KR20140040471A - 형광강도를 이용한 피부의 항산화 활성 평가방법 - Google Patents

형광강도를 이용한 피부의 항산화 활성 평가방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 메이크업 제품의 내수성 정량 평가 방법에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 피부에 일정 크기의 시험 부위를 지정하는 단계; 테이프를 상기 시험 부위에 일정 압력으로 밀착시키는 단계; 피부 각질층이 흡착된 테이프를 피부로부터 분리하여 반응 용기에 넣는 단계; 반응 용기 내에서 항산화 효소에 대한 형광 반응을 유도하는 단계; 상기 형광 반응 이미지를 얻는 단계; 및 상기 이미지를 이미지 분석 프로그램으로 처리하여 형광 강도를 수치화하는 단계를 포함하는 형광강도를 이용한 피부의 항산화 활성 평가방법에 관한 것이다.
본 발명에 따른 평가 방법을 통해 피부의 항산화 활성을 이미지 분석 프로그램을 통해 객관적이고 가시적으로 평가할 수 할 수 있다. 또한, 이러한 방법은 항산화 기능성 화장품의 효능 평가에 적용함으로써, 항산화 기능성 화장품에 대한 신뢰성을 높일 수 있으며 품질 보증의 수단으로 크게 기여할 수 있는 효과가 있다.

Description

형광강도를 이용한 피부의 항산화 활성 평가방법{ESTIMATING METHOD FOR ANTI-OXYDATION ACTIVITY OF SKIN USING FLUORESCENCE INTENSITY}
본 발명은 이미지 분석 프로그램을 이용하여 형광 강도를 수치화함으로써 피부의 항산화 활성을 정량적이고 객관적으로 평가할 수 있는 방법에 관한 것이다.
생체 내에서 에너지 생산을 위한 산화 과정 중에 상당량의 활성산소종(reactive oxygen species: ROS)들이 생성된다. 이러한 활성산소종은 생체 내 제거되기전에 의해 대부분 소멸되지만 순간적으로 활성산소종이 다량으로 발생되거나 만성적으로 활성산소종이 발생되어, 항산화 방어계와의 균형이 깨지면 각종 질환의 원인이 된다. 활성산소종은 피부 세포 및 조직의 손상은 물론이며 항산화 효소와 비효소적 항산화제로 구성된 산화제와 항산화제의 균형을 파괴하고 지질과산화, 단백질 산화, 콜라겐과 엘라스틴의 사슬절단 및 멜라닌 생성반응의 촉진, DNA의 산화와 같은 생체 구성 성분의 손상을 야기한다.
생체 내에는 활성 산소종을 제거하기 위한 방어 시스템을 갖추고 있으며, 항산화제로는 대표적으로 효소계와 비효소계로 나눌 수 있다. 비효소적 방어체계로는 비타민 C, E, 폴리페놀 등과 항산화 화합물이 있고, 합성 항산화제로는 부틸레이티드하이드록산솔(butylated hydroxy anisole), 부티레이티드하이드록시 톨루엔 등이 있는데, 이러한 항산화제는 슈퍼옥사이드 음이온을 하이드로젠 퍼옥사이드로 변환시키고 하이드로젠 퍼옥사이드를 산소와 물 분자로 전환시켜 활성 산소종을 제거함으로써 항산화제로 작용한다.
효소적 방어체계로는 SOD(superoxide dismutase), CAT(catarase), GPX(glutathione peroxidase) 등이 있다. SOD 등의 항산화 효소 활성은 아토피 피부염 등의 피부질환 및 노화의 진행에 따라 활성이 감소하는 것으로 알려져 있다.
일반적으로 이러한 항산화 효소의 활성에 대한 평가는 효소-기질반응을 이용하거나, 루미놀의 화학발광 강도(chemiluminescence intensity)를 루미노미터를 이용하여 측정하였다.
일예로 대한민국 특허공개 제2011-0043888호는 발광물질로 루미놀을 사용하며, 측정 물질이 수용되는 수용공간이 형성된 반응용기; 상기 수용공간에 활성산소를 발생시키는 활성산소 발생장치; 상기 수용공간에 일단이 연결되어, 외부로 연장된 광섬유; 및 상기 광섬유의 타단에 연결되어, 빛의 세기를 전기신호로 변환하는 광센싱장치; 를 포함하며, 상기 반응용기의 내부에는 빛이 새어나가지 않도록 암실로 형성된 것을 특징으로 하는 항산화 능력 측정장치를 개시하고 있다.
하지만 상기 특허를 비롯한 기존의 방법은 고가의 루미노미터와 같은 장비가 없으면 항산화 활성 측정이 불가능하며, 활성에 대한 시각화된 정보를 제공받는 것이 불가능하였다.
대한민국 특허공개 제2011-0043888호
이에 본 발명자들은 피부에 존재하는 항산화 효소의 활성에 대한 정보를 시각적으로 구현할 수 있는 평가법에 대해 연구한 결과, 항산화 효소의 활성에 대한 형광 반응 이미지의 형광 강도를 이미지 분석 프로그램을 이용하여 수치화함으로써 객관적으로 피부의 항산화 활성을 평가할 수 있다는 것을 확인하고, 이를 토대로 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 피부 내 존재하는 슈퍼옥사이드 디스뮤타제를 비롯한 항산화 효소의 항산화 활성을 시각적으로 가시화하고, 객관적으로 수치화하여 평가할 수 있는 방법을 제공하는데 그 목적이 있다.
상기한 목적을 달성하기 위해, 본 발명은
피부에 일정 크기의 시험 부위를 지정하는 단계;
테이프를 상기 시험 부위에 일정 압력으로 밀착시키는 단계;
피부 각질층이 흡착된 테이프를 피부로부터 분리하여 반응 용기에 넣는 단계;
반응 용기 내에서 항산화 효소에 대한 형광 반응을 유도하는 단계;
상기 형광 반응 이미지를 얻는 단계; 및
상기 이미지를 이미지 분석 프로그램으로 처리하여 형광 강도를 수치화하는 단계
를 포함하는 형광강도를 이용한 피부의 항산화 활성 평가방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기한 평가방법을 이용하여 항산화 기능성 화장품의 효능을 평가하는 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 평가 방법을 통해 피부의 항산화 활성을 이미지 분석 프로그램을 통해 객관적이고 가시적으로 평가할 수 할 수 있다. 또한, 이러한 방법은 항산화 기능성 화장품의 효능 평가에 적용함으로써, 항산화 기능성 화장품에 대한 신뢰성을 높일 수 있으며 품질 보증의 수단으로 크게 기여할 수 있는 효과가 있다.
도 1은 본 발명에 따른 형광강도를 이용한 피부의 항산화 활성 평가방법을 보여주는 순서도이다.
도 2는 디지털 카메라를 이용하여 얻는 형광 반응 이미지 촬영 사진이다.
도 3은 이미지 프로 플러스 프로그램의 HSI 히스토그램을 이용하여 형광 강도를 분석한 것이다.
도 4는 이미지 프로 플러스 프로그램을 이용하여 대조군, 전박 및 안면의 형광 이미지를 흑백 이미지로 변환한 후 형광 강도를 분석한 것이다.
도 5는 이미지 프로 플러스 프로그램의 HSI 히스토그램을 이용하여 대조군, 전박 및 안면의 형광 이미지에 대한 형광 강도를 분석한 것이다.
도 6은 항산화 제품 사용에 따른 안면과 전박의 항산화 활성을 통계 처리한 후 수치화한 그래프이다.
본 발명에 따른 평가방법은 기존의 고가 장비를 이용하지 않고 이미지 분석을 통해 피부의 항산화 활성을 알 수 있는 방법이다. 특히, 발광기질에 의해 발생한 형광 강도를 이미지 분석 프로그램을 통해 수치화 함으로써 객관적이고 가시적인 평가가 가능하다.
이하 본 발명을 도면을 참조하여 더욱 상세히 설명한다.
도 1은 본 발명에 따른 형광강도를 이용한 피부의 항산화 활성 평가방법을 보여주는 순서도이다.
도 1을 참조하면, 먼저 피부에 일정 크기의 시험 부위를 지정한다.
상기 시험 부위는 인체피부(안면 또는 전박 등) 또는 시험동물의 피부가 될 수 있으며, 그 크기는 2.5×2.5 ㎠로 한다.
다음으로, 테이프를 상기 시험 부위에 일정 압력으로 밀착시킨다.
상기 테이프에 가해지는 압력의 차이에 따른 측정상의 오류가 발생할 수 있으므로 밀착시 압력은 모두 동일하게 진행되어야 하며, 일례로 압력 장치(pressure instrument, cuderm, USA)를 이용하여 동일하게 적용이 가능하다.
다음으로, 피부 각질층이 흡착된 테이프를 피부로부터 분리하여 반응 용기에 넣는다.
피부로부터 분리된 테이프 표면에는 피부 각질층이 흡착되어 있고, 테이프에 의해 피부로부터 분리된 각질층에는 피부의 항산화 활성을 평가할 수 있는 슈퍼옥사이드 디스뮤타제 (superoxide dismutase, SOD)를 비롯한 항산화 효소가 포함되어 있다.
이어서, 반응 용기 내에서 항산화 효소에 대한 형광 반응을 유도한다.
테이프에 의해 흡착된 각질층 내 항산화 효소의 항산화 활성을 평가하기 위해 형광 반응을 유도한다.
이를 위해 슈퍼 옥사이드 생성물질을 첨가하여 슈퍼 옥사이드를 생성시킨다. 이러한 생성물질로 하이포크산틴/크산틴 산화효소(hypoxanthine/xanthine oxidase) 시스템, 플럼바진(plumbagin), 파라콰트(paraquat), 메나디온(menadion)이 가능하다. 이때 피부 각질층에 존재하는 슈퍼 옥사이드 디스뮤타제 등과 같은 항산화 효소는 슈퍼 옥사이드와 반응하여 과산화수소를 생성시키고, 과산화수소와 반응하여 발광하는 발광기질을 이용하여 형광 반응을 유도한다.
이때 발광기질로는 아다만탄-디옥세탄(Adamantane-dioxetane), 아크리디늄(Acridinium) 유도체, 루미놀(Luminol) 유도체, 루시게닌(Lucigenin), 반딧불이 루시페린(Firefly luciferin), 포토프로테인(Photoprotein), 히드라지드(hydrazides) 등이 가능하다.
다음으로, 상기 형광 반응 이미지를 얻는다.
형광 강도를 이미지화하기 위해 통상의 이미지 측정장치를 사용하여 이미지를 얻을 수 있으며, 일례로 디지털 카메라(canon 450d, Japan)를 이용하여 촬영한다.
다음으로, 상기 이미지를 이미지 분석 프로그램으로 처리하여 형광 강도를 수치화한다.
이미지는 이미지 분석 프로그램(Image-pro plus), 대표적으로 이미지 프로 플러스(Image-pro plus), 어도비 포토 샵 등이 가능하며, 본 발명에서는 이미지 프로 플러스 프로그램을 사용하여 설명한다.
이미지를 프로그램에서 파일 열기를 수행한 후 필터링하여 노이즈를 제거한다. 노이즈는 분석 값에 많은 영향을 주어 재현성(reproducibility) 있는 결과를 도출하는데 방해되므로, 필터링을 통해 측정된 이미지가 내재하고 있는 많은 충격성 잡음(Impulse noise)를 제거하여 정밀한 분석 데이터를 얻을 수 있다.
상기 필터링은 이미지가 가진 intensity transition(이진 이미지에서 윤곽선을 만드는 과정)에 나타나는 변화율을 증가시키거나 감소시키는 과정으로 이미지 화상 분석을 하는데 가장 중요하다. 대표적으로 lo-pass, hi-pass, sharpen, gauss,higauss, local equalize, median 및 rank 등이 있으며, 이들 이외에도 수십 가지의 필터링 방법이 존재하므로, 당업자에 의해 적절히 선택하여 사용한다.
바람직하기로, 이미지 프로 플러스 프로그램을 이용하여 본 발명에서는 Process→filters→lo-pass→sharpen→gauses→median→rank→despeckle 단계를 거쳐 필터링을 수행한다.
이어서, 상기 필터링을 통해 노이즈가 제거된 이미지의 분석영역을 설정하고, 분석 영역에 대한 HSI(Hue, Saturation, Intensity) 히스토그램을 이용하여 형광 영역의 형광 강도를 수치화한다.
상기 수치화는 이미지 분석 프로그램을 통해 변환이 가능하고, 일례
로 이미지 프로 플러스 프로그램을 이용하여 본 발명에서는 Measure→histogram→HSI 순으로 처리하여 이미지를 수치화한다.
이렇게 얻은 수치화된 값을 통계학적으로 처리할 수 있다.
형광 반응 유도 전 후 이미지 변화는 대응 t 검증(paired t-test)로 수행하고, 시험하고자 하는 시험군과 대조군과의 유의차는 ANCOVA 검증으로 수행한다. 그 결과 수치적으로 확인할 수 있도록 제품 내 또는 제품 간 미세한 차이를 관찰하는 것뿐만 아니라 수치적으로 입증이 가능해짐에 따라 객관적인 정량평가가 가능해진다.
상기한 방법을 이용하여 항산화 기능성 화장품의 효능 평가에 적용할 수 있다. 지정된 피부 부위에 일정 기간 동안 항산화 기능성 화장품을 도포하고, 도포 전, 후의 피부 항산화 활성을 전술한 바의 방법으로 평가하여, 항산화 기능성 화장품의 항산화 효과를 평가할 수 있다.
바람직한 구현예로서, 본 발명에서 제시한 방법에 따라 항산화 기능성을 갖는 화장품에 대한 피부의 항산화능 개선정도를 분석하였다.
1) 항산화 활성의 평가를 위해 30~40대의 건강한 여성 피험자 10명을 모집하였고, 항산화 활성이 있는 제품을 4주 동안 안면에 도포하게 한 후, 아래와 같은 방법으로 평가하였으며, 그 결과는 도 3에 나타내었다.
2) 자외선 노출(안면) 및 비노출(전박) 부위를 비누로 씻은 후 항온 항습 조건(22℃, 50%)에서 30분간 대기하도록 하였다.
3) 안면 및 전박 부위를 2.5 x 2.5㎠의 D-squame tape(cuderm, USA)을 이용하여 피부 각질층이 테이프에 흡착되도록 하였다. 이때 테이프에 가해지는 압력의 차이에 따른 측정상의 오류를 방지하기 위해 테이프에 가해지는 힘은 pressure instrument(cuderm, USA)를 이용하여 동일하게 적용하였다.
4) 표 1의 조건에 따라 피부 각질이 흡착되어 있는 테이프를 6-웰 플레이트(nunc, USA)에 4등분 하여 넣고, 반응에 필요한 용액을 첨가하여 형광반응을 유도하였다. 형광반응을 위해 Xanthine oxidase 20mU, Luminol 22.5mM, hypoxanthine 367uM, KOH 500mM, K3Fe(CN)6 1.21mM을 첨가하였다. 양성 대조군으로서 소의 SOD 1U을 사용하였다.
5) 루미놀에 의한 형광반응은 약 30초간 지속되므로 그 전에 디지털 카메라(canon 450d, Japan)를 이용하여 6-웰 플레이트를 촬영하였다. 도 2는 디지털 카메라를 이용하여 얻는 형광 반응 이미지 촬영 사진이다.
6) 촬영된 6-웰 플레이트 형광 이미지를 이미지 분석 프로그램(Image-pro plus)를 이용하여 평가하였고, 6-웰 플레이트 이미지를 HSI 히스토그램을 이용하여 형광강도를 intensity value로 정량하였다. 구체적으로, 노이즈 필터링 과정을 통해 노이즈를 제거하였다(Process→filters→lopass→sharpen→gauses→median→rank→despeckle). 분석하고자 하는 영역의 AOI(area of interest) 설정하고, HSI 히스토그램을 이용하여 형광영역의 intensity value 측정하였다(Measur→histogram→HSI). 도 3은 이미지 프로 플러스 프로그램의 HSI 히스토그램을 이용하여 형광 강도를 분석한 것이다. 시료간 Intensity value의 차이는 paired t-test, ANCOVA test를 이용하여 구하였다.
도 4는 이미지 프로 플러스 프로그램을 이용하여 대조군, 전박 및 안면의 형광 이미지를 흑백 이미지로 변환한 후 형광 강도를 분석한 것이다.
도 4를 참조하면, 형광강도에 대한 이미지를 이미지 프로 플러스(Image-pro plus) 프로그램을 이용하여 흑백 이미지로 변환 후, display range의 수치 변화를 형광의 강도에 대한 척도로서 사용한 것이다. 그러나 이러한 방법은 측정된 디지털 이미지를 흑백 이미지로 변환 후 밝은 영역의 면적을 측정하기 때문에 형광의 강도 측정이라기 보다 흑백으로 변화된 형광 부분의 면적 분석에 가까우므로 본래의 다양한 색측학적 형광강도 변화의 측정이라 보기 어렵고, 샘플의 수가 늘어날 경우 다양한 시료 또는 평가 대상간의 형광강도의 차이가 명확하지 않으면 미세한 형광강도의 차이를 정량적으로 구분할 수 없다는 단점이 있다. 이에 따라서, 흑백 이미지로 변환 후 대조군, 전박 및 안면의 형광 이미지를 분석하는 경우 각 웰의 형광 강도의 차이에 대한 비교가 불가능하다.
도 5는 이미지 프로 플러스 프로그램의 HSI 히스토그램을 이용하여 대조군, 전박 및 안면의 형광 이미지에 대한 형광 강도를 분석한 것이다. 도 5에 나타낸 바와 같이, 각 형광강도의 차이를 완벽히 반영하여 객관적인 수치로 정량화가 가능하다.
7) 항산화 제품 사용에 따른 안면과 전박의 피부 시료 간 Intensity value의 차이는 paired t-test, ANCOVA test 를 이용하여 분석하였다. 도 6은 항산화 제품 사용에 따른 안면과 전박의 항산화 활성을 통계 처리한 후 수치화한 그래프이다.
전술한 바와 같이 본 발명에 따른 평가 방법은 피부 항산화 활성을 객관적으로 수치화하여 정량적으로 평가가 가능하다. 이를 통해 종래 고가의 장비를 이용하지 않고, 형광 강도의 미세한 차이를 이미지 분석을 통해 수치화할 수 있다.

Claims (10)

  1. 피부에 일정 크기의 시험 부위를 지정하는 단계;
    테이프를 상기 시험 부위에 일정 압력으로 밀착시키는 단계;
    피부 각질층이 흡착된 테이프를 피부로부터 분리하여 반응 용기에 넣는 단계;
    반응 용기 내에서 항산화 효소에 대한 형광 반응을 유도하는 단계;
    상기 형광 반응 이미지를 얻는 단계; 및
    상기 이미지를 이미지 분석 프로그램으로 처리하여 형광 강도를 수치화하는 단계
    를 포함하는 형광강도를 이용한 피부의 항산화 활성 평가방법.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 필름은 2.5×2.5 ㎠의 면적을 갖는 것을 특징으로 하는 평가 방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 밀착은 압력 장치를 이용하여 동일 압력으로 수행하는 것을 특징으로 하는 평가 방법.
  4. 제1항에 있어서, 상기 형광 반응은 하이포크산틴/크산틴 산화효소와 발광 기질을 이용하는 것을 특징으로 하는 평가 방법.
  5. 제4항에 있어서, 상기 발광 기질은 아다만탄-디옥세탄(Adamantane-dioxetane), 아크리디늄(Acridinium) 유도체, 루미놀(Luminol) 유도체, 루시게닌(Lucigenin), 반딧불이 루시페린(Firefly luciferin), 포토프로테인(Photoprotein) 또는 히드라지드(hydrazides)인 것을 특징으로 하는 평가 방법.
  6. 제1항에 있어서, 상기 형광 반응 이미지는 디지털 카메라로 촬영하여 얻는 것을 특징으로 하는 평가 방법.
  7. 제1항에 있어서, 상기 이미지 분석 프로그램은 필름의 이미지를 필터링하여
    노이즈를 제거한 다음, 노이즈가 제거된 이미지를 수치화(pixel)하여 수행하는 것을 특징으로 하는 평가 방법.
  8. 제1항에 있어서, 상기 수치화는 HSI 히스토그램을 이용하는 것을 특징으로 하는 평가 방법.
  9. 제1항에 있어서, 상기 수치화된 형광 강도를 통계학적 처리하는 것을 특징으로 하는 평가 방법.
  10. 제1항에 따른 피부의 항산화 활성 평가방법을 이용하여 항산화 기능성 화장품의 효능을 평가하는 방법.
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Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113711012A (zh) * 2018-09-14 2021-11-26 联合利华知识产权控股有限公司 免洗型化妆品组合物保护皮肤免受污染的功效的评估
CN114674734A (zh) * 2022-04-20 2022-06-28 无限极（中国）有限公司 一种评价化妆品产品及原料抗氧化功效的方法

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
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CN113711012A (zh) * 2018-09-14 2021-11-26 联合利华知识产权控股有限公司 免洗型化妆品组合物保护皮肤免受污染的功效的评估
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