KR20140042598A

KR20140042598A - 비 방울 미세추출 방법을 이용한 모세관 전기영동 방법

Info

Publication number: KR20140042598A
Application number: KR1020120109553A
Authority: KR
Inventors: 정두수; 김지혜
Original assignee: 서울대학교산학협력단
Priority date: 2012-09-28
Filing date: 2012-09-28
Publication date: 2014-04-07

Abstract

본 발명은 모세관 전기영동에서 방울이 없이 미세추출방법으로 시료를 추출하여 분석하는 기술에 대한 것이다. 본 발명은 모세관 끝에 미세방울을 형성하지 않고, 모세관끝에 유기층막을 형성하여 3-phase 방식을 사용하거나, 시료를 펜탄올과 같은 물질을 모세관 말단 부분에 일부 채워넣어 여기에 시료를 모아 전기영동을 시행하는 2-phase 방식을 사용한다. 본 발명에 따르면, 미세방울의 형성과정과 유지를 위한 노력이 소요되지 않고 간편하게 분석을 자동화할 수 있다. 또한, 2-phase, 3-phase를 비롯하여 억셉터와 도너의 여러가지 화학적인 차이를 이용하여 다양하게 비 방울 미세추출의 활용영역을 넓힐 수 있다.

Description

비 방울 미세추출 방법을 이용한 모세관 전기영동 방법{Capillary electrophoresis using No drop microeextraction}

본 발명은 모세관 전기영동에서 방울이 없이 미세추출방법으로 시료를 추출하여 분석하는 기술에 대한 것이다.

CE(capillary electrophoresis)는 높은 분리능으로 인해 생물학적 또는 환경물질들을 분석하는데 많이 사용되어 왔다. 생물학적 시료 등에서의 분석대상은 통상적으로 복잡한 매트릭스내에 미량 존재하는 관계로 샘플 정화(cleanup) 및 농축을 위한 전처리과정들을 필요로 한다. 다양한 고효율의 자동화된 분석장비가 사용되고 있지만, 실질적으로 분석효율을 높이는 단계는 샘플의 전처리 과정이라 할 수 있다. 이를 위한 방법 중의 하나로 SDME(single drop microextraction; 단일방울 미세추출법)은 매우 유용한 방법이며, 샘플의 클린업 및 농축을 동시에 달성할 수 있는 방법이다. SDME방법은 모세관의 끝부분에 유기용매로 코팅된 수용성 받게 상(aqueous acceptor phase)을 가지는 방울을 만들고 분석물(analyte)은 수용성 주게 상과 수용성 받게 상의 pH차이에 의해 방울내로 농축됨으로써 모세관 내로 주입하여 분석하는 방법이다.

한편, SDME방법에서 미세방울을 안정적으로 만들기 위한 노력이 필요하고 또한 격렬한 교반이 가해졌을 때 미세방울의 안정성이 떨어지는 문제를 여전히 갖고 있다. 또한 보다 높은 EF(enrichment factor)를 얻기 위해 보다 작은 부피의 방울을 만들기가 쉽지 않고 이 경우 방울의안정성은 더욱 떨어진다.

본 발명은 상기한 문제점을 해결하기 위한 것으로 미세방울의 형성을 하지 않고 분석하는 방법을 제시함으로써 방울의 형성과정과 유지를 위한 노력이 소요되지 않고 간편하게 분석을 자동화할 수 있는 방법을 제공하고자 한다.

또한 2-phase, 3-phase를 비롯하여 억셉터와 도너의 여러가지 화학적인 차이를 이용하여 다양하게 비 방울 미세추출을 활용영역을 넓히고자 한다.

본 발명은 모세관 전기영동에서 모세관의 말단에 미세 방울을 형성하지 않고 2-phase 또는 3-phase 방식으로 시료를 추출하여 CE분석을 할 수 있다.

도 1은 본 발명의 일 실시형태를 설명하기 위한 개념도로서 2-phase 방식을 보여준다. 본 방식은 헤드스페이스 추출방식이 아니라 샘플용액에서 분석물을 직접적으로 추출하여 분석하는 방식으로 적용될 수 있다. 각 과정을 간단히 설명한다. 우선 모세관에 받게층을 주입한 후 다음으로는 모세관을 펜탄올 용액에 담궈 압력을 조절하여 모세관내로 일부 주입시킨다. 다음으로 샘플(측정하고자 하는 대상용액)에 모세관을 담궈 시료를 모세관내의 펜탄올 용액부분으로 모이게 한다. 적절한 pH 조건에서 추출하고자 하는 시료가 중성상태로 존재하므로 상기 펜탄올은 시료를 모세관으로 오게 하는 유기층의 역할을 하는 것으로 분리를 위한 전기를 걸어주기 전에는 시료가 펜탄올 상을 벗어나 받게층까지 진입하는 것은 아니다. 즉, 펜탄올의 역할은 중성상태의 시료를 모으는 역할을 하는 것일 뿐이며 다른 것으로 대체가능함은 물론이다. 다음으로 분리를 위한 전기를 걸어 모세관 전기영동을 시행한다. 추출하고자 하는 시료가 EF 차이로 시료는 모세관 내의 받게층으로 추출되고, 펜탄올은 반대방향으로 배출된다. 도면상에서 모세관의 끝부분의 파란색이 펜탄올이고, 파란색위의 하늘색 부분이 받게층이며, 보라색 부분이 샘플용액이 되며 샘플용액 내의 HA가 추출 대상이다. 파란색 부분의 펜탄올은 단지 추출대상 시료를 모여 머물게 하는 것이므로, 여기에서 2-phase는 샘플용액과 모세관내의 받게층의 2 개상으로 되어 있음을 의미한다. 도면상의 제약으로 파란색부분을 짧게 표현하였으나, 실제 실험에서는 모세관 전체 부피의 1 내지 5% 정도까지 채워 테스트하였다. 이러한 형태의 경우 미세방울 형성없이도 추출가능하다. 한편, 펜탄올의 주입양에 따라 EF값이 변하는 정도를 시료에 따라 측정해 본 결과 영향을 받는 종류와 받지 않는 종류가 있었다.

도 2는 본 발명의 일 실시형태를 설명하기 위한 개념도로서 3-phase 방식을 보여준다. 본 방식도 마찬가지로 헤드스페이스 추출방식이 아니라 샘플용액에서 분석물을 직접적으로 추출하여 분석하는 방식으로 적용될 수 있다. 각 과정을 간단히 설명한다. 본 일 실시형태에서는 샘플용액과 모세관내의 받게층 사이에 또 하나의 얇은 유기층막이 존재하며 추출하고자 하는 대상이 이를 통과하는 형태이므로 3-phase 방식이 된다. 우선 모세관에 받게층을 주입한 후 모세관의 끝부분을 옥탄올에 담궈 압력을 조절하여 모세관의 끝부분에 옥탄올 막이 형성되게 한다. 도면에서는 모세관 끝부분에 빨간색으로 표현된 부분이다. 모세관을 샘플에 담궈 샘플내의 추출대상이 모세관 부분으로 모이게 하고 전기를 걸어 모세관 전기영동을 시행한다. 추출 대상인 HA가 옥탄올 막을 통과하여 모세관내의 받게층으로 이동한다. 통상 받게층은 런버퍼와 동일한 것을 사용한다.

도 3은 2-phase 방식을 사용하여 온도에 따른 EF를 알아본 것이다. 시료는 펜타클로로페놀(Pentachlorophenol;PCP), 3-브로모벤조익산(3- Bromobenzoic acid;3-BBA), 4-아이오도벤조익산(4-iodobenzoic acid; 4-IBA)을 사용하였다. 25 mM Tris:Ac in methanol (25:9.9, pH 8.0) 버퍼를 사용하였고, 샘플내 시료의 농도는 2 μM이며(in pH 3) 추출 시간은 30분이다. 펜탄올은 0.3 psi로 30초간 주입하여 약 5%를 주입하였고, 온도는 25, 30, 35℃로 시행하였다. 온도에 따라 EF는 전반적으로 증가하고 있으며, 3-BBA와 4-IBA는 대략적으로 30℃를 지나자 오히려 낮아지고 있다.

도 4는 2-phase 방식을 사용하되, 펜탄올의 주입량의 조절에 따른 EF를 살펴본 것이다. 도 3에서의 조건에서, 온도는 25℃로 조절하고, 펜탄올의 주입은 0.3 psi에서 각각 7초, 18초, 30초 주입하여 각각 약 1%, 3%, 5%를 주입하였다. 펜탄올로 인한 스태킹 효과가 자연적으로 일어나게 되는데 이에 대한 어느 정도의 펜탄올양이 이상적인지 실험하기 위한 것이었다. 펜탄올 양이 많을수록 EF값이 증가하는 것은 아니라는 것을 알 수 있다.

도 5는 2-phase 방식을 사용하되, 스터링(stirring)의 유무에 따른 EF를 살펴본 것이다. 도 3에서와 조건은 같게 하고, 스터링을 한 경우와 스터링을 하지 않은 경우를 살펴보았다. 전반적으로 스터링을 통해서 더 나은 추출 환경이 조성될 것이라고 기대할 수 있다.

도 6은 3-phase 방식에서도 추출이 잘 이루어지는지를 테스트해보기 위한 것으로 추출시간에 따른 EF값의 변화를 알아보았다. 버퍼는 20 mM 소디움 테트라 보레이트 (pH 9.2), 샘플시료는 pH 1.5의 2,7-다이클로로플루오러세인(DCF;2,7- dicholrofluorescein)과플루오러세인( fluorescein)을 사용하여 5분동안 시행한 것은 10 nM의 농도로 10분동안 시행한 것은 5nM의 농도의 것을 사용하였다. 낮은 농도임에도 불구하고 10분 동안의 추출시간에서 EF값이 높았다. 결과적으로 3-phase방식에서도 본 발명의 비방울 미세추출방법으로 추출이 잘 이루어지므로 본 방식을 사용하여 모세관 전기영동방법을 사용할 수 있다는 것을 보여준다.

본 발명은 미세방울의 형성을 하지 않고 충분한 효과를 얻을 수 있는 CE방법을 제공함으로써, 방울의 형성과정과 유지를 위한 노력이 소요되지 않고 간편하게 분석을 자동화할 수 있다. 또한, 2-phase, 3-phase를 비롯하여 억셉터와 도너의 여러가지 화학적인 차이를 이용하여 다양하게 비 방울 미세추출의 활용영역을 넓힐 수 있다.

도 1은 본 발명의 일 실시형태를 설명하기 위한 개념도이다.
도 2는 본 발명의 또 다른 일 실시형태를 설명하기 위한 개념도이다.
도 3은 2-phase에서 온도에 따른 EF를 나타내는 그래프이다.
도 4은 2-phase에서 펜탄올의 주입양에 따른 EF를 나타내는 그래프이다.
도 5은 2-phase에서 스터링 유무에 따른 EF를 나타내는 그래프이다.
도 6은 3-phase에서 추출시간에 따른 EF 변화를 나타내는 그래프이다.

이하 실시예를 통해 본 발명을 보다 상세히 알아본다.

<시료 준비>

10 mM의 펜타클로로페놀(Pentachlorophenol;PCP), 3-브로모벤조익산(3- Bromobenzoic acid;3-BBA), 4-아이오도벤조익산(4-iodobenzoic acid; 4-IBA) 스톡용액을 메탄올상 제조하여 사용하였다. 주게층은 1 mM HCl(pH 3.0)이다. 모세관은 30/40 cm, 50 ㎛ ID를 사용하여 2-phase상 실험을 하였고, 3-phase상 실험은 50/60 cm, 40 ㎛ ID를 사용하였다. 25 mM Tris:Ac in methanol (25:9.9, pH 8.0) 버퍼를 사용하여 2-phase 실험을 하였으며, 3-phase 에서는 20 mM 소디움 테트라 보레이트 (pH 9.2)버퍼를 사용하였다.

<CE;Capillary electrophoresis>

CE는 UV 디텍터를 갖춘 P/ACE MDQ CE system (Beckman, Fullerton, CA, USA)를 가지고 수행되었으며, 디텍션 파장은 214 nm로 세팅하였다. 베어 퓨즈드 실리카 모세관은 40 psi에서 각각 5분 동안 0.1 M NaOH로, 15분 동안 물로 세척하여 조절되었다. CE 장비의 샘플 트레이는 샘플 바이얼 온도를 조절하기 위하여 재킷된(jacketed) 비이커를 수용할 수 있도록 수정하였다. 각각의 가동전, 모세관은 0.1 M NaOH, 물 및 런버퍼로 40 psi에서 각각 5분간 선처리(pretreat)되었다. 전기영동(electrophoresis)를 위하여 +20 kV의 노말 포텐셜을 모세관에 적용하였고 214 nm에서 분석물의 흡광도(absorbance)를 모니터하였다.

<실시예 1 : 온도에 따른 EF>

시료는 펜타클로로페놀(Pentachlorophenol;PCP), 3-브로모벤조익산(3- Bromobenzoic acid;3-BBA), 4-아이오도벤조익산(4-iodobenzoic acid; 4-IBA)를 사용하여 샘플내 시료의 농도는 2 μM이며(in pH 3) 추출 시간은 30분이다. 펜탄올은 0.3 psi로 30초간 주입하여 약 5%를 주입하였고, 온도는 25, 30, 35℃로 시행하였다. 디텍션은 214 nm에서 하였다. 온도에 따라 EF는 전반적으로 증가하고 있으며, 3-BBA와 4-IBA는 대략적으로 30℃를 지나자 오히려 낮아지고 있다.

<실시예 2 : 펜탄올 주입량에 따른 EF>

시료는 펜타클로로페놀(Pentachlorophenol;PCP), 3-브로모벤조익산(3- Bromobenzoic acid;3-BBA), 4-아이오도벤조익산(4-iodobenzoic acid; 4-IBA)를 사용하여 샘플내 시료의 농도는 2 μM이며(in pH 3) 추출 시간은 30분이다. 온도는 25℃로 조절하고, 펜탄올의 주입은 0.3 psi에서 각각 7초, 18초, 30초 주입하여 각각 약 1%, 3%, 5%를 주입하였다. 디텍션은 214 nm에서 하였다. 펜탄올로 인한 스태킹 효과가 자연적으로 일어나게 되는데 이에 대한 어느 정도의 펜탄올양이 이상적인지 실험하기 위한 것이었다. 펜탄올 양이 많을수록 EF값이 증가하는 것은 아니라는 것을 알 수 있다.

<실시예 3 : 스터링 유무에 따른 EF>

시료는 펜타클로로페놀(Pentachlorophenol;PCP), 3-브로모벤조익산(3- Bromobenzoic acid;3-BBA), 4-아이오도벤조익산(4-iodobenzoic acid; 4-IBA)를 사용하여 샘플내 시료의 농도는 2 μM이며(in pH 3) 추출 시간은 30분이다. 펜탄올은 0.3 psi로 30초간 주입하여 약 5%를 주입하였고, 온도는 25, 30, 35℃로 시행하였다. 디텍션은 214 nm에서 하였다. 스터링을 한 경우와 스터링을 하지 않은 경우를 살펴보았다. 전반적으로 스터링을 통해서 더 나은 추출 환경이 조성될 것이라고 기대할 수 있다.

<실시예 4 : 3-phase에서 추출 시간에 따른 EF값의ㅣ 변화>

버퍼는 20 mM 소디움 테트라 보레이트 (pH 9.2), 샘플시료는 pH 1.5의 2,7-다이클로로플루오러세인(DCF;2,7- dicholrofluorescein)과플루오러세인( fluorescein)을 사용하여 5분 동안 시행한 것은 10 nM의 농도로 10분동안 시행한 것은 5nM의 농도의 것을 사용하였다. 낮은 농도임에도 불구하고 10분 동안의 추출시간에서 EF값이 높았다. 결과적으로 3-phase방식에서도 본 발명의 비방울 미세추출방법으로 추출이 잘 이루어지므로 본 방식을 사용하여 모세관 전기영동방법을 사용할 수 있다는 것을 보여준다.

Claims

ⅰ) 모세관에 받게층을 주입하는 단계;
ⅱ) 모세관을 유기용매에 담궈 압력을 조절하여 유기용매를 모세관의 말단에 주입하는 단계;
ⅲ) 유기용매가 주입된 모세관을 샘플용액에 담궈 추출대상을 유기용매 부분에 모이게 하는 단계;
ⅳ) 모세관에 전기장을 걸어주어 모세관 전기영동을 수행하는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 모세관 전기영동 방법.
ⅴ
제 1항에 있어서,
상기 유기용매는 펜탄올인 것을 특징으로 하는 방법.
제 1항에 있어서, 상기 유기용매는 모세관 전체 부피의 1 내지 5 %를 주입하는 것을 특징으로 하는 방법.
ⅰ) 모세관에 받게층을 주입하는 단계;
ⅱ) 모세관을 유기용매에 담궈 압력을 조절하여 모세관의 말단에 유기용매 막을 형성하는 단계;
ⅲ) 유기용매 막이 형성된 모세관을 샘플용액에 담궈 추출대상을 유기용매 막 부분에 모이게 하는 단계;
ⅳ) 모세관에 전기장을 걸어주어 모세관 전기영동을 수행하는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 모세관 전기영동 방법.
제 4항에 있어서,
상기 유기용매는 옥탄올인 것을 특징으로 하는 방법.