KR20140030188A - Igfbp 단편을 이용한 심혈관 사건의 위험도 측정 방법 - Google Patents
Igfbp 단편을 이용한 심혈관 사건의 위험도 측정 방법 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 환자의 혈액에서 IGFBP-4 또는 IGFBP-5 (인슐린 유사 생장 인자 결합 단백질 4 또는 인슐린 유사 생장 인자 결합 단백질 5)의 단백질 분해 단편을 검출하는 것을 포함하는, 장래의 주요 유해 심혈관 질환의 위험도 측정 방법을 개시한다. 본 발명은 IGFBP들의 단백질 분해 단편들을 특이적으로 측정하기에 적합한 항체들 및 면역분석법들을 제공한다. 본 발명에 있어서, 주요 유해 심혈관 질환 (major adverse cardiovascular events, MACE)의 위험도 예측용 혈액 생체마커로서IGFBP 단편들의 이용이 제시된다.
Description
본 발명은 환자의 혈액에서 IGFBP-4 또는 IGFBP-5 (인슐린 유사 생장 인자 결합 단백질 4 또는 인슐린 유사 생장 인자 결합 단백질 5)의 단백질 분해 단편을 검출하는 것을 포함하는, 장래의 주요 유해 심혈관 사건의 위험도 측정 방법을 개시한다. 본 발명은 IGFBP들의 단백질 분해 단편들을 특이적으로 측정하기에 적합한 항체들 및 면역분석법들을 제공한다. 본 발명에 있어서, 주요 유해 심혈관 사건 (major adverse cardiovascular events, MACE)의 위험도 예측용 혈액 생체마커로서IGFBP 단편들의 이용이 제시된다.
심혈관 질환의 치료 분야의 괄목할 만한 진전에도 불구하고, 이는 개발도상국들에서 선두 사망 원인으로 남아있다. 고전적인 심혈관 위험 인자들 - 의 평가는 질환 예측에 있어서 중추 역할을 한다. 그러나, 관상동맥성 심장 질환 (심장에 혈액을 공급하는 혈관의 협소화)은 상기 고전적인 위험 인자를 전혀 갖지 않거나 오직 하나만을 가진다. 따라서, 종래의 표지자들로부터 얻은 정보를 확장하고 질환 메커니즘을 설명할 새로운 바이오마커가 필요하다.
장래의 MACE 위험 평가에 대한 믿을 만한 바이오마커 연구는 현재 시험관 내 (in vitro) 진단학의 중대 과제로 보인다. MACE는 급성 관상동맥 증후군 (ACS), 불안정 협심증, ST분절 상승 MI (myocardial infarction) 및 비(非)ST분절 상승 MI를 포함하는 심근 경색 및 기타 몇 가지 사건들을 포함한다. 문헌에 기술되어 있는 MACE 위험 평가에 사용되는 광범위한 군의 후보자들에도 불구하고, 이들 중 어떤 것도 심근 경색에 대한 심장 트로포닌 I (cardiac Troponin I, cTnI)이나, 심부전 (heart failure) 진단을 위한 NT-proBNP와 같은 골드 스탠다드 바이오마커가 되지 못하였다. 임상 실시에서 사용되는 MACE 위험 평가 바이오마커들의 주된 단점은 심혈관 특이성이 부족하고, 분석 대상의 혈액 수준과 진행될 심혈관 합병증간의 관계의 불명확성, 및 그 결과로 예후적 가치가 제한된다는 것이다. 급성 심근 경색의 명확한 표식이 없고 (트로포닌 시험 음성 및 심전도상 ST분절 상승이 없는) 급성 흉통만 있는 환자의 MACE 위험 평가를 위한 응급실에서 사용될 수 있는 바이오마커에 대한 필요성은 시급하다. 이러한 바이오마커는 고전적인 심혈관 위험 인자를갖는 환자 그룹을 스크리닝하여 단기 심장 사건 고위험 하위 그룹을 확인할 가능성을 열 수도 있다.
동맥경화 플라크 불안정화와 관련된 염증성 바이오마커에 대한 연구는 MACE 위험 평가에 있어서 새로운 미래를 열었다. 지난 10년간 광범위한 패밀리의 후보 바이오마커들 (고감도 C-반응성 단백질 (hsCRP), 지질단백질 관련 포스포리파아제 A2 (Lp-PLA2), 기질 금속단백질분해효소-9, 단핵구 조화성 단백질-1, 용해성 CD40L, 미옐로퍼옥시다아제 등)이 집중적으로 조사되었다. 임상적 실시에 있어서 이들 중 2 가지 - hsCRP와 Lp-PLA2의 유용성을 뒷받침하는 충분한 증거들이 출간, 축적되었다.
본 발명에 있어서, IGFBP-4 및 IGFBP-5 단편들은 MACE 예측용 바이오마커로서 제안된다. 특이적인 단백질 분해가 IGFBP-4 및 IGFBP-5 기능에 대한 주요 조절 메커니즘이다. 문헌상 임신 관련 혈장 단백질-A (PAPP-A)가 IGFBP-4 및 IGFBP-5 단백질 분해, 및 뒤이은 활성 IGF들의 방출을 담당하는 효소로서 기술되었다. 동맥경화 플라크 내부의 PAPP-A의 단백질 분해 활성이 입증되지 않았음에도 불구하고, 동맥경화 플라크 내에서 활성화 평화근 세포에 의하여 발현된 PAPP-A가 IGF의 생체이용도를 증가시킬 것이 예상되었다. 본 발명의 발명자들은 IGFBP-4 및 IGFBP-5의 단백질 분해 단편들을 MACE 예측용으로 사용될 수 있는 독자적인 혈액 바이오마커로서 이용하는 것을 제안한다.
발명의 요약
본 발명은 환자의 혈액에서 IGFBP-4 또는 IGFBP-5 (인슐린 유사 생장 인자 결합 단백질 4 또는 인슐린 유사 생장 인자 결합 단백질 5)의 단백질 분해 단편을 검출하는 것을 포함하는, 장래의 주요 유해 심혈관 사건의 위험도 측정 방법을 개시한다. 이 방법은 측정된 IGFBP-4의 N-말단 단편 또는 IGFBP-4의 C-말단 단편 수치, 및 측정된 IGFBP-5의 N-말단 단편 또는 IGFBP-5의 C-말단 단편 수치에 따라 개체들을 여러 가지 위험 그룹으로 분류할 수 있도록 한다. 이 방법에 있어서, IGFBP-4의 N-말단 단편 또는 IGFBP-4의 C-말단 단편의 증가, 및 IGFBP-5의 N-말단 단편 또는 IGFBP-5의 C-말단 단편의 증가는 주요 유해 심혈관 사건의 위험 증가와 관련되어 있다. 본 발명은 IGFBP-4의 단백질 분해 단편, 및 또한 IGFBP-5의 N-말단 단편을 특이적으로 측정하기에 적합한 항체 및 면역분석법을 제공한다. IGFBP-4 또는 IGFBP-5의 단백질 분해 과정에서 형성되는 신규한 단백질 분해 에피토프 (단백질 분해 네오-에피토프) 특이적 항체들은 전장의 IGFBP-4 및 IGFBP-5 분자의 존재와 무관하게 인간 혈액에서 IGFBP-의 N-말단 및 C-말단 단편들 양자 모두 뿐 아니라 IGFBP-5의 N-말단 단편에 대한 정확한 면역적 검출에 적합하다. 또한, 본 발명은 전장 IGFBP-4 및 전장 총IGFBP-4 및 IGFBP-4의 단편에 대한 개별적 측정에 기초하여 IGFBP-4의 차등적 검출 방법을 제공한다.
도면의 간단한 설명
도 1. 마우스 면역화 및 시험을 위하여 얻은 합성 펩타이드 및 항원에 대한 설명.
면역원: 1. NSO 세포에서 생산된 전장 IGFBP-4
2. IGFBP-4-펩타이드#1, BSA와 컨쥬게이션
3. IGFBP-4-펩타이드#2, BSA와 컨쥬게이션
도 2. 선별된 모노클로날 항체들의 특이성에 대한 모식적 설명
도 3A 및 3B. NT-IGFBP-4 단백질 분해 단편들 (A, 면역분석 IBP3-IBP144) 및 CT-IGFBP-4 단백질 분해 단편들 (B, 면역분석 IBP182-IBP163)에 특이적인 샌드위치 면역분석법의 교정 곡선 및 이들의 전장 IGFBP-4와의 교차 반응에 대한 교정 곡선.
도 4A 및 4B. 전장 IGFBP-4 (A, IBP185-IBP180 및 B, IBP185-IBP154)에 특이적인 샌드위치 면역분석법의 교정 곡선 및 이들의 IGFBP-4 단편과의 교차 반응에 대한 교정 곡선.
도 5A 및 5B. (단백질 분해 단편 및 전장 IGFBP-4을 인식하는) 총IGFBP-4에 특이적인 샌드위치 면역분석법의 교정 곡선. 이 분석법은 (A) IGFBP-4의 C-말단 부분 (IBP185-IBP190) 및 (B) IGFBP-4의 N-말단 부분 (IBP17-IBP180)에 특이적이다; Ags - 항원.
도 6. PAPP-A 단백질분해효소 활성을 입증하는 IGFBP-4 단백질 분해 단편의 웨스턴 블롯 검출. 래빗 항-IGFBP-4 폴리클로날 항체를 면역염색에 사용하였다.
IGFBP-4 (레인당 200 ng)는 하기와 같이 처리되었다:
레인 1, 재조합 PAPP-A;
레인 2, 동맥경화 조직 PAPP-A;
레인 3, PAPP-A 없음;
레인 4, 분자량 스탠다드; kDa로 나타냄.
도 7. 샌드위치 면역분석법 NT-IGFBP-4 및 CT-IGFBP-4 (각각, IBP3-IBP144 및 IBP182-IBP163)를 이용한 건강한 기증자와 AMI 진단 환자의 혈장 시료에서의 IGFBP-4 단편의 측정. ACS (급성 심근 경색) 환자의 혈장 내 IGFBP-4 수준 (평균 ± SD)이 건강한 기증자의 혈장 내에서보다 NT-IGFBP-4에 대하여는 5.1배 (p<0.0001), CT-IGFBP-4에 대하여는 2.7배 (p<0.0001) 높았다.
도 8A 및 8B. 각각 샌드위치 면역분석법 IBP3-IBP144 및 BP182-IBP163으로 측정된 NT-IGFBP-4 및 CT-IGFBP-4에 대한 ROC 곡선. A - MACE 예측, B - MACEACD 예측.
도 9A 및 9B. A - 차등적 면역분석법으로 측정된 NT-IGFBP-4 단백질 분해 단편에 대한 ROC 곡선 (IBP17-IBP180에 의하여 측정된 총IGFBP-4와, IBP185-IBP154에 의하여 측정된 전장 IGFBP-4 간의 차이), B - 차등적 면역분석법으로 측정된 CT-IGFBP-4 단백질 분해 단편에 대한 ROC 곡선 (IBP185-IBP190에 의하여 측정된 총IGFBP-4와 IBP185-IBP154에 의하여 측정된 전장 IGFBP-4 간의 차이).
도 10. 쿠마시 블루 R-250 염색을 이용하는 소듐 도데실 술페이트 폴리아크릴아미드 겔 전기영동에 의하여 결정된 IGFBP-5의 PAPP-A-의존성 절단.
레인 1, PAPP-A 없는 IGFBP-5 (레인당 1 μg);
레인 2, 재조합 PAPP-A로 특이적으로 절단된 IGFBP-5;
레인 3, 재조합 NT-IGFBP-5 (1 μg);
레인 4, 재조합 CT-IGFBP-5 (1 μg);
레인 5, 분자량 스탠다드; kDa로 나타냄.
도 11A 및 11B. NT-IGFBP-5 단백질 분해 단편들 (A, IBPF15-IBPF72 및 B, IBPF16-IBPF72)에 특이적인 샌드위치 면역분석법의 교정 곡선 및 이들의 전장 IGFBP-5와의 교차 반응의 교정 곡선. 항원 농도 1 pmol/ml는 16.1 ng/ml의 NT-IGFBP-5 또는 28.6 ng/ml의 전장 IGFBP-5에 해당한다.
도 12. 청색선 - 샌드위치 면역분석법 IBPF15-IBPF72에 의하여 측정된 NT-IGFBP-5 단백질 분해 단편에 대한 ROC 곡선, 녹색선 - 샌드위치 면역분석법 IBPF16-IBPF72에 의하여 측정된 NT-IGFBP-5 단백질 분해 단편에 대한 ROC 곡선.
발명의 상세한 설명
본 발명에서 행하여진 실험들에서, 급성 심근 경색 환자들의 혈장 내 NT-IGFBP-4 및 CT-IGFBP-4 단편들의 수준은 건강한 기증자들의 혈장 내에서보다 각각 5.1배 및 2.7배 높았다. 이러한 초기 임상 연구 결과는 MACE 위험 평가에 대한 IGFBP-4의 가치 탐색의 가능성을 여는 것이다.
IGFBP-4 단백질 분해 단편들 및 IGFBP-5 N-말단 단편의 진단적 가치를 유망한 추적 임상 연구에서 평가하였다. 급성 흉통 및 숨가쁨을 느끼는 응급 환자들을 연속적으로 이 연구에 포함시켰다. 환자들의 혈장 내 IGFBP-4 단편들 및 IGFBP-5의 N-말단 단편을 측정하였다. 6 개월의 추적 기간 동안, MACE의 발생을 관찰하였다. 그 결과, 환자들의 시료 중 IGFBP-4의 N-말단 및 C-말단 단편들 양자 모두와 IGFBP-5의 N-말단 단편 수준의 증가는 MACE 위험의 증가와 현저히 관계가 있었다.
IGFBP-4 단편들은 MACE의 단기 위험을 예측할 수 있는 명백히 미진한 혈액 분석법을 충족시킬 수 있다.
본 발명에 있어서, 개발된 샌드위치 면역분석 방법의 검출 항체는 안정한 Eu3+ 킬레이트에 의하여 표지된다. 다른 다양한 실시 상태에 있어서, 검출 항체는, 다양한 스탠다드 방법들, 예컨대 발광, 화학발광, 형광, 흡수, 방사선 또는 현미경법, 영상화 등을 이용하여 검출할 수 있거나 시각화할 수 있는 여러 가지 유형의 시그널을 생성할 수 있는 여러 가지 유형의 표지자들에 의하여 표지될 수 있다. 면역분석법은 면역조직화학, 효소 결합 면역 분석 (ELISA), 웨스턴 블롯, 비탁법, 혼탁법, 면역방사선법, 측방 유동 면역분석법, 면역조직/세포화학 및 기타 이 기술 분야의 숙련자들에게 알려진 방법들을 포함할 수 있다.
본 발명에 있어서, PAPP-A의 동맥경화형은 재조합 PAPP-A와 동일한 효율로 IGFBP-4를 절단하는 것으로 나타났다 (실시예 6). 따라서, 인간 플라크에서 발현되는 PAPP-A의 동맥경화형이 IGFBP-4를 절단할 수 있는 활성 단백질 분해 효소임이 최초로 보여졌다.
면역분석법은 시료 중 바이오마커의 존재 또는 부존재 뿐 아니라 시료 중의 바이오마커의 양을 측정하는 데에도 사용될 수 있다. 시료 중의 IGFBP-4 단백질 분해 단편들의 양은 레퍼런스 또는 스탠다드, 예컨대 온전한 IGFBP-4 또는 시료 중 존재한다고 알려진 다른 폴리펩타이드와 비교함으로써 (또는 그와의 비율로써) 결정될 수 있다. 시료 중의 IGFBP-4 단백질 분해 단편들의 양은 또한 레퍼런스 또는 스탠다드, 예컨대 레퍼런스 또는 대조군 시료 중의 내인성 또는 재조합 또는 합성 IGFBP-4 단편들의 양과 비교하여 결정될 수도 있다. 따라서, 시료 중의 바이오마커의 양은 절대적 관점에서 정량되어야 할 필요는 없고 레퍼런스 또는 대조군에 대하여 상대적인 관점에서 측정될 수 있다.
본 발명의 다양한 실시 상태들은 ACS 진행 위험의 평가를 위하여 환자들의 혈장 시료 중 IGFBP-4의 N-말단 또는 C-말단, 또는 동시에 C-말단과 N-말단을 검출하는 것을 포함한다.
면역분석법은 시료 중 바이오마커의 존재 또는 부존재 뿐 아니라 시료 중의 바이오마커의 양을 결정하는 데에도 사용될 수 있다. 시료 중 IGFBP-4 단백질 분해 단편들의 양은 IGFBP-4의 단백질 분해 단편들에 특이적인 샌드위치 면역분석법에 의하여, 예컨대 총IGFBP-4 (전장 IGFBP-4 및 단편)와 전장 IGFBP-4의 양 차이로 결정될 수 있다. 본 연구는 NT- 및 CT-IGFBP-4 단편들의 정량 측정을 위한 이러한 계산을 이용하는 가능성을 보여준다 (실시예 9).
실험
실시예 1. 단백질 분해 매개 IGFBP-4의 신규한 에피토프에 특이적인 마우스 모노클로날 항체의 생성.
마우스의 면역화를 위한 합성 펩타이드:
IGFBP-4 펩타이드-1: CHFAKIRDRSTSGGKM;
IGFBP-4 펩타이드-2: KVNGAPREDARPVPQC.
IGFBP-4 펩타이드-1 및 IGFBP-4 펩타이드-2 (도 1)을 고상 Fmoc 화학을 이용하여 합성하였다. 펩타이드를 p-알콕시벤질알코올 수지상에서 제조하였다. 수지로부터 분리한 후, 크루드 펩타이드 제조물을 역상 고압 액체 크로마토그래피로 정제하였다.
C18 제조 컬럼에 수중 0.1% 트리플루오로아세트산 및 아세토니트릴 중 트리플루오로아세트산 0.1%의 구배를 적용하였다. 순도 (>95%)를 C18 고압 액체 크로마토그래피 분석 및 질량 분광 분석 (정확도 ± 0.5 Dalton의 기질 보조 레이저 탈착/이온화 질량 분석)으로 측정하였다.
IGFBP-4 펩타이드-1은 IGFBP-4 단편 122~135의 아미노산 서열과 동일하였고 N-말단에 추가의 시스테인 잔기를 하나 더 함유하였다. IGFBP-4 펩타이드-2는 IGFBP-4 단편 136~150의 아미노산 서열과 동일하였고 C-말단에 추가의 시스테인 잔기를 하나 더 함유하였다. 이들 추가의 시스테인 잔기들의 술프하이드릴기를 캐리어 단백질과 컨쥬게이션하는 펩타이드의 제조에 사용하였다.
펩타이드의 캐리어 단백질과의 컨쥬게이트 제조는 Pierce (Rockford, IL)의 술포-SMCC를 이용하여 제조자의 지침에 따라 수행되었다. 컨쥬게이션을 위하여 캐리어 단백질 - 보바인 세럼 알부민 (BSA) 또는 오브알부민 (양자 모두 Sigma Chemicals, St. Louise, Mo.로부터 구득) - 2.5 mg을 10 mM KHPO4, 150 mM NaCl, pH 7.4 (PBS)에 용해시켜 농도 10 mg/ml로 하였다. 0.1 ml 디메틸 술폭사이드에 ㅇ요용해된, 2 밀리그램의 술포-SMCC를 상기 단백질 용액에 첨가하였다. 캐리어 단백질 활성화 반응을 실온에서 2 시간 수행하였다. NAP-5 컬럼 (GE Healthcare Life Sciences, Piscataway, NJ로부터 구득)을 이용, 과량의 술포-SMCC를 겔 여과로 제거하였다. NAP-5 컬럼은 10 mM KH2PO4, 150 mM NaCl, pH 7.2로 미리 평형을 맞춰두었다. 그 후, 2 mg의 합성 펩타이드-1 또는 펩타이드-2를 단백질 용액에 첨가하여 컨쥬게이션을 개시하였다. 일정하게 교반하면서 이 반응을 얼음 위에서 2 시간 수행하였다. 미반응 펩타이드 분율은 PBS로 미리 평형화시킨 겔 여과 NAP-5 컬럼을 이용하여 단백질-펩타이드 컨쥬게이트로부터 제거되었다. 펩타이드들의 적절한 캐리어 단백질로의 컨쥬게이션은 소듐 도데실 술페이트 폴리아크릴아미드 겔 전기영동을 이용하여 단백질 분자량에 있어서 3~5 kDa의 증가로 확인되었다. 컨쥬게이트를 분주하여 사용시까지 -20℃에 보관하였다.
펩타이드
-(
캐리어
단백질)
컨쥬게이트를
이용한 마우스 면역화
5 마리 BALB/c 마우스로 이루어진 그룹들을 펩타이드-단백질 컨쥬게이트로 5 회 면역화하였다.
그룹 1: 제1 면역화: 60% 프로운트 컴플리트 아쥬반트를 함유하는 PBS 중의 10 μg BSA-펩타이드-1을 복강내로 0.2 ml; 제2 면역화: 제30일에, 60% 프로운트 인컴플리트 아쥬반트를 함유하는 PBS 중의 5 μg BSA-펩타이드-1을 복강내로 0.2 ml; 제3 면역화: 제60일에, PBS 중의 2.5 μg BSA-펩타이드-1을 복강내로 0.2 ml.
그룹 2: 제1 면역화: 60% 프로운트 컴플리트 아쥬반트를 함유하는 PBS 중의 10 μg BSA-펩타이드-2를 복강내로 0.2 ml; 제2 면역화: 제30일에, 60% 프로운트 인컴플리트 아쥬반트를 함유하는 PBS 중의 5 μg BSA-펩타이드-2를 복강내로 0.2 ml; 제3 면역화: 제60일에, PBS 중의 2.5 μg BSA-펩타이드-2를 복강내로 0.2 ml.
제3 면역화로부터 20일 후, 최종 면역화 및 혼성화를 위하여 펩타이드 특이적 항체 타이터가 가장 높은 마우스들을 선별하였다. 그룹 1에 대하여는 PBS 중의 10 μg BSA-펩타이드-1 0.2 ml을, 그룹 2에 대하여는 PBS 중의 10 μg BSA-펩타이드-2 0.2 ml을 마우스의 정맥 내 주사하였다. 정맥 내 주사를, 다음날 동일한 프로토콜로 반복하였다 (제5 면역화). 그 후, 제5 면역화로부터 2일 후, 면역화된 마우스의 비장을 살균 분리하여 종래 설명하는 바와 같이 (Kohler and Milstein, 1975, 1976; Kohler et al ., 1976; Hammerling et al., 1981) 균질화된 조직을 마우스 골수 세포주 sp2/0와 융합하였다.
효소 결합 면역 흡착 분석 (ELISA)으로, 생장하고 있는 하이브리도마 조정 배양체를 항체용으로 스크리닝하였다. 펩타이드- 1 또는 펩타이드-2에 특이적인 항체들을 생산하는 하이브리도마를, 미리 흡착된 항원으로서 사용되는 오브알부민-펩타이드-1 또는 오브알부민-펩타이드-2 각각을 이용하여 ELISA로 선별하였다. 추가적인 시험에서는 NSO 세포주 (Sigma Chemicals, St. Louise, Mo.로부터 구득)에서 발현된 인간의 재조합 IGFBP-4 역시 미리 흡착된 항원으로 사용되었다. 분석을 위하여, 웰당 오브알부민-펩타이드-1, 또는 오브알부민-펩타이드-2, 또는 인간 재조합 IGFBP-4 50 ng/0.1 ml PBS를 면역 분석 폴리스티렌 플레이트 (Corning, Cambridge, MA로부터 구득) 상에 흡착시켰다. 항원 흡착 40 분 후, 플레이트를 2회 수세하고 계면활성제 Tween20, 0.1%을 함유하는 PBS (PBST)로 10 분간 블로킹하였다. 그 후, 플레이트를 생장 중인 하이브리도마로부터 수집한 조정 배지 0.05 ml로 30 분간 반응시키고 PBST로 2회 수세하였다. 미리 흡착된 항원에 결합된 마우스 항체들은, 웰당 1:1000으로 PBST에 희석된 0.1 ml의 2차 항-마우스 IgG 폴리클로날 항체와의 30 분간의 반응을 통하여 밝혀졌는데, 이 항체는 HRP와 컨쥬게이션된 것이다. 2차 항체들은 Sigma Chemicals, St. Louise, Mo로부터 구득하였다. 2차 항체들과의 반응 후, 플레이트를 PBST로 6회 수세하고, 0.03% 과산화수소를 함유하는 3,3',5,5'-테트라메틸 벤지딘 (TMB) 퍼옥시다아제 기질을 첨가하였다. 0.1 ml의 0.5 M 인산을 첨가하여 15 분 후 반응을 종료시키고 450 nm에서 웰의 흡광도를 측정하였다. 흡광도 측정은 Labsystems Multiscan 마이크로플레이트 리더 (Labsystems, Finland)를 이용하여 수행되었다.
차기 작업을 위하여 오브알부민과 컨쥬게이션된 적절한 펩타이드에 특이적인 동시에 (전술한 조건, 450 nm에서 백그라운드를 초과한 흡광도 >0.5) 인간 재조합 IGFBP-4와는 반응하지 않는 (450 nm에서 백그라운드를 초과한 흡광도 <0.025) 항체를 생산하는 하이브리도마를 선별하였다. 제한 희석으로 이러한 하이브리도마를 클로닝하였다. 목적하는 모노클로날 항체를 분비하는 하이브리도마 클론들을 10% 페탈 보바인 세럼 (HyClone Laboratories, Logan, UT)을 함유하는 Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM)에서 배양하였다.
항체의 친화 정제
선별된 하이브리도마 클론들을 복강 내 주입한 후, 마우스의 복수액에서 모노클로날 항체를 배양하였다. 단백질 A 친화 크로마토그래피를 이용하여 복수액으로부터 항체를 정제하였다. 수지는 GE Healthcare Life Sciences (Piscataway, NJ)로부터 구득하였고, 정제를 제조자의 지침에 따라 수행하였다. 정제된 모노클로날 항체들을 4℃, 50% 암모늄 술페이트에서 현탁하여 보관하였다.
모노클로날
항체의 특이성 조사
선별된 모노클로날 항체들의 특이성을 확인하기 위하여, IGFBP-4 단백질 분해 단편들을 얻었다. PAPP-A-의존성 단백질 분해 반응을 종래 알려진 조건에 따라 수행하였다 (Overgaard et al., 2000). 2 mM CaCl2, 1.8 μg IGF-II (Sigma Chemicals, St. Louise, Mo로부터 구득), 40 ng의 인간 재조합 PAPP-A (HyTest, Turku, Finland), 및 2 μl 단백질 분해 효소 억제제 칵테일 (Sigma Chemicals, St. Louise, Mo로부터 구득)의 존재 하에서 2 μg의 인간 재조합 IGFBP-4를 0.23 ml의 50 mM Tris-HCl, pH 7.5에서 반응시켰다. 이 반응을 37℃에서 15 시간 수행하고 시료를 -20℃에서 동결시킴으로써 종료시켰다. Abcam (Cambridge, MA)으로부터 구득한 특이적 래빗 폴리클로날 항체 1 μg/ml을 이용하여 웨스턴 블롯으로 IGFBP-4의 PAPP-A-의존성 분해를 측정하였다 (도 6). 선별된 모노클로날 항체들의 IGFBP-4 단백질 분해 단편들에 대한 특이성 연구는 친화 정제 항체를 이용, 간접적 ELISA로 수행되었다. 전장 재조합 IGFBP-4 또는 PAPP-A-의존성 분해에 의하여 생성된 IGFBP-4 단편들 10 ng을 폴리스티렌 플레이트에 흡착시켰다. 40 분의 반응 후, 플레이트를 2회 수세하고 계면활성제 Tween 20, 0.1%를 함유하는 PBS (PBST)로 10 분간 블로킹하였다. 그 후, 선별된 MAbs (10 μg/ml)를 교반하면서 실온에서 30 분간 반응시키고, 그 후 PBST로 2회 수세하였다. 특이적으로 결합된 항체들은 웰당 1:1000으로 PBST에 희석된 0.1 ml의 항-마우스 IgG 폴리클로날 항체로 검출되었는데, 상기 항체는 HRP와 컨쥬게이션되어 있는 것이다. 2차 항체들은 Sigma Chemicals, St. Louise, Mo로부터 구득되었다. 2차 항체들과의 반응 후, 플레이트를 PBST로 6회 수세하고, 퍼옥시다아제 기질을 함유하고 0.03% 과산화수소로 보충된 3,3',5,5'-테트라메틸 벤지딘 (TMB)을 첨가하였다. 0.1 ml의 0.5 M 인산을 첨가하여 15 분 후 반응을 종료시키고 450 nm에서 흡광도를 측정하였다. PAPP-A-의존성 분해로 생성된 IGFBP-4의 단백질 분해 단편들에 특이적이고, 온전한 IGFBP-4와 5% 미만의 교차 반응성을 갖는 모노클로날 항체들의 그룹이 최종적으로 선별되었다: IBP28, IBP27, IBP12, IBP3, IBP4, IBP7, IBP13, IBP18, IBP19, IBP20, IBP30, IBP167, IBP174, IBP160, IBP161, IBP164, IBP171, IBP163, IBP162 (도 2). IBP30만 IgM 아이소 타입으로서 제외하고 모든 모노클로날 항체들은 IgG 아이소 타입이었다.
실시예 2. 온전한 IGFBP-4에 특이적인 마우스 모노클로날 항체들의 생성
마우스의 면역화
포유류 NSO 세포주에서 발현된 인간 재조합 IGFBP-4를 이용하여 5 마리의 BALB/c 마우스를 5회 면역화시켰다. 이 단백질은 Sigma Chemicals, St. Louise, Mo로부터 구득하였다. 제1 면역화: 60% 프로운트 컴플리트 아쥬반트를 함유하는 PBS 중의 5 μg IGFBP-4를 복강내로 0.2 ml; 제2 면역화: 제30일에, 60% 프로운트 인컴플리트 아쥬반트를 함유하는 PBS 중의 2 μg IGFBP-4를 복강내로 0.2 ml; 제3 면역화: 제60일에, PBS 중의 2 μg IGFBP-4를 복강내로 0.2 ml.
제3 면역화로부터 20일 후, 후속 면역화 및 혼성화를 위하여 펩타이드 특이적 항체 타이터가 가장 높은 마우스들을 선별하였다. PBS 중의 2 μg IGFBP-4 0.2 ml를 4회째로 마우스의 정맥 내 주사하였다. 마지막 정맥 내 주사를, 다음날 동일한 프로토콜로 수행하였다 (제5 면역화). 2일 후, 면역화된 마우스의 비장을 살균 분리하여 종래 설명하는 바와 같이 (Kohler and Milstein, 1975, 1976; Kohler et al ., 1976; Hammerling et al., 1981) 균질화된 조직을 마우스 골수 세포주 sp2/0와 융합하였다. ELISA 방법을 이용하여, 생장하고 있는 하이브리도마의 조정 배지를 IGFBP-4 특이적 항체에 대하여 스크리닝하였다. 온전한 IGFBP-4에 특이적인 항체들을 생산하는 하이브리도마를, 간접적 ELISA로 선별하였다. 분석을 위하여, 웰당 전장 인간 재조합 IGFBP-4 50 ng/0.1 ml PBS를 면역 분석 폴리스티렌 플레이트 상에 흡착시켰다. 반응 40 분 후, 플레이트를 2회 수세하고 계면활성제 Tween20, 0.1%을 함유하는 PBS (PBST)로 10 분간 블로킹하였다. 그 후, 플레이트를 생장 중인 하이브리도마를 포함하는 웰로부터 수집한 조정 배지 0.05 ml와 함께 30 분간 반응시켰다. 반응 후, 플레이트를 PBST로 2회 수세하였다. 수세 후, 플레이트들을 웰당 2차 항-마우스 IgG 폴리클로날 항체 0.1 ml (PBST 내에서 1:1000 희석)과 30 분간 반응시켰는데, 이 항체는 HRP와 컨쥬게이션되어 있는 것이다. 2차 항체들과의 반응 후, 플레이트를 PBST로 6회 수세하고, TMB와 0.03% 과산화수소를 함유하는 퍼옥시다아제 기질을 첨가하였다. 0.1 ml의 0.5 M 인산을 첨가하여 15 분 후 반응을 종료시키고 450 nm에서 웰의 흡광도를 측정하였다. 전장 IGFBP-4에 특이적인 항체들을 생산하는 하이브리도마 (전술한 조건, 450 nm에서 백그라운드를 초과한 흡광도 >0.5)를 제한 희석으로 클로닝하였다. 목적하는 모노클로날 항체를 분비하는 하이브리도마 클론들을 10% 페탈 보바인 세럼을 함유하는 DMEM에서 배양하였다.
항체의 친화 정제
선별된 하이브리도마 클론들을 복강 내 주입한 후, 마우스의 복수액에서 전장 IGFBP-4에 특이적인 모노클로날 항체들을 배양하였다. 단백질 A 친화 크로마토그래피를 이용하여 복수액으로부터 항체를 정제하였다. 수지는 GE Healthcare Life Sciences (Piscataway, NJ)로부터 구득하였고, 정제를 제조자의 지침에 따라 수행하였다. 정제된 모노클로날 항체들을 4℃, 50% 암모늄 술페이트에서 현탁하여 보관하였다. 온전한 (전장) IGFBP-4에 특이적인 모노클로날 항체들의 그룹을 최종 선별하였다: IBP17, IBP180, IBP181, IBP153, IBP154, IBP152, IBP156, IBP144, IBP190, IBP182, IBP185, IBP186, IBP187 (도 2).
실시예 3. IGFBP-4 단편들의 정량을 위한 샌드위치 면역분석법의 설계
또한, 친화 정제된 모노클로날 항체들의 특이성을 샌드위치 면역분석법으로 확인하였다 (도 3). 요구되는 성질과의 조합을 찾기 위하여 몇 가지 그룹의 특이적 항체들이 샌드위치 면역분석법에서 시험되었다. 온전한 (전장) IGFBP-4의 존재와 무관하게 IGFBP-4 단백질 분해 단편들의 특이적 측정을 위한 샌드위치 면역분석법을 개발하기 위하여, 온전한 (전장) IGFBP-4에 특이적인 모노클로날 항체들을 이용하여 단백질 분해 네오-에피토프에 특이적인 모노클로날 항체들을 시험하였다. IGFBP-4의 단백질 분해 단편 (N-말단 또는 C-말단; 간접적 ELISA에서 전장 분자와의 교차 반응이 5% 미만)에 특이적인 하나의 모노클로날 항체와, 온전한 IGFBP-4의 임의의 에피토프를 인식하는 또 다른 MAb를 이용하는 몇 가지 샌드위치 분석법들이 개발되었다. 온전한 IGFBP-4의 임의의 에피토프에 특이적인 마우스 모노클로날 항체들의 생성은 실시예 2에 기술되어 있다. 샌드위치 형광 면역분석법을 수행하기 위하여, 안정한 Eu3 + 킬레이트로 표지한 검출 MAbs가 사용되고, 이는 Hyytiaet al., 2010에 기술된 바와 같다. 이 분석법에서 캡쳐 항체들은 온전한 IGFBP-4에 특이적인 반면, 검출 항체들은 IGFBP-4의 단백질 분해 네오-에피토프에 특이적이었다. 웰당 100 μl의 인산염 완충 염용액 중의 2 μg의 캡쳐 항체들 (IBP3, IBP18, IBP185, IBP182)을 일정하게 교반하면서 실온에서 30 분간 96-웰 면역분석 플레이트에서 반응시켰다. 플레이트를, 0.15 M NaCl, 0.025 % Tween 20 및 0.5 g/L NaN3로 보충된 10 mM Tris-HCl (pH 7.8) 완충액 (완충액 A)으로 수세하였다. 수세 후, 100 ng/ml의 전장 인간 재조합 IGFBP-4 또는 재조합 IGFBP-4 단편들을 함유하는 0.1 ml의 분석 완충액 (50 mM Tris-HCl 완충액, pH 7.7, 9 g/L NaCl, 0.01 % Tween 40, 0.5% BSA 및 0.5 g/L NaN3)을 플레이트에 첨가하였다. 플레이트를 일정하게 교반하면서 실온에서 30 분간 반응시켰다. 완충액 A로 수세한 후, 분석 완충액 중의 검출 항체들 (IBP144, IBP180, IBP177, IBP163 및 IBP162)의 용액 (1 mg/L) 0.1 ml을 첨가하였다. 플레이트를 일정하게 교반하면서 실온에서 30 분간 반응시켰다. 완충액 A로 수세한 후, 웰당 강화 용액 (1.75M NaSCN, 1M NaCl, 5% 글리세롤, 20% 1-프로판올, 5mM Na2CO3, 50mM 글리신-NaOH, pH 10.0) 0.2 ml을 첨가하고 부드럽게 교반하면서 실온에서 30 분간 반응시켰다. Victor 1420 다표지 계수기 (Wallac-Perkin Elmer) 상에서 Eu3 +의 형광을 측정하였다. 형광은 초당 수치 (CPS)로 표현되었다. 개발된 샌드위치 면역분석법은 오로지 PAPP-A-의존성 분해에 의하여 생성된 IGFBP-4 단편만을 검출할 수 있었고, 전장 IGFBP-4와의 교차 반응은 없었다 (또는 1% 미만). NT-IGFBP-4에 특이적인 최상의 쌍은 IBP3-IBP144 (도 3A)였고, CT-IGFBP-4에 특이적인 최상의 쌍은 IBP182-IBP163 (도 3B)였다. NT-IGFBP-4에 특이적인 샌드위치 면역분석법을 위하여, IGFBP-4의 단백질 분해 단편에 특이적인 모노클로날 항체들이 캡쳐 항체로 사용되었고, 온전한 IGFBP-4에 특이적인 모노클로날 항체들이 검출 항체로 사용되었으나, CT-IGFBP-4 면역분석법에서는 반대의 배향이 사용되었다.
실시예 4. 온전한 (전장) IGFBP-4의 정량을 위한 샌드위치 면역분석법의 설계
IGFBP-4 단편들의 존재하의 전장 IGFBP-4의 정량은 단백질의 N-말단 도메인에 특이적인 하나의 모노클로날 항체와, 온전한 IGFBP-4의 C-말단 도메인 상의 에피토프를 인식하는 다른 MAb를 이용하는 특이적 샌드위치 면역분석법을 이용함으로써 이루어질 수 있다. 전장 IGFBP-4에 특이적인 마우스 모노클로날 항체들의 생성은 실시예 2에 개시되어 있다. 샌드위치 형광 면역분석법을 수행하기 위하여 실시예 3에 기술된 방법을 사용하였다. 이 분석법에서 캡쳐 항체들은 온전한 IGFBP-4 (IBP182, IBP186, IBP185, IBP187)의 C-말단 부위에 특이적이었다. 이 분석법에서 검출 항체는 전장 IGFBP-4 (IBP154, IBP180, IBP181, IBP153 및 IBP156)의 N-말단에 특이적이었다. 개발된 샌드위치 면역분석법들은 오로지 전장 IGFBP-4만을 검출할 수 있었고 PAPP-A-의존성 분해에 의하여 생성된 단편들과는 어떠한 교차 반응도 없었다 (또는 1% 미만). 최상의 쌍은 IBP185-IBP180 및 IBP185-IBP154였다 (도 4).
실시예 5. 총IGFBP-4의 정량을 위한 샌드위치 면역분석법의 설계
총IGFBP의 양을 검출하기 위한 면역분석법을 개발하기 위하여 IGFBP-4의 두 가지 형태 모두 (전장 및 단편들)에 특이적인 모노클로날 항체를 사용하였다. 이러한 형태의 면역분석법에 있어서는 양자의 단백질 형태 모두에 대하여: 즉, 온전한 단백질 및 단백질 분해된 단백질에 대하여 동일하게 특이적인 것이 중요하다 (도 5). 두 가지 유형의 이러한 샌드위치 면역분석법이 설계될 수 있다: (1) 전체 크기 IGFBP-4와 CT-IGFBP-4 단편 두 가지 모두를 검출하기 위한 것 (IGFBP-4의 C-말단 부위의 에피토프를 인식하는 2개의 모노클로날 항체를 이용) 및 (2) 전체 크기 IGFBP-4와 NT-IGFBP-4 단편 두 가지 모두를 검출하기 위한 것 (IGFBP-4의 N-말단 부위의 에피토프를 인식하는 2개의 모노클로날 항체를 이용).
온전한 IGFBP-4에 특이적인 마우스 모노클로날 항체들의 생성은 실시예 2에 개시되어 있다. 샌드위치 형광 면역분석법을 수행하기 위하여 실시예 3에 기술된 방법을 사용하였다. 이 분석법에서 캡쳐 항체들은 온전한 IGFBP-4 (IBP182, IBP186, IBP185, IBP187 및 IBP190)의 C-말단 부위에 특이적이었다. 이 분석법에서 검출 항체는 온전한 IGFBP-4 (IBP154, IBP180, IBP181, IBP153, IBP156 및 IBP17)의 N-말단에 특이적이었다. 개발된 샌드위치 면역분석법들은 총IGFBP-4를 검출할 수 있었고 PAPP-A-의존성 분해에 의하여 생성된 단편들 또는 온전한 IGFBP-4와 어떠한 차이도 없었다 (또는 매우 낮음 - 10% 미만). 최상의 쌍은 IBP185-IBP190 및 IBP17-IBP180 (각각, 도 5A 및 5B)였다.
실시예 6. 동맥경화형 PAPP-A의 단백질 분해 활성
인간의 동맥경화 관상 혈관 시료들을 사용시까지 -70℃에 보관하였다. 조직 균질화 후 동맥경화 관상 동맥들로부터 PAPP-A를 추출하였다. 추출된 PAPP-A는 친화 크로마토그래피 방법으로 정제되었다. PAPP-A 정제에 사용된 친화 기질은 PAPP-A-특이적 모노클로날 항체 4G11 (HyTest, Turku, Finland로부터 구득)를 이용하여 제조되었다. 정제된 단백질이 PAPP-A인지 확인하기 위하여, 몇 가지 PAPP-A-특이적 모노클로날 항체들을 이용한 웨스턴 블롯과 액체 크로마토그래피/탠덤 질량 분광 분석을 사용하였다.
동맥경화 PAPP-A의 단백질 분해 활성을 분석하기 위하여, 2 μg의 인간 재조합 IGFBP-4를 2 mM CaCl2, 1.8 μg IGF-II (Sigma Chemicals, St. Louise, Mo.로부터 구득), 40 ng의 동맥경화 PAPP-A, 및 2 μl의 단백질 분해 효소 억제제 칵테일 (Sigma Chemicals, St. Louise, Mo로부터 구득)의 존재 하에서 0.23 ml의 50mM Tris-HCl, pH 7.5에서 반응시켰다. 37℃, 15 시간 동안 반응을 수행하였고 시료를 -20℃에서 동결시킴으로써 반응을 종료하였다. IGFBP-4의 PAPP-A-의존성 분해의 정도를 IGFBP-4-특이적 래빗 폴리클로날 항체 (Abcam, Cambridge, MA로부터 구득)를 이용한 웨스턴 블롯으로 측정하였다 (도 6).
실시예 7. 건강한 기증자와 진단된 AMI 환자들의 혈장 시료에서의 IGFBP-4 단편들의 측정
ACS의 혈장 시료들 중 IGFBP-4의 단백질 분해 단편들의 검출을 단백질 분해 단편들에 특이적인 샌드위치 면역분석법을 이용하여 수행하였다. ACS 환자들 43명의 혈액 (심전도상 ST-분절 상승이 있음) 뿐 아니라 54명의 건강한 기증자들의 혈장 시료를 단편-특이적 샌드위치 면역분석법 IBP3-IBP144 (N-단편에 특이적) 및 IBP182-IBP163 (C-단편에 특이적)으로 시험하였다. 환자들로부터의 모든 혈장 시료는 EDTA의 존재하에 수집되었고 측정 전에는 -70℃에서 보관되었다.
샌드위치 면역분석법을 위하여, 웰당 0.1 ml 인산 완충액 중의 캡쳐 항체 IBP3 및 IBP182 2 μg을 일정하게 교반하면서 실온에서 30 분간 96-웰 면역분석 플레이트에서 반응시켰다. 완충액 A로 수세한 후, 분석 완충액으로 1:5 희석한 환자들의 혈장 시료 0.1 ml을 플레이트에 첨가하였다. 플레이트를 일정하게 교반하면서 실온에서 30 분간 반응시켰다. 완충액 A로 수세한 후, 안정한 Eu3 + 킬레이트와 컨쥬게이션된 분석 완충액 중의 검출 항체 IBP144 또는 IBP163 0.1 ml을 첨가하였다. 플레이트를 일정하게 교반하면서 실온에서 30 분간 반응시켰다. 완충액 A로 수세한 후, 웰당 강화 용액 0.2 ml을 첨가하고 부드럽게 교반하면서 실온에서 3 분간 반응시켰다. Eu3 +의 형광을 Victor 1420 다표지 계수기 (Wallac-Perkin Elmer)를 이용하여 측정하였다. ACS 환자들의 혈장에서의 IGFBP-4 단편들의 수준은 건강한 기증자들의 혈장에서보다 5.1 배 및 2.7배 높았다 (양자 모두 p<0.0005) (도 7). 평균값±표준편차는 도에 나타나 있다. 형광은 초당 수치 (CPS)로 표현되었다. 단편들 중 눈에 띄는 증가는 IBP3-IBP144 및 IBP182-IBP163 샌드위치 쌍을 이용하여 밝혀졌다 (도 7).
실시예 8. IGFBP-4 단백질 분해 단편에 특이적인 샌드위치 면역분석법을 이용한, 주요 유해 심장 사건 예측을 위한 IGFBP-4 단편들에 대한 추적 연구
이 연구를 위하여 응급실에 들어온 시점에 흉통/조임을 느끼는 환자들로부터 시료를 얻었다.
환자들은 숙련된 심장전문의에 의하여 분류된 심장병 유형의 특이적 흉통으로 주로 표현되는 허혈 증상을 보인다면 연구에 포함될 수 있었다. 166명의 환자들이 이 연구에 포함되었다. 환자들의 정맥 혈액을 K3EDTA-함유 배큐엣 튜브 (Vacuette tubes) (Greiner Bio-One)로 수집하여 3000 g, 4 ℃에서 15 분간 원심분리하였다. 혈장 시료들을 -70℃에 보관하였다. 모든 환자들은 연구 시작일 (환자들이 모두 베이스라인 평가치에 있는 시점)로부터 장래로 6 개월 또는 사망시까지 추적되었다. 등록된 1차 엔드포인트는 비치명적 심근 경색, 심장사를 포함하는 주요 유해 심장 사건 (MACE)을 포함하였다. 복합적 엔드포인트는 MACE 및 모든 원인으로 인한 죽음 (MACEACD)를 포함하였다. 총 166명의 환자들에 대하여 추적조사가 완료되었다 (100%). 17건의 MACE 케이스와 31건의 MACEACD 케이스가 있었다.
NT-, CT-IGFBP-4, 전장 IGFBP-4의 예측치 및 이들의 비를 조사하기 위하여 ROC 곡선 분석이 이루어졌다. 6 개월 시점의 MACE 엔드포인트는 목적 사건이었다. NT- 및 CT-IGFBP-4 컷-오프는 수신자 운용 곡선 (receiver operator curve, ROC)으로부터 도출되고 감도 및 특이성의 최상의 조합을 나타내는 값으로서 정의된다.
본 발명에서, 급성 흉통 환자들의 혈장 시료 중 IGFBP-4 단백질 분해 단편들의 검출은 단백질 분해 단편들에 특이적인 샌드위치 면역분석법을 이용하여 수행되었다. 166명의 환자들의 혈액을 단편-특이적 샌드위치 면역분석법 IBP3-IBP144 (NT-IGFBP-4에 대한 것) 및 IBP182-IBP163 (CT-IGFBP-4에 대한 것)으로 시험하였다.
샌드위치 면역분석법 측정을 위하여, 웰당 0.1 ml 인산 완충액 중의 캡쳐 항체 IBP3 및 IBP182 2 μg을 일정하게 교반하면서 실온에서 30 분간 96-웰 면역분석 플레이트에서 반응시켰다. 완충액 A로 수세한 후, 분석 완충액으로 1:5 희석한 환자들의 혈장 시료 0.1 ml을 플레이트에 첨가하였다. 플레이트를 일정하게 교반하면서 실온에서 30 분간 반응시켰다. 완충액 A로 수세한 후, 분석 완충액 중의 검출 항체 IBP144 또는 IBP163 0.1 ml을 첨가하였다. 플레이트를 일정하게 교반하면서 실온에서 30 분간 반응시켰다. 완충액 A로 수세한 후, 웰당 강화 용액 0.2 ml을 첨가하고 부드럽게 교반하면서 실온에서 3 분간 반응시켰다. Eu3 +의 형광을 Victor 1420 다표지 계수기 (Wallac-Perkin Elmer)를 이용하여 측정하였다.
NT- 및 CT-IGFBP-4 농도는 각각 7~2553 및 12~564 μg/L의 범위였다. 6 개월 시점에 MACE를 예측하는 NT- 및 CT-IGFBP-4의 능력 및 이들의 비율을 ROC 분석으로 조사하였다 (도 8). NT- 및 CT-IGFBP-4 분석에서 ROC 곡선하 면적 (ROC AUC)의 결과는 각각 0.861 (P<0.001) 및 0.800 (P<0.001)였고, 이것은 MACE의 강력한 예측자로서의 NT 및 CT-IGFBP-4를 보여준다 (도 8A). 또한, NT- 및 CT-IGFBP-4는 MACEACD의 강력한 예측자였다: 각각 ROC AUC 0.814 (P<0.001) 및 0.803 (P<0.001), (도 8B). 본 연구의 컷-오프 값은 NT-IGFBP-4에 대하여 214 μg/L로, CT-IGFBP-4에 대하여 124 μg/L로 추정되었다.
NT- 및 CT-IGFBP-4 양자 모두는 6 개월의 추적 시점에 급성 흉통 환자에서 MACE 및 MACEACD의 강력한 예측자로 보인다 (도 8).
이 콜렉션으로부터 무작위로 선택된 114개의 시료에 대하여 심장 트로포닌 I을 측정하였다. 콜렉션의 이 일부분은 추적 6 개월 후 10개의 MACE 케이스를 포함하였다. 콜렉션의 이러한 일부에서 심장 트로포닌 I에 대한 ROC AUC 결과는 0.686 (P=0.053)였고 CT-IGFBP-4에 대하여는 0.8 (P=0.002)이었다. 심장 트로포닌 I 및 CT-IGFBP-4 양자 모두에 근거한 조합 모델의 예측 능력은 ROC AUC 0.848 (P<0.001)로서, 개별적인 바이오마커들을 넘어선 강력한 예측자로서의 트로포닌 I 및 CT-IGFBP-4 조합 모델의 부가 가치를 나타내었다.
실시예 9. 차등적 샌드위치 면역분석법을 이용한, 주요 유해 심장 사건용 IGFBP-4 단편들의 추적 연구
이 연구를 위하여, 실시예 8에 기술된 혈액 시료 콜렉션 중 일부를 사용하였다. 이 무작위로 선택된 일부는 66명의 환자를 포함하였다. 6 개월 간의 추적 기간 중 콜렉션의 이 일부에서 6건의 MACE 케이스가 등록되었다.
급성 흉통 환자들의 혈장 시료 중 IGFBP-4의 단백질 분해 단편의 검출은 총IGFBP-4 IBP17-IBP180 및 IBP185-IBP190에 특이적인 샌드위치 면역분석법 및 전장 IGFBP-4 IBP185-IBP180 및 IBP185-IBP154에 특이적인 면역분석법을 이용하여 수행되었다. 실시예 8에 기술된 대로 샌드위치 면역분석법 측정을 수행하였다.
이 연구 집단의 중앙 (median) 전장 IGFBP-4 농도 (사분범위)는 822 (652~1013) μg/L, 농도 범위는 441~1865 μg/L였다. CT-특이적 분석 및 NT-특이적 분석에 의하여 측정된 총IGFBP-4 농도의 농도 범위는 각각 159~1124 및 46~1968 μg/L였다. NT-IGFBP-4 단편의 양은 총IGFBP-4의 양 (전장 및 NT-IGFBP-4 단편들 분석, IBP17-IBP180)과 전장 IGFBP-4의 양의 차이로 계산되었다. CT-IGFBP-4 단편의 양은 총IGFBP-4의 양 (전장 및 CT-IGFBP-4 단편들 분석, IBP185-IBP190)과 전장 IGFBP-4의 양의 차이로 계산되었다.
NT- 및 CT-IGFBP-4 분석의 ROC AUC 결과는 각각 0.77 (P<0.01) 및 0.8 (P<0.01)였고, MACE의 강력한 예측자들로서의 NT 및 CT-IGFBP-4를 보여준다 (도 9). 차등적 분석에 의하여 측정된 NT- 및 CT-IGFBP-4의 6 개월 시점에 MACE를 예측하는 능력은 ROC 분석에 의하여 조사되었다 (각각, 도 9A 및 9B).
실시예 10. IGFBP-5의 신규 단백질 분해 매개 에피토프에 특이적인 마우스 모노클로날 항체의 생성
마우스의 면역화를 위한 합성 펩타이드:
IGFBP-5 펩타이드-4: CKAEAVKKDRRKKLTQS
IGFBP-5 펩타이드-4를 전술한 바와 같이 고상 Fmoc 화학을 이용하여 합성하였다. IGFBP-5 펩타이드-4는 IGFBP-5 단편 128~143의 아미노산 서열과 동일하였고 N-말단에 추가의 시스테인 잔기를 하나 더 함유하였다. 펩타이드의 캐리어 단백질 (BSA 및 오브알부민)과의 컨쥬게이트 제조는 전술한 술포-SMCC를 이용하여 수행되었다.
펩타이드
-(
캐리어
단백질)
컨쥬게이트를
이용한 마우스 면역화
12 마리 BALB/c 마우스를 펩타이드-단백질 컨쥬게이트로 5 회 면역화하였다. 제1 면역화: 60% 프로운트 컴플리트 아쥬반트를 함유하는 PBS 중의 10 μg BSA-IGFBP-5-펩타이드-4를 복강내로 0.2 ml; 제2 면역화: 제30일에, 60% 프로운트 인컴플리트 아쥬반트를 함유하는 PBS 중의 5 μg BSA-IGFBP-5-펩타이드-4를 복강내로 0.2 ml; 제3 면역화: 제60일에, PBS 중의 2.5 μg BSA-IGFBP-5-펩타이드-4를 복강내로 0.2 ml.
제3 면역화로부터 20일 후, 최종 면역화 및 혼성화를 위하여 펩타이드 특이적 항체 타이터가 가장 높은 마우스들을 선별하였다. PBS 중의 10 μg BSA-IGFBP-5-펩타이드-4 0.2 ml을 마우스의 정맥 내 주사하였다. 정맥 내 주사를, 다음날 동일한 프로토콜로 반복하였다 (제5 면역화). 그 후, 제5 면역화로부터 2일 후, 면역화된 마우스의 비장을 살균 분리하여 종래 설명하는 바와 같이 (Kohler and Milstein, 1975, 1976; Kohler et al ., 1976; Hammerling et al., 1981) 균질화된 조직을 마우스 골수 세포주 sp2/0와 융합하였다.
효소 결합 면역 흡착 분석 (ELISA)으로, 생장하고 있는 하이브리도마의 조정 배지를 항체에 대하여 스크리닝하였다. BSA-IGFBP-5-펩타이드-4에 특이적인 항체들을 생산하는 하이브리도마를, 미리 흡착된 항원으로서 사용되는 오브알부민-IGFBP-5-펩타이드-4 각각을 이용하여 ELISA로 선별하였다. 추가적인 시험에서는 HEK 293F 세포들에서 발현된 인간의 재조합 IGFBP-5 역시 미리 흡착된 항원으로 사용되었다. 분석을 위하여, 웰당 오브알부민-IGFBP-5-펩타이드-4, 또는 인간 재조합 IGFBP-5 50 ng/0.1 ml PBS를 면역 분석 폴리스티렌 플레이트 (Corning, Cambridge, MA로부터 구득) 상에 흡착시켰다. 항원 흡착 40 분 후, 플레이트를 2회 수세하고 계면활성제 Tween20, 0.1%을 함유하는 PBS (PBST)로 10 분간 블로킹하였다. 그 후, 플레이트를 생장 중인 하이브리도마로부터 수집한 조정 배지 0.05 ml로 30 분간 반응시키고 PBST로 2회 수세하였다. 미리 흡착된 항원에 결합된 마우스 항체들은, 웰당 1:1000으로 PBST에 희석된 0.1 ml의 2차 항-마우스 IgG 폴리클로날 항체와의 30 분간의 반응을 통하여 밝혀졌는데, 이 항체는 HRP와 컨쥬게이션된 것이다. 2차 항체들은 Sigma Chemicals, St. Louise, Mo로부터 구득하였다. 2차 항체들과의 반응 후, 플레이트를 PBST로 6회 수세하고, 0.03% 과산화수소를 함유하는 3,3',5,5'-테트라메틸 벤지딘 (TMB) 퍼옥시다아제 기질을 첨가하였다. 0.1 ml의 0.5 M 인산을 첨가하여 15 분 후 반응을 종료시키고 450 nm에서 웰의 흡광도를 측정하였다. 흡광도 측정은 Labsystems Multiscan 마이크로플레이트 리더 (Labsystems, Finland)를 이용하여 수행되었다.
추가 작업을 위하여 오브알부민과 컨쥬게이션된 적절한 펩타이드에 특이적인 동시에 (전술한 조건, 450 nm에서 백그라운드를 초과한 흡광도 >0.5) 인간 재조합 IGFBP-5와는 반응하지 않는 (450 nm에서 백그라운드를 초과한 흡광도 <0.025) 항체를 생산하는 하이브리도마를 선별하였다. 제한 희석으로 이러한 하이브리도마를 클로닝하였다. 목적하는 모노클로날 항체를 분비하는 하이브리도마 클론들을 10% 페탈 보바인 세럼 (HyClone Laboratories, Logan, UT)을 함유하는 Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM)에서 배양하였다.
항체들의 생산과 친화 정제는 전술한 바와 같이 수행되었다.
모노클로날
항체의 특이성 조사
선별된 모노클로날 항체들의 특이성을 확인하기 위하여, IGFBP-5 단백질 분해 단편들을 얻었다. PAPP-A-의존성 단백질 분해 반응을 하기 조건에 따라 수행하였다.
2mM CaCl2. 120ng의 인간 재조합 PAPP-A (HyTest, Turku, Finland), 및 0.5 μl 단백질 분해 효소 억제제 칵테일 (Sigma Chemicals, St. Louise, Mo로부터 구득)의 존재 하에서 12 μg의 인간 재조합 IGFBP-5를 0.12 ml의 50 mM Tris-HCl, pH 7.5에서 반응시켰다. 이 반응을 37℃에서 40 분 수행하고 시료를 -70℃에서 동결시킴으로써 종료시켰다. IGFBP-5의 PAPP-A-의존성 분해 정도를 소듐 도데실 술페이트 폴리아크릴아미드 겔 전기영동과 그 후 쿠마시 블루 R-250 염색으로 결정하였다 (도 10). 선별된 모노클로날 항체들의 IGFBP-4 단백질 분해 단편들에 대한 특이성 연구는 친화 정제 항체를 이용, 간접적 ELISA로 수행되었다. 전장 재조합 IGFBP-5 또는 PAPP-A-의존성 분해에 의하여 생성된 IGFBP-5 단편들 (전술한 바와 같이 제조) 10 ng을 폴리스티렌 플레이트에 흡착시켰다. 40 분의 반응 후, 플레이트를 2회 수세하고 계면활성제 Tween 20, 0.1%를 함유하는 PBS (PBST)로 10 분간 블로킹하였다. 선별된 MAbs (10 μg/ml)를 교반하면서 실온에서 30 분간 반응시키고, 그 후 PBST로 2회 수세하였다. 특이적으로 결합된 항체들은 웰당 1:1000으로 PBST에 희석된 0.1 ml의 항-마우스 IgG 폴리클로날 항체로 검출되었는데, 상기 항체는 HRP와 컨쥬게이션되어 있는 것이다. 2차 항체들은 Sigma Chemicals, St. Louise, Mo로부터 구득되었다. 2차 항체들과의 반응 후, 플레이트를 PBST로 6회 수세하고, 퍼옥시다아제 기질을 함유하고 0.03% 과산화수소로 보충된 3,3',5,5'-테트라메틸 벤지딘 (TMB)을 첨가하였다. 0.1 ml의 0.5 M 인산을 첨가하여 15 분 후 반응을 종료시키고 450 nm에서 흡광도를 측정하였다. PAPP-A-의존성 분해로 생성된 IGFBP-5의 단백질 분해 단편들에 특이적이고, 온전한 IGFBP-5와 5% 미만의 교차 반응성을 갖는 하나의 모노클로날 항체가 최종적으로 선별되었다: IBPF72 (도 2). IBPF72는 IgG 아이소 타입이었다.
실시예 11. 온전한 IGFBP-5에 특이적인 마우스 모노클로날 항체의 생성
마우스의 면역화를 위한 합성 펩타이드:
IGFBP-5 펩타이드-2: CLNEKSYREQVKIERDSREHE
IGFBP-5 펩타이드-2를 전술한 바와 같이 고상 Fmoc 화학을 이용하여 합성하였다.
IGFBP-5 펩타이드-2는 IGFBP-5 단편 80~100의 아미노산 서열과 동일하였다. 펩타이드의 캐리어 단백질 (BSA)과의 컨쥬게이트 제조는 전술한 술포-SMCC를 이용하여 수행되었다.
펩타이드-(캐리어 단백질) 컨쥬게이트를 이용한 마우스 면역화. 12 마리 BALB/c 마우스를 펩타이드-단백질 컨쥬게이트로 5 회 면역화하였다. 제1 면역화: 60% 프로운트 컴플리트 아쥬반트를 함유하는 PBS 중의 10 μg BSA-IGFBP-5-펩타이드-2를 복강내로 0.2 ml; 제2 면역화: 제30일에, 60% 프로운트 인컴플리트 아쥬반트를 함유하는 PBS 중의 5 μg BSA-IGFBP-5-펩타이드-2를 복강내로 0.2 ml; 제3 면역화: 제60일에, PBS 중의 2.5 μg BSA-IGFBP-5-펩타이드-2를 복강내로 0.2 ml.
제3 면역화로부터 20일 후, 최종 면역화 및 혼성화를 위하여 펩타이드 특이적 항체 타이터가 가장 높은 마우스들을 선별하였다. PBS 중의 10 μg BSA-IGFBP-5-펩타이드-2 0.2 ml을 마우스의 정맥 내 주사하였다. 정맥 내 주사를, 다음날 동일한 프로토콜로 반복하였다 (제5 면역화). 그 후, 제5 면역화로부터 2일 후, 면역화된 마우스의 비장을 살균 분리하여 종래 설명하는 바와 같이 (Kohler and Milstein, 1975, 1976; Kohler et al ., 1976; Hammerling et al., 1981) 균질화된 조직을 마우스 골수 세포주 sp2/0와 융합하였다.
ELISA로, 생장하고 있는 하이브리도마의 조정 배지를 IGFBP-5-특이적 항체에 대하여 스크리닝하였다. 온전한 IGFBP-5에 특이적 항체들을 생산하는 하이브리도마를 간접적 ELISA 방법으로 선별하였다. 분석을 위하여, 웰당 전장 인간 재조합 IGFBP-5 50 ng/0.1 ml PBS를 면역 분석 폴리스티렌 플레이트 상에 흡착시켰다. 40 분 후, 플레이트를 2회 수세하고 계면활성제 Tween20, 0.1%을 함유하는 PBS (PBST)로 10 분간 블로킹하였다. 그 후, 플레이트를 생장 중인 하이브리도마로부터 수집한 조정 배지 0.05 ml로 30 분간 반응시켰다. 반응 후, 플레이트를 PBST로 2회 수세하였다. 수세 후, 플레이트들을 웰당 1:1000으로 PBST에 희석된 0.1 ml의 2차 항-마우스 IgG 폴리클로날 항체와 30 분간 반응시켰고, 이 항체는 HRP와 컨쥬게이션된 것이다. 2차 항체들과의 반응 후, 플레이트를 PBST로 6회 수세하고, TMB와 0.03% 과산화수소를 함유하는 퍼옥시다아제 기질을 첨가하였다. 0.1 ml의 0.5 M 인산을 첨가하여 15 분 후 반응을 종료시키고 450 nm에서 웰의 흡광도를 측정하였다. 전장 IGFBP-5에 특이적인 항체들을 생산하는 하이브리도마 (전술한 조건, 450 nm에서 백그라운드를 초과한 흡광도 >0.5)를 제한 희석 방법으로 클로닝하였다. 목적하는 모노클로날 항체들을 분비하는 하이브리도마 클론들을 10% 페탈 보바인 세럼을 함유하는 DMEM에서 배양하였다.
전술한 바와 같이 항체들의 생산 및 친화 정제를 수행하였다. 온전한 IGFBP-5에 특이적인 모노클로날 항체의 그룹들이 최종적으로 선별되었다: IBPF15, IBPF16.
실시예 12. IGFBP-5 단편들의 정량을 위한 샌드위치 면역분석법의 설계
또한, 친화 정제된 모노클로날 항체들의 특이성을 샌드위치 면역분석법으로 확인하였다 (도 11). 온전한 (전장) IGFBP-5의 존재와 무관하게 NT-IGFBP-5의 특이적 측정을 위한 샌드위치 면역분석법을 개발하기 위하여, 온전한 (전장) IGFBP-5에 특이적인 모노클로날 항체들을 이용하여 IBPF72를 시험하였다. IGFBP-5의 N-말단 단백질 분해 단편 (간접적 ELISA에서 전장 분자와의 교차 반응이 5% 미만)에 특이적인 IBPF72 모노클로날 항체와, 온전한 IGFBP-5를 인식하는 또 다른 MAb를 이용하는 두 가지 샌드위치 분석법이 개발되었다. 샌드위치 형광 면역분석법을 수행하기 위하여, Hyytiaet al., 2010에 기술된 바와 같이 안정한 Eu3 + 킬레이트로 표지한 검출 MAbs를 사용하였다. 이 분석법에서 캡쳐 항체들은 온전한 IGFBP-5에 특이적인 반면, 검출 항체들은 IGFBP-5의 단백질 분해 네오-에피토프에 특이적이었다. 웰당 100 μl의 인산염 완충 염용액 중의 1.5 μg의 캡쳐 항체들 (IBPF15 또는 IBPF16)을 일정하게 교반하면서 실온에서 30 분간 96-웰 면역분석 플레이트에서 반응시켰다. 플레이트를, 0.15 M NaCl, 0.025 % Tween 20 및 0.5 g/L NaN3로 보충된 10 mM Tris-HCl (pH 7.8) 완충액 (완충액 A)으로 수세하였다. 수세 후, 여러 가지 농도의 전장 인간 재조합 IGFBP-5 또는 재조합 NT-IGFBP-5 단편을 함유하는 0.05 ml의 분석 완충액 (50 mM Tris-HCl 완충액, pH 7.7, 9 g/L NaCl, 0.01 % Tween 40, 0.5% BSA 및 0.5 g/L NaN3)과, 0.05 ml의 분석 완충액 중의 검출 항체 (IBPF72) 용액을 플레이트에 첨가하였다. 플레이트를 일정하게 교반하면서 실온에서 30 분간 반응시켰다. 완충액 A로 수세한 후, 웰당 강화 용액 (1.75M NaSCN, 1M NaCl, 5% 글리세롤, 20% 1-프로판올, 5mM Na2CO3, 50mM 글리신-NaOH, pH 10.0) 0.2 ml을 첨가하고 부드럽게 교반하면서 실온에서 3 분간 반응시켰다. Victor 1420 다표지 계수기 (Wallac-Perkin Elmer) 상에서 Eu3 +의 형광을 측정하였다. 형광은 초당 수치 (CPS)로 표현되었다. 개발된 샌드위치 면역분석법은 오로지 PAPP-A-의존성 분해에 의하여 생성된 NT-IGFBP-5 단편 (또는 재조합 IGFBP-4의 N-말단 단편)만을 검출할 수 있었고, 전장 IGFBP-5와의 교차 반응은 없었다 (또는 5% 미만). NT-IGFBP-5에 특이적인 2개의 쌍은 IBPF15-IBPF72 및 IBPF16-IBPF72였다 (각각, 도 11A 및 11B).
실시예 13. NT-IGFBP-5에 특이적인 샌드위치 면역분석법을 이용한, 주요 유해 심장 사건 예측을 위한 NT-IGFBP-5에 대한 추적 연구
응급실에 들어온 흉통/조임을 느끼는 환자들이 이 연구에 포함되었다. 또한, 불안정 협심증이나 허혈성 심질환으로 진단된 환자들도 포함되었다.
276명의 환자들이 이 연구에 포함되었다. 환자들의 정맥 혈액을 K3EDTA-함유 배큐엣 튜브 (Vacuette tubes) (Greiner Bio-One)로 수집하여 3000 g, 4 ℃에서 15 분간 원심분리하였다. 혈장 시료들을 -70℃에 보관하였다. 모든 환자들은 연구 시작일 (환자들이 모두 베이스라인 평가치에 있는 시점)로부터 장래로 6 개월 또는 사망시까지 추적되었다. 등록된 1차 엔드포인트는 비치명적 심근 경색, 심장사를 포함하는 주요 유해 심장 사건 (MACE)을 포함하였다. 추적 정보를 갖는 환자들만이 이 연구에 포함되었다. 추적 중, 24건의 MACE 엔드포인트가 있었다.
MACE 케이스의 환자들 뿐 아니라 MACE 케이스가 없는 환자들 그룹으로부터 무작위 선택된 24명을 포함한 모든 시료에서 IBPF15-IBPF72 및 IBPF16-IBPF72에 의하여 NT-IGFBP-5의 농도가 측정되었다. NT-IGFBP-5의 예측치를 조사하기 위하여 ROC 곡선 분석이 수행되었다.
샌드위치 면역분석법 측정을 위하여, 웰당 0.1 ml 인산 완충액 중의 캡쳐 항체 IBPF15 또는 IBPF16 1.5 μg을 일정하게 교반하면서 실온에서 30 분간 96-웰 면역분석 플레이트에서 반응시켰다. 완충액 A로 수세한 후, 분석 완충액으로 1:5 희석한 환자들의 혈장 시료 0.05 ml과 분석 완충액 중의 검출 항체 IBPF72 0.05 ml을 플레이트에 첨가하였다. 플레이트를 일정하게 교반하면서 실온에서 40 분간 반응시켰다. 완충액 A로 수세한 후, 웰당 강화 용액 0.2 ml을 첨가하고 부드럽게 교반하면서 실온에서 3 분간 반응시켰다. Eu3 +의 형광을 Victor 1420 다표지 계수기 (Wallac-Perkin Elmer)를 이용하여 측정하였다.
NT-IGFBP-5 농도는 15.4~83.3 μg/L의 범위였다. 6 개월 시점에 MACE를 예측하는 NT-IGFBP-5의 능력을 ROC 분석으로 조사하였다 (도 12). NT-IGFBP-5 분석에서 ROC 곡선하 면적 (ROC AUC)의 결과는 IBPF15-IBPF72에 대하여 0.68 (P=0.034), IBPF16-IBPF72에 대하여 0.67 (P=0.039)였고, 이것은 MACE의 강력한 예측자로서의 NT-IGFBP-5를 보여준다 (도 12).
따라서, NT-IGFBP-5는 6 개월의 추적 시점에서 급성 흉통, 불안정 협심증 또는 허혈성 심질환을 앓는 환자들의 MACE의 예측자로 보인다.
참고문헌:
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이하 본 출원과 관련된 서열 목록을 나타낸다. 동물들의 면역화에 사용되는 펩타이드 (서열 7 내지 10)을 더 큰 단편들 (서열 1, 2 및 4)에서는 밑줄로 표시한다. 서열 목록은 별도로 제공된다.
SEQ ID NO. 1: (IGFBNP-4의 N-말단):
DEAIHCPPCSEEKLARCRPPVGCEELVREPGCGCCATCALGLGMPCGVYTPR-CGSGLRCYPPRGVEKPLHTLMHGQGVCMELAEIEAIQESLQPSDKDE-GDHPN-NSFSPCSAHDRRCLQKHFAKIRDRSTSGGKM
SEQ ID NO. 2: (IGFBP-4의 C-말단):
KVNGAPREDARPVPQGSCQSELHRALERLAASQSRTHEDLYIIPIPNCDRNGNFHPKQCHPALDGQRGKCWCVDRKTGVKLPGGLEPKGELDCHQLADSFRE
SEQ ID NO. 3: (IGFBP-4)
DEAIHCPPCSEEKLARCRPPVGCEELVREPGCGCCATCALGLGMPCGVYT-PRCGS-GLRCYPPRGVEKPLHTLMHGQGVCMELAEIEAIQESLQPSDKDEGDHP-NNSFS-PCS-AHDRRCLQKHFAKIRDRSTSGGKMKVNGAPREDARPVPQGSCQSELHRALERLAA-SQSRTHEDLYIIPIPNCDRNGNFHPKQCHPALDGQRGKCWCVDRKTGVKLPGGLEPKGELDCHQLADSFRE
SEQ ID NO. 4: (IGFBP-5의 N-말단):
LGSFVHCEPCDEKALSMCPPSPLGCELVKEPGCGCCMTCALAEGQSCGVYTERCAQGLRCLPRQDEEKPLHALLHGRGVCLNEKSYREQVKIERDSREHEEPTTSEMAEETYSPKIFRPKHTRISELKAEAVKKDRRKKLTQS
SEQ ID NO. 5: (IGFBP-5의 C-말단):
KFVGGAENTAHPRIISAPEMRQESEQGPCRRHMEASLQELKASPRMVPRAVYLPNCDR-KGFYKRKQCKPSRGRKRGICWCVDKYGMKLPGMEYVDGDFQCHTFDSSNVE
SEQ ID NO. 6: (IGFBP-5):
LGSFVHCEPCDEKALSMCPPSPLGCELVKEPGCGCCMTCALAEGQSCGVYTERCAQ-GLRCLPRQDEEKPLHALLHGRGVCLNEKSYREQVKIERDSREHEEPTTSEMAEETYSPKIFRPKHTRISELKAEAVKKDRRKKLTQSKFVGGAENTAHPRIISAPEMRQESEQGPCRR-HMEASLQELKASPRMVPRAVYLPNCDRKGFYKRKQCKPSRGRKRGICWCVDKYGM-KL-PGMEYVDGDFQCHTFDSSNVE
SEQ ID NO. 7: (IGFBP-4 펩타이드-1): CHFAKIRDRSTSGGKM
SEQ ID NO. 8: (IGFBP-4 펩타이드-2): KVNGAPREDARPVPQC
SEQ ID NO. 9: (IGFBP-5 펩타이드-4): CKAEAVKKDRRKKLTQS
SEQ ID NO. 10: (IGFBP-5 펩타이드-2): CLNEKSYREQVKIERDSREHE
SEQUENCE LISTING
<110> Hytest Ltd
<120> Method for determining the risk of cardiovascular events using
IGFBP fragments
<130> 50401
<150> US 61/475,778
<151> 2011-04-15
<150> FI 20115367
<151> 2011-04-15
<160> 10
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 135
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 1
Asp Glu Ala Ile His Cys Pro Pro Cys Ser Glu Glu Lys Leu Ala Arg
1 5 10 15
Cys Arg Pro Pro Val Gly Cys Glu Glu Leu Val Arg Glu Pro Gly Cys
20 25 30
Gly Cys Cys Ala Thr Cys Ala Leu Gly Leu Gly Met Pro Cys Gly Val
35 40 45
Tyr Thr Pro Arg Cys Gly Ser Gly Leu Arg Cys Tyr Pro Pro Arg Gly
50 55 60
Val Glu Lys Pro Leu His Thr Leu Met His Gly Gln Gly Val Cys Met
65 70 75 80
Glu Leu Ala Glu Ile Glu Ala Ile Gln Glu Ser Leu Gln Pro Ser Asp
85 90 95
Lys Asp Glu Gly Asp His Pro Asn Asn Ser Phe Ser Pro Cys Ser Ala
100 105 110
His Asp Arg Arg Cys Leu Gln Lys His Phe Ala Lys Ile Arg Asp Arg
115 120 125
Ser Thr Ser Gly Gly Lys Met
130 135
<210> 2
<211> 102
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 2
Lys Val Asn Gly Ala Pro Arg Glu Asp Ala Arg Pro Val Pro Gln Gly
1 5 10 15
Ser Cys Gln Ser Glu Leu His Arg Ala Leu Glu Arg Leu Ala Ala Ser
20 25 30
Gln Ser Arg Thr His Glu Asp Leu Tyr Ile Ile Pro Ile Pro Asn Cys
35 40 45
Asp Arg Asn Gly Asn Phe His Pro Lys Gln Cys His Pro Ala Leu Asp
50 55 60
Gly Gln Arg Gly Lys Cys Trp Cys Val Asp Arg Lys Thr Gly Val Lys
65 70 75 80
Leu Pro Gly Gly Leu Glu Pro Lys Gly Glu Leu Asp Cys His Gln Leu
85 90 95
Ala Asp Ser Phe Arg Glu
100
<210> 3
<211> 237
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 3
Asp Glu Ala Ile His Cys Pro Pro Cys Ser Glu Glu Lys Leu Ala Arg
1 5 10 15
Cys Arg Pro Pro Val Gly Cys Glu Glu Leu Val Arg Glu Pro Gly Cys
20 25 30
Gly Cys Cys Ala Thr Cys Ala Leu Gly Leu Gly Met Pro Cys Gly Val
35 40 45
Tyr Thr Pro Arg Cys Gly Ser Gly Leu Arg Cys Tyr Pro Pro Arg Gly
50 55 60
Val Glu Lys Pro Leu His Thr Leu Met His Gly Gln Gly Val Cys Met
65 70 75 80
Glu Leu Ala Glu Ile Glu Ala Ile Gln Glu Ser Leu Gln Pro Ser Asp
85 90 95
Lys Asp Glu Gly Asp His Pro Asn Asn Ser Phe Ser Pro Cys Ser Ala
100 105 110
His Asp Arg Arg Cys Leu Gln Lys His Phe Ala Lys Ile Arg Asp Arg
115 120 125
Ser Thr Ser Gly Gly Lys Met Lys Val Asn Gly Ala Pro Arg Glu Asp
130 135 140
Ala Arg Pro Val Pro Gln Gly Ser Cys Gln Ser Glu Leu His Arg Ala
145 150 155 160
Leu Glu Arg Leu Ala Ala Ser Gln Ser Arg Thr His Glu Asp Leu Tyr
165 170 175
Ile Ile Pro Ile Pro Asn Cys Asp Arg Asn Gly Asn Phe His Pro Lys
180 185 190
Gln Cys His Pro Ala Leu Asp Gly Gln Arg Gly Lys Cys Trp Cys Val
195 200 205
Asp Arg Lys Thr Gly Val Lys Leu Pro Gly Gly Leu Glu Pro Lys Gly
210 215 220
Glu Leu Asp Cys His Gln Leu Ala Asp Ser Phe Arg Glu
225 230 235
<210> 4
<211> 143
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 4
Leu Gly Ser Phe Val His Cys Glu Pro Cys Asp Glu Lys Ala Leu Ser
1 5 10 15
Met Cys Pro Pro Ser Pro Leu Gly Cys Glu Leu Val Lys Glu Pro Gly
20 25 30
Cys Gly Cys Cys Met Thr Cys Ala Leu Ala Glu Gly Gln Ser Cys Gly
35 40 45
Val Tyr Thr Glu Arg Cys Ala Gln Gly Leu Arg Cys Leu Pro Arg Gln
50 55 60
Asp Glu Glu Lys Pro Leu His Ala Leu Leu His Gly Arg Gly Val Cys
65 70 75 80
Leu Asn Glu Lys Ser Tyr Arg Glu Gln Val Lys Ile Glu Arg Asp Ser
85 90 95
Arg Glu His Glu Glu Pro Thr Thr Ser Glu Met Ala Glu Glu Thr Tyr
100 105 110
Ser Pro Lys Ile Phe Arg Pro Lys His Thr Arg Ile Ser Glu Leu Lys
115 120 125
Ala Glu Ala Val Lys Lys Asp Arg Arg Lys Lys Leu Thr Gln Ser
130 135 140
<210> 5
<211> 109
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 5
Lys Phe Val Gly Gly Ala Glu Asn Thr Ala His Pro Arg Ile Ile Ser
1 5 10 15
Ala Pro Glu Met Arg Gln Glu Ser Glu Gln Gly Pro Cys Arg Arg His
20 25 30
Met Glu Ala Ser Leu Gln Glu Leu Lys Ala Ser Pro Arg Met Val Pro
35 40 45
Arg Ala Val Tyr Leu Pro Asn Cys Asp Arg Lys Gly Phe Tyr Lys Arg
50 55 60
Lys Gln Cys Lys Pro Ser Arg Gly Arg Lys Arg Gly Ile Cys Trp Cys
65 70 75 80
Val Asp Lys Tyr Gly Met Lys Leu Pro Gly Met Glu Tyr Val Asp Gly
85 90 95
Asp Phe Gln Cys His Thr Phe Asp Ser Ser Asn Val Glu
100 105
<210> 6
<211> 252
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 6
Leu Gly Ser Phe Val His Cys Glu Pro Cys Asp Glu Lys Ala Leu Ser
1 5 10 15
Met Cys Pro Pro Ser Pro Leu Gly Cys Glu Leu Val Lys Glu Pro Gly
20 25 30
Cys Gly Cys Cys Met Thr Cys Ala Leu Ala Glu Gly Gln Ser Cys Gly
35 40 45
Val Tyr Thr Glu Arg Cys Ala Gln Gly Leu Arg Cys Leu Pro Arg Gln
50 55 60
Asp Glu Glu Lys Pro Leu His Ala Leu Leu His Gly Arg Gly Val Cys
65 70 75 80
Leu Asn Glu Lys Ser Tyr Arg Glu Gln Val Lys Ile Glu Arg Asp Ser
85 90 95
Arg Glu His Glu Glu Pro Thr Thr Ser Glu Met Ala Glu Glu Thr Tyr
100 105 110
Ser Pro Lys Ile Phe Arg Pro Lys His Thr Arg Ile Ser Glu Leu Lys
115 120 125
Ala Glu Ala Val Lys Lys Asp Arg Arg Lys Lys Leu Thr Gln Ser Lys
130 135 140
Phe Val Gly Gly Ala Glu Asn Thr Ala His Pro Arg Ile Ile Ser Ala
145 150 155 160
Pro Glu Met Arg Gln Glu Ser Glu Gln Gly Pro Cys Arg Arg His Met
165 170 175
Glu Ala Ser Leu Gln Glu Leu Lys Ala Ser Pro Arg Met Val Pro Arg
180 185 190
Ala Val Tyr Leu Pro Asn Cys Asp Arg Lys Gly Phe Tyr Lys Arg Lys
195 200 205
Gln Cys Lys Pro Ser Arg Gly Arg Lys Arg Gly Ile Cys Trp Cys Val
210 215 220
Asp Lys Tyr Gly Met Lys Leu Pro Gly Met Glu Tyr Val Asp Gly Asp
225 230 235 240
Phe Gln Cys His Thr Phe Asp Ser Ser Asn Val Glu
245 250
<210> 7
<211> 16
<212> PRT
<213> Synthetic peptide
<400> 7
Cys His Phe Ala Lys Ile Arg Asp Arg Ser Thr Ser Gly Gly Lys Met
1 5 10 15
<210> 8
<211> 16
<212> PRT
<213> Synthetic peptide
<400> 8
Lys Val Asn Gly Ala Pro Arg Glu Asp Ala Arg Pro Val Pro Gln Cys
1 5 10 15
<210> 9
<211> 17
<212> PRT
<213> Synthetic peptide
<400> 9
Cys Lys Ala Glu Ala Val Lys Lys Asp Arg Arg Lys Lys Leu Thr Gln
1 5 10 15
Ser
<210> 10
<211> 21
<212> PRT
<213> Synthetic peptide
<400> 10
Cys Leu Asn Glu Lys Ser Tyr Arg Glu Gln Val Lys Ile Glu Arg Asp
1 5 10 15
Ser Arg Glu His Glu
20
Claims (24)
- 개체의 장래 주요 유해 심혈관 사건 위험도를 측정하는 방법으로서,
(a) 상기 개체의 시료 중에서,
SEQ ID NO. 1에 해당하는 IGFBP-4의 N-말단 단편, 또는 SEQ ID NO. 1 중 13개 이상의 연속적 아미노산을 갖는 서열에 해당하는 단편, 또는 SEQ ID NO. 1과 80% 이상의 동일성을 갖는 서열에 해당하는 단편의 양을 측정하거나,
SEQ ID NO. 2에 해당하는 IGFBP-4의 C-말단 단편, 또는 SEQ ID NO. 2 중 13개 이상의 연속적 아미노산을 갖는 서열에 해당하는 단편, 또는 SEQ ID NO. 2와 80% 이상의 동일성을 갖는 서열에 해당하는 단편의 양을 측정하거나,
SEQ ID NO. 4에 해당하는 IGFBP-5의 N-말단 단편, 또는 SEQ ID NO. 4 중 13개 이상의 연속적 아미노산을 갖는 서열에 해당하는 단편, 또는 SEQ ID NO. 4와 80% 이상의 동일성을 갖는 서열에 해당하는 단편의 양을 측정하거나,
SEQ ID NO. 5에 해당하는 IGFBP-5의 C-말단 단편, 또는 SEQ ID NO. 5 중 13개 이상의 연속적 아미노산을 갖는 서열에 해당하는 단편, 또는 SEQ ID NO. 5와 80% 이상의 동일성을 갖는 서열에 해당하는 단편의 양을 측정하는 단계와,
(b) 단계 (a)에서 측정된 양을 해당 펩타이드의 적절한 레퍼런스량과 비교하는 단계와,
(c) 상기 장래 주요 유해 심혈관 사건의 위험도를 측정하는 단계
를 포함하는 방법. - 개체에서 심혈관 질환 치료 효능을 모니터링하는 방법으로서,
(a) 상기 치료의 개시 전, 또는 개시시, 또는 치료 중에 얻은 상기 개체의 제1 시료에서 제1항에 기재된 단편들 중 어느 하나의 양을 측정하는 단계와,
(b) 상기 제1 시료보다 나중에 얻은 상기 개체의 제2 시료에서 해당 단편들의 양을 측정하는 단계와,
(c) 단계 (a)에서 측정된 상기 단편들의 양을 단계 (b)에서 측정된 상기 해당 단편들의 양과 비교하는 단계로서, 단계 (a)에서 측정된 양에 비하여 단계 (b)에서 측정된 단편들의 양이 증가하거나 동일한 수준인 것은 상기 개체에 대한 상기 치료가 유효하지 않음을 나타내는 것인 단계와,
(d) 단계 (a)에서 측정된 상기 단편들의 양을 단계 (b)에서 측정된 상기 해당 단편들의 양과 비교하는 단계로서, 단계 (a)에서 측정된 단편들의 양에 비하여 단계 (b)에서 측정된 단편들의 양의 감소는 상기 개체에 대한 상기 치료가 유효함을 나타내는 것인 단계
를 포함하는 방법. - 제2항에 있어서, 상기 치료는 상기 개체에 대한 항혈소판 요법, 항염증 요법, 스타틴 요법, 지질 강하 요법, 플라크 안정 또는 퇴화 요법, 또는 혈전 용해 요법을 포함하는 것인 방법.
- 제1항에 있어서, 그들의 레퍼런스량보다 많은 상기 단편들의 양은 상기 개체가 장래 주요 유해 심혈관 사건의 위험에 처해 있음을 나타내는 것인 방법.
- 제1항에 있어서, 그들의 레퍼런스량보다 적은 상기 단편들의 양은 상기 개체가 장래 주요 유해 심혈관 사건의 위험이 낮음을 나타내는 것인 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 단편들의 측정치에 따라 여러 가지 위험 그룹으로 상기 개체를 분류하는 단계를 더 포함하는 것인 방법.
- 제1항 내지 제6항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 주요 유해 심혈관 사건은 급성 관상동맥 증후군 (ACS), 불안정 협심증, 심근 경색 (MI), ST분절 상승 MI, 비(非)ST분절 상승 MI, 혈관재생성, 응급 관상동맥 우회술, 경피적 관상동맥 중재술, 관상 심장 질환과 관련한 사망으로부터 선택되는 하나 이상의 사건인 것인 방법.
- 제1항 내지 제6항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 주요 유해 심혈관 사건은 뇌졸중인 것인 방법.
- 제1항에 있어서,
다른 마커, 또는 콜레스테롤 분율, C-반응성 단백질 (CRP), 심장 트로포닌 I, 심장 트로포닌 T, B형 나트륨 이뇨 펩타이드 (BNP), BNP 전구체 펩타이드 (proBNP), N-말단 proBNP (NT-proBNP), 지질단백질 관련 포스포리파아제 A2 (Lp-PLA2), 태반 생장 인자 (PIGF), 추정 사구체 여과율 (eGFR), 호모시스테인 (HCY), 콜린, 허혈 변형성 알부민 (IMA), 용해성 CD40 리간드 (sCD40L) 또는 미옐로퍼옥시다아제 (MPO)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 주요 유해 심혈관 사건 예측 마커에 대한 분석을 더 포함하고, 제1항에 기재된 상기 단편들 중 어느 하나의 수준과 상기 다른 마커(들)의 수준의 조합이 장래 주요 유해 심혈관 사건을 예측하는 것인 방법. - 제1항 내지 제9항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 시료 중의 제1항에 기재된 상기 단편들 중 어느 하나의 양은 어떠한 심혈관 질환력이 없는 개체군에서 발견되는 해당 단편의 50번째 백분위수를 초과하는 것인 방법.
- 제1항 내지 제9항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 시료 중의 제1항에 기재된 상기 단편들 중 어느 하나의 양은 어떠한 심혈관 질환력이 없는 개체군에서 발견되는 해당 단편의 95번째 백분위수를 초과하는 것인 방법.
- 제1항에 있어서,
(d) 시료 중에서 SEQ ID NO. 3에 해당하는 IGFBP-4의 양을 측정하는 단계와,
(e) 상기 IGFBP-4의 양에 대한, 제1항에 기재된 IGFBP-4의 단편들 중 어느 하나의 양의 비율을 계산하는 단계와,
(f) 단계 (e)에서 측정된 비율을 상기 해당 단편에 대한 적절한 레퍼런스 비율 값과 비교하는 단계와,
(g) 장래 주요 유해 심혈관 사건의 위험도를 측정하는 단계
를 더 포함하는 것인 방법. - 제1항에 있어서,
(d) 시료 중에서 SEQ ID NO. 6에 해당하는 IGFBP-5의 양을 측정하는 단계와,
(e) 상기 IGFBP-5의 양에 대한, 제1항에 기재된 IGFBP-5의 단편들 중 어느 하나의 양의 비율을 계산하는 단계와,
(f) 단계 (e)에서 측정된 비율을 상기 해당 단편에 대한 적절한 레퍼런스 비율 값과 비교하는 단계와,
(g) 장래 주요 유해 심혈관 사건의 위험도를 측정하는 단계
를 더 포함하는 것인 방법. - 제1항 내지 제13항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 개체는 ACS, 흉통 또는 숨가쁨을 나타내는 개체인 것인 방법.
- 제14항에 있어서, 상기 ACS는 관상 심장 질환, 안정 협심증, 불안정 협심증, MI, ST분절 상승 MI, 비ST분절 상승 MI, 좌심실 부전 및 울혈성 심부전으로부터 선택되는 하나 이상의 사건인 것인 방법.
- 제1항 내지 제13항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 개체는 관상 심장 질환과 관련된 어떠한 증상도 나타내지 않는 개체인 것인 방법.
- 제1항 내지 제15항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 개체는 임의 유형의 심혈관 질환 치료에 노출된 개체인 것인 방법.
- 심혈관 질환의 치료 효율 평가 방법으로서,
(a) 임상 시험에 포함된 1 이상의 개체의 시료 중에서 제1항에 기재된 단편들 중 어느 하나의 양을 측정하는 단계로서, 상기 측정은 상기 임상 시험의 개시시, 도중, 또는 후에 수행되는 것인 단계와,
(b) 앞서 측정되는 제1항에 기재된 단편들 중 어느 하나의 양을, 후에 측정되는 해당 단편들과 비교하는 단계로서, 상기 양의 증가 또는 동일한 수준은 상기 치료가 유효하지 않음을 나타내는 것인 단계와,
(c) 앞서 측정되는 제1항에 기재된 단편들 중 어느 하나의 양을, 후에 측정되는 해당 단편들과 비교하는 단계로서, 상기 양의 감소는 상기 치료가 유효함을 나타내는 것인 단계
를 포함하는 것인 방법. - 전술한 항들 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 시료는 혈액, 혈장 또는 혈청 시료인 것인 방법.
- 개체에서 심혈관 질환을 치료하거나 그 진행을 지연시키는 방법으로서, 그 결과 상기 개체의 혈액 순환에서 제1항에 기재된 단편들 중 어느 하나의 감소가 이루어지는 방법.
- 전술한 항들 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 개체는 인간 또는 포유류인 것인 방법.
- 뇌졸중, 심장마비 또는 심혈관 질환 예방용 제제 또는 심혈관 질환의 치료용 제제를 포함하는 약학적 조성물로서,
상기 제제는 항염증제, 항당뇨 약물, 항혈전제, 항혈소판제, 피브린용해제, 지질 강하제, 직접적 트롬빈 억제제, 당단백 IIb/IIIa 수용체 억제제, 세포 부착 분자들에 결합하고 백혈구 세포들의 이러한 분자들에 대한 부착능을 억제하는 제제, 칼슘 채널 차단제, 베타-아드레날린 수용체 차단제, 시클로옥시제나아제-2 억제제 및 안지오텐신 시스템 억제제로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것이고,
상기 약학적 조성물은 개체에서 제1항에 기재된 단편들 중 어느 하나의 수준을 저하시킬 수 있는 성분도 포함하는 것인 약학적 조성물. - 제1항 내지 제9항 중 어느 하나의 항에 기재된 방법을 수행하기 위한 시험 키트로서, 상기 시험 키트는
상기 방법을 수행하기 위한 지침과,
(a) 개체의 시료 중에서 제1항에 기재된 단편들 중 어느 하나의 양을 측정하기 위한 수단과,
(b) 상기 양을 적절한 레퍼런스량과 비교하기 위한 수단과, 그로써
(c) 장래 주요 유해 심혈관 사건의 위험도를 측정하는 것
을 포함하는 시험 키트. - 제23항에 있어서,
다른 마커, 또는 콜레스테롤 분율, C-반응성 단백질 (CRP), 심장 트로포닌 I, 심장 트로포닌 T, B형 나트륨 이뇨 펩타이드 (BNP), BNP 전구체 펩타이드 (proBNP), N-말단 proBNP (NT-proBNP), 지질단백질 관련 포스포리파아제 A2 (Lp-PLA2), 태반 생장 인자 (PIGF), 추정 사구체 여과율 (eGFR), 호모시스테인 (HCY), 콜린, 허혈 변형성 알부민 (IMA), 용해성 CD40 리간드 (sCD40L) 및 미옐로퍼옥시다아제 (MPO)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 주요 유해 심혈관 사건 예측 마커에 대한 분석을 더 포함하는 것인 시험 키트.
Applications Claiming Priority (5)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
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