CN104203287A - 新型艰难梭菌dna疫苗 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及通过对有需要的受试者施用至少一种编码毒素A和毒素B中的至少一种的至少一部分的核酸来治疗艰难梭菌相关疾病(CD AD)的组合物和方法。
Description
相关申请的交叉引用
本申请要求2011年7月12日提交的美国专利申请号61/506,973的优先权,所述美国专利申请的内容以引用的方式整体并入本文。
关于联邦资助的研究或开发的声明
本发明是由政府资助在美国国防部授予的合同号W81XWH-09-1-0382下完成的。政府对本发明享有某些权利。
发明背景
艰难梭菌(C.Difficile)相关疾病(CDAD)是发病率和死亡率的主要根源,每年花费美国医疗保健系统接近11亿美元,这归因于药物成本或者手术导致住院时间延长。此外,医院发现这种疾病的比率正在上升,其中医生记录在用甲硝唑(metronidazole)治疗后复发率明显增加。因艰难梭菌引起的死亡率也在不断上升,并且新菌株产生更高水平的耐抗生素的毒素。结肠感染艰难梭菌可导致从轻度腹泻到伴有可能危及生命的并发症的严重结肠炎这一系列病况发生。尽管接受抗生素的老年住院患者仍是CDAC风险的主要群体,但在以前未接触过医院环境或抗生素的年轻人群中,CDAD也正在新增。此外,在以前处于低风险的特定人群中,如儿童和孕妇,CDAD也正在增加。因此,保护包括处于围手术期和/或长期使用抗生素的患者在内的最危险患者应该是优先需要考虑的事情,这具有极其重要的意义。
艰难梭菌,一种革兰氏阳性、厌氧、产孢子细菌,被认为是医院获得性腹泻的主要原因(2008,Wilcox等,J Antimicrob Chemother62(2):388-396;2008,Gould等,Crit Care12(1):203)。多达3%的健康成年门诊患者可能被这种生物体定植,而住院治疗后这种比率更是急剧增加。自2000年以来,大量出版物对艰难梭菌疾病在北美和欧洲的再现速率以及严重程度进行了描述(Gould等,Crit Care12(1):203)。这些事件重新引发了人们对包括毒素特异性疫苗在内的疾病治疗和预防新途径的兴趣。疾病起因于重要细胞毒素,即毒素A和B的产生,其临床表现形式是从无症状携带者到腹泻、中毒性巨结肠和死亡。毒素A和B分别为300kD和270kD蛋白,并且是大梭菌细胞毒素家族的成员,与索氏梭菌(C.sordelli)的出血性和致死性毒素以及诺氏梭菌(C.Novyi)的α毒素共享同源性。这些葡萄糖基转移酶使包括Rho、Rac和Cdc42在内的多种宿主蛋白失活,最终导致归因于此的病理和临床改变。毒素A在动物模型中被认为是艰难梭菌相关疾病的主要介质。这种毒素介导上皮的破坏,导致也为一种肠毒素的毒素B进入细胞。所述毒素刺激IL-8和MIP-2分泌,并促进中性粒细胞募集(2005,Voth等,Clin Microbiol Rev18(2)247-263)。此外,毒素B菌株(TcdA-TcdB+)已被证明在引起粘膜坏死和降低屏障功能中比毒素A菌株(TcdA+TcdB-)更有效(2009,Rupnik等,Nat Rev Microbiol7(7)526-536)。这些毒素介导的事件重新引发了人们对包括毒素特异性疫苗在内的疾病治疗和预防新途径的兴趣。
最近的研究突出了毒素特异性宿主抗体反应对艰难梭菌定植和感染转归的影响。已观察到在艰难梭菌孢子定植前具有抗毒素A抗体的患者发展成具活动性且严重疾病的风险明显更低。一旦被感染,发展强抗毒素抗体反应的患者使用抗菌治疗来清除他们的疾病,并保持无病。在过去的10年里,已在动物体内针对艰难梭菌感染测试了一些被动和主动免疫策略。这些研究都强调了羧基末端受体结合结构域(RBD)的重要性,RBD含有用于中和毒素A和毒素B的活性的关键表位。最终,在小鼠和仓鼠中静脉内施用针对RBD发展的IgG是具有保护性的。毒素攻击后由许多被动和主动免疫研究进一步验证了抗毒素体液免疫反应在防御艰难梭菌疾病中的作用(2010,Leav等,Vaccine28(4):965-969)。此外,已证明,用福尔马林处理过的艰难梭菌毒素A(CDA)进行经皮免疫会诱导全身性和粘膜抗CDA免疫反应(2007,Ghose等,Infect Immun75(6):2826-2832)。然而,针对艰难梭菌的基于免疫的疗法的临床适应症尚未充分确定用于被动免疫,因为合并免疫球蛋白制剂的功效并未很好地确立为辅助疗法(2005,Aslam等,Lancet Infect Dis5(9):549-557)。此外,还存在某些基于类毒素的疫苗平台的稳定性问题(1995,Torres等,Infect Immun62(12):4619-4627),这可能限制其在临床上的有效性。这些研究为针对艰难梭菌毒素的替代性的下一代优化疫苗的发展提供了强有力的科学依据。为此,前景看好的包括粘膜靶向佐剂在内的下一代DNA疫苗技术(2010,Kraynyak等,Vaccine28(8):1942-1951;2010,Kutzler等,GeneTher17(1):72-82)和电穿孔递送方法已被证明在HIV疫苗平台中是有效的。
基于DNA的免疫具有许多优点,这使其成为有吸引力的疫苗平台(2006,Hokey等,Springer Semin Immunopathol28(3):267-279;2008,Kutzler和Weiner,Nat Rev Genet9(10):776-788)。首先,与活的减毒病毒相比,它具有改善的安全性概况,所述活的减毒病毒可能会恢复成它们的毒性形式或者扩散至非意愿个体。基于DNA的疫苗和佐剂的以下特性支持这一平台的使用优于基于类毒素的策略:易于操作,已证实的生产技术,稳定性,以及对冷藏链无要求。此外,DNA疫苗已被证明在小型和较大动物模型中引出体液和细胞反应,并给予保护作用(2008,Kutzler和Weiner,Nat Rev Genet9(10):776-788)。总而言之,这些优势使得基于DNA的免疫成为针对艰难梭菌的理想疫苗模式。通过包括电穿孔在内的各种物理递送方法提高靶细胞转染效率在这一领域内已经获得成功。重要的是,DNA疫苗平台已经显示出了广阔前景,目前正在I期临床试验中测试高度优化的抗原构建体,支持这一平台的安全性和潜能(2009,Yin等,Virology393(1):49-55;2005,Kutzler等,J Immunol175(1):112-123;2007,Chong等,Vaccine25(26):4967-4982)。以前已发现DNA疫苗与细胞免疫反应的诱导有关,不过最近已证明使用电穿孔递送DNA疫苗除可用于诱导强烈的细胞反应之外,还可用于诱导强烈的体液反应。这包括在包括如下疾病在内的多种疾病的动物模型中诱导中和抗体效价:禽流感(2008,Laddy等,PLoS One3(6):e2517;2007,Laddy等,Vaccine25(16):2984-2989)、天花(2011,Hirao等,J Infect Dis203(1):95-102)、登革热(2009,Ramanathan等,Vaccine27(46):6444-6453;2009,Ramanathan等,Vaccine27(32):4370-4380)和基孔肯雅热(chikungunya)(2011,Mallilankaraman等,PLoS Negl Trop Dis5(1):e928)。
尽管众多平台已经被研究作为候选艰难梭菌疫苗(2007,Ghose等,Infect Immun75(6):2826-2832;2011,Oberli等,Chem Biol18(5):580-588;2011,Pechine等,FEMS Immunol Med Microbiol(6月24日);2011,Permpoonpattana等,Infect Immun79(6):2295-2302;2011,Sandolo等,Eur J Pharm Biopharm(6月1日);2008,Ni Eidhin等,FEMSImmunol Med Microbiol52(2):207-218;2008,Taylor等,Vaccine26(27-28):3404-3409;2009,Gardiner等,Vaccine27(27):3598-3604),但在临床管道中的产品数量还很不足。考虑到巨额成本和日益流行的艰难梭菌感染,因此,本领域需要一种防御艰难梭菌相关疾病的有效疫苗疗法。本发明致力于解决本领域这一尚未被满足的需求。
概述
在各种实施方案中,本发明为一种包含至少一种核酸的疫苗,所述核酸表达艰难梭菌毒素A和艰难梭菌毒素B中的至少一种的至少一部分。在一个实施方案中,本发明为一种包含至少一种核酸的疫苗,所述核酸选自由以下组成的组:编码包含SEQ ID NO:3氨基酸序列的多肽的核酸,和编码包含SEQ ID NO:4氨基酸序列的多肽的核酸。在另一个实施方案中,所述疫苗进一步包含编码分泌前导肽的核酸。在一个具体的实施方案中,所述分泌前导肽为IgE分泌前导肽。在一些实施方案中,所述核酸被并入一种表达载体中,而在其他实施方案中,所述核酸被并入两种或更多种表达载体中。在一些实施方案中,所述至少一种核酸被密码子优化用于在人类细胞中表达。
在另一个实施方案中,本发明为一种使哺乳动物针对艰难梭菌免疫的方法,所述方法包括对所述哺乳动物的组织施用至少一种本发明的疫苗的步骤。在一些实施方案中,所述免疫方法包括对所述哺乳动物的组织施用疫苗,和用有效允许核酸分子进入所述哺乳动物的组织的细胞中的电流对所述细胞进行电穿孔。在一些实施方案中,所述哺乳动物的组织为肌肉。在其他实施方案中,所述哺乳动物的组织为皮肤。在一些实施方案中,所述疫苗通过肌肉内或皮内注射施用。在一个实施方案中,所述哺乳动物目前未感染艰难梭菌,且所述疫苗诱导保护性免疫反应。在一些实施方案中,所述保护性免疫反应包括至少一种抗体,所述抗体特异性结合到由SEQ ID NO:3的多肽和SEQ IDNO:4的多肽组成的组中的至少一种多肽上。在一些实施方案中,所述哺乳动物为人类。
在另一个实施方案中,本发明为一种使感染艰难梭菌的哺乳动物免疫的方法,所述方法包括对所述哺乳动物的组织施用至少一种本发明的疫苗的步骤。在一些实施方案中,所述免疫方法包括对所述哺乳动物的组织施用疫苗,和用有效允许核酸分子进入所述哺乳动物的组织的细胞中的电流对所述细胞进行电穿孔。在一些实施方案中,所述哺乳动物的组织为肌肉。在其他实施方案中,所述哺乳动物的组织为皮肤。在一些实施方案中,所述疫苗通过肌肉内或皮内注射施用。在一个实施方案中,所述哺乳动物目前感染艰难梭菌,且所述疫苗诱导治疗性免疫反应。在一些实施方案中,所述治疗性免疫反应包括至少一种抗体,所述抗体特异性结合到由SEQ ID NO:3的多肽和SEQ IDNO:4的多肽组成的组中的至少一种多肽上。在一些实施方案中,所述哺乳动物为人类。
在一个实施方案中,本发明为一种包含SEQ ID NO:3氨基酸序列的分离的多肽。在另一个实施方案中,本发明为一种编码SEQ IDNO:3氨基酸序列的核酸。在一个实施方案中,本发明为一种包含SEQID NO:4氨基酸序列的分离的多肽。在另一个实施方案中,本发明为一种编码SEQ ID NO:4氨基酸序列的分离的核酸。在又一个实施方案中,本发明为一种组合物,所述组合物包含包含SEQ ID NO:3氨基酸序列的分离的多肽和包含SEQ ID NO:4氨基酸序列的分离的多肽。在再一个实施方案中,本发明为一种组合物,所述组合物包含编码SEQ ID NO:3氨基酸序列的分离的核酸和编码SEQ ID NO:4氨基酸序列的分离的核酸。
附图简述
结合附图阅读时,将更好地理解本发明优选实施方案的以下详细描述。出于说明本发明的目的,附图中所示的是目前优选的实施方案。然而,应了解,本发明不限于图中所示实施方案的精确的安排以及仪器。
图1包括图1A和1B,显示毒素A的RBD序列和毒素B的RBD序列,以及证明毒素RBD的体外表达的实验。
图2显示证明毒素特异性IgG而非IgA在肌肉内免疫、随后体内电穿孔的小鼠的血清中可检测到的实验的结果。
图3显示评估小鼠中pA/B RBD N→Q给药后毒素A和毒素B特异性抗体分泌细胞的数量的实验的结果。
图4显示证明毒素特异性成浆细胞在pRBD免疫小鼠的脾脏中增多的实验的结果。
图5显示分析疫苗诱导的B细胞的表型的实验的结果,以及证明毒素特异性记忆反应在pRBD免疫小鼠的脾脏中增强的实验的结果。
图6显示证明来自pRBD N→Q免疫动物的血清防止暴露于毒素A或毒素B的细胞发生细胞变圆的实验的结果。
图7显示证明用pRBD N→Q免疫会保护小鼠免受全身性毒素攻击的实验的结果。
图8显示肌肉内免疫和体内电穿孔后在雌性恒河猴中所观察到的免疫方案和免疫原性。
图9包括图9A至图9E,显示示例性表达载体构建体设计以及评估构建体表达的实验的结果。(A)左侧表中对抗原DNA修饰进行了总结。右侧展示了呈现pVAX(骨架)的关键组件的示意图。优化并构建了编码A或B RBD wt以及A或B RBD N→Q的四种质粒。(B)对毒素A和B的RBD中推定的N-连接糖基化位点加下划线。在构建DNA疫苗质粒过程中,Gln在这些位点取代首个Asn。(C)各推定的N-连接糖基化位点的首个Asn被Gln取代的毒素A和B的RBD序列。(D)使用脂质体2000(Lipofectamine2000)用2μg pRBD N→Q构建体转染293T细胞(3.0×105个细胞)。转染后48小时,收集裂解液(RIPA缓冲液)和上清液,用SDS-PAGE(4-12%)分级分离,并转移到PVDF膜上。用特异性小鼠抗血清进行免疫检测,并用辣根过氧化物酶结合的山羊抗小鼠IgG使用ECL检测系统观察表达的蛋白。(E)将裂解液和上清液的等分试样在37℃下用500U多肽N-糖苷酶F(PNGaseF)消化1小时,并在65℃下失活15分钟。对样本进行SDS-PAGE(8%)和免疫检测。
图10显示了免疫和收集方案。
图11包括图11A至图11C,显示评估用pRBD N→Q免疫后的抗原特异性B细胞的实验的结果。(A)在每次免疫时测量血清中的抗体水平。用0.5μg/mL类毒素A或B涂布96孔板过夜。加入血清稀释液,且使用HRP结合的抗体测量总IgG。(B)用0.5μg/mL类毒素A或B或总IgG涂布ELISpot板过夜。在第三次免疫后10天,分离出脾细胞,并加入板中(Ag特异性,5.0x105个细胞/孔,和总IgG,1.0x104个细胞/孔)。24小时后,洗掉细胞,并用HRP结合的抗体进行探测。(C)或者,将脾细胞(1.5x106个)在R10培养基加上1:6CpG2006、1:1000PWM、1:1000BMe和1:10000SAC中刺激3天以促进记忆B细胞增殖。如本文其他地方所述,检测抗原特异性记忆B细胞。
图12包括图12A至图12B,显示证明来自用pRBD N→Q免疫的动物的血清可在体外中和艰难梭菌毒素活性的实验的结果。(A)维洛(Vero)细胞(5.0x104个细胞)在96孔板中生长至单层(24小时)。小鼠血清在生长培养基中稀释,并加入等体积的含充分纯化的毒素A或毒素B的生长培养基中,以诱导100%细胞变圆。轻轻混合,在37℃下孵育1小时,并重复加入96孔板中。20-24小时后,在10X放大倍数下评估细胞变圆。图片表示两个孔中的平均效果。山羊抗毒素A(List Biologicals)用作阳性对照。(B)通过对每孔6个随机视野进行分析并对变圆细胞的百分比求平均值来测量细胞变圆情况。对比于pVAX血清和山羊抗毒素A,将结果绘制成图。
图13显示了免疫和收集方案。
图14显示了评估使用纯化的艰难梭菌毒素的致死全身性攻击的实验的结果。(A)用(1)150ng毒素A或B;(2)300ng毒素A或B;(3)75ng这两种毒素;或者(4)150ng这两种毒素腹腔内(i.p.)攻击5只C57BL/6小鼠。每天监控小鼠的发病征兆。(B)用毒素腹腔内攻击10只C57BL/6小鼠/组。pA RBD N→Q小鼠接受300ng毒素A,而pB RBD N→Q小鼠接受150ng各毒素。
图15显示证明pRBD-N→Q构建体在恒河猴中有免疫原性的实验的结果。
图16显示证明恒河猴超免疫血清会中和艰难梭菌毒素对小鼠的致死效果的实验的结果。
发明详述
本发明提供预防、抑制和治疗艰难梭菌相关疾病(CDAD)的组合物和方法。在一个实施方案中,本发明的组合物是一种疫苗,其诱导产生对艰难梭菌蛋白(例如,毒素A(TcdA)和毒素B(TcdB))具特异性的抗体。在一个实施方案中,所述组合物包含毒素A的受体结合结构域(RBD)。在另一个实施方案中,所述组合物包含毒素B的RBD。在另一个实施方案中,所述组合物包含毒素A的RBD和毒素B的RBD。
在一个实施方案中,本发明的组合物为一种DNA疫苗。在一个实施方案中,本发明的组合物包含编码毒素A的RBD的核酸序列。在另一个实施方案中,本发明的组合物包含编码毒素B的RBD的核酸序列。在另一个实施方案中,所述组合物包含编码毒素A的RBD和毒素B的RBD的核酸序列。在一个实施方案中,优化所述组合物的核酸以增强RBD多肽翻译和分泌。在一个实施方案中,所述组合物包含一种或多种选自SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2的多肽,或其修饰形式。在一个实施方案中,所述组合物包含一种或多种编码选自SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2的氨基酸序列的核酸序列,或其修饰形式。
在一个实施方案中,使来自野生型的毒素A的RBD和毒素B的RBD突变以防止N-连接糖基化。这些突变保持由艰难梭菌产生的天然毒素A和毒素B的糖基化状态,进而确保有效免疫原性。在一个实施方案中,所述组合物包含一种或多种选自SEQ ID NO:3和SEQID NO:4的多肽。在一个实施方案中,所述组合物包含一种或多种编码选自SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4的氨基酸序列的核酸序列。
本发明也提供诱导免疫反应以预防和治疗CDAD的方法。在一个实施方案中,所述方法包括将毒素A的RBD和/或毒素B的RBD施用给受试者。在另一个实施方案中,所述方法包括将编码毒素A的RBD和/或毒素B的RBD的核酸施用给受试者。在一个实施方案中,所述方法包括肌肉内施用组合物。在一个实施方案中,所述方法包括体内电穿孔。
定义
除非另外定义,否则本文所使用的所有技术和科学术语均具有与本发明所属领域一般技术人员通常理解相同的含义。虽然在本发明的实践或测试中可以使用类似或等同于本文所描述的那些方法和材料的任何方法和材料,但描述优选方法和材料。
本文所使用的下列术语各具有在本节中与它相关联的含义。还将理解,本文所使用的术语仅是用于描述具体实施方案的目的,并且不意图具限制性。
冠词“一(a/an)”在本文中用来指代冠词的语法对象中的一个或一个以上(也就是,指代“至少一个”)。例如,“一元件”指的是一个元件或一个以上元件。
当涉及可测量的值,如量、持续时间等时,本文所使用的“约”是指涵盖指定值的±20%或±10%偏差,更优选±5%偏差,甚至更优选±1%偏差,还更优选±0.1%偏差,因为这些偏差适于完成所公开的方法。
本文所使用的术语“抗体”是指与抗原特异性结合的免疫球蛋白分子。抗体可以是来源于天然来源或重组来源的完整免疫球蛋白,并且可以是完整免疫球蛋白的免疫活性部分。本发明中的抗体可以各种形式存在,包括例如多克隆抗体、单克隆抗体、Fv、Fab和F(ab)2以及单链抗体和人源化抗体(Harlow等,1999,Using Antibodies:ALaboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,NY;Harlow等,1989,In:Antibodies:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor,NewYork;Houston等,1988,Proc.Natl.Acad.Sci.USA85:5879-5883;Bird等,1988,Science242:423-426)。
本文所使用的术语“抗原”或“Ag”被定义为一种激起免疫反应的分子。这种免疫反应可能涉及抗体产生,或者特定的免疫感受态细胞的激活,或者这两者。本领域技术人员将理解包括实际上所有的蛋白质或肽在内的任何大分子均可以充当抗原。另外,抗原可以来源于重组或基因组DNA。本领域技术人员将理解,包含编码引出免疫反应的蛋白的核苷酸序列或部分核苷酸序列的任何DNA均因此编码本文所使用的术语“抗原”。此外,本领域技术人员将理解抗原不需要仅由基因的全长核苷酸序列编码。显而易见的是,本发明包括但不限于使用超过一个基因的部分核苷酸序列,且这些核苷酸序列被安排在多种组合中以引出期望的免疫反应。此外,本领域技术人员将理解,抗原根本不需要由一个“基因”编码。显而易见的是,抗原可以合成生成或者可以来源于生物样本。
本文所使用的术语“自体的”意思是指来源于同一个体且后来又再引入所述个体中的任何材料。
本文所使用的“组合疗法”意思是第一药剂与另一药剂联合施用。“联合”是指施用一种治疗模式以及另一种治疗模式。因此,“联合”是指在将另一治疗模式递送至个体之前、期间或之后,施用一种治疗模式。这样的组合被认为是单一治疗方案或体系的一部分。
本文所使用的术语“同时施用”是指在组合疗法中第一疗法的施用与第二疗法的施用彼此重叠。
“疾病”是动物的一种健康状态,其中所述动物不能维持体内平衡,而且其中如果所述疾病得不到改善,那么动物的健康状况将继续恶化。相比之下,在动物中“病症”是所述动物能够维持体内平衡但动物的健康状态比没有病症的情况下不利的一种健康状态。即便不进行治疗,病症也不一定导致动物的健康状态进一步下降。
本文所使用的“有效量”意思是提供治疗或预防益处的量。
本文所使用的术语“表达”被定义为具体核苷酸序列由其启动子驱动的转录和/或翻译。
“表达载体”是指包含重组多核苷酸的载体,所述重组多核苷酸包含可操作地连接到待表达的核苷酸序列的表达控制序列。表达载体包含足够的顺式作用表达元件;其他表达元件可以由宿主细胞或在体外表达系统中提供。表达载体包括本领域所有已知的表达载体,如柯斯质粒(cosmid)、质粒(例如,裸露或包含在脂质体中)和病毒(例如,慢病毒、逆转录病毒、腺病毒和腺相关病毒),所述表达载体并入有重组多核苷酸。
“同源的”是指两个多肽之间或两个核酸分子之间的序列相似性或序列同一性。当两个相比较序列中均有一个位置被相同的碱基或氨基酸单体亚单位所占据时,例如,如果两个DNA分子中各有一个位置被腺嘌呤占据,那么所述分子在那个位置是同源的。两个序列之间的同源性百分比为两个序列共享的匹配或同源位置数除以相比位置数乘100的函数。例如,如果两个序列中的10个位置中有6个位置是匹配的或同源的,那么这两个序列为60%同源。举个例子,DNA序列ATTGCC和TATGGC共享50%同源性。通常,当比对两个序列时进行比较以提供最大的同源性。
本文所使用的术语“免疫球蛋白”或“Ig”被定义为一类充当抗体的蛋白质。B细胞表达的抗体有时被称为BCR(B细胞受体)或抗原受体。包括在这类蛋白质中的五名成员为IgA、IgG、IgM、IgD和IgE。IgA为存在于身体分泌物中的一抗,这些身体分泌物如唾液、眼泪、乳汁、胃肠分泌物以及呼吸道和泌尿生殖道的粘液分泌物。IgG是最常见的循环抗体。IgM是大多数受试者在初次免疫反应中产生的主要免疫球蛋白。IgM在凝集、补体结合和其他抗体反应中是最有效的免疫球蛋白,并且在防御细菌和病毒中也很重要。IgD是没有已知抗体功能的免疫球蛋白,但可以充当抗原受体。IgE是通过导致在暴露于过敏原后从肥大细胞和嗜碱性粒细胞释放介质来介导速发型超敏反应的免疫球蛋白。
本文所使用的术语“免疫反应”包括T细胞介导的免疫反应和/或B细胞介导的免疫反应。示例性的免疫反应包括T细胞反应(例如,细胞因子产生和细胞毒性)和B细胞反应(例如,抗体产生)。此外,术语免疫反应包括间接受T细胞激活影响的免疫反应,例如抗体产生(体液反应)和细胞因子应答细胞(例如,巨噬细胞)的激活。参与免疫反应的免疫细胞包括淋巴细胞,如B细胞和T细胞(CD4+、CD8+、Th1和Th2细胞);抗原呈递细胞(例如,专职抗原递呈细胞,如树突状细胞、巨噬细胞、B淋巴细胞、朗格汉斯细胞;和非专职抗原呈递细胞,如角质化细胞,内皮细胞、星形胶质细胞、成纤维细胞、少突胶质细胞);天然杀伤细胞;骨髓细胞,如巨噬细胞、嗜酸性粒细胞、肥大细胞、嗜碱性粒细胞和粒细胞。
“分离的”意思是从天然状态发生改变或者去除。例如,在活动物体内天然存在的核酸或肽不是“分离的”,但部分地或完全地从其天然状态的共存物质分离出来的相同核酸或肽是“分离的”。分离的核酸或蛋白质可以大致上纯化的形式存在,或者可存在于非天然环境(例如,宿主细胞)中。
免疫原性组合物的“胃肠外”施用包括例如皮下(s.c.)注射、静脉内(i.v.)注射、肌肉内(i.m.)注射、胸骨内注射或者输注技术。
术语“患者”、“受试者”、“个体”等在本文中可互换使用,并且是指无论在体外或是在原位可顺从本文所述方法的任何动物或其细胞。在某些非限制性实施方案中,患者、受试者或个体是人。
本文所使用的术语“同时施用”意思是在组合疗法中,第一疗法与第二疗法施用时的时间间隔不超过约15分钟,如不超过约10分钟、5分钟或者1分钟中的任一者。当同时施用第一疗法和第二疗法时,第一疗法和第二疗法可以包含在同一组合物中(例如,包含第一疗法和第二疗法两者的组合物),或者在单独的组合物中(例如,第一疗法包含在一种组合物中,第二疗法包含在另一种组合物中)。
关于抗体,本文所使用的术语“特异性结合”意思是识别特异性抗原但大致上不识别或结合样本中其他分子的抗体。例如,与来自一个物种的抗原特异性结合的抗体也可能与来自一个或多个物种的这一抗原结合。但是,这种跨物种反应性本身并不改变抗体分类为特异性的。在另一个例子中,与抗原特异性结合的抗体也可能与所述抗原的不同等位形式结合。然而,这种交叉反应性本身并不改变抗体分类为特异性的。在一些实例中,关于抗体、蛋白质或者肽与第二种化学物质的相互作用,术语“特异性结合(specific binding/specifically binding)”可用来意指所述相互作用依赖于化学物质上具体结构(例如,抗原决定簇或表位)的存在;例如,抗体识别并结合于特定的蛋白质结构,而不是与蛋白质广泛结合。如果抗体对表位“A”是特异性的,那么在含被标记的“A”和抗体的反应中,含表位A的分子(或者游离的未标记A)的存在将会降低与所述抗体结合的被标记的A的量。
本文所使用的术语“治疗”意思是治疗和/或预防。通过抑制、缓解或根除疾病状态获得治疗效果。
术语“治疗有效量”是指将引出由研究者、兽医、医师或其他临床医生所研究的组织、系统或受试者的生物学或医学反应的主题化合物的量。术语“治疗有效量”包括当施用时足以预防正治疗的病症或疾病的一种或多种征兆或症状发展,或在某种程度上减轻一种或多种征兆或症状的化合物的量。治疗有效量将根据化合物、疾病和其严重程度以及待治疗受试者地年龄、体重等而变化。
本文所使用的术语“治疗”疾病意思是降低受试者所经受的疾病或病症的至少一种征兆或症状的频率或严重程度。
本文所使用的术语“转染的”或“转化的”或“转导的”是指将外源核酸转移入或引入宿主细胞中的方法。“转染的”或“转化的”或“转导的”细胞是已用外源核酸转染、转化或转导的细胞。所述细胞包括原代主题细胞和其后代。
范围:贯穿本公开内容,本发明的各个方面可以范围形式呈现。应当了解,呈范围形式的描述仅仅是为了方便和简洁,不应理解为对本发明范围的硬性限制。因此,范围的描述应当被认为已经特定地公开了所有可能的子范围以及该范围内的个别数值。例如,一个范围,如从1到6的描述应当被认为已经特定地公开了子范围,如从1到3,从1到4,从1到5,从2到4,从2到6,从3到6等,以及该范围内的个别数字,例如1、2、2.7、3、4、5、5.3和6。不管范围有多宽,这都适用。
描述
本发明涉及以下发现,即将艰难梭菌毒素A和/或毒素B核酸的一个区域施用至受试者中会产生毒素特异性抗体。因而,本发明提供多肽或者多肽组合、多核苷酸或者多核苷酸组合、药物和疫苗组合物,包括一些在调节免疫反应中以及在抑制、预防和治疗CDAD和相关病症中有用的物质。
本发明提供一种包含多肽表位或者多肽表位组合的免疫组合物,所述多肽表位来源于在引出免疫反应中有用的艰难梭菌毒素A(TcdA)和艰难梭菌毒素B(TcdB)。包含一种或多种本发明多肽的组合物不仅可用作用于免疫保护的预防性治疗剂,而且也可在受试者中用作治疗CDAD相关的进行性病况的治疗剂。
在一个实施方案中,所述组合物包含毒素A的受体结合结构域(RBD)。在一个实施方案中,所述组合物包含毒素A的突变受体结合结构域(RBD)。在一个实施方案中,所述组合物包含毒素B的RBD。在另一个实施方案中,所述组合物包含毒素B的突变RBD。在一个实施方案中,所述组合物为编码毒素A的RBD和/或毒素B的RBD的多核苷酸。在另一个实施方案中,所述组合物为编码毒素A的突变RBD和/或毒素B的RBD的多核苷酸。所述组合物可以被改变以增加免疫原性。例如,在一个实施方案中,所述组合物的多核苷酸包含增加RBD多肽翻译和分泌的区域。在另一个实施方案中,使编码毒素A和/或毒素B的野生型RBD的核苷酸序列突变以去除用于N-连接糖基化的潜在位点。也就是说,在一个实施方案中,所述组合物包含编码毒素A的突变RBD和/或毒素B的突变RBD的核苷酸序列。
本发明也提供预防、抑制和治疗CDAD的方法。在一个实施方案中,本发明方法通过针对艰难梭菌毒素(如毒素A和/或毒素B)产生免疫反应,来诱导针对艰难梭菌的免疫性。在一个实施方案中,本发明方法诱导产生毒素A和/或毒素B特异性抗体。在一个实施方案中,本发明方法预防艰难梭菌相关的病变。在一个实施方案中,本发明方法包括向受试者施用一种组合物,所述组合物包含毒素A的至少一部分(例如,RBD)和/或毒素B的至少一部分(例如,RBD),或其变体。在另一个实施方案中,本发明方法包括向受试者施用一种组合物,所述组合物包含编码毒素A的RBD和/或毒素B的RBD或其变体的核酸序列。在一个实施方案中,所述方法包括向受试者施用DNA疫苗,进而诱导对艰难梭菌的免疫性。在一个实施方案中,将组合物肌肉内施用至受试者。在一个实施方案中,所述方法包括体内电穿孔。
组合物
本发明提供组合物,包括多肽、核苷酸、载体和疫苗,所述组合物当施用至哺乳动物时引出针对艰难梭菌的免疫反应,包括针对毒素A和/或毒素B的免疫反应(例如,抗毒素A抗体和抗毒素B抗体)。此外,当将所述组合物施用至哺乳动物时,所述组合物引出用来保护接种过的哺乳动物抵御CDAD相关病况的免疫反应。如本文所例示的,可大量获得所述组合物用作疫苗。
本发明的组合物也可在哺乳动物中用作评估抗毒素A和/或抗毒素B免疫反应存在或不存在的诊断试剂。通过自哺乳动物获得血清或细胞,并以本领域已知的用于检测多肽结合的标准测定法,将它与本发明的多肽或者多肽组合接触来进行这种评估。
在一个实施方案中,本发明提供了组合物,所述组合物例如在刺激免疫反应中以及在预防艰难梭菌相关病变中可用作免疫调节剂。
本文中表明,毒素A和毒素B的RBD可用作免疫刺激剂来诱导产生毒素A和毒素B特异性抗体,并防止艰难梭菌诱导的病变。因此,在一个实施方案中,本发明的组合物包含毒素A多肽的RBD区域或其片段。在另一个实施方案中,本发明的组合物包含突变毒素A多肽的RBD区域或其片段。在一个实施方案中,本发明的组合物包含毒素B多肽的RBD区域或其片段。在另一个实施方案中,本发明的组合物包含突变毒素B多肽的RBD区域或其片段。在一个实施方案中,本发明的组合物包含毒素A和毒素B两者的RBD区域或其片段。在另一个施方案中,本发明的组合物包含突变毒素A和突变毒素B两者的RBD区域或其片段。
本发明也提供编码本文所述多肽的多核苷酸。例如,在一个实施方案中,本发明的组合物包含一种多核苷酸,所述多核苷酸编码毒素A多肽的RBD或其片段。在另一个实施方案中,本发明的组合物包含一种多核苷酸,所述多核苷酸编码突变毒素A多肽的RBD区域或其片段。在一个实施方案中,本发明的组合物包含一种多核苷酸,所述多核苷酸编码毒素B多肽的RBD或其片段。在另一个实施方案中,本发明的组合物包含一种多核苷酸,所述多核苷酸编码突变毒素B多肽的RBD区域或其片段。在一个实施方案中,本发明的组合物包含毒素A和毒素B多肽两者的RBD区域或其片段。在另一个实施方案中,本发明的组合物包含突变毒素A和突变毒素B多肽两者的RBD区域或其片段。所述多核苷酸可以为RNA或DNA。在一个实施方案中,所述组合物包含DNA疫苗。
在一个实施方案中,所述组合物包含从野生型突变的RBD,或者编码从野生型突变的RBD的多核苷酸。本发明部分地基于以下发现:RBD区域内N-连接糖基化潜在位点发生突变的多肽产生会诱导产生毒素特异性抗体并预防毒素诱导的病变。突变保持细菌产毒素的糖基化状态,进而确保针对所施用组合物产生的抗体也会识别细菌产毒素。在真核生物中,野生型毒素A RBD和毒素B RBD的翻译会产生糖基化的毒素A RBD和毒素B RBD。针对糖基化的毒素A RBD和毒素B RBD的免疫原性可能在艰难梭菌感染期间不能有效识别细菌毒素A和毒素B,因而使接种效果较差或无效。在一个实施方案中,所述组合物包含含有天冬酰胺到谷氨酰胺(N→Q)突变的毒素A RBD和/或毒素B RBD,所述突变位于野生型序列中发现的一个或多个天然天冬酰胺残基处。在一个实施方案中,所述组合物包含一种核酸,所述核酸编码含有天冬酰胺到谷氨酰胺(N→Q)突变的毒素A RBD和/或毒素B RBD,所述突变位于野生型序列中发现的一个或多个天然天冬酰胺残基处。
在一个实施方案中,本发明提供一种包含多肽或者其片段或变体的组合物,所述多肽包含SEQ ID NO:1氨基酸序列。在另一个实施方案中,本发明提供一种包含多肽或者其片段或变体的组合物,所述多肽包含SEQ ID NO:2氨基酸序列。在另一个实施方案中,所述组合物包含一种包含SEQ ID NO:1氨基酸序列的多肽和一种包含SEQID NO:2氨基酸序列的多肽,或者其片段或变体。
在一个实施方案中,本发明提供一种包含多肽或者其片段或变体的组合物,所述多肽包含SEQ ID NO:3氨基酸序列。在另一个实施方案中,本发明提供一种包含多肽或者其片段或变体的组合物,所述多肽包含SEQ ID NO:4氨基酸序列。在另一个实施方案中,所述组合物包含一种包含SEQ ID NO:3氨基酸序列的多肽和一种包含SEQID NO:4氨基酸序列的多肽,或者其片段或变体。
在一个实施方案中,本发明提供一种多肽,或者多肽的片段,多肽的同源物、变体、衍生物或者盐,所述多肽具有SEQ ID NO:1-4中任何一个或多个序列,其中所述多肽或其片段的免疫原活性被保留。
本发明还应当解释为包括任何形式的与本文所公开的多肽具有大致同源性的多肽。优选地,“大致上同源的”多肽与本文所公开多肽的氨基酸序列是约50%同源,更优选约70%同源,甚至更优选约80%同源,更优选约90%同源,甚至更优选约95%同源,甚至更优选约99%同源。
根据又一实施方案,本发明的多肽或者多肽组合能够产生毒素A和/或毒素B特异性免疫反应。在另一实施方案中,本发明的多肽或者多肽组合能够产生毒素A和/或毒素B特异性抗体。
此外,在另一个实施方案中,本发明提供一种可用于预防、抑制和治疗CDAD的多肽,其中所述多肽选自由多肽、多肽的片段、多肽的同源物、变体、衍生物、盐组成的组,所述多肽具有SEQ ID NO:1-4中任何一个或多个序列,其中所述多肽或片段的免疫原活性被保留。
可使用众所周知的技术来制备本发明的多肽。例如,可使用重组DNA技术或化学合成来合成制备多肽。本发明的多肽可个别地合成,或以由两个或更多个多肽构成的更长多肽形式合成。本发明的多肽优选为分离的,即,大致上不含其他天然存在的宿主细胞蛋白和其片段。
本发明的多肽可含有修饰,如糖基化、去糖基化、侧链氧化或磷酸化;只要所述修饰不破坏多肽的生物活性。其他修饰包括并入D-氨基酸或者其他可使用的氨基酸模拟物,例如,以延长多肽的血清半衰期。
可对本发明的多肽进行修饰,由此将氨基酸取代为不同氨基酸,其中氨基酸侧链的性质被保留(一种被称为保守性氨基酸取代的方法)。氨基酸侧链的性质的实例为疏水性氨基酸(A、I、L、M、F、P、W、Y、V),亲水性氨基酸(R、D、N、C、E、Q、G、H、K、S、T),和具有下列共同官能团或特征的侧链:脂肪族侧链(G、A、V、L、I、P);含羟基侧链(S、T、Y);含硫原子侧链(C、M);含羧酸和酰胺的侧链(D、N、E、Q);含碱基侧链(R、K、H);和含芳族侧链(H、F、Y、W)。注意,附加说明的字母表示氨基酸的单字母代码。
本发明的多肽可制备成一种用作预防或治疗CDAD的疫苗的组合,所述组合包括两种或更多种本发明的多肽。所述多肽可以呈混合形式或者可以使用标准技术彼此结合。例如,多肽可以表现为单一多肽序列。组合中的多肽可以相同或不同。
本发明还应当解释为涵盖本发明多肽(或者编码相同多肽的DNA)的“突变体”、“衍生物”和“变体”,所述突变体、衍生物和变体为在一个或多个氨基酸处发生改变(或当涉及编码相同多肽的核苷酸序列时,在一个或多个碱基对处发生改变)的多肽,使得所得多肽(或DNA)与本文所述序列不相同,但具有与本文所公开的多肽相同的生物学性质。
本发明也提供一种编码至少一种多肽的多核苷酸,所述多肽选自具有SEQ ID NO:1-4中任何一个或多个序列的多肽。在一个实施方案中,本发明提供一种组合物,所述组合物包含编码SEQ ID NO:1-4中任何一个或多个氨基酸序列的核酸序列。
核酸序列包括被转录成RNA的DNA序列和被翻译成多肽的RNA序列。根据其他实施方案,从本发明多肽的氨基酸序列推测本发明的多核苷酸。如本领域所已知的,由于存在冗余密码子,所以在保留被翻译的多肽的生物学活性的同时,可能存在几种替代性多核苷酸。
此外,本发明涵盖一种分离的核酸,所述分离的核酸编码与本文所公开的多肽具有大致同源性的多肽。优选地,编码本发明多肽的分离的核酸的核苷酸序列为“大致上同源的”,也就是说,与编码本发明多肽的分离的核酸的核苷酸序列是约60%同源,更优选约70%同源,甚至更优选约80%同源,更优选约90%同源,甚至更优选约95%同源,甚至更优选约99%同源。
应明确地了解,如本领域所已知的,本发明的范围涵盖同源物、类似物、变体、片段、衍生物和盐,包括较短和较长的多肽和多核苷酸,以及具有一个或多个氨基酸或核酸取代的多肽和多核苷酸类似物,以及氨基酸或核酸衍生物、非天然氨基酸或核酸和合成氨基酸或核酸,其中规定这些修饰必须保留原始分子的免疫学活性。具体来说,根据本发明的原理,活性多肽的任何活性片段以及延伸物、结合物和混合物均包括在内并在本文中公开。
本发明应解释为包括与本文所描述和引用的核酸同源的任何和所有分离的核酸,前提是这些同源的核酸编码具有本文所公开的多肽的生物学活性的多肽。
本领域技术人员将理解,本发明的核酸涵盖编码本发明多肽的RNA或DNA序列,和其任何修饰过的形式,包括DNA或RNA的化学修饰,所述修饰使核苷酸序列在脱离细胞时或在与细胞缔合时变得更稳定。核苷酸的化学修饰也可用于提高细胞吸收核苷酸序列的效率或核苷酸在细胞中表达的效率。核苷酸序列的修饰的任何和所有组合均涵盖在本发明中。
另外,许多程序可以用于使用本领域众所周知的重组DNA方法(例如,在Sambrook和Russell(同上),和Ausubel等(同上)中所描述的方法)来生成本发明蛋白质的突变体、衍生物或变体形式。通过改变编码多肽的DNA序列将氨基酸变化引入多肽或多肽中的程序在本领域是众所周知的,且在上述和其他论文中也有描述。
载体
编码本发明的多肽或者多肽组合的核酸可以并入合适载体中,包括但不限于质粒和逆转录病毒载体。这样的载体是本领域众所周知的,因此未在本文中详细描述。
在一个实施方案中,本发明包括编码一种或多种本发明多肽的核酸序列,所述核酸序列与包含启动子/调节序列的核酸可操作地连接,使得所述核酸优选能够指导所述核酸所编码的蛋白质的表达。因而,本发明涵盖用于将外源DNA引入细胞中并在细胞中伴随表达外源DNA的表达载体和方法,如描述在例如Sambrook等(2001,MolecularCloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,NewYork)和Ausubel等(1997,Current Protocols in Molecular Biology,JohnWiley&Sons,New York)中的那些表达载体和方法。所需的多核苷酸并入载体中和载体的选择在本领域是众所周知的,描述在例如Sambrook等(同上)和Ausubel等(同上)中。
所述多核苷酸可以被克隆到许多类型的载体中。然而,本发明不应该被解释为限于任何具体的载体。相反,本发明应被理解为涵盖可轻易获得和/或在本领域众所周知的许许多多载体。例如,本发明的多核苷酸可以被克隆到载体中,所述载体包括但不限于质粒、噬菌粒、噬菌体衍生物、动物病毒和柯斯质粒。特别关注的载体包括表达载体、复制载体、探针生成载体和测序载体。
在具体的实施方案中,所述表达载体选自由病毒载体、细菌载体和哺乳动物细胞载体组成的组。存在许多包含上文所讨论组合物的至少一部分或者全部的表达载体系统。基于原核生物和/或真核生物载体的系统可供本发明使用,以产生多核苷酸或者它们的同源多肽。许多这样的系统可商购并容易获得。
另外,表达载体可以病毒载体的形式提供给细胞。病毒载体技术是本领域众所周知的,并描述于例如Sambrook等(2001)和Ausubel等(1997)以及其他病毒学和分子生物学手册中。可用作载体的病毒包括但不限于逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒和慢病毒。一般来说,合适的载体含有在至少一种生物体中发挥功能的复制起点、启动子序列、便利的限制核酸内切酶位点和一个或多个选择性标记(参见例如WO01/96584;WO01/29058;和美国专利号6,326,193)。
为表达本发明的所需核苷酸序列,各启动子中的至少一个模块发挥功能来定位用于RNA合成的起始位点。这个模块的最有名的例子是TATA盒,但在一些缺乏TATA盒的启动子(如用于哺乳动物末端脱氧核苷酸转移酶基因的启动子和用于SV40基因的启动子)中,一个覆盖在起始位点上的个别元件本身有助于固定起始位置。
另外的启动子元件(即增强子)调节转录起始的频率。通常,这些启动子位于起始位点上游30-110bp区域中,不过许多启动子最近已被证明也含有起始位点下游的功能元件。启动子元件之间的间隔常常是灵活的,以便当元件相对于彼此反转或移动时保留启动子功能。在胸苷激酶(tk)启动子中,在活性开始下降之前,启动子元件之间的间隔可以增加到相隔50bp。视启动子不同,似乎个别元件可以协同或者独立地发挥功能来激活转录。
启动子可以是与基因或者多核苷酸序列天然缔合的启动子,如可以通过分离位于编码区段和/或外显子上游的5'非编码序列来获得。这样的启动子可以被称作“内源性的”。同样地,增强子可以是与多核苷酸序列天然缔合,位于所述序列下游或上游的增强子。或者,某些优点将通过在重组或异源启动子控制下安置编码多核苷酸区段来获得,所述重组或异源启动子是指在其天然环境中通常与多核苷酸序列不缔合的启动子。重组或异源增强子也是指在其天然环境中通常与多核苷酸序列不缔合的增强子。这样的启动子或增强子可以包括其他基因的启动子或增强子,从任何其他原核、病毒或真核细胞中分离的启动子或增强子,和非“天然存在的”(即,含有不同转录调节区的不同元件,和/或改变表达的突变)启动子或增强子。除了合成产生启动子和增强子的核酸序列,关于本文所公开的组合物,还可以使用重组克隆和/或包括PCR在内的核酸扩增技术产生序列(美国专利4,683,202、美国专利5,928,906)。此外,预期也可采用在无核细胞器(如线粒体、叶绿体等)内指导序列转录和/或表达的控制序列。
当然,采用在选择用于表达的细胞类型、细胞器和生物体中有效指导DNA区段表达的启动子和/或增强子将是很重要的。分子生物学领域技术人员一般知道如何使用用于蛋白表达的启动子、增强子和细胞类型组合,例如,参见Sambrook等(2001)。所采用的启动子可以是组成型的、组织特异性的、可诱导的和/或在适当条件下可用于指导所引入DNA区段的高水平表达,如在大规模生产重组蛋白和/或多肽中很有优势。所述启动子可以是异源的或内源的。
组成型启动子序列的一个例子是即刻早期巨细胞病毒(CMV)启动子序列。这种启动子序列是一种强大的组成型启动子序列,能够驱动任何与其可操作地连接的多核苷酸序列的高水平表达。然而,也可以使用其他组成型启动子序列,包括但不限于猿猴病毒40(SV40)早期启动子,小鼠乳腺肿瘤病毒(MMTV),人类免疫缺陷病毒(HIV)长末端重复序列(LTR)启动子,莫洛尼(Moloney)病毒启动子,禽白血病病毒启动子,爱泼斯坦-巴尔(Epstein-Barr)病毒即刻早期启动子,劳氏(Rous)肉瘤病毒启动子,以及人类基因启动子,如但不限于肌动蛋白启动子、肌球蛋白启动子、血红蛋白启动子和肌肉肌酸启动子。此外,本发明不应该被局限于使用组成型启动子。诱导型启动子也可考虑作为本发明的一部分。在本发明中使用诱导型启动子提供了一种分子开关,所述分子开关能够在想要这种表达时开启与它可操作地连接的多核苷酸序列的表达,或者在不想要表达时关闭所述表达。诱导型启动子的例子包括但不限于金属硫蛋白启动子、糖皮质激素启动子、黄体酮启动子和四环素启动子。此外,本发明包括使用组织特异性启动子,其中所述启动子仅在所需组织中有活性。组织特异性启动子是本领域众所周知的,并且包括但不限于HER-2启动子和PSA相关启动子序列。
为了评估编码本发明多肽或多肽组合的核苷酸序列的表达,待引入细胞中的表达载体也可以含有选择性标记基因或报告基因或这两者,以便有助于从试图通过病毒载体转染或感染的细胞群中识别和选择表达细胞。在其他实施方案中,选择性标记可以在一段单独的DNA上携带,并在共转染程序中使用。选择性标记和报告基因均可以侧接适当的调节序列,使得在宿主细胞中能够表达。有用的选择性标记是本领域已知的,并且包括例如抗生素抗性基因,如neo等。
报告基因用于识别潜在被转染的细胞并用于评价调节序列的功能性。编码易测定蛋白的报告基因是本领域众所周知的。一般来说,报告基因是一种不存在于受体生物体或组织中或不由所述受体生物体或组织表达的基因,它编码一种通过一些易于检测的性质(例如,酶活性)显现表达的蛋白质。在DNA已被引入受体细胞中后合适的时间,测定报告基因的表达。
合适的报告基因可以包括编码荧光素酶、β-半乳糖苷酶、氯霉素乙酰转移酶、分泌型碱性磷酸酶的基因或绿色荧光蛋白基因(参见,例如,Ui-Tei等,2000FEBS Lett.479:79-82)。合适的表达系统是众所周知的,并且可以使用众所周知的技术来制备或者商购获得。可以使用独特的内部限制位点,或通过部分消化非唯一的限制位点来生成内部缺失构建体。构建体然后可以转染到呈现高水平的siRNA多核苷酸和/或多肽表达的细胞中。一般来说,具有显示报告基因的最高水平表达的最小5'侧翼区的构建体被识别为启动子。这样的启动子区域可以连接到报告基因,并用于评估药剂调节启动子驱动的转录的能力。
在一些实施方案中,修饰表达载体以增加所需多肽的表达。例如,载体可以进行密码子优化以改善给定哺乳动物中的表达。例如,载体可以进行密码子优化用于人类表达。在另一个实施方案中,所述表达载体包含有效的分泌前导子。示例性前导子为IgE前导序列。在另一个实施方案中,所述表达载体包含Kozak元件来启动翻译。在另一个实施方案中,所述核酸被去除将会妨碍翻译的顺式作用序列基序/RNA二级结构。这样的修饰以及其他修饰是本领域已知用于DNA疫苗中的(Kutzler等,2008,Nat.Rev.Gen.9:776-788;PCT申请号PCT/US2007/000886;PCT申请号;PCT/US2004/018962)。
引入核酸组合物的方法
本发明也提供预防、抑制和治疗受试者中的CDAD的方法。本发明的方法在所述受试者中激起免疫反应。在一个实施方案中,所述方法诱导产生毒素A和毒素B特异性抗体。在另一个实施方案中,所述方法诱导产生毒素特异性抗体分泌细胞(ASC)。在另一个实施方案中,所述方法预防、减轻或治疗CDAD和相关病变。
在一个实施方案中,本发明的方法包括向受试者施用有效量的编码毒素A RBD和/或毒素B RBD或其变体的核酸。在一个实施方案中,将所述核酸递送至细胞或者细胞群。在一个实施方案中,将所述核酸递送至体内细胞,例如,以肌肉内方式。在另一个实施方案中,将所述核酸递送至离体细胞,然后将所述细胞施用至受试者。优选地,所述细胞也来源于受试者。
在一个实施方案中,本发明的方法可以用于离体接种方法中,其中,将本发明的组合物递送至细胞或者细胞群,将所述细胞或者细胞群施用至受试者,从而通过例如生成毒素A和/或毒素B抗体来诱导免疫反应。
在表达载体的情况下,可以通过本领域的任何方法容易地将所述载体引入宿主细胞(例如,哺乳动物、细菌、酵母或者昆虫细胞)中。例如,表达载体可通过物理、化学或生物学手段转移到宿主细胞中。
用于将多核苷酸引入宿主细胞中的物理方法包括磷酸钙沉淀、脂质转染、粒子轰击、显微注射、电穿孔等。用于产生包含载体和/或外源核酸的细胞的方法是本领域众所周知的。参见,例如,Sambrook等(2001,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring HarborLaboratory,New York)和Ausubel等(1997,Current Protocols inMolecular Biology,John Wiley&Sons,New York)。
用于将所关注的多核苷酸引入宿主细胞中的生物学方法包括使用DNA和RNA载体。病毒载体,特别是逆转录病毒载体,已成为最广泛使用的用于将基因插入哺乳动物(例如,人类细胞)中的方法。其他病毒载体可以来源于慢病毒、痘病毒、单纯疱疹病毒I、腺病毒和腺相关病毒等。参见,例如,美国专利号5,350,674和美国专利号5,585,362。
用于将多核苷酸引入宿主细胞中的化学手段包括胶体分散系统,如大分子复合物、纳米胶囊、微球体、珠子,和基于脂质的系统,包括水包油乳剂、胶束、混合胶束和脂质体。一种优选的在体外和体内用作递送媒介物的胶体系统为脂质体(即,人工膜囊泡)。此类系统的制备和使用是本领域众所周知的。
在利用非病毒递送系统的情况下,一种示例性递送媒介物是脂质体。关于将核酸引入宿主细胞中(体外、离体或体内)可考虑使用脂质制剂。另一方面,所述核酸可以与脂质缔合。与脂质缔合的核酸可以被包封在脂质体的含水内部,散布在脂质体的脂质双层内,通过与脂质体和寡核苷酸均缔合的连接分子附接到脂质体,包埋在脂质体中,与脂质体复合,分散在含有脂质的溶液中,与脂质混合,与脂质结合,以混悬液形式含于脂质中,含于胶束中或与胶束复合,或以其他方式与脂质缔合。脂质、脂质/DNA或者脂质/表达载体缔合的组合物不限于在溶液中的任何具体结构。例如,它们可以存在于双层结构中,以胶束形式存在,或者具有“塌陷的”结构。它们也可以仅仅散布在溶液中,可能形成大小或形状不均一的聚集体。脂质为脂肪物质,它们可以为天然存在的或合成脂质。例如,脂质包括天然存在于细胞质中的脂肪滴,以及含有长链脂肪族烃和其衍生物的一类化合物,如脂肪酸、醇、胺、氨基醇和醛。
适合使用的脂质可以从商业来源获得。例如,二肉豆蔻磷脂酰胆碱(“DMPC”)可从Sigma,St.Louis,MO获得;磷酸双十六烷基酯(“DCP”)可从K&K Laboratories(Plainview,NY)获得;胆固醇(“Choi”)可从Calbiochem-Behring获得;二肉豆蔻磷脂酰甘油(“DMPG”)和其他脂质可从Avanti Polar Lipids,Inc.(Birmingham,AL)获得。脂质在氯仿或者氯仿/甲醇中的储备溶液可以储存在约-20℃下。因为氯仿比甲醇更易于蒸发,所以它作为唯一的溶剂使用。“脂质体”是一个通用术语,涵盖各种单一和多层的脂质媒介物,所述脂质媒介物通过生成封闭的脂质双层或聚集体而形成。脂质体可以被表征为具有囊泡结构,所述囊泡结构具有磷脂双层膜和内部水介质。多层脂质体具有通过水介质分隔的多个脂质层。它们在磷脂悬浮于过量水溶液中时自发形成。脂质组分在形成封闭结构之前进行自我重排,并将水和溶解的溶质包埋在脂质双层之间(Ghosh等,1991Glycobiology5:505-10)。然而,与正常囊泡结构相比在溶液中具有不同结构的组合物也包括在内。例如,脂质可以呈现胶束结构或仅仅以非均一脂质分子聚集体形式存在。脂质体(lipofectamine)-核酸复合物也考虑在内。
在其他实施方案中,使用体外转录的mRNA将本发明的多肽递送到细胞中。可以使用转染的细胞作为载体,或者使用被包封、结合的或裸露的mRNA的无细胞局部或全身递送,将体外转录的mRNA递送到不同类型的真核细胞中以及组织和整个生物体中。所使用的方法可以是为了其中需要瞬时表达或者瞬时表达即足够的任何目的。
所述方法也可通过改变例如启动子或输入RNA的量提供在较宽范围内控制表达水平的能力,使得个别地调节表达水平成为可能。此外,基于PCR的mRNA产生技术大大促进了具有不同结构和结构域组合的嵌合受体mRNA的设计。例如,改变同一细胞中多个嵌合受体上的不同胞内效应子/共刺激因子结构域可允许确定受体组合的结构,所述受体组合评估针对多抗原靶的最高水平细胞毒性,并且同时评估对正常细胞的最低细胞毒性。
本发明的RNA转染方法的一个优点是,RNA转染基本上是瞬时的和无载体的:在短暂的体外细胞激活后,RNA转基因可以作为最小表达盒被递送至细胞并在细胞中表达,无需任何额外的病毒序列。在这些条件下,整合转基因到宿主细胞基因组中是不太可能的。由于RNA的转染效率和其均一修饰整个淋巴细胞群的能力,因而细胞克隆没有必要。
用体外转录的RNA(IVT-RNA)对细胞进行遗传修饰使用了两种不同策略,这两种策略已相继在各种动物模型中进行测试。体外转录的RNA借助于脂质体转染或电穿孔转染细胞。优选地,希望使用各种修饰稳定化IVT-RNA以便实现转移的IVT-RNA的表达延长。
一些IVT载体在文献中已知,其以标准化的方式用作体外转录的模板,并且已以产生稳定化RNA转录本这样一种方式进行遗传修饰。目前本领域使用的方案是基于具有下列结构的质粒载体:能使RNA转录的5'RNA聚合酶启动子,随后是3'和/或5'侧接非翻译区(UTR)的所关注基因,和含有50-70个A核苷酸的3'多聚腺苷酸盒。在体外转录之前,II型限制性内切酶在多聚腺苷酸盒下游(对应于裂解位点的识别序列)将环状质粒线性化。多聚腺苷酸盒因而对应于转录本中的后一多聚A(poly(A))序列。这个程序的结果是,一些核苷酸在线性化后仍为酶裂解位点的一部分,并且在3'端延伸或掩蔽poly(A)序列。尚不清楚这种非生理性突出是否影响细胞内从这种构建体产生的蛋白量。
RNA具有优于更传统的质粒或病毒方法的几个优点。RNA来源的基因表达不需要转录,并且在转染后迅速产生蛋白产物。另外,由于RNA仅必须进入细胞质,而非细胞核,因此典型的转染方法导致转染率极高。此外,基于质粒的方法要求驱动所关注基因的表达的启动子在所研究的细胞中是有活性的。
另一方面,RNA构建体可通过电穿孔被递送到细胞中。参见,例如US2004/0014645、US2005/0052630A1、US2005/0070841A1、US2004/0059285A1、US2004/0092907A1中所教导的核酸构建体的制剂和通过电穿孔进入哺乳动物细胞中的方法。各种参数,包括任何已知细胞类型的电穿孔所需的电场强度,一般在相关研究文献以及本领域中的多个专利和申请中是已知的。参见,例如,美国专利号6,678,556、美国专利号7,171,264和美国专利号7,173,116。用于电穿孔的治疗性应用的仪器可商购获得,例如MedPulserTMDNA电穿孔疗法系统(Inovio/Genetronics,San Diego,Calif.),并且描述于专利中,如美国专利号6,567,694、美国专利号6,516,223、美国专利号5,993,434、美国专利号6,181,964、美国专利号6,241,701和美国专利号6,233,482;例如US20070128708A1中所述,电穿孔也可用于体外转染细胞。电穿孔也可用于将核酸递送到体外细胞中。因此,利用本领域技术人员已知的许多可用装置和电穿孔系统中的任何一种,由电穿孔介导将核酸(包括表达构建体)施用到细胞呈现了一种用于将所关注RNA递送到靶细胞的手段。
不管使用何种方法将外源核酸引入宿主细胞中或者以其他方式将细胞暴露于本发明的抑制剂,为了确认重组DNA序列存在于宿主细胞中,可进行各种测定。所述测定包括例如本领域技术人员众所周知的“分子生物学”测定,例如DNA印迹法和RNA印迹法、RT-PCR和PCR;“生物化学”测定,如检测具体多肽存在或不存在,这类测定例如通过免疫学手段(ELISA和蛋白质印迹法)或者通过本文所述的识别落入本发明范围内的药剂的测定来进行。
疫苗
对于将可用作疫苗的抗原组合物,所述抗原组合物必须在细胞、组织或哺乳动物(例如人类)中诱导对所述抗原的免疫反应。优选地,所述疫苗在哺乳动物中诱导保护性免疫反应。本文所用的“免疫组合物”可以包含例如抗原(例如多肽),编码抗原的核酸(例如,抗原表达载体),或者表达或呈递抗原的细胞或细胞组分。在具体实施方案中,所述抗原组合物包含或编码本文所述的任何多肽抗原的全部或部分,或者其免疫学功能等同物。在其他实施方案中,所述抗原组合物是在包含额外免疫刺激剂或编码该免疫刺激剂的核酸的混合物中。免疫刺激剂包括但不限于额外抗原、免疫调节剂、抗原呈递细胞或佐剂。在其他实施方案中,一种或多种所述额外药剂以任意组合共价键合到所述抗原或一种免疫刺激剂上。在某些实施方案中,所述抗原组合物结合到或包含HLA锚定基序氨基酸。
在本发明的上下文中,术语“疫苗”(也称为免疫原性组合物)是指一种在接种到动物中后会诱导抗艰难梭菌免疫性或抑制艰难梭菌的物质。
本发明的疫苗在其核酸和/或细胞组分的组成可变化。在一非限制性实例中,编码抗原的核酸也可以用佐剂来配制。当然,应了解,本文所述的各种组合物可进一步包含额外组分。例如,一种或多种疫苗组分可包含在脂质或脂质体中。在另一个非限制性实例中,一种疫苗可包含一种或多种佐剂。本发明的疫苗和其各种组分可根据本发明,通过本文所公开的或本领域技术人员已知的任何方法制备和/或施用。
在一个实施方案中,本发明的多肽疫苗包括但不限于与佐剂物质混合的多肽,和与抗原呈递细胞(APC)一同被引入的多肽。用于后一类型疫苗的最常见的细胞是来源于骨髓和外周血的树突状细胞,因为这些细胞表达有助于T细胞激活的共刺激分子。WO00/06723公开了一种细胞疫苗组合物,其包括呈递肿瘤相关抗原多肽的APC。对APC加载编码多肽的多核苷酸(例如,DNA、RNA)或对APC加载多肽本身可以影响多肽的呈递。
因此,本发明也涵盖一种使用一种或多种多肽或其变体诱导抗毒素免疫性的方法,所述多肽具有SEQ ID NO:1-4氨基酸序列。当某一多肽或者多肽组合在接种到动物中后诱导抗毒素免疫反应时,确定所述多肽或者多肽组合具有抗毒素免疫性诱导作用。可通过在体内或体外观察宿主免疫系统针对多肽的反应,检测所述多肽或者多肽组合对抗毒素免疫性的诱导。
例如,一种用于检测细胞毒性T淋巴细胞的诱导的方法是众所周知的。进入活体的外来物质通过APC的作用被呈递到T细胞和B细胞。由于抗原的刺激,以抗原特异性方式对APC呈递的抗原起反应的T细胞分化成细胞毒性T细胞(也称为细胞毒性T淋巴细胞或CTL)。这些抗原刺激细胞接着增殖。这一过程在本文中被称为T细胞的“激活”。因此,本发明的某一多肽或者多肽组合对CTL的诱导可通过由APC呈递多肽到T细胞并检测CTL的诱导进行评价。此外,APC具有激活CD4+T细胞、CD8+T细胞、巨噬细胞、嗜酸性粒细胞和NK细胞的作用。
一种使用树突状细胞(DC)作为APC来评价CTL的诱导作用的方法是本领域众所周知的。在APC中,DC是一种具有最强CTL诱导作用的代表性APC。在这种方法中,所述多肽或者多肽组合最初与DC接触,然后所述DC与T细胞接触。检测与DC接触后具有针对所关注细胞的细胞毒性作用的T细胞表明,所述多肽或者多肽组合具有诱导细胞毒性T细胞的活性。此外,也可通过使用抗IFN-抗体进行观察(如ELISPOT测定),来测量在携带固定化多肽或者多肽组合的抗原呈递细胞存在下由CTL产生和释放的IFN-,从而检查诱导的免疫反应。
除了DC外,外周血单核细胞(PBMC)也可用作APC。据报道,通过在GM-CSF和IL-4存在下培养PBMC可增强对CTL的诱导。类似地,CTL已被证明可通过在匙孔血蓝蛋白(KLH)和IL-7存在下培养PBMC加以诱导。
由这些方法确认具有CTL诱导活性的多肽或者多肽组合是具有DC激活作用和随后的CTL诱导活性的多肽。因此,针对毒素A和毒素B诱导CTL的多肽或者多肽组合可用作针对艰难梭菌相关病症的疫苗。此外,由于APC呈递多肽或者多肽组合而获得细胞毒性的CTL也可用作针对艰难梭菌相关病症的疫苗。
一般来说,当多肽用于细胞免疫疗法时,通过组合多种具有不同结构的多肽并使其与DC接触,可提高CTL诱导的效率。因此,当用蛋白片段刺激DC时,使用多种类型的片段的混合物是有利的。
对针对特定毒素诱导产生抗体的观察可进一步确认多肽或者多肽组合对抗毒素免疫性的诱导。例如,当在用多肽或者多肽组合免疫的实验动物中诱导针对所述多肽或者多肽组合的抗体时,或当艰难梭菌相关病变被这些抗体抑制时,确定所述多肽或者多肽组合诱导抗艰难梭菌毒素的免疫性。
通过施用本发明的疫苗可诱导抗毒素免疫性,且抗毒素免疫性的诱导使得能够治疗和预防与毒素A和毒素B的存在相关的疾病。针对艰难梭菌相关疾病的疗法或预防其发作可以包括抑制毒素诱导的肌动蛋白去稳定化,预防上皮破坏,抑制毒素介导的粘膜坏死,和预防屏障功能下降。患艰难梭菌相关疾病的个体的死亡率下降、血液中疾病标志物的减少、伴随疾病出现的可检测症状的减轻等也包括在疾病的疗法或预防内。这样的治疗性和预防性作用优选在统计学上是显著的,例如,观察到5%或更小的显著水平,其中将针对艰难梭菌相关疾病的疫苗的治疗性或预防性作用与不施用疫苗的对照进行比较。例如,学生t检验(Student’s t-test)、曼-惠特尼(Mann-Whitney)U检验或ANOVA可用于确定统计显著性。
本发明提供了一种用于治疗或预防艰难梭菌相关疾病或病况的方法。本发明的治疗性化合物或组合物可预防性或治疗性施用于受试者,所述受试者患有所述疾病或病况,或处于发展所述疾病或病况的风险中,或容易发展所述疾病或病况。可使用标准临床方法来识别这样的受试者。在本发明的上下文中,预防性施用在明显的临床疾病症状显现前进行,使得疾病或病症的进展可被预防或者被延迟。在药学领域的上下文中,术语“预防”涵盖降低来自疾病的死亡或发病负担的任何活动。预防可在一级、二级和三级预防水平下发生。一级预防避免了疾病的发展,而二级和三级水平的预防涵盖旨在预防疾病进展和症状出现以及通过恢复功能并减少疾病相关并发症来降低已确定的疾病的消极影响的活动。
本发明的具有免疫活性的多肽或者多肽组合或编码这种多肽或者多肽组合的多核苷酸或载体可与佐剂组合。佐剂是指一种化合物,其在与具有免疫活性的多肽一起(或相继)施用时增强针对所述多肽或者多肽组合的免疫反应。合适的佐剂的实例包括霍乱毒素、沙门氏菌毒素、明矾等,但不限于这些实例。此外,本发明的疫苗可适当地与药学上可接受的载体组合。这种载体的实例为无菌水、生理盐水、磷酸盐缓冲液、培养液等。此外,必要时所述疫苗可含有稳定剂、混悬剂、防腐剂、表面活性剂等。所述疫苗可全身或局部施用。疫苗施用可以通过单次施用来完成或者通过多次施用来强化。
施用
本领域技术人员认识到可利用不同的递送方法将载体施用到细胞内。实例包括:(1)利用物理手段的方法,如电穿孔(电力)、基因枪(物理力)或应用大量液体(压力);和(2)其中将所述载体复合到另一实体(例如脂质体、聚集蛋白或转运分子)的方法。
在一个实施方案中,本发明的方法包括将包含编码本发明多肽的多核苷酸的组合物直接施用到受试者。组合物的施用可包括例如肌肉内、静脉内、腹膜、皮下、皮内以及局部施用。在一个实施方案中,通过体内电穿孔辅助组合物递送。在一个实施方案中,组合物的递送包括肌肉内施用和体内电穿孔的组合。
此外,可依据所述组合物是否与其他药物组合物组合施用或依据个体间药代动力学、药物处置和代谢方面的差异改变实际剂量和方案。类似地,在体外应用中,量可依据利用的具体细胞系(例如,基于存在于细胞表面上的载体受体的数量,或所采用的具体载体将基因转移到该细胞系使其复制的能力)而变化。此外,将加入到每个细胞上的载体的量将可能随插入载体中的治疗基因的长度和稳定性也以及序列的性质而变化,并且特别是需要根据经验确定的参数,可由于非本发明方法所固有的因素(例如,与合成相关的成本)发生变化。本领域技术人员根据具体情况下的紧急性可容易地作出任何必要的调整。
含有治疗剂的细胞也可能含有自杀基因,即一种编码可用于破坏细胞的产物的基因。在许多基因疗法情况中,均期望能够在宿主细胞中表达用于治疗目的的基因,但也期望具有任意破坏宿主细胞的能力。所述组合物可连接到自杀基因,所述自杀基因在没有激活剂化合物时表达不被激活。当希望已引入药剂和自杀基因的细胞死亡时,施用激活剂化合物到所述细胞,从而激活自杀基因的表达并杀死细胞。可使用的自杀基因/前药组合的实例为单纯疱疹病毒-胸苷激酶(HSV-tk)和更昔洛韦(ganciclovir)、阿昔洛韦(acyclovir);氧化还原酶和环己酰亚胺;胞嘧啶脱氨酶和5-氟胞嘧啶;胸苷激酶胸苷酸激酶(Tdk::Tmk)和AZT;以及脱氧胞苷激酶和阿糖胞苷。
本文所述的这些方法并不能包括所有的方法,而且适合特定应用的其他方法对本领域普通技术人员将是显而易见的。而且,可进一步通过与已知发挥所需作用的化合物进行类比对组合物的有效量作出估计。
药物组合物
本发明预期在哺乳动物中通过向有需要的哺乳动物施用本发明的治疗组合物来治疗CDAD相关疾病或病况。依据例如接受者的生理状况、施用目的是治疗性的或是预防性的和熟练从业人员已知的其他因素,根据本发明施用治疗组合物可以是连续的或间断的。本发明组合物的施用可以在一个预选时间段内基本上是连续的或可以是以一系列间隔的剂量进行。局部和全身施用都包括在内。施用量将依据各种因素而变化,所述因素包括但不限于选择的组合物、具体疾病、哺乳动物的体重、身体状况和年龄以及是要实现预防或是治疗。这些因素可由临床医生使用动物模型或本领域众所周知的其他测试系统容易地确定。
一种或多种具有本发明组合物的合适单位剂型,如以下所讨论的,可任选配制用于持续释放(例如使用微包封,参见WO94/07529和美国专利号US4,962,091,其公开内容通过引用并入本文),所述单元剂型可通过多种途径施用,包括胃肠外途径、包括静脉内和肌肉内途径以及直接注射到患病组织中。制剂可以在适当情况下方便地以个别单位剂型呈现,并且可以通过药学上众所周知的任何方法制备。所述方法可包括以下步骤:将治疗剂与液体载体、固体基质、半固体载体、微细固体载体或其组合缔合,然后必要时将产物引入或成形到预期的递送系统中。
当制备本发明的组合物用于施用时,所述组合物优选与药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂组合形成药学制剂或单位剂型。所述制剂中的总活性成分包括制剂的0.1到99.9重量%。“药学上可接受的”是与制剂的其他成分相容并对所述制剂的接受者无毒的载体、稀释剂、赋形剂和/或盐。用于施用的活性成分可以呈粉末剂或颗粒剂;溶液、混悬剂或乳剂。
含有本发明组合物的药物制剂可通过本领域已知的程序,使用众所周知并且可轻易获得的成分来制备。本发明的组合物也可配制成适于胃肠外施用(例如通过肌肉内、皮下或静脉内途径)的溶液。
本发明的组合物的药物制剂也可采用含水或无水溶液或分散液形式,或者采用乳剂或混悬剂形式。
因而,所述组合物可以配制用于胃肠外施用(例如,通过注射,如弹丸注射或持续输注),并且可能以安剖、预填充注射器、小容量输注容器或具有添加的防腐剂的多剂量容器中的单位剂型呈现。活性成分可采用如油性或含水媒介物中的混悬剂、溶液或乳剂的形式,并且可以含有配制试剂,如悬浮剂、稳定剂和/或分散剂。或者,活性成分可以呈通过灭菌固体的无菌分离或通过冻干溶液获得的粉末形式,在使用前用合适的媒介物(例如,无菌、无热原的水)复原。
应了解,含于各剂型的个别气雾剂剂量中的活性成分的单位含量本身无需构成用于治疗具体适应症或疾病的有效量,因为必要的有效量可通过施用多个剂量单位达到。而且,有效量可以通过个别地或在一系列施用中使用低于所述剂型的剂量来实现。
本发明的药物制剂可以包括药学上可接受的载体、稀释剂、增溶剂或乳化剂和本领域众所周知的类型的盐作为可选成分。可用于本发明药物制剂中的载体和/或稀释剂的具体非限制性实例包括水和生理学上可接受的缓冲盐水溶液,如pH7.0-8.0磷酸盐缓冲盐水溶液。
本发明的表达载体、转导的细胞、多核苷酸和多肽(活性成分)可以加以配制并施用,以通过使所述活性成分与生物体体内药剂作用位点产生接触的任一手段来治疗各种疾病状态。它们能以个别的治疗活性成分形式或者治疗活性成分的组合形式,通过可用于结合药物的任一常规手段施用。它们可单独施用,但通常与基于所选施用途径和标准药学实践选择的药物载体一起施用。
一般来说,水、合适的油、盐水、含水右旋糖(葡萄糖)和相关的糖溶液和二醇类(如丙二醇或聚乙二醇)是用于胃肠外溶液的合适载体。用于胃肠外施用的溶液含有活性成分、合适的稳定剂,必要时还含有缓冲物质。单独或组合的抗氧化剂,如硫酸氢钠、亚硫酸钠或抗坏血酸,是合适的稳定剂。也可使用柠檬酸和其盐以及乙二胺四乙酸钠(EDTA)。此外,胃肠外溶液可以含有防腐剂,如苯扎氯铵(benzalkonium chloride)、对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯和氯丁醇。在本领域的标准参考文献雷明顿药物科学(Remington'sPharmaceutical Sciences)中对合适的药物载体进行了描述。
本发明的活性成分可配制成悬浮在药学上可接受的组合物中,所述组合物适合在哺乳动物且尤其在人类中使用。所述制剂包括佐剂的使用,所述佐剂如美国专利号4,082,735、美国专利号4,082,736、美国专利号4,101,536、美国专利号4,185,089、美国专利号4,235,771和美国专利号4,406,890中描述的胞壁酰二多肽衍生物(MDP)或类似物。其他有用佐剂包括明矾(Pierce Chemical Co.)、脂质A、海藻糖二霉菌酸酯和双十八烷基二甲基溴化铵(DDA)、弗氏佐剂和IL-12。其他组分可包括非离子表面活性剂聚氧化丙烯-聚氧化乙烯嵌段聚合物和可代谢油剂,如角鲨烯(美国专利号4,606,918)。
此外,可以采用标准的药学方法控制作用的持续时间。这些方法是本领域众所周知的,并且包括控制释放制剂,且可包括适当的大分子,例如聚合物、聚酯、聚氨基酸、聚乙烯、吡咯烷酮、乙烯乙酸乙烯酯、甲基纤维素、羧甲基纤维素或硫酸鱼精蛋白。可以调整大分子浓度以及并入方法以便控制释放。此外,可以将药剂并入聚合材料的粒子中,所述聚合材料如聚酯、聚氨基酸、水凝胶、聚(乳酸)或乙烯乙酸乙烯酯共聚物。除了被并入,这些药剂还可以用于将化合物捕入微胶囊剂中。
因此,本发明的药物组合物可以通过各种途径递送到哺乳动物体内的多个位点来实现具体的效果(参见,例如,Rosenfeld等,1991;Rosenfeld等,1991a;Jaffe等,同上;Berkner,同上)。本领域技术人员应认识到,尽管可使用一种以上途径用于施用,但一种具体途径可提供比另一种途径更快速且更有效的反应。局部或全身递送可通过包括涂覆或滴注制剂到体腔、吸入或吹入气雾剂在内的施用,或通过包括肌肉内、静脉内、腹膜、皮下、皮内以及局部施用在内的胃肠外引入来实现。在一个实施方案中,由体内电穿孔辅助组合物的递送。在一个实施方案中,所述组合物的递送包括组合肌肉内施用和体内电穿孔。
本发明的活性成分可以单位剂型提供,其中各剂量单位(如,一茶匙、片剂、溶液或栓剂)单独地或与其它活性剂适当组合地含有预定量的所述组合物。本文所用的术语“单位剂型”是指适合作为用于人类和哺乳动物受试者的单位剂量的物理个别单位,各单位单独地或与其他活性剂组合地含有预定量的本发明组合物,所述预定量按足以在适当时与药学上可接受的稀释剂、载体或媒介物缔合产生所需效果的量来计算。针对本发明的单位剂型的规格取决于要达到的具体效果和与具体宿主中的药物组合物相关联的具体药效学。
本文所述的这些方法并不能包括所有的方法,而且适合特定应用的其他方法对本领域普通技术人员将是显而易见的。此外,可进一步通过与已知发挥所需作用的化合物进行类比对组合物的有效量作出估计。
实验实施例
可参照以下实验实施例对本发明进一步详述。提供这些实施例的目的只为了说明而并非意图进行限制,除非另有规定。因此,本发明不应以任何方式被解释为限于以下实施例,而是应被解释为涵盖因本文提供的教导而变得显而易见的任何和所有变化。
无需进一步说明,相信本领域普通技术人员可以使用前述的说明和下列说明性实施例,制备和利用本发明的化合物和实践所要求保护的方法。因此,下列工作实施例特别指出了本发明的优选实施方案,并且不应当被解释为以任何方式限制本公开的其余部分。
现在说明实施例中采用的材料和方法。
质粒免疫和小鼠
对6到8周龄的雌性Balb/C小鼠(Jackson Laboratory)的四头肌肌肉注射含有载体骨架(pVAX,Invitrogen)的组合或如所述的抗原质粒(2005,Kutzler等,J Immunol175(1):112-123;1998,Kim等,J ClinInvest102(6)1112-1124)的质粒DNA制剂。制剂含有溶于等渗柠檬酸盐缓冲液中的0.25%布比卡因(bupivicaine)-HCL(Sigma)。各种基因质粒的共施用涉及混合指定的DNA质粒以便在以20μL最终体积注射前,每一实验组含有相同浓度的DNA(添加载体骨架使全部组的DNA浓度相等)。所有DNA均使用无内毒素的Qiagen柱制备。所有动物均圈养在DUCOM的温度控制、光循环的设备中,并且在DUCOM按美国国立卫生研究院以及IACUC/ULAR的指导进行护理。
小鼠中的电穿孔条件
方波脉冲被用于所有实验(Draghia-Akli和Smith,2003,In:Templeton NS,Lasic DD(编者)Gene Therapy-TherapeuticMechanisms and Strategies.Marcel Dekker,Inc.,New York,245-263),并用本实验室设计和检验的恒流EKD递送。在小鼠实验中使用三电极阵列(3-EA)。所述3-EA由三个呈等腰三角形排列的26号实心不锈钢电极组成,有两个长度为0.5毫米的长边和长度为0.3毫米的短边,所述长边和短边用绝缘的塑料固定在一起。用于小鼠实验的具体EP条件是使用0.1安培的恒流,三个脉冲,52毫秒/脉冲,脉冲之间间隔4秒。质粒注射与EP之间的延迟时间为约20秒。质粒施用/EP的事件顺序如下:将一次性电极组件放到手柄插孔中,按下手柄上的启动按钮,输入动物实验组编号,使用胰岛素注射器注射DNA构建体质粒,立即将针放入注射位点周围的区域中,按下手柄上的启动按钮,并在4秒倒计时后,递送脉冲。电穿孔后5秒,轻轻从肌肉去除阵列。在所有的治疗过程中,所有电极均完全插入到肌肉中。
用于小鼠处死、组织或样本收集和供免疫分析的细胞纯化的方法
在图例中指定的终点处,使用阿佛丁(avertin)或异氟烷使动物镇静,并在处死动物前取适量的血液和粪粒。处死后,从各实验组的每只小鼠收集脾脏,并将组织放入含有R10培养基(RPMI1640+10%胎牛血清、500μg/L青霉素和500μg/L链霉素,Gibco,Invitrogen)的15毫升锥形管中。使用Seward Stomacher80将每个实验组的脾脏捣碎成单细胞混悬液,使其通过40微米的细胞过滤器,用培养基洗涤,集结成粒,室温下在裂解红细胞的ACK裂解缓冲液中孵育5到10分钟。洗涤全部细胞,重悬于培养基中,并使用血细胞计数器计数(使用台盼蓝染色确定细胞活力)。
由ELISA分析IgG和IgA结合抗体
如所述(1989,Ogawa等,J Immunol142(4):1150-1158;2004,Mestecky等,AIDS research and human retroviruses20(9):972-988)使用ELISA确定小鼠血清和粪便提取物中的抗原特异性IgG。通过颌下腺或眶后出血从小鼠收集小鼠血液样本,从各小鼠组的笼中获得粪粒,随后在每个实验组内个别地操作血清和粪便样本。用PBS(Mediatech)稀释的0.5到2mg/mL类毒素A或B(List Biologicals)涂布EIA/RIA板(Costar),最终体积为每孔100μL,且在4℃下孵育过夜。用PBS/吐温(Tween)(0.05%Tween20)洗涤所述板3次,用200μL阻断缓冲液/稀释剂(PBS中的3%BSA)在室温下针对非特异性结合阻断2小时。洗涤所述板,将用PBS/1%BSA稀释的来自免疫小鼠的合并血清或粪便提取物加入孔中,最终体积为100μL。在1:25到1:150,000稀释系列的稀释度下一式三份加入样本以确定终点效价(定义为最低样本稀释度,在所述最低样本稀释度下,实验组的测量值等于载体免疫的小鼠样本O.D.值),并在室温下孵育2小时或在4℃下孵育过夜。结合的抗体用辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠IgG或IgA(SantaCruz)检测,并用底物TMB H2O2(SIGMA)显色。用2N H2SO4终止显色反应,用EL312Bio-Kinetics微板读数器(Bio-Tek Instruments Inc.)读取450nm下的吸光度。通过使用DeltaSoft II程序(BioMettalics,Inc.)在校准曲线上内插光密度来计算血清或粪便分泌物中总IgG或IgA的量。
用于测量IgA和IgG的B细胞ELISPOT
如先前所述(1996,Slifka等,J Immunol Met199(1):37-46;2000,Brown等,J Infect Dis182(4):1039-1043;2004,Crotty等,J ImmunolMet286(1-2):111-122;2003,Qadri等,Infect Immun71(8):4808-4814)进行B细胞ELISPOT,并如下所述进行一些修改。在最后一次免疫后一周处死免疫小鼠,从脾细胞收集分泌抗体的细胞。用PBS(Mediatech)稀释的2μg/mL类毒素A或B(List Biologicals)涂布ELISpot96孔板,最终体积为每孔100μL,并在4℃下孵育24小时。洗涤所述板并用1%BSA阻断2小时。一式三份向各孔中加入来自免疫小鼠的500,000个总淋巴细胞,在37℃、5%CO2下孵育5小时。洗涤所述板,加入100μL1:2000稀释度的抗小鼠IgA-生物素(稀释在PBS/1%BSA中),在4℃下孵育过夜。洗涤所述板,加入100μL1:100稀释度的链霉亲和素-碱性磷酸酶(稀释在PBS/1%BSA中),并在室温下孵育2小时。洗涤所述板,将(BCIP)和(NBT)底物加入各孔中。用蒸馏水漂洗所述板,在室温下干燥。用自动化ELISpot读数器(CTLLimited,Inc.)和用眼睛对斑点计数。确定原始值,并乘以一个系数,以使数据代表每1,000,000个分泌IgA的B细胞中的抗体分泌细胞(ASC)。
统计学分析
将数据表示为从来自每个试验组的3个复孔的合并淋巴细胞计算出的平均值±标准差(st dev)。在适当情况下,免疫组之间的统计学差异通过使用双尾配对学生t检验来评估,得到每个试验组的具体p值。p值<0.05的样本之间的比较被认为有统计学差异,且因此是显著的。
现在描述实验结果。
实施例1:通过肌肉内途径和随后电刺激递送的优化的基于DNA 的疫苗的开发,所述疫苗编码艰难梭菌的毒素A和毒素B受体结合 结构域。
艰难梭菌RBD质粒的构建和表达
高度优化的质粒是基于与新型的基于质粒的粘膜趋化因子组合的艰难梭菌毒素A(Tcd A)和毒素B(TcdB)设计的。为产生高度优化的抗原构建体,识别对应于艰难梭菌菌株VPI10463(NCBIAAA23283)的毒素A和B蛋白的全长氨基酸序列;通过电脑模拟将对应于推定受体结合结构域(RBD)氨基酸序列的残基回译成新型遗传序列,所述RBD已知占据所述蛋白的羧基端的三分之一。为增强蛋白质表达引入了基因修饰,包括密码子优化(对于人类),有效分泌前导子(IgE)的加入,KOZAK规律,和阻碍翻译的顺式作用序列基序/RNA二级结构的去除(图1)。此外,使潜在的N-连接糖基化序列突变,以保护细菌毒素的天然糖基化。接着,提交这种基因用于商业合成(Geneart)。消化基因插入物(EcoR1/Xho1,New England Biolabs),并接合到商业载体pVAX(Invitrogen,Carlsbad,CA)上,通过用于体内检验的蛋白质杂交来确认蛋白表达(图1)。抗原构建体称为TcdA-RBD和TcdB-RBD。综上所述,这些数据表明趋化因子的质粒形式表达具体的趋化因子蛋白。
免疫诱导体内产生TcdA和TcdB特异性抗体和抗体分泌细胞
(ASC)
用针对不同量(5μg、10μg或25μg)的抗原构建体pA RBD N→Q或pB RBD N→Q的质粒DNA制剂与必需量的插入载体骨架pVAX一起使雌性Balb/C小鼠(6到8周龄)免疫,确保总质粒共为25μg。在第0天、第14天和第28天使小鼠免疫。在第38天处死小鼠。免疫组的血清和粪便样本用PBS/1%BSA稀释,稀释度从1:20到1:200000。稀释物被涂覆于已经用1μg/mL类毒素A(txdA)或类毒素B(txdB)涂布的EIA/RIA板。孵育后,通过在450nm下的吸光度读数(OD450)检测抗体结合。针对所有量的所测试pA RBD N→Q和pBRBD N→Q都检测到抗体结合(图2)。此外,在免疫小鼠的血清中检测到毒素A和毒素B特异性IgG,而不是IgA。
在免疫后一周收集脾脏,且如本文其他地方所述,从脾细胞收集ASC。使用涂布有2μg/mL txdA或txdB的ELISPOT96孔板进行B细胞ELISPOT测定法。与免疫组的细胞一起孵育后的所计数斑点,证明用pA RBD N→Q或pB RBD N→Q免疫在免疫小鼠中产生数量增加的ASC(图3)。
TcdA-RBD和TcdB-RBD的同时免疫
通过IM/EP在第0天、第14天和第28天用10ug pA RBD N→Q和10μg pB RBD N→Q同时使小鼠免疫,或用20μg载体骨架pVAX为对照使小鼠免疫。通过ELISA检测免疫动物的血清样本中的毒素A和毒素B特异性抗体(图4)。此外,来自免疫动物的分离脾细胞证明免疫后毒素A特异性ASC和毒素B特异性ASC计数增加(图4)。
毒素特异性记忆反应和疫苗诱导的B细胞的分析
将来自接种过的小鼠的脾细胞用PWIM(1:100,000)、CpG2006(6μg/mL)和金黄色葡萄球菌Cowan(1:10,000)刺激72小时,然后用涂布有1μg/ml txdA或txdB的板孵育。由于从接种毒素A或毒素B的小鼠收集到的受刺激的脾细胞显示毒素A特异性ASC或毒素B特异性ASC数量增加,故观察到毒素A特异性和毒素B特异性记忆反应。
RBD免疫动物的血清防止细胞变圆
毒素的应用导致维洛细胞(一种来源于非洲绿猴肾细胞的永生化细胞系)发生剂量依赖性变圆。因此,细胞变圆可以在体外用作毒素介导的病变的标志物。用pA RBD N→Q免疫的小鼠的血清样本显示能够防止250ng毒素A诱导的细胞变圆。此外,用pB RBD N→Q免疫的小鼠的血清样本也证明了能够防止应用250ng毒素B可察看到的细胞变圆(图6)。总之,这些数据表明,用本文所述的DNA构建体免疫的小鼠产生的毒素A和毒素B特异性抗体可防御由艰难梭菌所生成的毒素诱导的病变。
用pCdiffA/B进行IM/EP免疫会保护小鼠免受全身性毒性攻击
在第0天、第14天和第28天用pA RBD N→Q和pB RBD N→Q使小鼠免疫。在最后一次免疫剂量后5周,用毒素A和毒素B攻击小鼠。然后每天监测小鼠的体重减轻和艰难梭菌相关疾病(CDAD)征兆,持续14天。在仅用对照pVAX免疫的小鼠中,所有受攻击的小鼠均在24小时内死亡。然而,用25μg pA RBD N→Q免疫的小鼠免于由300ng毒素A介导的死亡,而用25μg pB RBD N→Q免疫的小鼠免于通过用毒素A和毒素B各150ng进行攻击所介导的死亡(图7)。
雌性印度恒河猴的免疫
通过IM/EP在第0周、第6周、第12周和第18周用pTcdA/B N→Q中任一者使雌性印度恒河猴免疫。在第2周、第8周和第14周评估抗-A RBD IgG和抗-B RBD IgG的效价。分析表明接种过的构建体具有高度免疫原性,因为在整个免疫方案中均检测到特异性抗体。(图8)
实施例2:用于预防CDAD的新型DNA疫苗的开发
本文公开了编码毒素A和毒素B RBD的高度优化质粒的生成,其中改变了推定的N-连接糖基化位点。本文包括的抗原DNA修饰概括在图9A中。呈现pVAX的关键组件的质粒图谱如图9A所示。优化并构建编码A或B RBD wt和A或B RBD N→Q的四种质粒。对毒素A和B的RBD中推定的N-连接糖基化位点加下划线,如图9B所示。在构建DNA疫苗质粒过程中,在这些位点,Gln(Q)取代首个Asn(N)。为了验证表达,使用脂质体2000用2μg pRBD N→Q构建体转染293T细胞(3.0x105个细胞)。转染后48小时,收集裂解液(RIPA缓冲液)和上清液,用SDS-PAGE(4-12%)分级分离,并转移到PVDF膜上。用特异性小鼠抗血清进行免疫检测,用辣根过氧化物酶结合的山羊抗小鼠IgG使用ECL检测系统观察表达的蛋白(图9C)。将裂解液和上清液的等分试样用500U多肽N-糖苷酶F(PNGaseF)在37℃下消化1小时,并在65℃下失活15分钟。如上所述,对样本进行SDS-PAGE(8%)和免疫检测(图9D)。构建体的免疫检测证明N→Q构建体未被糖基化。
用两种质粒使C57BL/6小鼠(n=4/组)肌肉内免疫,之后进行体内电穿孔,免疫3次,每次间隔2周(图10)。按时间纵向收集血清和粪便物,并分析Tcd A/B RBD特异性免疫反应。每次免疫时测量血清中的抗体水平。用0.5μg/mL类毒素A或B涂布96孔板过夜。加入血清稀释液,使用HRP结合的抗体测量总IgG(图11A)。血清分析表明,接种诱导显著水平的抗RBD抗体。
用0.5μg/mL类毒素A或B或总IgG涂布ELISpot板过夜。第三次免疫后10天,分离出脾细胞,并加入板中(Ag特异性,5.0x105个细胞/孔,和总IgG,1.0x104个细胞/孔)。24小时后,洗掉细胞,并用HRP结合的抗体进行探测(图11B)。或者,将脾细胞(1.5x106个)在R10培养基加上1:6CpG2006、1:1000PWM、1:1000BMe和1:10000SAC中刺激3天以促进记忆B细胞增殖(图11C)。如上所述,检测抗原特异性记忆B细胞。脾细胞分析表明,接种引出RBD特异性抗体分泌细胞的频率增加。此外,接种过的小鼠的脾细胞显示增大的RBD特异性记忆反应。此外,抗原特异性IgG的外周效价高于IgA。
Vero细胞(5.0x104个细胞)在96孔板中生长至单层(24小时)。将小鼠血清稀释在25μL R10培养基中,并加入含250ng毒素A或毒素B的25μL R10中。轻轻混合,在37℃下孵育1小时,并重复加入96孔板中。20-24小时后,在10X放大倍数下评估细胞变圆。图片表示两个孔中的平均效果。山羊抗毒素A(List Biologicals)用作阳性对照(图12A)。用pRBD N→Q免疫的小鼠的血清在体外中和艰难梭菌毒素的细胞病变作用。通过对每孔6个随机视野进行分析并对变圆细胞的百分比求平均值来完成细胞变圆的定量。对比于pVAX血清和山羊抗毒素A,将结果绘制成图(图12B)。这一数据表明RBD AN→Q血清比RBD B N→Q血清更有效地中和毒素活性。
在小鼠模型中评估毒素特异性接种对致死性毒素攻击起反应的能力。在第0周、第2周和第4周使小鼠免疫。免疫后5周后,用毒素攻击小鼠,并监测2周(图13)。用(1)150ng毒素A或B;(2)300ng毒素A或B;(3)75ng这两种毒素;或者(4)150ng这两种毒素腹腔内攻击5只C57BL/6小鼠。每天监控小鼠的发病征兆(图14A)。观察到300ng毒素A以及毒素A和Tcd B各150ng导致所有受攻击的动物在50小时内死亡。用毒素腹腔内攻击10只C57BL/6小鼠/组。ARBD N→Q小鼠接受300ng毒素A,而B RBD N→Q小鼠接受150ng各毒素(图14B)。观察到接种显著改善存活率。
这些数据表明了基于毒素A/B RBD的DNA疫苗的强免疫原性。我们注意到,含有受阻的N-连接糖基化位点的优化质粒可以在哺乳动物细胞系中表达。与N→Q RBD不同,293T细胞表达的野生型RBD被糖基化,这表明突变是保持天然艰难梭菌RBD区域的非糖基化形式所必需的。
本文所引用的每个专利、专利申请和出版物的公开内容在此以引用的方式整体并入本文。虽然本发明已经参照具体实施方案得到公开,但显而易见地,本领域技术人员可以设计出本发明的其他实施方案和变化形式而不背离本发明的真实精神和范围。所附权利要求意图被解释为包括所有这些实施方案和等同的变化形式。
Claims (26)
1.一种疫苗,其包含选自由以下组成的组中的至少一种核酸:
a.编码包含SEQ ID NO:3氨基酸序列的多肽的核酸;和
b.编码包含SEQ ID NO:4氨基酸序列的多肽的核酸。
2.如权利要求1所述的疫苗,其进一步包含编码分泌前导肽的核酸。
3.如权利要求2所述的疫苗,其中所述分泌前导肽是IgE分泌前导肽。
4.如权利要求1所述的疫苗,其中所述核酸被并入一种表达载体中。
5.如权利要求1所述的疫苗,其中所述核酸被并入两种或更多种表达载体中。
6.如权利要求1所述的疫苗,其中所述至少一种核酸被密码子优化用于在人类细胞中表达。
7.一种使哺乳动物针对艰难梭菌免疫的方法,包括将如权利要求1所述的疫苗施用到所述哺乳动物的组织的步骤。
8.如权利要求7所述的方法,其包括以下步骤:
a.将所述疫苗施用到所述哺乳动物的所述组织;和
b.用有效允许所述核酸分子进入所述哺乳动物的所述组织的细胞中的电流对所述细胞进行电穿孔。
9.如权利要求8所述的方法,其中所述哺乳动物的所述组织是肌肉。
10.如权利要求7所述的方法,其中所述疫苗通过肌肉内或皮内注射施用。
11.如权利要求7所述的方法,其中所述哺乳动物目前未感染艰难梭菌,并且所述疫苗诱导保护性免疫反应。
12.如权利要求11所述的方法,其中所述保护性免疫反应包括至少一种抗体,所述抗体特异性结合到由SEQ ID NO:3的多肽和SEQID NO:4的多肽组成的组中的至少一种多肽上。
13.如权利要求7所述的方法,其中所述哺乳动物是人类。
14.一种治疗感染艰难梭菌的哺乳动物的方法,包括将如权利要求1所述的疫苗施用到所述哺乳动物的组织的步骤。
15.如权利要求14所述的方法,其包括以下步骤:
a.将所述疫苗施用到所述哺乳动物的所述组织;和
b.用有效允许所述核酸分子进入所述哺乳动物的所述组织的细胞中的电流对所述细胞进行电穿孔。
16.如权利要求14所述的方法,其中所述哺乳动物的所述组织是肌肉。
17.如权利要求14所述的方法,其中所述疫苗通过肌肉内或皮内注射施用。
18.如权利要求14所述的方法,其中所述哺乳动物目前感染艰难梭菌,并且所述疫苗诱导治疗性免疫反应。
19.如权利要求18所述的方法,其中所述治疗性免疫反应包括至少一种抗体,所述抗体特异性结合到由SEQ ID NO:3的多肽和SEQID NO:4的多肽组成的组中的至少一种多肽上。
20.如权利要求14所述的方法,其中所述哺乳动物是人类。
21.一种分离的多肽,其包含SEQ ID NO:3氨基酸序列。
22.一种分离的核酸,其编码SEQ ID NO:3氨基酸序列。
23.一种分离的多肽,其包含SEQ ID NO:4氨基酸序列。
24.一种分离的核酸,编码SEQ ID NO:4氨基酸序列。
25.一种组合物,其包含含有SEQ ID NO:3氨基酸序列的分离的多肽,和包含SEQ ID NO:4氨基酸序列的分离的多肽。
26.一种组合物,其包含编码SEQ ID NO:3氨基酸序列的分离的核酸,和编码SEQ ID NO:4氨基酸序列的分离的核酸。
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