KR20140054399A - 암에서의 prame 유전자 발현의 검출 - Google Patents

암에서의 prame 유전자 발현의 검출 Download PDF

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KR20140054399A
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캐서린 민게트
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글락소스미스클라인 바이오로지칼즈 에스.에이.
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Abstract

본 발명은 신규한 진단 키트 및 방법에 사용하기 위한 PRAME 특이적 프라이머 및 프로브에 관한 것이다. 본 발명은 추가로 PRAME 발현 종양으로부터 고통받는 특정 집단의 암 환자의 치료에 관한 것이다.

Description

암에서의 PRAME 유전자 발현의 검출{DETECTION OF PRAME GENE EXPRESSION IN CANCER}
발명의 분야
본 발명은 PRAME의 검출을 위한 진단 방법 및 조성물, 뿐만 아니라 PRAME 발현 종양으로부터 고통받는 환자 집단의 면역치료요법 치료에 관한 것이다.
배경
"흑색종에서 우선적으로 발현되는 항원" 또는 "PRAME"은 PRAME 유전자에 의해 엔코딩된 종양 항원이다.
PRAME은 흑색종, 폐암 및 백혈병을 포함하는 많은 유형의 종양에서 과다발현되는 항원이다(Ikeda et al ., Immunity 1997, 6 (2) 199-208). 난소암, 유방암, 폐암 및 흑색종, 수모세포종, 육종, 두경부암, 신경모세포종, 신장암 및 윌름씨 종양을 포함하는 여러 고형 종양, 및 급성 림프모구성 및 골수성 백혈병(ALL 및 AML), 만성 골수성 백혈병(CML), 호지킨병, 다발성 골수종, 만성 림프구성 백혈병(CLL) 및 외투세포림프종(MCL)을 포함하는 혈액암에서 높은 수준의 PRAME 발현이 보고되었다.
또한, PRAME은 몇몇 정상 조직, 예를 들어, 고환, 부신, 난소 및 자궁내막에서 매우 낮은 수준으로 발현된다.
흑색종
원격 전이(미국공동암위원회(American Joint Committee on Cancer, AJCC) 분류에 따라 단계 IV)에서 악성 흑색종을 나타내는 환자는 단지 5%의 장기간 생존률과 함께 1년의 중앙 생존 기간을 갖는다. 단계 IV 흑색종에 대한 표준 화학요법이 단지 8-25%의 치료 반응률을 갖지만, 전체 생존에는 영향을 미치지 않는다. 국소 전이(단계 III)를 갖는 환자는 원발 및 국소 전이의 적합한 외과적 제어 후에도 매우 낮은 가능성의 장기간 생존과 함께 2 내지 3년의 중앙 생존 기간을 갖는다. 단계 I 내지 III 흑색종을 갖는 대부분의 환자는 이들의 종양이 외과적으로 제거되나, 이들 환자는 재발에 대한 실질적 위험이 지속된다.
폐암
비소세포폐암(NSCLC) 및 소세포폐암(SCLC)의 2개의 유형의 폐암이 존재한다. 상기 명칭은 단순히 종양에서 발견된 세포의 유형을 기재한다. NSCLC는 편평-세포 암종, 샘암종, 및 대세포 암종을 포함하며, 폐암의 약 80%의 원인이다. NSCLC는 치료하기가 어렵고, 이용가능한 치료는 가능한 한 생명을 연장시키고, 질병의 증상을 경감시키는 목적을 갖는 경향이 있다. NSCLC는 가장 흔한 유형의 폐암이며, 불량한 결과와 관련된다. 모든 NSCLC 환자 중, 약 25%가 진단시에 국소구역 질병(loco-regional disease)을 갖고, 외과적 절제가 여전히 가능하다(AJCC 분류에 따라 단계 IB, IIA 또는 IIB). 그러나, 상기 환자의 50% 초과는 완전한 외과적 절제 후 2년 이내에 재발할 것이다.
PRAME 발현
신선한 조직에서 PRAME의 발현 수준을 결정하기 위한 실시간 PCR 검정에서 사용하기 위한 프라이머가 개발되었다. 예를 들어, 전체 혈액 내의 PRAME을 검출하는데 사용하기 위한 하기 프라이머가 기재된 문헌[Paydas et al ., Leukemia Research 31 (2007) 365-369]를 참조하라:
AF 5'-CCA TGA CAA AGA AGC GAA AA-3'(SEQ ID NO:1) 및
AR 5'-CAT CTG GCC CAG GTA AGG AG-3' (SEQ ID NO:2).
RT-PCR 생성물의 반-정량 분석이 또한 보고되었다(Proto-Siqueira et al ., Leukemia Research 27 (2003) 393-396). 이러한 반 정량 검정에서, 하기 프라이머가 PRAME 유전자의 발현 수준을 결정하는데 사용되었다:
5'-CTGTACTCATTTCCAGAGCCAGA-3' (SEQ ID NO:3) 및
5'-TATTGAGAGAGGGTTTCCAAGGGGTT-3'(SEQ ID NO:4).
임상 센터에서 종양 조직 보존의 통상적인 방법인 포르말린-고정, 파라핀-포매(Formalin-Fixed, Paraffin-Embedded, FFPE) 종양 조직의 사용에 따른 어려움이 발생한다. 포르말린 내에서의 고정은 조직 내의 RNA의 분자 구조를 변경시켜, 가교 및 또한 부분적 분해를 야기시킨다. 부분적 분해는 100 내지 300개의 염기쌍의 RNA의 보다 작은 단편의 생성을 초래한다. 상기 RNA에 대한 구조적 변화는 통상적인 진단 기술에서 FFPE 조직으로부터 추출된 RNA를 이용하는 것을 어렵게 만든다.
발명의 개요
PRAME 유전자 생성물, 예를 들어, 핵산, 예를 들어, mRNA, 또는 단백질이 발현되는 조직을 확인하기 위한 방법 및 조성물이 본원에 제공된다.
본 발명의 한 구체예에서, SEQ ID NO:5, 6 또는 7 중 임의의 SEQ ID NO의 누클레오티드 서열을 포함하거나, 이들을 필수적으로 포함하여 구성되거나, 이들로 구성되는 올리고누클레오티드가 제공된다. 본 발명의 한 구체예에서, 검정 조건하에서 SEQ ID NO:8, 9 또는 10, 또는 SEQ ID NO:5, 6 또는 7의 표적 서열에 결합할 수 있는 올리고누클레오티드가 제공된다. 본원에서 언급되는 올리고누클레오티드 서열은 전장 PRAME 폴리누클레오티드 서열을 포함하지 않는다.
일부 구체예에서, 올리고누클레오티드는 SEQ ID NO:5, 6, 7, 8, 9, 및 10으로 구성된 군으로부터 선택된 누클레오티드 서열의 적어도 6개의 누클레오티드를 포함한다. 일부 구체예에서, 적어도 6개의 누클레오티드는 SEQ ID NO:5, 6, 7, 8, 9, 및 10의 6개의 3'측 누클레오티드이다.
본 발명의 개시는 SEQ ID NO:5 및/또는 SEQ ID NO:6을 포함하는 프라이머 쌍을 추가로 제공한다.
한 추가 양태에서, SEQ ID NO:5 또는 SEQ ID NO:7 중 임의의 SEQ ID NO의 누클레오티드 서열 또는 SEQ ID NO:6의 역 상보체(reverse complement)(SEQ ID NO:9)를 포함하는 프로브가 제공된다.
일부 구체예에서, 프로브는 중합효소에 의한 연장(extension)을 방지하기 위해 화학적으로 변형된다.
한 구체예에서, (i) SEQ ID NO:5 및 SEQ ID NO:6을 포함하거나 이들로 구성된 프라이머 쌍; 및 (ii) SEQ ID NO:7을 포함하거나 이로 구성된 프로브를 포함하는 올리고누클레오티드 세트가 제공된다.
한 구체예에서, (i) SEQ ID NO:5를 포함하거나 이로 구성된 정방향 프라이머; (ii) SEQ ID NO:6을 포함하거나 이로 구성된 역방향 프라이머; 및 (iii) SEQ ID NO:7을 포함하거나 이로 구성된 프로브를 포함하는 올리고누클레오티드 세트가 제공된다.
본 발명의 한 추가 구체예에서, 생물학적 샘플로부터 수득되거나 유래된 누클레오티드 서열과, (i) 본원에 기재된 올리고누클레오티드 중 적어도 하나; (ii) 본원에 기재된 일련의 프라이머; (iii) 본원에 기재된 프로브; 및/또는 (iv) 본원에 기재된 올리고누클레오티드 세트를 접촉시키는 단계를 포함하는, PRAME 유전자가 생물학적 샘플에서 발현되는지 결정하기 위한 방법이 제공된다.
한 추가 구체예에서, 환자-유래 생물학적 샘플로부터 수득되거나 유래된 누클레오티드 서열과 하기 성분 (i) 내지 (iv) 중 하나 이상을 접촉시키는 단계를 포함하는 환자 진단 방법이 제공된다:
(i) 본원에 기재된 적어도 하나의 올리고누클레오티드;
(ii) 본원에 기재된 일련의 프라이머;
(iii) 본원에 기재된 프로브; 및/또는
(iv) 본원에 기재된 올리고누클레오티드 세트.
본 발명의 한 추가 구체예에서, 환자-유래 생물학적 샘플로부터 수득되거나 유래된 누클레오티드 서열과 하기 성분 (i) 내지 (iv) 중 하나 이상을 접촉시키는 단계를 포함하는, 환자-유래 생물학적 샘플에서의 PRAME 양성 종양 조직의 존재 또는 부재를 결정하는 방법이 제공된다:
(i) 본원에 기재된 적어도 하나의 올리고누클레오티드;
(ii) 본원에 기재된 일련의 프라이머;
(iii) 본원에 기재된 프로브; 및/또는
(iv) 본원에 기재된 올리고누클레오티드 세트.
본원에 기재된 방법의 일부 구체예에서, 누클레오티드 서열과 성분 (i) 내지 (iv) 중 하나 이상을 접촉시키는 단계는 검정 조건하에서의 누클레오티드 서열과 성분 (i) 내지 (iv) 중 하나 이상 사이의 결합을 포함한다.
정방향 프라이머 및 프로브의 서열이 PRAME 핵산의 서열을 인지하고, 역방향 프라이머의 서열이 PRAME 핵산의 서열의 역 상보체를 인지하는 것이 당업자에게 명백할 것이며, 이는 본원에 개시된 프라이머 및 프로브 서열을 이용하여 용도, 방법, 검정 또는 올리고누클레오티드 세트가 개발되는 경우에 고려되어야 한다.
본원에 기재된 구체예에서, 프라이머 세트는 PRAME의 누클레오티드 서열의 일부(앰플리콘)를 증폭시킬 수 있고, 프로브는 검정 조건하에서 앰플리콘의 누클레오티드 서열에 결합할 수 있다.
프라이머 또는 프로브가 샘플로부터 유래된 핵산에 결합하는 경우, 샘플은 PRAME 항원을 발현하는 것으로 확인(PRAME 양성)될 수 있다. 본원에 기재된 방법의 적용, 및/또는 본원에 기재된 방법의 결과의 분석으로부터, 샘플은 이에 따라 PRAME 양성 종양 조직으로 확인될 수 있다.
한 구체예에서, 상기 방법은 누클레오티드 서열이 본원에 기재된 적어도 하나의 올리고누클레오티드에 결합하는지 검출하기 위한 제자리부합법(in situ hybridisation)의 단계를 포함한다.
본원에 기재된 방법은 상기 방법의 결과의 분석에 따라 PRAME이 샘플에서 발현되는지 결정하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
본원에 기재된 방법은 상기 방법의 결과의 분석에 따라 PRAME 양성 종양 조직의 존재 또는 부재를 결정하는 결정하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
본원에 기재된 방법은 신선하거나 동결되거나 동결된 적이 있었던 생물학적 샘플에 대해 사용될 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, 본원에 기재된 방법은 파라핀-보존되고, 예를 들어, 포르말린-고정, 파라핀-포매(FFPE)되는 생물학적 샘플에 대해 수행될 수 있다.
환자-유래 종양 조직이 본원에 기재된 방법에 따라 PRAME 유전자를 발현하는지 결정한 후, 본원에 기재된 PRAME 면역요법제를 환자에게 투여하는 단계를 포함하는 환자를 치료하는 방법이 또한 제공된다.
한 추가 구체예에서, 환자가 본원에 기재된 방법을 이용하여 PRAME 유전자를 발현하는 조직("PRAME-발현 종양 조직")을 갖는 것으로 확인된, 환자의 치료에서 사용하기 위한 PRAME 면역요법제가 제공된다.
용도 또는 치료 방법의 한 구체예에서, 환자는 절제되지 않은 PRAME-발현 종양 조직(활성 질병)을 가질 수 있다. 한 추가 구체예에서, 환자는 PRAME-발현 종양 조직의 외과적 절제를 받은 적이 있을 수 있다(애쥬번트 환경). 한 추가 구체예에서, 환자는 종양 조직을 표적화하기 위해 화학요법 또는 방사선요법을 먼저 또는 동시에 받을 수 있다.
본 발명의 개시는 PRAME 발현 종양의 재발에 민감한 환자를 치료하는 방법을 추가로 제공하며, 상기 환자는 PRAME 발현 종양 조직을 제거/치료하기 위해 치료된 적이 있고, 상기 방법은 본원에 기재된 방법을 이용하여 환자의 종양 조직이 PRAME을 발현하는지 결정한 후, 상기 환자에 PRAME 특이적 면역요법제를 포함하는 조성물을 투여하는 것을 포함한다.
도면의 간단한 설명
도 1-2: AM 및 GSK RealTime PRAME 올리고 설계의 분석 민감도 비교.
도 3: AM 대 GSK 올리고 세트로 수득된 PRAME Ct 결과에 대한 상관관계 분석.
표 및 서열의 설명
표 1은 본 발명의 구체예의 정방향 및 역방향 프라이머의 서열을 나타내는 표이다.
SEQ ID NO:5는 PRAME의 cDNA 발현 생성물을 검출하기 위한 정방향 프라이머의 연속적인 5'으로부터 3'으로의 핵산 서열이다.
SEQ ID NO:6은 PRAME의 cDNA 발현 생성물을 검출하기 위한 역방향 프라이머의 연속적인 5'으로부터 3'으로의 핵산 서열이다.
SEQ ID NO:7은 PRAME의 cDNA 발현 생성물을 검출하기 위한 프로브의 연속적인 5'으로부터 3'으로의 핵산 서열이다.
SEQ ID NO:8은 SEQ ID NO:5의 프라이머 서열에 의해 인지되는, PRAME 유전자의 연속적인 5'으로부터 3'으로의 핵산 서열("SEQ ID NO:5의 표적 서열")이다.
SEQ ID NO:9는 SEQ ID NO:6의 프라이머 서열의 역 상보체에 의해 인지되는, PRAME 유전자의 연속적인 5'으로부터 3'으로의 핵산 서열("SEQ ID NO:6의 표적 서열")이다.
SEQ ID NO:10은 SEQ ID NO:7의 프로브 서열에 의해 인지되는, PRAME 유전자의 연속적인 5'으로부터 3'으로의 핵산 서열("SEQ ID NO:7의 표적 서열")이다.
표 1
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상세한 설명
생물학적 샘플은 피검체로부터 제거되거나 분리된 피검체로부터의 조직 또는 세포의 샘플을 의미한다. 일부 구체예에서, 피검체는 인간 환자이다. PRAME 양성 종양 조직은 임의의 조직, 예를 들어, 환자로부터 분리된 PRAME 유전자 또는 PRAME 항원을 발현하는 종양 조직 또는 종양 세포를 의미한다.
한 구체예에서, 종양 조직은 흑색종; 유방암; 이행 세포 암종을 포함하는 방광암; 비소세포폐암종(NSCLC)을 포함하는 폐암; 식도 암종을 포함하는 두경부암; 편평세포 암종; 간암; 다발골수종 및/또는 결장 암종이다.
한 구체예에서, 본원에 개시된 방법 및 조성물은 상기 암, 특히 폐암 및 흑색종에서 애쥬번트(수술 후) 환경, 또는 전이성 암의 치료에서 환자의 치료에 사용될 수 있다.
한 구체예에서, 누클레오티드 서열은 생물학적 샘플, 예를 들어, 종양 조직 샘플이거나, 이들로부터 분리되거나 정제된 것이다. RT-PCR에서, 유전체 DNA 오염은 거짓 양성 결과를 초래할 수 있다. 한 구체예에서, 유전체 DNA는 본원에 개시된 방법에서 시험되거나 포함되는 샘플로부터 제거되거나, 실질적으로 제거된다.
본원에서 사용되는 용어 "~로부터 수득되거나 유래된"은 포괄하여 사용되는 것을 의미한다. 즉, 이는 종양 샘플로부터 직접 분리된 임의의 누클레오티드 서열, 또는 mRNA 또는 cDNA를 생성시키기 위해, 예를 들어, 역전사의 사용에 의해 샘플로부터 유래된 임의의 누클레오티드 서열을 포함하는 것으로 의도된다.
본원에서 사용되는 용어 '표적 서열'은 프로브 또는 프라이머의 서열이 부분적(즉, 약간의 정도의 미스매치를 갖음) 또는 전체 동일성을 갖는 PRAME 핵산 서열(DNA 또는 RNA, 예를 들어, 유전체 DNA, 메신저 RNA, 또는 이들의 증폭된 형태)의 영역이며, 역 프라이머는 이러한 역 프라이머가 인지하는 서열의 역 상보체(또는, 상기와 같이, 약간의 정도의 미스매치를 갖음)이다.
적합하게는, 프라이머 또는 프로브는 프라이머 또는 프로브의 길이에 걸쳐 표적 서열과 적어도 95% 동일할 수 있고, 적합하게는 표적 PRAME 서열에 대해 이의 길이에 걸쳐 95% 초과의 동일성, 예를 들어, 96%, 97%, 98%, 99%, 가장 바람직하게는 100%의 동일성을 가질 수 있다. 본 발명의 프라이머 또는 프로브는 프라이머 또는 프로브의 모든 누클레오티드 위치에서 표적 서열과 동일할 수 있거나, 예를 들어, 프로브의 길이, 온도, 반응 조건 및 검정의 필요조건에 따라 1, 2개 또는 그 초과의 미스매치를 가질 수 있다. 물론, 역 프라이머는 프라이머 서열의 역 상보체인 영역에 대해 상기 조건을 충족해야 한다.
용어 "프라이머"는, 예를 들어, PCR 기술에서 프라이머로 사용될 수 있는 임의의 단일-가닥 올리고누클레오티드 서열을 의미하는 것으로 본원에서 사용된다. 따라서, 본 발명에 따른 '프라이머'는 실질적으로 동일(정방향 프라이머에 대함)하거나 카피되는 핵산 가닥에 대해 실질적으로 역 상보성(역방향 프라이머에 대함)인 프라이머 연장 생성물의 합성을 위한 개시점으로 작용할 수 있는 단일-가닥 올리고누클레오티드 서열을 나타낸다. 프라이머의 설계(길이 및 특정 서열)는 DNA 및/또는 RNA 표적의 특성, 및 프라이머가 사용되는 조건(예를 들어, 온도 및 이온 강도)에 좌우될 것이다.
프라이머는 SEQ ID NO:5, 6 또는 7에 제시된 누클레오티드 서열로 구성될 수 있거나, SEQ ID NO:5, 6 또는 7의 서열을 포함하거나 이에 속하는 약 또는 정확히 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 75, 100개 또는 그 초과의 누클레오티드로 구성되거나 이를 포함할 수 있으나, 단, 이들은 검정 조건하에서 PRAME 누클레오티드 서열 내의 표적 서열에 특이적으로 결합하기에 적합해야 한다. 필요한 경우, 제공된 환경하에서 필요한 특이성 및 민감도를 유지시키기 위해 길이 또는 서열에 있어서 프로브의 프라이머의 약간의 변형이 수행될 수 있다. 본원에 기재된 바와 같은 SEQ ID NO:5 내지 6의 프로브 및 프라이머 서열은, 예를 들어, 어느 방향이든 1, 2, 3, 4, 5개 또는 그 초과의 누클레오티드까지 길이에 있어서 연장되거나 감소될 수 있다.
일부 구체예에서, 올리고누클레오티드는 SEQ ID NO:5, 6, 7, 8, 9, 및 10으로 구성된 군으로부터 선택된 누클레오티드 서열의 적어도 6개의 누클레오티드를 포함한다. 일부 구체예에서, 적어도 6개의 누클레오티드는 SEQ ID NO:5, 6, 7, 8, 9, 및 10의 6개의 3' 측 누클레오티드이다.
PRAME 누클레오티드 서열의 영역에 대한 프로브의 "결합"은 프라이머 또는 프로브가 이용된 검정 조건하에서 상기 영역의 일부 또는 전체 영역과 듀플렉스(이중-가닥의 누클레오티드 서열)를 형성하고, 상기 조건하에서, 프라이머 또는 프로브가 분석되는 샘플 내에 존재하는 누클레오티드 서열의 다른 영역과 안정적인 듀플렉스를 형성하지 않는 것을 의미한다. PRAME 누클레오티드 서열의 영역 내에서의 특이적 하이브리드화를 위해 설계된 본 발명의 프라이머 및 프로브는 상기 영역 내에 완전히 해당할 수 있거나, 상기 영역과 많은 정도로 중첩(즉, 상기 영역 내부 뿐만 아니라 외부의 누클레오티드와 듀플렉스를 형성)될 수 있음이 이해되어야 한다.
본 발명의 한 추가 양태에서, SEQ ID NO:5 또는 SEQ ID NO:7 중 임의의 SEQ ID NO의 누클레오티드 서열 또는 SEQ ID NO:6의 역 상보체(SEQ ID NO:9)를 포함하는 프로브가 제공된다.
용어 "프로브"는 핵산에 결합할 수 있고, 예를 들어, PCR 기술에서 프로브로서 사용될 수 있는 임의의 단일-가닥의 올리고누클레오티드 서열을 의미하기 위해 본원에서 사용되며; 프로브는 SEQ ID NO:7에 제시된 누클레오티드 서열로 구성될 수 있거나, SEQ ID NO:5 또는 SEQ ID NO:7의 서열을 포함하거나 이에 속하는 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 75, 100개 또는 그 초과의 염기쌍 또는 SEQ ID NO:6의 역 상보체(SEQ ID NO:9)일 수 있으나, 이들은 PRAME 누클레오티드 서열 내의 표적 서열에 특이적으로 결합하기에 적합해야 한다.
프로브가 프라이머의 쌍과 조합하여 방법에서 사용되는 본 발명의 한 구체예에서, 프라이머 쌍은 프로브가 결합할 수 있거나 프로브가 고체 지지체 상에 고정되는 PRAME 폴리누클레오티드 단편의 일부 또는 전부의 증폭을 가능케 해야 한다.
프라이머 및/또는 프로브는 프로브가 검출되는 것을 가능하게 하는 마커를 추가로 포함할 수 있다.
사용될 수 있는 마커의 예는 형광 마커, 예를 들어, 6-카르복시플루오레세인(6FAM™), NED™(Applera Corporation), HEX™ 또는 VIC™(Applied Biosystems); TET 및 TAMRA™ 마커(Applied Biosystems, CA, USA); 화학발광 마커, 예를 들어, 루테늄 프로브; 및 방사성 라벨, 예를 들어, 삼중수소 티미딘 형태의 트리튬을 포함한다. 32-인이 또한 방사성 라벨로 사용될 수 있다. 프로브가 검출될 수 있는 한 임의의 마커가 사용될 수 있다.
본 발명의 한 구체예에서, 프로브는 이의 5'-말단에 형광 리포터 염료 및 이의 3'-말단에 켄처(quencher) 염료를 포함할 수 있다. 형광 리포터 염료는 6-카르복시플루오레세인(6FAM)을 포함할 수 있고, 켄처 염료는 비-형광 켄처(NFQ)를 포함할 수 있다. 임의로, Minor Groove Binder 단백질(MGB™; Applied Biosystems, CA, USA)이 프로브, 예를 들어, 프로브의 3' 말단에 첨가될 수 있다.
한 구체예에서, MGB™ Eclipse 프로브가 사용될 수 있다(Epoch Biosciences, WA, USA). MGB™ Eclipse 프로브는 Eclipse™ Dark Quencher를 갖고, MGB™ 모이어티(moiety)가 프로브의 5'-말단에 위치된다. 형광 리포터 염료는 프로브의 3'-말단에 위치된다.
한 구체예에서, 본 발명의 프라이머 및 프로브 서열은 자연 발생 누클레오티드 구조 또는 염기, 예를 들어, 아데닌(A), 시토신(C), 구아닌(G), 티민(T) 및 우라실(U)을 함유하거나 포함할 수 있다. 적합하게는, 프라이머 또는 프로브의 각각의 누클레오티드는 이의 대응물 표적 누클레오티드와 수소 결합을 형성할 수 있다.
바람직하게는, 프라이머 또는 프로브와 표적 서열의 상보성은 A:T 및 C:G 염기쌍 형성의 정도, 예를 들어, 티민(T)과의 아데닌(A) 누클레오티드 쌍, 및 시토신(C)과의 구아닌(G) 누클레오티드 쌍, 또는 이들의 반대의 정도에 의해 평가된다. RNA 형태에서, T는 U(우라실)로 대체될 수 있다.
이노신이, 예를 들어, 유니버셜(universal) 프로브에서 사용될 수 있고, 이러한 경우 상보성은 또한 이노신(프로브)-표적 누클레오티드 상호작용의 정도에 의해 평가될 수 있다.
한 추가 구체예에서, 누클레오티드 구조 또는 염기의 합성 또는 변형 유사체가 프로브의 서열에 포함될 수 있다. 합성 또는 변형은 비-자연 발생 누클레오티드 구조 또는 염기를 의미한다. 상기 합성 또는 변형 염기는 프로브 서열 내의 염기 중 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9개 또는 전부를 대체할 수 있다. 한 구체예에서, 시토신은 5-메틸 dC에 의해 대체될 수 있고, 티민은 5-프로피닐 dU에 의해 대체될 수 있다. BHQ2 켄처가 또한 서열 내에 포함될 수 있다.
한 구체예에서, 본 발명의 올리고누클레오티드는 프로브 기반 검정에서 프로브로 사용될 수 있다. 프로브-기반 검정은 특정 서열에 대한 올리고누클레오티드 하이브리드화를 이용하고, 이후에 프로브가 하이브리드화되는 서열을 검출하기 위해 사용될 수 있다. 올리고누클레오티드 프로브는 당 분야에 공지된 임의의 검출 시스템을 이용하여 라벨링될 수 있다. 이들은 형광 모이어티, 방사성 동위원소 라벨링된 모이어티, 생물발광 모이어티, 발광 모이어티, 화학발광 모이어티, 효소, 기질, 수용체, 또는 리간드를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
프로브로 사용하기 위한 올리고누클레오티드는 SEQ ID NO:5 또는 7 중 임의의 SEQ ID NO의 누클레오티드 서열, 또는 SEQ ID NO:6의 역 상보체(SEQ ID NO:9)를 포함하거나, 이들을 필수적으로 포함하여 구성되거나, 이들로 구성될 수 있다.
본 발명의 프라이머 및 프로브는 핵산 또는 핵산의 생성물, 예를 들어, 증폭에 의해 수득된 생성물에 직접 하이브리드화될 수 있다. 또한, 증폭 생성물이 검출되기 전에 추가 정제 단계, 예를 들어, 침전 단계가 존재할 수 있다.
본 발명의 방법은 누클레오티드 서열을 증폭시키는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 한 구체예에서, 누클레오티드 서열은 중합효소 연쇄반응(PCR)에 의해 증폭된다. 대안적으로 또는 추가로, 본 발명의 방법은 증폭된 누클레오티드 서열과 본원에 기재된 하나 이상의 프로브를 접촉시키는 것을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 방법은 PRAME 양성 종양 조직을 검출하는데 적합하다. 본 발명의 한 구체예에서, PRAME 양성 조직은 제자리부합법을 이용하여 검출될 수 있다. 제자리부합법은 특정 DNA 또는 RNA 서열의 형태학적 위치의 직접적 시각화를 위해 환자로부터 분리된 온전한 염색체, 세포 또는 조직에 대한 본 발명에 따른 프라이머 또는 프로브를 이용하여 수행되는 하이브리드화 반응을 의미한다.
폴리누클레오티드의 하이브리드화는 임의의 적합한 하이브리드화 방법 및 검출 시스템을 이용하여 수행될 수 있다. 하이브리드화 시스템의 예는 통상적인 도트 블롯(dot blot), 서던 블롯, 및 샌드위치 방법을 포함한다. 예를 들어, 적합한 방법은 역 하이브리드화 방법을 포함할 수 있고, 여기서 타입-특이적 프로브가 공지된 별개의 위치에서 고체 지지체 상에 고정되고(도트, 라인 또는 다른 형상), 증폭된 폴리핵산이 하이브리드 형성을 검출하기 위해 라벨링된다. PRAME 특이적 핵산 서열, 예를 들어, 본원에 기재된 프로브 또는 프라이머는 비오틴으로 라벨링될 수 있고, 하이브리드는 비-방사성 발색 시스템을 이용하여 비오틴-스트렙타비딘 커플링을 통해 검출될 수 있다. 그러나, 예를 들어, 개시내용이 참조로서 또한 포함되는 문헌[Gravitt et al, (Journal of Clinical Microbiology, 1998, 36(10): 3020-3027)]에 예시된 바와 같은 다른 역 하이브리드화 시스템이 또한 이용될 수 있다. 표준 하이브리드화 및 세척 조건은 문헌[Kleter et al., Journal of Clinical Microbiology, 1999, 37(8): 2508-2517]에 기재되어 있고, 이는 프로브(들) 및 프라이머(들)의 길이 및 서열에 의해 요구되는 특이성 및 민감도를 유지하기 위해 제공된 환경하에서 최적화될 것이다.
본원에 기재된 방법은 신선한 조직, 동결 조직, 파라핀-보존된 조직 및/또는 에탄올 보존된 조직에서 사용하기에 적합할 수 있다. 널리-공지된 추출 및 정제 절차가 샘플로부터 RNA 또는 DNA의 분리에 이용가능하다(예를 들어, Sambrook et al., 1989). RNA 또는 DNA는 샘플로부터의 추출 후, 또는 더욱 바람직하게는 폴리누클레오티드 증폭 단계(예를 들어, PCR) 단계 후에 직접 이용될 수 있다. 특정 예에서, 예를 들어, 역 하이브리드화 검정을 위해, 증폭 전에 RNA를 cDNA로 역전사시키는 것이 필요할 수 있다. 후자의 경우 모두에서, 증폭된 폴리누클레오티드는 샘플로부터 '유래'된다.
본 발명은 본원에 기재된 방법을 이용하여 환자의 종양 조직이 PRAME을 발현하는지 결정하고, 상기 환자에 본원에 기재된 PRAME 면역요법제를 투여하는 것을 포함하는 환자를 치료하는 방법을 추가로 제공한다. 환자는 PRAME을 발현하는 종양 조직(활성 질병 환경)을 가질 수 있거나, PRAME 발현 종양의 재발에 민감할 수 있고, 환자는 PRAME 발현 종양 조직을 제거/치료하기 위해 치료된다(애쥬번트 환경).
본 발명은 PRAME 발현 종양으로부터 고통받거나 PRAME 발현 종양의 재발에 민감한 환자의 치료를 위한 약제의 제조에서의 PRAME 면역요법제의 용도를 추가로 제공하며, 여기서 환자는 본원에 기재된 진단 방법, 키트, 프라이머 또는 프로브를 이용하여 PRAME 발현 종양 조직을 갖는 것으로 확인되거나, PRAME 발현 종양 조직을 가졌던 것으로 확인된다.
따라서, 본 발명은 임상 적용에서 인간 환자로부터의 조직 샘플을 PRAME의 발현의 존재 또는 부재에 대해 스크리닝하는 방법을 제공한다.
이러한 샘플은, 예를 들어, 바늘 생검 코어, 외과적 절제 샘플 또는 림프절 조직으로 구성될 수 있다. 예를 들어, 이들 방법은 종양 세포를 전체 세포 집단의 약 80%로 높이기 위해 크립스탯(crypstat) 절제함으로써 임의로 분획화되는 생검을 수득하는 것을 포함한다. 특정 구체예에서, 핵산은 당 분야에 널리 공지된 기술을 이용하여 상기 샘플로부터 추출될 수 있다. 다른 구체예에서, 조직 샘플로부터 추출된 핵산은 당 분야에 널리 공지된 기술을 이용하여 증폭될 수 있다. PRAME 발현의 수준은 검출될 수 있고, 통계적 유효 그룹 및/또는 PRAME 음성 환자의 대조군과 비교될 수 있다.
한 구체예에서, 진단 방법은, 예를 들어, 유전자 생성물의 상응하는 mRNA 및/또는 단백질 수준을 검출함으로써 피검체가 PRAME 유전자 생성물을 발현하는지 결정하는 것을 포함한다. 예를 들어, 노던 블롯 분석, 역전사-중합효소 연쇄반응(RT-PCR), 반정량 RT-PCR, 정량 RT-PCR, TaqMan PCR, 제자리부합법, 면역침전, 웨스턴 블롯 분석 또는 면역조직화학과 같은 기술을 이용한다. 상기 방법에 따르면, 세포 또는 조직은 피검체로부터 수득될 수 있고, mRNA 및/또는 단백질의 수준이 PRAME을 발현하지 않는 조직의 mRNA 및/또는 단백질의 수준과 비교된다.
TaqMan PCR 기술
Taq DNA 중합효소는 5'-3' 엑소누클레아제 활성을 갖는다. Taqman PCR 검정은 PCR 증폭 동안 표적 서열로 어닐링되는 이중-라벨링된 프로브를 분해하는 상기 엑소누클레아제 활성을 이용한다.
간단히, RNA는 샘플로부터 추출되고, cDNA는 합성(역전사)된다. 이후, cDNA가 표준 PCR 성분(예를 들어, Taqman PCR에 대해 Roche (CA, USA)에 의해 공급되는 성분 참조)을 함유하는 PCR 반응 혼합물에 첨가된다. 반응 혼합물은 추가로 2개의 프라이머 사이의 주형 누클레오티드 서열(즉, PCR 반응에 의해 증폭되는 서열 내, "앰플리콘")로 어닐링되는 프로브를 함유한다. 프로브는 5'-말단에 형광 리포터 염료 및 3'-말단에 켄처 염료를 포함한다. 켄처는 2개의 염료가 서로 근접하는 경우에만 리포터 형광을 켄칭시킬 수 있고; 이는 온전한 프로브에 대해 발생한다.
증폭 동안 및 증폭 후, 프로브는 Taq DNA 중합효소에 의해 분해되고, 임의의 형광이 검출된다.
정량 측정을 위해, 형광이 기준선 방출의 표준 편차의 10배의 역치 값에 도달하는 PCR 주기 수가 이용된다. 주기 역치(Ct)로 언급되는 상기 주기 수는 표적 cDNA의 시작 양에 역으로 비례하고, cDNA의 양이 측정되는 것을 가능케 한다. 본질적으로, 샘플 내에 존재하는 표적 RNA가 많을수록, 수득되는 Ct 수는 낮아진다.
Ct 값에 대해 수득된 측정치는 하우스키핑 유전자(housekeeping gene)에 대해 수득된 측정치와 비교된다. 이는 각각의 역전사 반응에 첨가되는 전체 RNA의 양(파장 흡광도를 기초로 함) 및 이의 특성(즉, 분해)를 기초로 하여 임의의 오차를 허용하나; 상기 각각의 역전사 반응에 첨가되는 전체 RNA의 양 및 이의 특성은 어느 것도 시작 물질을 측정하는 확실한 파라미터는 아니다. 따라서, 하우스키핑 유전자의 전사체가 내인성 대조군으로 정량된다. 베타-액틴이 가장 흔하게 사용되는 비-특이적 하우스키핑 유전자 중 하나이나, 다른 것도 이용될 수 있다.
면역요법
한 구체예에서, 본 발명에서 사용하기 위한 PRAME 면역요법제는 PRAME 항원, 펩티드 또는 이들의 에피토프를 포함하는 조성물일 수 있다(능동 면역요법). 한 대안적 구체예에서, PRAME 면역요법제는 PRAME 항원을 특이적으로 인지할 수 있는 항원 결합 단백질 또는 항원 결합 단백질의 단편일 수 있다(수동 면역요법). 항원 결합 단백질은 자연 항체 또는 이의 기능적 단편 또는 등가물의 구조로 포맷화될 수 있는 본 발명의 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함할 수 있다.
한 구체예에서, PRAME 항원, 펩티드 또는 에피토프는 융합 파트너 또는 담체 단백질에 융합되거나 컨쥬게이션될 수 있다. 예를 들어, 융합 파트너 또는 담체 단백질은 단백질 D, NS1 또는 CLytA 또는 이들의 단편으로부터 선택될 수 있다.
PRAME 단백질은 509개의 아미노산을 가지며, 한 구체예에서, PRAME의 509개 모두의 아미노산이 이용될 수 있다. 그러나, 보존성 치환을 갖는 PRAME 작제물이 또한 이용될 수 있다. 한 구체예에서, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9개 또는 그 초과의 아미노산이 치환될 수 있다. PRAME 작제물은 추가로 또는 대안적으로 야생형 PRAME 서열과 비교하는 경우 아미노산 서열 내에 결실 또는 삽입을 함유할 수 있다. 한 구체예에서, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9개 또는 그 초과의 아미노산이 삽입되거나 결실될 수 있다.
한 구체예에서, PRAME 항원의 서열은 자연 발생 PRAME과 80% 또는 80% 초과, 예를 들어, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일할 수 있다.
한 양태에서, 본 발명에서 사용하기 위한 PRAME 항원은 본원에 기재된 융합 파트너 단백질 및 PRAME 항원 또는 이들의 면역원성 단편을 포함한다.
한 구체예에서, PRAME 항원은, a) PRAME 또는 이의 면역원성 단편, 및 b) 단백질 D로부터 유래된 이종성 융합 파트너를 포함하는 융합 단백질이며, 상기 융합 단백질은 단백질 D의 분비 서열(신호 서열)을 포함하지 않는다. 단백질 D의 분비 또는 신호 서열 또는 분비 신호는 단백질 D의 N-말단의 19개의 아미노산을 의미한다. 따라서, 본 발명의 융합 파트너 단백질은 나머지 전장 단백질 D 단백질을 포함할 수 있거나, 대략 단백질 D의 나머지 N-말단 1/3을 포함할 수 있다. 예를 들어, 단백질 D의 나머지 N-말단 1/3은 단백질 D의 대략 또는 약 아미노산 20 내지 127을 포함할 수 있다. 한 구체예에서, 단백질 D 서열은 단백질 D의 N-말단 아미노산 20 내지 127을 포함한다.
항원 및 융합 파트너는 화학적으로 컨쥬게이션될 수 있거나, 재조합 융합 단백질로 발현될 수 있다. 항원 및 파트너가 재조합 융합 단백질로 발현되는 한 구체예에서, 이는 융합되지 않은 단백질에 비해 발현 시스템에서 생성되는 수준을 증가시킬 수 있다. 따라서, 융합 파트너는 T 헬퍼 에피토프, 예를 들어, 인간에 의해 인지되는 T 헬퍼 에피토프를 제공하는 것을 도울 수 있고/있거나(면역학적 융합 파트너), 융합 파트너는 자연 재조합 단백질보다 높은 수율로 단백질을 발현시키는 것을 도울 수 있다(발현 증강자). 한 구체예에서, 융합 파트너는 면역학적 융합 파트너 및 발현 증강 파트너 둘 모두일 수 있다.
본 발명의 한 구체예에서, 사용될 수 있는 면역학적 융합 파트너는 단백질 D, 그람-음성 박테리아의 표면 단백질, 헤모필루스 인플루엔자 B(W091/18926) 또는 이들의 유도체로부터 유래된다. 단백질 D 유도체는 단백질의 처음 1/3, 또는 단백질의 대략 처음 1/3을 포함할 수 있다. 한 구체예에서, 단백질 D의 처음 109개의 잔기가 추가의 외인성 T-세포 에피토프를 갖는 PRAME 항원을 제공하고, 이. 콜리(E. coli)에서의 발현 수준을 증가시키기 위한 융합 파트너(따라서, 또한 발현 증강자로 작용함)로 사용될 수 있다. 한 대안적 구체예에서, 단백질 D 유도체는 처음 N-말단의 100-110개의 아미노산 또는 약 또는 대략 처음 N-말단의 100-110개의 아미노산을 포함할 수 있다. 한 구체예에서, 단백질 D 또는 이의 유도체는 지질화될 수 있고, 지질단백질 D가 사용될 수 있고; 지질 꼬리는 항원 제시 세포로의 항원의 최적 제시를 보장할 수 있다.
한 구체예에서, PRAME은 N-말단으로부터 C-말단으로 아미노산 Met-Asp-Pro - 단백질 D의 아미노산 20 내지 127 - PRAME(509개의 아미노산 또는 본원에 기재된 구체예)을 포함하는 융합 단백질인 단백질 D-PRAME/His일 수 있고, 임의로 생성 과정 동안 융합 단백질의 정제를 촉진할 수 있는 링커 및 폴리히스티딘 꼬리(His)가 포함될 수 있다.
PRAME은 N-말단에 단백질 D 및 C-말단에 7개의 히스티딘 잔기(His 꼬리)의 서열을 갖는 융합 단백질로 발현될 수 있다.
본 발명의 한 구체예에서, 면역요법제는 단백질 D-PRAME 융합 단백질을 포함한다.
본 발명의 한 추가 구체예에서, 면역요법제는 본원에 기재된 PRAME 특이적 종양 관련 항원을 엔코딩하는 핵산 분자를 포함한다. 본 발명의 한 구체예에서, 서열은 적합한 발현 벡터로 삽입될 수 있고, DNA/RNA 예방접종에 사용될 수 있다. 핵산을 발현하는 미생물 벡터가 또한 벡터로 전달되는 면역치료요법제(immunotherapeutic)로 사용될 수 있다.
적합한 바이러스 벡터의 예는 레트로바이러스, 렌티바이러스, 아데노바이러스, 아데노-관련 바이러스, 단순헤르페스 바이러스를 포함하는 헤르페스 바이러스, 알파-바이러스, 폭스 바이러스, 예를 들어, 카나리폭스(Canarypox) 및 백시니아-바이러스 기반 시스템을 포함한다. 이들 바이러스를 이용한 유전자 전달 기술은 당업자에게 공지되어 있다. 레트로바이러스 벡터는, 예를 들어, 숙주 유전체로 본 발명의 폴리누클레오티드를 안정적으로 통합시키는데 사용될 수 있으나, 상기 재조합은 바람직하지 않다. 대조적으로, 복제-불능 아데노바이러스 벡터는 에피솜으로 남아 있으며, 따라서 일시적 발현을 가능케 한다. 곤충 세포(예를 들어, 배큘로바이러스 벡터), 인간 세포, 효모 또는 박테리아에서 발현을 유도할 수 있는 벡터가, 예를 들어, 서브유닛 백신으로 또는 면역검정에서 사용하기 위한 본 발명의 폴리누클레오티드에 의해 엔코딩되는 많은 양의 PRAME 단백질을 생성시키기 위해 이용될 수 있다.
핵산 서열을 수득하기 위한 통상적인 재조합 기술, 및 발현 벡터의 생성은 문헌[Maniatis et al ., Molecular Cloning - A Laboratory Manual; Cold Spring Harbor, 1982-1989]에 기재되어 있다.
단백질 기반 면역요법을 위해, 본 발명의 단백질은 액체 형태 또는 동결건조된 형태로 제공된다.
각각의 인간 용량은 1 내지 1000 μg의 단백질을 포함할 수 있다. 한 구체예에서, 용량은 30-300 μg의 단백질을 포함할 수 있다.
본 발명의 한 구체예에서, PRAME 항원을 포함하는 조성물은 애쥬번트를 추가로 포함할 수 있다. 예를 들어, 애쥬번트는 3D-MPL; 알루미늄 염; CpG 함유 올리고누클레오티드; 사포닌-함유 애쥬번트, 예를 들어, QS21 또는 ISCOM; 수중유 에멀젼; 및 리포솜 중 하나 이상 또는 이들의 조합물을 포함할 수 있다. 한 구체예에서, 애쥬번트는 리포솜 제형 내에 3D-MPL, CpG 함유 올리고누클레오티드 및 QS21을 포함할 수 있다.
본 발명에서 사용하기에 적합한 백신 애쥬번트, 예를 들어, 프로인트 불완전 애쥬번트(Freund's Incomplete Adjuvant) 및 완전 애쥬번트(Difco Laboratories, Detroit, Ml); Merck Adjuvant 65(Merck and Company, Inc., Rahway, NJ); AS-2(SmithKline Beecham, Philadelphia, PA); 알루미늄 염, 예를 들어, 알루미늄 하이드록시드 겔(백반) 또는 알루미늄 포스페이트; 칼슘, 철 또는 아연의 염; 아실화된 티로신의 불용성 현탁액; 아실화된 당; 양이온적 또는 음이온적으로 유도체화된 다당류; 폴리포스파젠; 생물분해성 미세구; 모노포스포릴 지질 A 및 quil A가 시판된다. 사이토카인, 예를 들어, GM-CSF 또는 인터루킨-2, -7, 또는 -12, 및 케모카인이 또한 애쥬번트로 사용될 수 있다.
본 발명에서 사용하기 위한 애쥬번트는 모노포스포릴 지질 A의 조합물, 예를 들어, 알루미늄 염과 함께 3-데-O-아실화된 모노포스포릴 지질 A(3D-MPL)를 포함할 수 있다. 3D-MPL 또는 기타 toll 유사 수용체 4(TLR4) 리간드, 예를 들어, 아미노알킬 글루코사미니드 포스페이트가 또한 사용될 수 있다.
사용될 수 있는 기타 공지된 애쥬번트는 TLR9 길항제, 예를 들어, 메틸화되지 않은 CpG 함유 올리고누클레오티드를 포함한다. 올리고누클레오티드는 CpG 디누클레오티드가 메틸화되지 않은 것을 특징으로 한다. 이러한 올리고누클레오티드는 널리 공지되어 있고, 예를 들어, WO 96/02555호에 기재되어 있다.
제형은 추가로 수중유 에멀젼 및/또는 토코페롤을 포함할 수 있다.
사용될 수 있는 또 다른 애쥬번트는 사포닌, 예를 들어, 단독으로 사용되거나 다른 애쥬번트와 함께 사용될 수 있는 QS21(Aquila Biopharmaceuticals Inc., Framingham, MA)이다. 예를 들어, 한 시스템은 WO 94/00153호에 기재된 바와 같은 모노포스포릴 지질 A 및 사포닌 유도체의 조합물, 예를 들어, QS21 및 3D-MPL의 조합물, 또는 WO 96/33739호에 기재된 바와 같은 QS21이 콜레스테롤로 켄칭된 덜 반응원성인 조성물을 포함한다. 다른 제형은 수중유 에멀젼 및 토코페롤을 포함한다. 본 발명에서 사용될 수 있는 한 애쥬번트 제형은 수중유 에멀젼 중 QS21, 3D-MPL 및 토코페롤을 포함하며, 이는 WO 95/17210호에 기재되어 있다.
또 다른 구체예에서, 애쥬번트는 리포솜 조성물 내에서 제형화될 수 있다. 사용된 3D-MPL의 양은 일반적으로 적으나, 면역요법제에 따라, 제형은 용량 당 1-1000μg, 바람직하게는 용량 당 1-500μg, 더욱 바람직하게는 용량 당 1 내지 100μg의 범위로 존재할 수 있다.
한 구체예에서, 애쥬번트는 3D-MPL, QS21 및 면역자극성 CpG 올리고누클레오티드 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 한 구체예에서, 3개 모두의 면역자극제가 존재한다. 또 다른 구체예에서, 3D-MPL 및 Qs21은 수중유 에멀젼에 내에 제공되며, CpG 올리고누클레오티드의 부재하에 제공된다. 본 발명의 한 구체예에서, 애쥬번트는 WO 95/17210호에 기재된 바와 같이 리포솜 제형 또는 수중유 에멀젼 내에 제공되는 CpG 올리고누클레오티드, 3D-MPL, 및 QS21을 포함한다.
본 발명의 애쥬번트 또는 면역치료요법제 중의 CpG 또는 면역자극성 올리고누클레오티드의 양은 일반적으로 적으나, 면역치료요법제에 따라, 제형은 용량 당 1-1000μg, 바람직하게는 용량 당 1-500μg, 더욱 바람직하게는 용량 당 1 내지 100μg의 범위로 존재할 수 있다.
본 발명의 애쥬번트에서 사용하기 위한 사포닌의 양은 용량 당 1-1000μg, 바람직하게는 용량 당 1-500μg, 더욱 바람직하게는 용량 당 1-250μg, 가장 바람직하게는 용량 당 1 내지 100μg의 범위로 존재할 수 있다.
일반적으로, 각각의 인간 용량은 0.1-1000 μg의 항원, 예를 들어, 0.1-500 μg, 0.1-100 μg, 또는 0.1 내지 50 μg을 포함할 수 있다. 특정 면역요법제에 대한 최적량은 예방접종된 피검체에서의 적절한 면역 반응의 관찰을 포함하는 표준 연구에 의해 확인될 수 있다. 최초 예방접종 후, 피검체에 적절한 간격으로 1회 또는 수회의 부스터 면역화가 제공될 수 있다.
다른 적합한 애쥬번트는 Montanide ISA 720(Seppic, France), SAF(Chiron, California, United States), ISCOMS(CSL), MF-59(Chiron), Ribi Detox, RC-529(GSK, Hamilton, MT) 및 다른 아미노알킬 글루코사미니드 4-포스페이트(AGP)를 포함한다.
본 명세서 및 후속되는 청구항 전체에 걸쳐, 문맥이 달리 요구하지 않는 한, 용어 "-들을 포함하다", 및 "-을 포함하다" 및 "포함하는"과 같은 변형은 언급된 정수 또는 언급된 정수의 단계 또는 그룹 또는 단계들의 포함을 의미하나, 임의의 다른 정수 또는 정수의 단계 또는 그룹 또는 단계들을 배제하지는 않음이 이해될 것이다.
본 발명은 하기 비제한적인 도면 및 실시예를 참조로 하여 추가로 기재될 것이다.
실시예
실시예 1 - AM 및 GSK RealTime PRAME 올리고 설계의 분석 민감도 비교
목적
본 연구의 목적은 RealTime PRAME 검정에 대한 Abbott Molecular(AM) 및 GlaxoSmithKline(GSK) 올리고 설계의 분석 민감도를 비교하기 위한 것이었다. 이를 위해, 고정된 수준의 베타-액틴 RNA 및 감소하는 수준의 PRAME RNA를 함유하는 희석 패널을 시험하기 위해 각각의 올리고 설계를 이용하였다. 이러한 설계를 거쳐, 별개의 ΔCt 값(PRAME Ct 마이너스 액틴 Ct)을 갖는 패널 일원이 평가될 것이다.
방법
평가 중인 GSK 올리고누클레오티드 세트는 PRAME mRNA 엑손 5/6 영역의 역전사, PCR 증폭, 및 실시간 형광 검출을 유도하는 하나의 PRAME 정방향 프라이머(SEQ ID NO:5), 하나의 PRAME 역방향 프라이머(SEQ ID NO:6), 및 하나의 PRAME 프로브(SEQ ID NO:7)를 함유한다. GSK 올리고누클레오티드 세트는 또한 베타-액틴(내인성 대조군) mRNA 엑손 5/6 영역의 역전사, PCR 증폭, 및 실시간 형광 검출을 유도하는 하나의 베타-액틴 정방향 프라이머, 하나의 베타-액틴 역방향 프라이머, 및 하나의 베타-액틴 프로브를 함유한다.
평가 중인 AM 올리고누클레오티드 세트는 PRAME mRNA 엑손 3/4 영역의 역전사, PCR 증폭, 및 실시간 형광 검출을 유도하는 하나의 PRAME 정방향 프라이머, 하나의 PRAME 역방향 프라이머, 및 하나의 PRAME 프로브를 함유한다. AM 올리고누클레오티드 세트는 또한 베타-액틴 mRNA 엑손 4/5 영역의 역전사, PCR 증폭, 및 실시간 형광 검출을 유도하는 하나의 베타-액틴 정방향 프라이머, 하나의 베타-액틴 역방향 프라이머, 및 하나의 베타-액틴 프로브를 함유한다.
AM 및 GSK 올리고 설계의 성능을 직접 비교하기 위해, 2개의 마스터 믹스를 제조하였다. 프라이머 및 프로브를 제외하고, 각각의 마스터 믹스는 동일 농도의 동일 로트(lot)의 PCR 시약을 함유하였다.
본 실험을 위한 시험 샘플을 제조하기 위해, 포르말린 고정, 파라핀 포매(FFPE)된 A549 세포로부터의 PRAME 양성 RNA를 PRAME mRNA 무표지 세포주 MDA-MB-231로부터의 30 ng/rxn의 RNA 중에 점진적으로 희석시켰다. 100% 미만의 검출을 발생시킨 최소 PRAME RNA 농도를 달성하기 위해 A549 RNA(3,000 pg 내지 0.3 pg/rxn)의 5개의 10배 연속 희석액을 생성시켰다. A549 RNA가 없는 30 ng/rxn의 MDA-MB-231 RNA를 PRAME-음성 대조군으로 포함시켰다.
PRAME 및 베타-액틴 수준을 평가하기 위해 각각의 희석 수준을 동일한 m2000rt 기계에서 각각의 마스터 믹스에 대해 4개의 복제물(replicate)로 시험하였다.
선형 회귀를 A549 농도(pg/rxn)의 Log10에 비한 평균 PRAME Ct 값으로부터 계산하였다.
결과
각각의 희석 패널에 대한 PRAME 검출률은 둘 모두의 올리고 설계에 대해 유사하였고, 각각 30 pg A549 RNA/rxn에서 100% 검출(4개의 복제물 중 4개) 및 3 pg A549 RNA/rxn에서 50% 검출(4개의 복제물 중 2개)을 나타내었다. 0.3 pg의 A549 RNA/rxn에서, GSK 설계는 임의의 PRAME을 검출하지 않은 반면, AM 설계는 하나의 복제물에서 PRAME을 검출하였다. PRAME은 어느 설계에 대해서도 MDA-MB-231 음성 대조군에서 검출되지 않았다. 각각의 올리고 세트에 의해 발생된 PRAME Ct 값은 검출가능한 패널 범위에 걸쳐 선형(r2 > 0.99)이었다. 결과는 표 2 및 도 1 및 2에 제시되어 있다.
표 2
Figure pct00002
결론
가장 높은 희석액에서, PRAME이 검출되는 샘플의 Ct는 Abbott 프라이머보다 GSK 프라이머에 대해 더 낮다. 따라서, GSK 프라이머 세트의 민감도는 AM 프라이머 세트의 민감도보다 세포주 RNA에 대해 더 높다.
100% 효율을 갖는 PCR 반응에 대한 Ct 대 log10(농도)의 회귀의 이론적 기울기는 -3.322이다. PCR 반응의 효율(%)은 식 Eff% = ((10^(-1/기울기))-1)*100를 이용하여 계산될 수 있다. Abbott 프라이머에 대한 회귀선의 기울기는 -4.5063이며, 이는 66.7%의 PCR 효율에 해당한다(도 1). GSK 프라이머에 대해, 기울기는 -3.13이며, 이는 108.7%의 PCR 효율에 해당한다(도 2). GSK 프라이머의 효율은 Abbott 프라이머의 효율보다 이론적 효율에 더 가깝다. 90% 미만의 효율을 갖는 PCR 반응은 재설계되어야 하는 것이 또한 일반적으로 수용된다(예를 들어, http://www.dorak.info/genetics/glosrt.html).
실시예 2 - 7개의 FFPE NSCLC 샘플을 이용한 Abbott 및 GSK 올리고의 비교
목적
본 실험의 목적은 RealTime PRAME 검정에 대한 Abbott Molecular(AM) 및 GlaxoSmithKline(GSK) 올리고 설계의 성능을 비교하는 것이었다. 이를 위해, 7개의 대량절제되지 않은(non-macrodissected) 포르말린-고정, 파라핀-포매(FFPE)된 비소세포폐암(NSCLC) 표본으로부터의 RNA 용출물을 시험하기 위해 각각의 올리고 설계를 이용하였다.
방법
평가 중인 GSK 올리고누클레오티드 세트는 PRAME mRNA 엑손 5/6 영역의 역전사, PCR 증폭, 및 실시간 형광 검출을 유도하는 하나의 PRAME 정방향 프라이머, 하나의 PRAME 역방향 프라이머, 및 하나의 PRAME 프로브를 함유한다. GSK 올리고누클레오티드 세트는 또한 베타-액틴(내인성 대조군) mRNA 엑손 5/6 영역의 역전사, PCR 증폭, 및 실시간 형광 검출을 유도하는 하나의 베타-액틴 정방향 프라이머, 하나의 베타-액틴 역방향 프라이머, 및 하나의 베타-액틴 프로브를 함유한다.
평가 중인 AM 올리고누클레오티드 세트는 PRAME mRNA 엑손 3/4 영역의 역전사, PCR 증폭, 및 실시간 형광 검출을 유도하는 하나의 PRAME 정방향 프라이머, 하나의 PRAME 역방향 프라이머, 및 하나의 PRAME 프로브를 함유한다. AM 올리고누클레오티드 세트는 또한 베타-액틴 mRNA 엑손 4/5 영역의 역전사, PCR 증폭, 및 실시간 형광 검출을 유도하는 하나의 베타-액틴 정방향 프라이머, 하나의 베타-액틴 역방향 프라이머, 및 하나의 베타-액틴 프로브를 함유한다.
AM 및 GSK 올리고 설계의 실시간 PCR 성능을 직접 비교하기 위해, 2개의 마스터 믹스를 제조하였다. 프라이머 및 프로브를 제외하고, 각각의 마스터 믹스는 동일 농도의 동일 로트의 PCR 시약을 함유하였다.
본 실험에 대한 시험 샘플을 제조하기 위해, 7개의 FFPE NSCLC 표본 각각으로부터의 조직 섹션을 탈파라핀화시키고, Nuclear Fast Red로 염색시켰다. 이후, RNA를 전체-조직 섹션(대량절제되지 않은 섹션)으로부터 추출하고, Nanodrop 분광광도계를 이용하여 정량하였다.
각각의 표본으로부터의 10 ng의 RNA를 PRAME 및 베타-액틴 수준을 평가하기 위해 m2000rt 기계에서 각각의 마스터 믹스에 대해 3개의 복제물로 시험하였다.
결과
시험된 각각의 PCR 복제물에 대해, AM 및 GSK 올리고 세트로 수득된 PRAME 주기 역치(Ct) 및 ΔCt(PRAME Ct 마이너스 베타-액틴 Ct)가 표 3 및 4에 제시된다. 시험된 7개의 샘플 중 3개에 대해, PRAME 신호(Ct)는 어느 올리고 세트로도 검출가능하지 않았다. 검출가능한 PRAME 신호를 발생시킨 4개의 샘플 중, 하나는 어느 하나의 올리고 세트에 대해 검출된 3개 모두의 복제물을 가졌고; 하나는 AM 올리고에 의해 검출된 하나의 복제물 및 GSK 올리고에 의해 검출된 3개의 복제물을 가졌고; 2개는 AM 올리고에 의해 검출된 2개의 복제물 및 GSK 올리고에 의해 검출된 하나의 복제물을 가졌다.
표 3
Figure pct00003
표 4
Figure pct00004
결론
가장 높은 희석액에서, GSK 올리고는 AM 검정보다 낮은 Ct 및 낮은 델타 Ct 값에서 PRAME 표적을 검출한다. 따라서, 임상 샘플에 대한 GSK 검정의 민감도는 AM 검정의 민감도보다 낫다.
실시예 3 - 50개의 FFPE NSCLC 샘플을 이용한 Abbott 및 GSK 올리고의 비교
목적
본 연구의 목적은 RealTime PRAME 검정을 위한 Abbott Molecular(AM) 및 GlaxoSmithKline(GSK) 올리고 설계의 성능을 비교하는 것이었다. 이를 위해, 50개의 대량절제되지 않은 포르말린-고정, 파라핀-포매(FFPE)된 비소세포폐암(NSCLC) 표본으로부터의 RNA 용출물을 시험하기 위해 각각의 올리고 설계를 이용하였다.
방법
평가 중인 GSK 올리고누클레오티드 세트는 PRAME mRNA 엑손 5/6 영역의 역전사, PCR 증폭, 및 실시간 형광 검출을 유도하는 하나의 PRAME 정방향 프라이머, 하나의 PRAME 역방향 프라이머, 및 하나의 PRAME 프로브를 함유한다.
평가 중인 AM 올리고누클레오티드 세트는 PRAME mRNA 엑손 3/4 영역의 역전사, PCR 증폭, 및 실시간 형광 검출을 유도하는 하나의 PRAME 정방향 프라이머, 하나의 PRAME 역방향 프라이머, 및 하나의 PRAME 프로브를 함유한다.
본 연구에서, 둘 모두의 올리고누클레오티드 세트는 또한 베타-액틴(내인성 대조군) mRNA 엑손 5/6 영역의 역전사, PCR 증폭, 및 실시간 형광 검출을 유도하는 하나의 베타-액틴 정방향 프라이머, 하나의 베타-액틴 역방향 프라이머, 및 하나의 베타-액틴 프로브를 함유한다.
AM 및 GSK 올리고 설계의 실시간 PCR 성능을 직접 비교하기 위해, 2개의 마스터 믹스를 제조하였다. PRAME 프라이머 및 프로브를 제외하고, 각각의 마스터 믹스는 동일 농도의 동일 로트의 PCR 시약을 함유하였다.
본 실험에 대한 시험 샘플을 제조하기 위해, 50개의 FFPE NSCLC 표본 각각으로부터의 조직 섹션을 탈파라핀화시키고, Nuclear Fast Red로 염색시키고, 대량절제하여 적어도 50mm2의 영역에서 최소 50% 종양 세포를 달성시켰다. 이후, RNA를 각각의 대량절제된 표본으로부터 추출하고, Nanodrop 분광광도계를 이용하여 정량하였다.
50 ng의 RNA를, 충분한 샘플의 결핍으로 인해 단지 하나의 복제물이 시험된 2개의 표본, 및 충분한 샘플의 결핍으로 인해 25 ng이 2개의 복제물 각각에서 시험된 1개의 표본을 제외하고는, PRAME 및 베타-액틴 수준을 평가하기 위해 m2000rt 기계에서 각각의 마스터 믹스에 대해 2개의 복제물로 시험하였다. PCR 플레이트에서의 공간 제한으로 인해, 표본을 각각의 마스터 믹스에 대해 2개의 별개의 배치로 시험하였다.
결과
50개의 표본 중 48개에 대해, 시험된 PCR 복제물 100%에서 AM 올리고 세트는 PRAME 신호(Ct)를 검출하였다. 나머지 2개의 표본에 대해, 2개의 PCR 복제물 중 1개에서 AM 올리고 세트는 PRAME 신호를 검출하였다. AM 올리고 세트는 모든 표본에 대해 시험된 모든 PCR 복제물에서 베타-액틴 신호를 검출하였다. GSK 올리고 세트는 모든 표본에 대해 시험된 모든 PCR 복제물에서 PRAME 신호 및 베타-액틴 신호를 검출하였다.
시험된 각각의 표본에 대해, AM 및 GSK 올리고 세트로 수득된 평균 PRAME 주기 역치(Ct), 평균 베타-액틴 Ct, 및 ΔCt(평균 PRAME Ct 마이너스 평균 베타-액틴 Ct)가 표 5 및 6에 제시된다.
AM 대 GSK 올리고 세트로 수득된 PRAME Ct 결과에 대한 상관관계 분석이 도 3에 도시된다.
표 5
Figure pct00005
표 6
Figure pct00006
결론
임상 샘플 중 PRAME의 검출률은 AM 검정에 대해 96%이고, GSK 검정에 대해 100%이다.
GSK Ct 값 대 AM Ct 값의 회귀의 절편은 2.2이다. 따라서, 임상 샘플에서의 PRAME의 검출은 AM 검정에 대해서보다 GSK 검정에 대해 평균 2.2 Ct 더 일찍 발생한다. 이는 임상 샘플에 대한 GSK 검정의 보다 나은 민감도를 입증한다.
GSK Ct 값 대 AM Ct 값의 회귀의 기울기는 0.8675이다. GSK 및 PRAME 검정의 동치(equivalence)는 1의 기울기를 발생시킨다. 이는 PRAME 농도가 감소됨에 따라 AM 검정에 대한 Ct 값이 GSK 검정의 Ct 값보다 더 신속히 증가(13.3%)하는 것을 의미한다. 이는 또한 GSK 프라이머의 보다 나은 성능을 강조한다.
서열 목록
Figure pct00007
Figure pct00008
SEQUENCE LISTING <110> GlaxoSmithKline Biologicals S.A. <120> METHOD <130> VB64750FF <150> 1114919.2 <151> 2011-08-30 <160> 7 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 1 ccatgacaaa gaagcgaaaa 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 2 catctggccc aggtaaggag 20 <210> 3 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 3 ctgtactcat ttccagagcc aga 23 <210> 4 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 4 tattgagaga gggtttccaa ggggtt 26 <210> 5 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 5 gaggccgcct ggatcag 17 <210> 6 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 6 cggcagttag ttattgagag ggttt 25 <210> 7 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PRAME probe <400> 7 tgctcaggca cgtgat 16

Claims (19)

  1. SEQ ID NO:5 내지 7 중 임의의 SEQ ID NO의 누클레오티드 서열을 포함하는 올리고누클레오티드.
  2. SEQ ID NO:5 내지 7 중 임의의 SEQ ID NO의 누클레오티드 서열을 포함하는 프라이머.
  3. SEQ ID NO:5 및 6을 포함하는 프라이머 쌍.
  4. SEQ ID NO:5, 6 또는 7 중 임의의 SEQ ID NO의 누클레오티드 서열을 포함하는 프로브.
  5. (i) SEQ ID NO:5 및 SEQ ID NO:6을 포함하거나, 이들로 구성된 프라이머 쌍; 및
    (ii) SEQ ID NO:7을 포함하거나 이로 구성된 프보르를 포함하는, 키트.
  6. (i) SEQ ID NO:5를 포함하거나 이로 구성된 정방향 프라이머;
    (ii) SEQ ID NO:6을 포함하거나 이로 구성된 역방향 프라이머; 및
    (iii) SEQ ID NO:7을 포함하거나 이로 구성된 프로브를 포함하는, 키트.
  7. 생물학적 샘플로부터 수득되거나 이로부터 유래된 누클레오티드 서열과,
    (i) 본원에 기재된 적어도 하나의 프라이머;
    (ii) 본원에 기재된 일련의 프라이머;
    (iii) 본원에 기재된 프로브; 및/또는
    (iv) 본원에 기재된 키트를 접촉시키는 단계를 포함하는,
    PRAME 유전자가 생물학적 샘플에서 발현되는지 결정하는 방법.
  8. 환자-유래 생물학적 샘플로부터 수득되거나 이로부터 유래된 누클레오티드 서열과 하기 성분 (i) 내지 (iv) 중 하나 이상을 접촉시키는 단계를 포함하는 환자 진단 방법:
    (i) 본원에 기재된 적어도 하나의 프라이머;
    (ii) 본원에 기재된 일련의 프라이머;
    (iii) 본원에 기재된 프로브; 및/또는
    (iv) 본원에 기재된 키트.
  9. 환자-유래 생물학적 샘플로부터 수득되거나 이로부터 유래된 누클레오티드 서열과 하기 성분 (i) 내지 (iv) 중 하나 이상을 접촉시키는 단계를 포함하는, 환자-유래 생물학적 샘플에서 PRAME 양성 종양 조직의 존재 또는 부재를 결정하는 방법:
    (i)본원에 기재된 적어도 하나의 프라이머;
    (ii) 본원에 기재된 일련의 프라이머;
    (iii) 본원에 기재된 프로브; 및/또는
    (iv) 본원에 기재된 키트.
  10. 제 7항 내지 제 9항 중 어느 한 항에 있어서, 누클레오티드 서열을 증폭시키고, 샘플 내에서 증폭된 누클레오티드 서열을 검출하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  11. 제 7항 내지 제 9항 중 어느 한 항에 있어서, 누클레오티드 서열이 성분 (iii)에 하이브리드화되는지 검출하기 위한 제자리부합법(in situ hybridisation)을 이용하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  12. 제 7항 내지 제 11항 중 어느 한 항에 있어서, 생물학적 샘플이 포르말린-고정, 파라핀-포매(Formalin-Fixed, Paraffin-Embedded) 조직인 방법.
  13. PRAME 양성 종양 조직을 갖는 환자를 선택하기 위해 제 7항 내지 제 12항 중 어느 한 항의 방법을 이용한 후, 상기 환자에 PRAME 면역요법제를 투여하는 것을 포함하는, 환자를 치료하는 방법.
  14. 환자가 제 7항 내지 제 12항 중 어느 한 항의 방법을 이용하여 PRAME 발현 종양 조직을 갖는 것으로 확인된, PRAME 발현 종양으로 고통받는 환자의 치료에 사용하기 위한 PRAME 면역요법제를 포함하는 조성물.
  15. 제 7항 내지 제 14항 중 어느 한 항에 있어서, PRAME 면역요법제가 PRAME 항원 또는 이의 펩티드를 포함하는 방법 또는 조성물.
  16. 제 15항에 있어서, PRAME 항원 또는 펩티드가 담체 단백질에 융합되거나 컨쥬게이션된 방법 또는 조성물.
  17. 제 16항에 있어서, 담체 단백질이 단백질 D, NS1 또는 CLytA 또는 이들의 단편으로부터 선택되는 방법 또는 조성물.
  18. 제 7항 내지 제 17항 중 어느 한 항에 있어서, 조성물이 애쥬번트를 추가로 포함하는 방법 또는 조성물.
  19. 제 18항에 있어서, 애쥬번트가 3D-MPL; 알루미늄 염; CpG 함유 올리고누클레오티드; 사포닌-함유 애쥬번트, 예를 들어, QS21 또는 ISCOM; 수중유 에멀젼; 및 리포솜 중 하나 이상 또는 이들의 조합물을 포함하는 방법 또는 조성물.
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