KR20140051741A - 유채 품종 특이적 마커, 프라이머 및 이의 용도 - Google Patents

유채 품종 특이적 마커, 프라이머 및 이의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 유채 품종 특이적 마커, 프라이머 및 이의 용도에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 유채 탐라 품종 판별용 마커, 판별용 PCR 프라이머 세트 및 이의 용도에 관한 것이다. 따라서 본 발명은 유채 탐라 품종을 판별하기 위한 마커, 프라이머 세트, 상기 프라이머 세트를 이용한 판별방법 및 판별용 키트를 제공함으로서, 유채 탐라 품종을 판별하는데 효과적이다.

Description

유채 품종 특이적 마커, 프라이머 및 이의 용도{Novel marker and primer to identify and discriminate cultivars in Brassica napus L. and use thereof}
본 발명은 유채 품종 특이적 마커, 프라이머 및 이의 용도에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 유채 탐라 품종 판별용 마커, 판별용 PCR 프라이머 세트 및 이의 용도에 관한 것이다.
육종에 이용되고 있는 대부분의 주요 작물 및 소재배 작물에서 해마다 많은 양의 유전자원이 수집되고 있다. 그러나 이에 반해 유전자원에 대한 평가는 충분히 이루어지지 않고 있는 실정이다. 수집된 유전자원의 종간 및 아종간 품종의 신속한 판별은 정확한 유전자원의 관리 및 보호를 위하여 매우 중요하다. 또한 품종의 판별과 함께 유전자원의 유형 형질 탐색과 분류, 그리고 유연관계의 규명은 유전자원의 보존이나 신품종의 창출 및 작물의 개량에 있어서 매우 중요하다.
최근 분자생물학의 급속한 발전으로 핵산(DNA) 수준에서 유전자원의 다양성(bio-diversity) 연구를 가능케 하는 다양한 DNA 다형성 검출용 마커들이 개발되었다. 이를 통해 유용 형질 탐색, 생물의 종 판별, 품종 분류·동정 및 집단 개체군의 유연관계 분석을 외부환경 등에 대하여 거의 영향을 받지 않고 간단하고 신속하게 수행할 수 있게 되었다. 지금까지 개발된 다형성 검출용 마커에는 RAPD(randomly amplified polymorphic DNAs) 마커, AFLP(amplified fragment length polymorphic DNA) 마커, 초위성체(microsatellite) 마커, SSR(simple sequence repeat) 마커 등이 있다.
전이인자(transposable element; TE)는 게놈의 한 장소에서 다른 장소로 이동할 수 있는 DNA 절편을 말하는 것으로서, 이들은 전이(transposition)에 의해 염색체 내에서 이곳 저곳으로 옮겨 다니므로 유전적 다양성(genetic diversity)을 일으키는 중요한 요소이다. 전이인자는 트랜스포존(transposon)이라고도 하는데, 그 길이는 수백에서 수천 개의 염기서열에 이른다. 각각의 전이인자는 자신의 이동에 필요한 DNA를 절단하고 연결시킬 수 있는 전이효소(transposase) 유전자를 지니고 있으며, 각 전이인자들은 상기 전이효소에 의해 인식되는 DNA 염기서열을 가지고 있다. 일부 전이인자들은 그 내부에 앰피실린(ampicillin)이나 테트라사이클린(tetracycline)과 같은 항생제를 불활성화시키는 효소를 암호화하는 유전자(ampR, terR)를 지니고 있다. 또한, 어떤 전이인자들은 전사 프로모터를 지니고 있어, 전이인자가 염색체 내 특정 유전자 근처에 삽입될 경우, 삽입부 근처에 위치한 유전자의 발현 양을 변화시키거나, 특정 조건 하에서도 유전자가 발현할 수 있게 한다.
전이인자는 클래스 1(class 1)과 클래스 2(class 2)로 분류되는데, 전자에 속하는 전이인자들은 RNA 매개체(intermediate)를 통하여 숙주의 염색체 내로 삽입되고(Kumar A., and J. L. Benntzen., Annu. Rev. Genet ., 33:479-532, 1999), 후자에 속하는 전이인자들은 DNA 매개체를 통하여 숙주의 염색체 내로 삽입된다. 클래스 1에 속하는 전이인자로는 레트로트랜스포존(retrotransposon), SINE(short interspersed nuclear element) 및 LINE(long interspersed nuclear element)가 있으며, 이들은 게놈 내에서 매우 높은 복제수(copy number)로 존재한다. 한편, 클래스 2에 속하는 전이인자들은 다시 전이능력(transposability)에 따라 Ac와 Spm과 같은 자발적 인자(autonomous elements)와 Ds와 dSpm과 같은 비자발적 인자(nonautonomous elements)로 나뉜다. 자발적 인자들은 전이(transposition)에 필요한 모든 요소를 암호화하기 때문에 그 자체가 전이될 수 있다. 그러나 비자발적인 인자들은 대부분 자발적 인자들의 결실 유도체이거나 중요한 조절 서열(regulatory sequence)이 메틸화에 의해 유전적으로 불활성화되어 있기 때문에, 전이를 위해서는 반드시 게놈 내 자발적 인자의 존재를 필요로 한다(Wessler, S. R., et al., Science, 242: 399-405. 1988). 클래스 2에 속하는 전이인자들은 전이능력과는 상관없이 짧은 말단 역위 반복 서열(terminal inverted repeat, 이하 'TIR'이라 함)을 가진다는 특징이 있으며, 보존된 메카니즘에 의한 DNA 매개체를 통하여 전이되기 때문에 게놈 내에서 비교적 낮은 복제수로 존재한다(보통 게놈 반수체 당 <100 카피).
유채로 알려진 Brassica napus는 전세계적으로 중요한 기름 농작물이다. B. napus (2n=4x=38, AACC)는 B. rapa (2n=2x=20, AA)와 B. oleracea (2n=2x=18, CC)의 교잡에 의해 유래된 이질사배체(alloteotraploid)이다.
화석연료 생산의 한계는 디젤 연료로서의 유채오일에 높은 과학적 관심을 불러왔다. 농업경제학 및 산업에서 이의 중요성 때문에, Multinational Brassica Genome Project (MBGP)에 의해 유채의 게놈이 시퀀싱 되었으며, 게놈의 정보는 웹(http://www.brassica.info/)에서 이용이 가능하다.
유채는 타가수분식물(cross-pollinating plant)이므로, 꽃가루 오염은 새로운 품종 개발 및 이미 개발된 품종의 유전적 순도를 유지하는데 문제가 되어왔다. 따라서, 품종의 유전마커가 절실히 필요하다.
이에 본 발명인들은 transposon display를 이용한 Ti-SCAR (Transposon insertion sequence characterized amplified region)을 개발하기 위해, 한국 유채 품종의 Ti-SCAR markers를 CACTA transposon의 서열을 이용하여 개발하였다.
따라서 본 발명의 목적은 서열번호 23으로 표시되는 뉴클레오티드 및 이들의 상보적인 폴리뉴클레오티드로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 폴리뉴클레오티드로 이루어진 유채 탐라 품종(Brassica napus L. cv. Tamra) 판별용 마커를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 서열번호 15 및 서열번호 18로 표시되는 염기서열을 갖는 유채 탐라 품종(Brassica napus L. cv. Tamra) 판별용 PCR 프라이머 세트를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 (a) 시료로부터 DNA를 분리하는 단계; (b) 분리된 상기 DNA를 주형으로 하고, 상기 프라이머 세트를 이용하여 PCR을 수행하는 단계; 및 (c) 상기 (b) 단계의 증폭된 PCR 산물을 전기영동으로 확인하는 단계를 포함하는 유채 탐라 품종(Brassica napus L. cv. Tamra) 판별 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 프라이머 세트를 포함하는 유채 탐라 품종(Brassica napus L. cv. Tamra) 판별용 키트를 제공하는 것이다.
상기 본 발명의 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 서열번호 23으로 표시되는 폴리뉴클레오티드 및 이와 상보적인 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 폴리뉴클레오티드로 이루어진 유채 탐라 품종(Brassica napus L. cv. Tamra) 판별용 마커를 제공한다.
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 서열번호 15 및 서열번호 18로 표시되는 염기서열을 갖는 유채 탐라 품종(Brassica napus L. cv. Tamra) 판별용 PCR 프라이머 세트를 제공한다.
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 (a) 시료로부터 DNA를 분리하는 단계; (b) 분리된 상기 DNA를 주형으로 하고, 제2항의 프라이머 세트를 이용하여 PCR을 수행하는 단계; 및 (c) 상기 (b) 단계의 증폭된 PCR 산물을 전기영동으로 확인하는 단계를 포함하는 유채 탐라 품종(Brassica napus L. cv. Tamra) 판별 방법을 제공한다.
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 상기 프라이머 세트를 포함하는 유채 탐라 품종(Brassica napus L. cv. Tamra) 판별용 키트를 제공한다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 서열번호 23으로 표시되는 뉴클레오티드 및 이들의 상보적인 폴리뉴클레오티드로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 폴리뉴클레오티드로 이루어진 유채 탐라 품종(Brassica napus L. cv. Tamra) 판별용 마커를 제공한다.
상기 마커를 제조하기 위해, 본 발명에서는 Transposon Display(TD) 방법을 사용하였다. TD(Transposon Display) 방법은 TE(Transposable element)의 삽입, 제거 다형성을 분석하는 기술로써, 기존의 AFLP(Amplified Fragment Length Polymorphism) 방법을 수정한 것이다. 이 방법의 모식도는 [도 1]에 표시하였다.
[도 1]의 그림으로 본 발명의 제조방법을 설명하자면, 유채로부터 gDNA를 분리하여, AFLP에서 통상적으로 쓰이는 제한효소로 절단한 후, 어댑터를 ligation 한다. 그 후, 유채 공통의 CACTA 전이인자를 특이적으로 인식하는 프라이머([도 1]의 P1 프라이머), 어댑터의 일부 또는 전부를 포함하는 프라이머([도 1]의 P2 프라이머)로 1차 PCR 반응을 진행한다. 상기 1차 PCR 반응 산물을 다시 P1 프라이머 및 P3 프라이머로 2차 PCR을 진행한다. P3 프라이머는 P2 프라이머에 비하여 업스트림(up stream)인 것을 특징으로 한다. 상기 2차 PCR 반응 산물의 염기서열 중 P3 서열을 제외한 나머지 서열이 본 발명의 마커가 된다.
본 발명에서는 유채 탐라 품종 판별용 마커를 제조하기 위한 P1 프라이머가 B-CAC-TIR1(서열번호 15) 이고, P2 프라이머는 KRMP-0(서열번호 3), P3 프라이머는 KRMP-GTC(서열번호 13)이다. 또한 유채 탐라 품종 판별용 마커는 서열번호 23의 폴리뉴클레오티 또는 이와 상보적인 서열을 갖는 폴리뉴클레오티 서열이다.
상기 유채 탐라 품종 판별용 마커는 유채 탐라 품종에만 특이적으로 검출되며 다른 유채 품종 및 다른 품종에서는 검출 되지 않아 효과적인 유채 탐라 품종 판별용 마커로 사용될 수 있다. 이는 [도 2]에서 확인할 수 있다.
본 발명에서는 서열번호 15 및 서열번호 18로 표시되는 염기서열을 갖는 유채 탐라 품종(Brassica napus L. cv. Tamra) 판별용 PCR 프라이머 세트를 제공한다.
본 발명에 있어서, “프라이머”는 상보적인 템플레이트와 염기세트(base pair) 을 형성할 수 있고 템플레이트 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능을 하는 짧은 핵산 서열을 의미한다.
상기 본 발명의 프라이머 세트는 상기 판별용 마커를 제조한 후, 마커의 염기서열로부터 품종 또는 계통 특이성을 높일 수 있도록 디자인 된 것이다. 상기 프라이머 세트 중 서열번호 15로 표시되는 프라이머는 [도 1]의 프라이머 P1, 서열번호 18로 표시되는 프라이머는 프라이머 P4를 가르킨다. 본 발명의 상기 프라이머 세트로 PCR을 수행한 결과, 유채 탐라 품종을 특이적으로 검출하는 것을 [도 4]에서 확인할 수 있다.
본 발명에서 제공되는 유채 탐라 품종 판별용 프라이머 세트는 유채 탐라 품종에서 CACTA 이동유전자를 검출하고 유채 품종의 fingerprinting 및 유채 품종개량 프로그램의 selection에 유용하게 사용될 수 있다. 또한 본 발명에 따른 유채 탐라 품종 판별 프라이머 세트를 이용하여 유채 탐라 품종을 동정할 수 있으므로 유채 탐라 품종의 유전자원을 효율적으로 평가 및 보존할 수 있다.
본 발명은 (a) 시료로부터 DNA를 분리하는 단계; (b) 분리된 상기 DNA를 주형으로 하고, 상기 프라이머 세트를 이용하여 PCR을 수행하는 단계; 및 (c) 상기 (b) 단계의 증폭된 PCR 산물을 전기영동으로 확인하는 단계를 포함하는 유채 탐라 품종(Brassica napus L. cv. Tamra) 판별 방법을 제공한다.
상기 (a)단계에서 시료로부터 DNA를 분리하는 단계는 당업계에서 통상적으로 사용되는 페놀/클로포름 추출법 또는 SDS 추출법(Tai et al., Plant Mol. Biol. Reporter, 8: 297-303, 1990) CTAB 분리법(Cetyl Trimethyl Ammonium Bromide; Murray et al., Nuc. Res., 4321-4325, 1980) 또는 상업적으로 판매되는 DNA 추출 키트를 이용하여 수행할 수 있다.
또한 상기 (b) 단계에서 PCR은 PCR 반응에 필요한 당업계에 공지된 여러 성분을 포함하는 PCR 반응 혼합액을 이용하여 수행될 수 있다. 상기 PCR 반응 혼합액에는 분석하고자 하는 유채 탐라 품종에서 추출된 게놈 DNA와 본 발명에서 제공되는 유채 탐라 품종 판별 프라이머 세트 이외에 적당량의 DNA 중합효소, dNTP, PCR 완충용액 및 물(dH2O)을 포함한다. 상기 PCR 완충용액은 Tris-HCl, MgCl2, KCl 등을 포함한다. 이 때 MgCl2 농도는 증폭의 특이성과 수량에 크게 영향을 준다. 바람직하게는 1.5-2.5 mM의 범위로 사용될 수 있다. 일반적으로 Mg2 +가 과량인 경우는 비특이적인 PCR 증폭산물이 증가하고, Mg2 +가 부족한 경우 PCR 산물의 산출율이 감소한다. 상기 PCR 완충용액에 는 적당량의 Triton X-100이 추가로 포함될 수도 있다. 또한 PCR은 94-95℃에서 주형 DNA를 전변성시킨 후, 변성(denaturation); 결합(annealing); 및 증폭(extension)의 사이클을 거친 후, 최종적으로 72℃에서 연장(elongation)시키는 일반적인 PCR 반응 조건에서 수행될 수 있다. 상기에서 변성 및 증폭은 94-95℃ 및 72℃에서 각각 수행될 수 있으며, 결합시의 온도는 프라이머의 종류에 따라 달라질 수 있다. 바람직하게는 52-57℃이며, 보다 바람직하게는 55℃이다. 각 단계의 시간과 싸이클 수는 당업계에 일반적으로 행해지는 조건에 따라 정해질 수 있다. 본 발명에 따른 유채 탐라 품종 판별 프라이머 세트를 이용한 PCR 수행시의 최적의 반응 조건은 다음과 같다: 94℃에서 10분간 주형 DNA를 전변성시킨 후, 94℃에서 1분; 55℃에서 1분; 및 72℃에서 1분을 20 싸이클 반복 수행한 후, 최종적으로 72℃에서 10분간 반응시킨다.
PCR 증폭 결과는 아가로스 겔(agarose gel), 폴리아크릴아미드 겔(polyacrylamide gel) 전기영동 또는 형광분석장치(ABI prism 3100 genetic analyzer-electropherogram)에 의해 유채 탐라 품종 특이적 밴드(band)의 증폭 여부를 확인할 수 있다(상기 (c) 단계). 이 때, 형광분석장치를 이용하기 위해서는 당업계에 공지된 형광 다이(dye)를 붙인 프라이머세트를 이용하여 상기 (b)단계에서 PCR을 수행한다. 상기 PCR 수행 결과는 아가로스 겔에 의해 확인하는 것이 바람직하다. 전기영동 후 실버 염색(silver staining)으로 전기영동 결과를 분석할 수 있다. 바람직하게는 UV transilluminator로 전기영동 결과를 분석할 수 있다. 일반적인 PCR 수행 및 그 결과 분석 방법에 대해서는 당업계에 잘 알려져 있다.
또한 본 발명은 본 발명에 따른 유채 탐라 품종 판별 프라이머 세트, DNA 중합효소 및 PCR 반응 완충 용액을 포함하는 유채 탐라 품종 판병 키트를 제공한다. 상기에서 PCR 반응 완충 용액의 조성은 상기에서 기재한 바와 같다.
또한 본 발명은 본 발명의 상기 프라이머 세트를 포함하는 유채 탐라 품종(Brassica napus L. cv. Tamra) 판별용 키트를 제공한다.
상기 본 발명의 키트에는 본 발명의 프라이머 세트를 이용하여 유채 탐라 품종을 검출하는데 필요한 실험(예: PCR) 및 결과 확인에 필요한 여러 가지 시약들, 예컨대, PCR 조성물, 제한효소, 아가로스, 혼성화 및 전기영동에 필요한 완충용액 등이 추가로 포함될 수 있다.
또한 상기 키트에는 상기 PCR 반응을 용이하게 수행할 수 있기 위하여 DNA 중합효소 및 상기 조성의 PCR 반응 완충 용액이 추가로 포함될 수 있으며, PCR 산물의 증폭 여부를 확인할 수 있는 전기영동 수행에 필요한 구성성분이 본 발명의 키트에 추가로 포함될 수 있다.
본 발명은 유채 탐라 품종을 판별하기 위한 마커, 프라이머 세트, 상기 프라이머 세트를 이용한 판별방법 및 판별용 키트를 제공함으로서, 유채 탐라 품종을 판별하는데 효과적이다.
도 1은 본 발명의 마커 및 프라이머 세트 제조방법의 모식도이다.
도 2는 본 발명의 유채 탐라 품종 판별용 마커를 선별한 전기영동 결과이다.
도 3은 상기 도 2에서 빨간 화살표로 표시한 본 발명의 마커를 포함하는 전기영동 밴드의 DNA 염기서열이다.
도 4는 본 발명의 프라이머 세트로 전기영동한 결과이다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1>
유채 품종별 DNA 추출
농촌진흥청 국립식량과학원 바이오에너지작물센터(무안)에서 개발된 대표적인 6종의 유채품종과 육성중인 4종의 고정계통들을 사용하였다. 본 연구개발에 사용된 6종의 유채품종은 탐미, 탐라, 한라, 내한, 선망, 그리고 영산이며 4종의 고정계통은 목포68, 목포111, 목포113, 그리고 목포114 이다. 게놈 DNA는 DNeasy Plant Mini kit (Qiagen, USA)을 이용하여 어린 묘목으로부터 추출하였다.
<실시예 2>
CACTA transposon 발굴 및 transposon display를 위한 프라이머 디자인
Brassica 종 식물에는 3개 class의 CACTA transposon(Bot-1, Bot-2, Bot-3)이 있다(Aix et al.,Plant J 56:1030-1044, 2008). 각 인자들(Bot-1, Bot-2, Bot-3)의 3’end에 위치하는 500bp 염기서열을 NCBI에서 제공하는 blsatn 프로그램의 querry로 사용하였으며 컷오프값을 E x 10-4로 하여 NCBI의 Brassica 데이터베이스에 존재하는 Brassica CACTA elements를 동정하였다. CACTA elements의 최종 선발은 양쪽 말단 역위 반복 서열(terminal inverted repeat)이 온전한 것으로 한정하였으며, 동일한 서열은 분석에서 제외하였다. Bot관련 서열은 최종적으로 58개 요소로 좁혔으며, 보존지역을 밝히기 위하여 각 인자들의 3’end로 부터 500bp 염기서열을 추출하여 다중 정렬하였다.
CACTA motif를 포함하며 3’ end 말단에 위치하는 전이인자의 보존지역(conseved region)으로부터 22bp의 degenerated primer 서열을 설계하였다. 프라이머의 서열(B-CAC-TIR1)은 ATMCCGMTGTTTTCTTGTAGTG이며, M은 A 또는 C를 말한다([표 1] 참조).
상기 설계한 프라이머들은 하기 [표 1]에 표시하였다.
사용된 프라이머 서열
Primer 이름 Sequences 서열번호
MseI-adaptor
MA-1 5- GACGATGAGTCCTGAG - 3 1
MA-2 5- TACTCAGGACTCAT - 3 2
Anchored MseI-adaptor primers
KRMP-0 5- GACGATGAGTCCTGAGTAA - 3 3
KRMP-TCA 5- GACGATGAGTCCTGAGTAATCA - 3 4
KRMP-TCT 5- GACGATGAGTCCTGAGTAATCT - 3 5
KRMP-TCG 5- GACGATGAGTCCTGAGTAATCG - 3 6
KRMP-TCC 5- GACGATGAGTCCTGAGTAATCC - 3 7
KRMP-CGA 5- GACGATGAGTCCTGAGTAACGA - 3 8
KRMP-CGT 5- GACGATGAGTCCTGAGTAACGT - 3 9
KRMP-CGG 5- GACGATGAGTCCTGAGTAACGG - 3 10
KRMP-CGC 5- GACGATGAGTCCTGAGTAACGC - 3 11
KRMP-GTG 5- GACGATGAGTCCTGAGTAAGTG - 3 12
KRMP-GTC 5- GACGATGAGTCCTGAGTAAGTC - 3 13
KRMP-CAT 5- GACGATGAGTCCTGAGTAACAT - 3 14
CACTA transposon specific primer
B-CAC-TIR1 5- ATMCCGMTGTTTTCTTGTAGTG - 3
(M=A or C)		 15
< 실시예 3>
Transposon display
게놈 DNA(100ng)를 2.5 unit의 MseI (Invitrogen, USA)로 절단한 후 15picomol의 adaptor cassette에 T4 DNA ligase (Invitrogen, USA)를 이용하여 연결하였다. 연결된 주형 DNA는 4배 희석한 후, CACTA 이동유전자(전이인자) 특이적 프라이머(서열번호 15, [표 1] 참조.) 및 어댑터 특이 프라이머인 KRMP-0(서열번호 3, [표 1] 참조.)로 PCR 증폭하였다. PCR증폭은 초기 denaturation을 94℃에서 10분간 한 후, 94℃에서 1분, 55℃에서 1분, 72℃에서 1분을 20cycle동안 증폭하고, 72℃에서 10분간 하여 수행하였다.
상기 PCR 산물은 100배 희석하여 3 ul을 IRD-700 label 된 CACTA transposon specific primer(B-CAC-TIR1, 서열번호 15)와 11개의 adaptor primer(서열번호 4 내지 14)로 선택적 증폭을 실시하였다. PCR조건은 위와 동일하다. 중폭된 산물은 Li-Cor(LiCor, USA) 자동화 장비 및 6% denaturing PAGE gel로 1800볼트에서 2시간 전기영동 하였다. 분리된 DNA는 Li-Cor의 경우 컴퓨터 화상장비로 그리고 PAGE gel의 경우 silver staining kit(Promega, USA)으로 silver staining하여 확인하였다.
상기 [표 1]의 프라이머들 중 몇몇 품종 또는 계통의 감별에 이용될 수 있는 세트들을 발견하였는데, 그 중 프라이머 B-CAC-TIR1(서열번호 15)와 프라이머 KRMP-GTC(서열번호 13)로 이루어진 프라이머 세트가 유채 내한 품종 선발에 이용 가능한 것을 확인할 수 있었다. 이에 대한 결과는 [도 2]에 기재하였는데, 프라이머 B-CAC-TIR1와 KRMP-GTC로 PCR 반응을 진행할 시, 유채 내한 품종에만 특이적인 밴드가 있는 것을 확인할 수 있다([도 2]의 빨간 화살표).
< 실시예 4>
시퀀싱, SCAR primer 디자인, PCR 증폭 및 gel 전기영동
상기 실시예 3의 전기영동 결과들에서, 각 품종별 또는 계통별로 특이성을 보이는 밴드 부분(다형성 DNA 조각)을 gel에서 분리하여 ABI3730xl (Life Technology, USA)으로 sequencing하였고, 상기 서열결과를 바탕으로 Primer3 program으로 SCAR 프라이머를 디자인 하였다([표 2] 참조).
서열분석 결과 중, 상기 실시예 3에서 유채 탐라 품종에 특이적인 프라이머 B-CAC-TIR1(서열번호 15)와 프라이머 KRMP-GTC(서열번호 13)로 실시한 PCR 산물의 서열분석 결과는 [도 3]에 표시하였다. 또한 상기 [도 3]의 염기서열에서 프라이머 B-CAC-TIR1(서열번호 15) 부터 SCAR 프라이머 까지의 염기서열, 즉 유전자 마커(서열번호 23)는 하기 [표 2]에서 Ti-SCAR3 이고, Ti-SCAR3에서 유래한 SCAR 프라이머는 서열번호 18의 염기서열을 갖는다.
실험에 사용한 품종 및 계통들의 주형 게놈 DNA 50ng을 10 picomol 프라이머 KRMP-0(서열번호 3) 및 [표 2]의 SCAR 프라이머로 94℃에서 20초, 58℃ 내지 60℃에서 20초, 72℃에서 40초의 PCR조건에서 증폭하였다. 증폭된 산물은 1% agarose gel에서 1시간 동안 분리하여 UV transilluminator로 관찰하였다.
품종 특이적 SCAR 프라이머
마커 이름 polymorphism
종류		 Primer 이름, 서열번호 및
sequences(5에서 3방향)		 Annealing
온도		 증폭산물
크기		 대상 품종
Ti-SCAR1 Presence/absence GTG2-1: 서열번호 16:
ACAATAGCCTCTAACATCCTGAGC		 60 237 bp 내한
Ti-SCAR2 Presence/absence TCA4-2: 서열번호 17:
CAAGAATGAGACAACATGTCAGG		 56 183 bp 탐라
Ti-SCAR3 Presence/absence GTC4-1: 서열번호 18:
GAAATCTAACCACTCTTTAGCACCA		 60 233 bp 탐라
Ti-SCAR4 Presence/absence CGG6-1: 서열번호 19:
ATTGGCCCATCTTATTGTCTCTT		 60 175 bp 한라
Ti-SCAR5 Presence/absence CGT7-1: 서열번호 20:
CTGCACCTAAGTTTCTTGATCGTA		 60 330 bp 목포68
Ti-SCAR6 Presence/absence CGT7-2: 서열번호 21:
GAACTCTAGCTTCTTCGGCTCTT		 60 240 bp 목포68
Ti-SCAR7 Presence/absence CAT7-1: 서열번호 22:
GAGATGCGTGTGAACTCTAGCTT		 60 251 bp 목포68
관찰결과, 본 발명의 방법에 의하여 유채 품종을 특이적으로 판별할 수 있는 마커를 확보하였으며, 이를 특이적으로 증폭하는 프라이머를 제조할 수 있음을 확인하였다. [도 4]에서 프라이머 B-CAC-TIR1(서열번호 15)와 프라이머 GTC4-1(서열번호 18)로 증폭한 결과, 유채 탐라 품종에만 특이적인 것을 확인할 수 있다.
이상 살펴본 바와 같이,본 발명은 유채 품종 특이적 마커, 프라이머 및 이의 용도에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 유채 탐라 품종 판별용 마커, 판별용 PCR 프라이머 세트 및 이의 용도에 관한 것이다. 본 발명은 유채 탐라 품종을 판별하기 위한 마커, 프라이머 세트, 상기 프라이머 세트를 이용한 판별방법 및 판별용 키트를 제공함으로서, 유채 탐라 품종을 효과적으로 판별하는 목적으로 사용될 수 있다.
<110> KNU-Industry Cooperation Foundation <120> Novel marker and primer to identify cultivar discrimination in Brassica napus L. and use thereof <130> NP12-0093 <160> 23 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 16 <212> DNA <213> MA-1 <400> 1 gacgatgagt cctgag 16 <210> 2 <211> 14 <212> DNA <213> MA-2 <400> 2 tactcaggac tcat 14 <210> 3 <211> 19 <212> DNA <213> KRMP-0 <400> 3 gacgatgagt cctgagtaa 19 <210> 4 <211> 22 <212> DNA <213> KRMP-TCA <400> 4 gacgatgagt cctgagtaat ca 22 <210> 5 <211> 22 <212> DNA <213> KRMP-TCT <400> 5 gacgatgagt cctgagtaat ct 22 <210> 6 <211> 22 <212> DNA <213> KRMP-TCG <400> 6 gacgatgagt cctgagtaat cg 22 <210> 7 <211> 22 <212> DNA <213> KRMP-TCC <400> 7 gacgatgagt cctgagtaat cc 22 <210> 8 <211> 22 <212> DNA <213> KRMP-CGA <400> 8 gacgatgagt cctgagtaac ga 22 <210> 9 <211> 22 <212> DNA <213> KRMP-CGT <400> 9 gacgatgagt cctgagtaac gt 22 <210> 10 <211> 22 <212> DNA <213> KRMP-CGG <400> 10 gacgatgagt cctgagtaac gg 22 <210> 11 <211> 22 <212> DNA <213> KRMP-CGC <400> 11 gacgatgagt cctgagtaac gc 22 <210> 12 <211> 22 <212> DNA <213> KRMP-GTG <400> 12 gacgatgagt cctgagtaag tg 22 <210> 13 <211> 22 <212> DNA <213> KRMP-GTC <400> 13 gacgatgagt cctgagtaag tc 22 <210> 14 <211> 22 <212> DNA <213> KRMP-CAT <400> 14 gacgatgagt cctgagtaac at 22 <210> 15 <211> 22 <212> DNA <213> B-CAC-TIR1 <400> 15 atmccgmtgt tttcttgtag tg 22 <210> 16 <211> 24 <212> DNA <213> GTG2-1 <400> 16 acaatagcct ctaacatcct gagc 24 <210> 17 <211> 23 <212> DNA <213> TCA4-2 <400> 17 caagaatgag acaacatgtc agg 23 <210> 18 <211> 25 <212> DNA <213> GTC4-1 <400> 18 gaaatctaac cactctttag cacca 25 <210> 19 <211> 23 <212> DNA <213> CGG6-1 <400> 19 attggcccat cttattgtct ctt 23 <210> 20 <211> 24 <212> DNA <213> CGT7-1 <400> 20 ctgcacctaa gtttcttgat cgta 24 <210> 21 <211> 23 <212> DNA <213> CGT7-2 <400> 21 gaactctagc ttcttcggct ctt 23 <210> 22 <211> 23 <212> DNA <213> CAT7-1 <400> 22 gagatgcgtg tgaactctag ctt 23 <210> 23 <211> 267 <212> DNA <213> Ti-SCAR3 <400> 23 tataaacgat gttttcttgt agtgaccttc caggcttgtt tgaagaatcc gatcccatgt 60 ataccaagcc ccaagacaag cagttgtgtc aggtttagtg ttggaggtca ttttggttcc 120 ttcaaaaaca atcttagcaa gagtggttag ttgacaggtt gatccacttt agtatctata 180 gtactaattt caatcagtaa gtctagaatg gtgctaaaga gtggttagat ttcttagcaa 240 aatctataag ttcataatcc ctttttt 267

Claims (4)

  1. 서열번호 23으로 표시되는 뉴클레오티드 및 이들의 상보적인 폴리뉴클레오티드로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 폴리뉴클레오티드로 이루어진 유채 탐라 품종(Brassica napus L. cv. Tamra) 판별용 마커.
  2. 서열번호 15 및 서열번호 18로 표시되는 염기서열을 갖는 유채 탐라 품종(Brassica napus L. cv. Tamra) 판별용 PCR 프라이머 세트.
  3. (a) 시료로부터 DNA를 분리하는 단계;
    (b) 분리된 상기 DNA를 주형으로 하고, 제2항의 프라이머 세트를 이용하여 PCR을 수행하는 단계; 및
    (c) 상기 (b) 단계의 증폭된 PCR 산물을 전기영동으로 확인하는 단계를 포함하는 유채 탐라 품종(Brassica napus L. cv. Tamra) 판별 방법.
  4. 제2항의 프라이머 세트를 포함하는 유채 탐라 품종(Brassica napus L. cv. Tamra) 판별용 키트.
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