JP4930886B2 - 糖鎖分析方法 - Google Patents
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Description
Structure analyses of oligosaccharides by tagging of the reducing end sugars with a fluorescent compound. Hase, S., Ikenaka, T., Matsushima, Y., Biochem. Biophys. Res. Commun., 85, 257-263 (1978). Two-dimensinal mapping of N-glycosidically linked asialo-oligosaccharides from glycoproteins as reductively pyridylaminated derivatives using dual separation modes of high-performance capillary electrophoresis. Suzuki. S., Kakehi. K., Honda. S., Anal. Biochem. 205, 227-236 (1992). Multi-dimensional mapping of pyridylaminated-labeled N-linked oligosaccharides by capillary electrophoresis. Zieske. LR., Fu. D., Khan. SH., O'Neill. RA. J. Chromatogr. A. 720, 395-407 (1996).
キャピラリー電気泳動において一般的に使用されている泳動液は無機バッファーである(例えば上記非特許文献2および3参照)。しかし、このような揮発性に乏しいバッファーを質量分析計(MS)へそのまま導入するとMSを汚染するため、CEにより分離した試料をMSへ導入するためには前処理が必要となる。そこで本発明者らは、泳動液として良好な揮発性を有する有機酸系バッファーを使用することとした。これにより、キャピラリー電気泳動装置によって分離した試料を直接MSに導入することが可能となる。しかし、本発明者らが更に検討を重ねた結果、有機酸系バッファーの使用によりCEにおける糖鎖の分離効率が低下し、これにより検出感度が著しく低下することが判明した。そこで本発明者らは有機酸系バッファーを使用したCEにおける分離効率低下を改善するために更に検討を重ねた結果、キャピラリー内に試料濃縮領域を電気的に形成した後に電気泳動を行うことにより、検出感度を顕著に改善できることを見出し、本発明を完成するに至った。
[1]二種以上の糖鎖を含む試料を泳動液を充填したキャピラリー内へ導入し、該キャピラリーに電界を印加することにより、上記二種以上の糖鎖を電気泳動により分離することを含む糖鎖分析方法であって、
前記キャピラリー内への試料導入を、前記キャピラリーの一端に泳動液とは異なる液体を保持したプラグ領域を形成し、該プラグ領域端面を、前記試料を含む試料溶液と接触させた状態で該キャピラリーに電界を印加することにより行うこと、および、
前記泳動液として、有機酸および/または有機酸塩を含む緩衝液を使用すること、
を含み、
前記分離は、二工程以上の分離工程からなり、第二工程以降の工程は、直前に行われた分離工程においてキャピラリー内に充填した泳動液とはpHの異なる泳動液をキャピラリー内に充填もしくは直前に行われた分離工程においてキャピラリー内に充填した泳動液のpHを変更し、および/または、直前に行われた分離工程とは逆向きの電界を印加して行われ、
第二工程以降の分離工程と直前に行われた分離工程との間に、泳動液を充填したキャピラリーの一端に泳動液とは異なる液体を保持したプラグ領域を形成し、該プラグ領域端面を、前記試料を含む試料溶液と接触させた状態で該キャピラリーに電界を印加することにより、キャピラリー内へ前記試料の少なくとも一部を導入することを更に含む、前記糖鎖分析方法。
[2]前記試料溶液は、キャピラリー内に充填した泳動液より伝導度の低い溶液である[1]に記載の糖鎖分析方法。
[3]前記糖鎖は、少なくとも1つの側鎖が塩基性置換基によって置換された中性糖鎖を含む[1]または[2]に記載の糖鎖分析方法。
[4]前記糖鎖は、前記中性糖鎖とともに酸性糖鎖を含む[3]に記載の糖鎖分析方法。
[5]前記塩基性置換基は、芳香族アミノ基である[3]または[4]に記載の糖鎖分析方法。
[6]前記芳香族アミノ基は2−アミノピリジニル基である[5]に記載の糖鎖分析方法。
[7]酸性糖鎖と、少なくとも1つの側鎖が塩基性置換基によって置換された中性糖鎖と、を含む試料をキャピラリー電気泳動により分離することを含む糖鎖分析方法であって、
(1)酸性糖鎖が負電荷を帯び得るpHを有する泳動液を充填したキャピラリーの一端に、前記泳動液とは異なる液体を保持したプラグ領域を形成し、該プラグ溶液端面を前記試料を含む試料溶液と接触させた状態で、該キャピラリーに、プラグ領域側が−、他方が+となるように電界を印加することにより、プラグ領域内に前記酸性糖鎖の少なくとも一部を導入した後、前記キャピラリーに、プラグ領域側が−、他方が+となるように電界を印加することにより酸性糖鎖を電気泳動させ、次いで、
キャピラリー内の泳動液のpHを、前記中性糖鎖が有する塩基性置換基が正電荷を帯び得るpHに変更した後、泳動液を充填したキャピラリーの一端に、前記泳動液とは異なる液体を保持したプラグ領域を形成し、該プラグ溶液端面を前記試料を含む試料溶液と接触させた状態で、該キャピラリーに、プラグ領域側が+、他方が−となるように電界を印加することにより、プラグ領域内に前記中性糖鎖の少なくとも一部を導入した後、前記キャピラリーに、プラグ領域側が+、他方が−となるように電界を印加することにより中性糖鎖を電気泳動させるか、または、
(2)前記中性糖鎖が有する塩基性置換基が正電荷を帯び得るpHを有する泳動液を充填したキャピラリーの一端に、前記泳動液とは異なる液体を保持したプラグ領域を形成し、該プラグ溶液端面を前記試料を含む試料溶液と接触させた状態で、該キャピラリーに、プラグ領域側が+、他方が−となるように電界を印加することにより、プラグ領域内に前記中性糖鎖の少なくとも一部を導入した後、前記キャピラリーに、プラグ領域側が+、他方が−となるように電界を印加することにより中性糖鎖を電気泳動させ、次いで、
キャピラリー内の泳動液のpHを、前記酸性糖鎖が負電荷を帯び得るpHに変更した後、泳動液を充填したキャピラリーの一端に、前記泳動液とは異なる液体を保持したプラグ領域を形成し、該プラグ溶液端面を前記試料を含む試料溶液と接触させた状態で、該キャピラリーに、プラグ領域側が−、他方が+となるように電界を印加することにより、プラグ領域内に前記酸性糖鎖の少なくとも一部を導入した後、前記キャピラリーに、プラグ領域側が−、他方が+となるように電界を印加することにより酸性糖鎖を電気泳動させること、
を特徴とする糖鎖分析方法。
[8]前記泳動液は、有機酸および/または有機酸塩を含む緩衝液である[7]に記載の糖鎖分析方法。
[9]前記緩衝液は、ギ酸および/またはギ酸塩を含む緩衝液である[1]〜[6]、[8]のいずれかに記載の糖鎖分析方法。
以下、本発明の糖鎖分析方法について、更に詳細に説明する。
一方、本発明における試料導入は、泳動液を充填したキャピラリーの一端にプラグ領域(濃縮ゾーン)を形成し、この領域に試料(溶質)を電気泳動させることにより導入する。この方法によれば、試料を溶液として導入する加圧導入法に比べて、多量の試料をキャピラリー内に導入することができる。前述のように本発明では泳動液として有機酸バッファーを使用するため、無機バッファーを使用する場合と比べて分離効率の点では不利であるにもかかわらず、上記方法により試料を導入することにより検出感度を顕著に改善することができる。
以下に、上記試料導入法について更に詳細に説明する。
酸性糖鎖と、少なくとも1つの側鎖が塩基性置換基によって置換された中性糖鎖と、を含む試料をキャピラリー電気泳動により分離することを含む糖鎖分析方法であって、
(1)酸性糖鎖が負電荷を帯び得るpHを有する泳動液を充填したキャピラリーの一端に、前記泳動液とは異なる液体を保持したプラグ領域を形成し、該プラグ溶液端面を前記試料を含む試料溶液と接触させた状態で、該キャピラリーに、プラグ領域側が−、他方が+となるように電界を印加することにより、プラグ領域内に前記酸性糖鎖の少なくとも一部を導入した後、前記キャピラリーに、プラグ領域側が−、他方が+となるように電界を印加することにより酸性糖鎖を電気泳動させ、次いで、
キャピラリー内の泳動液のpHを、前記中性糖鎖が有する塩基性置換基が正電荷を帯び得るpHに変更した後、泳動液を充填したキャピラリーの一端に、前記泳動液とは異なる液体を保持したプラグ領域を形成し、該プラグ溶液端面を前記試料を含む試料溶液と接触させた状態で、該キャピラリーに、プラグ領域側が+、他方が−となるように電界を印加することにより、プラグ領域内に前記中性糖鎖の少なくとも一部を導入した後、前記キャピラリーに、プラグ領域側が+、他方が−となるように電界を印加することにより中性糖鎖を電気泳動させるか、または、
(2)前記中性糖鎖が有する塩基性置換基が正電荷を帯び得るpHを有する泳動液を充填したキャピラリーの一端に、前記泳動液とは異なる液体を保持したプラグ領域を形成し、該プラグ溶液端面を前記試料を含む試料溶液と接触させた状態で、該キャピラリーに、プラグ領域側が+、他方が−となるように電界を印加することにより、プラグ領域内に前記中性糖鎖の少なくとも一部を導入した後、前記キャピラリーに、プラグ領域側が+、他方が−となるように電界を印加することにより中性糖鎖を電気泳動させ、次いで、
キャピラリー内の泳動液のpHを、前記酸性糖鎖が負電荷を帯び得るpHに変更した後、泳動液を充填したキャピラリーの一端に、前記泳動液とは異なる液体を保持したプラグ領域を形成し、該プラグ溶液端面を前記試料を含む試料溶液と接触させた状態で、該キャピラリーに、プラグ領域側が−、他方が+となるように電界を印加することにより、プラグ領域内に前記酸性糖鎖の少なくとも一部を導入した後、前記キャピラリーに、プラグ領域側が−、他方が+となるように電界を印加することにより酸性糖鎖を電気泳動させること、
を特徴とする糖鎖分析方法。
(1)分析対象試料
本分析で使用したPA化中性糖鎖構造は以下の四種類で、全てタカラバイオから購入した。
CDH-PA (Galβ1-4Glc-PA)、
CTH-PA (Galα1-4Galβ1-4Glc-PA)、
Globoside-PA (GalNAcβ1-3Galα1-4Galβ1-4Glc-PA)、
Forssman antigen-PA (GalNAcα1-3GalNAcβ1-3Galα1-4Galβ1-4Glc-PA)
CE-LIF分析は、P/ACE MDQ型キャピラリー電気泳動装置(Beckman Coulter)にHe-Cdレーザー励起蛍光検出器(Kimmon、Ex: 325 nm、Em: 405 nm)を直結したシステムに、フューズドシリカキャピラリー(30 μm i.d. x 100 cm、GLサイエンス)を装着して行った。まず、本システムのキャピラリーに100mMギ酸-100mMギ酸アンモニウム水溶液(1:1、v/v;pH3.6)の電解液(泳動液)を導入後、ミクロバイアル(PCRチューブ、PCR-02-NC、Axgen)に予め分注してあるアセトニトリル-水(7:3、v/v)にキャピラリーの一端を浸漬し、6.9x103Pa、30秒の条件下でアセトニトリル-水を加圧導入し、プラグを形成した。キャピラリー中の泳動液は約1000nl、プラグ容量は約10nlであった。
次に、上述のPA化中性糖鎖混合物(各50fmol、50 x 10-15モル)のアセトニトリル-水(7:3、V/V)溶液5μlをPCRチューブに分注後、プラグを形成した側のキャピラリー末端を浸漬し、10kVの電圧(プラグ側が+、他方が−)を90秒印加することで、予めキャピラリーに注入したアセトニトリル-水(7:3、v/v)プラグの中に試料を電気的に導入した。
次に、カラム温度を25℃、カラム印加電圧を30kV(プラグ側が+、他方が−)に設定して電気泳動を行った。キャピラリー電気泳動により分離された試料をLIFに付し蛍光を検出することでクロマトグラムを得た。得られたクロマトグラムを、上記(2)にて試料溶液を加圧導入し、上記(3)の試料導入を行わなかった点を除き同様の方法で得られたクロマトグラムとともに図1に示す。
(1)分析対象試料
本分析で使用したPA化酸性糖鎖構造は以下の九種類で、全てタカラバイオから購入した。
GM1-PA [Galβ1-3GalNAcβ1-4(NeuAcα2-3)Galβ1-4Glc-PA]
GM2-PA [GalNAcβ1-4(NeuAcα2-3)Galβ1-4Glc-PA]
GM3-PA [NeuAcα2-3Galβ1-4Glc-PA
GD1a-PA [NeuAcα2-3Galβ1-3GalNAcβ1-4(NeuAcα2-3)Galβ1-4Glc-PA]
GD1b-PA [Galβ1-3GalNAcβ1-4(NeuAcα2-8NeuAcα2-3)Galβ1-4Glc-PA]
GD2-PA [GalNAcβ1-4(NeuAcα2-8NeuAcα2-3)Galβ1-4Glc-PA]
GD3-PA [NeuAcα2-8NeuAcα2-3Galβ1-4Glc-PA]
GT1b-PA [NeuAcα2-3Galβ1-3GalNAcβ1-4(NeuAcα2-8NeuAcα2-3)Galβ1-4Glc-PA]
GQ1b-PA [NeuAcα2-8NeuAcα2-3Galβ1-3GalNAcβ1-4(NeuAcα2-8NeuAcα2-3)Galβ1-4Glc-PA]
CE-LIF分析は、P/ACE MDQ型キャピラリー電気泳動装置(Beckman Coulter)にHe-Cdレーザー励起蛍光検出器(Kimmon、Ex: 325 nm、Em: 405 nm)を直結したシステムに、フューズドシリカキャピラリー(30 μm i.d. x 100 cm、GLサイエンス)を装着して行った。まず、本システムのキャピラリーに100mMギ酸アンモニウム水溶液(pH6.5)の電解液を導入後、ミクロバイアル(PCRチューブ、PCR-02-NC、Axgen)に予め分注してあるアセトニトリル-水(9:1、v/v)にキャピラリーの一端を浸漬し、6.9x103Pa、30秒の条件下でアセトニトリル-水を加圧導入し、プラグを形成した。キャピラリー中の泳動液は約1000nl、プラグ容量は約10nlであった。
次に、上述のPA化酸性糖鎖混合物(各50fmol)のアセトニトリル-水(9:1、V/V)溶液5μlをPCRチューブに分注後、−10kV(プラグ側が−、他方が+)、90秒且つ1.4x104Paの条件下で、予めキャピラリーに形成したアセトニトリル-水(9:1、v/v)プラグの中に試料を電気的に導入した。
次に、カラム温度を25℃、カラム印加電圧を−30KV(プラグ側が−、他方が+)に設定して電気泳動を行った。キャピラリー電気泳動により分離された試料をLIFに付し蛍光を検出することでクロマトグラムを得た。得られたクロマトグラムを、上記(2)にて試料溶液を加圧導入し、上記(3)の試料導入を行わなかった点を除き同様の方法で得られたクロマトグラムとともに図2に示す。
四種類の中性糖脂質由来のPA化糖鎖混合物(各50 fmol)を電気的導入法および加圧法により導入して分析した結果を図1(a:電気的試料導入、b: 従来型加圧試料導入)に、九種類の酸性糖脂質由来のPA化糖鎖混合物(各50 fmol)を分析した結果を図2 (a:電気的試料導入、b: 加圧法)に示した。
2〜5糖から構成される中性糖脂質由来PA化糖鎖(CDH-PA、CTH-PA、Globoside-PA及びForssman antigen-PA)は、ピリジニウムイオン由来の正電荷に依存して糖鎖の重合度が小さいものから泳動され、加圧法の電気泳動図において9.5分、10.7分、12.1分及び13.2分に観察され、また、電気的導入法において8.2分、8.9分、9.7分および10.5分に観察された。電気的導入法を用いた際に観察される各糖鎖のピーク強度は、加圧法に比べ約250倍増大した。また、PA化中性糖鎖はそれぞれ良く分離しており、従って、本電気的試料導入によるCE-LIFは、泳動液として有機酸系バッファーを使用したにもかかわらず分離能を損なうことなく、高感度化が達成されていることを示している。
九種類の酸性糖脂質由来PA化糖鎖(GM1-PA、GM2-PA、GM3-PA、GD1b-PA、 GD1a-PA、 GD2-PA、 GD3-PA、GT1b-PAおよびGQ1b-PA)の混合物(各50 fmol)を分析した結果、加圧試料導入CE-LIFのクロマトグラムにおいて、シアル酸を1残基有するモノシアロ糖鎖(GM1-PA、 GM2-PA、およびGM3-PA)が21分付近に、2残基有するジシアロ糖鎖(GD1b-PA、GD1a-PA、GD2-PA及びGD3-PA)が24〜26分付近に、3残基有するGT1b-PAが28分、更にテトラシアロ糖鎖(GQ1b-PA)が34分に観察された。電気的試料導入CE-LIFのクロマトグラムでは、モノシアロ糖鎖が22〜23分付近に、ジシアロ糖鎖が26〜28分付近に、GT1b-PAが33分に、GQ1b-PAが39分に観察された。シアル酸残基数が同一で、且つ、糖鎖の重合度が異なるモノシアロ糖鎖(GM1-PA、GM2-PAおよびGM3-PA)およびジシアロ糖鎖(GD1-PA、GD2-PAおよびGD3-PA)は、重合度が大きい糖鎖から順に、GM1-PA、GM2-PA続いてGM3-PA、また、GD1-PA、GD2-PAおよびGD3-PAの順に泳動された。同一のシアル酸残基数と重合度を有するGD1a-PAとGD1b-PAは、分離がやや不完全なものの、明瞭に分離していることが確認された。電気的導入法を用いた際に観察される各糖鎖のピーク強度は、加圧法に比べ約150倍増大した。また、PA化酸性糖鎖はそれぞれ良く分離しており、従って、本電気的試料導入によるCE-LIFは、泳動液として有機酸系バッファーを使用したにもかかわらず分離能を損なうことなく、高感度化が達成されていることを示している。
なお、電気的導入CE-LIFと加圧導入CE-LIFで得られるクロマトグラム上の各ピークの時の泳動時間の差は、電気的導入法における濃縮・導入の際に糖鎖が泳動されているためであると考えられる。
本方法における検出限界は、5μlの試料溶液とした場合、PA化中性糖鎖で25amol(25アトモル、25 x 10-18モル)/ミクロバイアル、PA化酸性糖脂質で100amol(100アトモル、100 x 10-18モル)/ミクロバイアルである。従って、本CE-LIF法は、同一試料中に存在する中性糖鎖と酸性糖鎖を個別に超高感度測定することが可能であるとともに、揮発性緩衝液を使用しているため、質量分析計(MS)と直結したCE-MSシステムにも応用可能であると考えられる。
(1)分析対象試料
本分析で使用したPA化中性糖鎖構造は以下の四種類、PA化酸性糖鎖構造は以下の七種類であり、全てタカラバイオから購入した。
(中性糖鎖)
CDH-PA (Galβ1-4Glc-PA)、
CTH-PA (Galα1-4Galβ1-4Glc-PA)、
Globoside-PA (GalNAcβ1-3Galα1-4Galβ1-4Glc-PA)、
Forssman antigen-PA (GalNAcα1-3GalNAcβ1-3Galα1-4Galβ1-4Glc-PA)
(酸性糖鎖)
GM1-PA [Galβ1-3GalNAcβ1-4(NeuAcα2-3)Galβ1-4Glc-PA]
GM2-PA [GalNAcβ1-4(NeuAcα2-3)Galβ1-4Glc-PA]
GM3-PA [NeuAcα2-3Galβ1-4Glc-PA
GD1a-PA [NeuAcα2-3Galβ1-3GalNAcβ1-4(NeuAcα2-3)Galβ1-4Glc-PA]
GD1b-PA [Galβ1-3GalNAcβ1-4(NeuAcα2-8NeuAcα2-3)Galβ1-4Glc-PA]
GT1b-PA [NeuAcα2-3Galβ1-3GalNAcβ1-4(NeuAcα2-8NeuAcα2-3)Galβ1-4Glc-PA]
GQ1b-PA [NeuAcα2-8NeuAcα2-3Galβ1-3GalNAcβ1-4(NeuAcα2-8NeuAcα2-3)Galβ1-4Glc-PA]
CE-LIF分析は、P/ACE MDQ型キャピラリー電気泳動装置(Beckman Coulter)にHe-Cdレーザー励起蛍光検出器(Kimmon、Ex: 325 nm、Em: 405 nm)を直結したシステムに、フューズドシリカキャピラリー(30 μm i.d. x 100 cm、GLサイエンス)を装着して行った。まず、本システムのキャピラリーに100mMギ酸-100mMギ酸アンモニウム水溶液(1:1、v/v; pH3.6)の電解液を導入後、ミクロバイアル(PCRチューブ、PCR-02-NC、Axgen)に予め分注してあるアセトニトリル-水(7:3、v/v)にキャピラリーの一端を浸漬し、6.9x103Pa、30秒の条件下で加圧導入してプラグを形成した。キャピラリー中の泳動液は約1000nl、プラグ容量は約10nlであった。以上の条件でプラグを形成した後、後述の(3)および(4)に記載した手順に従ってPA化中性糖鎖のみの試料導入およびCE-LIF分析を行った。その後、PA化酸性糖鎖分析を行うために、PA化中性糖鎖分析に用いたキャピラリーと同じキャピラリーに、100mMギ酸アンモニウム水溶液(pH6.5)の電解液を導入後、ミクロバイアル(PCRチューブ、PCR-02-NC、Axgen)に予め分注してあるアセトニトリル-水(9:1、v/v)にキャピラリーの一端を浸漬し、6.9x103Pa、30秒の条件下で加圧導入してプラグを形成した。キャピラリー中の泳動液は約1000nl、プラグ容量は約10nlであった。以上の条件でプラグを形成した後、後述の(3)および(4)に記載した手順に従ってPA化中性糖鎖のみの試料導入およびCE-LIF分析を行った。
上記(2)でプラグを形成した後、5lのアセトニトリル-水(7:3、v/v)に溶解したPA化中性糖鎖およびPA化酸性糖鎖混合物(各50fmol、50x10-15モル)溶液にキャピラリーの一端を浸漬し、10kVの電圧(プラグ側が+、他方が-)を90秒印加することで、PA化中性糖鎖のみを選択的に導入した。酸性糖鎖の選択的導入は、PA化中性糖鎖分析終了後、PA化中性糖鎖で用いたキャピラリーと同じキャピラリーに100mMギ酸アンモニウム水溶液(pH6.5)の電解液を導入し、プラグをアセトニトリル-水(9:1、v/v)に変換し、試料溶液を一旦乾燥させ、アセトニトリル-水(9:1、v/v)に再溶解した後、-10kVの電圧(プラグ側が-、他方が+)を90秒印加することで行った。
図3(A)には、PA化中性糖鎖とPA化酸性糖鎖が共存する混合物を従来の加圧試料導入法で分析を行った結果を示した。
図3(B)には、PA化中性糖鎖とPA化酸性糖鎖が共存する混合物を、まず、前述の(2)および(3)に記載した手順でPA化中性糖鎖のみの電気的試料導入後、30kVの電圧(プラグ側が+、他方が-)を加えて泳動を行って分析を行った。次に同一チューブ内のPA化酸性糖鎖のみの電気的試料導入を (2)および(3)で記載した方法で行った後、30kVの電圧(プラグ側が-、他方が+)を加えて泳動を行って分析を行った結果を図3(C)に示した。
図3に示すように、本分析により同一試料に含まれる中性糖鎖と酸性糖鎖をそれぞれ選択的に分離することができた。特に、電気的に試料を導入した図3(B)、(C)のクロマトグラムでは高強度の蛍光を得ることができた。ほとんどの生体試料には中性糖鎖と酸性糖鎖が混在しているため、中性糖鎖と酸性糖鎖を選択的に分離分析できることは生体試料分析においてきわめて大きな意義がある。
Claims (9)
- 二種以上の糖鎖を含む試料を泳動液を充填したキャピラリー内へ導入し、該キャピラリーに電界を印加することにより、上記二種以上の糖鎖を電気泳動により分離することを含む糖鎖分析方法であって、
前記キャピラリー内への試料導入を、前記キャピラリーの一端に泳動液とは異なる液体を保持したプラグ領域を形成し、該プラグ領域端面を、前記試料を含む試料溶液と接触させた状態で該キャピラリーに電界を印加することにより行うこと、および、
前記泳動液として、有機酸および/または有機酸塩を含む緩衝液を使用すること、
を含み、
前記分離は、二工程以上の分離工程からなり、第二工程以降の工程は、直前に行われた分離工程においてキャピラリー内に充填した泳動液とはpHの異なる泳動液をキャピラリー内に充填もしくは直前に行われた分離工程においてキャピラリー内に充填した泳動液のpHを変更し、および/または、直前に行われた分離工程とは逆向きの電界を印加して行われ、
第二工程以降の分離工程と直前に行われた分離工程との間に、泳動液を充填したキャピラリーの一端に泳動液とは異なる液体を保持したプラグ領域を形成し、該プラグ領域端面を、前記試料を含む試料溶液と接触させた状態で該キャピラリーに電界を印加することにより、キャピラリー内へ前記試料の少なくとも一部を導入することを更に含む、前記糖鎖分析方法。 - 前記試料溶液は、キャピラリー内に充填した泳動液より伝導度の低い溶液である請求項1に記載の糖鎖分析方法。
- 前記糖鎖は、少なくとも1つの側鎖が塩基性置換基によって置換された中性糖鎖を含む請求項1または2に記載の糖鎖分析方法。
- 前記糖鎖は、前記中性糖鎖とともに酸性糖鎖を含む請求項3に記載の糖鎖分析方法。
- 前記塩基性置換基は、芳香族アミノ基である請求項3または4に記載の糖鎖分析方法。
- 前記芳香族アミノ基は2−アミノピリジニル基である請求項5に記載の糖鎖分析方法。
- 酸性糖鎖と、少なくとも1つの側鎖が塩基性置換基によって置換された中性糖鎖と、を含む試料をキャピラリー電気泳動により分離することを含む糖鎖分析方法であって、
(1)酸性糖鎖が負電荷を帯び得るpHを有する泳動液を充填したキャピラリーの一端に、前記泳動液とは異なる液体を保持したプラグ領域を形成し、該プラグ溶液端面を前記試料を含む試料溶液と接触させた状態で、該キャピラリーに、プラグ領域側が−、他方が+となるように電界を印加することにより、プラグ領域内に前記酸性糖鎖の少なくとも一部を導入した後、前記キャピラリーに、プラグ領域側が−、他方が+となるように電界を印加することにより酸性糖鎖を電気泳動させ、次いで、
キャピラリー内の泳動液のpHを、前記中性糖鎖が有する塩基性置換基が正電荷を帯び得るpHに変更した後、泳動液を充填したキャピラリーの一端に、前記泳動液とは異なる液体を保持したプラグ領域を形成し、該プラグ溶液端面を前記試料を含む試料溶液と接触させた状態で、該キャピラリーに、プラグ領域側が+、他方が−となるように電界を印加することにより、プラグ領域内に前記中性糖鎖の少なくとも一部を導入した後、前記キャピラリーに、プラグ領域側が+、他方が−となるように電界を印加することにより中性糖鎖を電気泳動させるか、または、
(2)前記中性糖鎖が有する塩基性置換基が正電荷を帯び得るpHを有する泳動液を充填したキャピラリーの一端に、前記泳動液とは異なる液体を保持したプラグ領域を形成し、該プラグ溶液端面を前記試料を含む試料溶液と接触させた状態で、該キャピラリーに、プラグ領域側が+、他方が−となるように電界を印加することにより、プラグ領域内に前記中性糖鎖の少なくとも一部を導入した後、前記キャピラリーに、プラグ領域側が+、他方が−となるように電界を印加することにより中性糖鎖を電気泳動させ、次いで、
キャピラリー内の泳動液のpHを、前記酸性糖鎖が負電荷を帯び得るpHに変更した後、泳動液を充填したキャピラリーの一端に、前記泳動液とは異なる液体を保持したプラグ領域を形成し、該プラグ溶液端面を前記試料を含む試料溶液と接触させた状態で、該キャピラリーに、プラグ領域側が−、他方が+となるように電界を印加することにより、プラグ領域内に前記酸性糖鎖の少なくとも一部を導入した後、前記キャピラリーに、プラグ領域側が−、他方が+となるように電界を印加することにより酸性糖鎖を電気泳動させること、
を特徴とする糖鎖分析方法。 - 前記泳動液は、有機酸および/または有機酸塩を含む緩衝液である請求項7に記載の糖鎖分析方法。
- 前記緩衝液は、ギ酸および/またはギ酸塩を含む緩衝液である請求項1〜6、8のいずれか1項に記載の糖鎖分析方法。
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