KR20140024871A - 대사 활성 프로필을 모니터링 및 분석하는 방법 및 그의 진단 및 치료학적 용도 - Google Patents

대사 활성 프로필을 모니터링 및 분석하는 방법 및 그의 진단 및 치료학적 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 세포의 대사 활성 (MA)을 측정하는 방법을 제공한다. 상기의 방법은 (i) 비-휘발성 가용성 대사 생성물; (ii) 비-휘발성 가용성 대사 생성물 및 휘발성 가용성 대사 생성물; 및 (iii) 휘발성 가용성 대사 생성물의 분비에 기인한 시간-의존적 산성화 프로필을 세포의 세포외 환경에서 독립적으로 측정하는 것을 포함하며, 여기에서, 시간-의존적 산성화 프로필 중의 적어도 하나는 세포의 대사 활성을 나타낸다. 또한, 상기의 측정검사를 이용하는 임상 방법이 제공된다.

Description

대사 활성 프로필을 모니터링 및 분석하는 방법 및 그의 진단 및 치료학적 용도{METHODS OF MONITORING AND ANALYZING METABOLIC ACTIVITY PROFILES DIAGNOSTIC AND THERAPEUTIC USES OF SAME}
본 발명은 일부의 구체예에서, 대사 활성 프로필(metabolic activity profile)을 모니터링 및 분석하는 방법, 및 그의 진단적 또는 치료학적 용도에 관한 것이거나, 특히 혈액 샘플의 대사 활성 모니터링에 의한 암 진단에 관한 것이다.
질병 치료에 있어서의 주된 문제점은 조기 검출 및 기결정 (staging)에 있다. 조기 검출은 질병의 발병 시부터 치료학적 치료를 가능하게 하여 대부분의 경우에 성공적인 치료를 야기한다. 질병의 기결정은 최적의 치료에 결정적일 수 있는 약물치료의 적절한 프로토콜 상에서 나타낼 수 있다. 예를 들어, 오늘날 수백만 명의 사람들이 암에 걸려 생활하거나 암에 걸렸다. 암은 미국에서, 심장 질환만이 상회하는 두 번째로 가장 통상적인 사망의 원인이다. 암은 미국에서 4명의 사망당 거의 1명을 차지한다. 암을 진단하고 치료하는 것이 빠르면 빠를수록 생존 가능성은 더 좋아진다.
암의 검출을 위한 모든 공지된 방법은 대부분 악성 조직 및/또는 순환계에 분비된 그의 병리학적 암 바이오마커 (biomarkers)를 확인하는데 초점을 맞추고 있다. 그러나, 이들 진단 방법은 단지 불행하게도 질병의 비교적 진행된 단계에서만 효과적이다.
와버그 효과 (Warburg effect)는 대부분의 암 세포가 대부분의 정상 세포와 같이 미토콘드리아 내에서의 비교적 낮은 비율의 해당작용에 이은 피루베이트의 산화에 의해서가 아니라, 사이토졸 내에서의 높은 비율의 해당작용에 이은 락트산 생산에 의해서 에너지를 산출한다는 관찰결과이다 [Kim JW, Dang CV (2006). "Cancer's molecular sweet tooth and the Warburg effect". Cancer Res . 66 (18): 8927-30]. 두 번째로, 1920년대에 오토 와버그 (Otto Warburg)는, 정상 분화 세포와 대조적으로 암 세포19 , 20는 주로 미토콘드리아 산화적 포스포릴화가 아니라 호기성 해당작용에 의존하여 세포 과정에 필요한 에너지를 위한 에너지로서 ATP를 생성시킨다는 것을 발견하였다. 이러한 역사적 현상을 "와버그 효과 (Warburg effect)"라 칭하였다21. 오토 와버그는 대사에 있어서의 이러한 변화가 암의 근본적 원인이라고 주장하였다 [Warburg O (1956). "On the origin of cancer cells". Science 123 (3191): 309-14]으며, 이 주장은 현재 와버그 가설 (Warburg hypothesis)로 알려져 있다. 약 50년 후에, 와버그 효과는 또한 시험관내의 활성화된 림프구에서 관찰되었다 [참조: 예를 들어, Maclver et al. 2008 J. Leukocyte Biology 84:1-9; 및 DeBerardinis Cell Metabolism 7:11-20]. 와버그 효과는 또한, 활성화된 T 세포22 ,23가 예를 들어, 글루코즈 트랜스포터 (GLUT)24의 과발현에 의해 빠르게 해당작용을 과유도하는 면역 시스템에서도 발견되었다.
악성 종양에 의한 고 호기성 해당작용은 양전자 방사 단층촬영 (PET)에 의해서 2-18F-2-데옥시글루코즈 (FDG) (방사성의 변형된 헥소키나제 기질)의 흡수를 영상화함으로써 암의 치료 반응을 진단 및 모니터링하는데 임상적으로 이용되기 때문에 와버그 효과는 중요한 의학적 적용성을 갖는다. 국제 출원 공보 WO2007/102146을 또한 참고로 한다. 그러나, 이들 방법은 최첨단 시설 또는 인시츄 조직생검 (in - situ tissue biopsies)을 필요로 함으로써 번잡하며, 비용이 많이 든다.
따라서, 조기의 간단한 진단을 위한 비-침습적 방법이 필요하다.
발명의 요약
본 발명의 일부의 구체예의 관점에 따르면,
(i) 비-휘발성 가용성 대사 생성물;
(ii) 비-휘발성 가용성 대사 생성물 및 휘발성 가용성 대사 생성물;
(iii) 휘발성 가용성 대사 생성물의 분비에 기인한 시간-의존적 산성화 프로필을 세포의 세포외 환경에서 독립적으로 측정하는 것을 포함하며,
여기에서 시간-의존적 산성화 프로필 중의 적어도 하나는 세포의 대사 활성을 나타내는 것인,
세포의 대사 활성 (MA)을 측정하는 방법이 제공된다.
본 발명의 일부의 구체예의 관점에 따르면,
(a) 세포를 포함하는 대상체의 생물학적 샘플을 제공하고;
(b) (i) 비-휘발성 가용성 대사 생성물;
(ii) 비-휘발성 가용성 대사 생성물 및 휘발성 가용성 대사 생성물; 및
(iii) 휘발성 가용성 대사 생성물의 분비에 기인한 시간-의존적 산성화 프로필을 세포의 세포외 환경에서 독립적으로 측정하는 것을 포함하며;
여기에서, 시간-의존적 산성화 프로필 중의 적어도 하나가 세포의 대사 활성을 나타내는 반면, 동일한 조건 하에서 검사한 정상적인 비질병 세포 샘플의 경우와 비교한 대사 활성에 있어서의 이동은 변형된 대사 활성과 연관된 질병을 나타내는 것인,
이를 필요로 하는 대상체에서 변형된 대사 활성과 연관된 질병을 진단하는 방법이 제공된다.
본 발명의 일부의 구체예의 관점에 따르면,
(a) 세포를 포함하는 대상체의 생물학적 샘플을 적어도 하나의 약제와 접촉시키고;
(b) (i) 비-휘발성 가용성 대사 생성물;
(ii) 비-휘발성 가용성 대사 생성물 및 휘발성 가용성 대사 생성물; 및
(iii) 휘발성 가용성 대사 생성물의 분비에 기인한 시간-의존적 산성화 프로필을 세포의 세포외 환경에서 독립적으로 측정하는 것을 포함하며;
여기에서, 시간-의존적 산성화 프로필 중의 적어도 하나는 세포의 대사 활성을 나타내는 반면, 동일한 조건 하에서 검사한 정상적인 건강한 세포 샘플의 대사활성 쪽으로의 세포의 대사 활성에 있어서의 이동은 상기 질병에 대한 효과적인 약제를 나타내는 것인,
질병 치료를 개별적으로 최적화시키는 방법이 제공된다.
본 발명의 일부의 구체예의 관점에 따르면,
(a) 질병에 대한 적어도 하나의 약제를 대상체에게 투여하고;
(b) 투여 후에 대상체의 세포를 포함하는 생물학적 샘플을 회수하고;
(c) (i) 비-휘발성 가용성 대사 생성물;
(ii) 비-휘발성 가용성 대사 생성물 및 휘발성 가용성 대사 생성물; 및
(iii) 휘발성 가용성 대사 생성물의 분비에 기인한 시간-의존적 산성화 프로필을 세포의 세포외 환경에서 독립적으로 측정하는 것을 포함하며;
여기에서, 시간-의존적 산성화 프로필 중의 적어도 하나는 세포의 대사 활성을 나타내는 반면, 동일한 조건 하에서 검사한 정상적인 건강한 세포 샘플의 대사활성 쪽으로의 대사 활성에 있어서의 이동은 상기 질병의 효과적인 치료를 나타내는 것인,
대상체에서 질병 치료를 모니터링하는 방법이 제공된다.
본 발명의 일부의 구체예의 관점에 따르면,
(a) 특허청구범위 제2항의 방법에 따라 대상체에서 질병의 존재를 진단하고;
(b) 진단에 기초하여 대상체를 치료하는 것을 포함하는,
이를 필요로 하는 대상체에서 질병을 치료하는 방법이 제공된다.
본 발명의 일부의 구체예의 관점에 따르면,
(a) 세포를 제제 (agent)에 적용하고;
(b) (a) 이후 및 임의로 (a) 전에 특허청구범위 제1항의 방법에 따라 세포의 대사 활성을 측정하는 것을 포함하며;
여기에서, 산성화 프로필에 있어서의 이동은 세포의 대사 활성을 변화시킬 수 있는 제제를 나타내는 것인,
세포의 대사 활성을 변화시킬 수 있는 제제를 확인하는 방법이 제공된다.
본 발명의 일부의 구체예에 따르면, 세포외 환경은 보정된 완충능 (calibrated buffer capacity)을 갖는 규정된 용액을 포함한다.
본 발명의 일부의 구체예에 따르면, 완충액이 포스페이트 완충 식염수를 포함한다.
본 발명의 일부의 구체예에 따르면, 세포는 백혈구를 포함한다.
본 발명의 일부의 구체예에 따르면, 세포는 암 세포를 포함한다.
본 발명의 일부의 구체예에 따르면, 세포는 말초혈액 단핵구 세포 (PBMC)를 포함한다.
본 발명의 일부의 구체예에 따르면, 질병은 암을 포함한다.
본 발명의 일부의 구체예에 따르면, 생물학적 샘플은 혈액 샘플을 포함한다.
본 발명의 일부의 구체예에 따르면, 질병은 암, 병원체 감염 및 자가면역 질환으로 구성된 그룹으로부터 선택된다.
본 발명의 일부의 구체예에 따르면, 측정은 pH 프로브, CO2 프로브 및 NH3 프로브로 구성된 그룹으로부터 선택된 비독성 막 불투과성 프로브를 사용하여 수행된다.
본 발명의 일부의 구체예에 따르면, pH 프로브는 비율 척도 (ratiometric) pH 프로브를 포함한다.
본 발명의 일부의 구체예에 따르면, pH 프로브는 HPTS를 포함한다.
본 발명의 일부의 구체예에 따르면, 비-휘발성 대사산물은 락테이트를 포함한다.
본 발명의 일부의 구체예에 따르면, 휘발성 대사산물은 NH3 및 CO2를 포함한다.
본 발명의 일부의 구체예에 따르면, (i)의 산성화 프로필의 측정은 공기-노출된 챔버에서 수행된다.
본 발명의 일부의 구체예에 따르면, (ii)의 산성화 프로필의 측정은 공기-밀폐된 챔버에서 수행된다.
본 발명의 일부의 구체예에 따르면, 산성화 프로필의 측정은 항온에서 수행된다.
본 발명의 일부의 구체예에 따르면, 항온은 37℃를 포함한다.
본 발명의 일부의 구체예에 따르면, 상기 방법은 세포를 산성화 프로필을 측정하기 전에 또는 그와 동시에 자극제 또는 억제제에 적용하는 것을 더 포함한다.
본 발명의 일부의 구체예에 따르면, 자극제 또는 억제제는 세포를 포함한다.
본 발명의 일부의 구체예에 따르면, 자극제 또는 억제제는 무-세포 항원을 포함한다.
본 발명의 일부의 구체예에 따르면, 자극성 세포는 림프구를 포함하며, 세포는 상기 림프구에 대해서 비-공통 유전자형 림프구를 포함한다.
본 발명의 일부의 구체예에 따르면, 산성화 프로필의 측정은 상업용 형광 멀티 웰 플레이트 스캐너 (multi well plate scanner)에서 수행된다.
본 발명의 일부의 구체예에 따르면, MA 시험 배경 측정치의 신호 대 잡음 여과 (signal to noise filtering)는 k-평균 군집 분석 (k-means cluster analysis)에 의해서 수행된다.
본 발명의 일부의 구체예에 따르면, 대사 활성 측정치에 의한 진단적 결정은 적어도 2 개의 의사결정 계통도 모델 (decision tree model)에 따른다.
본 발명의 일부의 구체예에 따르면, 의사결정 계통도 모델은 C5, C&R 계통도 및 CHAID의 그룹으로부터 선택된다.
본 발명의 일부의 구체예에 따르면, 상기 방법은 세포외 환경으로부터 세포를 분리시키는 것을 추가로 포함한다.
본 발명의 일부의 구체예에 따르면, 상기의 분리는 원심분리 하에서의 피콜 (ficoll) 분리에 의한다.
별도로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및/또는 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상적으로 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 비록 본 발명에 기술된 것과 유사하거나 동등한 방법 및 재료들이 본 발명의 구체예를 실시하거나 시험하는데 사용될 수 있지만, 예시적인 방법 및/또는 재료가 이하에 기술된다. 상충되는 경우에는, 정의를 포함한 본 명세서가 통제할 것이다. 또한, 재료, 방법 및 예들은 단지 설명을 하는 것이며, 반드시 제한하고자 하는 것은 아니다.
본 발명의 일부의 구체예는 단지 예로서 첨부된 도면을 참고하여 본 명세서에 기술된다. 이제 상세하게 도면을 구체적으로 참고하여, 상세한 사항은 예로서 그리고 본 발명의 구체예의 설명을 목적으로 제시된 것임이 강조된다. 이에 관해서, 도면과 함께 제시된 설명은 본 발명의 구체예를 어떻게 실시할 수 있는지를 본 기술분야에서 숙련된 전문가에게 명백하게 만들 것이다.
도면에서,
도 1은 산화적 포스포릴화, 혐기성 해당작용 및 호기성 해당작용 (또한 "와버그 효과"로 공지됨) 사이의 차이의 도식적 표현이다.
도 2는 8-하이드록시피렌-1,3,6-트리설폰산 (HPTS)의 pH-의존적 흡수 스펙트럼을 나타내는 그래프이다.
도 3A-D는 1 μM HPTS에서, 2 mM 및 10 mM 포스페이트 완충 식염수에서의 작업 용액 (working solution)의 pH 및 산도 보정을 나타내는 그래프이다. OPEN; 산도 단계를 밀폐하지 않고 37℃에서 모니터링하였다. CLOSE; 산도 단계를 멀티-웰 플레이트를 밀폐시킨 후에 37℃에서 모니터링하였다.
X 축; 비: (Ex. 403 ㎚에서의 형광 강도) / (Ex. 455 ㎚에서의 형광 강도)
오른쪽 Y 축 (삼각형): 1 N HCl의 순차적 첨가에 의해서 수득된 것으로서 HCl (μmol/㎖)의 누적량.
왼쪽 Y 축 (원): pH 유리 전극에 의해서 측정된 것으로서 적절한 pH 값. 도 3A-B - 2 mM 포스페이트 완충 식염수를 갖는 작업 용액. 도 3C-D - 10 mM 포스페이트 완충 식염수를 갖는 작업 용액.
도 4A-B는 10 mM 포스페이트 완충 식염수에서 1 μM 및 10 μM의 HPTS 농도에서의 검정곡선을 나타내는 그래프이다.
X 축; 비: (Ex. 403 ㎚에서의 형광 강도) / (Ex. 455 ㎚에서의 형광 강도)
오른쪽 Y 축 (삼각형): 1 N HCl의 순차적 첨가에 의해서 수득된 것으로서 HCl (μmol/㎖)의 누적량.
왼쪽 Y 축 (원): pH 유리 전극에 의해서 측정된 것으로서 적절한 pH 값. (도 4A) HPTS의 최종 농도가 1 μM이다. (도 4B) HPTS의 최종 농도가 10 μM이다.
도 5A-D는 HPTS 기준율 값 (reference rate value)의 k-평균 군집 분석을 나타낸다. 도 5A-C - x-축은 "OPEN"으로부터 제공된 프로브의 표준화 값 상에서의 포인트이고, y-축은 "CLOSE" 측정으로부터 제공된 프로브의 표준화 값 상에서의 포인트이다. 도 5A - 군집 분석 전의 모든 시험 공여체 (N = 730 개의 관찰)로부터의 모든 값의 검사. 도 5B - 프로브 데이터의 k-평균 군집 분석은 상이한 색상을 갖는 26 개의 군집 상에 나타낸다. 5 개의 군집은 작은 것으로 발견되었으며 (관찰 ≤ 6 개), 따라서 버렸다 (이상치 (outliers)). 도 5C-D - 730 개의 관찰 중에서 34 개의 관찰 (4.66%)은 배제하였다 (적색). 나머지 696 개의 관찰 (95.34%) (청색)은 (도 5B)에서 21 개의 별개의 군집에서 제시된다. 그 후, "OPEN" 상태의 평균값 및 "CLOSE" 상태의 평균값을 각각의 공여체에 대해서 재계산하였다.
도 6A-C는 대표적인 건강한 공여체 및 암 공여체에 대해서 수득된 증가하는 글루코즈 농도에 대한 MA 프로필이다. x 축: 글루코즈 농도 (mM). y 축: 도 6B-C의 경우에는 피코몰 H+/㎕/시간/2500 PBMC, 및 도 6C의 경우에는 피코몰 H+/㎕/시간의 단위로 나타낸 hPBMC의 대사 활성율. 산성화 동력학은 37℃에서의 배양의 1 시간 동안 측정된다. 30 분 동안 멀티 웰 플레이트의 "OPEN" 상태 사이클. 이 상태에서는, 단지 락테이트 산 생산 (다른 비-휘발성 유기산을 포함)만이 각각의 웰에서 동등한 산성 축적에 기여하도록 C02 및 NH3의 가스 환기를 한다. 30 분 동안 동일한 멀티 웰 플레이트의 "CLOSE" 상태 사이클. 이러한 용접 밀폐된 상태에서, CO2 및 NH3는 물과 평형으로 반응하여 카본산 및 암모늄 이온을 형성한다. 산도 수준은 pH 7.3 주위에서 락트산 및 카본산 음이온 둘 다에 의해서 산출된다. 여기에서 NH4 + 염기성 양이온을 평가하여 산도 수준을 적정한다. "CLOSE"-"OPEN" = CO2 + (- NH3)). (도 6A) 프로브 HPTS 및 글루코즈를 포함하지만 세포는 없는 MA 시험의 대조군 기록. (도 6B) 대표적인 건강한 공여체를 나타내는 45 세 여성의 MA 프로필 (유사한 프로필이 상이한 연령 및 성별에 대해서 수득된다). (도 6C) 2 기의 유방 idc 암을 갖는 치료 전의 37세 여성의 MA 프로필. 건강한 샘플과 질병 샘플 사이에서 유도된 MA 변화는 기준 상태 (자극제가 없는 대조 샘플)에서 이미 검출될 수 있음을 주목하여야 한다.
도 7A-D는 69세의 건강한 남성과 비교하여 유방암이 있는 65세의 여성에 대해 수득된 증가하는 글루코즈에 대한 MA 프로필의 추적 사례 연구를 나타내는 그래프이다. 흑색 - "CLOSE"; 적색 - "OPEN"; 청색 - "C-O" = "CLOSE"-"OPEN". 도 7A - 69세의 건강한 남성의 말초혈액 단핵구 세포 (PBMC)의 MA 프로필. 도 7B-D는 유방 idc 암이 있는 65세의 여성의 말초혈액 단핵구 세포 (PBMC)의 3 개의 추적 MA 프로필을 나타낸다. X 축: 글루코즈 농도 (mM). Y 축: 피코몰/㎕/시간/2500 PBMC의 단위로 나타낸 PBMC의 대사 활성율. (도 7B) 시험 결과에 의해서 암이 있는 것으로 이미 의심스러운 추적 환자의 최초 MA 시험 (시간 =0). (도 7C) 시간 = + 10.5 개월 - 의사에 의해 3 기의 유방 idc 암을 갖는 것으로 일상적인 유방조영술에 의해서 진단된 직후의 두 번째 MA 시험. (도 7D) 시간 = + 14.5 개월 - 여섯 번째 MA 시험은 왼쪽 유방에서 2.2x2.4 ㎝의 종양을 수술로 제거한 후 및 3 회의 화학요법 치료의 2 개월 후에 수행되었다.
도 8A-D는 대표적인 건강한 공여체, 유방암 환자 및 유방암 회복 공여체에 대해서 수득된 증가하는 PSA 농도에 대한 MA 프로필을 나타내는 그래프이다.
도 8A - 프로브 HPTS 및 PSA를 포함하지만 세포는 없는 MA 시험의 대조 기록. (도 8B-D) 3 명의 상이한 공여체의 말초혈액 단핵구 세포 (PBMC)의 MA 프로필. X 축: PSA 농도 (㎍/㎖). Y 축: 도 9B-D의 경우에는 피코몰 H+/㎕/시간/2500 PBMC 및 도 8A의 경우에는 피코몰 H+/㎕/시간의 단위로 나타낸 PBMC의 대사 활성율. 산성화 동력학은 37℃에서의 배양 1 시간 중에 측정된다. 흑색 - "CLOSE"; 적색 - "OPEN"; 청색 - "C-O" = "CLOSE"-"OPEN". (도 8A) 대표적인 건강한 공여체를 나타내는 59 세의 여성의 MA 프로필. (도 8B) 2 기의 유방 idc 암을 갖고, 어떤 치료도 하기 전의 37 세 여성의 MA 프로필. (도 8C) MA 시험을 하기 18년 전에 유방암으로부터 회복된 50 세 여성의 MA 프로필.
도 9A-D는 MA 시험 결과에 대한 모델 구축 및 분류 평가를 나타낸다.
도 9A-B - 연령이 40 세 이상인 공여체의 제1 그룹 (n=42). 도 9C-D - 연령이 22세와 81세 사이인 공여체의 제2 그룹. 도 9A, C - 2 개의 표는 최상의 분류의 최상의 구분점 (cutting point)을 갖는 최고의 모델을 나타낸다. "O"는 "OPEN" 상태를 나타내며, "C"는 "CLOSE" 상태를 나타내고, "C-O"는 "CLOSE - OPEN" 상태를 나타낸다. TP는 참양성 (true positive)을 나타내며, FN은 위음성 (false negative)을 나타내고, TN은 참음성 (true negative)을 나타내며, FP는 위양성 (false positive)을 나타낸다. 도 9 B, D - 누적 이득 도표 (cumulative gain chart)에 의한 모델 성능의 평가 및 비교에 대한 2 개의 그래프. y 축은 암을 갖는 모델에 의해서 분류된 공여체의 백분율을 나타낸다. 이것은 총 공여체 (건강한 공여체 및 암 환자)의 백분율이다. x 축은 제1 그룹에 대한 42 명의 총 공여체 및 제2 그룹에 대한 67 명의 총 공여체의 분율인, 암을 갖는 것으로 분류된 환자의 백분율을 나타낸다. 높은 정확도로 건강한 공여체 및 암 환자 모두를 분류할 수 있는 4 개의 최고의 모델이 제시된다. 네 번째 모델은 회귀 모델의 패밀리로부터의 로지스틱 회귀 모델 (logistic regression model)이다. 흑색 선은 무작위 반응율 (random response rate)을 나타낸다 (만일 공여체의 X%를 무작위로 분류하였다면, 암 환자의 X%가 수득된다). 하늘색 선은 이론적인 최고의 모델을 나타낸다. 적색 선은 CHAID 모델을 나타내고, 녹색 선은 C5 알고리듬을 나타내며, 황색 선은 C&R 계통도 모델을 나타내고, 청색 선은 로지스틱 모델을 나타낸다.
도 10A-D는 공여체의 30%의 검증 세트를 사용하여 MA 시험의 모델 결과를 평가하는 것을 나타낸다. 도 10A-B - 연령이 40세 이상인 공여체의 제 1 그룹 (n=42). 도 10C, D - 연령이 22세와 81세 사이인 공여체의 제2 그룹. (a, c) 도 9에 기술된 바와 같은 데이터를 클레멘타인 소프트웨어 (clementine software) V13.0을 사용하여 "훈련 (Training)" 및 "시험 (Testing)"의 2 개의 그룹으로 무작위 구분하였다. 도 10A - 검증 세트는 제1 그룹에 대한 공여체의 70%를 포함하였다. 도 10C - 검증 세트는 제2 그룹에 대한 공여체의 70%를 포함하였다. 도 10A, C - 무작위 데이터 구분 후에 누적 이득 도표에 의해서 만들어진 모델 성능의 평가 및 비교를 위한 2 개의 그래프. y 축은 암을 갖는 모델에 의해서 분류된 공여체의 백분율을 나타낸다. 이것은 총 공여체 (건강한 공여체 및 암 환자)의 백분율이다. x 축은 암을 갖는 것으로 분류된 환자의 백분율을 나타낸다. "훈련" 세트는 공여체의 70% 상에서 데이터 마이닝 모델 (data mining model)을 구축하기 위해서 사용된다. 공여체의 나머지 30%는 훈련 세트에서 생성된 모델 (CHAID, 로지스틱, C5, C&R 계통도)을 사용하여 "훈련" 세트에 대한 분류 결과를 평가하기 위해서 나중에 사용된다. 도 9에 기술된 바와 같이, 하늘색 선은 이론적인 최고의 모델을 나타내고, 적색 선은 CHAID 모델을 나타내며, 녹색 선은 C5 알고리즘을 나타내고, 황색 선은 C&R 계통도 모델을 나타내며, 청색 선은 로지스틱 모델을 나타내고, 흑색 선은 무작위 모델을 나타낸다. 도 10B, D - 2 개의 표는 무작위 데이터 구분 후의 최상의 분류의 최상의 구분점을 갖는 최고의 모델을 나타낸다. "O"는 "OPEN" 상태를 나타내며, "C"는 "CLOSE" 상태를 나타내고, "C-O"는 "CLOSE - OPEN" 상태를 나타낸다. TP는 참양성을 나타내며, FN은 위음성을 나타내고, TN은 참음성을 나타내며, FP는 위양성을 나타낸다. 공여체의 두 가지 그룹 모두에서 C5는 "시험" 세트에서의 최고의 수행자 (performer)였으며, 반면에 "훈련" 세트에서는 C&R 계통도가 최고의 수행자였다.
도 11은 작업 가설을 도시한다: 종양 발생의 거울 영상으로서 hPBMC의 대사 활성 프로필. 암 발생은 hPBMC의 상이한 대사 활성 (MA) 프로필에 반영될 수 있는 면역 시스템의 생리학적 기능에 있어서의 변화와 연관되는 것으로 생각된다. Y 축은 대사 경로의 두 개의 팔(arm), 즉 산화적 포스포릴화 대 호기성 해당작용을 나타낸다. X 축은 건강한 상태로부터 전이된 암까지의 종양 발생의 기를 나타낸다. 정지 세포 (quiescent cells; Q)는 산화적 포스포릴화의 우성 기초율 (dominant basal rate)을 갖는다. 종양 발생의 초기 단계에서는, Q의 적절한 조직 특이적 서브 그룹 (Qi)의, 후기 단계에서 아마도 전종양 효과기 피더 세포 (protumor effector feeder cells; Efi)로 형질전환되는 항종양 효과기 킬러 세포 (Eki)로의 "클론 증식 (clonal expansion)"이 있다. 동시에, 면역 관용 및 아네르기 (anergy)는 전이된 상태로 굴복하고, 여기에서 그들 각각의 정지 서브그룹 (Qi)을 포함한 조직 특이적 효과기 서브그룹은 모두 소진될 수 있다. 본 결과는 건강한 공여체의 hPBMC가 선호하는 우성 산화적 포스포릴화로부터 국소적 종양 발생의 단계 (1-3 기)에서의 다양한 암 환자의 hPBMC가 선호하는 우성 호기성 해당작용 ("와버그 효과") 쪽으로의 대사 이동을 나타낸다. 호기성 해당작용 쪽으로의 이동은 우성 Efi 서브그룹 및 아마도 또한, Eki 서브그룹과 관련될 수 있다. 암 (0 기)의 조직-특이적 조기 검출의 능력은 추적 프로토콜에 의해서 검사될 것이다. 이것은 건강한 공여체에 대해 수득된 것에 비해, 조직-특이적 항원에 의한 자극 하에서 증진/감소된 대사 활성화로 나타나는 것으로 예상된다. 조기 전이된 암 (4 기)에서는 우성 산화적 포스포릴화 쪽으로의 점진적인 역방향 이동이 예상되어 적절한 치료를 위한 진단 도구를 제공한다. 특징적인 대사 활성 프로필의 상기한 도식적 설명은 hPBMC의 와버그 효과 이동을 시사하는 MA 시험의 차이 "close - open" 결과와 관련된 줄무늬가 있는 오렌지색 선에 의해서 표시된다.
도 12는 MA 시험 프로토콜 및 분석 체제(framework)의 플로우차트 (flowchart)이다. MA 시험 체제의 순차적 단계 A-E는 이하의 실시예 항목의 실시예 1에 상세히 기술된 것과 부합한다.
도 13A-I는 대표적인 건강한 공여체, 암 공여체 및 자가면역 루푸스 공여체에 대해 수득된 증가하는 글루코즈 농도에 대한 MA 프로필이다. X 축: 글루코즈 농도 (mM). Y 축: 피코몰 H+/㎕/시간/2500 세포의 단위로 나타낸 PBMC의 대사 활성율. 산성화 동력학은 37℃에서의 배양 1 시간 중에 측정된다.
도 13A, D, G - "CLOSE"; 13B, E, H - "OPEN"; 13C, F, I - "C-O" = "CLOSE"-"OPEN". 도 13A-C - 대표적인 건강한 공여체의 전형적인 MA 프로필. 도 13D-F - 대표적인 암 환자의 전형적인 MA 프로필. 도 13G-I - 전신 루푸스 (자가면역 질환)가 있는 환자의 MA 프로필.
본 발명은 그의 일부의 구체예에서, 대사 활성 프로필을 모니터링 및 분석하는 방법, 및 그의 진단적 또는 치료학적 용도에 관한 것이거나, 특히 혈액 샘플의 대사 활성 모니터링에 의한 암 진단에 관한 것이다.
본 발명의 적어도 하나의 구체예를 상세히 설명하기 전에, 본 발명은 이하의 설명에 제시되거나 실시예에 의해서 예시된 상세한 사항으로 그의 적용이 반드시 제한되지 않는다는 것을 이해하여야 한다. 본 발명은 다른 구체예도 가능하거나, 다양한 방식으로 실시 또는 수행될 수 있다.
오늘날, 다양한 질병의 조기 검출 및 기결정을 위해서는 고속-처리 방법 (high-throughput methods)이 절실하게 필요하다. 예를 들어, 암을 발견하고 치료하는 것이 빠르면 빠를수록 생존율은 더 좋다. 또한, 질병의 단계를 확인하는 것은 적절한 치료를 보장한다.
본 발명자들은, 비교적 후기 단계에서의 질병 검출을 허용하는 질병과 연관된 다양한 인시츄 파라메터 또는 적절한 순환 마커를 분석하는 질병 검출을 위한 표준 방법과는 대조적으로, 면역 시스템이 질병의 발현 시에 이미 질병 상태를 반영할 수 있음을 깨달았다. 면역 시스템은 천연적으로 초기 단계에서 이미 질병 발생과 싸우는데 책임이 있기 때문에, 적절한 면역 반응의 특징적 프로필을 확인하는 것이 유익할 것이다. 질병 발생에 따르는 면역 시스템의 대사 활성의 이러한 프로필의 변이는 또한 질병 기결정에 유용할 수 있을 것이다. 예를 들어, 항상성에 있어서는 면역 시스템 활성이 잘 제어되어야 한다; 과활성은 자가면역 질환과 연관되는 반면에 암 발생은 아마도 면역 시스템의 저활성과 관련된다. 이들 반대 경로는 다양한 영양소 및 자극제에 대한 반응으로 일반적이며 더욱 특이적인 MA 프로필에 의해서 표시될 수 있다.
따라서, 본 발명자들은 질병의 지표로서 적절한 세포 집단의 대사 활성의 정량적 측정을 위한 획기적인 임상적 방향의 방법을 고안하였다. 측정검사 (assay)는 pH-민감성 불투과성 형광 프로브를 사용하여 세포외 환경을 모니터링함으로써 마이크로리터 세포 샘플의 대사 활성의 비율을 측정한다.
이하의 실시예 항목에 예시된 바와 같이, 대사 활성 (MA) 분석을 사용하여 본 발명자들은 암 환자 및 건강한 공여체로부터 수득된 PBMC에 대해 모니터링된 상이한 대사 경로들 사이에서 상당한 이동이 있음을 깨달았다. 이러한 이동은 PBMC의 대사 활성에 있어서의 특징적인 변화를 모니터링함으로써 건강한 공여체와 암 환자 사이의 명백한 차이에 대한 진단 도구로서 채택될 수 있다 (도 6-10, 13). 이들 중요한 예비적 발견은 "open" 대 "close" (공기-밀폐) 웰에서의 MA 시험 결과를 비교함으로써 수득되었다. 두 가지 기록들은 모두 가용성 대 휘발성 대사 생성물 (락트산 대 CO2 및 NH3)의 축적을 측정함으로써 이하에 설명하는 바와 같이 3 가지 대사 경로, 즉 산화적 포스포릴화, 혐기성 해당작용 및 호기성 해당작용 사이를 구분할 수 있게 한다.
대부분의 통상적인 분화 세포와 같이 비-활성화 T 세포 (천연 T 세포)는 주로 미토콘드리아 산화적 포스포릴화에 의존하여 세포 과정에 필요한 에너지를 위한 ATP, 및 휘발성 CO2 생성물을 효율적으로 생성시킨다. 산소의 부재 하에서, 이들은 반드시 혐기성 해당작용으로 알려진 락트산 생산과 연관된 ATP 생산의 훨씬 덜 효율적인 대사 경로에 의존하여야 한다. 그에 반해서, 대부분의 암 세포18는 산소의 존재에도 불구하고 혐기성 해당작용과 유사한 호기성 해당작용에 의존하는 것으로 발견된다. 이러한 현상은 원래, 암 세포와 관련하여 오토 와버그에 의해서 발견되었으며, "와버그 효과"라 칭하였다. 본 발명자들은 암 환자의 신선한 PBMC에서 "와버그 효과"의 존재를 밝혀냈다. 이론적으로 구속되지는 않지만, "와버그 효과"의 면역대사적 원리 (immunometabolic rational), 즉 암 환자의 신선한 PBMC에서 천연 및 활성화 림프구 사이의 이동은, 초기 단계에서 혈관형성 전에 아마도 산소 결핍이 되는 종양 세포 근처에서 활성화 T 세포의 공격적이며 효과적인 생리학적 기능의 필요성과 관련될 수 있다. 이 생각은 종양 세포가 초기에 "와버그 효과"를 통해서 산소 결핍에 적응한다는 사실과 일치한다.
상기의 대사 경로에 비추어, 최종 생성물, CO2 및 락테이트는 MA 시험에 의해서 검사된 산성화에 직접 기여한다.
또한, MA 시험에서 주된 역할을 하는 것으로 생각되는 또 다른 최종 생성물은 암모니아 (NH3)이다. 세포 에너지의 주된 공급원 중의 하나는 단백질을 아미노산으로 파괴시키는 과정인 단백질 이화작용이다. 아미노 그룹은 아미노산으로부터 분리되어 암모니아로 전환된다. 세포 NH3 생산의 또 다른 공급원은 질소성 염기의 2 그룹을 구성하는 퓨린 및 피리미딘의 대사 경로를 통해서이다. 생체내에서와 같은 본 측정 시스템에서, 활력 세포 (vital cell)는 반드시 락트산, 카본산 및 암모늄 염기와 같은 대사적 산성 및 염기성 생성물의 분비에 의해서 약 7.2-7.4의 일정한 pH에서 세포질을 유지하여야 한다.
이들 발견은 이미, 면역 시스템과 소통함으로써 생리학적으로-지향된 MA 분석이 다른 질환뿐만 아니라 암을 검출, 진단 및 치료하는 새로운 방법을 개발하기 위한 중요한 암시를 가질 수 있었음을 확실히 한다.
따라서, 본 발명의 관점에 따르면 세포의 대사 활성 (MA)을 측정하는 방법이 제공된다. 상기의 방법은
(i) 비-휘발성 가용성 대사 생성물;
(ii) 비-휘발성 가용성 대사 생성물 및 휘발성 가용성 대사 생성물;
(iii) 휘발성 가용성 대사 생성물의 분비에 기인한 시간-의존적 산성화 프로필을 세포의 세포외 환경에서 독립적으로 (즉, 개별적으로) 측정하는 것을 포함하며,
여기에서, 시간-의존적 산성화 프로필 중의 적어도 하나는 세포의 대사 활성 경로를 나타낸다.
본 명세서에서 사용된 것으로서 "대사 활성 경로"는 에너지 생산에 대한 미토콘드리아 산화적 포스포릴화, 혐기성 해당작용, 호기성 해당작용 및 NH3 + 생산의 상대적 기여를 나타낸다.
프로필은 스파이크 배열 (spike configuration) 또는 단조 포화 거동 (monotonic saturated behavior)을 가질 수 있다.
스파이크 프로필은 전형적으로, 농도 의존적 영양소 반응에 비해 더 특이적인 것으로 예상되는 대사 활성의 수용체 매개된 자극을 반영한다. 상기의 반응은 일반적으로 단조 포화 프로필이다.
본 명세서에서 사용된 것으로서 "세포"는 그에 대한 상기의 대사 활성이 측정될 수 있는 원핵 또는 진핵 세포를 나타낸다. 세포는 박테리아, 효모, 식물, 곤충 또는 포유동물 세포일 수 있다. 특정한 구체예에 따르면, 세포는 인간 세포이다. 세포는 단일 세포를 나타낼 수 있지만, 또한 다수의 세포를 나타낼 수도 있는 것으로 인식될 것이다. 세포는 분리된 세포 (조직 기구를 갖지 않음) 또는 조직 또는 조직 단편 내의 세포일 수 있다. 특정한 구체예에 따르면, 세포가 PBMC인 경우에, 측정검사는 103-1010 세포에 대해 수행된다. 특정한 구체예에 따르면, 세포의 수는 106-107이다.
세포는 분화 세포, 비-분화 세포 (예를 들어, 줄기 세포) 또는 탈분화 세포일 수 있다.
특정한 구체예에 따르면, 세포는 백혈구 (즉, 백혈구(leukocyte))인 면역 시스템의 세포이다. 예로는 호중구, 호산구, 호염기구, 림프구 (T 세포 또는 B 세포), 단핵구, 대식세포 및 수지상 세포가 포함된다.
또 다른 구체예에 따르면, 세포는 암 세포와 같이 어떤 조직의 병원성 또는 병적인 세포이다. 본 발명의 기술에 따라 검출될 수 있는 그 밖의 다른 질병 및 의학적 상태는 이하에 제시된다.
본 발명의 기술에 따라 분석될 수 있는 그 밖의 다른 세포에는 배아 세포 (예를 들어, IVF 자격을 위한 경우), 적혈구, 혈소판, 박테리아-감염 세포, 진균-감염 세포, 및 바이러스 감염 세포가 포함되나, 이들로 제한되지는 않는다.
따라서, 세포는 특정 세포의 고도로 정제된 서브세트를 포함하는 세포의 분리된 집단, 즉 동형 세포 집단 (예를 들어, > 80% 순도), 예를 들어, T 세포, 또는 말초혈액 백혈구 (PBL) 또는 단핵 세포와 같은 다양한 타입의 면역 세포를 포함하는 이형 세포 집단을 나타낼 수 있다.
세포는 비-배양, 배양 일차 세포 또는 클론화 세포 (예를 들어, 세포주)일 수 있다.
세포는 부착 세포 또는 현탁액 중의 세포일 수 있다.
추가의 구체예에 따르면, 세포는 비-유전적 변형되거나, 유전적 변형될 수 있다.
본 명세서에서 사용된 것으로서 "독립적으로 측정"은 항목 (i), (ii) 및 가능하게는 (iii)을 개별적으로 측정하는 것을 나타낸다. 특정한 구체예에 따르면 (iii)은 (ii)로부터 (i)을 뺀 결과인 것으로 인식될 수 있다고 하더라도, 이들 개별적인 측정은 동일하지만 별개의 세포 샘플에 대하여 병행하여, 동시에 수행되거나, 단일 세포 샘플에 대해 순차적으로 수행될 수 있다 (이하의 실시예 항목에 기술된 바와 같음).
따라서, 세포외 산성화 프로필의 측정은 산성화의 검정곡선에 의해서 수행된다 (표 1).
대사 활성의 측정은 "open" 및 "close" 상태에서 세포의 세포외 환경에서 형광적으로 측정된 pH 변화에 관하여 누적 산성화 (예를 들어, pmol/㎕/시간/2500 세포)를 계산함으로써 수행된다. 특정한 구체예에 따르면, 이 측정은 세포내가 아니라, 단지 세포의 세포외 환경에서만 수행되는 것으로 인식될 것이다. 세포외 pH 측정이 유리한데, 이는 세포외 환경에서는 항상성 생리학적 조절에 기인하여 일시적인 세포내 반응에서의 비교적 작은 평균 변화에 대비하여 지속적인 산성 축적이 있고; 세포내 과정에 의한 세포외 프로브의 생리학적 간섭이 없으며; 세포외 비율 척도 형광성 프로브의 비교적 높은 신호 대 잡음비가 있으며; 세포 조작에 대비한 형광성 배지 (보정된 완충능) 제제의 단순성이 있고; 세포내 프로브의 상당한 누출과는 대조적으로 배경 형광이 없으며; 동력학 측정이 투과화 절차에 대한 필요성이 없이 이루어짐으로써 생존 세포의 분석이 실시간으로 허용되고; 퀀칭 (quenching) 및 산화 효과와 연관된 문제가 최소이며; 마지막으로, 상기한 장애가 없이 동시 고속 처리 동력학 측정이 가능하기 때문이다.
본 명세서에서 사용된 것으로서 세포의 "세포외 환경"은 천연 환경, 예를 들어, 혈액 또는 혈장, 또는 배양 배지와 같은 인공적 환경을 나타낸다.
특정한 구체예에 따르면, MA 시험은 보정된 완충능을 갖는 규정된 용액 (모든 성분은 공지된다) 내에서 이루어진다.
완충능은 생리학적 pH에서의 최소 변화를 보장하여야 하는 것으로 인식될 것이다.
특정한 구체예에 따르면, 완충액은 포스페이트 완충액 (예를 들어, 포스페이트 완충 식염수 1-10 mM 또는 10 mM 포스페이트 완충액)이다. 낮은 완충액 농도가 낮은 세포 농도에서의 산성화 측정에 필요한 것으로 인식될 것이다. 특정한 구체예에 따르면, 10 mM 포스페이트 완충 식염수가 2.5x106 세포/㎖에 대해서 사용된다.
따라서, 대사 활성의 동력학은 HPTS 형광 보정된 완충능의 최소 산성화 과정에 의해서 배양 중에 모니터링된다.
도 3A-D 및 4A-D는 각각 작업 용액 보정 및 프로브 보정을 설명한다.
특정한 구체예에 따르면, 산성화 프로필의 측정은 항온, 예를 들어, 20-40℃에서, 또는 특히 최적 성장온도, 즉 포유동물 세포의 경우에 37℃에서 수행된다.
상기에서 기술된 바와 같이, 세포외 산성화 프로필은 세포에 의해서 분비된 다양한 대사 생성물의 정체를 나타낸다.
도 1에 나타낸 바와 같이, 종양 또는 증식성 조직 (예를 들어, 활성화 T 세포)는 주로 배지에 대한 락테이트의 분비를 특징으로 하는 호기성 해당작용을 선택적으로 사용한다. 그에 반해, 분화 조직은 산화적 포스포릴화 또는 혐기성 해당작용을 사용할 것이며, 따라서 산소의 이용도에 따라 각각 CO2 또는 락테이트를 분비할 것이다.
특정한 구체예에 따르면, 주로 락테이트인 비-휘발성 가용성 대사 생성물의 분비에 기인한 시간-의존적 산성화 프로필은 공기-노출된 챔버 내에서 수행된다. 이러한 조건 ("open") 하에서는 C02 및 NH3의 가스 환기가 있어서 단지 락테이트 산 생산 (다른 비-휘발성 유기산을 포함) 만이 각각의 웰에서 동등한 산성 축적에 기여한다.
특정한 구체예에 따르면, 비-휘발성 가용성 대사 생성물 및 휘발성 가용성 대사 생성물의 분비에 기인한 시간-의존적 산성화 프로필은 공기-밀폐 챔버 내에서 수행된다. 용접 밀폐된 상태 ("close")에서, CO2 및 NH3는 물과 평형으로 반응하여 카본산 및 염기성 암모늄 이온을 형성한다. 그러나, 이 상태에서 NH4 + 염기성 양이온은 대략 pH 7에서 락트산 및 카본산 음이온 둘 다에 의해 생산된 산도 수준을 적정한다.
특정한 구체예에 따르면, 산성화 동력학은 멀티 웰 플레이트의 공기 "open" 및 "close" 상태의 30분 순서에서 측정된다.
산성화 (+) 및 염기성 적정 (-)의 적절한 비율 (V)에 의해서, 개방 상태 (Vopen) 및 밀폐 상태 (Vclosed)에서 산성화의 총 측정된 비율은 이하의 연결된 수학식에 의해서 기술된다:
Vopen = V(락트산).
Vclose = V(락트산) + V(카본산) - V(암모늄 염기).
이 구성을 사용하여, 휘발성 가용성 대사 생성물의 분비에 기인한 시간-의존적 산성화 프로필은 (ii)-(i)의 프로필의 공제에 의해서 계산된다.
세포외 산성화의 동력학 측정은 비-독성 막 불투과성 프로브를 사용하여 수행된다. 예로는 비율 척도 pH 프로브, CO2 프로브, NH3 프로브, 락테이트 프로브 및 이들의 조합이 포함되나, 이들로 제한되지는 않는다. 특정한 구체예에 따르면, pH 완충 조건에서 높은 민감성을 위해서 비율 척도 기술이 필요하다.
본 발명의 기술에 따라 사용될 수 있는 특정의 프로브의 예로는 HPTS, CFDA 및 카복시 플루오레세인이 포함되나, 이들로 제한되지는 않는다. 이러한 프로브는 Molecular Probes로부터 제공되는 것과 같이 상업적으로 이용할 수 있다.
특정한 구체예에 따르면, 산성화의 측정은 비율 척도 pH 프로브 8-하이드록시피렌-1,3,6-트리설폰산 (HPTS)을 사용하여 수행된다.
HPTS는 수성 완충액 중에서 ~7.3의 pKa를 갖는 비용 효율적이며, 비-독성이고, 매우 수용성인 막-불투과성 pH 지표이다. HPTS는 pH-의존성 흡수 이동을 나타내어 455 ㎚ 및 403 ㎚에서의 여기 하에 순차적으로 측정된 513 ㎚에서의 형광 강도 사이의 비의 함수로서 비율 척도 pH 측정을 허용한다. 이 방법은 대략 pH 7의 생리학적 범위에서의 미미한 pH 변화에 대한 본 발명의 민감한 측정에 필수적이다.
특정한 구체예에 따르면. 형광성 프로브를 CO2, NH3, 락트산 등의 다양한 대사 생성물의 비율 척도 특이적인 광학적 모니터링을 확대시키기 위해 나노센서 (nanosensors)인 나노입자에 부착시킨다. 세포내 형광 측정은 예를 들어, 칼슘 가동화 및 막 탈분극을 위한 자극의 생리학적 기전의 기본적 연구에 매우 유용하다. 그러나, 항상성 세포 반응 하에서 이들 세포내 자극 신호는 일시적이 된다. 따라서, 이들은 MA 시험에서 기록되는 상시 누적 세포외 산성화에 비해 PBLs 자극의 민감한 모니터링에 훨씬 덜 적합한 것으로 생각된다. 이러한 세포외 모니터링은 비율 척도 분자 광학적 프로브를 나노입자에 부착시킴으로써 더 잘 촉진될 수 있다. 세포외 모니터링은 생체적합성이며, 세포내 프로브 측정에 공통적인 부정적 효과를 최소화하고, 기본적 연구에서뿐만 아니라 다양한 세포 타입에서의 다양한 임상적 적용성에 대한 세포외 방법의 이점을 시사한다.
산성화 프로필은 피코몰/㎕/시간/2500 세포 단위로 나타내는 H20-H+ 등가물의 분비율로 표시된다 (참조: 도 6-8, 13).
상기 산성화 프로필 중의 어떤 것이라도 세포의 대사 활성의 지표로 사용될 수 있다. 대안적으로, 측정된 프로필 중의 단지 하나가 세포의 대사 활성을 나타낸다.
언급된 바와 같이, 세포의 대사 활성은 자극제 또는 억제제의 다양한 농도에 노출된 활성화/효과기 세포 또는 천연 세포에서 측정될 수 있다.
본 명세서에서 사용된 것으로서 "자극제" 또는 "억제제"는 그에 대한 반응으로 세포의 대사 경로를 증가, 감소 또는 변화시키는 실체를 나타낸다.
예를 들어, 세포가 림프구이면, 자극제는 TCR 또는 BCR에 의해서 인식되며, 클론 증식 또는 항체 생산을 초래하는 항원이다. 특정의 자극제 또는 억제제는 이하의 표 1에 열거된다.
[표 1]
Figure pct00001
그 밖의 다른 예는 이하에 제시된다.
자극제 또는 억제제는 세포 또는 세포-연관된 자극제 또는 억제제일 수 있다. 자극성 세포의 예로는 백혈구, 줄기 세포, 혈소판, 적혈구, 박테리아 및 진균이 포함되나, 이들로 제한되지는 않는다. 이러한 세포성 자극제 또는 억제제는 온전한 세포 또는 세포 단편, 예를 들어, 세포막을 나타낼 수 있다.
세포 자극제의 사용은 이식편대 숙주 질환 또는 이식 거부반응을 예방 또는 치료하여 이식 거부 (조직 매칭)가 예측되는 경우와 같이 이식 적용분야에서 사용하기 위한 혼합 림프구 반응 (MLR)에서 특히 유리하다. 이러한 경우에, 자극제는 세포에 대해서 비-공통 유전자형 림프구이다.
대안적으로, 자극제 또는 억제제는 무-세포 항원 (예를 들어, 가용성 항원, 바이러스, 세포성 생물학적 유체)과 같이 무-세포성일 수 있다. 무-세포 자극제 또는 억제제의 특정한 예로는 대사산물, 영양소 (예를 들어, 글루코즈), 미토겐, 펩타이드, 사이토킨, 호르몬, 비타민, 약물, 항체, 신경전달물질, 암 특이적 항원 및 다양한 질병-연관된 조직-특이적 표준 항원 (TNAs)이 포함되나, 이들로 제한되지는 않는다.
MHC-제한 항원 (펩타이드)의 특정한 예로는 CEA (암배아 항원), MUC-1, HER2, CD340, MAGE 및 프로락틴이 포함되나, 이들로 제한되지는 않는다 (그 밖의 다른 것들은 문헌 [Renkvist et al. 2001 "A listing of human tumor antigens recognized by T cells". Cancer Immunol. Immunotherapy 50:3-15]에 열거된다).
자극제 또는 억제제는 다양한 농도로 세포와 접촉시킨다.
자극제 또는 억제제는 의심스러운 병리학에 따라 선택된다. 예를 들어, 시험관내 수정 적용분야에서는 그의 세포외 유체에 대한 배아 분비의 상시 MA를 검사한다. 대안적으로 또는 추가로, 모체 PBL의 MA 자극 프로필을 배아 분비의 자극에 의해서 검사한다.
스크리닝 시험에서는, 세포를 다수의 자극제 또는 억제제와 접촉시키고, 산성화 프로필을 각각의 이러한 반응에 대해서 동시에 모니터링한다.
따라서, 상술한 바와 같은 MA 시험은 다수의 자극제/억제제에 대한 반응을 스크리닝하거나 상이한 환자로부터의 다수의 샘플 또는 이들의 조합을 스크리닝하여 제한된 수의 샘플에 대해 (예를 들어, 조직 배양 접시를 사용), 또는 다수의 샘플에 대해 수행할 수 있다. 고속 처리 스크리닝은 멀티 웰 플레이트, 멀티 웰 플레이트 판독기 (형광성 신호의 검출용), 영상 분석을 적용하는 CCD 카메라 또는 광섬유 매트릭스를 사용하여 수행될 수 있다.
본 발명의 구체예에 따르면, 생성된 산성화 프로필은 데이터 조작 및 컴퓨터 모델의 구성이 가능하도록 컴퓨터 판독가능한 매체 상의 것과 같은 데이터베이스에 기록 및 저장한다. 본 명세서에서 사용된 것으로서 "컴퓨터 판독가능한 매체"는 컴퓨터에 의해서 직접 판독하고 접근할 수 있는 모든 매체를 나타낸다. 이러한 매체에는 플로피 디스크, 하드 디스크 저장 매체 및 자기 테이프와 같은 자기 저장 매체; 광학 디스크 또는 CD-ROM과 같은 광학 조장 매체; RAM 및 ROM과 같은 전기 저장 매체; 및 자기/광학 저장 매체와 같은 이들 카테고리의 하이브리드가 포함되나, 이들로 제한되지는 않는다. 적절한 저장 매체의 선택 및 사용은 본 기술분야에서 통상적으로 숙련된 전문가의 능력의 범위 내에서 잘 이루어진다.
본 명세서에서 사용된 것으로서 "기록"은 컴퓨터 판독가능한 매체 상에 정보를 저장하는 과정을 나타낸다.
본 발명의 방법의 견고성 (robustness) 및 정확성은 다수의 임상적 적용분야에서의 그의 용도를 시사한다.
따라서, 본 발명의 관점에 따르면
(a) 세포를 포함하는 대상체의 생물학적 샘플을 제공하고;
(b) (i) 비-휘발성 가용성 대사 생성물;
(ii) 비-휘발성 가용성 대사 생성물 및 휘발성 가용성 대사 생성물; 및
(iii) 휘발성 가용성 대사 생성물의 분비에 기인한 시간-의존적 산성화 프로필을 세포의 세포외 환경에서 독립적으로 측정하는 것을 포함하며,
여기에서, 시간-의존적 산성화 프로필 중의 적어도 하나가 세포의 대사 활성을 나타내는 반면, 동일한 조건 하에서 검사한 정상적인 비질병 세포 샘플의 경우와 비교한 대사 활성에 있어서의 이동은 변형된 대사 활성과 연관된 질병을 나타내는 것인,
이를 필요로 하는 대상체에서 변형된 대사 활성과 연관된 질병을 진단하는 방법이 제공된다.
대상체는 일상적인 웰빙 검진 (well-being check up)을 받고 있는 건강한 동물 또는 인간 대상체일 수 있다. 대안적으로, 대상체는 암과 같이 변형된 대사 활성과 연관된 질병을 가질 위험이 있을 수 있고 (예를 들어, 유전적 소인이 있는 대상체, 암의 병력 및/또는 가족력이 있는 대상체, 발암물질, 직업 재해, 환경 재해에 노출된 대상체)/있거나 암의 의심스러운 임상적 증상 [예를 들어, 대변에서의 혈액 또는 흑색변, 설명할 수 없는 통증, 발한, 설명할 수 없는 열, 식욕부진까지의 설명할 수 없는 체중 감소, 배변 습관의 변화 (변비 및/또는 설사), 이급후중 (특히 직장암인 경우의 불완전한 배변의 느낌), 빈혈 및/또는 일반적 쇠약감)을 나타내는 대상체일 수 있다.
본 명세서에서 사용된 것으로서 "변형된 대사 활성과 연관된 질병"은 정상적인 건강인 (질병에 걸리지 않은)으로부터 채취한 동일한 세포 집단과 비교하여 대사 활성의 이동을 겪은 세포 집단을 특징으로 하는 질병을 나타낸다. 대사 활성의 이동을 겪은 그 세포 집단은 병원성 세포 집단 (즉, 질병을 야기하는 세포, 예를 들어, 암 세포) 또는 비-병원성 세포 집단 (예를 들어, 질병 투쟁 세포, 예를 들어, 고형-종양의 경우에서와 같은 면역 세포)일 수 있다. 예를 들어, 상술한 바와 같이, 종양학에서 주로 대부분의 암 세포 및 클론 증식을 겪는 면역 시스템의 일부의 집단은 대부분의 정상 세포에서와 같은 비교적 낮은 비율의 해당작용에 이은 미토콘드리아 내에서의 피루베이트의 산화작용에 의해서가 아니라, 높은 비율의 해당작용에 이은 사이토졸 내에서의 락트산 생산에 의해서 에너지를 산출한다 (참조: 도 1).
본 발명의 기술에 따라 사용될 수 있는 세포성 생물학적 샘플에는 혈액 (예를 들어, 말초혈액 백혈구, 말초혈액 단핵구 세포, 전체 혈액, 제대혈), 고형 조직 생검물, 뇌척수액, 소변, 림프액, 및 호흡기, 장관 및 비뇨생식기의 다양한 외부 분비물, 활액, 양수 및 융모막 융모가 포함되나, 이들로 제한되지는 않는다.
생검물에는 절개 또는 절제 생검물, 미세-바늘 흡입물 등을 포함하는 수술 생검물, 완전한 절제물 또는 체액이 포함되나, 이들로 제한되지는 않는다. 생검물 회수의 방법은 본 기술분야에서 잘 알려져 있다.
본 명세서에서 사용된 것으로서, 용어 "진단" 또는 "진단하는"은 병리학 (예를 들어, 질병, 장애, 상태 또는 증후군)의 존재 또는 부재를 결정하고, 병리학 또는 증상을 분류하고, 병리학의 중증도를 결정하고, 병리학 진행을 모니터링하고, 병리학의 결과 및/또는 회복할 가망을 예측하고, 특정 질병에 대해 대상체를 스크리닝하는 것을 나타낸다.
본 발명에 따르면, 동일한 세포 조성의 정상적인 건강한 (병에 걸리지 않은) 샘플의 산성화 프로필은 대상체의 세포를 모니터링하기 위해서 사용된 동일한 조건 하에서 측정하였다.
일단 산성화 프로필이 수득되면 (예를 들어, 자극제/억제제가 있거나 없이), 프로필(들)을 기록한다. 동일한 조건 하에서 수득된 산성화 프로필로부터 입증되는 바와 같은 대상체의 세포와 대조군 (정상, 질병에 걸리지 않은)의 세포 사이의 대사 활성에 있어서의 이동 (즉, 변화)은 변형된 대사 활성 프로필과 연관된 질병을 나타낸다.
대사 활성 측정검사의 결과를, 결과를 분류하고 최종 진단하는데 도움을 주는 의사결정 계통도 모델에 적용할 수 있다. 바람직한 구체예에 따르면, 적어도 2 개의 모델을 조합한다 (참조: 도 9 및 10). 이러한 모델의 예에는 CHAID, C5 및 C&R 계통도가 포함되나, 이들로 제한되지는 않는다. 로지스틱 모델이 더 적용될 수 있다.
본 발명에 따라 진단 및 치료될 수 있는 (이하에 더 기술되는 바와 같음) 의학적 상태의 예로는 암, 병원성 감염 및 자가면역 질환이 포함되나, 이들로 제한되지는 않는다. 구체적인 예는 이하에 제시된다.
염증성 질환 - 만성 염증성 질환 및 급성 염증성 질환이 포함되나, 이들로 제한되지는 않는다.
과민성과 연관된 염증성 질환
과민성의 예로는 타입 I 과민성, 타입 II 과민성, 타입 III 과민성, 타입 IV 과민성, 즉시형 과민성, 항체 매개 과민성, 면역 컴플렉스 매개 과민성, T 림프구 매개 과민성 및 DTH가 포함되나, 이들로 제한되지는 않는다.
천식과 같은 타입 I 또는 즉시형 과민성.
타입 II 과민성에는 류마티스성 질환, 류마티스성 자가면역 질환, 류마티스성 관절염 [Krenn V. et al., Histol Histopathol 2000 Jul;15 (3):791], 척추염, 강직성 척추염 [Jan Voswinkel et al., Arthritis Res 2001; 3 (3): 189], 전신성 질환, 전신성 자가면역 질환, 전신성 홍반성 루푸스 [Erikson J. et al., Immunol Res 1998;17 (1-2):49], 경화증, 전신성 경화증 [Renaudineau Y. et al., Clin Diagn Lab Immunol. 1999 Mar;6 (2):156; Chan OT. et al., Immunol Rev 1999 Jun;169:107], 선 질환, 선 자가면역 질환, 췌장 자가면역 질환, 당뇨병, 타입 I 당뇨병 [Zimmet P. Diabetes Res Clin Pract 1996 Oct;34 Suppl:S125], 갑상선 질환, 자가면역 갑상선 질환, 그레이브스 (Graves')병 [Orgiazzi J. Endocrinol Metab Clin North Am 2000 Jun;29 (2):339], 갑상선염, 자발적 자가면역 갑상선염 [Braley-Mullen H. and Yu S, J Immunol 2000 Dec 15;165 (12):7262], 하시모토 (Hashimoto) 갑상선염 [Toyoda N. et al., Nippon Rinsho 1999 Aug;57 (8):1810], 점액 수종, 특발성 점액 수종 [Mitsuma T. Nippon Rinsho. 1999 Aug;57 (8):1759]; 자가면역 생식 질환, 난소 질환, 난소 자가면역성 [Garza KM. et al., J Reprod Immunol 1998 Feb;37 (2):87], 자가면역 항-정자 불임 [Diekman AB. et al., Am J Reprod Immunol. 2000 Mar;43 (3):134], 반복된 유산 [Tincani A. et al., Lupus 1998;7 Suppl 2:S107-9], 신경변성 질환, 신경적 질환, 신경적 자가면역 질환, 다발성 경화증 [Cross AH. et al., J Neuroimmunol 2001 Jan 1;112 (1-2):1], 알츠하이머병 [Oron L. et al., J Neural Transm Suppl. 1997;49:77], 중증 근무력증 [Infante AJ. And Kraig E, Int Rev Immunol 1999;18 (1-2):83], 운동 신경병증 [Kornberg AJ. J Clin Neurosci. 2000 May;7 (3):191], 길랑-바레 (Guillain-Barre) 증후군, 신경병증 및 자가면역 신경병증 [Kusunoki S. Am J Med Sci. 2000 Apr;319 (4):234], 근무력성 질환, 람버트-이튼 (Lambert-Eaton) 근무력성 증후군 [Takamori M. Am J Med Sci. 2000 Apr;319 (4):204], 부종양성 신경적 질환, 소뇌 위축증, 부종양성 소뇌 위축증, 비-부종양성 강직 인간 증후군, 소뇌 위축증, 진행성 소뇌 위축증, 뇌염, 라스무센 (Rasmussen) 뇌염, 근위축성 측색 경화증, 시드함 무도병 (Sydeham chorea), 질레 드 라 투렛 증후군 (Gilles de la Tourette syndrome), 다발성 내분비병증, 자가면역 다발성 내분비병증 [Antoine JC. and Honnorat J. Rev Neurol (Paris) 2000 Jan;156 (1):23]; 신경병증, 면역불량 신경병증 [Nobile-Orazio E. et al., Electroencephalogr Clin Neurophysiol Suppl 1999;50:419]; 신경근 긴장증, 후천적 신경근 긴장증, 선천성 근형성 부전증 [Vincent A. et al., Ann N Y Acad Sci. 1998 May 13;841:482], 심혈관 질환, 심혈관 자가면역 질환, 아테롬성 동맥경화증 [Matsuura E. et al., Lupus. 1998;7 Suppl 2:S135], 심근경색 [Vaarala O. Lupus. 1998;7 Suppl 2:S132], 혈전증 [Tincani A. et al., Lupus 1998;7 Suppl 2:S107-9], 육아종증, 베게너 (Wegener) 육아종증, 동맥염, 타카야수 (Takayasu) 동맥염 및 카와사키 (Kawasaki) 증후군 [Praprotnik S. et al., Wien Klin Wochenschr 2000 Aug 25;112 (15-16):660]; 항-인자 VIII 자가면역 질환 [Lacroix-Desmazes S. et al., Semin Thromb Hemost. 2000;26 (2):157]; 맥관염, 괴사성 소형-도관 맥관염, 현미경 다발성 맥관염, 처그 (Churg)-스트라우스 (Strauss) 증후군, 사구체신염, 불충분-면역 초점 (pauci-immune focal) 괴사성 사구체신염, 반월형 사구체신염 [Noel LH. Ann Med Interne (Paris). 2000 May;151 (3):178]; 항인지질 증후군 [Flamholz R. et al., J Clin Apheresis 1999;14 (4):171]; 심부전, 심부전에서 아고니스트 (agonist)-유사 β-아드레날린수용체 항체 [Wallukat G. et al., Am J Cardiol. 1999 Jun 17;83 (12A):75H], 혈소판감소성 자반병 [Moccia F. Ann Ital Med Int. 1999 Apr-Jun;14 (2):114]; 용혈성 빈혈, 자가면역 용혈성 빈혈 [Efremov DG. et al., Leuk Lymphoma 1998 Jan;28 (3-4):285], 위장 질환, 위장관의 자가면역 질환, 장 질환, 만성 염증성 장 질환 [Garcia Herola A. et al., Gastroenterol Hepatol. 2000 Jan;23 (1):16], 소아 지방변증 [Landau YE. and Shoenfeld Y. Harefuah 2000 Jan 16;138 (2):122], 근육계의 자가면역 질환, 근염, 자가면역 근염, 쇼그렌 (Sjogren) 증후군 [Feist E. et al., Int Arch Allergy Immunol 2000 Sep;123 (1):92]; 평활근 자가면역 질환 [Zauli D. et al., Biomed Pharmacother 1999 Jun;53 (5-6):234], 간 질환, 간 자가면역 질환, 자가면역 간염 [Manns MP. J Hepatol 2000 Aug;33 (2):326] 및 원발성 담즙성 간경변 [Strassburg CP. et al., Eur J Gastroenterol Hepatol. 1999 Jun;11 (6):595]이 포함되나, 이들로 제한되지는 않는다.
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지연형 과민성의 예로는 접촉 피부염 및 약물 발진이 포함되나, 이들로 제한되지는 않는다.
T 림프구 매개성 과민성의 타입의 예로는 헬퍼 T 림프구 및 세포독성 T 림프구가 포함되나, 이들로 제한되지는 않는다.
헬퍼 T 림프구-매개 과민성의 예로는 Th1 림프구 매개 과민성 및 Th2 림프구 매개 과민성이 포함되나, 이들로 제한되지는 않는다.
자가면역 질환
이것은 심혈관 질환, 류마티스성 질환, 선 질환, 위장 질환, 피부 질환, 간 질환, 신경적 질환, 근육 질환, 신장 질환, 생식과 관련된 질환, 결합조직 질환 및 전신성 질환이 포함되나, 이들로 제한되지는 않는다.
자가면역 심혈관 질환의 예로는 아테롬성 동맥경화증 [Matsuura E. et al., Lupus. 1998;7 Suppl 2:S135], 심근경색 [Vaarala O. Lupus. 1998;7 Suppl 2:S132], 혈전증 [Tincani A. et al., Lupus 1998;7 Suppl 2:S107-9], 베게너 육아종증, 타카야수 동맥염, 카와사키 증후군 [Praprotnik S. et al., Wien Klin Wochenschr 2000 Aug 25;112 (15-16):660], 항-인자 VIII 자가면역 질환 [Lacroix-Desmazes S. et al., Semin Thromb Hemost.2000;26 (2):157], 괴사성 소형-도관 맥관염, 현미경 다발성 맥관염, 처그-스트라우스 증후군, 불충분-면역 초점 괴사성 및 반월형 사구체신염 [Noel LH. Ann Med Interne (Paris). 2000 May;151 (3):178], 항인지질 증후군 [Flamholz R. et al., J Clin Apheresis 1999;14 (4):171], 항체-유도 심부전 [Wallukat G. et al., Am J Cardiol. 1999 Jun 17;83 (12A):75H], 혈소판감소성 자반병 [Moccia F. Ann Ital Med Int. 1999 Apr-Jun;14 (2):114; Semple JW. et al., Blood 1996 May 15;87 (10):4245], 자가면역 용혈성 빈혈 [Efremov DG. et al., Leuk Lymphoma 1998 Jan;28 (3-4):285; Sallah S. et al., Ann Hematol 1997 Mar;74 (3):139], 샤가스병에서 심장 자가면역성 [Cunha-Neto E. et al., J Clin Invest 1996 Oct 15;98 (8):1709] 및 항-헬퍼 T 림프구 자가면역성 [Caporossi AP. et al., Viral Immunol 1998;11 (1):9]이 포함되나, 이들로 제한되지는 않는다.
자가면역 류마티스성 질환의 예로는 류마티스성 관절염 [Krenn V. et al., Histol Histopathol 2000 Jul;15 (3):791; Tisch R, McDevitt HO. Proc Natl Acad Sci units S A 1994 Jan 18;91 (2):437] 및 강직성 척추염 [Jan Voswinkel et al., Arthritis Res 2001; 3 (3): 189]이 포함되나, 이들로 제한되지는 않는다.
자가면역 선 질환의 예로는 췌장 질환, 타입 I 당뇨병, 갑상선 질환, 그레이브스병, 갑상선염, 자발적 자가면역 갑상선염, 하시모토 갑상선염, 특발성 점액 수종, 난소 자가면역성, 자가면역 항-정자 불임, 자가면역 전립선염 및 타입 I 자가면역 다선성 증후군이 포함되나, 이들로 제한되지는 않는다. 질병에는 췌장의 자가면역 질환, 타입 1 당뇨병 [Castano L. and Eisenbarth GS. Ann. Rev. Immunol. 8:647; Zimmet P. Diabetes Res Clin Pract 1996 Oct;34 Suppl:S125), 자가면역 갑상선 질환, 그레이브스병 [Orgiazzi J. Endocrinol Metab Clin North Am 2000 Jun;29 (2):339; Sakata S. et al., Mol Cell Endocrinol 1993 Mar;92 (1):77], 자발적 자가면역 갑상선염 [Braley-Mullen H. and Yu S, J Immunol 2000 Dec 15;165 (12):7262], 하시모토 갑상선염 [Toyoda N. et al., Nippon Rinsho 1999 Aug;57 (8):1810], 특발성 점액 수종 [Mitsuma T. Nippon Rinsho. 1999 Aug;57 (8):1759], 난소 자가면역성 [Garza KM. et al., J Reprod Immunol 1998 Feb;37 (2):87], 자가면역 항-정자 불임 [Diekman AB. et al., Am J Reprod Immunol. 2000 Mar;43 (3):134], 자가면역 전립선염 [Alexander RB. et al., Urology 1997 Dec;50 (6):893] 및 타입 I 자가면역 다선성 증후군 [Hara T. et al., Blood. 1991 Mar 1;77 (5):1127]이 포함되나, 이들로 제한되지는 않는다.
자가면역 위장 질환의 예로는 만성 염증성 장 질환 [Garcia Herola A. et al., Gastroenterol Hepatol. 2000 Jan;23 (1):16], 소아 지방변증 [Landau YE. and Shoenfeld Y. Harefuah 2000 Jan 16;138 (2):122], 대장염, 회장염 및 크론병 (Crohn's disease)이 포함되나, 이들로 제한되지는 않는다.
자가면역 피부 질환의 예로는 심상성 천포창, 수포성 류천포창 및 낙엽성 천포창과 같은 (단, 이들로 제한되지는 않는다) 자가면역 수포성 피부 질환이 포함되나, 이들로 제한되지는 않는다.
자가면역 간 질환의 예로는 간염, 자가면역 만성 활성 간염 [Franco A. et al., Clin Immunol Immunopathol 1990 Mar;54 (3):382], 원발성 담즙성 간경변 [Jones DE. Clin Sci (Colch) 1996 Nov;91 (5):551; Strassburg CP. et al ., Eur J Gastroenterol Hepatol. 1999 Jun;11 (6):595] 및 자가면역 간염 [Manns MP. J Hepatol 2000 Aug;33 (2):326]이 포함되나, 이들로 제한되지는 않는다.
자가면역 신경적 질환의 예로는 다발성 경화증 [Cross AH. et al ., J Neuroimmunol 2001 Jan 1;112 (1-2):1], 알츠하이머병 [Oron L. et al ., J Neural Transm Suppl. 1997;49:77], 중증 근무력증 [Infante AJ. And Kraig E, Int Rev Immunol 1999;18 (1-2):83; Oshima M. et al., Eur J Immunol 1990 Dec;20 (12):2563], 신경병증, 운동 신경병증 [Kornberg AJ. J Clin Neurosci. 2000 May;7 (3):191]; 길랑-바레 증후군 및 자가면역 신경병증 [Kusunoki S. Am J Med Sci. 2000 Apr;319 (4):234], 근무력증, 램버트-이튼 근무력성 증후군 [Takamori M. Am J Med Sci. 2000 Apr;319 (4):204]; 부종양성 신경적 질환, 소뇌 위축증, 부종양성 소뇌 위축증 및 강직-인간 증후군 [Hiemstra HS. et al., Proc Natl Acad Sci units S A 2001 Mar 27;98 (7):3988]; 비-부종양성 강직 인간 증후군, 진행성 소뇌 위축증, 뇌염, 라스무센 뇌염, 근위축성 측색 경화증, 시드함 무도병, 질레 드 라 투렛 증후군 및 자가면역 다발성 내분비병증 [Antoine JC. and Honnorat J. Rev Neurol (Paris) 2000 Jan;156 (1):23]; 면역불량 신경병증 [Nobile-Orazio E. et al., Electroencephalogr Clin Neurophysiol Suppl 1999;50:419]; 후천적 신경근 긴장증, 선천성 근형성 부전증 [Vincent A. et al., Ann N Y Acad Sci. 1998 May 13;841:482], 신경염, 시신경염 [Soderstrom M. et al., J Neurol Neurosurg Psychiatry 1994 May;57 (5):544] 및 신경변성 질환이 포함되나, 이들로 제한되지는 않는다.
자가면역 근육 질환의 예로는 근염, 자가면역 근염 및 원발성 쇼그렌 증후군 [Feist E. et al., Int Arch Allergy Immunol 2000 Sep;123 (1):92] 및 평활근 자가면역 질환 [Zauli D. et al., Biomed Pharmacother 1999 Jun;53 (5-6):234]이 포함되나, 이들로 제한되지는 않는다.
자가면역 신장 질환의 예로는 신염 및 자가면역 간질성 신염 [Kelly CJ. J Am Soc Nephrol 1990 Aug;1 (2):140]이 포함되나, 이들로 제한되지는 않는다.
생식과 관련된 자가면역 질환의 예로는 반복 유산 [Tincani A. et al., Lupus 1998;7 Suppl 2:S107-9]이 포함되나, 이들로 제한되지는 않는다.
자가면역 결합조직 질환의 예로는 귀 질환, 자가면역 귀 질환 [Yoo TJ. et al., Cell Immunol 1994 Aug;157 (1):249] 및 내이의 자가면역 질환 [Gloddek B. et al., Ann N Y Acad Sci 1997 Dec 29;830:266]이 포함되나, 이들로 제한되지는 않는다.
자가면역 전신성 질환의 예로는 전신성 홍반성 루푸스 [Erikson J. et al., Immunol Res 1998;17 (1-2):49] 및 전신성 경화증 [Renaudineau Y. et al., Clin Diagn Lab Immunol. 1999 Mar;6 (2):156); Chan OT. et al., Immunol Rev 1999 Jun;169:107]이 포함되나, 이들로 제한되지는 않는다.
감염성 질환
감염성 질환의 예로는 만성 감염성 질환, 아급성 감염성 질환, 급성 감염성 질환, 바이러스성 질환, 박테리아 질환, 원생동물 질환, 기생충 질환, 진균성 질환, 마이코플라즈마 질환 및 프리온 (prion) 질환이 포함되나, 이들로 제한되지는 않는다.
이식 거부 질환
이식편의 이식과 연관된 질환의 예로는 이식 거부, 만성 이식 거부, 아급성 이식 거부, 초급성 이식 거부, 급성 이식 거부 및 이식편 대 숙주 질환이 포함되나, 이들로 제한되지는 않는다.
알레르기 질환
알레르기 질환의 예로는 천식, 두드러기, 담마진, 꽃가루 알레르기, 먼지 진드기 알레르기, 독 알레르기, 화장품 알레르기, 라텍스 알레르기, 화학약품 알레르기, 약물 알레르기, 곤충 자상 알레르기, 동물 비듬 알레르기, 쐐기 식물 (stinging plant) 알레르기, 덩굴 옻나무 (poison ivy) 알레르기 및 식품 알레르기가 포함되나, 이들로 제한되지는 않는다.
특정한 구체예에 따르면, 질병은 암이다.
암성 질환
암의 예로는 암종, 림프종, 아세포종, 육종 및 백혈병이 포함되나, 이들로 제한되지는 않는다. 암성 질환의 특별한 예로는 만성 골수성 백혈병, 화농이 있는 급성 골수성 백혈병, 급성 전골수성 백혈병, 증가된 호중구를 갖는 급성 비림프구성 백혈병, 급성 단구성 백혈병, 호산구 증가증을 갖는 급성 골수단구성 백혈병과 같은 골수성 백혈병; 버킷 비-호지킨 (Birkitt's Non-Hodgkin's) 림프종과 같은 악성 림프종; 급성 림프아구성 백혈병, 만성 림프구성 백혈병과 같은 림프구성 백혈병; 고형 종양, 양성 수막종, 타액선의 혼합 종양, 대장 선종과 같은 골수증식성 질환; 소세포 폐암, 신장, 자궁, 전립선, 방광, 난소, 육종, 지방육종, 점액성, 활액성 육종, 횡문근육종 (폐포), 골격외 점액성 콘드로육종 (Extraskeletel myxoid chonodrosarcoma), 유잉 종양 (Ewing's tumor)과 같은 선암이 포함되나, 이들로 제한되지는 않으며; 그 밖의 다른 것에는 고환 및 난소 미분화세포종, 망막아종, 윌름스 종양 (Wilms' tumor), 신경아세포종, 악성 흑색종, 중피종, 유방, 피부, 췌장, 경부, 전립선 및 난소 종양이 포함된다.
따라서, 본 발명은 질병 검출에 사용될 수 있다. 다음은 초기 암 검출에 관한 비-제한적 구체예이다.
본 발명은 암의 조기 검출 및 기결정을 위한 비-침습성 진단 도구로서 면역 시스템-기본 접근방법을 제공한다. 통상적인 진단 접근방법은 주로 악성 조직의 병리학 및 암 특이적 항원 및 유전자에 초점을 맞추었다. 반대로, 본 발명은 암 (다른 질병뿐만 아니라)의 조기 검출 및 기결정을 위한 자연적으로 이용 가능한 도구로서 면역 시스템의 정상 대 비정상 반응에 초점을 맞춘다. 따라서, 본 발명은 상이한 농도의 광범한 스펙트럼의 자극제/억제제 (대사산물, 영양소, 미토겐, 천연 및 합성 펩타이드, 사이토킨, 호르몬, 비타민, 약물, 항체, 신경전달물질, 암 특이적 항원 및 다양한 질병-연관된 조직-특이적 정상 항원 (TNAs))에 대한 반응으로 면역 시스템의 PBLs 대사 활성 자극 프로필 (MASP)의 측정에 의한 고속 처리 기능적 생리학적 혈액 시험을 제공한다. 면역학적 반응의 통상적인 관점에 의해, PBL의 효과기 서브집단의 "클론 증식" 하에서 조차도 비교적 작은 효과가 예상된다. 그러나, "시스템 생물학"의 면에서 미미한 서브그룹 반응은 네트워크 자극을 통해서 증폭될 수 있다. 면역 시스템은 TNA의 비정상적인 높은 수준을 검출하는데 있어서의 그의 정규 기능에 의해 암에 대항하는 것으로 시사된다. PBL 대사 활성은 또한, 암 발전의 진행된 단계의 진단을 위해서 사용될 수 있다. 국소 종양의 단계에서, 비록 특이적 종양 침윤성 림프구 (TIL)가 관찰되더라도 종양 조직을 파괴할 수 없어서 면역 시스템의 효과적인 치사 반응은 이미 제한된다. 아직, 이 단계에서는 이러한 순환 T 림프구가 여전히 별개의 순환 암 세포를 사멸시키는데 책임이 있을 수 있다. 국소 종양으로부터 전이상으로의 이동은 면역 시스템의 완전한 특이적 부전에 대해서 나타나며, 이러한 전이는 MA 자극 프로필에서의 특징적 변화에 의해서 측정될 수 있다.
본 발명에 따라 이루어진 질병 진단에 이어서 금 표준 방법을 사용하여 스크린 결과를 실증한다. 일단 진단이 본 발명에 의존하여 정립되거나, 골드 표준 방법(Gold standard method)을 사용하여 실증되면, 대상체에게 진단을 알리고, 필요에 따라 치료한다.
본 발명은 질병 치료를 개별적으로 최적화하고, 대상체에서 질병 치료를 모니터링하고, 대상체에 대한 치료를 결정하고, 비정상적인 대사 활성과 연관된 질병을 치료할 수 있는 제제를 확인하는데 관한 다양한 적용성을 갖는다.
따라서, 본 발명의 관점에 따르면
(a) 상술한 방법에 따라 대상체에서 질병의 존재를 진단하고;
(b) 진단에 기초하여 대상체를 치료하는 것을 포함하는,
이를 필요로 하는 대상체에서 질병을 치료하는 방법이 제공된다.
본 명세서에서 사용된 것으로서, 용어 "치료하는"은 상태의 진행을 폐기, 실질적으로 억제, 둔화 또는 반전시키거나, 상태의 임상적 또는 심미적 증상을 실질적으로 개선시키거나, 상태의 임상적 또는 심미적 증상의 출현을 실질적으로 방지하는 것을 나타낸다.
본 발명의 또 다른 관점에 따르면,
(a) 세포를 포함하는 대상체의 생물학적 샘플을 적어도 하나의 약제와 접촉시키고;
(b) (i) 비-휘발성 가용성 대사 생성물;
(ii) 비-휘발성 가용성 대사 생성물 및 휘발성 가용성 대사 생성물; 및
(iii) 휘발성 가용성 대사 생성물의 분비에 기인한 시간-의존적 산성화 프로필을 세포의 세포외 환경에서 독립적으로 측정하는 것을 포함하며;
여기에서, 시간-의존적 산성화 프로필 중의 적어도 하나가 세포의 대사 활성을 나타내는 반면, 동일한 조건 하에서 검사한 정상적인 건강한 세포 샘플의 대상활성 쪽으로의 세포의 대사 활성에 있어서의 이동은 질병에 대한 효과적인 약제를 나타내는 것인,
질병 치료를 개별적으로 최적화시키는 방법이 제공된다.
본 명세서에서 사용된 것으로서 "치료를 개별적으로 최적화하는"은 치료 레지멘 (예를 들어, 의약의 타입, 용량)을 맞추는 생체외 방법을 나타낸다.
본 명세서에서 사용된 것으로서 "약제"는 본 명세서에서 상호교환적으로 사용되는 것으로서 약, 의약 또는 약물의 제형을 나타낸다. 약제의 예로는 화학요법, 항생제, 항기생충 약물, 항바이러스제 등이 포함되나, 이들로 제한되지는 않는다.
본 명세서에서 사용된 것으로서 용어 "접촉"은 약제가 세포막과 접촉하고, 필요에 따라 거기에서 내재화하도록 하는 조건 하에서 세포의 근처로 유도하는 것을 나타낸다. 따라서, 예를 들어, 접촉은 완충 조건 하에서 약제가 세포 표현형 (예를 들어, 세포독성 또는 세포증식억제 효과)에 영향을 미치도록 하는데 충분한 온도 및 시간으로 수행되어야 한다. 접촉은 시험관내, 생체외 또는 생체내에서 수행될 수 있다. 접촉은 전기적 신호가 온-라인 검출되도록 효소반응의 생성물을 검출할 수도 있는 용기 내에서 (즉, 전기화학 전지 내에서) 수행될 수 있다. 이러한 용기는 이하에 더 기술된다. 대안적으로, 특별한 시점에 샘플을 연속적으로 뽑아낼 수 있고, 이러한 샘플을 전기화학 전지 내에 배치할 수 있도록 접촉은 검출이 일어나는 것과는 별도의 용기에서 수행될 수 있다. 따라서, 접촉은 시험관, 플라스크, 조직 배양물, 칩 (chip), 어레이 (array), 플레이트, 마이크로플레이트, 모세관 등에서 수행될 수 있다. 세포는 기질의 첨가 후에, 세포의 내용물의 연속적인 철저한 혼합을 위해서 진동 플레이트 상에 배치할 수 있다.
특정한 구체예에 따르면, "동일한 조건 하에서 검사한 정상적인 건강한 세포 샘플의 대사활성 쪽으로의 세포의 대사 활성에 있어서의 이동"은 바람직하게는 정상적인 건강한 대조 세포 샘플과 100% 동일한 쪽으로의 적어도 10%의 국소적 또는 전체적 (프로필 전체적으로)인 이동을 나타낸다.
숙련된 전문가에 의해서 결정될 수 있는 것으로서 예정된 역치 (threshold) 이상의 이동은 효과적인 치료를 나타낸다.
마찬가지로,
(a) 질병에 대한 적어도 하나의 약제를 대상체에게 투여하고;
(b) 투여 후에 대상체의 세포를 포함하는 생물학적 샘플을 회수하고;
(c) (i) 비-휘발성 가용성 대사 생성물;
(ii) 비-휘발성 가용성 대사 생성물 및 휘발성 가용성 대사 생성물; 및
(iii) 휘발성 가용성 대사 생성물의 분비에 기인한 시간-의존적 산성화 프로필을 세포의 세포외 환경에서 독립적으로 측정하는 것을 포함하며;
여기에서, 시간-의존적 산성화 프로필 중의 적어도 하나는 세포의 대사 활성을 나타내는 반면, 동일한 조건 하에서 검사한 정상적인 건강한 세포 샘플의 대사활성 쪽으로의 대사 활성에 있어서의 이동은 상기 질병의 효과적인 치료를 나타내는 것인,
대상체에서 질병 치료를 모니터링하는 방법이 제공된다. 예를 들어, 전이 상에서 MA 프로필은 정상 프로필에 가깝게 회귀할 수 있는 것으로 시사된다.
마찬가지로,
(a) 세포를 제제에 적용하고;
(b) (a) 이후 및 임의로 (a) 전에 특허청구범위 제1항의 방법에 따라 세포의 대사 활성을 측정하는 것을 포함하며,
여기에서, 산성화 프로필에 있어서의 이동은 세포의 대사 활성을 변화시킬 수 있는 제제를 나타내는 것인,
세포의 대사 활성을 변화시킬 수 있는 제제를 확인하는 방법이 제공된다.
본 명세서에서 사용된 것으로서, 용어 "제제"는 생물학적 제제 또는 화학적 제제를 포함하는 시험 조성물을 나타낸다.
본 발명의 방법에 따라 대사 활성의 잠재적 변조물질로서 시험할 수 있는 생물학적 제제의 예로는 핵산, 예를 들어, 폴리뉴클레오타이드, 리보자임, siRNA 및 안티센스 분자 (제한이 없이 RNA, DNA, RNA/DNA 하이브리드, 펩타이드 핵산, 및 변화된 골격 구조 또는 다른 화학적 변형을 갖는 폴리뉴클레오타이드 유사체); 단백질, 폴리펩타이드 (예를 들어, 펩타이드), 탄수화물, 지질 및 "소분자" 약물 후보물질이 포함되나, 이들로 제한되지는 않는다. "소분자"는 예를 들어, 천연적으로 존재하는 화합물 (예를 들어, 식물 추출물, 동물 배양액 등으로부터 유도된 화합물), 또는 약 10,000 달톤 미만, 바람직하게는 약 5,000 달톤 미만, 가장 바람직하게는 약 1,500 달톤 미만의 분자량을 갖는 합성 유기 또는 유기금속 화합물일 수 있다.
본 발명의 이 관점의 바람직한 구체예에 따르면, 제제는 항암, 항바이러스 또는 항생제이다.
본 발명의 방법에 따라 잠재적 항암제로서 시험될 수 있는 상태의 예로는 방사선 노출 (예를 들어, 감마선 방사, UV 방사, X-선 방사)이 포함되나, 이들로 제한되지는 않는다.
본 발명에서 사용된 것으로서 이동은 또한 동일한 프로필에서의 상이한 수준 (예를 들어, 더 큰 수준)의 MA; 기초 상태에서의 변화; 및/또는 최대 MA 효과를 유도하는 제제 농도에서의 이동일 수도 있는 것으로 인식된다.
일단 대사 활성을 변화시킬 수 있는 제제가 상기의 가르침에 따라서 확인되면, 본 발명은 제제를 합성하거나, 이것을 천연 공급원으로부터 정제하는 것을 추가로 포함한다.
본 명세서에서 사용된 것으로서, 용어 "약"은 ±10%를 나타낸다.
용어 "포함한다 (comprises)", "포함하는 (comprising)", "포함한다 (includes)", "포함하는 (including)", "갖는 (having)" 및 이들의 동근어 (conjugate)는 "~를 포함하나, 이들로 제한되지는 않는" 것을 의미한다.
용어 "로 구성된"은 "~를 포함하며, 이들로 제한된" 것을 의미한다.
용어 "본질적으로 ~로 구성되는"은 조성물, 방법 또는 구조가 추가의 성분, 단계 및/또는 부분을 포함할 수 있지만, 추가의 성분, 단계 및/또는 부분이 특허청구된 조성물, 방법 또는 구조의 기본적 및 신규의 특징을 실질적으로 변화시키지 않는 것을 의미한다.
본 명세서에서 사용된 것으로서, 단수 형태 "a", "an" 및 "the"는 문맥이 별도로 명백하게 지시하지 않는 한, 복수형을 포함한다. 예를 들어, 용어 "화합물" 또는 "적어도 하나의 화합물"은 그의 혼합물을 포함한 다수의 화합물을 포함할 수 있다.
본 출원 전체에 걸쳐서, 본 발명의 다양한 구체예는 범위 형식으로 제시될 수 있다. 범위 형식으로의 설명은 단순히 편의 및 간결성을 위한 것이고, 본 발명의 범위에 대한 융통성 없는 제한으로 해석되지는 않아야 하는 것으로 이해되어야 한다. 따라서, 범위의 설명은 그 범위 내의 개별적인 숫자 값뿐만 아니라 모든 가능한 부분 범위를 구체적으로 기술한 것으로 생각되어야 한다. 예를 들어, 1 내지 6과 같은 범위의 설명은 그 범위 내의 개별적인 수, 예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 및 6뿐만 아니라 1 내지 3, 1 내지 4, 1 내지 5, 2 내지 4, 2 내지 6, 3 내지 6 등과 같은 부분 범위를 구체적으로 기술한 것으로 생각되어야 한다. 이것은 범위의 폭과는 무관하게 적용된다.
숫자 범위를 본 명세서에 나타내는 경우에는 언제나, 이것은 나타낸 범위 내의 모든 인용된 숫자 (분수 또는 정수)를 포함하는 것을 의미한다. 문구 첫 번째 지시된 수와 두 번째 지시된 수 "사이의 범위(ranging/range)" 및 첫 번째 지시된 수 내지 두 번째 지시된 수의 "부터의 범위"는 여기에서 상호교환하여 사용되며, 첫 번째 및 두 번째 지시된 수 및 그들 사이의 모든 분수 및 정수를 포함하는 것을 의미한다.
본 명세서에서 사용된 것으로서, 용어 "방법"은 화학적, 약물학적, 생물학적, 생화학적 및 의학적 기술의 전문가에게 공지되어 있거나, 그들에 의해서 공지된 방식, 수단, 기술 및 절차로부터 쉽게 개발되는 방식, 수단, 기술 및 절차를 포함하는 (단, 이들로 제한되지는 않는다), 소정의 임무를 성취하기 위한 방식, 수단, 기술 및 절차를 나타낸다.
명확성을 위해서 별개의 구체예의 맥락으로 기술된 본 발명의 특정한 특징은 또한, 단일 구체예에서 함께 제공될 수 있는 것으로 인식된다. 반대로, 간결성을 위해서 단일 구체예의 맥락으로 기술된 본 발명의 다양한 특징은 또한, 별개로, 또는 어떤 적합한 서브조합으로나, 또는 본 발명의 어떤 다른 기술된 구체예에서 적합한 것으로 제공될 수 있다. 다양한 구체예의 맥락으로 기술된 특정한 특징들은, 구체예가 이들 요소가 없이는 실시할 수 없는 것이 아닌 한, 이들 구체예의 필수적인 특징으로 생각되지 않는다.
상기에 기술되고 이하의 특허청구범위 항목에서 특허청구된 본 발명의 다양한 구체예 및 관점은 이하의 실시예에서 실험적으로 뒷받침된다.
실시예
이제는, 상기한 설명과 함께 본 발명의 일부의 구체예를 비-제한적 방식으로 예시하는 이하의 실시예를 참고로 한다.
일반적으로, 여기에서 사용된 명명법 및 본 발명에서 이용된 실험실 절차는 분자, 생화학, 미생물학 및 재조합 DNA 기술을 포함한다. 이러한 기술은 문헌에 철저하게 설명되어 있다 [참조: 예를 들어, "Molecular Cloning: A laboratory Manual" Sambrook et al., (1989); "Current Protocols in Molecular Biology" Volumes I-III Ausubel, R. M., ed. (1994); Ausubel et al., "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley and Sons, Baltimore, Maryland (1989); Perbal, "A Practical Guide to Molecular Cloning", John Wiley & Sons, New York (1988); Watson et al., "Recombinant DNA", Scientific American Books, New York; Birren et al. (eds) "Genome Analysis: A Laboratory Manual Series", Vols. 1-4, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (1998); 미국 특허 제4,666,828호; 제4,683,202호; 제4,801,531호; 제5,192,659호 및 제5,272,057호에 제시된 바와 같은 방법; "Cell Biology: A Laboratory Handbook", Volumes I-III Cellis, J. E., ed. (1994); "Current Protocols in Immunology" Volumes I-III Coligan J. E., ed. (1994); Stites et al. (eds), "Basic and Clinical Immunology" (8th Edition), Appleton & Lange, Norwalk, CT (1994); Mishell and Shiigi (eds), "Selected Methods in Cellular Immunology", W. H. Freeman and Co., New York (1980); 이용 가능한 면역측정방법은 특허 및 과학 문헌에 광범하게 기술되어 있다, 참조: 예를 들어, 미국 특허 제3,791,932호; 제3,839,153호; 제3,850,752호; 제3,850,578호; 제3,853,987호; 제3,867,517호; 제3,879,262호; 제3,901,654호; 제3,935,074호; 제3,984,533호; 제3,996,345호; 제4,034,074호; 제4,098,876호; 제4,879,219호; 제5,011,771호 및 제5,281,521호; "Oligonucleotide Synthesis" Gait, M. J., ed. (1984); "Nucleic Acid Hybridization" Hames, B. D., and Higgins S. J., eds. (1985); "Transcription and Translation" Hames, B. D., and Higgins S. J., Eds. (1984); "Animal Cell Culture" Freshney, R. I., ed. (1986); "Immobilized Cells and Enzymes" IRL Press, (1986); "A Practical Guide to Molecular Cloning" Perbal, B., (1984) and "Methods in Enzymology" Vol. 1-317, Academic Press; "PCR Protocols: A Guide To Methods And Applications", Academic Press, San Diego, CA (1990); Marshak et al., "Strategies for Protein Purification and Characterization - A Laboratory Course Manual" CSHL Press (1996); 이들은 모두 본 명세서에 충분히 개시된 것처럼 참고로 포함된다]. 그 밖의 다른 일반적 참고문헌은 본 문서 전체에 걸쳐서 제공된다. 이들문헌에서의 절차는 본 기술분야에서 잘 알려진 것으로 여겨지며, 읽는 사람의 편의를 위해서 제공된다. 이들문헌에 포함된 모든 정보는 본 명세서에 참고로 포함된다.
실시예 1
실험적 절차
A. 혈액 공여체 필요조건 및 의료 전문가에 의한 혈액 수집
혈액 샘플은 EDTA (Greiner Bio-One 455036)와 함께 9 ㎖ 바큐튜브 (Vacutubes) 내에 수집하였다. 연구는 Sheba Medical Center (Ramat Gan Israel)와 Israeli Ministry of Health에서 기관감사위원회 (institutional Review Boards)에 의해서 승인되었다 (Helsinki Approval number 7780-10-SMC).
B. 공여체의 인구학적 및 임상적 정보의 수집
비밀의 보호를 위해서, 모든 수거된 혈액 샘플은 데이터베이스 기록 및 진단 분석에서 사용하기 위해서 라벨을 붙이고, 즉시 코드화하였다.
MA 시험 결과는 22 내지 81세의 42명의 건강한 공여체 및 25명의 암 환자로부터 수집하였다 (표 2). 건강한 공여체는 고혈압, 고 콜레스테롤 수준, 가벼운 독감 및 염증의 치료된 증례를 포함한 혼합 집단이다.
[표 2] 암 환자의 임상적 특징:
ac - 선암 , idc - 침습성 도관암 ,
gej - 위식도 접합부,
NSCLC - 비-소세포 폐암
Figure pct00002
C. 혈액 샘플 수송
PBMC 분리 시까지 온화하게 진탕하면서 온도-조절 조건 (열전 냉각 (Thermo Electric cooling) (10℃-18℃로 저하))에서 혈액 샘플의 생존도를 유지시키는 조치를 취한다.
D 1 . 말초혈액 단핵구 세포 ( PBMC ) 분리
신선한 말초혈액 단핵구 세포 (PBMC)를 피콜-파크 (Ficoll-Paque (UNI-SEP, Novamed) 및 구배 원심분리에 의해서 분리시켰다. 펠릿을 형광 프로브 (HPTS)를 포함하는 작업 용액 (WS) (칼슘 및 마그네슘을 함유하는 PBS)에 5X106 세포/㎖의 최종 농도로 재현탁시켰다.
D 2 . MA 시험의 고속 처리 병행 측정
흑색 비-결합성, 저-용량 384 멀티-웰 플레이트 (Greiner Bio-One)에서 각각의 웰을 10 ㎕의 PBMC 용액 및 10 ㎕의 작업 용액 + 8개의 증가하는 농도로 10개의 시약 중의 하나를 포함하는 HPTS로 부하시켰다. 따라서, 각각의 웰에서 프로브의 최종 농도는 1 μM이었으며, PBMC의 최종 농도는 약 pH 7.3의 10 mM 포스페이트 완충액을 함유하는 20 ㎕ 생리적 작업 용액 내에서 2.5X106 세포/㎖였다. 성인 말초혈액 내의 평균 PBMC 농도를 고려하여, 2.5X106 세포/㎖의 작업 농도가 선택되었다. PBMC의 이 농도는 첫째로, 적어도 1 시간 동안의 생성물 축적에 기인한 합리적인 신호-대-잡음 비를 수득하고, 둘째로 세포간 상호작용을 허용하기 위한 두 가지 관점을 보장하는 것으로 생각된다. 10 ㎕ 부하의 동일한 프로토콜을 각각의 웰에서 필요한 농도로 최종 20 ㎕ 용적을 정확하게 수득하기 위해서, 첫째로는 PBMC 샘플에 대해서, 그 다음에는 시약에 대해서 적어도 3중으로 수행하였다. 또한, 각각의 시험에는 대조군의 2개의 타입이 포함되었는데, 하나는 8개의 웰에서 세포 및 자극제가 없이 프로브 (1 μM)만을 포함하였으며, 다른 것은 8개의 웰에서 자극제가 없이 단지 세포만을 포함하는 기초 상태였다. 산성화 과정은 37℃에서의 1시간 배양 중에 각 5분씩 상업용 형광 스캐너 (TECAN Infinite M200)에 의해서 모니터링하였다. 우선, 스캐너는 30분 동안 (6 사이클) 밀폐시키지 않고 ("OPEN" 모드) 산성화 과정을 모니터링한 다음에, 각각의 웰로부터의 C02 및 NH3의 환기를 피하기 위해서 멀티-웰 플레이트를 용접 밀폐시켰다 (ThermalSeal RT™, EXCEL Scientific, Inc.) ("CLOSE" 모드). 다음으로, 산성화 과정을 다시 30분 동안 (6 사이클) 모니터링하였다. 신호 대 잡음 비를 증가시키기 위해서, 513 ㎚에서의 형광 강도를 웰당 455 ㎚ 및 403 ㎚에서의 여기 하에 순차적으로 측정하였다.
D 3 . 시약의 타입, 스펙트럼 및 제조
각각의 시험에서, PBMC의 대사 활성 프로필은 기초 상태에서, 및 8가지 상이한 농도로 작업 용액에 희석된 다음의 10 가지 시약의 영향 하에서 모니터링하였다: PHA, CONA, PMA, LPS, MBP(28), MelanA, PSA(29), 글루코즈(24), L-글루타민 및 라파마이신 [Strauss L, Czystowska M, Szajnik M, Mandapathil M, & Whiteside TL (2009) Differential responses of human regulatory T cells (Treg) and effector T cells to rapamycin. PLoS One 4(6):e5994.]. 시약 선택은 면역 시스템에 대한 그들의 관계에 의해서 이루어졌다 (상기의 표 1 주목, 농도는 표에서의 농도로 제한되지 않는다, 농도 = 0 내지 비-독성 용량).
다른 시약들, 예를 들어, 이하의 것들은 검정 하에 있는 것으로 언급되어야 한다: (에스트라디올과 같은 호르몬, 암배아 항원 (CEA)과 같은 암 특이적 항원, Il-2와 같은 사이토킨 및 케모킨, 비타민, 호르몬, 약물, 면역 시스템의 항체, 신경전달물질, 다양한 암 펩타이드 및 인간 파필로마바이러스 (HPV)와 같은 특정의 바이러스 또는 그들의 단편 (데이터는 나타내지 않음).
D 4 . pH 민감성 형광 프로브의 비율 척도 측정 및 WS 산도 검정
본 시험에서 사용된 프로브는 8-하이드록시피렌-1,3,6-트리설폰산 (HPTS)이다.
HPTS는 수성 완충액 중에서 ~7.3의 pKa를 갖는 비용 효과적이며, 비-독성이고, 매우 수용성인 막-불투과성 pH 지시제이다. HPTS는 pH-의존적 흡수 이동을 나타내어, 455 ㎚ 및 403 ㎚에서의 여기 하에 순차적으로 측정된 513 ㎚에서의 형광 강도들 사이의 비의 함수로서 비율 척도 pH 측정을 가능하게 한다. 이 방법은 대략 pH 7의 생리적 범위에서 미미한 pH 변화의 이러한 민감한 측정에 필수적이다.
프로브의 민감성을 정량화하기 위해서, HPTS의 저장 용액을 물에 100 μM의 농도로 희석시킨 다음에, 1 μM 및 10 μM의 최종 농도로 희석시켰다. WS 산도 검정은 2 개의 완충액 농도에 대해서 이루어졌다: WS (10 mM 포스페이트 완충액) 및 식염수에 의해 5 배 희석된 WS (2 mM 포스페이트 완충액) (도 3A-D, 도 4A-B).
MA 시험에서 사용된 최종 검정곡선은 WS (2 μM HPTS 함유)의 순차적 적정의 pH-유리 전극 측정에 의해서 이행하였다. 적정된 샘플의 pH 측정 및 형광 측정은 37℃에서 수행하였다. 샘플을 멀티-웰 플레이트 내에 부하시키고, EX403 ㎚ 및 EX455 ㎚ 하에서의 형광 강도를 형광 스캐너를 사용하여 513 ㎚에서 측정한다.
"OPEN" 및 "CLOSE" 상태에 대해서, 다항식 (polynomial) 검정곡선을 작성하여 (도 3C-D), pH 값 및 각각 403 ㎚ 및 455 ㎚에서의 여기 하에 513 ㎚에서 측정된 형광 강도 사이의 비의 함수로서 누적 산성화 당량을 측정하도록 하였다.
수득된 수학식을 모든 새로운 공여체의 분석에 사용하였다 (이하의 표 3).
[표 3]최종 검정곡선으로부터 수득된 수학식
X = Ex. 403 ㎚에서의 형광 강도 / Ex. 455 ㎚에서의 형광 강도
Figure pct00003
E. 데이터 분석
계산, 분석 및 데이터 마이닝 (mining) [Nisbet R, IV JE, & Miner G (2009) Handbook of Statistical Analysis and Data Mining Applications]은 다음의 통계학적 패키지 (Statistical Package)를 사용하여 행하였다: EXCEL 2007, OriginPro 8, SAS Edition 9.2, PASW Modular client 13.0 (공식적으로는 Clementine, part of SPSS라 부름). 도 6A-C-8A-D, 13에서의 결과는 평균±평균의 표준 오차로 표현된다. 변형 모델에 대한 건강한 공여체와 암 환자 사이의 통계학적 유의성은 카이-스퀘어 (chi-square)를 사용하여 계산하였다. 결과는 p<0.05인 경우에 통계학적으로 상이한 것으로 생각되었다.
공여체의 데이터 분석 (MA 시험 체제의 플로우차트에서 요약됨 - 도 12)
데이터 준비 -
단계 0: 공여체 데이터의 처리 및 표준화
각각의 기록 (공여체)의 원 데이터를 처리하여 pmole H+/㎕/시간/2500 PBMC의 단위의 대사 활성의 산성화율에 관한 결과를 수득하였다.
전처리 - 단계 1a: 프로브 분석 및 공여체 데이터 표준화
신호 대 잡음 비를 개선시키기 위해서, 프로브의 분석은 모든 공여체로부터 수집된 모든 관찰결과 (n=730)에 대한 k-평균 군집 분석을 수행함으로써 이루어졌다 (도 5A-D). 이들 처리된 결과는 프로브의 이상치를 제거 (결과의 5% 이하가 제거되었다)한 후에 HPTS 평균값으로부터 공여체 값을 공제함으로써 표준화되었다.
전처리 - 단계 1b: 공여체의 데이터에서 제외된 이상치
공여체, 용량 및 자극제의 각각의 조합에 대한 "OPEN" 및 "CLOSE"의 평균값에 의해서 "OPEN" 및 "CLOSE" 값을 표준화시킨다. 표준 점수 > |1.7|를 갖는 관찰결과는 버렸다 (결과의 1.77%).
데이터 준비 - 단계 1c: 공여체 대사 활성 결과의 제시
각각의 공여체에서 이상치를 제거한 후에, "OPEN" 및 "CLOSE"의 평균값을 공여체당 각각의 용량 및 각각의 시약에 대한 적어도 삼중 결과의 평균을 기초로 하여, 각각의 공여체에 대해서 별도로 계산하였다. 이들 결과는 각각의 시약 및 용량에 대한 공여체 대사 활성을 제시하는 것으로서 후에 사용될 것이다. 결과는 2D 그래프 및 3D 그래프로 작성되었으며, 매 공여체마다 자동적으로 업데이트될 것이다.
분류 모델에 대한 탐색 - 단계 2: 데이터 마이닝 알고리즘
시험한 암 환자의 대부분이 39세 이상이었기 때문에, 나이의 영향을 가능한 한 많이 최소화시키기 위해서, 남성 및 여성을 포함한 혈액 공여체의 두 개의 코호트 (cohorts)를 시험 및 분석하였다. 첫 번째 코호트는 나이가 40세 이상인 공여체 (n=42 (21명은 건강한 공여체, 21 명은 암 환자))를 포함하고, 두 번째 코호트는 22-81세인 공여체의 전체 세트 (n=67 (42명은 건강한 공여체, 25명은 암 환자))를 포함한다. 단계 3의 결과의 분류를 위해서, 의사결정 계통도/규칙 귀납 (Rule Induction) (C5, CART, CHAID, ASSOCIATION RULE) 및 로그 선형 모델 (Logistic Regression)의 패밀리로부터의 알고리즘의 세트가 사용되었다. 탐색적 분석방법을 사용하여 데이터에서 감추어진 관계 및 드러난 관계를 조사하였다.
모델 평가 - 단계 3: 모델 구축 및 분류
공여체를 건강한 공여체와 암 환자로 분류하기 위해서, 데이터 마이닝, 기계 학습 및 통계학적 모델링을 포함한 10 가지의 상이한 모델의 패밀리로부터의 세트를 SAS 9.3 및 클레멘타인 소프트웨어 (V13.0)를 적용하여 사용하였다. 모델의 성능을 평가 및 비교하기 위해서 클레멘타인 소프트웨어 (V13.0)에 의해서 작성된 누적 이득 도표를 기초로 한 그래프적 방법을 사용하기로 결정하였다 (도 9A-D).
예측 모델링 - 단계 4: 혈액 공여체의 30%의 검증 세트를 사용한 평가
단계 3에 기술된 바와 같은 데이터를 클레멘타인 소프트웨어 (V13.0)를 사용하여 "훈련 (Training)" 및 "시험 (Testing)"의 두 개의 그룹으로 무작위 구분하였다. "훈련 세트"는 데이터 마이닝 모델을 구축하기 위해서 사용되고, 공여체의 70%를 포함한다. 공여체의 나머지 30%는 훈련 세트에서 생성된 모델을 사용하여 "시험" 세트에 대한 분류 결과를 평가하기 위해서 사용된다 (도 10A-D).
전체 데이터 분석 과정은 MA 시험 프로토콜 및 분석 체제의 플로우차트 (도 12)에 요약되어 있다.
실시예 2
MA 시험 디자인 및 특징
신선한 말초혈액 단핵구 세포 (hPBMC)를 42명의 건강한 공여체 및 25명의 암 환자 (상기의 표 2)로부터 피콜-파크 및 구배 원심분리에 의해서 분리시켰다. 각각의 혈액 샘플에 대해서, 384 멀티-웰 플레이트를 대략 pH 7.3의 10 mM 완충액에서의 생리적 작업 용액, ~2.5X106 세포/㎖의 최종 농도의 hPBMC, 1 μM pH 프로브 (HPTS), 및 8 개의 증가하는 농도의 10 개의 자극성 시약 중의 하나를 함유하는 20 ㎕로 부하시켰다 (상기의 표 3). MA 시험은 상업용 형광 스캐너를 사용하여 수행한다. 세포외 산도 동력학적 프로필은 공기-개방 ("OPEN") 또는 용접-밀봉된 밀폐 ("CLOSE") 상태 하에서 측정하였다. 두 가지 기록은 모두 '가용성' 대 '휘발성' 대사 생성물 (락트산 대 CO2 및 NH3)의 실시간 누적을 측정할 수 있게 함으로써 산화적 포스포릴화, 혐기성 해당작용 및 호기성 해당작용을 구분할 수 있게 한다 ("와버그 효과")[Vander Heiden MG, Cantley LC, & Thompson CB (2009) Understanding the Warburg effect: the metabolic requirements of cell proliferation. Science 324(5930):1029-1033]. MA율 프로필은 데이터 마이닝 도구를 포함한 동적 온라인 분석에 의해서 암 진단을 위해 계산 및 검사하였다 (도 12).
실시예 3
비율 척도 형광 세포외 pH 측정 및 산도 검정
본 MA 시험에서 사용된 비-독성, 막-불투과성, 비율 척도 분자 pH-프로브는 수성 생리학적 완충액 중에서 ~7.3의 pKa를 갖는 8-하이드록시피렌-1,3,6-트리설폰산 (HPTS)[Hakonen A & Hulth S (2008) A high-precision ratiometric fluorosensor for pH: implementing time-dependent non-linear calibration protocols for drift compensation. Anal Chim Acta 606(1):63-71; Han J & Burgess K (Fluorescent indicators for intracellular pH. Chem Rev 110(5):2709-2728]이다. 이것은 다수의 세포 타입에서의 세포내 pH 측정으로부터, 2 mM에서의 밤새 배양 하에서도 그의 저-독성에 의해서 잘 알려져 있다 [Overly CC, Lee KD, Berthiaume E, & Hollenbeck PJ (1995) Quantitative measurement of intraorganelle pH in the endosomal-lysosomal pathway in neurons by using ratiometric imaging with pyranine. Proc Natl Acad Sci U S A 92(8):3156-3160]. 여기에서, HPTS는 오히려 그의 비-독성을 더 보장하기 위해서 낮은 1 μM 농도에서 세포외 pH 측정을 위해서 사용된다. 다항식 검정곡선을 "OPEN" 및 "CLOSE" 상태에 대해서 작성하여 (도 3A-D), 각각 403 ㎚ 및 455 ㎚에서의 여기 하에 513 ㎚에서 측정된 형광 강도 사이의 비의 함수로서 누적 산성화 당량 및 pH 값을 측정하도록 허용하였다. 산성화 검정곡선은 작업 용액 (WS) 및 식염수 (각각 10 mM 및 2 mM 포스페이트 완충액)로 5배 희석된 WS에 대해서 수득하였다 (도 3A-D). 예상된 바와 같이, 이 도면은 pH 변화의 동일한 범위 내에서 10 mM 완충능이 2 mM 완충능의 경우와 비교하여 약 5배의 산성화 값을 허용한다는 것을 입증한다. 이들 결과는 생리학적 pH 범위 6.5-7.5에서 산성화에 대한 적절한 민감성을 나타낸다. 추가의 결과는 측정방법이 1-10 μM 사이의 형광 프로브 농도와는 무관함을 나타낸다. 시스템은 HPTS의 세포외 최종 농도가 단지 1 μM인 경우에 높은 신호-대-잡음 비를 제공하기에 충분히 민감하다 (도 4A-B).
최종 농도 곡선 (도 3A-D, 표 4)으로부터 수득된 수학식을 모두 67명의 공여체 (42명의 건강한 공여체 및 25명의 암 환자)로부터의 PBMC 대사 활성 기록에서의 유의적인 측정된 변화의 정량적 분석을 위해서 사용하였다.
실시예 4
HPTS 배경의 동적 K-평균 군집 분석에 의한 신호-대-잡음 비의 개선
MA 시험 결과의 동적인 임상적 평가를 목적으로 하여, 각각의 공여체에 대한 어떤 MA 시험이라도 HPTS 신호의 참조 비율 값 (n= 730 관찰결과)에 관한 이전의 시험과 비교하는 신뢰할 수 있는 방법이 개발되었다. 이 데이터 수집에 의해서, 예외적인 참조 결과를 여과함으로써 MA 시험의 신호 대 잡음 비를 개선시킬 수 있다. 그 목적으로, k-평균 군집 분석 [Nisbet R, IV JE, & Miner G (2009) Handbook of Statistical Analysis and Data Mining Applications]을 HPTS 프로브의 누적 표준화 비율 값에 적용하였다. 각각의 시험에서, 세포가 없고 자극제가 없이 작업 용액 중에 1 μM HPTS를 함유하는 적어도 8개의 대조 웰이 검사되었다. 각각의 값은 표준 점수를 사용하여 누적 관찰결과를 고려하여 표준화되었다. 도 5A는 모든 MA 시험의 "OPEN" 및 "CLOSE" 비율 값에 대한 표준 점수의 분포를 나타낸다. k-평균 군집 분석에 의해서 26개의 군집이 수득되었으며 (도 5B), 여기에서 각각의 관찰은 최근접 평균을 갖는 군집에 속한다. 도 5D에 보고된 결과는 프로브의 안정한 성능을 평가한다. 모든 HPTS 참조 결과 (n=730) 중에서, 단지 5개의 군집 (4.66%)만을 버렸다. 나머지 21개의 군집 (95.34%)을 최종적으로 정상 참조 범위를 구성하기 위해서 고려하였다. "OPEN" 상태의 평균값 및 "CLOSE" 상태의 평균값을 각각의 공여체에 대해서 재계산하였다. k-평균 군집 분석은 세포 데이터로부터 프로브 배경 비율 신호를 추출하고, 이에 의해서 진행 중인 MA 시험 결과의 실제 비율 값을 얻도록 하였다.
실시예 5
대조 샘플의 MA 프로필: (i) 세포의 부재 하에 증가하는 시약 농도에서; (ii) 시약은 없고 세포 존재.
(i) 세포의 부재 하에서의 대조 실험은 세포의 존재 하에서 수득된 산성화 프로필이 실제로 세포 대사 활성의 비율을 측정한 것임을 입증한다. 따라서, 세포가 있는 샘플에서의 명백한 산성화 변화와 비교하여 프로브, 완충액 및 증가하는 농도의 각각의 시약은 존재하지만 세포는 없는 상태에서 적용된 동일한 프로토콜 하에서는 산성화가 수득되지 않았다 (예를 들어, 글루코즈 (도 6A) 및 PSA (도 8A)). 동일한 대조 결과는 모든 시약에 대해서 수득되었다. (ii) 세포의 존재 하에서 산성화의 기초 수준은 글루코즈를 포함한 어떤 시약도 부재하는 상태에서 측정하였다. 일반적으로, 이 기초 수준은 글루코즈 농도가 증가함에 따라서 증가하여 세포 대사 활성의 뚜렷한 관점을 입증한다 (도 6B-C). 더구나, 기초 상태에서의 MA 프로필은 이미, 건강한 공여체의 69%의 천연 hPBMC가 선호하는 우성 산화적 포스포릴화로부터 다양한 암 환자의 60%의 활성화 hPBMC가 선호하는 우성 호기성 해당작용 ("와버그 효과") 쪽으로의 진단적 이동의 일반적인 경향을 드러내었다. 이들 결과는 생체내 상태에 대한 더 근접한 시나리오인 기초 상태에서 이미 진단 도구로서의 MA-시험의 잠재력을 강조한다. 그러나, 기초 상태만으로는 건강한 공여체와 암 환자 사이를 뚜렷하게 구분하는데 충분하지 않다 (카이-스퀘어, p=0.45). 시약의 네트워크에 대한 반응으로 모든 MA-시험 프로필의 이러한 데이터 마이닝에 의해서 (도 10A-D), 건강한 공여체의 95.24% 및 암 환자의 88% (나이≥4°카이-스퀘어, p<0.0001)에 대해서, 및 90.48%의 건강한 공여체 및 95.24%의 암 환자 (22≤나이≥81, 카이-스퀘어, p<0.0001)에 대해서 유의적으로 지적할 수 있다.
실시예 6
전형적인 건강한 공여체 및 유방암 환자에 대해서 수득된 , 증가하는 글루코즈 농도에서의 MA 프로필의 비교
우선, 건강한 공여체의 MA 프로필 (도 6B, 7A)은 나이 (45 (도 6B) 대 69 (도 7A)) 및 성별에서의 상당한 차이에도 불구하고 두드러지게 유사하다. 둘째로, 도 6A-C에서의 결과는 전형적인 건강한 공여체 및 유방 상피내암 환자 (2기, 어떤 치료도 하기 전)를 나타내는 2명의 공여체 사이의 유의적인 MA 프로필 차이를 밝혀내었다. 추가로, MA 시험이 몇 증례의 자가-면역 질환 및 추가의 비-암 관련된 감염성 질환에 대해 적용된 예비 실험에서는, 건강한 개체 및 암 환자에 대해서 수득된 것과 비교하여 상이한 대사 활성 프로필(데이터는 나타내지 않음)이 이미 밝혀졌다. 이들 차이는 3 개의 암의 임상 진단 지수로 나타낸다 (도 4A-C). 지수 1: 기초 상태 (시약이 없이 작업 용액 중의 세포)에서 MA율 "OPEN" > MA율 "CLOSE". 지수 2: 모든 글루코즈 농도에 대해 MA율 "OPEN" > MA율 "CLOSE". 지수 3: 암의 MA율 "OPEN" > 건강한 공여체의 MA율 "OPEN" 및 암 환자의 MA율 "CLOSE" > 건강한 공여체의 MA율 "CLOSE". 따라서, 산화적 포스포릴화의 더 높은 값은 암 샘플의 신선한 PBMC에서의 호기성 해당작용의 더 높은 값과 비교하여 건강한 샘플의 신선한 PBMC에서 수득된다. 도입부에서 언급한 바와 같이 [Vander Heiden MG, Cantley LC, & Thompson CB (2009) Understanding the Warburg effect: the metabolic requirements of cell proliferation. Science 324(5930):1029-1033.; Fox CJ, Hammerman PS, & Thompson CB (2005) Fuel feeds function: energy metabolism and the T-cell response. Nat Rev Immunol 5(11):844-852; Michalek RD & Rathmell JC (The metabolic life and times of a T-cell. Immunol Rev 236:190-202)], 이들 결과는 아마도 암 환자의 활성화된 hPBMC에서 "와버그 효과"의 생체내 발생을 나타낸다. 암 환자에 대해서 수득된 MA 시험 결과 (도 6C 및 도 7B-D)에 대한 더 상세한 관찰은, "CLOSE" 상태에서의 총 산성화 비율이 "OPEN" 상태에서 보다 더 낮음을 나타낸다. 이들 결과는 락트산 및 CO2에 기인한 산도의 부분 적정에 책임이 있는 휘발성 염기성 생성물에 대해서 나타낸다. 이 적정은 비-휘발성 락트산 생산으로의 대사 스위치 (switch)에 대해서 생리적으로 필요할 수 있다. 이 역할은 단백질 이화작용 및 퓨린 및 피리미딘의 대사 경로의 주된 생성물 중의 하나인 암모니아 (NH3)에 관련된다. 생체내에서와 같은 본 측정 시스템에서, 활력 세포는 반드시, 이하에 기술된 바와 같이 산성 및 염기성 생성물 둘 다의 동시 대사적 분비에 의해 약 7.2-7.4의 일정한 pH에서 세포질을 유지시켜야 한다.
Figure pct00004
3 지수 분석에서는 상이한 조합이 다양한 암 (예를 들어, 결장, 유방, 폐, 및 췌장) (상기의 표 2)의 상이한 단계에서 발견되었음이 언급되어야 한다. 따라서, 이들 변이에 의해서, 개별적인 공여체의 충분한 데이터 수집 및 추적의 검사는 이하의 증례 연구 (도 7A-D)에서 입증되는 바와 같이, 신뢰할 수 있고 더 유익한 진단 프로필을 제공할 것으로 믿어진다.
실시예 7
유방암이 있는 65세의 여성에 대해 수득된 것으로, 증가하는 글루코즈 농도에서의 MA 프로필의 증례 연구 추적
예비적 MA-시험 측정에 관해서는, 갑상선암의 한 증례 및 유방함의 한 증례가 의사 이전에 본 시험에 의해서 진단되었음이 언급되어야 한다. 유방암 증례는 기결정 및 치료의 전형적인 분류와 비교하여 MA 시험의 민감한 정보적 능력에 대한 증거로서 2년 동안 추적하였다. 이것은 MA 시험이 암 상태를 확인한 지 1년 후에 유방암을 갖는 것으로 임상적으로 진단된 여성 공여체의 2년 추적 연구의 첫 번째 보고이다. 비교를 위해서, 전형적인 건강한 69세의 남성의 MA 프로필을 나타낸다 (도 7A). MA 시험이 암 상태를 확인한 지 1 년 후에 유방암을 갖는 것으로 임상적으로 진단된 환자인 암 환자의 시간 0에서의 MA 프로필 (I.E.,) (도 7B). 3개의 암 진단 지수는 건강한 프로필 (도 7A)에서 관찰된 산화적 포스포릴화로부터 암 증례 프로필 (도 7B)에서 관찰된 호기성 해당작용으로의 이동에 대해서 나타낸다. 즉, 건강한 프로필 (도 7A)의 "CLOSE-OPEN"에 대한 양성 값 및 암 프로필 (도 7B)에 대해 수득된 "CLOSE-OPEN"에 대한 음성 값. 이 연구 증례에 대해 수득된 다음의 MA 시험은 10.5개월 후에, 2기의 유방 idc 암의 일상적인 유방조영술 진단 직후에 수행되었다 (도 7C). 그 시기에 환자는 어떤 생리학적 또는 감지할 수 있는 증상도 보고하지 않았음이 강조되어야 한다.
이 시점으로부터, 추적 MA 시험이 매 3주일 마다 수행되었다. 1개월 후에, 종양의 외과적 제거가 수행되었다. 다시 1개월 후에, 화학요법 치료를 매 3주일 마다 제공하였다. 각각의 MA 시험은 각각의 치료의 약 20일 후 및 다음 치료의 2일 전에 수행하였다. 여기에 제시된 마지막 MA 시험 (도 7D)은 세 번째 화학요법 치료 후에, 즉 화학요법 프로토콜을 시작한 지 약 2개월 후에 수행하였다 (시간 = (+)14.5 개월). MA 시험의 3개의 지수에 따르면, 이 마지막 시험은 이미 건강한 공여체 (도 7A)의 특징적인 MA 프로필 (도 7D)을 나타낸다는 것에 주목하여야 한다. 명백하게, MA 시험은 진행 중인 치료에 따른 양성 경향을 입증한다. 이들 결과에 의해서, 화학요법 치료 중의 및 치료의 완료 훨씬 뒤의 임상적 평가와 비교하여 MA 시험 프로필의 경향 거동을 밝히기 위해서 추적 절차에서 MA 시험을 사용하는 것이 중요할 것이다. 이 추적 프로그램은 간단하고, 비-침습성이며, 비용이 많이 들지 않는 임상적으로-지향된 MA 시험에 의해서 이용할 수 있다.
실시예 8
전형적인 건강한 공여체, 유방암 환자 및 유방암-회복 공여체에 대해 수득된 것으로, 증가하는 PSA 농도에서의 MA 프로필의 비교
지금까지, MA 프로필은 암 진단을 위한 일반적인 비-특이적 임상 도구로 뚜렷하게 발견된 글루코즈의 증가하는 농도 하에서 검사하였다. 더 특이적인 암 분류를 수득하기 위해서, MA 시험은 조직-특이적 표준 항원 (예를 들어, PSA, MelanA)과 같은 다양한 시약 (표 3)을 동시에 조사하였다.
전립선-특이적 항원 (PSA)은 전립선의 세포에 의해서 생산된 표준 단백질이다. PSA는 암-연관된 조직-특이적 표준 항원이다. 이 펩타이드는 세포독성 T 림프구 (CTL)에 의해서 인식된다. 인간 말초혈액 내에서 이 펩타이드의 증가하는 수준은 남자의 경우에 전립선암의 생화학적 진단 마커로서 임상적으로 사용된다 [Greene KL, et al. (2009) Prostate specific antigen best practice statement: 2009 update. J Urol 182(5):2232-2241]. 그러나, PSA의 낮은 수준은 여성 순환계 내로 방출되며, 현재까지 임상적 PSA 혈액 시험은 여성의 경우의 진단 인자로 사용되지 않는다. 그러나, 다수의 연구는 PSA가 전립선 특이적이지 않지만, 일부의 여성 호르몬 조절된 조직, 주로 유방 및 그의 분비물 내에 존재하는 것을 나타내었다 [Black MH & Diamandis EP (2000) The diagnostic and prognostic utility of prostate-specific antigen for diseases of the breast. Breast Cancer Res Treat 59(1):1-14; Black MH, et al. (2000) Serum total and free prostate-specific antigen for breast cancer diagnosis in women. Clin Cancer Res 6(2):467-473]. 여성에게서, PSA는 남성 정액에서 발견되는 것과 대략 동등한 농도로 여성 정액에서 발견된다 [Wimpissinger F, Stifter K, Grin W, & Stackl W (2007) The female prostate revisited: perineal ultrasound and biochemical studies of female ejaculate. J Sex Med 4(5):1388-1393; discussion 1393]. 전형적인 건강한 여성 (도 8B), 치료 전의 2기 유방암 idc이 있는 여성 (도 8C), 및 18년 전에 2기 유방암으로부터 회복된 여성 (도 8D)에 대한 3개의 MA 프로필을 도 8A-D에 제시한다. 조직-특이적 자극제, 예를 들어, PSA는 암 환자의 MA-시험 프로필에서 최적 농도에서 뚜렷한 피크를 유도하는 것으로 관찰된다 (도 8A-D). 이러한 프로필은 질병-특이적 수용체-매개된 자극을 반영하는 것으로 생각되며, 이에 의해서 특정의 종양을 검출하도록 할 수 있다 (예를 들어, PSA에 의한 유방암, melanA 자극에 의한 흑색종). 결과는 몇 가지의 중요한 쟁점을 드러내고 있다. 첫째로, 건강한 여성의 MA 프로필이 글루코즈 MA 프로필 (도 6A-C 및 도 7A-D)에 대해서 이미 상기 보고된 바와 같이 더 높은 수준의 산화적 포스포릴화를 나타낸다. 둘째로, 도 8C는 어떤 치료도 하기 전의 2기 유방 idc 암이 있는 여성에 의한 PSA에 대한 PBMC 반응을 나타낸다. 이 프로필은 "OPEN" 상태에서, 이미 기초 상태로부터 높은 대사 활성율을 나타낸다. 이들 프로필은 암 환자의 글루코즈 MA 프로필에 대해서 수득된 바와 같은 활성화된 T-세포와 유사한 현상인 호기성 해당작용의 높은 수준을 나타낸다. MA 시험의 또 다른 독특한 프로필은 18년 전에 유방암으로부터 회복된 50세 여성에 대해서 확인되었다 (도 8D). PSA 자극에 대한 이 프로필은 오히려 건강한 공여체의 경우에 가깝게 거동한다 (도 8B). 더욱이, 이것은 건강한 공여체에 대한 특징적 프로필 (도 8D)보다, 증가하는 PSA 농도에서 우성 산화적 포스포릴화 경로를 나타내는 "CLOSE" 상태에서 더 높은 MA율을 나타낸다. 이 프로필은 항-유방암 기억 세포의 증가된 집단과 관련될 수 있다. 이 관계는, 병원체 청소 후에 생존하는 효과기 세포는 장수하는 기억 세포로 분화하고, 산화적 대사 상태로 되돌아간다는 관찰결과와 일치한다 [Michalek RD & Rathmell JC (The metabolic life and times of a T-cell. Immunol Rev 236:190-202].
실시예 9
모델 구축 및 데이터 마이닝 도구에 의한 MA 시험 결과에 대한 분류 평가
막대한 수의 MA율 값을 포함한 다수의 MA 프로필을 각각의 공여체에 대해서 수득한다. 모든 새로운 공여체에 의해서 업데이트되는 동적 임상 분석을 개발하고, 이 큰 데이터베이스로부터 패턴을 추출하기 위해서, 통계학 및 인공 지능으로부터의 방법과 데이터베이스 관리를 조합한, 데이터 마이닝 도구를 사용한 컴퓨터 프로그래밍이 개발되었다 [Nisbet R, IV JE, & Miner G (2009) Handbook of Statistical Analysis and Data Mining Applications]. 남성 및 여성 둘 다에 대한 MA 시험 결과의 두 개의 선택된 코호트를 분석하였다. 시험한 암 환자의 대부분은 39세 이상이기 때문에 나이의 영향을 가능한 많이 최소화시키기 위해서, 이 분석은 나이가 40세 이상인 42명의 공여체의 서브그룹 (21명의 건강한 공여체 및 21명의 암 환자)에 초점을 맞추었다. 두 번째 코호트에서는 22-81세의 공여체의 전체 세트가 사용되었다 (n=67, 42명의 건강한 공여체 및 25명의 암 환자). 공여체를 건강한 공여체 및 암 개체로 구분하기 위해서, 데이터 마이닝, 기계 학습 및 통계학적 모델링을 포함한 10 가지의 상이한 모델의 패밀리로부터의 세트를 SAS 9.3 및 클레멘타인 소프트웨어 (V13.0)를 적용하여 사용하였다. 이들 10개의 모델 중에서, 단지 4개만이 건강한 공여체 및 암 환자 둘 다를 최고의 정확도로 분류할 수 있었다. 4개의 모델 중에서 3개는 의사결정 계통도 (CHAID, C5, C&R 계통도)의 패밀리로부터 유래하며. 하나는 로그 선형 모델 (Logistic Regression)이다. 4 가지 모두는 도 9A-D에 제시된다. 결정-계통도 모델은 이들 모델이 어떤 분포도, 또는 어떤 추정도 나타내지 않기 때문에, 최고의 분류자인 것으로 생각된다. 다른 것들만큼 우수하게 수행하지 않는 네 번째 모델은 로지스틱 회귀이다. 이런 종류의 모델은 입력 데이터가 분포 및 독립성에 대한 추정과 같은 모델의 추정에 따라 정확하게 거동하는 경우에 가장 적합하다. 과대-적합 (over-fitting)을 가능한 많이 최소화시키기 위해서, 로지스틱 회귀 모델은 중요성에 의해서 변수를 정돈하고, 선택된 변수의 수를 가능한 많이 최소화시킬 수 있도록 하는 전진적 선택방법 (forward selection method)을 사용하여 실행하였다. 각각의 모델은 상이한 농도에서 각각 상이한 항원의 함수로서 상이한 변수/특징을 나타내기 때문에, 하나 이상의 모델의 함수로서 본 예측 변수 (predictors)를 조합할 수 있다. 모델의 정확성에 대한 상이한 농도의 전반적인 시약의 영향을 검사하는 경우에, 선택된 변수의 최대 수는 샘플 크기가 과대-적합을 가능한 많이 최소화시키는데 충분하지 않은 경우에 추천되는 5 이하였다 (도 9A, 9C). 이들 초기 결과에 의해서, 다양한 모델에서의 그들의 출현 빈도에 따른 예측 변수로서 10 개의 시약을 정돈할 수 있었다 (도 9A, 9C). 현재, MA 시험에서 및 면역 시스템과 관련한 중추적 플레이어로서 글루코즈, MBP, 라파마이신, PSA 및 PMA를 정확하게 지적할 수 있다 (표 3). 그 밖의 다른 5 개의 시약 (표 3)의 면역학적 적절성 (immunological relevance)은 여전히 기회적 모델 선택에 의해서 밝혀진다. 모델의 성능을 평가 및 비교하기 위해서, 본 발명은 클레멘타인 소프트웨어 (V13.0)에 의해서 생산된 누적 이득 도표를 기초로 하는 그래프적 방법을 사용하도록 결정하였다. 이득 도표 (도 9B, D)는 임의 곡선 (흑색 선) 및 최적합 곡선 (하늘색 선)인 두 개의 내장 곡선을 함유한다. 모든 모델은 이들 두 개의 곡선 사이에 있다. 이 방법에서, 소정의 곡선과 임의 곡선 (흑색 곡선) 사이의 더 큰 영역은 더 우수한 모델을 나타낸다. 혈액의 공여체 모델링 및 분류 결과는 최고의 모델 (도 9A-D)과 유사한 성능을 갖는 모델을 나타낸다 (Figures 9A-D).
실시예 10
혈액 공여체의 30%의 검증 세트를 사용한 MA 시험의 평가 모델 결과
이하에 기술된 분배 과정은 MA 시험 결과의 정확성에서 더 많은 신뢰를 획득하도록 모델을 조합 및 비교하고, 모델의 로부스트 수준 (robust level)을 평가하고, 작은 샘플링 (n=67 혈액 샘플 공여)에 기인하여 과대-적합을 최소화하도록 할 수 있다. 도 9A-D에 기술된 바와 같은 데이터를 클레멘타인 소프트웨어 V13.0 9를 사용하여 "훈련" 및 "시험"의 두 개의 그룹으로 무작위 분류하였다 (도 10A-D). 검증 세트는 두 개의 코호트 모두에 대해 공여체의 70%를 포함하였다. 첫 번째 코호트는 40세 이상인 42 명의 공여체를 포함하며 (도 10A-B), 두 번째 코호트는 22-81세의 공여체의 전체 세트 (n=67)를 포함한다 (도 10C-D). 공여체의 처음 70%는 "훈련 세트"로 기술된다. "훈련 세트"는 도 9A-D에 기술된 바와 같이 데이터 마이닝 모델을 구축하기 위해서 사용된다. 공여체의 나머지 30% ("시험 세트")는 "트레이닝 세트"에서 생성된 모델을 사용하여 "시험 세트"에 대한 분류 결과를 평가하도록 할 수 있다 (CHAID, Logistic, C5, C&R 계통도) (도 10A. C). "훈련" 및 "시험" 세트는 더 큰 신뢰성을 가지로 모델 결과를 평가하고, 과대 적합 도전을 가능한 많이 제거하도록 할 수 있다. 두 가지 코호트 모두에서, C5 모델은 더 로부스트한 결과를 제공하였으며, 여기에서 "시험" 세트 곡선은 "훈련" 세트와 유사하였음을 발견하였다 (도 10B, D). C5 모델이 "시험" 세트에서 최고의 수행자였으며, 반면에 "훈련" 세트에서는 C&R 계통도가 최고의 수행자였다. 이들 결과에 의해, MA 시험에서 및 면역 시스템과 관련한 중추적 플레이어로서 글루코즈, MBP, PMA, PHA, CONA 및 L-글루타민을 정확하게 지적할 수 있다 (표 3). 도 9A-D에서의 최고의 모델과 마찬가지로, 이들 결과 (도 10A-D)는 도 9A-D의 결과를 뒷받침한다.
암 진단에 대한 생리학적 접근방법은 여기에서 건강한 공여체 및 암 환자의 hPBMC에 대해 수득된 대사 활성 프로필의 예비 실험 결과에 의존하여 나타낸다. 이 접근방법에 의해서, 본 발명자들은 10-20 ㎖ 혈액 샘플로부터 추출된 신선한 hPBMC를 사용하여 MA 시험의 단순한 고속-처리, 단시간 및 비용 효과적인 광학적 방법을 디자인하였다. hPBMC 핑거프린팅 (fingerprinting) MA 패턴의 두드러진 차이는 두 개의 임상 그룹인 42명의 건강한 개체 및 25명의 암 환자의 예비 검사에 의해서 밝혀졌다. 42명의 건강한 공여체의 hPBMC MA 프로필은 유사한 바람직한 산화적 포스포릴화 경로를 나타내는 반면에, 25명의 암 환자의 hPBMC는 기결정 및 치료와 관련하여 호기성 해당작용을 선호하는 광범한 스펙트럼의 MA 프로필을 갖는다. 갑상선암의 한 증례 및 유방암의 한 증례를 의사에 앞서서 MA 시험으로 진단하였다. 이 유방암 증례는 기결정 및 치료의 전형적인 분류에 관해서 MA 시험의 민감한 정보적 능력에 대한 증거로서 2 년 동안 MA 시험에 의해서 추적하였다.
여기에 보고된 결과는 종양 발생의 거울 이미지로서 hPBMC의 대사 활성의 추가 탐색을 조장한다 (도 9A-D). 예비 결과는 상이한 종양의 병리학적 발생 중에 면역 시스템의 암-유도된 회피 하에서 hPBMC 대사 경로의 공통적일뿐만 아니라 특이적인 특징을 뚜렷하게 반영한다.
조직-특이적 암 진단 지수는 건강한 공여체에 대해서 관찰된 것과 비교한 MA율의 증가 (또는 감소)에 의해 국소 종양 발생의 초기 및 후기 단계에서의 MA-시험 프로필에 의해서 제공될 수 있다. 조직-특이적 항원의 특정한 최적 농도는 MA-시험 프로필에 대해서 탐구되어야 하였다. 이러한 조직-특이적 진단 프로필은 또한, 초기 공격적 항종양 면역반응이 예상되는 경우에, 종양 발생의 초기 단계에서도 예상된다. 이러한 접근방법에 의해서, 면역 시스템은 모든 체조직을 철저히 조사함으로써 그의 정상 기능과 관련하여 암 세포의 진행중인 조기 검출 및 효과적인 근절에 책임이 있는 것으로 가정될 수 있다. 따라서, 면역 시스템은 그들의 조직-특이적 정상 항원의 과도한 발현에 의해서 암 세포를 검출 및 제거하도록 제안된다. 따라서, 항상성에 있어서 효과적인 면역 반응의 균형 잡힌 수준은 효과적인 세포용해 기능의 저하, 또는 오히려 자가면역 질환을 침전시킬 수 있는 자체 정상 세포에 대한 이러한 공격적 활성을 회피하도록 잘 제어되어야 한다. 따라서, 불행하게도 암의 진행된 단계에서 면역 시스템은 억제되거나, 순환 hPBMC의 일부분일 수 있는 종양-침윤성 림프구에 의해서 암 발생을 지지하도록 교육까지 될 수 있는 것으로 알려져 있다. 이러한 관점에서, 추가로 암의 치명적인 전이기에서 hPBMC의 MA-시험 프로필은 만성 염증에서와는 달리, 조직-특이적 면역성 내성 및 아네르기 (anergy)에 기인하여 명백히 건강한 상태를 반영하도록 뒤로 이동할 수 있는 것으로 예상된다. 이러한 명백한 건강 상태는 적절한 조직-특이적 항원 자극의 고갈에 의해서 드러날 수 있다.
실시예 11
전형적인 건강한 공여체, 암 공여체 및 자가면역 루푸스 공여체에 관해서 수 득된 증가하는 글루코즈 농도에 대한 PBMC 대사 활성 프로필
항상성에 있어서, 면역 시스템 활성은 잘 제어되어야 하며; 고활성은 자가면역 질환과 연관되는 반면에 암 발생은 아마도 면역 시스템의 저활성과 관련된다.
유의적으로 상이한 MA 프로필이 전형적인 건강한 공여체, 암 공여체 및 자가면역 루푸스 공여체에 관해서 수득된 증가하는 글루코즈 농도에 대해 수득되었다 (도 13).
비록 본 발명은 그의 특정한 구체예와 함께 기술되었지만, 다수의 대체예, 변형 및 변이가 본 기술분야에서 숙련된 전문가에게 명백할 것임은 분명하다. 따라서, 첨부된 특허청구범위의 정신 및 넓은 범위에 속하는 이러한 대체예, 변형 및 변이는 모두 포함시키고자 한다.
본 명세서에서 언급된 모든 출판물, 특허 및 특허출원은, 마치 각각의 개별적인 출판물, 특허 또는 특허출원이 구체적으로 및 개별적으로 본 명세서에 참고로 포함되는 것으로 지시되는 것처럼 그와 동일한 정도까지 본 명세서에 온전히 참고로 포함된다. 또한, 본 출원에서 어떤 문헌의 언급 또는 확인은 이러한 문헌이 본 발명에 대한 선행기술로서 이용 가능하다는 것을 승인하는 것으로 해석되지는 않아야 한다. 항목의 제목이 사용되는 정도까지, 이들은 반드시 제한적인 것으로 해석되지 않아야 한다.
참고문헌
(다른 참고문헌은 출원 전체에 걸쳐서 열거된다)
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Claims (32)

  1. (i) 비-휘발성 가용성 대사 생성물;
    (ii) 비-휘발성 가용성 대사 생성물 및 휘발성 가용성 대사 생성물; 및
    (iii) 휘발성 가용성 대사 생성물의 분비에 기인한 시간-의존적 산성화 프로필을 세포의 세포외 환경에서 독립적으로 측정하는 것을 포함하고,
    여기에서, 상기 시간-의존적 산성화 프로필 중의 적어도 하나는 세포의 대사 활성을 나타내는 것인,
    세포의 대사 활성 (MA)을 측정하는 방법.
  2. (a) 세포를 포함하는 대상체의 생물학적 샘플을 제공하고;
    (b) (i) 비-휘발성 가용성 대사 생성물;
    (ii) 비-휘발성 가용성 대사 생성물 및 휘발성 가용성 대사 생성물; 및 (iii) 휘발성 가용성 대사 생성물의 분비에 기인한 시간-의존적 산성화 프로필을 세포의 세포외 환경에서 독립적으로 측정하는 것을 포함하며;
    여기에서, 상기 시간-의존적 산성화 프로필 중의 적어도 하나는 상기 세포의 대사 활성을 나타내는 반면, 동일한 조건 하에서 검사한 정상적인 비질병 세포 샘플의 경우와 비교한 대사 활성에 있어서의 이동은 변형된 대사 활성과 연관된 질병을 나타내는 것인,
    이를 필요로 하는 대상체에서 변형된 대사 활성과 연관된 질병을 진단하는 방법.
  3. (a) 세포를 포함하는 대상체의 생물학적 샘플을 적어도 하나의 약제와 접촉시키고;
    (b) (i) 비-휘발성 가용성 대사 생성물;
    (ii) 비-휘발성 가용성 대사 생성물 및 휘발성 가용성 대사 생성물; 및
    (iii) 휘발성 가용성 대사 생성물의 분비에 기인한 시간-의존적 산성화 프로필을 세포의 세포외 환경에서 독립적으로 측정하는 것을 포함하며;
    여기에서, 상기 시간-의존적 산성화 프로필 중의 적어도 하나는 상기 세포의 대사 활성을 나타내는 반면, 동일한 조건 하에서 검사한 정상적인 건강한 세포 샘플의 대사활성 쪽으로의 상기 세포의 대사 활성에 있어서의 이동은 상기 질병에 대한 효과적인 약제를 나타내는 것인,
    질병 치료를 최적화시키는 방법.
  4. (a) 질병에 대한 적어도 하나의 약제를 대상체에게 투여하고;
    (b) 투여 후에 대상체의 세포를 포함하는 생물학적 샘플을 회수하고;
    (c) (i) 비-휘발성 가용성 대사 생성물;
    (ii) 비-휘발성 가용성 대사 생성물 및 휘발성 가용성 대사 생성물; 및
    (iii) 휘발성 가용성 대사 생성물의 분비에 기인한 시간-의존적 산성화 프로필을 세포의 세포외 환경에서 독립적으로 측정하는 것을 포함하며;
    여기에서, 상기 시간-의존적 산성화 프로필 중의 적어도 하나는 상기 세포의 대사 활성을 나타내는 반면, 동일한 조건 하에서 검사한 정상적인 건강한 세포 샘플의 대사활성 쪽으로의 상기 세포의 대사 활성에 있어서의 이동은 상기 질병의 효과적인 치료를 나타내는 것인,
    대상체에서 질병 치료를 모니터링하는 방법.
  5. (a) 제2항의 방법에 따라 대상체에서 질병의 존재를 진단하고;
    (b) 상기 진단에 기초하여 대상체를 치료하는 것을 포함하는,
    이를 필요로 하는 대상체에서 질병을 치료하는 방법.
  6. (a) 세포를 제제에 적용하고;
    (b) (a) 이후 및 임의로 (a) 전에 제1항의 방법에 따라 세포의 대사 활성을 측정하는 것을 포함하며,
    여기에서, 상기 산성화 프로필에 있어서의 이동은 세포의 대사 활성을 변화시킬 수 있는 제제를 나타내는 것인,
    세포의 대사 활성을 변화시킬 수 있는 제제를 확인하는 방법.
  7. 제1항 내지 제6항 중의 어느 하나에 있어서, (i)의 상기한 산성화 프로필의 측정이 공기-노출된 챔버에서 수행되는 방법.
  8. 제1항 내지 제6항 중의 어느 하나에 있어서, (ii)의 상기한 산성화 프로필의 측정이 공기-밀폐된 챔버에서 수행되는 방법.
  9. 제1항 내지 제6항 중의 어느 하나에 있어서, 상기 세포외 환경이 보정된 완충능을 갖는 규정된 용액을 포함하는 방법.
  10. 제9항에 있어서, 상기 완충액이 포스페이트 완충 식염수를 포함하는 방법.
  11. 제1항 내지 제6항 중의 어느 하나에 있어서, 상기 세포가 백혈구를 포함하는 방법.
  12. 제1항 내지 제6항 중의 어느 하나에 있어서, 상기 세포가 암 세포를 포함하는 방법.
  13. 제2항 내지 제5항 중의 어느 하나에 있어서, 상기 질병이 암을 포함하는 방법.
  14. 제13항에 있어서, 상기 생물학적 샘플이 혈액 샘플을 포함하는 방법.
  15. 제2항 내지 제5항 중의 어느 하나에 있어서, 상기 질병이 암, 병원체 감염 및 자가면역 질환으로 구성된 그룹으로부터 선택되는 방법.
  16. 제1항 내지 제6항 중의 어느 하나에 있어서, 상기의 측정이 pH 프로브, CO2 프로브 및 NH3 프로브 및 락테이트 프로브로 구성된 그룹으로부터 선택된 비독성 막 불투과성 프로브를 사용하여 수행되는 방법.
  17. 제16항에 있어서, 상기 pH 프로브가 비율 척도 pH 프로브를 포함하는 방법.
  18. 제17항에 있어서, 상기 pH 프로브가 HPTS를 포함하는 방법.
  19. 제1항 내지 제6항 중의 어느 하나에 있어서, 상기 비-휘발성 대사산물이 락테이트를 포함하는 방법.
  20. 제1항 내지 제6항 중의 어느 하나에 있어서, 상기 휘발성 대사산물이 NH3 및 CO2를 포함하는 방법.
  21. 제1항 내지 제6항 중의 어느 하나에 있어서, 상기 산성화 프로필의 측정이 항온에서 수행되는 방법.
  22. 제21항에 있어서, 상기의 항온이 37℃를 포함하는 방법.
  23. 제1항 내지 제6항 중의 어느 하나에 있어서, 상기 세포를 상기의 산성화 프로필을 측정하기 전에 또는 그와 동시에 자극제 또는 억제제에 적용하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  24. 제23항에 있어서, 상기의 자극제 또는 억제제가 세포를 포함하는 방법.
  25. 제23항에 있어서, 상기의 자극제 또는 억제제가 무-세포 항원을 포함하는 방법.
  26. 제24항에 있어서, 상기의 자극성 세포가 림프구를 포함하며, 상기 세포는 상기 림프구에 대해서 비-공통 유전자형 림프구를 포함하는 방법.
  27. 제1항 내지 제26항 중의 어느 하나에 있어서, 상기 산성화 프로필의 측정이 상업용 형광 멀티 웰 플레이트 스캐너에서 수행되는 방법.
  28. 제1항 내지 제27항 중의 어느 하나에 있어서, 상기 대사 활성의 대사 활성 측정치가 적어도 2 개의 의사결정 계통도 모델에 적용되는 방법.
  29. 제1항 내지 제27항 중의 어느 하나에 있어서, 상기 대사 활성의 대사 활성 측정치가 MA 시험 배경 측정치의 신호 대 잡음 여과가 k-평균 군집 분석에 의해서 수행되는 방법.
  30. 제28항에 있어서, 상기의 의사결정 계통도 모델이 C5, C&R 계통도 및 CHAID의 그룹으로부터 선택되는 방법.
  31. 제1항 내지 제27항 중의 어느 하나에 있어서, 상기 세포를 상기 세포외 환경으로부터 분리시키는 것을 추가로 포함하는 방법.
  32. 제30항에 있어서, 상기의 분리가 원심분리 하에서의 피콜 분리에 의한 것인 방법.
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