식량공급원이지만 WTO 및 FTA로 인해 세계시장의 도전을 받고 있고, 원유가격 및 사료 원료의 상승으로 인해 축산물의 생산비가 턱없이 높아져 다른 나라와 가격 경쟁이 되지 않고 있다(한국농촌경제연구원, 2008). 현재 양돈 산업은 2006년 말부터 시작된 국제 사료원료 가격의 상승, FTA의 발효로 수입개방에 의한 경쟁력 하락, 분뇨의 처리와 악취 문제, 다양한 기후 변화성 질병의 만연과 돼지의 폐사율 상승 등 많은 문제로 인해 어려운 실정이다. 국내 양돈 농가에서 이유 전과 후의 자돈의 평균 폐사율은 9.7%과 15%이고(2010년도 기준) 생산성 저하의 주요 원인이 되고 있다(대한 양돈협회, 2010).

가축의 사육에 있어서 효과적인 공간 활용을 위해 현재 시행되고 있는 밀사는 가축에게 스트레스의 유발에 기인하는 면역력의 저하, 병원성 세균의 손쉬운 감염을 유발할 수 있다. 이와 같은 환경은 약병원성 세균들이 감염을 유발하기에 적합한 환경을 유도할 수 있다. 병원성 세균에 대한 감염방지 또는 감염은 항생제에 의해 효과적인 치료가 가능하지만, 과거 항생제 남용으로 인한 문제점으로 항생제 저항성 균주가 만연하는 현상이 나타나고 있다. 현재는 치료용 목적 이외에 가축의 성장 향상을 위해 사용되는 항생제의 사용이 금지되어 있다. 현재와 같은 가축의 사육 시설에서 질병을 예방하기 위해서 다양한 생균제나 생약제의 연구가 시도되고 있으며, 상업화된 제품들도 매우 많다.

또 다른 한편으로 특정 병원성 미생물에 대한 예방을 위해 사용할 수 있는 것은 백신이다. 백신은 예방이 가능한 질병의 90%까지 발병률을 줄일 수 있는 비용 대비 효과가 가장 큰 의약품으로서 인수공통 전염병원체의 전파에 반드시 고려되어야할 분야이다. 인수공통 전염병원체에 의하여 나타나는 질병은 예고 없이 나타나며 그 피해는 예측이 불가능할 정도로 크다. 따라서 지속적인 전파 경로와 대규모 발생(outbreak)를 예측할 수 있는 역학조사 및 유전체 확보 등의 시스템 확보가 요구되며, 이와 더불어 병원체 감염에 대한 백신 개발이 요구된다. 특히 백신을 이용한 예방 접종은 특정 병원체의 출현을 막고 궁극적으로 이 세상에서 병원체를 근절시킬 수 있는 유일한 방법으로 여겨진다. 예로써 에드워드 제너로부터 시작된 두창(smallpox)에 대한 예방 접종은 범세계적으로 능동적으로 시행되어 결국 두창은 근절되었다. 또 다른 예로서 WHO(세계보건기구)에 의하면 글로벌 백신접종(global vaccination)에 의하여 전 세계 소아마비 환자수가 1988년에 350,000명 이상에서 2001년 500명 수준까지 떨어졌으며, 가까운 미래에는 소아마비가 근절될 것으로 예측하고 있다.

대한민국등록특허 10-0765357 미국등록특허 US 6,610,529

이러한 기술적 배경하에서, 본 발명자들은 예의 노력한 결과 본 발명을 완성하기에 이르렀다.

본 발명의 목적은 다목적 고스트 살모넬라 유도용 재조합벡터를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 재조합벡터로 형질전환된 살모넬라를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 살모넬라를 특정 조건에서 배양하여 수득되는 것을 특징으로 하는 고스트 살모넬라의 제조방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 고스트 살모넬라를 유효량 함유하는 세균성 소화기 질환 예방용 백신을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 백신을 이용한 동물의 면역반응 유도방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 일 측면에 따르면, 하기 유전자를 포함하는 재조합벡터가 제공될 수 있다.

1) lysis E 유전자;

2) 상기 lysis E 유전자의 업스트림에 연결된 λPR 프로모터(promoter)/cI857 리프레서(repressor);

3) 상기 lysis E 유전자의 안티센스 RNA를 생성하도록 상기 lysis E 유전자의 다운스트림에 결합된 ParaBAD 프로모터 및 araC 유전자;

4) 상기 1)~3)과는 독립적으로 발현되는 asd(aspartate semialdehyde dehydrogenase) 유전자; 및

5) 형질전환된 세포의 외부에 항원을 표지할 수 있도록 TMD(transmembrane domain)와 연결된, FedA, FedF, F41 및 인티민(intimin)으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 외부항원을 더 포함하는 재조합벡터.

본 발명의 일 측면에 따르면, 상기 재조합벡터로 형질전환된 asd 결실(asd^-) 미생물이 제공될 수 있다.

본 발명의 일 측면에 따르면, 상기 재조합벡터로 형질전환된 asd 결실(asd^-) 살모넬라(Salmonella)가 제공될 수 있다.

본 발명의 일 측면에 따르면, 다음 단계를 포함하는 고스트(ghost) 살모넬라의 제조방법이 제공될 수 있다.

(a) 제2항의 살모넬라를 아라비노즈를 함유하는 배지에서 25~30℃ 조건으로 배양하는 단계;

(b) 상기 배양액의 세포밀도(OD600)가 0.2~0.4에 도달하면 아라비노즈를 함유하지 않는 배지에서 40~43℃의 온도에서 추가로 배양하는 단계; 및

(c) 상기 배양액의 세포밀도 감소가 중지되었을 때 상기 살모넬라를 수득하는 단계.

본 발명의 일 측면에 따르면, 상기 고스트 살모넬라를 유효량 함유하는 세균성 소화기 질환 예방용 백신이 제공될 수 있다.

본 발명의 일 측면에 따르면, 상기 백신을 동물의 경구 또는 근육내에 투여하는 것을 특징으로 하는 마우스의 면역반응 유도방법이 제공될 수 있다.

일 실시예에 따르면, 상기 동물은 설치류일 수 있다.

일 실시예에 따르면, 상기 동물은 포유류일 수 있다.

일 실시예에 따르면, 상기 포유류는 돼지일 수 있다.

일 실시예에 따르면, 상기 백신을 모돈에 1회 이상 투여하고, 그 모돈으로부터 생산된 자돈에 1회 이상 투여하는 것을 특징으로 하는 돼지의 면역반응 유도방법이 제공될 수 있다.

본 발명에 따른 다목적 고스트 백신을 이용하면, 다양한 연령의 돼지에서 발생하는 대장균증과 살모넬라균증을 안전하고 효과적으로 방어할 수 있고, 사람으로의 교차감염을 미연에 방지할 수 있는 효과가 있다.

도 1은 자돈의 설사를 유발하는 병원성 대장균의 부착요소 및 외막 단백질을 무항생제 마크 고스트 카세트를 운반하는 pMMP184에 클로닝하여 발현을 분석한 결과이다.
도 2 내지 도 6은 다목적 백신으로서의 기능을 분석하기 위해 BALB/c의 근육 내로 고스트 백신을 투여한 후 살모넬라에 대한 면역응답을 ELISA을 통해 분석한 결과로서, 혈청 중의 총 IgG (도 2), IgG1 (도 3), IgG2a (도 4)의 분석과 분변 중의 분비 IgA (도 5) 및 질 분비액 중의 분비 IgA (도 6) 등을 분석한 결과이다.
도 7 내지 도 11은 다목적 백신으로서 기능을 분석하기 위해 BALB/c의 근육내로 고스트 백신을 투여한 후 대장균의 각 항원에 대한 면역응답을 ELISA를 통해 분석한 결과로서, 혈청 중의 총 IgG (도 7), IgG1 (도 8), IgG2a (도 9)의 분석과 분변 중의 분비 IgA (도 10) 및 질 분비액 중의 분비 IgA (도 11) 등을 분석한 결과이다.
도 12 및 도 13은 고스트 백신을 근육으로 투여한 후 살모넬라와 대장균 항원에 대해 증식된 지라의 T-세포(도 12)와 B-세포(도 13)를 나타낸 것이다.
도 14는 각 항원을 운반하는 고스트 세포를 근육내 주사한 후 사이토카인의 발현을 분석한 결과이다.
도 15는 고스트 백신을 근육으로 2회 백신화한 후 병원성 살모넬라 균주로 도전실험을 수행한 결과이다.
도 16은 다목적 백신으로서 기능을 분석하기 위해 BALB/c의 경구로 고스트 백신을 투여한 후 살모넬라에 대한 면역응답을 ELISA을 통해 분석한 결과로서 혈청 중의 총 IgG를 분석한 결과이다.
도 17은 다목적 백신으로서 기능을 분석하기 위해 BALB/c의 경구로 고스트 백신을 투여한 후 대장균의 각 항원에 대한 면역응답을 ELISA을 통해 분석한 결과로서 혈청 중의 총 IgG를 분석한 결과이다.
도 18 및 도 19는 경구로 고스트 백신을 투여한 후 살모넬라와 대장균 항원에 대해 증식된 지라의 T-세포(도 18)와 B-세포(도 19)를 나타낸 것이다.
도 20은 각 항원을 운반하는 고스트 세포를 경구로 투여한 후 사이토카인의 발현을 분석한 결과이다.
도 21은 고스트 백신으로 경구로 2회 백신화한 후 병원성 살모넬라 균주로 도전실험을 수행한 결과이다.
도 22 내지 도 24는 임신돈과 자돈에 대해 고스트 백신을 투여한 후 자돈에서 면역능력을 분석한 결과이며, 임신돈에 2회 고스트 백신을 투여한 후 자돈에서 총 IgG 수준을 분석(도 22), 임신돈에 대해 2회 고스트 백신을 투여하고 그 임신돈으로 생산된 자돈에 1회 더 고스트 백신을 투여하여 자돈에서 총 IgG 수준을 조사(도 23), 및 자돈에 2회 고스트 백신을 투여하고 난 후 총 IgG 수준(도 24) 등을 분석한 것이다.
도 25는 본 발명에 따른 벡터의 모식도이다.

이하, 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.

1) lysis E 유전자;

5) 형질전환된 세포의 외부에 항원을 표지할 수 있도록 TMD(transmembrane domain)와 연결된, FedA, FedF, F41 및 인티민(intimin)으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 외부항원.

상기 재조합벡터 제작시, 조절 부위는 특정 온도 조건에서만 유전자의 유도발현이 가능한 박테리오파지 λPR프로모터(promoter)/cI 리프레서(repressor)를 이용하였고, 세균벽에 미세 구멍을 유도하기 위하여 phiX174 파지의 lysis E 유전자를 이용하였다.

상기 재조합벡터의 커피수를 조절하기 위해 다양한 오리진이 사용될 수 있다. 본 발명의 일 실시예에 따르면, pBR ori (pMMP184)및 p15A ori(pMMP187)가 사용되었으나, 사용 목적에 따라 다른 오리진이 사용될 수도 있다.

일 실시예에 따르면, 상기 재조합벡터로 형질전환된 세포의 외부에 외부항원을 표지할 수 있도록 TMD(transmembrane domain)와 연결된 MCS(multi cloning site)를 더 포함할 수 있다.

본 발명에서는, 상기와 같은 lysis E 유전자의 조절체계에 추가하여, 플라스미드 pMMP184와 pMMP187에 P_R 프로모터에 E. coli ompA (outermembrane protein A)의 8 TMD (transmembrane domain) 영역에 해당하는 부분을 삽입하였다.

E. coli ompA는 1041 nts, 346 아미노산으로 구성되는 데, 이 중 8 TMD가 유지되는 N-말단 1~540 nts인 (아미노산 1~180까지) 영역은 세포질에 존재하며, 세포 외부로 4개의 루프(loop)가 존재한다. ompA 유전자 TMD와 인프레임(in frame)으로 His₆ 에피토프(epitope)가 부가되어 있고, His₆의 3-말단쪽에 MCS(multi-cloning site)가 있어 외부항원을 클로닝할 수 있도록 디자인되어 있다. His₆은 상업적으로 시판되고 있는 His-항체를 이용하여 쉽게 감지할 수 있다. 보다 상세한 모식도는 도 25에 나타나 있다.

상기 외부 항원으로 사용된 FedA, FedF, F41 및 인티민(intimin)은 병원성 대장균에서 특이적으로 나타나는 항원이다. 소화기 계통의 질환 설사와 연관된 병원성 대장균 중에는 각 병원성에 특이적으로 운반되는 핌브리아(fimbria)가 존재한다. 5일 미만의 신생자돈의 설사와 연관된 F4 핌브리아, 5~14일의 경우에는 F5, F6, F41 등이 관여하며, 3~4주의 경우에는 F4와 F18 등이 특이적으로 운반되는 것으로 알려져 있다(하기 실시예 참조). 또한, eae 유전자에 의해 발현되는 인티민(intimin)은 EHEC (enterohemorrhagic E. coli) O157:H7가 숙주 동물에 정착하기 위한 부착(adhesion)에 요구되는 것으로 알려져 있다(하기 실시예 참조). 본 발명에서는 다양한 핌브리아 중에서 F41, F18, 인티민(intimin) 등 비교적 포유시기 후반부~이유자돈기에 설사 유발과 관련되는 요소에 대한 것들을 외부항원으로 포함한다.

(a) 상기 살모넬라를 아라비노즈를 함유하는 배지에서 25~30℃ 조건으로 배양하는 단계;

상기 살모넬라를 25~30℃ 온도 조건하에서 아리비노즈를 함유하는 배지에서, 180~220rpm으로 배양하면, cI857 리프레서와 안티센스의 동시작용을 통해 lysis E 유전자의 발현을 엄격히 통제할 수 있다. 배양된 세포의 OD값이 0.2 내지 0.4에 달하면, lysis E 유전자의 발현을 위해 아라비노즈를 포함하는 배지로 옮겨 40~43℃ 온도에서 배양하여 lysis E 유전자를 발현시킬 수 있다.

이때, 초기 배양 온도 조건이 상기 범위를 벗어나면 미세 터널구조 형성의 효율성이 저하되는 문제가 있고, 승온된 온도가 상기 범위를 벗어나면 세균 생장 온도 범위를 초과하여 자연사하는 문제가 있다. 상기 40~43℃로의 온도 자극을 통해 lysis E 유전자의 발현을 유도하여 세포벽의 미세한 터널구조를 유도하고, 이를 통하여 세포질을 유출시켜 고스트화할 수 있다. 상기 온도 자극 후, 세포밀도를 측정하여 세포밀도의 감소가 더 이상 일어나지 않을 때 집균한 다음, 동결 건조하여 냉장 보관하였다.

본 발명의 일 측면에 따르면, 상기 방법에 의해 제조되고, lysis E 유전자를 함유하는 고스트 살모넬라가 제공될 수 있다.

상기 세균성 소화기 질환은 설사와 구토, 장염을 유발하는 것을 예로 들 수 있고, 원인이 되는 세균의 타입에 따라 대장균성, 살모넬라성으로 분류할 수 있다.

일 실시예에 따르면, 상기 동물은 설치류일 수 있다. 보다 바람직하게는, 상기 설치류는 마우스일 수 있다.

일 실시예에 따르면, 상기 동물은 포유류일 수 있다. 보다 상세하게는, 상기 포유류는 돼지일 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 마우스 및 돼지의 구강 및 근육내로 상기 백신을 투여하여 면역 유도 반응을 관찰하였다. 그 결과, 전반적으로는 구강 투여에 비해 근육내로 백신을 투여하는 것이 보다 효과적인 것으로 나타났다.

돼지의 경우, 포유시기 후반부~이유자돈기의 모돈 및 자돈에 대한 백신 투여후 면역반응을 검사하였으며, 하기 실시예에서 확인할 수 있듯이, 모돈에 1회 이상 경구 또는 구강투여하고, 그 모돈으로부터 생산된 자돈에 1회 이상 경구 또는 구강투여하는 것이 백신의 효율을 가장 높일 수 있는 것으로 나타났다.

이하에서는 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 다만, 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다 할 것이다.

실시예

1. 백신 후보 균주들로부터 신생 자돈의 설사와 관련된 FedA , FedF , F41, 인티민( intimin ) 발현분석

제작된 고스트 시스템을 다목적용 백신으로 활용하기 위한 방안으로 병원성 대장균에서 특이적으로 나타나는 항원을 조사했다. 소화기 계통에 설사와 연관된 병원성 대장균 중에서 각 병원성에 특이적으로 운반되는 핌브리아(fimbria)가 존재한다. 5일 미만의 신생자돈의 설사와 연관된 F4 핌브리아, 5~14일의 경우에는 F5, F6, F41 등이 관여하며, 3~4주의 경우에는 F4와 F18 등이 특이적으로 운반되는 것으로 알려져 있다(Kim et al., 2010; Nagy and Fekete, 1999; Smeds et al., 2003; Vu-Khac et al., 2004). 또한, eae 유전자에 의해 발현되는 인티민(intimin)은 EHEC (enterohemorrhagic E. coli) O157:H7가 숙주 동물에 정착을 위한 부착(adhesion)에 요구된다(Amani et al., 2010; Dean-Nystrom, et al., 1998). 본 연구에서는 다양한 핌브리아 중에서 F41, F18, 인티민(intimin) 등 비교적 포유시기 후반부~이유자돈기에 설사 유발과 관련되는 요소에 대한 것들을 조사하였다.

구축한 벡터의 시그널 펩티드와 His-항원을 통해 외부 단백질의 발현을 알아보기 위해 FedA, FedF, F41, 인티민(intimin) 유전자를 제작된 벡터 pMMP184에 제한효소 EcoRI과 HindIII로 절단하여 라이게이션하였다. 상기 라이게이션된 산물은 asd 돌연변이주인 E. coli x6212에 형질전환하여 EcoRI과 HindIII로 절단한 후 삽입물을 확인하였다. 클로닝된 이들 재조합산물은 각각 MMP13에 형질전환하여 고스트 세포를 구축하였다. 상기 형질전환된 E. coli x6212에서 FedA, FedF, F41, 인티민(intimin)의 발현량을 측정하기 위해 웨스턴 블롯을 실시하였다. 1차 항체는 상업적으로 판매하고 있는 마우스에서 발현된 His-에피토프 항체(IgG Therapy Co.)를 1차 항체로 사용하였다. 2차 항체는 염소에서 발현된 항 마우스 IgG에 HRP(horseradish peroxidase)에 접합한 항체를 사용하였다. 그 결과, FedA, FedF, F41, 인티민(intimin)의 발현의 이루어지고 있다는 것을 확인할 수 있었다(도 1).

2. 근육으로 고스트 백신을 투여한 후 살모넬라에 대한 면역유도 분석 결과

웨스턴 블랏으로 발현 확인이 완료된 각 항원을 유지하는 고스트 백신을 BALB/c 마우스에 접종하여 면역유도 반응을 분석하였다. 반응의 분석을 위한 샘플은 근육으로 접종 전, 그리고 접종 후 2, 4, 6, 8, 10주째의 혈청, 질 분비 샘플 및 분변 분비 샘플로부터 채취하였다. 혈청은 안와후 정맥을 통해 채혈한 후 4,000g, 5분 동안 원심분리하여 상층액인 혈청을 분리한 후 -20℃에 보관하며 실험에 사용하였다. 분변 분비 샘플은 무게를 잰 후 PBS로 100mg/ml가 되도록 부유시킨 후 최고속도에서 10분간 원심분리 후 상층액을 분리, -20℃에 보관하며 실험에 사용하였다.

혈청, 분변 분비 샘플, 질 분비 샘플(2, 4, 6, 8, 10주)에서 살모넬라 LPS에 특이적인 항체를 측정하기 위해 ELISA를 시행하였다. 샘플 웰에는 살모넬라 LPS를 200ng/웰의 농도로, 기준 웰(standard well)에는 염소 항-마우스 IgG/IgG1/IgG2a 혹은 래빗 항-마우스 IgA를 각각 200ng/웰의 농도로 분주한 후, 4℃로 철야배양하여 코팅하였다. 코팅된 플레이트는 PBS로 3번 세척한 후 블로킹 버퍼(1% skim milk in PBS) 로 블로킹한 다음, 혈청은 PBS로 1:100으로 희석하고, 질 분비 샘플과 분변 분비 샘플은 1:2로 각각 희석한 다음 100μl 씩 각 웰에 분주한 후, 37℃에서 2시간~4시간 동안 반응시켰다. 혈청의 경우 페록시다제-컨쥬게이티드 고트 항 마우스(peroxidase-conjugated goat anti-mouse) IgG, IgG1, IgG2a HRP 그리고 IgA 레벨에 대해서는 페록시다제-컨쥬게이티드 고트 항 마우스 IgA HRP를 1:2,000의 배율로 희석하여 각 웰에 100μl씩 분주한 후 37℃에서 2시간 동안 반응시켰다. PBS 용액을 완전히 제거한 후 반응 기질 2,2'-azino-bis(3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonic acid) (ABTS)를 유지하는 용액에서 10~90분 동안 반응시켰다. 0.1% SDS로 반응을 정지시킨 후 ELISA 리더기로 파장 405nm에서 발현정도를 관찰하였다.

그 결과 도 2, 도 3 및 도 4에 나타난 바와 같이, 혈청에서의 IgG, IgG1, IgG2a의 발현이 고스트 백신을 투여한 후 4주째부터 대조구에 비해서 현저히 증가하는 것을 확인할 수 있었다. Th1 세포는 세포매개면역반응을 유도하고, IgG2a 생성을 촉진하는 반면에, Th2 세포는 B-세포 항체 생성에 대한 효능적인 조력자로 제공되며, IgG1 생성을 촉진한다. 이 결과는 살모넬라 고스트 백신을 IM(근육내 투여)으로 주사하더라도 세포성 및 체액성 면역에 관련된 요소의 발현이 상승하는 것을 나타낸다. 또한 도 5에 나타난 바와 같이, 분변 분비 샘플에서의 sIgA의 발현은 특이적인 발현 패턴의 변화가 감지되지 않았다. 마지막으로 질 분비 샘플에서의 sIgA의 발현을 보면, FedF, F41, 인티민(인티민(intimin))의 항원이 투여된 마우스에서 4주째부터 발현이 증가하다가 점차적으로 발현이 감소하는 패턴을 보였지만, FedA의 경우는 6주째에 발현이 보인 후에 8주째에 최대값에 도달한 뒤 감소되는 경향을 보였다.(도 6).

3. 근육으로 고스트 백신화 후 각 E. coli 항원에 대한 면역유도 결과

각 항원에서의 발현정도를 보면 도 7, 도 8 및 도 9에 나타난 바와 같이, 혈청에서는 고스트 백신을 투여한 후 총 IgG는 4주째부터 발현이 점차 증가하고 IgG1, IgG2a는 6주째부터 발현이 증가하는 패턴을 보였다. 분변 분비 샘플에서의 sIgA의 발현을 보면, 특이적인 발현 패턴이 감지되지 않았다(도 10). 질 분비 샘플에서의 sIgA의 발현을 보면, FedA는 대조구로 발현에서 차이점을 찾을 수 없었고, FedF는 10주째에 발현이 증가하는 것을 확인할 수 있었다. 마지막으로 F41은 4주째에 상승하여 지속되는 경향을 보였지만, 인티민(intimin)은 또한 4주째에 상승되고 6주째에 최대값에 도달한 후 감소되는 경향을 보였다(도 11).

4. 근육으로 고스트 백신을 투여한 마우스에서 T- 세포과 B-세포의 분포도 확인

고스트 백신을 투여한 마우스에서 T-세포와 B-세포의 분포도를 알아보기 위해서 FACS를 시행하였다. 마우스에 고스트 백신을 투여한 후 5주째에 고스트 백신을 투여한 마우스와 PBS만 투여한 마우스로부터 비장(spleen)을 재취한 후 지라세포(splenocyte)를 각각 분리하였다. 분리한 지라세포에 마우스 T 림프구 서브셋 항체 칵테일(subset antibody cocktail)과 마우스 B 림프구 서브셋 칵테일을 이용해서 형광물질을 부착시킨 후 T-세포와 B-세포의 분포를 확인하였다. 그 결과 도 12에 나타난 바와 같이, FedA, FedF, F41, 인티민(intimin)의 항원이 투여된 마우스에서 CD3e에서의 분포가 대조구인 아이소타입 대조구(isotype control)보다 증가하는 것을 알 수 있었다. 또한, 도 13에 나타난 바와 같이, CD23 B 세포의 증가를 유도하는 것을 관찰할 수 있었다.

5. RT - PCR 을 이용한 유전자 발현 분석

고스트 세포를 근육으로 처리한 마우스에서 면역반응을 관찰하기 위해 사이토카인 중에 mIL-2, mIL-4, mIL-6, mIL-8, mIFN-, mTNF-, mActin등의 유전자 발현 변화에 대해 관찰하였다. 도 14는 항원인 FedA, FedF, F41, 인티민(intimin)을 처리하고 5주 후에, mIL-2, mIL-4, mIL-6, mIL-8, mIFN-, mTNF-을 관찰한 결과이다. 5주째에 mIL-6와 mIFN- 유전자의 발현레벨이 증가하였고, 나머지 mIL-2, mIL-4, mIL-8, mTNF-는 대조구와 비슷하게 발현한 것을 알 수 있다.

6. 근육으로 접종한 고스트 백신이 독력이 있는 살모넬라균에 대한 보호능력의 확인

고스트 백신이 독력이 있는 살모넬라균에 대한 보호능력을 관찰하기 위해서 도전실험을 다음과 같이 실시하였다. S. typhimurium X3339를 LB 브로스에 접종하여 37℃ 배양기에서 A600 0.8 OD 값이 되도록 배양한 후 멸균 PBS로 20μl 안에 2× 10⁷CFU가 되도록 희석한 후 접종 10주째에 20μl 씩 경구 접종하였다. 경구로 도전감염 후 30일 동안 매일 2회씩 폐사 여부를 확인하였다.

그 결과 도 15에 나타난 바와 같이, 대조구 마우스는 살모넬라균을 투여한지 10일을 전후로 폐사하기 시작해서 16일째에는 모든 대조구 마우스가 폐사하였다. 인티민(intimin)의 항원을 투여한 마우스의 경우 생존율이 25% 정도로 낮은 생존율을 보였다. 그에 반해 FedA, FedF, F41의 항원을 투여한 마우스는 10~11일째에 폐사가 일어나지만, 14일째부터는 폐사가 일어나지 않고 생존율이 50%정도 되는 것을 확인할 수 있었다.

7. 경구로 고스트 세포를 접종한 마우스의 면역유도 실험 결과

경구로 고스트 백신을 투여한 후 혈청에서의 총 IgG 발현을 보면, 도 16에서 나타난 바와 같이, LPS로 관찰했을 경우에 각 샘플은 4주 이후에 발현이 상승되는 것을 관찰할 수 있지만, 근육내 주사와 비교할 때 2배 이하의 발현력이 관찰되었다. 분변 분비 샘플이나 질 분비 샘플에서 IgA를 감지하는 것이 불가능하였다. 이것은 경구로 고스트 백신을 투여할 경우의 낮은 발현성에 기인되는 것으로 추정된다.

각 항원에서의 발현을 알아보면, 도 17에서 나타난 바와 같이, F41과 인티민은 4주째부터 발현이 관찰되었다, FedF는 8주째부터 발현이 상승되었지만, FedA는 발현이 관찰되지 않았다. 질 분비 샘플이나 분변 분비 샘플에서 IgA는 감지되지 않았다. 도 16과 도 17에서 나타난 결과와 같이 고스트 백신을 구강으로 투여한 경우에는 강한 면역 반응을 유발하지 못하는 것으로 추정된다.

8. 경구로 고스트 백신을 투여한 마우스에서 T-세포와 B-세포의 분포도 확인 실험

고스트 백신을 투여한 마우스에서 T-세포와 B-세포의 분포도를 알아보기 위해서 FACS를 시행하였다. 마우스에 고스트 백신을 경구로 투여한 후 5주째에 고스트 백신을 투여한 마우스와 PBS만 투여한 마우스로부터 비장을 재취한 후 지라세포를 각각 분리하였다. 분리한 지라세포에 마우스 T 림프구 서브셋 항체 칵테일과 마우스 B 림프구 서브셋 항체 칵테일을 이용해서 형광물질을 부착시킨 후 T-세포와 B-세포의 분포를 확인하였다. 그 결과 도 18에 나타난 바와 같이, T-세포의 분포를 보면 다음과 같다. FedF 항원만 투여된 마우스에서 PE CD4와 PE-Cy7 CD3e에서의 분포가 대조구 보다 증가하는 것을 알 수 있었다. 하지만 다른 항원에서는 별다른 차이점을 찾을 수 없었다. 도 19에 나타난 바와 같이, B-세포의 분포를 보면 다음과 같다. FedA, F41, 인티민(intimin) 항원이 투여된 마우스에서 PE-Cy7 CD45R/B220와 APC sIgM의 분포에 영향을 주는 것을 확인할 수 있었다.

9. RT - PCR 을 이용한 유전자 발현 결과

고스트 세포를 경구로 처리한 마우스에서 면역반응을 관찰하기 위해 사이토카인 중에 mIL-4, mIL-5, mIL-6, mIFN-, mTNF-, mActin등의 유전자 발현 변화에 대해 관찰하였다. 그림 16는 항원인 FedA, FedF, F41, 인티민(intimin)을 처리하고 5주 후에, mIL-2, mIL-4, mIL-6, mIL-8, mIFN-, mTNF-을 관찰한 결과이다. 5주째에 mIL-6의 유전자의 발현레벨이 증가하였고, 나머지 mIL-4, mIL-5, mIFN-, mTNF-는 대조구와 비슷하게 발현하였다(도 20).

10. 경구로 접종한 고스트 백신이 독력이 있는 살모넬라균에 대한 보호능력을 관찰

고스트 백신이 독력이 있는 살모넬라균에 대한 보호능력을 관찰하기 위해서 도전실험을 다음과 같이 실시하였다. S. typhimurium X3339를 LB 브로스에 접종하여 37℃ 배양기에서 A600 0.8 OD값으로 배양한 후 멸균 PBS로 20μl 안에 2×10⁷CFU가 되도록 희석한 후 접종 10주째에 20μl 씩 경구 접종하였다. 경구로 도전감염 후 18일 동안 매일 2회씩 폐사 여부를 확인하였다.

그 결과 도 21에 나타난 바와 같이, 대조구 마우스는 살모넬라균을 투여한지 9일째에 폐사하기 시작해서 16일째에는 모든 대조구 마우스가 폐사하였다. FedA, F41의 항원을 투여한 마우스의 경우 생존율이 25% 정도로 낮은 생존율을 보였다. 그에 반해 FedF, 인티민(intimin)의 항원을 투여한 마우스는 9일째에 폐사가 일어나지만, 13일째부터는 폐사가 일어나지 않고 생존율이 50%정도 되는 것을 확인할 수 있었다.

11. 고스트 백신을 임신돈 또는 자돈에 투여한 후 자돈의 면역유도 결과

모돈 12마리에 5x10⁹ CFU/2ml로 고스트 세포 (FedA, FedF, K88ab, K88ac)를 경구와 근육으로 분만 5주, 2주전에 각각 접종하였다. 고스트 세포를 백신화 시키기 전 모돈에서 채혈을 하였고, 분만 후 1주 안에 채혈을 수행하였다. 자돈은 1주령, 3주령, 5주령에서 채혈을 수행하였다. 2차 실험에서는 모돈 12마리에 5x10⁹ CFU/2mL로 고스트 세포 (FedA, FedF, K88ab, K88ac)를 경구와 근육으로 분만 5주, 2주 전에 각각 접종하였다. 자돈 1주령에서도 5x10⁹ CFU/2mL으로 고스트 세포를 근육으로 접종하였다. 고스트 세포를 백신화 시키기 전 모돈에서 채혈을 하였고 분만 후 1주 안에 채혈을 수행하였다. 자돈은 1주령, 3주령, 5주령에서 채혈을 수행하였다. 3차 실험에서는 자돈 1주령, 3주령에서만 5x10⁹ CFU/2mL로 고스트 세포를 경구와 근육으로 접종하였고, 1주령, 3주령, 5주령 때 채혈을 수행하였다.

혈청에서 살모넬라 LPS에 특이적인 항체를 측정하기 위해 ELISA를 시행하였다. 샘플 웰에는 살모넬라 LPS를 200ng/웰의 농도로 분주 한 후 4℃로 철야배양하여 코팅하였다. 코팅된 플레이트는 PBS로 3번 세정한 후 블로킹 버퍼(1% skim milk in PBS)로 블로킹 한 다음, 혈청은 PBS로 1:50으로 희석하여 100μl 씩 웰에 분주한 후, 37℃에서 2~4시간 동안 반응시켰다. 혈청의 경우 페록시다제 컨쥬게이트 염소 항-스와인(Peroxidase-conjugated goat anti-swine) IgG(H+L) HRP을 1:2,000의 배율로 희석하여 각 웰에 100μl씩 분주한 후 37℃에서 2시간 동안 반응시켰다. PBS 용액을 완전히 제거한 후 반응 기질 2,2'-azino-bis(3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonic acid) (ABTS)를 유지하는 용액에서 10~90분 동안 반응시켰다. 0.1% SDS로 반응을 정지시킨 후 ELISA 리더기로 파장 405nm에서 발현정도를 관찰하였다.

그 결과 도 22에 나타난 바와 같이, IM(근육내 투여)으로 백신화한 자돈 혈청에서의 총 IgG의 발현이 자돈 1 및 3주령에서는 대조구에 비교하여 고스트 백신을 투여한 모돈에서 태어난 자돈의 경우에서 발현이 상승하는 경향을 나타내었다. 그러나, 5주령에서는 발현 수준이 감소되는 것으로 나타났다. 그러나, 구강으로 투여한 경우에는 전반적으로 면역활성이 낮은 것으로 나타났지만, 살모넬라에 대한 면역활성은 5주째까지 지속적으로 유지되는 것을 관찰할 수 있었다. FedF 및 K88ab는 IM과 유사한 현상이 관찰되었다.

모돈에 경구와 근육으로 분만 5주, 2주 전에 접종한 후 그 모돈으로부터 생산된 자돈 2주차에 추가접종을 했을 때, 나타나는 면역반응을 조사해 본 결과 도 23과 같이 나타났다. 근육내 주사의 경우에서 살모넬라에 대한 면역응답은 모돈에 고스트 백신을 투여한 경우와 유사한 경향성을 나타내었다. 그러나 각 항원에 대한 면역응답은 5주차에 상승을 유도하는 것이 모돈만 백신화한 것과 차이를 보였다. 자돈에 추가접종은 면역기능을 상승시킬 수 있다는 것을 나타낸다.

자돈에 경구와 근육으로 1 주와 3주 차에 접종한 후, 나타나는 면역반응을 조사해 본 결과 도 24와 같이 나타났다. 근육내 주사의 경우에서 살모넬라와 각 항원에 대한 면역응답이 3 및 5주차에 상승되는 경향을 볼 수 있다. 구강의 경우에서 살모넬라와 FedF는 약하게 면역반응을 보였지만, K88ab는 면역응답이 없었다.

이상의 결과를 종합해 보면, 고스트 백신을 접종할 경우에는 모돈에 1회 이상 투여하고, 그 모돈으로부터 생산된 자돈에 1회 이상 투여하는 것이 면역응답을 높게 유지하는 것으로 추정된다.

본 발명에 따른 다목적 고스트 백신을 이용하면, 다양한 연령의 돼지에 안전하면서 대장균증과 살모넬라균증을 동시에 효과적으로 방어할 수 있고, 사람으로의 교차감염을 미연에 방지할 수 있는 효과가 있다.

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시 양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항 들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims

하기 유전자를 포함하는 재조합벡터.
1) lysis E 유전자;
2) 상기 lysis E 유전자의 업스트림에 연결된 λPR 프로모터(promoter)/cI857 리프레서(repressor);
3) 상기 lysis E 유전자의 안티센스 RNA를 생성하도록 상기 lysis E 유전자의 다운스트림에 결합된 ParaBAD 프로모터 및 araC 유전자;
4) 상기 1)~3)과는 독립적으로 발현되는 asd(aspartate semialdehyde dehydrogenase) 유전자; 및
5) 형질전환된 세포의 외부에 항원을 표지할 수 있도록 TMD(transmembrane domain)와 연결된, FedA, FedF, F41 및 인티민(intimin)으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 외부항원을 더 포함하는 재조합벡터.
제1항의 재조합벡터로 형질전환된 asd 결실(asd^-) 미생물.
제1항의 재조합벡터로 형질전환된 asd 결실(asd^-) 살모넬라 (Salmonella).
다음 단계를 포함하는 고스트(ghost) 살모넬라의 제조방법:
(a) 제2항의 살모넬라를 아라비노즈를 함유하는 배지에서 25~30℃ 조건으로 배양하는 단계;
(b) 상기 배양액의 세포밀도(OD600)가 0.2~0.4에 도달하면 아라비노즈를 함유하지 않는 배지에서 40~43℃의 온도에서 추가로 배양하는 단계; 및
(c) 상기 배양액의 세포밀도 감소가 중지되었을 때 상기 살모넬라를 수득하는 단계.
제3항의 고스트 살모넬라를 유효량 함유하는 세균성 소화기 질환 예방용 백신.
제5항의 백신을 동물의 경구 또는 근육내에 투여하는 것을 특징으로 하는 마우스의 면역반응 유도방법.
제6항에 있어서, 상기 동물은 설치류인 것을 특징으로 하는 동물의 면역반응 유도방법.
제6항에 있어서, 상기 동물은 포유류인 것을 특징으로 하는 동물의 면역반응 유도방법.
제8항에 있어서, 상기 포유류는 돼지인 것을 특징으로 하는 동물의 면역반응 유도방법.
제9항에 있어서, 상기 백신을 모돈에 1회 이상 투여하고, 그 모돈으로부터 생산된 자돈에 1회 이상 투여하는 것을 특징으로 하는 돼지의 면역반응 유도방법.