KR101023915B1 - 모세관 전기영동에서 큰 부피 단일 방울 미세추출방법과스위핑 방법을 결합한 시료의 이중 농축 방법과 큰 부피단일 방울 미세 추출을 위한 모세관 - Google Patents

모세관 전기영동에서 큰 부피 단일 방울 미세추출방법과스위핑 방법을 결합한 시료의 이중 농축 방법과 큰 부피단일 방울 미세 추출을 위한 모세관 Download PDF

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Abstract

본 발명은 모세관 전기영동에서 큰 부피 단일 방울 미세추출방법과 스위핑 방법을 결합한 시료의 이중 농축 방법과 큰 부피 단일 방울 미세 추출을 위한 모세관에 관한 것이다. 보다 상세하게는 모세관 전기영동에서 모세관의 말단에 미세방울을 형성하여 액체상 미세추출을 함에 있어 미세 방울을 안정적으로 형성함과 아룰러 큰 부피로 형성할 수 있는 방법과 이를 스위핑 방법과 결합하여 적은 양의 시료나 극히 낮은 농도의 시료를 선 농축하여 이의 분석시 그 감도를 매우 증진시키는 기술에 관한 것이다.
모세관 전기영동, 단일 방울 미세추출, 스태킹, 감도

Description

모세관 전기영동에서 큰 부피 단일 방울 미세추출방법과 스위핑 방법을 결합한 시료의 이중 농축 방법과 큰 부피 단일 방울 미세 추출을 위한 모세관{Dual stacking method combining large volume single drop microextraction and sweeping and the capillary for large volume single drop microextraction}
본 발명은 모세관 전기영동에서 큰 부피 단일 방울 미세추출방법과 스위핑 방법을 결합한 시료의 이중 농축 방법과 큰 부피 단일 방울 미세 추출을 위한 모세관에 관한 것이다. 보다 상세하게는 모세관 전기영동에서 모세관의 말단에 미세방울을 형성하여 액체상 미세추출을 함에 있어 미세 방울을 안정적으로 형성함과 아룰러 큰 부피로 형성할 수 있는 방법과 이를 스위핑 방법과 결합하여 적은 양의 시료나 극히 낮은 농도의 시료를 선 농축하여 이의 분석시 그 감도를 매우 증진시키는 기술에 관한 것이다.
모세관 전기영동(capilliary electrophoresis;CE)은 다양한 분야에서 유용하게 사용될 수 있는 분리 방법이지만 흡광 검출에서 감도가 낮아 미량 분석에 어려움이 있다. 모세관 전기영동 방법은 고효율과 높은 분리도를 갖는 분리 방법으로 매우 뛰어난 것이지만 CE에서 적은 양의 시료 사용으로 인해 감도가 떨어지는 단점 이 있는데, 이를 극복하는 방법이 필요하다. 특히 단백질이나 대사체 분석에 있어 저농도 시료의 정성분석을 위한 감도 개선 방법들은 더욱 요구되고 있다. 컬럼상 농축의 장점은 컬럼의 어떠한 기계적 변형 없이도 가능하며, 완충액과 시료 시스템에 거의 별다른 조작이 없이도 농축 절차가 상당히 단순하다는 점이다. 그러나, 상기 방법은 완충액과 시료 용액에 대한 특이적 필수조건을 만족시키는 경우에만 적용된다는 단점이 있다. 이러한 방법에 대한 대안 기술로 CE와 연결된 시료의 선농축(preconcentration)방법이 이용될 수 있다. 그 결과, 액체-액체 추출(liquid-liquid extraction; LLE)이 CE(Pedersen-Bjergaard, S. et. al., J. Chromatogr., A 2000, 902, 91-105)에 적용되었다. LLE 보다 더 높은 농축 효과를 달성하면서도 보다 적은 용매를 소비하는 다양한 액체상 미세추출방법이 CE에 적용되어 오고 있으나 실험 조작이 매우 복잡하고 기억효과(memory effect)를 나타내며, 더구나 민감성 향상이 불충분한 문제가 있다. 따라서 시료를 농축하여 감도를 높이는 문제는 매우 중요한 문제가 되었다.
단일 방울 미세추출(Single drop microextraction;SDME)방법은 모세관 전기영동에 있어 샘플의 선농축(preconcentration) 방법으로서 사용될 수 있다. 샘플을 처리하는 순서들을 간단히 프로그램밍함으로써, 유기 상(organic phase)의 얇은 층으로 코팅된 수용성 받게 상(aqueous acceptor phase)의 단일 방울은 모세관의 끝에 형성시킬 수 있다. 분석물은 수용성 받게 상과 수용성 주게 상(aqueous donor phase)의 pH 차이에 의해 선농축될 수 있다. 그런데, 모세관 전기영동에 있어 유기 용매로 코팅된 미세방울을 만들어서 시료를 농축하는 방법은 검출감도를 높일 수 있을 것으로 예상되지만 미세방울이 유기 용매를 통과해서 새는 문제가 있다. 또한 추출 시간이 길어지거나 격렬한 교반이 가해졌을 때 미세방울의 안정성이 떨어지는 문제가 있다.
한편, 미세방울을 보다 안정적이면서 크게 형성할 수 있다면, 농축효율이 더욱 높아질 수 있을 것이다. 많은 양의 시료 주입이 필요한 실험에 있어 더 큰 방울을 만들 수 있다면 CE의 적용범위를 더욱 넓힐 수 있을 것이며, 다른 농축방법과도 연계하기가 보다 용이할 것이다.
본 발명에서는 모세관 전기영동에 있어 시료를 농축하여 감도를 향상시킬 수 있는 수단을 제공하는 것을 목적으로 한다. 모세관에 미세방울을 만들어 시료를 농축함에 있어 미세방울의 형성이 용이하지 않거나 형성된 미세방울의 안정성이 떨어지는 문제점이 우선적으로 해결해야 할 과제이다. 또한 큰 부피를 갖는 단일 방울 미세추출(Large volume SDME)이 가능하다면 단일방울 미세추출법의 적용범위를 넓힐 수 있으며, 이를 토대로 스위핑(sweeping) 방법과 결합하여 이중 농축방법을 제공하고자 한다.
이를 위한 본 발명은 모세관 전기영동에서 시료의 선농축(preconcentration)을 위하여 모세관의 말단에 단일 방울을 형성하여 단일 방울 미세추출을 시행하는 방법에 있어서, 단일 방울을 안정하게 형성될 수 있도록 모세관의 말단에 소수성의 튜브를 끼우는 것을 특징으로 하며 상기 튜브는 폴리테트라플루오로에틸렌(polytetrafluoroethylene;PTFE), 퍼플루오로알콕시 폴리머 레진(perfluoroalkoxy polymer resin; PFA), 플루오린네이티드 에틸렌-프로필렌(fluorinated ethylene-propylene; FEP) 등의 테플론 튜브 및 폴리에테르에테르케톤(polyetheretherketones; PEEK) 튜브로 이루어진 군에서 선택되는 것이 바람직하다.
그리고, 본 발명은 모세관 전기영동에서 시료의 선농축(preconcentration)을 위한 방법에 있어서, 단일 방울 미세추출방법에 의해 농축된 시료를 다시 스위핑 방법(단일 방울 미세추출-스위핑 방법;SDME-sweeping method)을 사용하여 재농축하는 과정을 거치는 것을 특징으로 하는 시료의 선농축 방법이며, 상기 스위핑 방법은, 단일 방울 미세추출 후에 분석물들이 스위핑 효과를 갖는 미셀 전기역학적 크로마토크래피(micellar electrokinetic chromatography;MEKC)방법에 의해 유사 고정상(pseudostationary phase;micelles)에 채집되고 축적되는 것이 바람직하다. 이는 모세관 전기영동 장치의 모세관 말단에 단일 방울을 형성하는 단계; 상기 단일방울에 시료를 농축하는 단계; 단일 방울에 농축된 시료를 모세관 내로 주입하는 단계; 모세관 내에 주입된 시료를 스위핑하는 단계;를 포함하여 이루어지는 모세관 전기영동에서의 시료의 선농축(preconcentration) 방법이며, 상기 모세관 말단의 단일 방울은 상기한 튜브 군에서 선택하여 상기 모세관의 말단에 끼워서, 단일 방울을 안정하게 형성하는 단계를 더 포함하는 것이 바람직하다.
본 발명은 모세관 전기영동에서 모세관의 말단에 미세방울을 형성하여 액체상 미세추출을 함에 있어 미세 방울을 안정적으로 형성하고, 아울러 큰 부피로 형성할 수 있는 간단한 수단을 제공한다. 또한, 큰 부피를 갖는 단일 방울 미세추출(Large volume SDME)이 가능하다면 단일방울 미세추출법의 적용범위를 넓힐 수 있으며, 스위핑이나 장-증폭 샘플 스태킹(field-amplified sample stacking;FASS)과 같은 방법과 결합하여 실시하는 것을 보다 용이하게 한다. 이는 적은 양의 시료 나 극히 낮은 농도의 시료의 분석시 그 감도를 매우 증진시키는 장점이 있다.
이하에서는 본 발명을 보다 상세히 설명하며, 발명의 요지를 모호하지 않게 하기 위하여 당업자에 자명한 사실은 간략히 언급하거나 생략한다.
우선 단일 방울 미세추출(Single drop microextraction;SDME)에 관하여 간단히 설명한다. 우선 단일 방울을 형성방법을 설명한다. 모세관의 양쪽 끝에 가하는 압력의 차이를 이용해서 모세관에 수 나노 리터 수준의 유기용매를 주입하고 반대 쪽에 압력을 가해서 주입한 유기용매와 모세관에 있는 수용액 일부를 모세관 밖으로 분출시켜 끝 부분에 유기용매로 코팅된 수용성 받게 상(aqueous acceptor phase)을 가지는 방울을 만들게 된다. 이 방울의 수용성 받게 상(aqueous acceptor phase)으로 분석물을 추출하여 농축하고 이를 모세관 내로 주입하여 분석과정을 거친다. 이러한 과정을 도 1에 설명하였다.
도 2는 추출원리를 설명하기 위한 도면이다. 유기 상(organic phase)의 얇은 층으로 코팅된 수용성 받게 상(aqueous acceptor phase)의 단일 방울은 모세관의 끝에 형성시킬 수 있다. 분석물(analyte)은 수용성 받게 상과 수용성 주게 상(aqueous donor phase)의 pH 차이에 의해 방울 내로 농축된다. 이러한 방법에 의하여 제조된 미세방울은 종래의 추출법 중에서 가장 큰 수용액의 부피비를 얻게 되므로 추출효율이 매우 크다. 또한 유기층으로 분배되는 과정을 거쳐서 시료가 이동 하기 때문에 유기층으로 녹아들지 않는 무기염류는 수용성 받게 상으로 이동하지 않기 때문에 모세관 전기영동에 방해되는 무기염류를 제거하는 역할도 수행할 수 있다. 문제는 단일 방울의 형성이 용이하지 않거나 안정적이지 않다는 것이며, 또 다른 문제는 보다 많은 양의 주입이 필요한 실험의 경우 방울의 크기가 크지 않다는 것이다.
도 3은 단일 방울 미세추출(Single drop microextraction;SDME)을 위한 방울 형성을 보다 안정적으로 그리고 크게 할 수 있도록 구성한 것을 보여준다. 모세관 표면은 유기 용매와 상호 작용이 약하고 미세 방울은 물리적 지지체가 없으므로 모세관에 매달려 있을 때 매우 불안정해지고 교반이나 휘젓음 등의 과정을 적용하기가 힘들다. 본 발명은 모세관의 끝에 테플론 튜브(teflon tube)를 끼워 이러한 문제를 간단히 해결한다. 테플론 튜브와 유기용매(예컨대 옥탄올)의 친화력 때문에 지지가 확실히 되어 방울이 안정화되며, 튜브 두께가 모세관보다 굵기 때문에 더 큰 방울을 만들 수 있는 것이다. 이러한 큰 방울은 많은 양의 주입이 필요한 실험에 매우 적합하며, SDME 방법의 적용범위를 넓히는 토대를 제공한다. 도면의 왼쪽 그림과 오른쪽 그림의 모세관의 크기는 같다. 다만 오른쪽 그림에서는 모세관에 테플론 튜브를 끼운 것이다. 그러나 결과적으로는 오른쪽 사진의 단일방울의 크기가 상당히 크며, 테플론튜브에 의해 지지되어 안정적으로 형성되어 있음을 확인할 수 있다. 상기 테플론 튜브에 국한되지 않고, PEEK 튜브 등의 소수성 튜브들도 사용될 수 있다.
본 발명에 의해 보다 안정적이고 큰 단일 방울을 형성하여 추출한 경우 농축 효율이 매우 높다. 본 발명은 여기에서 그치지 않고 이를 스위핑(sweeping)방법과 결합하여 보다 효과적인 샘플의 이중 농축방법을 제공한다. 이를 단일 방울 미세추출-스위핑 방법(SDME-sweeping method)이라 칭하겠다. 스위핑 모드를 위한 큰 부피의 샘플 주입을 하기 위한 단일 방울 미세추출에 있어 방울의 부피를 증가시키기 위하여 튜브가 덧붙여진다. 상기 튜브는 PTFE ,PFA, FEP 등의 테플론 튜브, PEEK 튜브 등을 사용할 수 있다. 상기 단일 방울 미세추출-스위핑 방법(SDME-sweeping method)을 도식화한 그림을 도 4에 나타내었다. 큰 부피의 단일 방울에 선농축된 시료를 모세관을 통해 보내주는데, 이를 스태킹 존에서 다시 한번 농축하는 과정을 거치게 하는 것이다.
스위핑 과정을 보다 상세하게 도 5에 나타내었다. 큰 부피 단일 방울로 추출하여 농축한 샘플을 모세관내로 주입시킨다(a). 단일 방울 미세추출 후에, 샘플들은 스위핑 효과를 갖는 미셀 전기역학적 크로마토크래피(micellar electrokinetic chromatography;MEKC)에 의해 각각 분리된다. 미셀 전기역학적 크로마토그래피에서의 스위핑은 전압을 걸어둔 상태에서 샘플 지역으로 관통하는 유사 고정상(pseudostationary phase;micelles)에 의해 분석물들이 채집되고 축적되는 것으로 정의될 수 있다. 버퍼에 미셀구조의 양이온들이 있고, 샘플에 분석물이 음이온을 있을 때, (b)와 같이 전압을 걸어주면 미셀구조의 양이온들이 임시적으로 고정 상과 같은 형태를 만들어 분석물들이 그 앞쪽으로 쌓이게 된다. 그리고 이렇게 농축된 분석물들을 디텍트하는 것이다. 샘플의 종류에 따라서 적절한 버퍼를 선택하고, EOF의 크기를 조절하는 등 프로그래밍을 조절하여 실시할 수 있을 것이며 이러한 부분은 당업자에게 있어 용이하게 파악될 수 있는 부분으로 자세한 설명은 생략한다.
적은 양의 시료나 극히 미세농도의 샘플들을 사용하더라도, 이러한 이중 농축 방법을 사용하는 경우에는 그 감도가 매우 뛰어나게 된다. 이는 안정적으로 그리고 충분히 큰 단일 방울 미세추출이 선행되어야 한다. 큰 단일 방울 미세추출과 스위핑 방법이 결합하면 보통의 모세관 존 전기영동 모드와 비교하여 10,000배 정도의 감도 개선 효과가 있다.
이하 플루오레세인을 농축하기 위하여 SDME와 스위핑을 결합하여 농축한 실시예를 통해 본 발명을 설명한다.
단일 방울의 비교와 단일 방울 미세추출( SDME )
50 ㎛ 내경의 60 ㎝ 용융 실리카 모세관(Polymicro Technologies, Phoenix, AZ)에 내경 0.3 mm, 1 mm 외경 테플론 튜브를 끼우고 완충용액으로 채웠다. 그리고 나서, 상기 모세관의 주입부를 1-옥탄올(시그마, St. Louis, MO)에 넣고, 출구부는 완충용액 용기에 넣었다. 주입부 말단을 3 분 동안 9 ㎝ 상승시켜 옥탄올을 모세관내로 주입시켰다. 상기 모세관을 수용성 시료용액(주게상)을 포함하는 큐벳으로 옮 겼다. 상기 큐벳을 4 분 동안 9 ㎝를 낮추어서 모세관 말단에서 옥탄올로 뒤덥힌 완충용액(받게상)의 방울을 형성시켰다. 이때, 완충용액은 20 mM 소듐 포스페이트(시그마, St. Louis, MO)를 0.1 M HCl로 pH를 조정하여 pH 9.0으로 제조하였다. 플루오레스세인(fluorescein)(시그마, St. Louis, MO)의 1.5 ㎖의 수용성 시료 용액(주게상)은 완충액의 표준 용액 10 ㎕에 0.10 M HCl(약 pH 1)의 1490 ㎕를 첨가하여 제조하였다.
테플론 튜브를 사용한 것과 그렇지 않은 경우 그 결과의 차이는 확연하였다. 이 결과를 도 3에 나타내었다.
SDME - 스위핑을 통한 농축
양이온 미셀인 20 mM dodecyltrimethylammonium bromide (DTAB), 15% 아세토니트릴이 포함된 10 mM 포스페이트 완충용액으로 모세관을 채운 후 DTAB가 포함되지 않은 20 mM 포스페이트 완충용액을 모세관에 9 cm 차이로 3 분 동안 주입한다. 그리고 옥탄올을 9 cm 높이차로 3 분 동안 주입한 후 모세관의 주입부를 시료 용액에 담그고 이 용액을 말단부보다 4 분 동안 9 cm 낮게 해서 미세방울을 만들었다. 시료 용액과 말단부의 완충용액의 높이를 맞춘 후 10분 동안 시료를 추출하고 10 cm 높이 차로 2 분 동안 미세방울의 수용액을 모세관에 주입하였다. 모세관 주입부를 DTAB가 포함된 포스페이트 완충용액에 넣고 10 kV를 가하여 스위핑을 하였다.
비교예
동일한 샘플을 가지고, 보통의 모세관 존 전기영동(capillary zone electrophoresis)을 한 경우, 단일 방울 미세추출(SDME)을 사용한 경우, 본 발명에서와 같이 테플론 튜브를 사용하여 큰 부피를 형성한 단일 방울 미세추출(Large Volume SDME)을 한 경우, 단순히 스위핑(Sweeping)한 경우, 본 발명의 테플론 튜브를 사용하여 단일 방울 미세추출을 하고 스위핑도 하는 이중 농축 방법(SDME-Sweeping)을 사용한 경우에 대하여 농축 방법만을 달리하여 상기 실시예와 같은 조건으로 실험하였다. 그 결과를 도 6에 나타내었다.
일반적인 모세관 전기영동 (CZE)에 비해서 테플론 튜브를 사용하지 않은 미세방울 추출할 때 100배 정도의 감도 향상이 있었다. 그런데 테플론 튜브를 사용하여 미세방울을 크게 하고 주입량을 늘이면 검출량은 늘어나지만 감도는 증가하지 않는 것을 도 6의 large volume SDME에서 볼 수 있다. 이를 해결하기 위해서 스위핑을 대용량의 시료에 적용하면 농축이 되는 것을 도 6의 sweeping에서 확인할 수 있었다. 두 방법을 결합한 도 6의 SDME-Sweeping에서는 큰 감도 향상이 가능하였다.
보통의 모세관 존 전기영동(capillary zone electrophoresis)과 대비하여 볼 때, 본 발명에서와 같이 테프론 튜브를 사용하여 큰 부피를 형성한 단일 방울 미세추출(Large Volume SDME)을 한 경우 약 110배의 감도 향상이 있었으며, 본 발명과 같이 큰 방울을 형성하여 단일 방울 미세추출-스위핑 방법(SDME-sweeping method)을 사용한 경우 감도 향상이 약 10,000배에 이르렀다.
상기한 본 발명의 실시형태에 의해 본 발명이 한정되는 것이 아니라 당업자의 입장에서 본 발명의 기술적 사상을 벗어나지 않는 범위 내에서 다양한 변화가 부가 및 변경이 가능함은 물론 균등한 타 실시예가 가능할 것이며, 이는 본 발명의 기술적 사상내의 것이다.
도 1은 단일 방울의 형성과정과 시료의 추출 및 주입 과정을 도식화한 도면이다.
도 2는 SDME의 원리를 설명하기 위한 도면이다.
도 3은 본 발명의 일실시예에 따라 테플론 튜브를 모세관의 끝에 끼워서 단일 방울을 형성한 것의 효과를 보여주는 도면이다.
도 4는 상기 단일 방울 미세추출-스위핑 방법(SDME-sweeping method)을 도식화한 그림을 나타내었다.
도 5는 스위핑 과정을 보다 상세하게 도식화한 것이다.
도 6은 본 발명의 농축효과에 따른 향상된 분석 감도의 결과를 보여주고 있다.

Claims (8)

  1. 모세관 전기영동에서 시료의 선농축(preconcentration)을 위하여 모세관의 말단에 단일 방울을 형성하여 단일 방울 미세추출을 시행하는 방법에 있어서, 단일 방울을 안정하게 형성될 수 있도록 모세관의 말단에 소수성의 튜브를 끼우는 것을 특징으로 하는 방법.
  2. 제 1항에 있어서,
    상기 튜브는 폴리테트라플루오로에틸렌(polytetrafluoroethylene; PTFE), 퍼플루오로알콕시 폴리머 레진(perfluoroalkoxy polymer resin; PFA), 플루오린네이티드 에틸렌-프로필렌(fluorinated ethylene-propylene; FEP) 및 폴리에테르에테르케톤(polyetheretherketones; PEEK)재질의 튜브로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 모세관 전기영동에서 시료의 선농축(preconcentration)을 위하여 모세관의 말단에 단일 방울을 형성하여 단일 방울 미세추출을 시행하기 위한 모세관에 있어서, 폴리테트라플루오로에틸렌(polytetrafluoroethylene; PTFE), 퍼플루오로알콕시 폴리머 레진(perfluoroalkoxy polymer resin; PFA), 플루오린네이티드 에틸렌-프로필렌(fluorinated ethylene-propylene; FEP) 및 폴리에테르에테르케톤(polyetheretherketones; PEEK)재질의 튜브로 이루어진 군에서 하나 선택하여 상 기 모세관의 말단에 끼워지는 형태를 갖는 모세관.
  4. 모세관 전기영동에서 시료의 선농축(preconcentration)을 위한 방법에 있어서, 단일 방울 미세추출방법에 의해 농축된 시료를 다시 스위핑 방법(단일 방울 미세추출-스위핑 방법;SDME-sweeping method)을 사용하여 재농축하는 과정을 거치는 것을 특징으로 하는 시료의 선농축 방법.
  5. 제 4항에 있어서, 상기 단일 방울 미세추출 방법은 폴리테트라플루오로에틸렌(polytetrafluoroethylene; PTFE), 퍼플루오로알콕시 폴리머 레진(perfluoroalkoxy polymer resin; PFA), 플루오린네이티드 에틸렌-프로필렌(fluorinated ethylene-propylene; FEP) 및 폴리에테르에테르케톤(polyetheretherketones; PEEK)재질의 튜브로 이루어진 군에서 하나 선택하여 상기 모세관의 말단에 끼워 큰 부피 단일 방울을 형성하여 실시하는 것을 특징으로 하는 시료의 선농축 방법.
  6. 제 4항 또는 제 5항의 어느 한 항에 있어서,
    상기 스위핑 방법은, 단일 방울 미세추출 후에 분석물들이 스위핑 효과를 갖는 미셀 전기역학적 크로마토크래피(micellar electrokinetic chromatography;MEKC)방법에 의해 유사 고정상(pseudostationary phase;micelles)에 채집되고 축적되는 것을 특징으로 하는 시료의 선농축 방법.
  7. 모세관 전기영동 장치의 모세관 말단에 단일 방울을 형성하는 단계;
    상기 단일방울에 시료를 농축하는 단계;
    단일 방울에 농축된 시료를 모세관 내로 주입하는 단계;
    모세관 내에 주입된 시료를 스위핑하는 단계;를 포함하여 이루어지는 모세관 전기영동에서의 시료의 선농축(preconcentration) 방법.
  8. 제 7항에 있어서,
    상기 모세관 말단의 단일 방울은 폴리테트라플루오로에틸렌(polytetrafluoroethylene; PTFE), 퍼플루오로알콕시 폴리머 레진(perfluoroalkoxy polymer resin; PFA), 플루오린네이티드 에틸렌-프로필렌(fluorinated ethylene-propylene; FEP) 및 폴리에테르에테르케톤(polyetheretherketones; PEEK)재질의 튜브로 이루어진 군에서 하나 선택하여 상기 모세관의 말단에 끼워서, 단일 방울을 안정하게 형성하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
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