KR20140048262A - 신규한 클로스트리듐 디피실(Clostridium Difficile) DNA 백신 - Google Patents

Abstract

본 발명은 클로스트리듐 디피실(C. difficile) 연합된 질병 (CDAD)의 치료용 조성물 및 톡신 A 및 톡신 B의 최소한 하나의 일부를 인코드하는 최소한 하나의 핵산을 이를 필요로 하는 대상에게 투여함으로써 클로스트리듐 디피실(C. difficile) 연합된 질병 (CDAD)을 치료하는 방법에 관계한다.

Description

신규한 클로스트리듐 디피실(Clostridium Difficile) DNA 백신{Novel Clostridium Difficile DNA Vaccine}

관련된 출원에 대한 교차-참조

본 출원은 2011년 7월 12일자로 제출된 U.S. 특허 출원 번호 61/506,973에 대해 우선권을 주장하며, 이는 전문이 여기에 참고자료로 편입된다.

연방 정부 지원 연구 또는 개발에 대한 언급

본 발명은 미국방부에서 부여하는 계약 W81XWH-09-1-0382에 의해 정부 지원으로 이루어졌다. 정부는 이 발명에 대해 특정 권한을 보유한다.

클로스트리듐 디피실(C. difficile) 연합된 질병 (CDAD)은 장기간 입원으로 이어지는 의학 비용 또는 수술비로 인하여 매년 미국 의료계가 대략 11억 달러를 지불하게 되는, 주요 유병률 및 치사율의 원인이다. 또한, 병원들은 이 질병의 증가된 비율을 경험하고, 의사들은 메트로니다졸로 치료한 이후 확연히 증가된 재발율을 기록하고 있다. 클로스트리듐 디피실(C. difficile)로 인한 사망률은 증가되고 있고, 새로운 균주들은 항생제에 저항성인 독소를 더 많은 수준으로 생산한다. 클로스트리듐 디피실(C. difficile)에 의한 결장 감염은 약한 설사에서부터 잠재적으로 생명을 위협하는 여병과 함께, 심각한 결장염에 이르는 범위의 상태를 초래할 수 있다. 비록 항생제를 복용한 나이든 입원 환자들이 여전히 CDAC의 위험의 주요 집단이기는 하지만, 병원 환경 또는 항생제에 기존에 접촉이 없었던 젊은이 집단에서 CDAD의 증가가 나타난다. 더욱이, 어린이 및 임산부와 같은 기존에 저위험군이었던 특정 집단에서 CDAD가 증가되고 있다. 따라서, 수술 주변 환경 및/또는 장기간 항생제에 노출된 사람들을 포함하여 대부분 위험에 처한 자들의 보호가 우선되어야 하며, 가장 중요하다.

그람-양성, 혐기성, 포자-형성 박테리아 클로스트리듐 디피실(C. difficile)은 병원-감염(hospital acquired) 설사의 주요 원인으로 인지된다(2008, Wilcox et al., J Antimicrob Chemother 62(2): 388-396; 2008, Gould et al., Crit Care 12(1): 203). 건강한 외래 성인 환자의 3%는 이 유기체로 집단 형성될 수 있지만, 이 비율은 입원 후 급격히 증가된다. 2000년 이후, 방대한 논문들은 북미와 유럽에서 클로스트리듐 디피실(C. difficile) 질병의 비율 및 심각성에서 재발에 대해 설명하였다(Gould et al., Crit Care 12(1): 203). 이런 사건들은 독소-특이적 백신을 포함하여, 질병 치료 및 예방에 대한 새로운 접근법에 대한 관심을 새롭게 하였다. 질환은 주요 세포독소, 톡신(Toxin) A 및 B의 생산으로 것이며, 이들의 임상적 현시는 증상이 없는 운반에서부터 설사, 독성 거대결장(toxic megacolon), 및 사망까지 그 범위가 된다. 톡신 A 및 B는 각각 300 kD 및 270 kD 단백질이며, 그리고 C. 소르델리(C. sordelli)의 출혈 및 치사 독소와 C. 노비이(C. novyi)의 알파 독소와 상동성을 공유하는 큰 클로스트리듐 세포독소 패밀리의 일원이다. 이들 글루코실 전이효소는 Rho, Rac, 및 Cdc42를 포함하는 다양한 숙주 단백질을 비활성화시키고, 궁극적으로 부여받은 병리 및 임상적 변화로 이어진다. 톡신 A는 동물 모델에서 클로스트리듐 디피실(C. difficile) 연합된 질병의 주요 중개물질로 간주된다. 이 독소는 장독소 이기도 한, 톡신 B의 세포 진입으로 이어지는 상피 파열을 중개한다. 이 독소들은 IL-8 및 MIP-2 분비를 촉진시키고, 호중구 보충을 촉진시킨다(2005, Voth et al., Clin Microbiol Rev 18(2) 247-263). 또한, 톡신 B 균주 (TcdA-TcdB+)는 점막 괴사를 야기하고, 장벽 기능을 감소시키는데 있어서 톡신 A 균주(TcdA+TcdB-)보다 더 강력한 것으로 나타났다 (2009, Rupnik et al., Nat Rev Microbiol 7(7) 526-536). 이들 독소-중개된 사건들은 독소-특이적 백신을 포함하는 질병 치료 및 예방에 대한 새로운 접근방법에 관심을 새롭게 하였다.

최근 연구들은 클로스트리듐 디피실(C. difficile) 콜로니화(colonization) 및 감염의 결과에 대해 독소-특이적, 숙주 항체 반응의 영향을 강조한다. 클로스트리듐 디피실(C. difficile) 포자로 콜로니화에 앞서 항-톡신 A 항체들을 가진 환자들은 활성이며 심각한 질병으로 진행에 대해 상당히 더 낮은 위험을 보유한 것으로 관찰되었다. 일단 감염되면, 강력한 항-독소 항체 반응이 발생되는 환자들은 항균 치료로 이들의 질병을 치료하고, 질병이 없는 상태를 유지한다. 지난 10년간, 동물에서 클로스트리듐 디피실(C. difficile) 감염에 대하여 몇 가지 수동적 그리고 능동적 면역화 전략이 테스트 되었다. 이들 연구는 톡신 A 및 톡신 B의 활성 중화를 위하여 주요 에피토프를 보유하는 카르복시-말단 수용체-결합 도메인 (RBD)의 중요성을 강조하였다. 끝으로, RBD에 대항하여 발생된 IgG의 정맥 내 투여는 마우스 및 햄스터에게서 보호적이다. 클로스트리듐 디피실(C. difficile) 질병에 대항한 보호에서 항-독소 체액 면역 반응의 역할은 독소 공격 후 다수의 수동 및 능동 면역화 연구에 의해 추가 실증된다(2010, Leav et al., Vaccine 28(4): 965-969). 더욱이, 포르말린-처리된 클로스트리듐 디피실(C. difficile) 톡신 A (CDA)로 경피 면역화는 전신 및 점막 항-CDA 면역 반응을 유도한다는 것이 밝혀졌다(2007, Ghose et al., Infect Immun 75(6): 2826-2832). 그러나, 모아진 면역글로블린 조제물의 효과는 부속 요법(adjunct therapy)으로 잘 확립되지 않았기 때문에, 클로스트리듐 디피실(C. difficile)에 대항하여 면역 기반 치료법에 대한 임상적 징후는 수동 면역화에 대해 충분히 정의되지 않았다(2005, Aslam et al., Lancet Infect Dis 5(9): 549-557). 더욱이, 톡소이드-기초된 백신 플랫포옴에 대해 임상에서 이들의 효과를 제한할 수 있는 특정 안정성 문제가 있었다(1995, Torres et al., Infect Immun 62(12): 4619-4627). 이러한 연구는 클로스트리듐 디피실(C. difficile) 독소에 대항하여 최적화된 차세대 대체 백신의 개발에 대해 강력한 과학적 근거를 제공한다. 이를 위하여, 점막 표적화 어쥬번트 (2010, Kraynyak et al., Vaccine 28(8):1942-1951; 2010, Kutzler et al., Gene Ther 17(1): 72-82) 및 전기천공 운반 방법을 포함하는 전망 있는 차세대 DNA 백신 기술이 HIV 백신 플랫포옴에서 효과적인 것으로 나타났다.

DNA-기반 면역화는 매력적인 백신 플랫포옴을 만드는 다수의 장점을 가진다(2006, Hokey et al., Springer Semin Immunopathol 28(3): 267-279; 2008, Kutzler and Weiner, Nat Rev Genet 9(10): 776-788). 첫째, 독성(virulent) 형태로 되돌아갈 수 있거나 또는 의도되지 않은 개인으로 전파될 수 있는 살아있는 감쇠된 바이러스와 비교하여 개선된 안전성 프로파일을 보유한다. DNA-기반 백신 및 어쥬번트의 다음 성질은 톡소이드-기반 전략보다 이 플랫포옴의 이용을 뒷받침한다: 조작의 용이성, 증명된 생산 기술, 안정성, 그리고 저온 유통 체계의 부족. 또한, DNA 백신은 체액 및 세포 반응을 유도하고, 그리고 작은 그리고 더 큰 동물 모델에서 보호를 부여하는 것으로 나타났다(2008, Kutzler and Weiner, Nat Rev Genet 9(10): 776-788). 다 함께, 이들 장점들은 DNA-기반 면역화를 클로스트리듐 디피실(C. difficile)에 대한 바람직한 백신 양태(modality)로 만든다. 전기천공을 포함하는 다양한 물리적 운반 방법을 통하여 표적 세포의 형질감염 효과의 증가는 이 분야에서 성공한 영역이다. 중요한 것은, DNA 백신 플랫포옴은 전망이 있으며, 매우 최적화된 항원 구조체를 테스트하는 단계 I 임상 시험중으로, 이는 이 플랫포옴의 안전성 및 가능성을 뒷받침한다 (2009, Yin et al., Virology 393(1): 49-55; 2005, Kutzler et al., J Immunol 175(1): 112-123; 2007, Chong et al, Vaccine 25(26): 4967-4982). 비록 좀 더 최근에, 전기천공을 이용한 DNA 백신 운반이 강력한 세포 반응에 추가하여, 강건한 체액 반응을 유도할 수 있다고 설명되기는 하였지만, DNA 백신은 세포 면역 반응의 유도와 역사적으로 연합되어 있었다. 이것은 조류 인플루엔자(2008, Laddy et al., PLoS One 3(6): e2517; 2007, Laddy et al., 백신 25(16): 2984-2989), 천연두 (2011, Hirao et al, J Infect Dis 203(1): 95-102), 뎅기열 (2009, Ramanathan et al., Vaccine 27(46): 6444-6453; 2009, Ramanathan et al, Vaccine 27(32): 4370-4380), 그리고 치큰건야열(chikungunya) (2011, Mallilankaraman et al., PLoS Negl Trop Dis 5(1): e928)을 포함하는 다수의 질병에 대해 동물 도멜에서 항체 역가를 중화시키는 유도를 포함한다

수많은 플랫포옴이 클로스트리듐 디피실(C. difficile) 후보 백신으로 연구되어왔고 (2007, Ghose et al., Infect Immun 75(6): 2826-2832; 2011, Oberli et al., Chem Biol 18(5): 580-588; 2011, Pechine et al., FEMS Immunol Med Microbiol June 24; 2011, Permpoonpattana et al., Infect Immun 79(6): 2295-2302; 2011, Sandolo et al., Eur J Pharm Biopharm June 1; 2008, Ni Eidhin et al, FEMS Immunol Med Microbiol 52(2): 207-218; 2008, Taylor et al., Vaccine 26(27-28): 3404-3409; 2009, Gardiner et al., Vaccine 27(27): 3598-3604), 임상 경로에서 많은 제품이 부족하다. 엄청난 비용과 클로스트리듐 디피실(C. difficile) 감염의 횡행이 증가되면서, 클로스트리듐 디피실(C. difficile) 연합된 질병에 대항하여 보호해줄 효과적인 백신 요법이 이 분야에 절실하다. 본 발명은 이 분야에서 이러한 충족되지 않은 요구를 해결한다.

요약

다양한 구체예들에서, 본 발명은 클로스트리듐 디피실(C. difficile) 톡신 A 및 클로스트리듐 디피실(C. difficile) 톡신 B중 최소한 하나의 최소한 일부를 발현시키는 최소한 하나의 핵산을 포함하는 백신이다. 한 구체예에서, 본 발명은 서열 번호:3의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 인코드하는 핵산 및 서열 번호:4의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 인코드하는 핵산으로 구성된 군으로부터 선택된 최소한 하나의 핵산을 포함하는 백신이다. 또 다른 구체예에서, 이 백신은 분비 리더(leader) 펩티드를 인코드하는 핵산을 더 포함한다. 특정 구체예에서, 분비 리더 펩티드는 IgE 분비 리더 펩티드다. 일부 구체예들에서, 이 핵산은 하나의 발현 벡터로 통합되며, 다른 구체예들에서, 이 핵산은 2개 또는 그 이상의 발현 벡터로 통합된다. 일부 구체예들에서, 최소한 하나의 핵산은 인간 세포에서 발현을 위하여 코돈-최적화된다.

또 다른 구체예에서, 본 발명은 본 발명의 최소한 하나의 백신을 포유류의 조직에 투여하는 단계를 포함하는 클로스트리듐 디피실(C. difficile)에 대항하여 포유류를 면역화시키는 방법이다. 일부 구체예들에서, 면역화 방법은 포유류의 조직으로 이 백신을 투여하고, 그리고 이 핵산 분자가 세포 안으로 진입을 허용하는데 효과적인 전류로 포유류의 조직의 세포를 전기천공하는 것을 포함한다. 일부 구체예들에서, 포유류의 조직은 근육이다. 다른 구체예들에서, 포유류의 조직은 피부다. 일부 구체예들에서, 이 백신은 근육 내 또는 피부 내 주사에 의해 투여된다. 한 구체예에서, 포유류는 클로스트리듐 디피실(C. difficile)에 현재 감염되어 있지 않으며, 그리고 이 백신은 보호성 면역 반응을 유도한다. 일부 구체예들에서, 보호성 면역 반응은 서열 번호:3의 폴리펩티드 및 서열 번호:4의 폴리펩티드로 구성된 군으로부터 선택된 최소한 하나의 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 최소한 하나의 항체를 포함한다. 일부 구체예들에서, 포유류는 인간이다.

또 다른 구체예에서, 본 발명은 본 발명의 최소한 하나의 백신을 포유류의 조직으로 투여하는 단계를 포함하는, 클로스트리듐 디피실(C. difficile)에 감염된 포유류를 면역화시키는 방법이다. 일부 구체예들에서, 면역화 방법은 이 백신을 포유류의 조직에 투여하고, 이 핵산 분자가 세포 안으로 진입을 허용하는데 효과적인 전류로 포유류의 조직의 세포를 전기천공하는 것을 포함한다. 일부 구체예들에서, 포유류의 조직은 근육이다. 다른 구체예들에서, 포유류의 조직은 피부이다. 일부 구체예들에서, 이 백신은 근육 내 또는 피부 내 주사로 투여된다. 한 구체예에서, 포유류는 클로스트리듐 디피실(C. difficile)에 현재 감염되어 있고, 이 백신은 치료 면역 반응을 유도한다. 일부 구체예들에서, 치료 면역 반응은 서열 번호:3의 폴리펩티드 및 서열 번호:4의 폴리펩티드로 구성된 군으로부터 선택된 최소한 하나의 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 최소한 하나의 항체를 포함한다. 일부 구체예들에서, 포유류는 인간이다.

한 구체예에서, 본 발명은 서열 번호:3의 아미노산 서열을 포함하는 단리된 폴리펩티드이다. 또 다른 구체예에서, 본 발명은 서열 번호:3의 아미노산 서열을 인코드하는 핵산이다. 한 구체예에서, 본 발명은 서열 번호:4의 아미노산 서열을 포함하는 단리된 폴리펩티드이다. 또 다른 구체예에서, 본 발명은 서열 번호:4의 아미노산 서열을 인코드하는 단리된 핵산이다. 추가 구체예에서, 본 발명은 서열 번호:3의 아미노산 서열을 포함하는 단리된 폴리펩티드와 서열 번호:4의 아미노산 서열을 포함하는 단리된 폴리펩티드를 포함하는 조성물이다. 여전히 추가 구체예에서, 본 발명은 서열 번호:3의 아미노산 서열을 인코드하는 단리된 핵산과 서열 번호:4의 아미노산 서열을 인코드하는 단리된 핵산을 포함하는 조성물이다.

본 발명의 바람직한 구체예의 다음 상세한 설명은 첨부된 도면과 함께 보았을 때 더 잘 이해될 것이다. 본 발명을 설명하기 위한 목적으로, 현재 바람직한 구체예를 도면에 나타낸다. 그러나, 본 발명은 도면에 나타낸 구체예들의 정확한 배열 및 방편들에 제한되지 않는다는 것을 이해해야 한다.
도 1은 도 1A 및 1B를 포함하고, 톡신 A의 RBD 및 톡신 B의 RBD의 서열, 뿐만 아니라, 독소 RBD의 시험관 발현을 설명하는 실험을 나타낸다.
도 2에서 독소-특이적 IgG(IgA는 아님)가 근육 내로 면역주사되고, 이어서 생체 내 전기천공된 마우스의 혈청에서 탐지가능하다는 것을 설명하는 실험 결과를 나타낸다.
도 3은 마우스에서 pA/B RBD N→Q 투약 이후 톡신 A- 및 톡신 B-특이적 항체 분비 세포의 수를 산정하는 실험 결과를 나타낸다.
도 4는 pRBD-면역화된 마우스의 비장에서 독소-특이적 형질아모세포가 증가됨을 설명하는 실험 결과를 나타낸다.
도 5는 백신-유도된 B 세포들의 표현형을 분석하는 실험 결과와, 독소-특이적 기억 반응이 pRBD-면역화된 비장에서 증가되었음을 설명하는 실험 결과를 나타낸다.
도 6은 pRBD N→Q 면역화된 동물의 혈청은 세포들이 톡신 A 또는 톡신 B에 노출된 세포의 세포 라운딩을 예방한다는 것을 설명하는 실험 결과를 나타낸다.
도 7은 pRBD N→Q로 면역화는 전신 독소 도전에 대해 마우스를 보호한다는 것을 설명하는 실험 결과를 나타낸다.
도 8은 근육 내 면역화 및 생체 내 전기천공 이후 암컷 레소스 마카크(Rhesus macaques)에서 관찰된 면역화 일정 및 면역원성을 나타낸다.
도 9는 도 9A-9E를 포함하며, 예시적인 발현 벡터 구조체 고안 및 구조체 발현을 평가하는 실험 결과를 나타낸다. (A) 항원 DNA 변형은 표 좌측 패널에 요약된다. pVAX (기본골격)의 주요 성분들을 나타내는 개요는 우측 패널에 나타낸다. A 또는 B RBD wt 그리고 A 또는 B RBD N→Q를 인코드하는 4개 플라스미드를 최적화시키고, 작제하였다(constructed). (B) 톡신 A 및 B의 RBD에서 가상 N-연계된 당화 부위는 밑줄을 쳐놓았다. 이들 부위에서, Gln은 DNA 백신 플라스미드의 작제 동안 첫 Asn을 대체하였다. (C) 각 가상 N-연계된 당화 부위의 첫 Asn을 보유하는 톡신 A 및 B의 RBD의 서열은 Gln으로 대체되었다. (D) 293T 세포 (3.0x10⁵ 세포)는 Lipofectamine 2000을 이용하여 2μg의 pRBD N→Q 구조체로 형질감염되었다. 형질감염 후 48시간 이후, 용해물 (RIPA 완충액) 및 상층액이 수거되었고, SDS-PAGE (4-12%)에서 분획되었고, 그리고 PVDF 막으로 이동되었다. 특이적 마우스 항혈청으로 면역탐지가 실행되었고, 그리고 발현된 단백질은 ECL 탐지 시스템을 이용하여 양고추냉이 과산화효소-접합된 염소 항-마우스 IgG로 시각화되었다. (E) 용해물 및 상층액의 분획은 500U의 폴리펩티드 N-글리코시다제 F (PNGaseF)로 37℃에서 1시간 동안 절단되고, 그리고 65℃에서 15분간 비활성화되었다. 시료들은 SDS-PAGE (8%) 및 면역탐지되었다.
도 10은 면역화 및 수집 일정을 나타낸다.
도 11은 도 11A-11C를 포함하는데, pRBD N→Q로 면역화 이후 항원-특이적 B 세포들을 평가하는 실험 결과를 나타낸다. (A) 항체 수준은 각 면역화 시점에서 혈청에서 측정되었다. 96-웰 플레이트는 0.5 μg/mL의 톡소이드 A 또는 B로 하룻밤 동안 피복되었다. 혈청 희석액이 첨가되었고, 총 IgG는 HRP-접합된 항체들을 이용하여 측정되었다. (B) ELISpot 플레이트는 0.5μg/mL의 톡소이드 A 또는 B 또는 전체 IgG로 하룻밤 동안 피복되었다. 비장세포는 3차 면역화 이후 10일 시점에 단리되었고, 플레이트에 추가되었다(Ag-특이적, 5.0x10⁵ 세포/웰 및 전체 IgG, 1.0x10⁴ 세포/웰). 24 시간 후, 세포를 씻어내었고, HRP-접합된 항체들로 프로브하였다. (C) 대안으로, 비장세포 (1.5x10⁶)는 R10 배지+1:6 CpG2006, 1:1000 PWM, 1:1000 BMe, 및 1:10000 SAC에서 3일간 자극되어, 기억 B 세포들을 촉진시켜 증식되도록 하였다. 본 명세서에서 설명된 것과 같이, 항원-특이적 기억 B 세포들이 탐지되었다.
도 12는 도 12A-12B를 포함하고, pRBD N→Q로 면역화된 동물의 혈청은 시험관에서 클로스트리듐 디피실(C. difficile) 독소 활성을 중화시킬 수 있음을 설명하는 실험 결과를 나타낸다. (A) 베로 세포(Vero cell)(5.0x10⁴ 세포)는 96-웰 플레이트에서 단층(24시간)으로 성장되었다. 마우스 혈청은 성장 배지에서 희석되었고, 100% 세포 라운딩(rounding)을 유도하기 위하여, 충분히 정제된 톡신 A 또는 톡신 B를 함유하는 동량의 성장 배지에 추가되었다. 부드럽게 혼합한 후, 37℃에서 1시간 동안 항온처리되고, 96-웰 플레이트로 중복 첨가하였다. 20-24 시간 후, 세포 라운딩은 10X 확대하에서 평가되었다. 도면은 두 개 웰을 통한 평균 효과를 나타낸다. 염소 항-톡신 A (List Biologicals)는 양성 대조군으로 이용되었다. (B) 세포 라운딩은 웰당 6개의 무작위 필드를 분석하고, 라운드된 세포의 비율을 평균하여 측정되었다. 결과는 pVAX 혈청 및 염소 항-톡신 A와 비교하여 그래프로 나타내었다.
도 13은 면역화 및 수집 일정을 나타낸다.
도 14는 정제된 클로스트리듐 디피실(C. difficile) 독소와 함께 치명적 전신 공격을 평가하는 실험 결과를 나타낸다. (A) 5마리 C57BL/6 마우스는 (1) 150 ng 톡신 A 또는 B; (2) 300 ng 톡신 A 또는 B; (3) 75 ng의 두 가지 독소; 또는 (4) 150 ng의 두 가지 독소에 의해 복막(i.p.)으로 공격받았다. 유병율 징후에 대해 매일 마우스를 관찰하였다. (B) 10마리 C57BL/6 마우스/집단은 독소를 i.p.로 공격받았다. pA RBD N→Q 마우스는 300 ng 톡신 A를 제공받았고, pB RBD N→Q 마우스는 각 독소 150 ng을 제공받았다.
도 15는 pRBD-N→Q 구조체가 레소스 마카크(Rhesus macaques)에서 면역원성임을 설명하는 실험 결과를 나타낸다.
도 16은 마카크(macaque) 과다면역 혈청은 마우스에서 클로스트리듐 디피실(C. difficile) 독소의 치명적 효과를 중화시킨다는 것을 설명하는 실험 결과를 나타낸다.

본 발명은 클로스트리듐 디피실(C. difficile) 연합된 질병 (CDAD)을 방지, 저해 및 치료하는 조성물 및 방법을 제공한다. 한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 클로스트리듐 디피실(C. difficile) 단백질 (가령, 톡신 A (TcdA) 및 톡신 B (TcdB))에 특이적 항체 생산을 유도하는 백신이다. 한 구체예에서, 이 조성물은 톡신 A의 수용체 결합 도메인 (RBD)을 포함한다. 또 다른 구체예에서, 이 조성물은 톡신 B의 RBD를 포함한다. 또 다른 구체예에서, 이 조성물은 톡신 A의 RBD와 톡신 B의 RBD를 포함한다.

한 구체예에서, 본 발명의 이 조성물은 DNA 백신이다. 한 구체예에서, 본 발명의 이 조성물은 톡신 A의 RBD를 인코드하는 핵산 서열을 포함한다. 또 다른 구체예에서, 본 발명의 이 조성물은 톡신 B의 RBD를 인코드하는 핵산 서열을 포함한다. 또 다른 구체예에서, 이 조성물은 톡신 A의 RBD 및 톡신 B의 RBD를 인코드하는 핵산 서열을 포함한다. 한 구체예에서, 이 조성물의 핵산은 RBD 폴리펩티드의 해독 및 분비 증가되 대해 최적화된다. 한 구체예에서, 이 조성물은 서열 번호:1 및 서열 번호:2, 또는 이의 변형으로부터 선택된 하나 또는 그 이상의 폴리펩티드를 포함한다. 한 구체예에서, 이 조성물은 서열 번호:1 및 서열 번호:2, 또는 이의 변형으로부터 선택된 아미노산 서열을 인코드하는 하나 또는 그 이상의 핵산 서열을 포함한다.

한 구체예에서, 톡신 A의 RBD 및 톡신 B의 RBD는 N-연계된 당화를 방지하기 위하여 야생형으로부터 돌연변이된다. 이러한 돌연변이는 클로스트리듐 디피실(C. difficile)에 의해 생산되는 고유한 톡신 A 및 톡신 B의 당화 상태를 보존하고, 이로 인하여 효과적인 면역원성을 지킨다. 한 구체예에서, 이 조성물은 서열 번호:3 및 서열 번호:4로부터 선택된 하나 또는 그 이상의 폴리펩티드를 포함한다. 한 구체예에서, 이 조성물은 서열 번호:3 및 서열 번호:4로부터 선택된 아미노산 서열을 인코드하는 하나 또는 그 이상의 핵산 서열을 포함한다.

본 발명은 CDAD를 예방하고 치료하기 위하여 면역 반응을 유도하는 방법을 또한 제공한다. 한 구체예에서, 이 방법은 톡신 A의 RBD 및/또는 톡신 B의 RBD를 대상에게 투여하는 것을 포함한다. 또 다른 구체예에서, 이 방법들은 톡신 A의 RBD및/또는 톡신 B의 RBD를 인코드하는 핵산을 대상에게 투여하는 것을 포함한다. 한 구체예에서 이 방법은 이 조성물을 근육 내로 투여하는 것을 포함한다. 한 구체예에서, 이 방법은 생체 내 전기천공을 포함한다.

정의

다른 언급이 없는 한, 본 명세서에서 이용된 모든 기술적 그리고 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 분야에 평균적 기술을 가진 자가 통상적으로 인지하는 것과 동일한 의미를 가진다. 본 명세서에서 기술된 것과 유사한 또는 대등한 임의의 방법들 및 재료들이 본 발명의 실시 또는 테스트에 이용될 수 있지만, 바람직한 방법 및 재료들이 기술된다.

본 명세서에서 이용된 것과 같이, 다음의 각 용어는 이 단락에서 이와 연합된 의미를 가진다. 본 명세서에서 이용된 용어는 특정 구체예를 설명하기 위함이지, 이에 제한되는 것이 아님을 이해해야 한다.

관사("a" 및 "an")는 관사의 문법적 목적어의 하나 또는 그 이상(가령, 최소한 하나)의 것을 지칭하도록 이용된다. 예를 들면, "요소"은 하나 또는 하나 이상의 요소를 의미한다.

양, 일시적 기간 및 이와 유사한 것과 같은 측정가능한 값을 지칭할 때 "본 명세서에서 이용된 것과 같은 "약"은 명시된 값으로부터 ±20% 또는 ±10%, 좀더 바람직하게는 ±5%, 더욱더 바람직하게는 ±1%, 그리고 여전히 좀더 바람직하게는 ±0.1%의 변화를 포괄하며, 이러한 변이는 공개된 방법을 실행하는데 적합하다.

용어 "항체"는 본 명세서에서 이용된 것과 같이, 항원에 특이적으로 결합하는 면역글로블린 분자를 지칭한다. 항체들은 천연 원천 또는 재조합 원천으로부터 유도된 고유한 면역글로블린이거나, 고유한 면역글로블린의 면역반응성 부분일 수 있다. 본 발명의 이 항체들은 예를 들면, 다클론 항체들, 단클론 항체들, Fv, Fab 및 F(ab)₂, 뿐만 아니라 단일 쇄 항체들 그리고 인간화된 항체들을 포함하는 다양한 형태로 존재할 수 있다(Harlow et al., 1999, In: Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY; Harlow et al., 1989, In: Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, New York; Houston et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883; Bird et al., 1988, Science 242:423-426).

용어 "항원" 또는 "Ag"는 본 명세서에서 이용된 것과 같이 면역 반응을 야기하는 분자로 정의된다. 이 면역 반응은 항체 생산, 또는 특이적 면역학적으로-유능한 세포의 활성화, 또는 이 둘 모두와 관련될 수 있다. 당업계 숙련자는 실질적으로 모든 단백질 또는 펩티드를 포함하는 임의의 거대 분자가 항원으로 작용될 수 있다는 것을 인지할 것이다. 더욱이, 항원은 재조합 또는 게놈 DNA로부터 유도될 수 있다. 당업계 숙련자는 면역 반응을 유도하는 단백질을 인코드하는 뉴클레오티드 서열 또는 부분적 뉴클레오티드 서열을 포함하는 임의의 DNA는 본 명세서에서 이용된 용어인 "항원"을 인코드한다는 것을 인지할 것이다. 더욱이, 당업계 숙련자는 뉴클레오티드 서열에 의해 전적으로 인코드될 필요가 없다는 것을 인지할 것이다. 본 발명은 하나 이상의 유전자의 부분적 뉴클레오티드 서열의 이용을 포함하고, 이들 뉴클레오티드 서열은 원하는 면역 반응을 유도하기 위하여 다양한 조합으로 배열된다는 것은 자명하지만 이에 한정되지 않는다. 더욱이, 당업계 숙련자는 항원이 "유전자"에 의해 전혀 인코드될 필요가 없다는 것을 인지할 것이다. 항원은 합성에 의해 생성되거나 또는 생물학적 시료로부터 유도될 수 있음도 자명하다.

본 명세서에서 이용된 것과 같이, 용어 "자가(autologous)"는 동일한 개체로부터 유도되고, 나중에 다시 이 개체로 재-도입되는 임의의 물질을 지칭한다.

본 명세서에서 이용된 것과 같이, "복합 요법"이란 첫 물질이 또 다른 물질과 함께 투여된다는 것을 의미한다. "~와 함께(In conjunction with)"는 또 다른 치료 양태에 추가하여 한 가지 치료 양태의 투여를 지칭한다. 이와 같이, "~와 함께"는 개체에게 다른 치료 양태 전, 치료 동안, 또는 치료 이후, 한 가지 치료 양태의 투여를 지칭한다. 이러한 복합은 단일 치료 섭생 또는 체계의 일부로 간주된다.

본 명세서에서 이용된 것과 같이, 용어 "동시 투여(concurrent administration)"는 복합 요법에서 제 1 요법의 투여와 제 2 요법의 투여가 서로 중첩됨을 의미한다.

"질병(disease)"은 동물이 항상성(homeostasis)을 유지할 수 없는 동물의 건강 상태를 말하며, 만약 이 질병이 개선되지 않으면, 이 동물의 건강은 계속 악화된다. 대조적으로, 동물의 "장애(disorder)"는 이 동물이 항상성을 유지할 수 있지만, 이 장애가 없는 경우보다는 이 동물의 건강 상태는 덜 호의적인 것을 나타내는 동물의 건강 상태다. 치료 없이 방치되어도, 장애는 동물의 건강 상태를 반드시 더 악화시키는 원인이 되지는 않는다.

"유효량(effective amount)"은 본 명세서에서 이용된 것과 같이, 치료 또는 예방적 이익을 제공하는 양을 의미한다.

용어 "발현"은 본 명세서에서 이용된 것과 같이 이의 프로모터에 의해 구동된 특정 뉴클레오티드 서열의 전사 및/또는 해독으로 정의된다.

"발현 벡터"는 발현되는 뉴클레오티드 서열에 작동가능하도록 연계된 발현 조절 서열을 포함하는 재조합 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 지칭한다. 발현 벡터는 발현을 위하여 충분한 시스-작용 요소들을 포함하고; 발현을 위한 다른 요소들은 숙주 세포 또는 시험관 발현 시스템에 의해 공급될 수 있다. 발현 벡터는 코스미드, 플라스미드 (가령, 네이키드 또는 리포솜 내에 포함된) 그리고 재조합 폴리뉴클레오티드에 통합되는 바이러스 (가령, 렌티바이러스, 레트로바이러스, 아데노바이러스, 그리고 아데노-연합된 바이러스)와 같은 당분야에 공지된 모든 것들을 포함한다.

"상동성(Homologous)"은 두 폴리펩티드 또는 두 핵산 분자 사이에 서열 유사성 또는 서열 동일성을 지칭한다. 두 개의 비교된 서열 모두의 위치가 동일한 염기 또는 아미노산 단량체 소단위에 의해 점령되는 경우, 가령, 두 DNA 분자 각각의 위치에 아데닌이 있다면, 이 분자는 이 위치에서 상동성이다. 두 서열 사이에 상동성 비율은 비교된 위치 수를 두 서열이 공유하는 정합 또는 상동성 위치의 수로 나누고, X 100을 곱한 함수다. 예를 들면, 두 서열에서 10개 위치중 6개가 정합되거나 상동성이면, 두 서열은 60% 상동성이다. 예를 들면, DNA 서열 ATTGCC 및 TATGGC는 50% 상동성을 공유한다. 일반적으로, 두 서열을 최대 상동성을 얻도록 배열할 때 비교된다.

용어 "면역글로블린" 또는 "Ig"는 본 명세서에서 이용된 것과 같이, 항체들로 기능하는 단백질 분류로 정의된다. B 세포들에 의해 발현된 항체들은 때로 BCR (B 세포 수용체) 또는 항원 수용체로 지칭된다. 이 분류의 단백질에 포함되는 5가지 구성요소는 IgA, IgG, IgM, IgD, 및 IgE이다. IgA는 이를 테면, 타액, 눈물, 젖, 위장 분비물 및 호흡기와 생식기 점막 분비물과 같이 체분비물에 존재하는 주요 항체다. IgG는 가장 흔한 순환 항체다. IgM은 대부분 대상에서 1차 면역 반응에서 생산되는 주요 면역글로블린이다. 이것은 응집, 컴피턴트 고정, 및 기타 항체 반응에서 가장 효과적인 면역글로블린이며, 박테리아 및 바이러스에 대항하는 방어에 중요하다. IgD는 공지의 항체 기능은 없지만, 항원 수용체로 작용할 수 있는 면역글로블린이다. IgE는 알레르겐에 노출시 비만 세포 및 호염기성 세포로부터 중개물질들의 방출을 일으켜 즉각 과민성을 중개하는 면역글로블린이다.

본 명세서에서 이용된 것과 같이, 용어 "면역 반응"은 T-세포 중개된 및/또는 T-세포 중개된 면역 반응을 포함한다. 예시적인 면역 반응은 T 세포 반응, 가령, 사이토킨 생산 및 세포성 세포독성, 그리고 B 세포 반응, 가령, 항체 생산을 포함한다. 또한, 용어 면역 반응은 T 세포 활성화에 간접적으로 영향을 받은 면역 반응을 포함하는데, 가령, 항체 생산 (체액 반응) 및 사이토킨 반응 세포, 가령, 대식세포의 활성화를 포함한다. 면역 반응에 관련된 면역 세포들은 임파세포들, 이를 테면, B 세포들 및 T 세포 (CD4+, CD8+, Th1 및 Th2 세포); 항원 제시 세포(가령, 전문 항원 제시 세포들, 이를 테면, 수지상 세포, 대식세포, B 임파세포, Langerhans 세포, 그리고 비-전문 항원 제시 세포, 이를 테면, 케라틴 세포, 내피 세포, 성상세포, 섬유아세포, 희돌기교세포); 천연 킬러 세포; 골수 세포, 이를 테면, 대식세포, 호산구, 비만 세포, 호염기성세포, 그리고 과립세포를 포함한다.

"단리된(isolated)"은 자연 상태로부터 변경된 또는 제거된다는 것을 의미한다. 예를 들면, 살아있는 동물에 자연적으로 존재하는 핵산 또는 펩티드는 "단리된"것이 아니지만, 자연 상태의 공존 물질로부터 부분적으로 또는 완전하게 분리된 동일한 핵산 또는 펩티드는 "단리되었다"라고 한다. 단리된 핵산 또는 단백질은 실질적으로 정제된 형태로 존재할 수 있거나, 또는 예를 들면, 숙주 세포와 같은 비-고유 환경에 존재할 수 있다.

면역원성 조성물의 "비경구(parenteral)" 투여는 가령, 피하 (s.c.), 정맥 내 (i.v.), 근육 내 (i.m.), 또는 흉골 내 주사, 또는 주입 기술을 포함한다.

용어 "환자", "대상", "개체" 및 이와 유사한 것은 본 명세서에서 호환되며, 시험관 또는 원위치에 있던 간에 본 명세서에서 기술된 방법에 순응되는 임의의 동물 또는 세포를 지칭한다. 특정 비-제한적 구체예들에서, 환자, 대상 또는 개체는 인간이다.

용어 "동시 투여"는 본 명세서에서 이용된 것과 같이, 복합 요법에서 제 1 요법과 제 2 요법이 이를 테면, 10분, 5분 또는 1분과 같은 약 15분 정도의 시간 분할로 투여되는 것을 의미한다. 제 1 요법과 제 2 요법이 동시에 투여될 때, 제 1 및 제 2 요법은 동일한 조성물(가령, 제 1 및 제 2 요법을 모두 포함하는 조성물) 또는 별도 조성물(가령, 한 조성물에는 제 1 요법, 그리고 또 다른 조성물에는 제 2 요법이 함유되는) 내에 함유될 수 있다.

용어 "특이적으로 결합한다"는 항체에 대해 본 명세서에서 이용된 것과 같이, 시료 내 다른 분자를 실질적으로 인지 또는 결합하지 않고, 특이적 항원을 인지하는 항체를 의미한다. 예를 들면, 한 종으로부터 항원에 특이적으로 결합하는 항체는 또는 하나 또는 그 이상의 종의 항원에 또한 결합될 수 있다. 그러나, 이러한 종-교차 반응성은 항체를 특이적으로 분류되는데 변경을 주지는 않는다. 또 다른 실시예에서, 항원에 특이적으로 결합하는 항체는 항원의 상이한 대립형질 형태에 또한 결합될 수 있다. 그러나, 이러한 교차 반응성은 항체를 특이적으로 분류되는데 변경을 주지는 않는다. 일부 경우에서, 용어 "특이적 결합" 또는 "특이적으로 결합"은 제 2 화학 종과 항체, 단백질, 또는 펩티드의 상호작용에서 이용되는데, 이러한 상호작용은 화학 종에 있는 특정 구조(가령, 항원 결정부위 또는 에피토프)에 따라 달라진다; 예를 들면, 항체는 일반적으로 단백질보다는 특이적 단백질 구조를 인지하고 이에 결합한다. 항체가 에피토프 "A"에 특이적이라면, 라벨된 "A"를 함유하는 반응물에서 에피토프 A를 함유하는 분자와 이 항체의 존재 (또는 자유의, 라벨안된 A)는 이 항체에 결합된 라벨된 A의 양을 감소시킬 것이다.

용어 "치료적"이란 본 명세서에서 이용된 것과 같이 치료 및/또는 예방을 의미한다. 치료 효과는 질병 상태의 억압, 감면 또는 근절에 의해 획득된다.

용어 "치료적으로 유효량"은 연구자, 수의사, 의사 또는 기타 임상의에 의해 추구되는 조직, 시스템, 또는 대상의 생물학적 또는 의학적 반응을 유도하는 해당 화합물의 양을 지칭한다. 이 용어 "치료적으로 유효량"은 투여되었을 때 치료될 장애 또는 질병의 하나 또는 그 이상의 사인 또는 징후를 어느 정도 경감시키거나 이의 발생을 방지하는데 충분한 화합물의 양을 포함한다. 치료적으로 유효량은 화합물, 질병 및 이의 중증도 또는 치료되는 대상의 나이, 체중 등에 따라 달라질 것이다.

본 명세서에서 이 용어가 이용될 때, 질병을 "치료"한다는 것은 대상이 겪게 되는 질병 또는 장애의 최소한 하나의 사인 또는 징후의 빈도 또는 심각성을 감소시킨다는 것을 의미한다.

용어 "형질감염된(transfected)" 또는 "형질변환된(transformed)" 또는 "형질유도된(transduced)"이란 본 명세서에서 이용된 것과 같이 외생성 핵산이 숙주 세포 안으로 전달 또는 도입되는 과정을 지칭한다. "형질감염된" 또는 "형질변환된" 또는 "형질유도된" 세포는 외생성 핵산으로 형질감염된, 형질변환된 또는 형질유도된 것이다. 이 세포는 주요 대상 세포 또는 이의 후손을 포함한다.

범위: 본 개시내용을 통하여, 본 발명의 다양한 측면들이 범위 형태로 제시될 수 있다. 범위 형태의 설명은 편의성 및 간편함을 위한 것으로 이해되어야 하며, 본 발명의 범위를 경직적으로 한정하는 것으로 간주되어서는 안된다. 따라서, 범위의 설명은 모든 가능한 하위범위뿐만 아니라 그 범위 내에 수치적인 값을 특별히 포함하는 것으로 간주되어야 한다. 예를 들면, 1 내지 6과 같은 범위의 설명은 이를 테면, 1 내지 3, 1 내지 4, 1 내지 5, 2 내지 4, 2 내지 6, 3 내지 6 등과 같은 특이적으로 개시된 하위 범위를 보유하는 것으로 간주되어야 하며, 뿐만 아니라 이 범위 내에 해당 숫자들, 예를 들면, 1, 2, 2.7, 3, 4, 5, 5.3, 및 6을 보유하는 것으로 간주되어야 한다. 이것은 범위의 폭에 무관하게 적용된다.

설명

본 발명은 클로스트리듐 디피실(C. difficile) 톡신 A 및/또는 톡신 B 핵산 영역을 대상에게 투여하여 독소 특이적 항체들을 생산하게 된다는 발견과 관련된다. 따라서, 본 발명은 면역 반응의 조절에 유용한 것과 CDAD 및 관련된 장애의 저해, 예방 및 치료에 유용한 것을 포함하는 폴리펩티드 또는 폴리펩티드들의 조합, 폴리뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드의 조합, 약학 및 백신 조성물을 제공한다.

본 발명은 면역 반응을 유도하는데 유용한 클로스트리듐 디피실(C. difficile) 톡신 A (TcdA) 및 클로스트리듐 디피실(C. difficile) 톡신 B (TcdB)로부터 유도된 폴리펩티드 에피토프 또는 폴리펩티드 에피토프의 조합을 포함하는 면역학적 조성물을 제공한다. 본 발명의 하나 또는 그 이상의 폴리펩티드를 포함하는 조성물은 면역보호용 예방 치료 물질로 유용할 뿐만 아니라, 대상에서 CDAD와 연합된 진행 질병의 치료를 위한 치료제로 또한 유용하다.

한 구체예에서, 이 조성물은 톡신 A의 수용체 결합 도메인 (RBD)을 포함한다. 한 구체예에서, 이 조성물은 톡신 A의 돌연변이 수용체 결합 도메인 (RBD)을 포함한다. 한 구체예에서, 이 조성물은 톡신 B의 RBD를 포함한다. 또 다른 구체예에서, 이 조성물은 톡신 B의 돌연변이 RBD를 포함한다. 한 구체예에서, 이 조성물은 톡신 A의 RBD 및/또는 톡신 B의 RBD를 인코드하는 폴리뉴클레오티드이다. 또 다른 구체예에서, 이 조성물은 톡신 A의 돌연변이 RBD및/또는 톡신 B의 돌연변이 RBD를 인코드하는 폴리뉴클레오티드이다. 이 조성물은 면역원성이 증가되도록 변경될 수 있다. 예를 들면, 한 구체예에서, 이 조성물의 폴리뉴클레오티드는 RBD 폴리펩티드의 해독 및 분비를 증가시키는 영역들을 포함한다. 또 다른 구체예에서, 야생형 톡신 A의 RBD및/또는 톡신 B를 인코드하는 뉴클레오티드 서열은 N-연계된 당화를 위한 가망 부위가 제거되도록 돌연변이된다. 즉, 한 구체예에서, 이 조성물은 톡신 A의 돌연변이 RBD 및/또는 톡신 B의 돌연변이 RBD를 인코드하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다.

본 발명은 CDAD를 예방, 저해 및 치료하는 방법들을 또한 제공한다. 한 구체예에서, 본 발명의 이 방법은 클로스트리듐 디피실(C. difficile) 독소, 가령, 톡신 A 및/또는 톡신 B로 지향되는 면역 반응을 발생시킴으로써, 클로스트리듐 디피실(C. difficile)에 대항하는 면역을 유도한다. 한 구체예에서, 본 발명의 이 방법은 톡신 A 및/또는 톡신 B-특이적 항체들의 생산을 유도한다. 한 구체예에서, 본 발명의 이 방법은 병리와 관련된 클로스트리듐 디피실(C. difficile)을 억제한다. 한 구체예에서, 본 발명의 이 방법은 톡신 A의 최소한 일부분 (가령 RBD) 및/또는 톡신 B의 최소한 일부분 (가령, RBD), 또는 이의 변이체들을 포함하는 조성물을 대상에게 투여하는 것을 포함한다. 또 다른 구체예에서, 본 발명의 이 방법은 톡신 A의 RBD및/또는 톡신 B의 RBD, 또는 이의 변이체들을 인코드하는 핵산 서열을 포함하는 조성물을 대상에게 투여하는 것을 포함한다. 한 구체예에서, 이 방법은 DNA 백신을 대상에게 투여하고, 이로 인하여 클로스트리듐 디피실(C. difficile)에 대한 면역을 유도하는 것을 포함한다. 한 구체예에서, 이 조성물은 대상의 근육 내로 투여된다. 한 구체예에서, 이 방법은 생체 내 전기천공을 포함한다.

조성물

본 발명은 폴리펩티드, 뉴클레오티드, 벡터, 및 백신을 포함하는 조성물이 포유류에게 투여되었을 때, 톡신 A 및/또는 톡신 B에 대항하는 면역 반응 (가령, 항-톡신 A 및 항-톡신 B 항체들)을 포함하는, 클로스트리듐 디피실(C. difficile)에 대항하는 면역 반응을 유도하는 조성물을 제공한다. 더욱이, 이 조성물이 포유류에게 투여될 때, 이 조성물은 CDAD와 연합된 질병에 대항하여 접종된 포유류를 보호하는 면역 반응을 유도한다. 본 명세서에서 구체화된 것과 같이, 이 조성물은 백신으로 이용되기 위하여 다량으로 획득될 수 있다.

본 발명의 이 조성물은 포유류 안에 항-톡신 A 및/또는 항-톡신 B 면역 반응의 존재 또는 부재를 평가하기 위한 진단 시약으로 또한 유용하다. 이러한 평가는 포유류로부터 혈청 또는 세포를 획득하고, 폴리펩티드에 결합을 탐지하는 당분야에 공지된 표준 분석에 의해 획득된 것을 본 발명의 폴리펩티드, 또는 폴리펩티드들의 조합과 접촉시켜 이루어진다.

한 구체예에서, 본 발명은 면역 조절물질, 예를 들면, 면역 반응을 자극하고, 그리고 클로스트리듐 디피실(C. difficile) 관련된 병리를 예방하는데 유용한 조성물을 제공한다.

톡신 A 및 B의 RBD는 톡신 A 및 톡신 B 특이적 항체들의 생산을 유도하고, 그리고 클로스트리듐 디피실(C. difficile) 유도된 병리로부터 보호하기 위한 면역자극 물질로 이용될 수 있음을 본 명세서에서 보여준다. 따라서, 한 구체예에서, 본 발명의 이 조성물은 톡신 A 폴리펩티드의 RBD 영역 또는 이의 단편을 포함한다. 또 다른 구체예에서, 본 발명의 이 조성물은 돌연변이성 톡신 A 폴리펩티드의 RBD 영역 또는 이의 단편을 포함한다. 한 구체예에서, 본 발명의 이 조성물은 톡신 B 폴리펩티드의 RBD 영역 또는 이의 단편을 포함한다. 또 다른 구체예에서, 본 발명의 이 조성물은 돌연변이성 톡신 B 폴리펩티드의 RBD 영역 또는 이의 단편을 포함한다. 한 구체예에서, 본 발명의 이 조성물은 톡신 A 및 톡신 B 둘 모두의 RBD 영역 또는 이의 단편을 포함한다. 또 다른 구체예에서, 본 발명의 이 조성물은 돌연변이성 톡신 A 및 톡신 B 모두의 RBD 영역 또는 이의 단편을 포함한다.

본 발명은 본 명세서에서 기술된 폴리펩티드를 인코드하는 폴리뉴클레오티드를 또한 제공한다. 예를 들면, 한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 톡신 A 폴리펩티드의 RBD, 또는 이의 단편을 인코드하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 또 다른 구체예에서, 본 발명의 이 조성물은 돌연변이성 톡신 A 폴리펩티드의 RBD, 또는 이의 단편을 인코드하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 톡신 B 폴리펩티드의 RBD, 또는 이의 단편을 인코드하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 또 다른 구체예에서, 본 발명의 이 조성물은 돌연변이 톡신 B 폴리펩티드의 RBD, 또는 이의 단편을 인코드하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 한 구체예에서, 본 발명의 이 조성물은 톡신 A 및 톡신 B 둘 모두의 폴리펩티드의 RBD 영역들, 또는 이의 단편들을 포함한다. 또 다른 구체예에서, 본 발명의 이 조성물은 돌연변이성 톡신 A 및 돌연변이성 톡신 B 둘 모두의 폴리펩티드의 RBD 영역들, 또는 이의 단편들을 포함한다. 이 폴리뉴클레오티드는 RNA 또는 DNA일 수 있다. 한 구체예에서, 이 조성물은 DNA 백신을 포함한다.

한 구체예에서, 이 조성물은 야생형으로부터 돌연변이된 RBD를 포함하거나, 또는 대안으로 야생형으로부터 돌연변이된 RBD를 인코드하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 본 발명은 RBD 영역 이내에 N-연계된 당화의 가능 부위 돌연변이를 가진 폴리펩티드의 생산은 독소-특이적 항체들의 생산을 유도하고, 독소-유도된 병리를 예방한다는 발견에 일부 기초된다. 돌연변이는 박테리아-생산된 독소의 당화 상태를 보존하고, 이로 인하여 투여된 조성물에 대항하여 생산된 항체들이 또한 박테리아-생산된 독소를 또한 인지하도록 한다. 진핵생물에서 야생형 톡신 A RBD 및 톡신 B RBD의 해독은 당화된 톡신 A RBD 및 톡신 B RBD를 만들 것이다. 당화된 톡신 A RBD 및 톡신 B RBD에 대항한 면역원성은 클로스트리듐 디피실(C. difficile) 감염 동안 세균성 톡신 A 및 톡신 B를 인지하는데 무효할 수 있고, 이로 인하여 접종의 효과가 약하거나 또는 효과가 없을 수 있다. 한 구체예에서, 이 조성물은 야생형 서열에서 발견되는 하나 또는 그 이상의 고유한 아스파라긴 잔기들에서 아스파라긴에서 글루타민으로의 돌연변이(N→Q)를 보유하는 톡신 A RBD 및/또는 톡신 B RBD를 포함한다. 한 구체예에서, 이 조성물은 야생형 서열에서 발견되는 하나 또는 그 이상의 고유한 아스파라긴 잔기들에서 아스파라긴에서 글루타민으로의 돌연변이(N→Q)를 보유하는 톡신 A RBD 및/또는 톡신 B RBD를 인코드하는 핵산을 포함한다.

한 구체예에서, 본 발명은 서열 번호:1의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 또는 이의 단편 또는 변이체를 포함하는 조성물을 제공한다. 또 다른 구체예에서, 본 발명은 서열 번호:2의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 또는 이의 단편 또는 변이체를 포함하는 조성물을 제공한다. 또 다른 구체예에서, 이 조성물은 서열 번호:1의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드와 서열 번호:2의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 또는 이의 단편들 또는 변이체를 포함하는 폴리펩티드를 포함한다.

한 구체예에서, 본 발명은 서열 번호:3의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 또는 이의 단편 또는 변이체를 포함하는 조성물을 제공한다. 또 다른 구체예에서, 본 발명은 서열 번호:4의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 또는 이의 단편 또는 변이체를 포함하는 조성물을 제공한다. 또 다른 구체예에서, 이 조성물은 서열 번호:3의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드와 서열 번호:4의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 또는 이의 단편들 또는 변이체를 포함하는 폴리펩티드를 포함한다.

한 구체예에서, 본 발명은 서열 번호:1-4중 임의의 하나 또는 그 이상의 서열을 보유하는 폴리펩티드, 또는 폴리펩티드의 단편, 폴리펩티드의 동족체, 변이체, 유도체 또는 염을 제공하며, 이때 폴리펩티드 또는 이의 단편의 면역원성 활성은 유지된다.

본 발명은 본 명세서에서 기술된 폴리펩티드에 실질적으로 상동성인 임의의 형태의 폴리펩티드를 포함하는 것으로 간주되어야 한다. 바람직하게는, "실질적으로 상동성"인 폴리펩티드는 본 명세서에서 기술된 폴리펩티드의 아미노산 서열에 대해 약 50% 상동성, 좀더 바람직하게는 약 70% 상동성, 더욱더 바람직하게는 약 80% 상동성, 좀더 바람직하게는 약 90% 상동성, 더욱더 바람직하게는, 약 95% 상동성, 그리고 더욱더 바람직하게는 약 99% 상동성이다.

여전히 또 다른 구체예에 따르면, 본 발명의 폴리펩티드 또는 폴리펩티드의 조합은 톡신 A 및/또는 톡신 B-특이적 면역 반응을 발생시킬 수 있다. 또 다른 구체예에서, 본 발명의 폴리펩티드 또는 폴리펩티드의 조합은 톡신 A 및/또는 톡신 B-특이적 항체들을 생성시킬 수 있다.

더욱이, 또 다른 구체예에서, 본 발명은 CDAD를 예방, 저해 및 치료하는데 유용한 폴리펩티드를 제공하며, 이때 이 폴리펩티드는 서열 번호:1-4중 임의의 하나 또는 그 이상의 서열을 보유하는 폴리펩티드, 또는 폴리펩티드의 단편, 폴리펩티드의 동족체, 변이체, 유도체 또는 염으로 구성된 군에서 선택되며, 이때 이 폴리펩티드 또는 단편의 면역원성 활성은 유지된다.

본 발명의 폴리펩티드는 공지된 기술을 이용하여 만들 수 있다. 예를 들면, 이 폴리펩티드는 재조합 DNA 기술 또는 화학적 합성을 이용하여 합성에 의해 준비될 수 있다. 본 발명의 폴리펩티드는 개별적으로 합성되거나, 또는 2개 또는 그 이상의 폴리펩티드를 포함하는 더 긴 폴리펩티드로 합성될 수 있다. 이 본 발명의 폴리펩티드는 가령, 다른 자연적으로 생성되는 숙주 세포 단백질 및 이의 단편들이 실질적으로 없는, 바람직하게는 단리된다.

이 본 발명의 폴리펩티드는 변형이 이 폴리펩티드의 생물학적 활성을 파괴시키지 않는 한, 가령, 당화, 비당화(aglycosylation), 측쇄 산화, 또는 포스포릴화를 포함할 수 있다. 다른 변형은 예를 들면, 이 폴리펩티드의 혈청 반감기를 증가시키기 위하여, D-아미노산 또는 기타 아미노산 모방체의 통합을 포함한다.

이 본 발명의 폴리펩티드는 변형될 수 있는데, 한 아미노산이 이 아미노산 측쇄의 성질이 보존되는, 상이한 아미노산으로 대체된다(보존성 아미노산 치환으로 알려진 공정). 아미노산 측쇄의 예시적인 성질은 소수성 아미노산(A, I, L, M, F, P, W, Y, V), 친수성 아미노산(R, D, N, C, E, Q, G, H, K, S, T), 그리고 공통적으로 다음의 기능기 또는 성질을 보유하는 측쇄: 지방족 측쇄(G, A, V, L, I, P); 히드록실 기를 보유하는 측쇄(S, T, Y); 황 원자를 보유하는 측쇄(C, M); 카르복실산 및 아미드를 보유하는 측쇄(D, N, E, Q); 염기를 보유하는 측쇄(R, K, H); 그리고 방향족을 보유하는 측쇄(H, F, Y, W). 괄호 안의 문자는 아미노산의 한-문자 코드를 나타낸다.

이 본 발명의 폴리펩티드는 CDAD의 예방 또는 치료용 백신으로 이용되는 2개 또는 그 이상의 본 발명의 폴리펩티드를 포함하는 복합물로 준비될 수 있다. 이 폴리펩티드는 칵테일로 존재하거나, 표준 기술을 이용하여 서로 접합되어 있을 수 있다. 예를 들면, 이 폴리펩티드는 단일 폴리펩티드 서열로 발현될 수 있다. 복합물에서 이 폴리펩티드는 동일하거나 또는 상이할 수 있다.

본 발명은 본 발명의 폴리펩티드의"돌연변이체", "유도체" 및 "변이체"(또는 이를 인코드하는 DNA)를 포괄하는 것으로 간주되어야 하는데, 이들 돌연변이체, 유도체 및 변이체는 하나 또는 그 이상의 아미노산 (또는, 이를 인코드하는 뉴클레오티드 서열인 경우, 하나 또는 그 이상의 염기쌍에서 변경된)에서 변경되어, 생성된 폴리펩티드 (또는 DNA)는 본 명세서에서 기술된 서열과 동일하지는 않지만, 본 명세서에서 기술된 폴리펩티드와 동일한 생물학적 활성을 가지는 폴리펩티드다.

본 발명은 서열 번호:1-4중 임의의 하나 또는 그 이상의 서열을 보유하는 폴리펩티드로부터 선택된 최소한 하나의 폴리펩티드를 인코드하는 폴리뉴클레오티드를 또한 제공한다. 한 구체예에서, 본 발명은 서열 번호:1-4중 임의의 하나 또는 그 이상의 아미노산 서열을 인코드하는 핵산 서열을 포함하는 조성물을 제공한다.

이 핵산 서열은 RNA로 전사되는 DNA 서열과 폴리펩티드로 해독되는 RNA 서열을 모두 포함한다. 다른 구체예들에 따르면, 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 이 본 발명의 폴리펩티드의 아미노산 서열로부터 유추된다. 당분야에 공지된 것과 같이, 축중(redundant) 코돈으로 인하여 대체 폴리뉴클레오티드가 가능한데, 해독된 폴리펩티드의 생물학적 활성은 유지된다.

더욱이, 본 발명은 본 명세서에서 기술된 폴리펩티드에 실질적으로 상동성인 폴리펩티드를 인코드하는 단리된 핵산을 포괄한다. 바람직하게는, 본 발명의 폴리펩티드를 인코드하는 단리된 핵산의 뉴클레오티드 서열은 본 발명의 폴리펩티드를 인코드하는 단리된 핵산의 뉴클레오티드 서열에 대해 "실질적으로 상동성," 즉, 약 60% 상동성, 좀더 바람직하게는 약 70% 상동성, 더욱더 바람직하게는 약 80% 상동성, 좀더 바람직하게는 약 90% 상동성, 더욱더 바람직하게는, 약 95% 상동성, 그리고 더욱더 바람직하게는 약 99% 상동성이다.

본 발명의 범위는 더 짧은 그리고 더 긴 폴리펩티드 및 폴리뉴클레오티드를 포함하는 동족체, 유사체, 변이체, 단편, 유도체 및 염, 뿐만 아니라 하나 또는 그 이상의 아미노산 또는 핵산 치환을 가진 폴리펩티드 및 폴리뉴클레오티드 유사체, 뿐만 아니라 당업계에 공지되어 있는 아미노산 또는 핵산 유도체, 비-천연 아미노 또는 핵산 그리고 합성 아미노 또는 핵산을 포괄하는데, 단서조항으로 이들 변형은 고유 분자의 면역 활성을 보존해야 한다. 특히, 활성 폴리펩티드의 임의의 활성 단편뿐만 아니라 연장, 접합 및 혼합물이 포함되며, 본 발명의 원리에 따라 본 명세서에서 기술된다.

본 발명은 본 명세서에서 기술된 핵산에 상동성인 임의의 그리고 모든 단리된 핵산을 포함하는 것으로 간주되어야 하는데, 단, 이들 상동성 핵산은 본 명세서에서 기술된 폴리펩티드의 생물학적 활성을 보유한 폴리펩티드를 인코드해야 한다.

본 발명의 핵산이 본 발명의 폴리펩티드를 인코드하는 RNA 또는 DNA 서열, 그리고 이 뉴클레오티드 서열이 세포와 연합될 때 또는 자유로운 상태에서 더 안정적이 되도록 DNA 또는 RNA의 화학적 변형을 포함하는 임의의 변형된 형태를 포괄한다는 것을 당업계 숙련자는 인지할 것이다. 뉴클레오티드의 화학적 변형을 또한 이용하여 뉴클레오티드 서열이 세포에 의해 취입될 때 효과를 강화시키거나 또는 세포 내에서 발현될 때 효과를 강화시킬 수 있다. 뉴클레오티드 서열의 임의의 그리고 모든 변형이 본 발명에서 고려된다.

더욱이, 당업계에 공지되어 있는 재조합 DNA 방법, 가령, 예를 들면, Sambrook and Russell, 상기, 및 Ausubel et al., 상기.에서 설명된 것과 같은 방법을 이용하여 본 발명의 단백질의 돌연변이, 유도체 또는 이의 변이 형태를 만들기 위하여 임의의 횟수의 과정이 이용될 수 있다. 폴리펩티드를 인코드하는 DNA 서열을 변경함으로써, 폴리펩티드 또는 폴리펩티드에서 아미노산 변화를 도입하는 절차는 당업계에 공지되어 있고, 이들 및 기타 전문 서적에 설명되어 있다.

벡터

본 발명의 폴리펩티드 또는 본 발명의 폴리펩티드의 조합을 인코드하는 핵산은 플라스미드 및 레트로바이러스 벡터를 포함하나 이에 한정되지 않는, 적합한 벡터에 통합될 수 있다. 이러한 벡터는 당업계에 공지되어 있고, 따라서 본 명세서에서 상세하게 설명되지 않는다.

한 구체예에서, 본 발명은 프로모터/조절 서열을 포함하는 핵산에게 작동가능하도록 연계되어, 이 핵산이 핵산에 인코드된 단백질의 발현을 바람직하게 지시하도록 된 하나 또는 그 이상의 본 발명의 폴리펩티드를 인코드하는 핵산 서열을 포함한다. 따라서, 본 발명은 발현 벡터 및 세포 안으로 외생성 DNA를 도입시키는 방법과, 세포에서 외생성 DNA의 부수적 발현시키는 것을 포함하는데, 가령, 예를 들면, Sambrook et al. (2001, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York), 및 Ausubel et al. (1997, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York)에서 설명되어 있다. 원하는 폴리뉴클레오티드의 벡터 내 통합과 벡터의 선택은 예를 들면, Sambrook et al., 상기, 및 Ausubel et al., 상기에서 설명된 것과 같이 당업계에 공지되어 있다.

폴리뉴클레오티드는 다양한 유형의 벡터로 클론될 수 있다. 그러나, 본 발명은 임의의 특정 벡터로 한정되는 것으로 간주되어서는 안된다. 오히려, 본 발명은 이용가능한 및/또는 당업계에 공지되어 있는 광범위한 벡터를 포함하는 것으로 간주되어야 한다. 예를 들면, 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 플라스미드, 파아지미드, 파아지 유도체, 동물 바이러스, 및 코스미드를 포함하나 이에 한정되지 않는, 벡터 안으로 클론될 수 있다. 특정 관심 벡터는 발현 벡터, 복제 벡터, 프로브 생성 벡터, 및 서열화 벡터를 포함한다.

특이적 구체예들에서, 발현 벡터는 바이러스성 벡터, 세균성 벡터 그리고 포유류 세포 벡터로 구성된 군으로부터 선택된다. 수많은 발현 벡터 시스템은 상기 논의된 조성물의 최소한 일부 또는 전부를 포함하도록 존재한다. 원핵생물- 및/또는 진핵생물-벡터 기반 시스템이 폴리뉴클레오티드, 또는 이의 고유 폴리펩티드를 만들기 위하여 본 발명에 이용될 수 있다. 이러한 시스템 중 많은 것들이 상업적으로 광범위하게 이용된다.

더욱이, 발현 벡터는 바이러스성 벡터의 형태로 세포에 제공될 수 있다. 바이러스성 벡터 기술은 당업계에 공지되어 있고, 예를 들면, Sambrook et al. (2001), 및 Ausubel et al. (1997), 그리고 기타 바이러스학 및 분자 생물학 매뉴얼에 설명되어 있다. 벡터로 유용한 바이러스는 레트로바이러스, 아데노바이러스, 아데노-연합된 바이러스, 허피스 바이러스, 및 렌티바이러스를 포함하나 이에 한정되지 않는다. 일반적으로, 적합한 벡터는 최소한 하나의 유기체 내에서 복제가능한 복제 원점, 프로모터 서열, 편리한 제한 엔도뉴클레아제 부위, 그리고 하나 또는 그 이상의 선택가능한 표식들을 포함한다 (가령, WO 01/96584; WO 01/29058; 및U.S. 특허 6,326,193 참고.

본 발명의 원하는 뉴클레오티드 서열의 발현을 위하여, 각 프로모터에서 최소한 하나의 모듈은 RNA 합성을 위한 시작 부위를 위치시키는 기능을 한다. 이것의 가장 잘 알려진 예가 TATA 박스이지만, TATA 박스가 없는 일부 프로모터, 가령, 포유류 말단 데옥시뉴클레오티딜 전이효소 유전자용 프로모터와 SV40 유전자용 프로모터의 경우, 자체 시작 부위를 덮고 있는 별개의 요소들이 시작 위치의 고정을 돕는다.

추가 프로모터 요소들, 이를 테면, 인헨서는 전사 개시 빈도를 조절한다. 전형적으로, 이들은 시작 위치의 상류 영역 30-110 bp에 위치하는데, 비록 다수의 프로모터는 마찬가지로 시작 부위의 하류 기능적 요소들을 보유하는 것으로 나타났다. 프로모터 요소들 사이에 공간은 빈번하게 유연성이 있어, 요소들이 서로에 대해 역전되거나 또는 이동될 때 프로모터 기능이 보존된다. 티미딘 키나제(tk) 프로모터에서, 프로모터 요소들 사이의 공간은 활성이 감소가 시작되기 전까지 50bp까지 증가될 수 있다. 프로모터에 따라, 개별 요소들은 전사를 활성화하기 위하여 공동-운영 또는 독립적으로 기능을 할 수 있다.

프로모터는 유전자 또는 폴리뉴클레오티드 서열과 자연적으로 연합된 것일 수 있고, 코딩 분절(segment) 및/또는 엑손의 상류에 위치한 5'넌-코딩 (5' non-coding) 서열을 단리함으로써 획득될 수 있다. 이러한 프로모터는 "내생성(endogenous)"이라고 할 수 있다. 유사하게, 인헨서는 이 서열의 상류 또는 하류에 위치된 폴리뉴클레오티드 서열과 자연적으로 연합될 수 있다. 대안으로, 재조합 또는 이종기원의 프로모터 조절하에 코딩 폴리뉴클레오티드 분절을 위치시킴으로써 특정한 장점이 있을 수 있는데, 이들은 자연 환경에서 폴리뉴클레오티드 서열과 정상적으로 연합되지 않은 프로모터를 말한다. 재조합 또는 이종기원의 인헨서는 또한 자연 환경에서 폴리뉴클레오티드 서열과 정상적으로 연합되지 않은 인헨서를 지칭한다. 이러한 프로모터 또는 인헨서는 다른 유전자의 프로모터 또는 인헨서, 그리고 임의의 다른 원핵생물, 바이러스성, 또는 진핵 세포로부터 단리된 프로모터 또는 "자연적으로 생성되지 않는" 인헨서 그리고 프로모터 또는 인헨서, 가령, 상이한 전사 조절 영역들의 상이한 요소들, 및/또는 발현을 변경시키는 돌연변이를 포함하는 것들일 수 있다. 합성에 의해 프로모터 및 인헨서의 핵산 서열을 생산하는 것에 추가하여, 서열은 본 명세서에서 기술된 조성물과 함께, PCR을 포함하는 재조합 클로닝 및/또는 핵산 증폭을 이용하여 생산될 수 있다(U.S. 특허 4,683,202, U.S. 특허 5,928,906). 더욱이, 비-핵 세포 기관 가령, 미토콘드리아, 염색체 및 이와 유사한 기관 내에 서열의 전사 및/또는 발현을 지시하는 조절 서열이 또한 이용될 수 있음이 고려된다.

물론, 발현을 위하여 선택된 세포 유형, 세포기관, 및 유기체 내에서 DNA 분절의 발현을 효과적으로 지시하는 프로모터 및/또는 인헨서를 이용하는 것이 중요할 것이다. 분자 생물학 분야에 당업자는 일반적으로 단백질 발현을 위하여 프로모터, 인헨서, 및 세포 유형의 조합을 어떻게 이용하는지 잘 알 것이고, 예를 들면, Sambrook et al. (2001)을 참고. 이용되는 프로모터는 구성적, 조직-특이적, 유도성일 수 있거나, 및/또는 도입된 DNA 분절의 높은 수준의 발현을 지시하는 적절한 조건하에 유용할 수 있으며, 가령, 재조합 단백질 및/또는 폴리펩티드의 대규모 생산에 유익하다. 프로모터는 이종기원의 또는 내생성일 수 있다.

구성적 프로모터 서열의 한 가지 예는 즉각 초기 사이토메갈로바이러스 (CMV) 프로모터 서열이다. 이 프로모터 서열은 이에 연계된 임의의 폴리뉴클레오티드 서열의 높은 수준의 발현을 구동시킬 수 있는 강력한 구성적 프로모터 서열이다. 그러나, 유인원 바이러스 40 (SV40) 초기 프로모터, 마우스 유방 종양 바이러스 (MMTV), 인간 면역결핍 바이러스 (HIV) 긴 말단 반복(LTR) 프로모터, Moloney 바이러스 프로모터, 조류 백혈병 바이러스 프로모터, Epstein-Barr 바이러스 즉각 초기 프로모터, Rous 육종 바이러스 프로모터를 포함하나 이에 한정되지 않는 다른 구성적 프로모터 서열이 이용될 수 있으며, 뿐만 아니라 가령, 액틴 프로모터, 미오신 프로모터, 헤모글로빈 프로모터, 그리고 근육 크레아틴 프로모터를 포함하나 이에 한정되지 않는 인간 유전자 프로모터가 이용될 수 있다. 더욱이, 본 발명은 구성적 프로모터의 사용에 한정되어서는 안된다. 유도성 프로모터 또한 본 발명의 일부로 고려된다. 본 발명에서 유도성 프로모터의 사용은 발현이 바람직한 시기에 작동가능하도록 연계된 폴리뉴클레오티드 서열의 발현을 시작하고, 또는 발명이 바람직하지 못한 시기에는 발현을 차단할 수 있는 분자 스위치를 제공한다. 유도성 프로모터의 예로는 메탈로티오닌 프로모터, 글루코코르티코이드 프로모터, 프로게스테론 프로모터, 그리고 테트라사이클린 프로모터를 포함하나 이에 한정되지 않는다. 더욱이, 본 발명은 프로모터가 원하는 조직에서만 활성인, 조직-특이적 프로모터의 사용을 포함한다. 조직-특이적 프로모터는 당업계에 공지되어 있고, HER-2 프로모터 및 PSA 연합된 프로모터 서열을 포함하나 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 폴리펩티드 또는 폴리펩티드의 조합을 인코드하는 뉴클레오티드 서열의 발현을 평가하기 위하여, 세포 안으로 도입된 발현 벡터는 또한 도입된 선택성 표식 유전자 또는 리포터 유전자 또는 이둘 모두를 포함하여, 바이러스성 벡터를 통하여 형질감염된 또는 감염된 세포 집단으로부터 발현 세포를 식별 및 선택을 용이하게 한다. 다른 구체예들에서, 선택성 표식은 별도의 DNA 조각으로 운반될 수 있고, 공동-형질감염 과정에서 이용될 수 있다. 선택성 표식과 리포터 유전자 둘 모두다 숙주 세포 안에서 발현되도록 하기 위하여 적절한 조절 서열의 측면에 있을 수 있다. 유용한 선택성 표식들은 당업계에 공지되어 있고, 예를 들면, 항생제-저항성 유전자, 가령, neo 및 이와 유사한 것을 포함한다.

리포터 유전자들은 잠재적으로 형질감염된 세포를 식별하고, 조절 서열의 기능을 평가하기 위하여 이용된다. 용이하게 분석가능한 단백질을 인코드하는 리포터 유전자들은 당분야에 공지되어있다. 일반적으로, 리포터 유전자는 수령 유기체 또는 조직에 존재하지 않는 또는 이들에 의해 발현되지 않는 유전자이며, 일부 용이한 탐지가능한 성질, 가령, 효소 활성에 의해 이들 발현이 나타나는 단백질을 인코드한다. 리포터 유전자의 발현은 DNA가 수령 세포 안으로 도입된 후 적합한 시간에 분석된다.

적합한 리포터 유전자들은 루시퍼라제, 베타-갈락토시다제, 클로람페니콜 아세틸 전이효소, 분비된 알칼리 포스포타제, 또는 녹색 형광 단백질 유전자를 인코딩하는 유전자들을 포함할 수 있다 (가령, Ui-Tei et al., 2000 FEBS Lett. 479:79-82 참고). 적합한 발현 시스템들은 공지되어 있고, 공지의 기술을 이용하여 준비되거나, 또는 상업적으로 획득할 수 있다. 내부 결손 구조체들은 독특한 내부 제한 부위를 이용하거나 또는 독특하지 않은 제한 부위의 부분적 절단에 의해 생성될 수 있다. 그 다음 구조체들은 높은 수준의 siRNA 폴리뉴클레오티드 및/또는 폴리펩티드 발현을 나타내는 세포 안으로 형질감염될 수 있다. 일반적으로, 높은 수준의 리포터 유전자 발현을 보이는 최소 5' 측면 영역을 가진 구조체들이 프로모터로 확인된다. 이러한 프로모터 영역들이 리포터 유전자에 연계되어, 프로모터-구동된 전사를 조절하는 능력에 대하여 물질을 평가하는데 이용된다.

일부 구체예들에서, 발현 벡터는 원하는 폴리펩티드의 발현을 증가시키기 위하여 변형된다. 예를 들면, 벡터는 주어진 포유류 안에서 발현이 개선되도록 코돈 최적화를 거칠 수 있다. 예를 들면, 벡터는 인간 발현을 위하여 코돈-최적화될 수 있다. 또 다른 구체예에서, 발현 벡터는 효과적인 분비 리더를 포함한다. 예시적인 리더는 IgE 리더 서열이다. 또 다른 구체예에서, 발현 벡터는 해독을 개시하기 위하여 Kozak 요소를 포함한다. 또 다른 구체예에서, 이 핵산은 해독을 방해할 수 있는 시스-작용 서열 모티프/RNA 2차 구조가 제거된다. 이러한 변형, 및 기타 변형들은 DNA 백신에서의 용도에 대해 당업계에 공지되어 있다 (Kutzler et al, 2008, Nat. Rev. Gen. 9: 776-788; PCT App. No. PCT/US2007/000886; PCT App. No.; PCT/US2004/018962).

핵산 조성물을 도입하는 방법들

본 발명은 대상에게서 CDAD를 예방, 저해 및 치료하는 방법들을 또한 제공한다. 본 발명의 이 방법은 대상에게서 면역 반응을 일으킨다. 한 구체예에서, 이 방법은 톡신 A 및 톡신 B 특이적 항체들의 생산을 유도한다. 또 다른 구체예에서, 이 방법은 독소-특이적 항체-분비 세포(ASC)의 생산을 유도한다. 또 다른 구체예에서, 이 방법은 CDAD 및 연합된 병리를 예방, 감소 또는 치료한다.

한 구체예에서, 본 발명의 이 방법은 톡신 A RBD 및/또는 톡신 B RBD, 또는 이의 변이체들을 인코드하는 핵산의 유효량을 대상에게 투여하는 것을 포함한다. 한 구체예에서, 이 핵산은 세포 또는 세포 집단으로 전달된다. 한 구체예에서, 이 핵산은 생체 내, 예를 들면, 근육 내 경로를 통하여 세포로 전달된다. 또 다른 구체예에서, 이 핵산은 생체 외(ex vivo)에서 세포로 전달되는데, 그 다음 이 세포는 대상에게 투여된다. 바람직하게는, 이 세포들은 대상으로부터 기인된 것이다.

한 구체예에서, 본 발명의 이 방법은 생체 외 백신접종 방법에 이용될 수 있는데, 본 발명의 조성물은 세포 또는 세포 집단으로 전달되고, 이 세포 또는 세포 집단은 대상에게 투여되고, 이로 인하여 톡신 A 및/또는 톡신 B 항체들의 생성을 통하여 면역 반응이 유도된다.

발현 벡터의 내용에서, 벡터는 당분야에서 임의의 방법에 의해 숙주 세포, 가령, 포유류, 세균, 효모 또는 곤충 세포 안으로 용이하게 도입될 수 있다. 예를 들면, 발현 벡터는 물리적, 화학적, 또는 생물학적 수단에 의해 숙주 세포 안으로 옮겨질 수 있다.

폴리뉴클레오티드를 숙주 세포 안으로 도입시키는 물리적 방법은 인산 칼슘 침전, 리포펙션, 과립 투하, 현미주사, 전기천공, 및 이와 유사한 것들을 포함한다. 벡터 및/또는 외생성 핵산을 포함하는 세포를 생산하는 방법들은 당업계에 공지되어 있다. 예를 들면, Sambrook et al. (2001, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York), 및 Ausubel et al. (1997, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York) 참고.

관심 폴리뉴클레오티드를 숙주 세포 안으로 도입시키는 생물학적 방법들은 DNA 및 RNA 벡터의 이용을 포함한다. 바이러스성 벡터, 그리고 특히 레트로바이러스 벡터는 포유류, 가령, 인간 세포 안으로 유전자들을 삽입시키기 위하여 가장 많 방법이 되었다. 다른 바이러스성 벡터는 렌티바이러스, 천연두바이러스, 단순 포진 바이러스 I, 아데노바이러스 및 아데노-연합된 바이러스 그리고 이와 유사한 것으로부터 유도될 수 있다. 예를 들면, U.S. Pat. Nos. 5,350,674 및 5,585,362 참고.

폴리뉴클레오티드를 숙주 세포 안으로 도입시키는 화학적 수단은 콜로이드성 분산 시스템, 가령, 거대분자 복합체, 나노입자, 미소구, 비드, 그리고 수중유 유제를 포함하는 액체-기반 시스템, 미셀, 혼합형 미셀 및 리포좀을 포함한다. 시험관 및 생체 내에서 운반 비이클로 유용한 바람직한 콜로이드성 시스템이 리포좀(가령, 인위적인 막 소포)이다. 이러한 시스템의 준비 및 사용은 당업계에 공지되어 있다.

비-바이러스성 운반 시스템이 이용되는 경우, 예시적인 운반 비이클은 리포좀이다. 핵산을 숙주 세포 안(시험관, 생체 외 또는 생체 내)으로 도입시키는데 액체 제제의 이용이 고려된다. 또 다른 측면에서, 이 핵산은 액체와 연합될 수 있다. 액체와 연합된 핵산 연합된 리포좀의 수용성 내부에 의해 포획되고, 리포좀의 지질 이중층 안에 분산되고, 리포좀 및 올리고뉴클레오티드 모두와 연합된 연결 분자를 통하여 리포좀에 부착되고, 리포좀 안에 포집되고, 리포좀과 복합되고, 지질을 포함하는 용액에 분산되고, 지질과 혼합되고, 지질과 복합되고, 지질 안에 현탁액으로 포함되고, 미셀에 포함되거나 또는 미셀과 복합되고, 또는 그렇지 않으면 지질과 연합될 수 있다. 지질, 지질/DNA 또는 지질/발현 벡터 연합된 조성물은 용액에서 임의의 특정 구조로 제한되는 것이 아니다. 예를 들면, 이들은 미셀과 같은 이중층 구조로 존재하거나 또는 "붕괴된(collapsed)"구조로 존재할 수 있다. 또는 단순하게 용액에 뿌려질 수 있고, 크기와 모양이 일정하지 않은 응집체를 형성할 가능성도 있다. 지질은 자연적으로 생성되는 또는 합성 지질일 수 있는 지방성 물질이다. 예를 들면, 지질은 세포질 안에서 자연적으로 발생되는 지방 방울뿐만 아니라 긴-쇄 지방족 탄화수소 및 이들의 유도체, 가령, 지방산, 알코올, 아민, 아미노 알코올 및 알데히드와 같은 부류의 화합물을 포함한다.

사용하는데 적합한 지질은 시판되는 원료로부터 획득될 수 있다. 예를 들면, 디미리스틸 포스파티딜콜린 ("DMPC")은 Sigma, St. Louis, MO로부터 구할 수 있고; 디세틸 포스페이트 ("DCP")은 K & K Laboratories (Plainview, NY)로부터 구할 수 있고; 콜레스테롤 ("Choi")은 Calbiochem-Behring으로부터 구할 수 있고; 디미리스틸 포스파티딜글리세롤 ("DMPG") 및 기타 지질은 Avanti Polar Lipids, Inc. (Birmingham, AL)로부터 구할 수 있다. 클로로포름 또는 클로로포름/메탄올에서 지질의 원액 용액은 약 -20℃에 보관될 수 있다. 클로로포름은 메탄올보다 더 용이하게 기화되기 때문에 단지 용매로 이용된다. "리포좀"은 닫힌 지질 이중층 또는 응집물의 생성에 의해 형성된 다양한 단일 및 다층 라멜라 지질 비이클을 포괄하는 일반 명칭이다. 리포좀은 인지질 이중층 막과 내부 수성 매질을 가진 소포 구조를 보유한 것으로 특징화될 수 있다. 다층라멜라 리포좀은 수성 매질에 의해 분리된 다중 지질 층들을 가진다. 이들은 과량의 수성 용액에 인지질이 현탁될 때 자발적으로 형성된다. 지질 성분들은 닫힌 구조가 형성되기에 앞서 자체-재배열을 하고, 물을 포집하고, 지질 이중층 사이에 있는 용질을 용해시킨다(Ghosh et al., 1991 Glycobiology 5: 505-10). 그러나, 정상 소포 구보와 달리 용액에서 상이한 구조들을 보유한 조성물 또한 포괄된다. 예를 들면, 지질은 미셀 구조를 취하거나, 지질 분자의 비균일 응집물로 단순히 존재할 수 있다. 리포펙타민-핵산 복합체가 또한 고려된다.

다른 구체예들에서, 이 본 발명의 폴리펩티드는 시험관 전사된 mRNA를 이용하여 세포 안으로 전달된다. 시험관 전사된 mRNA는 운반체로써 형질감염된 세포 또는 포집화된, 결합된 또는 네이키드 mRNA의 무-세포 국소 또는 전신 운반을 이용하여 상이한 유형의 진핵세포뿐만 아니라 조직 그리고 전체 유기체로 전달될 수 있다. 이용된 방법은 일과성 발현이 요구되거나 또는 충분한 임의의 목적을 위한 것일 수 있다.

이 방법은 또한 예를 들면, 프로모터 또는 유입 RNA의 양을 변화시켜, 개별적으로 발현 수준을 조절하는 것이 가능하게 됨으로써 광범위하게 발현 수준을 조절하는 능력을 제공한다. 더욱이, mRNA 생산의 PCR-기반 기술은 키메라 수용체 mRNAs를 이들 도메인의 상이한 구조 및 조합으로 고안을 상당히 용이하게 한다. 예를 들면, 동일한 세포에서 다중 키메라 수용체 상에서 상이한 세포 내 효과물질/공동자극 도메인을 다양하게 함으로써 다중-항원 표적에 대항하여 최대 수준의 세포독성을 부과하고 동시에 정상 세포에게는 최저의 세포 독성을 부과하는 수용체 복합 구조의 측정이 허용된다.

본 발명의 RNA 형질감염 방법의 한 가지 장점은 RNA 형질감염이 기본적으로 일과성이며, 벡터-없이 일어난다는 것이다: RNA 이식유전자는 세포로 전달되고, 간단한 시험관 내 세포 활성화 후 임의의 추가 바이러스 서열의 필요없이 최소 발현 카세트로써 그 안에서 발현될 수 있다. 이런 조건하에, 이식유전자가 숙주 세포 게놈으로의 통합 가능성은 없다. 전체 임파세포 집단을 균일하게 변형시키기 위하여 RNA의 형질감염 효과 및 전체 임파세포 집단을 균일하게 변형시키는 이의 능력으로 인하여 세포의 클로닝은 필수적인 것은 아니다.

시험관-전사된 RNA (IVT-RNA)로 세포의 유전적 변형은 다양한 동물 모델에서 성공적으로 테스트된 두 가지 상이한 전략을 이용한다. 세포들은 리포펙션 또는 전기천공 수단에 의해 시험관-전사된 RNA로 형질감염된다. 바람직하게는, 전달된 IVT-RNA의 장기 발현을 획득하기 위하여 다양한 변형을 이용하여 IVT-RNA를 안정화시키는 것이 바람직하다.

시험관 전사를 위한 주형으로 표준화된 방식으로 이용되며, 안정화된 RNA 전사체가 생산되는 방식으로 유전적으로 변형된 일부 IVT 벡터들이 문헌에 공지되어 있다. 당업계에 이용되는 현재 프로토콜은 다음의 구조를 가진 플라스미드 벡터에 기초된다: RNA 전사를 가능하게 하는 5' RNA 중합효소, 이어서 3' 및/또는 5' 비해독된 영역들 (UTR)의 측면에 있는 관심 유전자, 그리고 50-70개의 A 뉴클레오티드를 함유하는 3' 폴리아데닐 카세트. 시험관 전사에 앞서, 원형 플라스미드는 유형 II 제한효소(인지 서열은 절단 부위에 대응)에 의해 폴리아데틸 카세트의 하류에서 선형화된다. 따라서, 폴리아데틸 카세트는 전사체에서 나중의 폴리(A) 서열에 대응한다. 이 과정의 결과로써, 일부 뉴클레오티드는 선형화 다음 효소 전단 부위의 일부로 남아있고, 3' 단부에서 폴리(A) 서열을 연정하거나 또는 감춘다. 이러한 비생리학적 오버행(overhang)이 이러한 구조체로부터 세포내적으로 생산된 단백질의 양에 영향을 주는지는 분명하지 않다.

RNA는 더 전통적인 플라스미드 또는 바이러스성 접근방식보다 몇 가지 장점을 보유한다. RNA 원천으로부터 유전자 발현은 전사를 요구하지 않고, 단백질 생성물은 형질감염 이후 신속하게 만들어진다. 더욱이, RNA는 핵보다는 세포질에 대한 접근만을 획득하기 때문에, 따라서 전형적인 형질감염 방법은 상당히 높은 비율의 형질감염을 얻는다. 또한, 플라스미드 기반 접근방법은 연구 중 세포에서 활성인 관심 유전자를 발현시키는 프로모터를 요구한다.

또 다른 측면에서, RNA 구조체는 전기천공에 의해 세포 안으로 전달될 수 있다. 가령, US 2004/0014645, US 2005/0052630A1, US 2005/0070841A1, US 2004/0059285A1, US 2004/0092907A1에서 교시된 것과 같이 제형화 및 포유류 세포 안으로 핵산 구조체들의 전기 천공 방법. 임의의 공지의 유형의 전기천공에 요구되는 전기장 강도를 포함한 다양한 파라미터들이 관련 연구 문헌뿐만 아니라 당해 분야 수많은 특허 및 출원에 일반적으로 알려져 있다. 가령, U.S. 특허 6,678,556, U.S. 특허 7,171,264, 및 U.S. 특허 7,173,116 참고. 전기천공의 치료 적용을 위한 장치는 시판되는 것을 사용할 수 있는데 가령, MedPulser™ DNA 전기천공 요법 시스템 (Inovio/Genetronics, San Diego, Calif.), 그리고 가령, U.S. 특허 6,567,694; U.S. 특허 6,516,223, U.S. 특허 5,993,434, U.S. 특허 6,181,964, U.S. 특허 6,241,701, 및 U.S. 특허 6,233,482에서 설명되어 있고; 전기천공은 US20070128708A1에서 설명된 것과 같이 시험관에서 세포의 형질 감염에 또한 이용될 수 있다. 전기천공은 시험관에서 세포로 핵산을 전달하는데 이용될 수도 있다. 따라서, 당업계 숙련자들에게 공지된 많은 이용가능한 장치 및 전기천공 시스템 중 임의의 것을 이용하여, 발현 구조체를 포함하는 핵산을 세포 안으로 전기천공-중개된 투여하는 것은 표적 T 세포에게 관심 대상의 RNA를 전달하는 수단을 제시한다.

숙주 세포 안으로 외생성 핵산을 도입하는데 이용되는 방법에 관계없이 또는 그렇지 않으면 본 발명의 저해물질에 세포를 노출시키는데 이용되는 방법에 관계없이, 숙주 세포에서 재조합 DNA 서열의 존재를 확인하기 위하여, 다양한 분석이 실행될 수 있는데, 가령, 예를 들면, 당업계 숙련자들에게 잘 알려진 "분자 생물학적" 분석, 가령, 서든 및 노든 블랏팅(Southern and Northern blotting), RT-PCR 및 PCR; "생화학" 분석, 가령, 면역학적 수단에 의한 특정 폴리펩티드의 존재 또는 부재의 탐지, 또는 본 발명의 범위에 속하는 물질을 확인하기 위하여 본 명세서에서 설명된 분석에 의해 수행될 수 있다.

백신

백신으로 유용한 항원 조성물의 경우, 항원 조성물은 세포, 조직 또는 포유류 (가령, 인간)에서 항원에 대해 면역 반응을 유도해야만 한다. 바람직하게는, 이 백신은 포유류에서 보호성 면역 반응을 유도한다. 본 명세서에서 이용된 것과 같이, "면역학적 조성물"은 예를 들면, 항원 (가령, 폴리펩티드), 항원을 인코드하는 핵산 (가령, 항원 발현 벡터), 또는 항원 또는 세포 성분을 발현 또는 제시하는 세포를 포함할 수 있다. 특정 구체예들에서, 항원 조성물은 본 명세서에서 설명하는 폴리펩티드 항원의 전부 또는 일부분, 또는 이의 면역학적으로 기능성 등가체를 포함 또는 인코드한다. 다른 구체예들에서, 항원 조성물은 추가 면역자극 물질 또는 이러한 물질을 인코드하는 핵산을 포함하는 혼합물에 있다. 면역자극 물질들은 추가 항원, 면역조절물질, 세포 또는 어쥬번트를 제시하는 항원을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 다른 구체예들에서, 하나 또는 그 이상의 추가 물질(들)은 임의의 조합으로 항원 또는 면역자극 물질에 공유적으로 결합된다. 특정 구체예들에서, 항원 조성물은 HLA 고정(anchor) 모티프 아미노산에 접합되거나 또는 이를 포함한다.

본 발명의 내용에서, 용어 "백신" (면역원성 조성물로 또한 지칭된다)은 동물에 접종시 항-클로스트리듐 디피실(C. difficile) 면역을 유도하거나 또는 클로스트리듐 디피실(C. difficile)을 억제하는 물질을 지칭한다.

본 발명의 백신은 핵산 및/또는 세포 성분들의 조성들의 조성물이 다양할 수 있다. 비-제한적 실시예에서, 항원을 인코드하는 핵산은 어쥬번트와 함께 조제되어도 된다. 물론, 본 명세서에서 기술된 다양한 조성물이 추가 성분들을 더 포함할 수 있음을 인지할 것이다. 예를 들면, 하나 또는 그 이상의 백신 성분들이 지질 또는 리포좀 안에 포함될 수 있다. 또 다른 비-제한적 실시예에서, 백신은 하나 또는 그 이상의 어쥬번트를 포함할 수 있다. 본 발명의 백신, 및 이의 다양한 성분들은 본 명세서에서 설명된 임의의 방법에 따라, 또는 본 개시내용에 의거하여 당업계에 공지되어 있는 방법에 의해 제조되거나 및/또는 투여될 수 있다.

한 구체예에서, 본 발명의 폴리펩티드 백신은 항원 제시 세포(APC)와 함께 도입되는 어쥬번트 물질들 및 폴리펩티드가 혼합된 펩티드를 포함하나 이에 한정되지 않는다. 후자 유형의 백신에 이용되는 가장 흔한 세포는 골수 및 말초 혈액 유도된 수지상 세포인데, 그 이유는 T 세포의 활성화를 돕는 공동자극 분자를 발현시키기 때문이다. WO00/06723은 종양 연합된 항원 폴리펩티드를 제시하는 APC를 포함하는 세포 백신 조성물을 공개한다. 이 폴리펩티드를 인코드하는 폴리뉴클레오티드(가령, DNA, RNA)와 함께 APC 또는 이 폴리펩티드 자체와 APC를 적하시킴으로써 폴리펩티드가 제시될 수 있다.

따라서, 본 발명은 서열 번호:1-4의 아미노산 서열을 보유하는 하나 또는 그 이상의 폴리펩티드, 또는 이의 변이체들을 이용하여 항-독소 면역을 유도하는 방법을 또한 포괄한다. 특정 폴리펩티드 또는 폴리펩티드의 조합이 동물에 접종시 항-독소 면역 반응을 유도할 때, 이 폴리펩티드 또는 이 폴리펩티드의 조합은 항-독소 면역 유도 효과를 보유하는 것으로 결정된다. 폴리펩티드 또는 이 폴리펩티드의 조합에 의한 항-독소 면역의 유도는 이 폴리펩티드에 대항하여 숙주의 면역계 반응을 생체 내 또는 시험관에서 관찰함으로써 탐지될 수 있다.

예를 들면, 세포독성 T 임파세포의 유도를 탐지하는 방법은 공지되어 있다. 생체로 진입된 외부 물질은 APC의 작용에 의해 T 세포 및 B 세포들에게 제시된다. 항원-특이적 방식으로 APC에 의해 제시된 항원에 반응하는 T 세포는 항원에 의한 자극으로 인하여 세포독성 T 세포 (세포독성 T 임파세포 또는 CTL로 또한 지칭된다)로 분화된다. 그 다음 이들 항원 자극된 세포는 분화된다. 이 공정은 T 세포의 "활성화"로 본 명세서에서 지칭된다. 따라서, 본 발명의 특정 폴리펩티드 또는 폴리펩티드의 조합에 의한 CTL 유도는 APC에 의해 T 세포로 이 폴리펩티드를 제시하고, CTL 유도를 탐지함으로써 평가될 수 있다. 더욱이, APC는 CD4+ T 세포, CD8+ T 세포, 대식세포, 호산구 및 NK 세포들을 활성화시키는 효과를 보유한다.

APC로써 수지상 세포 (DC)를 이용하여 CTL의 유도 작용을 평가하는 방법은 당업계에 공지되어 있다. DC는 APC 가운데 가장 강력한 CTL 유도 작용을 보유하는 대표적인 APC이다. 이 방법에서, 이 폴리펩티드 또는 이 폴리펩티드의 조합은 DC와 함께 최초로 접촉되고, 그 다음 DC는 T 세포와 접촉된다. DC와 접촉된 후 관심 세포에 대항하여 세포독성 효과를 보유하는 T 세포의 탐지에서 이 폴리펩티드 또는 이 폴리펩티드의 조합은 세포독성 T 세포를 유도하는 활성을 보유한다는 것을 보여준다. 더욱이, 항-IFN-감마 항체들, 가령, ELISPOT 분석을 이용하여 시각화함으로써, 고정된 폴리펩티드 또는 이 폴리펩티드의 조합을 나르는 항원-제시 세포의 존재하에서 CTL에 의해 생산되고 방출된 IFN-감마를 측정함으로써 유도된 면역 반응은 또한 검사될 수 있다.

DC와는 별도로, 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)를 또한 APC로 이용할 수 있다. CTL의 유도는 GM-CSF 및 IL-4 존재하에 PBMC 배양함으로써 강화될 수 있다고 보고된다. 유사하게, CTL은 키홀 림페트 헤모시아닌(KLH) 및 IL-7 존재하에 PBMC를 배양함으로써 유도된다고 확인되었다.

이들 방법에 의해 CTL 유도 활성을 보유한 것으로 확인된 폴리펩티드 또는 이 폴리펩티드의 조합은 DC 활성화 효과를 보유하고, 결과적으로 CTL 유도 활성을 보유한 폴리펩티드이다. 따라서, 톡신 A 및 톡신 B에 대항하여 CTL을 유도하는 폴리펩티드 또는 이 폴리펩티드의 조합은 클로스트리듐 디피실(C. difficile) 연합된 장애들에 대항한 백신으로 유용하다. 더욱이, APC에 의한 폴리펩티드 또는 이 폴리펩티드의 조합의 제시로 인하여 감염성 세포 독성을 보유하는 CTL 또한 클로스트리듐 디피실(C. difficile) 연합된 장애에 대항한 백신으로 유용하다.

일반적으로, 세포 면역요법용 폴리펩티드를 이용할 때, CTL-유도의 효과는 상이한 구조를 보유한 다중 폴리펩티드를 복합시키고, 이들을 DC와 접촉시킴으로써 증가될 수 있다. 따라서, 단백질 단편들로 DC를 자극할 때, 다중 유형의 단편들 혼합물을 이용하는 것이 유익하다.

폴리펩티드 또는 이 폴리펩티드의 조합에 의한 항-독소 면역의 유도는 특이적 독소에 대항하여 항체 생산의 유도를 관찰함으로써 추가 확인될 수 있다. 예를 들면, 폴리펩티드 또는 이 폴리펩티드의 조합에 대항하는 항체들이 이 폴리펩티드 또는 이 폴리펩티드의 조합으로 면역화된 실험실 동물에서 유도될 때, 그리고 클로스트리듐 디피실(C. difficile) 연합된 병리가 이들 항체에 의해 억제될 때, 이 폴리펩티드 또는 이 폴리펩티드의 조합은 항-클로스트리듐 디피실(C. difficile) 독소 면역을 유도하는 것으로 결정된다.

항-독소 면역은 본 발명의 백신을 투여함으로써 유도될 수 있고, 항-독소 면역의 유도로 톡신 A 및 톡신 B의 존재와 연합된 질병을 치료 및 예방할 수 있다. 클로스트리듐 디피실(C. difficile)과 연합된 질병에 대항하는 치료 또는 이 질병의 개시를 예방하는 것은 독소 유도된 액틴 탈안정화의 저해, 상피 파괴의 예방, 독소-중개된 점막 괴사의 저해, 그리고 감소된 장벽 기능의 예방을 포함할 수 있다. 클로스트리듐 디피실(C. difficile)과 연합된 질병을 가진 개체의 치사율 감소, 혈액에서 질병 표식들의 감소, 이 질병과 수반되는 탐지가능한 징후들의 완화는 이 질병의 치료 또는 예방에 또한 포함된다. 이러한 치료 및 예방 효과는 바람직하게는 예를 들면, 5% 또는 이 미만의 유의성 수준에서 관찰될 때 통계학적으로 유의적이며 이때 클로스트리듐 디피실(C. difficile)과 연합된 질병에 대한 백신의 치료 또는 예방 효과는 백신 투여되지 않은 대조군과 비교된다. 예를 들면, Student's t-테스트, Mann-Whitney U-테스트 또는 ANOVA는 통계학적 유의성을 결정할 때 이용될 수 있다.

본 발명은 클로스트리듐 디피실(C. difficile) 연합된 질병 또는 상태를 치료 또는 예방하는 방법을 제공한다. 본 발명의 치료 화합물들 또는 조성물은 이 질병 또는 상태로 고통받는, 또는 발생 위험에 처한 또는 발생가능성이 있는 대상에게 예방적으로 또는 치료적으로 투여될 수 있다. 이러한 대상은 표준 임상 방법을 이용하여 확인될 수 있다. 본 발명의 내용에서, 예방적 투여는 질병의 명백한 임상적 징후의 현시 전에 일어나고, 따라서, 질병 또는 장애는 예방되거나 또는 대안으로 질병의 진행이 지연된다. 의약 분야에서, 용어 "예방하다"란 질병으로부터 치사율 또는 유병율의 부담을 감소시키는 임의의 활성을 포괄한다. 예방은 1차, 2차 및 3차 예방 수준에서 일어날 수 있다. 1차 예방은 질병의 발생을 피하는 것이며, 2차 및 3차 예방 수준은 질병의 진행 및 징후들의 출현을 막고, 뿐만 아니라 기능을 회복시키고, 질병-관련된 합병증을 감소시킴으로써 이미 시작된 질병의 부정적 충격을 감소시키는 것을 목포로 하는 활동을 포괄한다.

면역학적 활성을 보유한 본 발명의 폴리펩티드 또는 폴리펩티드의 조합, 또는 이러한 폴리펩티드 또는 이 폴리펩티드의 조합을 인코드하는 폴리뉴클레오티드 또는 벡터는 어쥬번트와 복합될 수 있다. 어쥬번트는 면역학적 활성을 보유하는 폴리펩티드와 함께(또는 연속적으로) 투여될 때, 이 폴리펩티드 또는 이 폴리펩티드의 조합에 대항한 면역 반응을 강화시키는 화합물을 지칭한다. 적합한 어쥬번트의 예로는 콜레라 독소, 살모넬라 독소, 칼륨명반을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 더욱이, 본 발명의 백신은 약학적으로 수용가능한 운반체에 적절하게 복합될 수 있다. 이러한 운반체의 예로는 멸균수, 생리학적 염수, 포스페이트 완충액, 배양 유체 및 이러한 것들이다. 더욱이, 이 백신은 필수적으로 안정화제, 현탁액, 보존제, 계면활성제 및 이러한 것을 포함할 수 있다. 이 백신은 국소적으로 또는 전신으로 투여된다. 백신 투여는 단일 투여로 실시되거나 또는 다중 투여에 의해 부스터될 수 있다.

투여

당업계 숙련자는 상이한 운반 방법을 이용하여 벡터를 세포 안으로 투여할 수 있음을 인지할 것이다. 실시예들은 다음을 포함한다: (1) 물리적 수단, 가령, 전기천공 (전기), 유전자 총(물리적 힘) 또는 다량의 액체적용(압력)을 이용하는 방법; 그리고 (2) 전술한 벡터가 또 다른 엔터티, 가령, 리포좀, 응집된 단백질 또는 운반 분자와 복합되는 방법.

한 구체예에서, 본 발명의 이 방법은 본 발명의 폴리펩티드를 인코드하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 조성물을 대상에게 직접적으로 투여하는 것을 포함한다. 이 조성물의 투여는 예를 들면, 근육 내, 정맥 내, 복막, 피하, 피부 내, 뿐만 아니라 국소 투여를 포함할 수 있다. 한 구체예에서, 이 조성물의 운반은 생체 내 전기천공에 의해 지원된다. 한 구체예에서, 이 조성물의 운반은 근육 내 투여 및 생체 내 전기천공의 조합을 포함한다.

더욱이, 실제 용량 및 일정은 이 조성물이 다른 약학 조성물과 복합되어 투여되느냐 따라 또는 약동학, 약물 성향 및 대사에서 개인간 차이에 따라 달라질 것이다. 유사하게 양은 이용되는 특정 세포계통에 따라 시험관 적용에서 다양해질 수 있다(가령, 세포 표면에 존재하는 벡터 수용체의 수, 또는 이 세포계통에서 복제되는 유전자 전달에 이용되는 특정 벡터의 능력). 더욱이, 세포당 추가되는 벡터의 양은 벡터 안에 삽입되는 치료 유전자의 길이 및 안전성에 따라 달라지며, 뿐만 아니라 서열의 성질에 따라 달라질 것이고, 특히 실험적으로 결정해야하는 매개변수이며, 그리고 본 발명의 방법에 고유한 것이 아닌 인자(가령, 합성과 연관된 비용)들로 인하여 변경될 수 있다. 당업계 숙련자는 특정 상황의 요구에 따라 임의의 필요한 조정을 용이하게 할 수 있다.

치료 물질을 포함하는 세포들은 자살 유전자 이를 테면, 세포를 파괴시키는데 이용될 수 있는 산물을 인코드하는 유전자를 또한 포함할 수 있다. 많은 유전자 요법 상황에서, 숙주 세포에서 치료 목적으로 유전자를 발현시키고 뿐만 아니라, 자유자재로 숙주 세포를 파괴하는 능력을 보유하는 것이 바람직하다. 이 조성물은 자살 유전자와 연계될 수 있는데, 이 자살 유전자의 발현은 활성 화합물이 없을 때 활성화되지 않는다. 물질 및 자살 유전자가 모두 도입된 세포의 사멸이 바람직한 경우, 활성화 화합물이 세포로 투여되고, 이로 인하여 자살 유전자의 발현이 활성화되고, 세포는 죽게 된다. 이용되는 자살 유전자/프로드럭 복합물은 단순 포진 바이러스-티미딘 키나제(HSV-tk) 및 강시클로비르, 아실클로비르; 산화환원효소 및 사이클로헥시미드; 시토신 디아미네이즈 및 5-플로오르시토신; 티미딘 키나제 티미딜레이트 키나제 (Tdk::Tmk) 및 AZT; 그리고 데옥시시티딘 키나제 및 시토신 아라비노시드이다.

본 명세서에서 기술된 방법들은 결코 포괄적인 것이 아니며, 더욱이 특정 용도에 적합한 방법들은 당업계 숙련자들에게 자명할 것이다. 더욱이, 이 조성물의 유효량은 원하는 효과를 발휘하는 것으로 알려진 화합물들에 대한 유추를 통하여 더 근접해질 수 있을 것이다.

약학 조성물

본 발명은 본 발명의 치료 조성물의 투여가 필요한 포유류에게 이 치료 조성물을 투여함으로써, 포유류에서 CDAD와 연합된 질병 또는 상태를 치료하는 것을 계획한다. 본 발명에 따른 치료 조성물의 투여는 수령인의 생리학적 상태, 투여 목적이 치료인지 또는 예방인지에 따라, 그리고 숙련자들에게 알려진 기타 인자들에 따라 지속적 또는 간헐적 투여가 될 수 있다. 본 발명의 조성물의 투여는 필수적으로 사전선택된 기간 동안 지속적이거나, 또는 간격을 둔 일련의 용량이 될 수 있다. 국소 및 전신 투여 모두 고려된다. 투여되는 양은 선택된 조성물, 특정 질병, 포유류의 체중, 신체 상태, 나이 및 예방 또는 치료를 원하는지를 포함하나 이에 한정되지 않는 다양한 인자들에 따라 달라진다. 이러한 인자들은 동물 모델 또는 당업계에 공지되어 있는 다른 테스트 시스템을 이용하는 임상의사에 의해 용이하게 결정될 수 있다.

본 발명의 조성물을 보유하는 하나 또는 그 이상의 적합한 단위 약형(unit dosage)은 하기에서 논의되는 것과 같이, 지속된 방출용으로 선택적으로 제형화될 수 있고(예를 들면 현미캡슐 이용, WO 94/07529, 및 U.S. 특허 4,962,091 참고, 이들 각각은 전문이 여기에 참고자료로 편입된다), 그리고 정맥 내 그리고 근육 내 경로, 뿐만 아니라 병이든 조직으로 직접 주사를 포함하는 비경구를 포함하는 다양한 경로에 따라 투여될 수 있다. 제제는 적절한 경우, 별도의 단위 투약형으로 편리하게 제공되거나, 약학분야에 잘 공지된 임의의 방법에 의해 준비될 수 있다. 이러한 방법은 치료 물질을 액체 운반체, 고체 매트릭스, 반-고체 운반체, 미세하게 분할된 고체 운반체 또는 이의 조합에 연합시키고, 필요에 따라, 산물을 원하는 운반 시스템에 도입 또는 형상화시키는 단계를 포함할 수 있다.

본 발명의 조성물이 투여용으로 준비될 때, 약학 제제(formulation), 또는 단위 투약 형을 형성하기 위하여 바람직하게는 약학적으로 수용가능한 운반체, 희석제 또는 부형제와 복합된다. 이러한 제제에 총 활성 성분들은 제제의 중량의 0.1 내지 99.9%를 포함한다. "약학적으로 수용가능한"은 제제의 다른 성분들과 양립가능한 운반체, 희석제, 부형제, 및/또는 염이며, 이를 제공받은 수령자에게 무해하다. 투여용 활성 성분은 분말 또는 과립; 용액, 현탁액 또는 유제로 존재할 수 있다.

본 발명의 조성물을 함유하는 약학 제제는 공지된 바로 이용가능한 성분들을 이용하여 당업계에 공지되어 있는 절차에 따라 준비될 수 있다. 본 발명의 조성물은 장관외 투여, 예를 들면 근육 내, 피하 또는 정맥 내 경로에 적합한 용액으로 제형화될 수 있다.

본 발명의 조성물의 약학 제제는 수성 또는 무수성 용액 또는 분산형의 형태를 취하거나, 또는 대안으로 유제 또는 현탁액의 형태를 또한 취할 수 있다.

따라서, 이 조성물은 비경구 투여 (가령, 주사, 예를 들면, 다량(bolus) 주사 또는 연속 주입에 의해)용으로 제형화되고, 앰플, 서전-충전된 주사기, 소량 주입 용기에 단위 용량 형태로 제공되거나, 또는 추가된 보존제가 있는 다중-용량 용기로 제공될 수 있다. 활성 성분들은 현택액, 용액 도는 오일 또는 수성 비이클내 유제와 같은 형태를 취할 수 있고, 그리고 제형화 물질, 현탁, 안정화 및/또는 분산 물질을 포함할 수 있다. 대안으로, 활성 성분들은 사용 전, 적합한 비이클, 가령, 멸균, 발열원-없는 물과 같은 비이클로 재구성되도록 멸균 고체의 무균 단리에 의해 또는 용액으로부터 동결건조에 의해 획득된 분말 형태일 수 있다.

각 투약형의 개별 에어로졸 용량안에 포함된 활성 성분 또는 성분들의 단위 함량은 그 자체가 특정 징후 또는 질병을 치료하기 위한 유효량으로 구성될 필요는 없다는 것을 인지할 것인데, 그 이유는 필수 유효량은 다수의 투약 단위를 투여함으로써 필수 유효량에 도달할 수 있기 때문이다. 더욱이, 유효량은 개별적으로 또는 일련의 투여에 의해 투약형 내 다소 적은 용량을 이용하여 획득될 수 있을 것이다.

본 발명의 약학 제제는 선택적 성분으로써 약학적으로 수용가능한 운반체, 희석제, 용해 또는 유화 물질, 그리고 당업계에 공지되어 있는 유형의 염을 포함할 수 있다. 본 발명의 약학 제제에 유용한 운반체 및/또는 희석제의 특정 비-제한적 실시예는 물과 생리학적으로 수용가능한 완충된 염 용액, 가령, 포스페이트 완충된 염 용액 pH 7.0-8.0을 포함한다.

본 발명의 발현 벡터, 형질유도된 세포들, 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드 (활성 성분들)은 유기체의 신체에서 물질의 작용 부위와 활성 성분의 접촉을 만드는 임의의 수단에 의해 다양한 질병 상태를 치료하기 위하여 제형화되고 투여될 수 있다. 개별적 치료 활성 성분 또는 치료 활성 성분들의 조합으로된 약물과 결합되어 이용가능한 임의의 통상적인 수단에 의해 투여될 수 있다. 이들은 단독으로 투여될 수 있지만, 일반적으로 선택된 투여 경로 및 표준 약학 실행에 근거하여 선택된 약학 운반체와 함께 투여된다.

일반적으로, 물, 적합한 오일, 염, 수성 덱스트로즈(포도당), 및 관련된 당 용액 그리고 글리콜 가령, 프로필렌 글리콜 또는 폴리에틸렌 글리콜이 비경구 용액의 적합한 운반체이다. 비경구(parenteral) 투여용 용액은 활성 성분, 적합한 안정화 물질들 그리고 필요한 경우, 완충액 물질들을 포함한다. 항산화 물질들 가령, 중황산 나트륨, 아황산 나트륨 또는 단독 또는 조합된 아스코르브산이 적합한 안정화 물질들이다. 구연산 및 이의 염 그리고 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA) 또한 이용된다. 또한, 비경구 용액은 보존제 가령, 염화벤잘코늄, 메틸 또는 프로필-파라벤 및 클로로부탄올을 포함할 수 있다. 적합한 약학 운반체는 이 분야에서 표준 참고자료인 Remington's Pharmaceutical Sciences에 설명되고 있다.

본 발명의 활성 성분들은 포유류 및 특히 인간에서 사용하기에 적합한 약학적으로 수용가능한 조성물에 현탁되도록 제형화될 수 있다. 이러한 제제는 어쥬번트 가령, 무라밀 디폴리펩티드 유도체 (MDP) 또는 U.S. 특허 4,082,735; 4,082,736; 4,101,536; 4,185,089; 4,235,771; 및 4,406,890에서 설명된 유사체의 이용을 포함한다. 유용한 다른 어쥬번트는 명반 (Pierce Chemical Co.), 지질 A, 트레알로즈 디미코레이트 및 디메틸디옥타데실알루미늄 브롬화물(DDA), Freund 어쥬번트, 및 IL-12를 포함한다. 기타 성분들은 폴리옥시프로필렌-폴리옥시에틸렌 블록 고분자(Pluronic®), 비-이온 계면활성제 및 대사가능한 오일 가령, 스쿠알렌(U.S. 특허 4,606,918)을 포함할 수 있다.

추가로, 표준 약학 방법은 작용 기간을 조절하기 위하여 이용될 수 있다. 이들은 당업계에 공지되어 있고, 조절 방출 조제물을 포함할 수 있고, 그리고 적절한 거대분자, 예를 들면 폴리머, 폴리에스테르, 폴리아미노산, 폴리비닐, 피롤리돈, 에틸렌비닐아세테이트, 메틸 셀룰로오즈, 카르복시메틸 셀룰로오즈 또는 프로타민 설페이트를 포함한다. 방출을 조절하기 위하여 거대분자의 농도뿐만 아니라 통합 방법이 조정될 수 있다. 추가로, 이 물질은 폴리머 물질들 가령, 폴리에스테르, 폴리아미노산, 하이드로겔, 폴리(락트산) 또는 에틸렌비닐아세테이트 코폴리머의 입자에 통합될 수 있다. 통합에 추가적으로, 이들 물질은 마이크로캡슐에서 화합물을 포획하는데 또한 이용될 수 있다.

따라서, 본 발명의 약학 조성물은 특정 효과를 획득하기 위하여 포유류 신체내 다양한 부위로 다양한 경로를 통하여 전달될 수 있다(가령, Rosenfeld et al., 1991; Rosenfeld et al., 1991a; Jaffe et al., 상기; Berkner, 상기, 참고). 당업계 숙련자는 투여를 위하여 하나 이상의 경로가 이용될 수 있지만, 특정 경로가 다른 경로보다 더 즉각적이고 더 효과적인 반응을 제공할 수 있다는 것을 인지할 것이다. 국소 또는 전신 운반은 신체 강(cavities)으로 제제의 제공 또는 주입, 에어로졸의 흡입 또는 뿌리기를 포함하는 투여, 또는 근육 내, 정맥 내, 복막, 피하, 피부 내를 포함하는 비경구 도입, 뿐만 아니라 국소 투여에 의해 이루어질 수 있다. 한 구체예에서, 조성물의 운반은 생체 내 전기천공에 의해 도움을 받는다. 한 구체예에서, 조성물의 운반은 근육 내 투여 및 생체 내 전기천공의 조합을 포함한다.

본 발명의 활성 성분들은 단위 투약 형으로 제공될 수 있는데, 이때 각 투약형 단위, 가령, 찻숟가락, 테블릿, 용액, 또는 좌약은 예정된 양의 조성물만을 또는 다른 활성 물질들과 적절하게 복합된 예정된 양의 조성물을 포함한다. 용어"단위 투약 형"은 본 명세서에서 이용된 것과 같이 인간 및 포유류 대상에게 단일 투약형으로 적합한 물리적으로 분리된 단위를 지칭하는데, 각 단위는 적절한 경우 약학적으로 수용가능한 희석제, 운반체, 또는 비이클과 연합되어 원하는 효과를 생산하는데 충분한 양으로 산출된 예정된 양의 조성물만을 또는 다른 활성 물질들과 적절하게 복합된 예정된 양의 조성물을 포함한다. 본 발명의 단위 투약 형의 상세는 획득하고자 하는 특정 효과와 특정 숙주에서 약학 조성물과 연합된 특정 약동학에 따라 달라진다.

본 명세서에서 설명된 이들 방법들은 단지 설명을 위한 것이며, 특정 용도에 적합하도록 추가 방법들은 당업계 숙련자들에게 자명할 것이다. 본 명세서에서 설명된 이들 방법은 결코 포괄적이지 않으며, 그리고 특정 용도에 적합한 추가 방법들은 당업계 숙련자들에게 자명할 것이다. 더욱이, 조성물의 유효량은 원하는 효과를 발휘하는 것으로 공지된 화합물에 대한 추정을 통하여 더욱더 예측될 수 있다.

실험적 실시예들

본 발명은 다음의 실험적 실시예들을 참고하여 더 상세하게 설명된다. 이들 실시예들은 설명을 목적으로만 제공된 것이며, 다른 언급이 없는 한 제한되는 것을 의미하지 않는다. 따라서, 본 발명은 다음의 실시예에 제한되는 것으로 간주되서는 안되며, 오히려 본 명세서에서 제공된 교시의 결과로 자명되지는 임의의 그리고 모든 변화를 포괄하는 것으로 간주되어야 한다.

추가 설명 없이, 당업자는 전술한 설명 및 다음의 예시적인 실시예를 이용하여, 본 발명의 화합물을 만들고 이용하고, 청구된 방법들을 실시할 수 있을 것으로 본다. 따라서, 다음의 작업 실시예는 본 발명의 바람직한 구체예들을 특별히 지적하는 것이지만, 설명의 나머지를 어떠한 방식으로든 제한하는 것으로 간주되어서는 안된다.

실시예에서 이용된 재료 및 방법들을 지금 설명한다.

플라스미드 면역화 및 마우스

6 내지 8 주령의 암컷 Balb/C 마우스(Jackson Laboratory)의 사두근 근육에 벡터 기본골격의 조합 (pVAX, Invitrogen), 또는 (2005, Kutzler et al., J Immunol 175(1): 112-123; 1998, Kim et al., J Clin Invest 102(6) 1112-1124)에서 설명된 것과 같이, 항원 플라스미드를 포함하는 플라스미드 DNA 제제를 주사하였다. 제제는 등장성 구연산 완충액내에 0.25% 부피비카인-HCL (Sigma)에 함유되었다. 다양한 유전자 플라스미드의 공동-투여는 고안된 DNA 플라스미드를 혼합하여, 각 실험 집단은 주사에 앞서 20μL의 최종 용적 안에 동일한 농도의 DNA(모든 집단이 동일한 DNA 농도를 가지도록 추가된 벡터 기본골격)를 함유하도록 혼합하는 것과 관련되었다. 모든 DNA는 내독소-없는 Qiagen 컬럼을 이용하여 만들었다. 모든 동물은 DUCOM에서 온도-제어된 빛-순환된 설비 안에 가두었고, DUCOM에서 National Institutes of Health 및 IACUC/ULAR의 지침에서 관리되었다.

마우스에서 전기천공 조건

모든 실험에서 정사각파(Square-wave) 펄스를 이용하였고(Draghia-Akli and Smith, 2003, In: Templeton NS, Lasic DD (eds.) Gene Therapy - Thereapeutic Mechanisms and Strategies. Marcel Dekker, Inc., New York, 245-263) 그리고 우리 실험실에서 고안 및 테스트된 정전류 EKD와 함께 전달되었다. 마우스 실험에서 3 전극 배열(3-EA)이 이용되었다. 3-EA는 두 개의 긴 변은 길이가 0.5mm이며, 짧은 변은 길이가 0.3 mm이고, 이들은 비-전도성 플라스틱에 의해 고정된 형태의 이등변 삼각형 모양으로 된 3개의 26-가우지 고형 스테인레스 강 전극으로 구성된다. 마우스 실험을 위한 특이적 EP 조건은 정전류, 0.1 Amps, 3개 펄스, 52 msec/펄스, 펄스간 4 sec를 이용하였다. 플라스미드 주사와 EP 사이의 래그 타입은 약 20 sec이었다. 플라스미드 투여/EP를 위한 진행 순서는 다음과 같았다: 핸들 소켓에 1회용 전극 어셈블리를 위치시키고, 핸들에 있는 시작 단추를 누르고, 동물 실험 진단 수를 입력하고, 인슐린 주사기를 이용하여 DNA 구조체 플라스미드를 주사하고, 주사 부위 주변에 바늘을 즉시 위치시키고, 핸들에 있는 시작 단추를 누르고, 4초를 헤아린 후, 펄스가 전달될 것이다. 전기천공 후 5초 후, 배열이 근육으로부터 부드럽게 제거된다. 모든 전극은 모든 치료 동안 근육에 완전하게 삽입되었다.

마우스 희생, 조직 또는 시료 회수 및 면역 분석용 세포 정제 방법

범례에서 지정된 종점에서, 동물은 아베르틴 또는 이소플루란으로 진정시키고, 동물을 죽이기에 앞서 적절한 양의 혈액 및 대변 펠렛을 취하였다. 동물을 죽인 후, 각 마우스의 비장을 각 실험 집단으로부터 수거하였고, 조직은 R10 배지(RPMI1640 + 10% 태아 소 혈청, 500 μg/L 페니실린, 및 500 μg/L 스트렙토마이신, Gibco, Invitrogen)이 포함된 15 mL 원뿔형 튜브 안에 넣었다. 각 실험 집단으로부터 비장을 Seward Stomacher 80을 이용하여 단일 세포 현탁액으로 뭉개고, 40 미크론 세포 여과기를 통하여 통과시키고, 배지로 세척하였고, 펠렛화시킨 후, ACK 용해 완충액에서 실온에서 5 내지 10분간 항온처리하면, 적혈구 세포가 용해되었다. 모든 세포들은 세척되었고, 배지에서 재현탁되었고, 혈구계산기로 카운트되었다(세포 생존능은 트립판 블루 착색을 이용하여 결정된다).

ELISA 에 의해 IgG 및 IgA 결합 항체들의 분석

(1989, Ogawa et al., J Immunol 142(4): 1150-1158; 2004, Mestecky et al., AIDS research and human retroviruses 20(9): 972-988)에서 설명된 것과 같이 마우스 혈청 및 대변 추출물에서 항원-특이적 IgG를 측정하는데 ELISA를 이용하였다. 마우스 하악선 또는 안와정맥혈로부터 혈액 시료들을 수거하거나 또는 대변 펠렛들은 마우스 집단의 우리에서 얻었고, 후속적으로 혈청 및 대변 시료들은 각 실험 집단에서 개별적으로 운용되었다. EIA/RIA 플레이트 (Costar)는 웰당 최종 용적 100 μL으로 PBS(Mediatech)에서 희석된 0.5 내지 2 mg/mL의 톡소이드 A 또는 B (List Biologicals)로 피복되었고, 4℃에서 하룻밤 동안 항온처리되었다. 플레이트는 PBS/Tween (0.05% Tween 20)으로 3회 세척되었고, 실온에서 2시간 동안 200 μL의 차단 완충액/희석제 (3%BSA/PBS)에서 비-특이적 결합에 대해 차단되었다. 플레이트를 세척하였고, 면역화된 마우스로부터 얻은 PBS/1%BSA에서 희석된 모아진 혈청 또는 대변 추출물을 최종 용적 100 μL으로 웰에 추가하였다. 종점 적정(실험 동물에서 측정이 벡터-면역화된 마우스 시료 O.D. 값과 동일한 최저 시료 희석으로 정의됨)을 결정하기 위하여 1 대 25 내지 1 대 150,000 희석 시리즈의 희석에서 시료들은 3중으로 추가되었고, 실온에서 2시간 또는 4℃에서 하룻밤 항온처리되었다. 결합된 항체들은 양고추냉이 과산화효소-라벨된 염소 항-마우스 IgG 또는 IgA (Santa Cruz)로 탐지되었고, 기질 TMB H₂O₂ (SIGMA)로 발달되었다. 색깔 반응은 2N H₂SO₄로 중단되었고, 450 nm에서 흡수도는 EL312 Bio-Kinetics 미량플레이트 판독기(Bio-Tek Instruments Inc.)에서 판독되었다. 혈청 또는 대변 분비물에 있는 전체 IgG 또는 IgA의 양은 DeltaSoft II 프로그램(BioMettalics, Inc.)을 이용하여 교정 곡선상에 광학 밀도를 삽입함으로써 산출되었다.

IgA 및 IgG 측정을 위한 B 세포 ELISPOT

B 세포 ELISPOT는 기존에 설명된 것(1996, Slifka et al., J Immunol Met 199(1): 37-46; 2000, Brown et al., J Infect Dis 182(4): 1039-1043; 2004, Crotty et al., J Immunol Met 286(1-2): 111-122; 2003, Qadri et al., Infect Immun 71(8): 4808-4814)에서 하기에서 설명되는 약간의 변형을 가하여 실시되었다. 면역주사를 맞은 마우스는 최종 면역화 후 1주일 뒤 희생되었고, 항체-분비 세포들은 비장세포로부터 회수되었다. ELISpot 96-웰 플레이트는 웰당 100 μL의 최종 용적에서 PBS (Mediatech)에서 희석된 2 μg/mL의 톡소이드 A 또는 B (List Biologicals)로 피복되었고, 4℃에서 24시간 동안 항온처리되었다. 플레이트는 세척되고, 1% BSA와 함께 2시간 동안 차단되었다. 면역화된 마우스로부터 총 500,000개 임파 세포를 각 웰에 3중 첨가되었고, 37℃, 5% CO₂에서 5시간 동안 항온처리되었다. 플레이트를 세척하였고, 1:2000 희석된 항-마우스 IgA-바이오틴(PBS/1% BSA에서 희석됨) 100 μL를 추가하였고, 4℃에서 하룻밤 동안 항온처리하였다. 플레이트를 세척하였고, 1:100 희석의 스트렙타아비딘-알칼리 포스포타제 (diluted in PBS/1%BSA에서 희석됨) 100 μL를 추가하였고, 실온에서 2시간 동안 항온처리하였다. 플레이트를 세척하였고, (BCIP) 및 (NBT) 기질이 각 웰에 추가되었다. 플레이트는 증류수로 헹구고, 그리고 실온에서 건조되었다. 자동화된 ELISpot 판독기(CTL Limited, Inc.) 및 눈으로 스팟을 카운터하였다. 가공안된 값을 측정하였고 인자를 곱하여 IgA-분비 B 세포들 백만당 ASC (항체-분비 세포)로 데이터를 나타낸다

통계학적 분석

각 실험 집단에서 모아진 임파세포의 삼중 웰로부터 산출된 평균±표준편차(st dev)로 데이터를 나타낸다. 적절한 경우, 면역화 집단 사이에 통계학적 차이는 양측-검정(two-tailed), 쌍으로된 Student t Test를 이용하여 측정되었고, 각 실험 집단에서 특이적 p 값을 산출하였다. p 값 <0.05 으로 시료들 사이에 비교는 통계학적으로 상이하였으며, 따라서 유의미적이었다.

실험 결과는 지금 설명된다.

실시예 1: 근육 내 경로로 전달되고, 이어서 전기자극된 클로스트리듐 디피실(C. difficile )의 톡신 A 및 톡신 B 수용체 결합 도메인을 인코드하는 최적화된 DNA-기반 백신의 개발

클로스트리듐 디피실 (C. difficile ) RBD 플라스미드의 작제 및 발현

매우 최적화된 플라스미드는 신규한 플라스미드-기반 점막 케모킨과 함께 클로스트리듐 디피실(C. difficile)의 톡신 A (TcdA) 및 톡신 B (TcdB)에 근거하여 기획되었다. 매우 최적화된 항원 구조체의 생성을 위하여, 클로스트리듐 디피실(C. difficile) 계통 VPI 10463 (NCBI AAA23283)의 톡신 A 및 B 단백질에 대응하는 전장 아미노산 서열이 확인되었다; 카르복시 말단 세 번째 단백질을 접령하는 것으로 알려진 가상 수용체-결합 도메인 (RBD)의 아미노산 서열에 대응하는 잔기들은 컴퓨터내 실험기술로(in silico) 새로운 유전자 서열로 역-해독되었다. 코돈 최적화(인간을 위한), 효과적인 분비 리더 (IgE)의 추가, KOZAK 전후관계, 그리고 해독을 방해하는 시스-작용 서열 모티프/RNA 2차 구조의 제거를 포함하는 단백질 발현을 강화시키기 위하여 유전자 변형이 도입되었다(도 1). 또한, 잠재적 N-연계된 당화 서열이 돌연변이되어, 세균성 독소의 고유한 당화를 보호하였다. 그 다음 이 유전자는 상업적 합성 (Geneart)을 위해 제시되었다. 유전자 삽입물은 절단되었고(EcoR1/Xho1, New England Biolabs) 시판되는 벡터, pVAX (Invitrogen, Carlsbad, CA)에 결찰되었고, 그리고 단백질 발현은 생체 내 테스트를 위하여 웨스턴 블랏으로 확인되었다(도 1). 항원 구조체들은 TcdA-RBD 및TcdB-RBD으로 명명되었다. 이를 함께 고려하며, 케모킨의 플라스미드 형태는 특이적 케모킨 단백질을 발현시킨다고 데이터에서 설명된다.

면역화는 TcdA - 및 TcdB -특이적 항체들의 생체 내 생산 및 항체 방출 세포( ASCs )를 유도하였다

암컷 Balb/C 마우스(6 내지 8주령)는 삽입 벡터 기본골격, pVAX의 필요량과 함께, pA RBD N→Q 또는 pB RBD N→Q의 항원 구조체의 다양한 양(5μg, 10μg, 또는 25μg)의 플라스미드 DNA 제제로 면역화되어, 총 25μg의 전체 플라스미드를 확보하였다. 마우스는 0 일, 14 일, 그리고 28일에 면역화되었다. 38일 시점에 마우스를 죽였다. 면역화된 집단으로부터 혈청 및 대변 시료들은 1:20 내지 1:200000 범위에서 PBS/1% BSA에 희석되었다. 희석물은 1 μg/mL 톡소이드 A (txdA) 또는 톡소이드 B (txdB)으로 피복된 EIA/RIA 플레이트에 제공되었다. 항온처리 후, 항체 결합은 450nm (OD450)에서 흡수도 판독을 통하여 탐지되었다. 항체 결합은 테스트된 pA RBD N→Q 및 pB RBD N→Q의 모든 양에 대해 탐지되었다(도 2). 더욱이, 톡신 A 및 톡신 B 특이적 IgG는 면역화된 마우스의 혈청에서 탐지되었지만, IgA는 아니다.

비장은 면역화 이후 1주일 시점에 수거되었고, 본 명세서에서 설명된 것과 같이 비장세포로부터 ASC가 수거되었다. B 세포 ELISPOT 분석은 2 μg/mL의 txdA 또는 txdB로 피복된 ELISPOT 96-웰 플레이트에서 실시되었다. 면역화된 집단의 세포와 함께 항온처리된 후 카운트된 스팟은 pA RBD N→Q 또는 pB RBD N→Q으로 면역화는 면역화된 마우스에서 ASC의 수를 증가시켰다는 것을 설명한다(도 3).

TcdA - RBD 및 TcdB - RBD 으로 동시 면역화

0 일, 14 일, 그리고 28일에 10ug pA RBD N→Q 및 10μg pB RBD N→Q를 동시에 IM/EP로 마우스를 면역화하거나, 또는 20μg의 벡터 기본골격 대조군, pVAX으로 면역화하였다. 톡신 A 및 톡신 B 특이적 항체들은 면역화된 동물의 혈청 시료에서 ELISA에 의해 탐지되었다(도 4). 더욱이, 면역화된 동물의 단리된 비장 세포는 면역화 이후 톡신 A-특이적 그리고 톡신 B-특이적 ASC 모두의 수가 증가되었음을 설명한다(도 4).

독소 특이적 기억 반응 및 백신-유도된 B 세포들의 분석

백신접종된 마우스의 비장세포는 72시간 동안 PWIM (1:100,000), CpG 2006 (6 μg/mL), 그리고 S. 아우레우스(aureus) Cowan (1:10,000)으로 자극되었고, 그리고 1 μg/mL txdA 또는 txdB로 피복된 플레이트와 함께 항온처리되었다. 톡신 A-특이적 그리고 톡신 B-특이적 기억 반응이 관찰되었는데, 그 이유는 톡신 A- 또는 톡신 B-백신접종된 마우스로부터 수거된 자극된 비장세포들은 톡신 A- 또는 톡신 B-특이적 ASC의 수가 증가되었음을 나타내었기 때문이다.

RBD -면역화된 동물의 혈청은 세포 라운딩( cell rounding )을 방지한다.

독소의 제공은 아프리카 그린 원숭이의 신장 세포에서 유도된 불사화된 세포 계통인 베로 세포의 용량-의존적 라운딩을 초래한다. 따라서, 세포 라운딩은 시험관에서 독소-중개된 병리 시험의 표식으로 이용될 수 있다. pA RBD N→Q로 면역화된 마우스의 혈청 시료는 250 ng 톡신 A로 유도된 세포 라운딩을 방지하는 능력을 보였다. 더욱이, pB RBD N→Q로 면역화된 마우스의 혈청 시료들 또한 250 ng 톡신 B (도 6)의 적용으로 보여진 세포의 라운딩을 방지시키는 능력이 설명되었다. 함께, 이들 데이터에서는 본 명세서에서 설명된 DNA 구조체로 면역화된 마우스에서 생산된 톡신 A- 및 톡신 B-특이적 항체들은 클로스트리듐 디피실(C. difficile)에 의해 생성된 독소에 의해 유도된 병리로부터 보호한다.

pCdiffA /B로 IM / EP 면역화는 마우스를 전신 독소 공격으로부터 보호한다.

0 일, 14 일, 그리고 28일에 pA RBD N→Q 및 pB RBD N→Q로 마우스가 면역화된다. 최종 면역화 용량 이후 5주 시점에서 마우스는 톡신 A 및 톡신 B로 공격받았다. 체중 감소 및 클로스트리듐 디피실(C. difficile)-연합된 질병 (CDAD)의 징후에 대해 14일 동안 매일 마우스를 감시하였다. 대조군 pVAX 만으로 면역화된 마우스에서, 공격을 받은 모든 마우스는 24시간 이내 죽었다. 그러나 25 μg pA RBD N→Q로 면역화된 마우스는 300 ng의 톡신 A에 의해 매개된 죽음으로부터 보호되었고, 25 μg pB RBD N→Q로 면역화된 마우스는 각 150 ng의 톡신 A 및 톡신 B의 공격에 의해 매개된 죽음에 대항하여 보호되었다(도 7).

인도 암컷 레소스 마카크(Rhesus macaques)의 면역화

인도 암컷 레소스 마카크(Rhesus macaques)는 0, 6, 12, 및 18 주에 pTcdA/B N→Q에 의해 IM/EP로 면역화되었다. 2, 8, 및 14주 시점에서 IgG 항-A RBD 및 IgG 항-B RBD의 역가가 평가되었다. 분석에 따르면, 백신접종된 구조체는 상당한 면역원성인데, 그 이유는 면역화 일정 동안 특이적 항체들이 탐지되었기 때문이다(도 8)

실시예 2: CDAD 예방용 신규한 DNA 백신 개발

톡신 A 및 톡신 B의 RBD를 인코드하는 매우 최적화된 플라스미드의 창조에 대해 본 명세서에서 설명되는데, 이때 가상 N-연계된 당화 부위는 변경되었다. 본 명세서에서 포함된 항원 DNA 변형은 도 9A에 요약된다. pVAX의 주요 성분들을 나타내는 플라스미드 지도는 도 9A에 나타낸다. A 또는 B RBD wt 및 A 또는 B RBD N→Q를 인코드하는 4개 플라스미드가 최적화되고 구축되었다. 톡신 A 및 B의 RBD에서가상 N-연계된 당화 부위는 도 9B에서 밑줄로 표시된다. 이들 부위에서, DNA 백신 플라스미드의 작제동안 Gln (Q)는 첫 Asn (N)을 대체하였다. 발현을 실증하기 위하여, 293T 세포 (3.0x10⁵ 세포)는 Lipofectamine 2000을 이용하여 2 μg의 pRBD N→Q 구조체로 형질감염되었다. 형질감염 후 48시간 시점에, 용해물 (RIPA 완충액) 및 상층액은 수거되었고, SDS-PAGE (4-12%)에서 분획화되었고, 그리고 PVDF 막으로 전달되었다. 면역탐지는 특이적 마우스 항혈청으로 실행되었고, 그리고 ECL 탐지 시스템을 이용하여 양고추냉이 과산화효소-접합된 염소 항-마우스 IgG로 발현된 단백질이 시각화되었다(도 9C). 용해물 및 상층액 분획은 1시간 동안 37℃에서 500U의 폴리펩티드 N-글리코시다제 F (PNGaseF)로 절단되고, 65℃에서 15분간 비활성화되었다. 시료들은 상기에서 설명된 것과 같이 SDS-PAGE (8%) 및 면역탐지되었다(도 9D). 구조체의 면역탐지에서 N→Q 구조체는 당화되지 않음이 나타났다.

C57BL/6 마우스(한 집단에 n=4)는 두 플라스미드 모두로 근육 내로 3회 면역화되고, 2주 간격을 두고 생체 내 전기천공되었다(도 10). 혈청 및 대변 물질은 장기간에 걸쳐 수집되고, Tcd A/B RBD-특이적 면역 반응에 대해 분석되었다. 각 면역화 시점에 혈청 내 항체 수준이 측정되었다. 96-웰 플레이트는 0.5 μg/mL의 톡소이드 A 또는 B로 하룻밤 동안 피복되었다. 혈청 희석물이 추가되었고, HRP-접합된 항체들을 이용하여 전체 IgG가 측정되었다(도 11A). 혈청 분석에서 백신접종은 유의적 수준의 항-RBD 항체들을 유도하였음이 설명되었다.

ELISpot 플레이트는 0.5 μg/mL의 톡소이드 A 또는 B 또는 전체 IgG로 하룻밤 동안 피복되었다. 비장세포는 3번째 면역화 이후 10일에 단리되었고, 플레이트에 추가되다(Ag-특이적, 5.0x10⁵ 세포/웰 및 총 IgG, 1.0x10⁴ 세포/웰). 24시간 이후, 세포를 씻어내고, HRP-접합된 항체들로 프로브시켰다(도 11B). 대안으로, 비장세포 (1.5x10⁶)는 R10 배지 + 1:6 CpG2006, 1:1000 PWM, 1:1000 BMe, 및 1:10000 SAC에서 3일간 자극되어 기억 B 세포들이 증식되도록 조장하였다(도 11C). 항원-특이적 기억 B 세포들은 상기에서 설명된 것과 같이 탐지되었다. 비장세포의 분석에서 백신접종은 RBD-특이적 항체 분비 세포의 빈도 증가를 유발하는 것이 설명되었다. 더욱이, 백신접종된 마우스의 비장세포는 RBD-특이적 기억 반응의 증가를 설명하였다. 추가로, 항원-특이적 IgG의 말초 역가는 IgA보다 더 높았다.

베로 세포 (5.0x10⁴ 세포)는 96-웰 플레이트에서 단층이 되도록 성장되었다(24시간). 마우스 혈청은 25 μL의 R10 배지로 희석되었고, 그리고 250 ng의 톡신 A 또는 톡신 B를 포함하는 25 μL 의 R10에 추가되었다. 부드럽게 혼합되고, 37℃에서 1시간 동안 항온처리되고, 96-웰 플레이트에 중복 추가되었다. 20-24 시간 이후, 10X 확대하에 세포 라운딩이 평가되었다. 도면은 두 개 웰을 통하여 평균 효과를 나타낸다. 염소 항-톡신 A (List Biologicals)은 양성 대조군으로 이용되었다(도 12A). pRBD N→Q 면역화된 마우스의 혈청은 시험관에서 클로스트리듐 디피실(C. difficile) 독소의 세포병리 효과를 중화시켰다. 세포 라운딩의 정성화는 웰당 6개의 무작위 필드를 분석하고, 라운드된 세포의 비율을 평균내어 실시되었다. 결과는 pVAX 혈청 및 염소 항-톡신 A에 비교하여 도표화되었다(도 12B). 이 데이터에서 RBD A N→Q 혈청은 RBD B N→Q 혈청보더 더 효과적으로 독소 활성을 중화시켰다는 것이 설명된다.

치명적 독소 공격에 반응하여 독소 특이적 백신접종의 능력이 마우스 모델에서 평가되었다. 0, 2, 및 4 주 시점에서 마우스들이 면역화되었다. 면역화 이후 5주차에, 마우스는 독소로 공격을 받고, 2주간 감시되었다(도 13). C57BL/6 5마리 마우스는 다음의 것으로 i.p. 공격을 받았다: (1) 150 ng 톡신 A 또는 B; (2) 300 ng 톡신 A 또는 B; (3) 75 ng의 두 가지 독소 모두; 또는 (4) 150 ng의 두 가지 독소 모두. 유병율 징후에 대해 마우스를 매일 관찰하였다(도 14A). 300 ng의 톡신 A 그리고 각각 150 ng의 톡신 A 및 Tcd B는 50시간 이내 공격을 받은 동물이 모두 사망했다는 결과가 관찰되었다. 한 집단당 10마리의 C57BL/6 마우스는 i.p.로 독소 공격을 받았다. A RBD N→Q 마우스는 300 ng 톡신 A를 제공받았고, B RBD N→Q 마우스는 각각 150 ng의 독소를 제공받았다(도 14B). 백신접종은 생존을 상당히 개선시켰음이 관찰되었다.

이들 데이터는 톡신 A/B RBD-기반 DNA 백신의 강력한 면역원성을 설명한다. 파괴된 N-연계된 당화부위를 포함하는 최적화된 플라스미드는 포유류 세포 계통에서 발현될 수 있음이 확인된다. 293T 세포에 의해 발현된 야생형 RBD는 N→Q RBD와는 달리 당화되는데, 이 돌연변이는 고유한 클로스트리듐 디피실(C. difficile) RBD 영역들의 비-당화된 형태를 보존하는데 필수적이라는 것을 설명한다.

본 명세서에서 언급된 각각 그리고 모든 특허, 특허 출원 및 공개는 이들 각각은 전문이 여기에 참고자료로 편입된다. 본 발명은 특정 구체예를 참고하여 설명되지만, 본 발명의 다른 구체예들 및 변화 또한 본 발명의 진실된 사상 및 범위를 벗어나지 않고 당업자에 의해 고안될 수 있음은 자명하다. 첨부된 청구범위는 이러한 구체예 및 등가의 변화를 모두 포함하는 것으로 해석되어야 한다.

SEQUENCE LISTING <110> Philadelphia Health and Education Corp., d/b/a Drexel University College of Medicine Trustees of the University of Pennsylvania Inovio Pharmaceuticals, Inc. Kutzler, Michele Baliban, Scott Weiner, David B Kim, Joseph Sardesai, Niranjan <120> Novel Clostridium Difficile DNA Vaccine <130> 046528-6051-00-WO.601478 <150> US 61/506,973 <151> 2011-07-12 <160> 4 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 872 <212> PRT <213> Clostridium difficile <400> 1 Ser Leu Phe Tyr Phe Asp Pro Ile Glu Phe Asn Leu Val Thr Gly Trp 1 5 10 15 Gln Thr Ile Asn Gly Lys Lys Tyr Tyr Phe Asp Ile Asn Thr Gly Ala 20 25 30 Ala Leu Thr Ser Tyr Lys Ile Ile Asn Gly Lys His Phe Tyr Phe Asn 35 40 45 Asn Asp Gly Val Met Gln Leu Gly Val Phe Lys Gly Pro Asp Gly Phe 50 55 60 Glu Tyr Phe Ala Pro Ala Asn Thr Gln Asn Asn Asn Ile Glu Gly Gln 65 70 75 80 Ala Ile Val Tyr Gln Ser Lys Phe Leu Thr Leu Asn Gly Lys Lys Tyr 85 90 95 Tyr Phe Asp Asn Asn Ser Lys Ala Val Thr Gly Trp Arg Ile Ile Asn 100 105 110 Asn Glu Lys Tyr Tyr Phe Asn Pro Asn Asn Ala Ile Ala Ala Val Gly 115 120 125 Leu Gln Val Ile Asp Asn Asn Lys Tyr Tyr Phe Asn Pro Asp Thr Ala 130 135 140 Ile Ile Ser Lys Gly Trp Gln Thr Val 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Phe Gly Gln Asn Ser Lys Ala Val Thr Gly Trp Gln Thr Ile Asn 820 825 830 Gly Lys Val Tyr Tyr Phe Met Pro Asp Thr Ala Met Ala Ala Ala Gly 835 840 845 Gly Leu Phe Glu Ile Asp Gly Val Ile Tyr Phe Phe Gly Val Asp Gly 850 855 860 Val Lys Ala Pro Gly Ile Tyr Gly 865 870 <210> 4 <211> 526 <212> PRT <213> Clostridium difficile <400> 4 Ser Leu Tyr Tyr Phe Lys Pro Pro Val Asn Asn Leu Ile Thr Gly Phe 1 5 10 15 Val Thr Val Gly Asp Asp Lys Tyr Tyr Phe Asn Pro Ile Asn Gly Gly 20 25 30 Ala Ala Ser Ile Gly Glu Thr Ile Ile Asp Asp Lys Asn Tyr Tyr Phe 35 40 45 Gln Gln Ser Gly Val Leu Gln Thr Gly Val Phe Ser Thr Glu Asp Gly 50 55 60 Phe Lys Tyr Phe Ala Pro Ala Asn Thr Leu Asp Glu Asn Leu Glu Gly 65 70 75 80 Glu Ala Ile Asp Phe Thr Gly Lys Leu Ile Ile Asp Glu Asn Ile Tyr 85 90 95 Tyr Phe Asp Asp Asn Tyr Arg Gly Ala Val Glu Trp Lys Glu Leu Asp 100 105 110 Gly Glu Met His Tyr Phe Ser Pro Glu Thr Gly Lys Ala Phe Lys Gly 115 120 125 Leu Asn Gln Ile Gly Asp Tyr Lys Tyr Tyr Phe Asn Ser Asp Gly Val 130 135 140 Met Gln Lys Gly Phe Val Ser Ile Asn Asp Asn Lys His Tyr Phe Asp 145 150 155 160 Asp Ser Gly Val Met Lys Val Gly Tyr Thr Glu Ile Asp Gly Lys His 165 170 175 Phe Tyr Phe Ala Glu Asn Gly Glu Met Gln Ile Gly Val Phe Asn Thr 180 185 190 Glu Asp Gly Phe Lys Tyr Phe Ala His His Asn Glu Asp Leu Gly Asn 195 200 205 Glu Glu Gly Glu Glu Ile Ser Tyr Ser Gly Ile Leu Asn Phe Asn Asn 210 215 220 Lys Ile Tyr Tyr Phe Asp Asp Ser Phe Thr Ala Val Val Gly Trp Lys 225 230 235 240 Asp Leu Glu Asp Gly Ser Lys Tyr Tyr Phe Asp Glu Asp Thr Ala Glu 245 250 255 Ala Tyr Ile Gly Leu Ser Leu Ile Asn Asp Gly Gln Tyr Tyr Phe Asn 260 265 270 Asp Asp Gly Ile Met Gln Val Gly Phe Val Thr Ile Asn Asp Lys Val 275 280 285 Phe Tyr Phe Ser Asp Ser Gly Ile Ile Glu Ser Gly Val Gln Asn Ile 290 295 300 Asp Asp Asn Tyr Phe Tyr Ile Asp Asp Asn Gly Ile Val Gln Ile Gly 305 310 315 320 Val Phe Asp Thr Ser Asp Gly Tyr Lys Tyr Phe Ala Pro Ala Asn Thr 325 330 335 Val Asn Asp Asn Ile Tyr Gly Gln Ala Val Glu Tyr Ser Gly Leu Val 340 345 350 Arg Val Gly Glu Asp Val Tyr Tyr Phe Gly Glu Thr Tyr Thr Ile Glu 355 360 365 Thr Gly Trp Ile Tyr Asp Met Glu Gln Glu Ser Asp Lys Tyr Tyr Phe 370 375 380 Asn Pro Glu Thr Lys Lys Ala Cys Lys Gly Ile Asn Leu Ile Asp Asp 385 390 395 400 Ile Lys Tyr Tyr Phe Asp Glu Lys Gly Ile Met Arg Thr Gly Leu Ile 405 410 415 Ser Phe Glu Asn Asn Asn Tyr Tyr Phe Asn Glu Asn Gly Glu Met Gln 420 425 430 Phe Gly Tyr Ile Asn Ile Glu Asp Lys Met Phe Tyr Phe Gly Glu Asp 435 440 445 Gly Val Met Gln Ile Gly Val Phe Asn Thr Pro Asp Gly Phe Lys Tyr 450 455 460 Phe Ala His Gln Asn Thr Leu Asp Glu Asn Phe Glu Gly Glu Ser Ile 465 470 475 480 Gln Tyr Thr Gly Trp Leu Asp Leu Asp Glu Lys Arg Tyr Tyr Phe Thr 485 490 495 Asp Glu Tyr Ile Ala Ala Thr Gly Ser Val Ile Ile Asp Gly Glu Glu 500 505 510 Tyr Tyr Phe Asp Pro Asp Thr Ala Gln Leu Val Ile Ser Glu 515 520 525

Claims (26)

1. 다음으로 구성된 군으로부터 선택된 최소한 하나의 핵산을 포함하는 백신:
   a. 서열 번호:3의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 인코드하는 핵산; 그리고
   b. 서열 번호:4의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 인코드하는 핵산.
2. 청구항 1에 있어서, 분비 리더 펩티드를 인코드하는 핵산을 더 포함하는, 백신.
3. 청구항 2에 있어서, 분비 리더 펩티드는 IgE 분비 리더 펩티드인, 백신.
4. 청구항 1에 있어서, 이 핵산은 하나의 발현 벡터 안에 통합되는, 백신.
5. 청구항 1에 있어서, 이 핵산은 2개 또는 그 이상의 발현 벡터 안에 통합되는, 백신.
6. 청구항 1에 있어서, 최소한 하나의 핵산은 인간 세포에서 발현용으로 코돈-최적화된, 백신.
7. 청구항 1의 백신을 포유류의 조직으로 투여하는 단계를 포함하는, 클로스트리듐 디피실(C. difficile)에 대항하여 포유류를 면역화시키는 방법.
8. 청구항 7에 있어서, 다음의 단계를 포함하는 방법:
   a. 이 백신을 포유류의 조직으로 투여하는 단계; 그리고
   b. 포유류의 조직의 세포 안으로 핵산 분자의 진입을 허용하는데 효과적인 전류로 포유류 조직의 세포를 전기천공하는 단계.
9. 청구항 8에 있어서, 포유류의 조직은 근육인, 방법.
10. 청구항 7에 있어서, 이 백신은 근육 내 또는 피부 내 주사로 투여되는, 방법.
11. 청구항 7에 있어서, 포유류는 현재 클로스트리듐 디피실(C. difficile)에 감염되지 않았으며, 이 백신은 보호성 면역 반응을 유도하는, 방법.
12. 청구항 11에 있어서, 보호성 면역 반응은 서열 번호:3의 폴리펩티드 및 서열 번호:4의 폴리펩티드로 구성된 집단의 최소한 하나의 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 최소한 하나의 항체를 포함하는, 방법.
13. 청구항 7에 있어서, 포유류는 인간인, 방법.
14. 청구항 1에 따른 백신을 포유류 조직으로 투여하는 단계를 포함하는 클로스트리듐 디피실(C. difficile)에 감염된 포유류를 치료하는 방법.
15. 청구항 14에 있어서, 다음의 단계를 포함하는 방법:
    a. 이 백신을 포유류의 조직으로 투여하는 단계; 그리고
    b. 포유류의 조직의 세포 안으로 핵산 분자의 진입을 허용하는데 효과적인 전류로 포유류 조직의 세포를 전기천공하는 단계.
16. 청구항 14에 있어서, 포유류의 조직은 근육인, 방법.
17. 청구항 14에 있어서, 이 백신은 근육 내 또는 피부 내 주사로 투여되는, 방법.
18. 청구항 14에 있어서, 포유류는 현재 클로스트리듐 디피실(C. difficile)에 감염되지 않았으며, 이 백신은 보호성 면역 반응을 유도하는, 방법.
19. 청구항 18에 있어서, 보호성 면역 반응은 서열 번호:3의 폴리펩티드 및 서열 번호:4의 폴리펩티드로 구성된 집단의 최소한 하나의 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 최소한 하나의 항체를 포함하는, 방법.
20. 청구항 14에 있어서, 포유류는 인간인, 방법.
21. 서열 번호:3의 아미노산 서열을 인코드하는 단리된 폴리펩티드.
22. 서열 번호:3의 아미노산 서열을 인코드하는 단리된 핵산.
23. 서열 번호:4의 아미노산 서열을 포함하는 단리된 폴리펩티드.
24. 서열 번호:4의 아미노산 서열을 인코드하는 단리된 핵산.
25. 서열 번호:3의 아미노산 서열을 포함하는 단리된 폴리펩티드와 서열 번호:4의 아미노산 서열을 포함하는 단리된 폴리펩티드를 포함하는 조성물.
26. 서열 번호:3의 아미노산 서열을 인코드하는 단리된 핵산과 서열 번호:4의 아미노산 서열을 인코드하는 단리된 핵산을 포함하는 조성물.

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