JP5990254B2 - 代謝活性プロフィルのモニタリング方法および分析方法ならびにそれらの診断使用および治療使用 - Google Patents

Description

本発明は、そのいくつかの実施形態において、代謝活性プロフィルのモニタリング方法および分析方法ならびにそれらの診断使用または治療使用に関連し、すなわち、具体的には、血液サンプルの代謝活性モニタリングによるガン診断に関連する。

疾患処置における大きな問題は依然として、早期検出および病期分類である。早期検出により、疾患発症からの治療的処置が可能となり、多くの場合において処置の成功をもたらす。疾患の病期分類では、最適な処置の決め手となるかもしれない薬物療法の適切なプロトコルが示されるかもしれない。例えば、今日、数百万人がガンと共存しているか、または、ガンを患ったことがある。ガンは合衆国における２番目に最も一般的な死因であり、心臓疾患のみが上回っている。ガンは合衆国における死者のほぼ４分の１を占める。ガンは診断および処置が早いほど、生存の可能性が良好である。

ガン検出のための知られている方法はすべて、ほとんどの場合、悪性組織、および／または、循環に分泌されるその病理学的なガン・バイオマーカを特定することに集中している。しかしながら、これらの診断方法は残念なことに、疾患の比較的進行した段階において効果的であるにすぎない。

Ｗａｒｂｕｒｇ効果は、ほとんどのガン細胞が主に、ほとんどの正常な細胞と同様にミトコンドリアにおけるピルビン酸の酸化が続く糖分解のかなり低い速度によってではなく、むしろ、細胞質ゾルにおける乳酸産生が続く糖分解の大きい速度によってエネルギーを産生するという観測結果である［Ｋｉｍ ＪＷ、Ｄａｎｇ ＣＶ（２００６）、“Ｃａｎｃｅｒ’ｓ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｓｗｅｅｔ ｔｏｏｔｈ ａｎｄ ｔｈｅ Ｗａｒｂｕｒｇ ｅｆｆｅｃｔ”、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．、６６（１８）：８９２７〜３０］。次に、１９２０年代において、Ｏｔｔｏ Ｗａｒｂｕｒｇが、正常な分化した細胞とは対照的であるが、ガン細胞^{１９、２０}は主として、細胞プロセスのために必要とされるエネルギーのための燃料としてのＡＴＰを生成するために、ミトコンドリアの酸化的リン酸化に依拠するのではなく、むしろ、好気的糖分解に依拠することを見出した。この歴史的現象は「Ｗａｒｂｕｒｇ効果」と名づけられた^２１。Ｏｔｔｏ Ｗａｒｂｕｒｇは、代謝におけるこの変化がガンの根本的原因であると仮定した［Ｗａｒｂｕｒｇ Ｏ（１９５６）、“Ｏｎ ｔｈｅ ｏｒｉｇｉｎ ｏｆ ｃａｎｃｅｒ ｃｅｌｌｓ”、Ｓｃｉｅｎｃｅ、１２３（３１９１）：３０９〜１４］。これは現在、Ｗａｒｂｕｒｇ仮説として知られる主張である。約５０年後、Ｗａｒｂｕｒｇ効果はまた、インビトロにおける活性化リンパ球でも認められた。例えば、Ｍａｃｌｖｅｒ他、２００８、Ｊ．Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ Ｂｉｏｌｏｇｙ、８４：１〜９、および、ＤｅＢｅｒａｒｄｉｎｉｓ、Ｃｅｌｌ Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ、７：１１〜２０を参照のこと。Ｗａｒｂｕｒｇ効果は、活性化されたＴ細胞^{２２、２３}が、糖分解を、例えば、グルコース輸送体（ＧＬＵＴ）の過剰発現^２４によって迅速に過剰誘導する免疫系においてもまた見出された。

Ｗａｒｂｕｒｇ効果には、重要な医学的応用がある。これは、悪性腫瘍による高い好気的糖分解が、２−^１８Ｆ−２−デオキシグルコース（ＦＤＧ）（放射性の修飾されたヘキソキナーゼ基質）の取り込みを陽電子放射断層撮影法（ＰＥＴ）により画像化することによってガンを診断し、また、ガンの処置応答をモニタするために臨床的に利用されているからである。国際公開ＷＯ２００７／１０２１４６もまた参照のこと。しかしながら、これらの方法は煩雑であり、また、先端技術施設またはインシトゥ組織生検によって費用がかかる。

したがって、早期かつ簡便な診断のための非侵襲的方法が求められている。

本発明のいくつかの実施形態の一局面によれば、細胞の代謝活性（ＭＡ）を測定する方法であって、当該細胞の細胞外環境において、
（ｉ）不揮発性の可溶性代謝生成物；
（ｉｉ）不揮発性の可溶性代謝生成物および揮発性の可溶性代謝生成物；
（ｉｉｉ）揮発性の可溶性代謝生成物
の分泌に起因する時間依存的な酸性化プロフィルを独立して測定することを含み、ただし、これらの時間依存的な酸性化プロフィルの少なくとも１つにより、当該細胞の代謝活性が示される方法が提供される。

本発明のいくつかの実施形態の一局面によれば、変化した代謝活性に伴う疾患をその必要性のある対象において診断する方法であって、
（ａ）細胞を含む当該対象の生物学的サンプルを提供すること；
（ｂ）当該細胞の細胞外環境において、
（ｉ）不揮発性の可溶性代謝生成物；
（ｉｉ）不揮発性の可溶性代謝生成物および揮発性の可溶性代謝生成物；ならびに
（ｉｉｉ）揮発性の可溶性代謝生成物
の分泌に起因する時間依存的な酸性化プロフィルを独立して測定すること
を含み、ただし、これらの時間依存的な酸性化プロフィルの少なくとも１つにより、当該細胞の代謝活性が示され、これに対して、同一条件下で調べられた正常な非患部細胞サンプルの代謝活性と比較される代謝活性における変化により、変化した代謝活性に伴う疾患が示される方法が提供される。

本発明のいくつかの実施形態の一局面によれば、疾患処置を個々に最適化する方法であって、
（ａ）細胞を含む対象の生物学的サンプルを少なくとも１つの医薬品と接触させること；
（ｂ）当該細胞の細胞外環境において、
（ｉ）不揮発性の可溶性代謝生成物；
（ｉｉ）不揮発性の可溶性代謝生成物および揮発性の可溶性代謝生成物；ならびに
（ｉｉｉ）揮発性の可溶性代謝生成物
の分泌に起因する時間依存的な酸性化プロフィルを独立して測定すること
を含み、ただし、これらの時間依存的な酸性化プロフィルの少なくとも１つにより、当該細胞の代謝活性が示され、これに対して、同一条件下で調べられた正常な健常な細胞サンプルの代謝活性に向かう、当該細胞の代謝活性における変化により、当該疾患のための有効な医薬品が示される方法が提供される。

本発明のいくつかの実施形態の一局面によれば、疾患処置を対象においてモニタする方法であって、
（ａ）当該疾患に対する少なくとも１つ医薬品を当該対象に投与すること；
（ｂ）投与後の当該対象の細胞を含む生物学的サンプルを回収すること；
（ｃ）当該細胞の細胞外環境において、
（ｉ）不揮発性の可溶性代謝生成物；
（ｉｉ）不揮発性の可溶性代謝生成物および揮発性の可溶性代謝生成物；ならびに
（ｉｉｉ）揮発性の可溶性代謝生成物
の分泌に起因する時間依存的な酸性化プロフィルを独立して測定すること
を含み、ただし、これらの時間依存的な酸性化プロフィルの少なくとも１つにより、当該細胞の代謝活性が示され、これに対して、同一条件下で調べられた正常な健常な細胞サンプルの代謝活性に向かう、当該細胞の代謝活性における変化により、当該疾患の有効な処置が示される方法が提供される。

本発明のいくつかの実施形態の一局面によれば、その必要性のある対象における疾患処置の方法であって、
（ａ）当該対象における当該疾患の存在を請求項２の方法に従って診断すること；
（ｂ）当該対象をその診断に基づいて処置すること
を含む方法が提供される。

本発明のいくつかの実施形態の一局面によれば、細胞の代謝活性を変化させることができる作用因を特定する方法であって、
（ａ）細胞を作用因に供すること；
（ｂ）（ａ）の後、および、必要な場合には（ａ）の前における当該細胞の代謝活性を請求項１の方法に従って測定すること
を含み、ただし、酸性化プロフィルにおける変化により、細胞の代謝活性を変化させることができる作用因が示される方法が提供される。

本発明のいくつかの実施形態によれば、細胞外環境は、校正された緩衝能を有する規定された溶液を含む。

本発明のいくつかの実施形態によれば、緩衝能を有する溶液はリン酸塩緩衝化生理食塩水を含む。

本発明のいくつかの実施形態によれば、細胞は白血球を含む。

本発明のいくつかの実施形態によれば、細胞はガン細胞を含む。

本発明のいくつかの実施形態によれば、細胞は末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を含む。

本発明のいくつかの実施形態によれば、疾患はガンを含む。

本発明のいくつかの実施形態によれば、生物学的サンプルは血液サンプルを含む。

本発明のいくつかの実施形態によれば、疾患は、ガン、病原性感染および自己免疫疾患からなる群から選択される。

本発明のいくつかの実施形態によれば、測定が、ｐＨプローブ、ＣＯ_２プローブおよびＮＨ_３プローブ、ならびに、乳酸プローブからなる群から選択される非毒性の膜不透過性プローブを使用して行われる。

本発明のいくつかの実施形態によれば、ｐＨプローブはレシオメトリックｐＨプローブを含む。

本発明のいくつかの実施形態によれば、ｐＨプローブはＨＰＴＳを含む。

本発明のいくつかの実施形態によれば、不揮発性の代謝産物は乳酸を含む。

本発明のいくつかの実施形態によれば、揮発性の代謝産物はＮＨ_３およびＣＯ_２を含む。

本発明のいくつかの実施形態によれば、（ｉ）の酸性化プロフィルの測定が空気暴露チャンバで行われる。

本発明のいくつかの実施形態によれば、（ｉｉ）の酸性化プロフィルの測定が空気封止チャンバで行われる。

本発明のいくつかの実施形態によれば、酸性化プロフィルの測定が一定温度で行われる。

本発明のいくつかの実施形態によれば、一定温度は３７℃を含む。

本発明のいくつかの実施形態によれば、上記方法はさらに、当該細胞を酸性化プロフィルの測定の前または測定と同時に刺激因子または阻害因子に供することを含む。

本発明のいくつかの実施形態によれば、刺激因子または阻害因子は細胞を含む。

本発明のいくつかの実施形態によれば、刺激因子または阻害因子は無細胞抗原を含む。

本発明のいくつかの実施形態によれば、刺激性細胞はリンパ球を含み、かつ、上記細胞は、リンパ球に関して非同系のリンパ球を含む。

本発明のいくつかの実施形態によれば、酸性化プロフィルの測定が、市販の蛍光マルチウエルプレート・スキャナにおいて行われる。

本発明のいくつかの実施形態によれば、ＭＡ試験バックグラウンド測定値のシグナル対ノイズ・フィルタリングがｋ−平均クラスタ分析によって行われる。

本発明のいくつかの実施形態によれば、代謝活性測定値による診断決定は、少なくとも２つの決定樹モデルを必要とする。

本発明のいくつかの実施形態によれば、決定樹モデルは、Ｃ５、Ｃ＆ＲツリーおよびＣＨＡＩＤからなる群から選択される。

本発明のいくつかの実施形態によれば、上記方法はさらに、当該細胞を当該細胞外環境から分離することを含む。

本発明のいくつかの実施形態によれば、分離が、遠心分離下におけるフィコール分離によってなされる。

別途定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術的用語および／または科学的用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書に記載される方法および材料と類似または同等である方法および材料を本発明の実施または試験において使用することができるが、例示的な方法および／または材料が下記に記載される。矛盾する場合には、定義を含めて、本特許明細書が優先する。加えて、材料、方法および実施例は例示にすぎず、限定であることは意図されない。

本明細書では本発明のいくつかの実施形態を単に例示し添付の図面を参照して説明する。特に詳細に図面を参照して、示されている詳細が例示として本発明の実施形態を例示考察することだけを目的としていることを強調するものである。この点について、図面について行う説明によって、本発明の実施形態を実施する方法は当業者には明らかになるであろう。

図１は、酸化的リン酸化、嫌気的糖分解および好気的糖分解（これはまた、「Ｗａｒｂｕｒｇ効果」として知られている）の違いの概略図である。

図２は、８−ヒドロキシピレン−１，３，６−トリスルホン酸（ＨＰＴＳ）のｐＨ依存性吸収スペクトルを示すグラフである。

図３Ａ〜図３Ｄは、１μＭのＨＰＴＳにおける、２ｍＭリン酸塩緩衝生理食塩水および１０ｍＭリン酸塩緩衝生理食塩水での作業溶液のｐＨおよび酸性度校正を示すグラフである。ＯＰＥＮ：酸性化ステップを、封止することなく３７℃でモニタした。ＣＬＯＳＥ：酸性化ステップを、マルチウエルプレート封止後、３７℃でモニタした。

Ｘ軸；比率（蛍光強度（励起：４０３ｎｍ）／蛍光強度（励起：４５５ｎｍ））。

右Ｙ軸（三角）：１Ｎ ＨＣｌの逐次添加によって得られるＨＣｌの蓄積量（μｍｏｌ／ｍｌ）。

左Ｙ軸（丸）：ｐＨガラス電極によって測定される適切なｐＨ値。図３Ａ〜図３Ｂ−２ｍＭリン酸塩緩衝生理食塩水による作業溶液。図３Ｃ〜図３Ｄ−１０ｍＭリン酸塩緩衝生理食塩水による作業溶液。

図４Ａ〜図４Ｂは、１０ｍＭリン酸塩緩衝生理食塩水における１μＭおよび１０μＭのＨＰＴＳ濃度での校正曲線を示すグラフである。

Ｘ軸；比率（蛍光強度（励起：４０３ｎｍ）／蛍光強度（励起：４５５ｎｍ））。

右Ｙ軸（三角）：１Ｎ ＨＣｌの逐次添加によって得られるＨＣｌの蓄積量（μｍｏｌ／ｍｌ）。

左Ｙ軸（丸）：ｐＨガラス電極によって測定される適切なｐＨ値。（図４Ａ）ＨＰＴＳの最終濃度が１μＭである。（図４Ｂ）ＨＰＴＳの最終濃度が１０μＭである。

図５Ａ〜図５Ｄは、ＨＰＴＳ参照速度値のｋ−平均クラスタ分析を示す。図５Ａ〜図５Ｃ−ｘ軸は、“ＯＰＥＮ”測定から受け取るプローブの標準化値を示し、ｙ軸は、“ＣＬＯＳＥ”測定から受け取るプローブの標準化値を示す。図５Ａ−クラスタ分析前の、すべての試験のドナーから得られるすべての値の検査（Ｎ＝７３０個の測定結果）。図５Ｂ−プローブデータのｋ−平均クラスタ分析により、異なる色で示される２６個のクラスタが示される。５個のクラスタは小さいことが見出され（６以下の観測結果）、したがって、棄却された（外れ値）。図５Ｃ〜図５Ｄ−７３０個の観測結果からの３４個の観測結果（４．６６％）が除外された（赤色）。残る６９６個の観測結果（９５．３４％）（青色）が（図５Ｂ）において２１個の別個のクラスタで示される。その後、“ＯＰＥＮ”状態の平均値および“ＣＬＯＳＥ”状態の平均値がそれぞれのドナーについて再計算された。

図６Ａ〜図６Ｃは、典型的な健常者ドナーおよびガンドナーについて得られる、増大するグルコース濃度についてのＭＡプロフィルである。ｘ軸：グルコース濃度（ｍＭ）。ｙ軸：図６Ｂ〜図６ＣについてはピコモルＨ＋／μｌ／時間／２５００個ＰＢＭＣを単位とし、図６ＡについてはピコモルＨ＋／μｌ／時間を単位とするｈＰＢＭＣの代謝活性速度。酸性化速度論が３７℃での１時間のインキュベーションの期間中に測定される。３０分の期間中におけるマルチウエルプレートの“ＯＰＥＮ”状態サイクル。この状態では、ＣＯ_２およびＮＨ_３のガス換気があり、その結果、（他の不揮発性有機酸を含めて）乳酸産生のみが、それぞれのウエルにおける当量酸性蓄積に寄与するだけである。３０分の期間中における同じマルチウエルプレートの“ＣＬＯＳＥ”状態サイクル。この気密封止状態では、ＣＯ_２およびＮＨ_３が平衡状態で水と反応して、炭酸イオンおよびアンモニウムイオンを形成する。酸性度レベルが、ｐＨ７．３前後で乳酸アニオンおよび炭酸アニオンの両方によってもたらされる。ＮＨ_４ ^＋の塩基性カチオンが、ここでは酸性度レベルを滴定するために評価される。“ＣＬＯＳＥ”−“ＯＰＥＮ”＝ＣＯ_２＋（−ＮＨ_３）。（図６Ａ）プローブＨＰＴＳおよびグルコースを含むが、細胞を伴わないＭＡ試験の対照記録。（図６Ｂ）典型的な健常者ドナーを表す４５歳女性のＭＡプロフィル（類似するプロフィルが、異なる年齢および性別について得られる）。（図６Ｃ）第２期のｉｄｃ乳ガンを有する処置前の３７歳女性のＭＡプロフィル。健常者サンプルと、疾患サンプルとの間における誘導されたＭＡ変化が、既に基礎状態（刺激因子を伴わない対照サンプル）において検出されているかもしれないことに留意すること。

図７Ａ〜図７Ｄは、６９歳の健常者男性と比較して６５歳の乳ガン女性について得られる、増大するグルコースについてのＭＡプロフィルの事例研究追跡調査を示すグラフである。黒色−“ＣＬＯＳＥ”；赤色−“ＯＰＥＮ”；青色−“Ｃ−Ｏ”＝“ＣＬＯＳＥ”−“ＯＰＥＮ”。図７Ａ−６９歳の健常者男性の末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）のＭＡプロフィル。図７Ｂ〜図７Ｄは、６５歳のｉｄｃ乳ガン女性の末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）の３つの追跡研究ＭＡプロフィルを示す。Ｘ軸：グルコース濃度（ｍＭ）。Ｙ軸：ピコモル／μｌ／時間／２５００個ＰＢＭＣを単位とするＰＢＭＣの代謝活性速度。（図７Ｂ）追跡調査患者（ガンを有することが試験結果によって既に疑われている）の最初のＭＡ試験（時間＝０）。（図７Ｃ）時間＝＋１０．５ヶ月、すなわち、第３期のｉｄｃ乳ガンを有することが医師によって診断された日常的マンモグラフィの直後における２回目のＭＡ試験。（図７Ｄ）時間＝＋１４．５ヶ月、すなわち、６回目のＭＡ試験が、左側乳房における２．２ｘ２．４ｃｍの腫瘍の外科的除去の後で、かつ、３回の化学療法処置が行われた２ヶ月の後で行われた。

図８Ａ〜図８Ｄは、典型的な健常者ドナー、乳ガン患者および乳ガン回復ドナーについて得られる、増大するＰＳＡ濃度についてのＭＡプロフィルを示すグラフである。

図８Ａ−プローブＨＰＴＳおよびＰＳＡを含むが、細胞を伴わないＭＡ試験の対照記録。（図８Ｂ〜図８Ｄ）３名の異なるドナーの末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）のＭＡプロフィル。Ｘ軸：ＰＳＡ濃度（μｇ／ｍｌ）。Ｙ軸：図８Ｂ〜図８ＤについてはピコモルＨ＋／μｌ／時間／２５００個ＰＢＭＣを単位とし、図８ＡについてはピコモルＨ＋／μｌ／時間を単位とするＰＢＭＣの代謝活性速度。酸性化速度論が３７℃での１時間のインキュベーションの期間中に測定される。黒色−“ＣＬＯＳＥ”；赤色−“ＯＰＥＮ”；青色−“Ｃ−Ｏ”＝“ＣＬＯＳＥ”−“ＯＰＥＮ”。（図８Ａ）典型的な健常者ドナーを表す５９歳女性のＭＡプロフィル。（図８Ｂ）第２期のｉｄｃ乳ガンを有し、何らかの処置を受ける前の３７歳女性のＭＡプロフィル。（図８Ｃ）ＭＡ試験の１８年前に乳ガンから回復した５０歳女性のＭＡプロフィル。

図９Ａ〜図９Ｄは、ＭＡ試験結果についてのモデル構築および分類評価を示す。

図９Ａ〜図９Ｂ−年齢が４０歳を超えるドナーの第１の群（ｎ＝４２）。図９Ｃ〜図９Ｄ−年齢が２２歳〜８１歳の間であるドナーの第２の群。図９Ａ、図９Ｃ−２つの表は、最も良い分類の最も良い切れ目点を有する最良モデルを示す。“Ｏ”は“ＯＰＥＮ”状態を示し、“Ｃ”は“ＣＬＯＳＥ”状態を示し、“Ｃ−Ｏ”は“ＣＬＯＳＥ−ＯＰＥＮ”状態を示す。ＴＰは真の陽性を示し、ＦＮは偽陰性を示し、ＴＮは真の陰性を示し、ＦＰは偽陽性を示す。図９Ｂ、図９Ｄ−累積増加チャートによるモデル成績の評価および比較のための２つのグラフ。ｙ軸は、ガンを有するとモデルによって分類されるドナーの百分率を示す。これは全ドナー（健常者およびガン患者）の百分率である。ｘ軸は、ガンを有すると分類される患者の百分率を示し、これは、第１の群については４２名の全ドナーの割合であり、第２の群については６７名の全ドナーの割合である。健常者ドナーおよびガン患者の両方を高い精度で分類することができた４つの最良モデルが示される。第４のモデルが、様々な回帰モデルの一群から得られるロジスティック回帰モデルである。黒色線はランダム応答率を示す（ドナーのＸ％をランダムに分類するならば、ガン患者のＸ％が得られる）。空色線は理論的最良モデルを示す。赤色線はＣＨＡＩＤモデルを示し、緑色線はＣ５アルゴリズムを示し、黄色線はＣ＆Ｒツリーモデルを示し、青色線はロジスティックモデルを示す。

図１０Ａ〜図１０Ｄは、ＭＡ試験のモデル結果を、ドナーの３０％からなる検証集合を使用して評価することを示す。図１０Ａ〜図１０Ｂ−年齢が４０歳を超えるドナーの第１の群（ｎ＝４２）。図１０Ｃ、図１０Ｄ−年齢が２２歳〜８１歳の間であるドナーの第２の群。（ａ、ｃ）図９に記載されるようなデータを、ｃｌｅｍｅｎｔｉｎｅソフトウエア（Ｖ１３．０）を使用して“学習”および“試験”の２つの群にランダムに仕分けた。図１０Ａ−検証集合には、第１の群についてドナーの７０％が含まれた。図１０Ｃ−検証集合には、第２の群についてドナーの７０％が含まれた。図１０Ａ、図１０Ｃ−ランダムなデータ仕分け後に累積増加チャートによってなされるモデル成績の評価および比較のための２つのグラフ。ｙ軸は、ガンを有するとモデルによって分類されるドナーの百分率を示す。これは全ドナー（健常者＆ガン患者）の百分率である。ｘ軸は、ガンを有すると分類される患者の百分率を示す。“学習”集合が、ドナーの７０％に対するデータマイニングモデルを組み立てるために使用される。ドナーの残る３０％がその後で、学習集合において作製されたモデル（ＣＨＡＩＤ、ロジスティック、Ｃ５、Ｃ＆Ｒツリー）を使用して“試験”集合に対する分類結果を評価するために使用される。図９に記載されるように、空色線は理論的最良モデルを示し、赤色線はＣＨＡＩＤモデルを示し、緑色線はＣ５アルゴリズムを示し、黄色線はＣ＆Ｒツリーモデルを示し、青色線はロジスティックモデルを示し、黒色線はランダムモデルを示す。図１０Ｂ、図１０Ｄ−２つの表は、ランダムデータ仕分け後における最も良い分類の最も良い切れ目点を有する最良モデルを示す。“Ｏ”は“ＯＰＥＮ”状態を示し、“Ｃ”は“ＣＬＯＳＥ”状態を示し、“Ｃ−Ｏ”は“ＣＬＯＳＥ−ＯＰＥＮ”状態を示す。ＴＰは真の陽性を示し、ＦＮは偽陰性を示し、ＴＮは真の陰性を示し、ＦＰは偽陽性を示す。両方のドナー群において、Ｃ５が、“試験”集合において最良の結果をもたらし、一方、“学習”集合においては、Ｃ＆Ｒツリーが最良の結果をもたらした。

図１１は作業仮説（すなわち、腫瘍発達の鏡像としてのｈＰＢＭＣの代謝活性プロフィル）を表す。ガン発達には、ｈＰＢＭＣの種々の代謝活性（ＭＡ）プロフィルに反映され得る免疫系の生理学的機能における変化が伴うと考えられる。Ｙ軸は、代謝経路の２つの流れ、すなわち、酸化的リン酸化対好気的糖分解を示す。Ｘ軸は、健常から転移ガンに至るまでの腫瘍発達の各段階を示す。休止細胞（Ｑ）は酸化的リン酸化の優勢的な基礎速度を有する。腫瘍発達の初期段階では、抗腫瘍エフェクタキラー細胞（Ｅｋｉ）へのＱの関連組織特異的なサブグループ（Ｑｉ）の「クローン拡大」が存在し、この抗腫瘍エフェクタキラー細胞はその後の段階でおそらくは、プロ腫瘍エフェクタフィーダ細胞（Ｅｆｉ）に形質転換される。同時に、免疫寛容およびアネルギーがなくなり、それらのそれぞれの休止サブグループ（Ｑｉ）を含めて、両方の組織特異的エフェクタ・サブグループが消耗させられ得る転移した段階になる。今回の結果は、健常者ドナーのｈＰＢＭＣが好む優勢的な酸化的リン酸化から、局所的腫瘍発達の段階（第１期〜第３期）における様々なガン患者のｈＰＢＭＣが好む優勢的な好気的糖分解（「Ｗａｒｂｕｒｇ効果」）への代謝変化を明らかにする。好気的糖分解に向かうこの変化は、優勢なＥｆｉサブグループに関連づけられ得、場合によって、Ｅｋｉサブグループにも関連づけられ得る。ガン（第０期）の組織特異的な早期検出能が、追跡調査プロトコルによって調べられることになる。健常者ドナーについて得られる場合と比較して、組織特異的抗原による刺激下での高まった／低下した代謝活性化として解明されることが予想される。早期の転移ガン（第４期）では、優勢的な酸化的リン酸化に向かう徐々の逆行変化が予想され、これにより、適切な処置のための診断ツールがもたらされる。特徴的な代謝活性プロフィルの上記の概略的記載が、ＭＡ試験の“ｃｌｏｓｅ−ｏｐｅｎ”結果における違い（これにより、ｈＰＢＭＣのＷａｒｂｕｒｇ効果変化が示される）に関連づけられる縞模様のオレンジ色線によって示される。

図１２は、ＭＡ試験プロトコルおよび分析枠組みのフローチャートである。ＭＡ試験枠組みの連続する段階（Ａ〜Ｅ）が、下記の実施例の節の実施例１において詳述される段階に一致する。

図１３Ａ−図１３Ｉは、典型的な健常者ドナー、ガンドナー、および自己免疫狼瘡ドナーについて得られる増大するグルコース濃度についてのＭＡプロフィルである。Ｘ軸：グルコース濃度（ｍＭ）。Ｙ軸：ピコモルＨ^＋／μｌ／時間／２５００個細胞を単位とするＰＢＭＣの代謝活性速度。酸性化速度論が３７℃での１時間のインキュベーションの期間中に測定される。

図１３Ａ、図１３Ｄ、図１３Ｇ−“ＣＬＯＳＥ”；図１３Ｂ、図１３Ｅ、図１３Ｈ−“ＯＰＥＮ”；図１３Ｃ、図１３Ｆ、図１３Ｉ−“Ｃ−Ｏ”＝“ＣＬＯＳＥ−ＯＰＥＮ”。図１３Ａ〜図１３Ｃ−典型的な健常者ドナーの代表的なＭＡプロフィル。図１３Ｄ〜図１３Ｆ−典型的なガン患者の代表的なＭＡプロフィル。図１３Ｇ〜図１３Ｉ−全身性狼瘡（自己免疫疾患）の患者のＭＡプロフィル。

本発明は、そのいくつかの実施形態において、代謝活性プロフィルのモニタリング方法および分析方法ならびにそれらの診断使用または治療使用に関連し、すなわち、具体的には、血液サンプルの代謝活性モニタリングによるガン診断に関連する。

本発明の少なくとも１つの実施形態を詳細に説明する前に、本発明は、その適用において、下記の説明に示される細部、または、実施例によって例示される細部に必ずしも限定されないことを理解しなければならない。本発明は他の実施形態が可能であり、あるいは、様々な方法で実施、または、実行される。

今日、高処理方法が、様々な疾患の早期検出および病期分類のために至急に要求されている。例えば、ガンは発見および処置が早いほど、生存の可能性が良好である。そのうえ、疾患の病期を特定することにより、適切な処置が保証される。

本発明者らは、比較的後期の段階での疾患検出を可能にする、疾患に伴う様々なインシトゥ・パラメータまたは関連した循環マーカを分析する疾患検出のための標準的な取り組みとは対照的に、免疫系が、既に疾患発症時において疾患状態を反映しているかもしれないことに気づいた。免疫系は当然のことながら、既に早い段階において疾患発達と闘うことに関与しているので、関連した免疫応答の特徴的プロフィルを特定することは有益であると思われる。疾患発達に伴う免疫系の代謝活性のそのようなプロフィルの変動は、疾患の病期分類のためにもまた有用になり得る。例えば、恒常性において、免疫系の活性は十分に制御されなければならない；活性亢進が自己免疫疾患には伴い、その一方で、ガン発達はおそらくは、免疫系の活性低下に関連づけられる。これらの正反対の経路が、様々な栄養素および刺激因子に対する応答における全般的、かつ、より特異的なＭＡプロフィルによって示され得る。

したがって、本発明者らは、関連した細胞集団の代謝活性を定量的に測定するための画期的な臨床指向の取り組みを疾患の指標として考案するに至った。アッセイでは、マイクロリットルの細胞サンプルの代謝活性の速度が、ｐＨ感受性の不透過性蛍光プローブを使用して細胞外の酸性化をモニタすることによって測定される。

下記の実施例の節において例示されるように、代謝活性（ＭＡ）分析を使用して、本発明者らは、ガン患者および健常者ドナーから得られるＰＢＭＣに関してモニタされる種々の代謝経路の間における著しい変化を明らかにしている。この変化は、ＰＢＭＣの代謝活性における特徴的な変化をモニタすることによって健常者およびガン患者を明確に識別するために診断ツールとして採用され得る（図６〜図１０、図１３）。これらの重要な予備的発見が、“ｏｐｅｎ”ウエル対“ｃｌｏｓｅ”（空気封止）ウエルにおけるＭＡ試験結果を比較することによって得られた。両方の記録は、可溶性代謝生成物対揮発性代謝生成物（乳酸対ＣＯ_２およびＮＨ_３）の蓄積を測定することを可能にし、それにより、下記で解釈されるような３つの代謝経路、すなわち、酸化的リン酸化、嫌気的糖分解および好気的糖分解を識別することを可能にする。

非活性化Ｔ細胞（ナイーブＴ細胞）は、ほとんどの正常な分化細胞と同様に、細胞プロセスのために必要とされるエネルギーのためのＡＴＰと、揮発性のＣＯ_２生成物とを効率よく生成するために、ミトコンドリアの酸化的リン酸化に主に頼っている。酸素がない場合、非活性化Ｔ細胞（ナイーブＴ細胞）は、嫌気的糖分解として知られている乳酸産生を伴う、ＡＴＰ産生のあまり効率的でない代謝経路に頼らなければならない。対照的に、ほとんどのガン細胞^１８は好気的糖分解に頼ることが見出されており、たが、この好気的糖分解は、酸素の存在にもかかわらず、嫌気的糖分解と類似している。この現象が、ガン細胞に関連して、Ｏｔｔｏ Ｗａｒｂｕｒｇによって初めて見出され、「Ｗａｒｂｕｒｇ効果」と呼ばれた。本発明者らは、「Ｗａｒｂｕｒｇ効果」がガン患者の新鮮なＰＢＭＣに存在することを明らかにした。理論にとらわれることはないが、「Ｗａｒｂｕｒｇ効果」の免疫代謝的な理論的根拠、すなわち、ガン患者の新鮮なＰＢＭＣにおけるナイーブなリンパ球および活性化されたリンパ球の間における変化が、血管形成前の初期の段階ではおそらくは酸素欠乏である腫瘍細胞近隣における活性化Ｔ細胞の攻撃的かつ効果的な生理学的機能を必要とすることに関連づけられ得る。この考えは、腫瘍細胞が最初に「Ｗａｒｂｕｒｇ効果」により酸素欠乏に適応するという事実と一致している。
上記の代謝経路を考慮すると、最終生成物、すなわち、ＣＯ_２および乳酸が、ＭＡ試験によって調べられる酸性化に直接に寄与している。

そのうえ、主要な役割をＭＡ試験において果たすと考えられる別の最終生成物が、アンモニア（ＮＨ_３）である。細胞エネルギーの主たる供給源の１つが、アミノ酸へのタンパク質分解のプロセスであるタンパク質異化である。アミノ基がアミノ酸から除かれ、アンモニアに変換される。細胞のＮＨ_３産生の別の供給源は、窒素含有塩基の２つの群を構成するプリン化合物およびピリミジン化合物の代謝経路を介してである。本発明の測定系では、インビボのように、生細胞は、代謝での酸性生成物および塩基性生成物（例えば、乳酸、炭酸およびアンモニウム塩基）の分泌によって、細胞質を約７．２〜７．４の一定ｐＨで維持しなければならない。

これらの発見は既に、免疫系と連絡することによって、生理学志向のＭＡ分析が、ガンを他の疾患と同様に検出し、診断し、また、処置するための新しい方法を開発するために重要な影響を有し得るであろうことを保証している。

したがって、本発明の一局面によれば、細胞の代謝活性（ＭＡ）を測定する方法が提供される。この方法は、当該細胞の細胞外環境において、
（ｉ）不揮発性の可溶性代謝生成物；
（ｉｉ）不揮発性の可溶性代謝生成物および揮発性の可溶性代謝生成物；
（ｉｉｉ）揮発性の可溶性代謝生成物
の分泌に起因する時間依存的な酸性化プロフィルを独立して（すなわち、別個に）測定することを含み、ただし、これらの時間依存的な酸性化プロフィルの少なくとも１つにより、当該細胞の代謝活性経路が示される。

本明細書中で使用される場合、「代謝活性経路」は、エネルギー産生に対する、ミトコンドリアの酸化的リン酸化、嫌気的糖分解、好気的糖分解およびＮＨ_３ ^＋産生の相対的寄与を示す。

上記プロフィルは、急上昇形状または単調な飽和挙動を有する場合がある。

急上昇プロフィルは典型的には、濃度依存的な栄養応答と比較して、より特異的であることが予想される代謝活性の受容体媒介刺激を反映する。濃度依存的な栄養応答は一般に、単調な飽和挙動である。

本明細書中で使用される場合、「細胞」は、上記の代謝活性が測定され得る原核細胞または真核細胞を示す。細胞は、細菌細胞、酵母細胞、植物細胞、昆虫細胞または哺乳動物細胞が可能である。具体的な実施形態によれば、細胞はヒト細胞である。細胞は、ただ１個の細胞を示す場合があること、しかし、複数の細胞を示す場合もあることが理解されるであろう。細胞は、（組織構成を何ら有しない）単離された細胞、あるいは、組織または組織断片における細胞である場合がある。具体的な実施形態によれば、細胞がＰＢＭＣであるとき、アッセイが１０^３個〜１０^１０個の細胞に対して行われる。具体的な実施形態によれば、細胞数は１０^６個〜１０^７個である。

細胞は、分化細胞、非分化細胞（例えば、幹細胞）または脱分化細胞である場合がある。

具体的な実施形態によれば、細胞は免疫系の細胞であり、すなわち、白血球である。例には、好中球、好酸球、好塩基球、リンパ球（Ｔ細胞またはＢ細胞）、単球、マクロファージおよび樹状細胞が含まれる。

別の実施形態によれば、細胞はいずれかの組織の病原性細胞または疾患細胞であり、例えば、ガン細胞などである。本発明の教示に従って検出することができる他の疾患および医学的状態が下記に示される。

本発明の教示に従って分析され得る他の細胞には、胚性細胞（例えば、ＩＶＦ認定のためなどの胚性細胞）、赤血球、血小板、細菌感染細胞、真菌感染細胞およびウイルス感染細胞が含まれるが、これらに限定されない。

したがって、細胞は、特定の細胞の高度に精製されたサブセットを含む単離された細胞集団、すなわち、同型遺伝子細胞集団（例えば、８０％超の純度）、例えば、Ｔ細胞、あるいは、様々なタイプの免疫細胞を含む異型遺伝子細胞集団、例えば、末梢血白血球（ＰＢＬ）または末梢血単核細胞などを示す場合がある。

細胞は、非培養細胞、培養された初代細胞、または、クローン化細胞（例えば、細胞株）である場合がある。

細胞は、接着性細胞または懸濁状態での細胞である場合がある。

さらなる実施形態によれば、細胞は遺伝子非改変または遺伝子改変であり得る。

本明細書中で使用される場合、「独立して測定する」は、項目（ｉ）、項目（ｉｉ）、および、場合により項目（ｉｉｉ）を別々に測定することを示す。だが、具体的な実施形態によれば、（ｉｉｉ）は、（ｉ）を（ｉｉ）から引くことの結果であることが理解されるであろう。これらの個別測定を、（下記の実施例の節において記載されるように）並行して、または、同時に、同一であるが別個の細胞サンプルに対して、または、連続してただ１つの細胞サンプルに対して行うことができる。

したがって、細胞外酸性化プロフィルの測定が酸性化の校正曲線（表１）によって行われる。

代謝活性の測定が、“ｏｐｅｎ”状態および“ｃｌｏｓｅ”状態での細胞の細胞外環境における蛍光測定されたｐＨ変化に関連して累積酸性化（例えば、ｐｍｏｌ／ｕｌ／時間／２５００個細胞）を計算することによって行われる。具体的な実施形態によれば、この測定が細胞の細胞外環境においてのみ行われ、細胞内では行われないことが理解されるであろう。細胞外ｐＨ測定が下記の理由から好都合である。細胞外環境においては、恒常性生理学的調節に起因する一過性の細胞内応答における比較的小さい平均変化に対して、持続した酸性蓄積が存在すること；細胞内プロセスによる細胞外プローブの生理学的妨害がないこと；細胞外レシオメトリック蛍光プローブのシグナル対ノイズ比がかなり大きいこと；蛍光媒体（校正された緩衝能）の調製が細胞操作に対して簡便であること；細胞内プローブの著しい漏出とは対照的に、バックグラウンド蛍光がないこと；速度論的測定が、透過性増大手順を必要とすることなく行われ、それにより、生細胞のリアルタイムでの分析を可能にすること；クエンチングおよび酸化の影響に伴う問題が最小限であること；そして、最後に、同時高処理速度論的測定が、上記障害を伴うことなく可能となること。

本明細書中で使用される場合、細胞の「細胞外環境」は、天然の環境（例えば、血液または血漿）または人工的な環境（例えば、培養培地など）を示す。

具体的な実施形態によれば、ＭＡ試験が、校正された緩衝能を有する定義された溶液（全成分が既知である）において行われる。

緩衝能は生理学的ｐＨにおける微小な変化を保証しなければならないことが理解されるであろう。

具体的な実施形態によれば、緩衝液はリン酸塩緩衝液（例えば、リン酸塩緩衝生理食塩水、１〜１０ｍＭまたは１０ｍＭのリン酸塩緩衝液）である。低い緩衝剤濃度が、低い細胞濃度での酸性化測定のために要求されることが理解されるであろう。具体的な実施形態によれば、１０ｍＭのリン酸塩緩衝生理食塩水が２．５×１０^６細胞／ｍｌに使用される。

したがって、代謝活性の速度論が、ＨＰＴＳ蛍光校正緩衝能の微小な酸性化過程によってインキュベーション期間中においてモニタされる。

図３Ａ〜図３Ｄおよび図４Ａ〜図４Ｄには、作業溶液校正およびプローブ校正がそれぞれ記載される。

具体的な実施形態によれば、酸性化プロフィルの測定が一定の温度（例えば、２０℃〜４０℃）で行われるか、または、具体的には、最適な成長温度で、例えば、哺乳動物細胞については３７℃で行われる。

本明細書中上記で記載されるように、細胞外酸性化プロフィルにより、当該細胞によって分泌される様々な代謝生成物の正体が示される。

図１に示されるように、腫瘍組織または増殖性組織（例えば、活性化Ｔ細胞）では、培地への乳酸の分泌によって主に特徴づけられる好気的糖分解が優先的に使用される。対照的に、分化した組織では、酸化的リン酸化または嫌気的糖分解が用いられることになり、したがって、酸素が利用できるかに依存して、ＣＯ_２または乳酸がそれぞれ分泌されることになる。

具体的な実施形態によれば、不揮発性の可溶性代謝生成物（主に乳酸）の分泌に起因する時間依存的な酸性化プロフィルが空気暴露チャンバにおいて履行される。そのような条件（“ｏｐｅｎ”）下では、ＣＯ_２およびＮＨ_３のガス換気があり、その結果、（他の不揮発性有機酸を含めて）乳酸産生のみがそれぞれのウエルにおける当量酸性蓄積に寄与する。

具体的な実施形態によれば、不揮発性の可溶性代謝生成物および揮発性の可溶性代謝生成物の分泌に起因する時間依存的な酸性化プロフィルが空気封止チャンバにおいて達成される。この気密封止状態（“ｃｌｏｓｅ”）では、ＣＯ_２およびＮＨ_３が水と平衡状態で反応して、炭酸イオンおよび塩基性アンモニウムイオンを形成する。しかしながら、この状態では、ＮＨ_４ ^＋の塩基性カチオンにより、乳酸アニオンおよび炭酸アニオンの両方によってもたらされる酸性度レベルがｐＨ７前後で滴定される。

具体的な実施形態によれば、酸性化速度論が、３０分間の、マルチウエルプレートの空気“開放”状態および空気“閉鎖”状態の連続で測定される。

酸性化（＋）および塩基性滴定（−）の適切な速度（Ｖ）によって、開放状態における酸性化の全体的な測定された速度（Ｖｏｐｅｎ）と、閉鎖状態における酸性化の全体的な測定された速度（Ｖｃｌｏｓｅｄ）とが、下記の連結された式によって表される：
Ｖｏｐｅｎ＝Ｖ（乳酸）
Ｖｃｌｏｓｅ＝Ｖ（乳酸）＋Ｖ（炭酸）−Ｖ（アンモニウム塩基）。

この形態を使用して、揮発性の可溶性代謝生成物の分泌に起因する時間依存的な酸性化プロフィルが、（ｉｉ）−（ｉ）のプロフィルの引き算によって計算される。

細胞外酸性化の速度論の測定が、非毒性の膜不透過性プローブを使用して行われる。例には、レシオメトリックｐＨプローブ、ＣＯ_２プローブ、ＮＨ_３プローブ、乳酸プローブ、および、これらの組合せが含まれるが、これらに限定されない。具体的な実施形態によれば、レシオメトリック技術がｐＨ緩衝化条件での高感度のために必要である。

本発明の教示に従って使用することができる具体的なプローブの例には、ＨＰＴＳ、ＣＦＤＡおよびカルボキシフルオレセインが含まれるが、これらに限定されない。そのようなプローブが、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓなどから市販されている。

具体的な実施形態によれば、酸性化の測定が、レシオメトリックｐＨプローブの８−ヒドロキシピレン−１，３，６−トリスルホン酸（ＨＰＴＳ）を使用して行われる。

ＨＰＴＳは、ｐＫａが水性緩衝液において約７．３である、費用効果的な非毒性の、非常に水溶性の膜不透過性ｐＨ指示薬である。ＨＰＴＳはｐＨ依存的な吸収移動を示し、これにより、レシオメトリックｐＨ測定を、４５５ｎｍおよび４０３ｎｍにおける励起下で連続して測定される５１３ｎｍにおける蛍光強度の比率の関数として可能にする。この方法は、ｐＨ７前後の生理学的範囲における微小ｐＨ変化の本発明の高感度測定には不可欠である。

具体的な実施形態によれば、蛍光プローブが、様々な代謝生成物、すなわち、ＣＯ_２、ＮＨ_３、乳酸などのレシオメトリでの特異的な光学的モニタリングを拡大するために、ナノセンサとしてナノ粒子に取り付けられる。細胞内蛍光測定が、生理学的な刺激機構の基礎研究において、例えば、カルシウムの動員および膜の脱分極についての基礎研究において極めて有用である。しかしながら、恒常性の細胞応答下では、これらの細胞内刺激シグナルは一過性になる。したがって、これらのシグナルは、ＭＡ試験で記録される進行中の累積細胞外酸性化と比較した場合、ＰＢＬ刺激の高感度モニタリングにはあまり適していないと見なされる。そのような細胞外モニタリングは、レシオメトリック分子の光学プローブをナノ粒子に取り付けることによってより良好に促進される場合がある。細胞外モニタリングは生体適合性であり、このため、細胞内プローブの測定に共通する負の影響が最小限に抑えられ、これにより、細胞外方法の利点が基礎研究においてだけでなく、異なる細胞タイプでの様々な臨床応用のためにもまた示される。

酸性化プロフィルが、ピコモル／μｌ／時間／２５００個細胞を単位として、Ｈ_２Ｏ−Ｈ^＋当量の分泌速度によって示される（図６〜図８、図１３を参照のこと）。

上記酸性化プロフィルのどれもが細胞の代謝活性の指標として使用することができる。あるいは、測定されたプロフィルの１つだけにより、細胞の代謝活性が示される。

述べられたように、細胞の代謝活性を、刺激因子または阻害因子の種々の濃度にさらされているナイーブ細胞または活性化／エフェクタ細胞において測定することができる。

本明細書中で使用される場合、「刺激因子」または「阻害因子」は、細胞の代謝経路をそれに応答して増大させるか、または低下させるか、または変化させる実体を示す。

例えば、細胞がリンパ球であるならば、刺激因子は、ＴＣＲまたはＢＣＲによって認識され、クローン拡大または抗体産生を引き起こす抗原である。具体的な刺激因子または阻害因子が下記の表１に示される。

他の例が本明細書中下記に提供される。

刺激因子または阻害因子は細胞あるいは細胞関連の刺激因子または阻害因子である場合がある。刺激性細胞の例には、白血球、幹細胞、血小板、赤血球、細菌および真菌が含まれるが、これらに限定されない。そのような細胞性の刺激因子または阻害因子は、無傷な細胞、または、細胞断片（例えば、細胞膜）を示す場合がある。

細胞刺激因子の使用は、移植適用における使用のための、例えば、移植片拒絶の予測（組織適合試験）、移植片対宿主病または移植片拒絶の防止または処置などにおける使用のための混合リンパ球反応（ＭＬＲ）において特に好都合である。そのような場合、刺激因子は、細胞に関して非同系であるリンパ球である。

あるいは、刺激因子または阻害因子は無細胞である場合があり、例えば、無細胞抗原（例えば、可溶性抗原、ウイルス、細胞の生物学的流体）である場合がある。無細胞性の刺激因子または阻害因子の具体的な例には、代謝産物、栄養物（例えば、グルコース）、分裂促進因子、ペプチド、サイトカイン、ホルモン、ビタミン、薬物、抗体、神経伝達物質、ガン特異的抗原、および、疾患に伴う様々な組織特異的な正常な抗原（ＴＮＡ）が含まれるが、これらに限定されない。

ＭＨＣ拘束抗原（ペプチド）の具体的な例には、ＣＥＡ（ガン胎児性抗原）、ＭＵＣ−１、ＨＥＲ２、ＣＤ３４０、ＭＡＧＥおよびプロラクチンが含まれるが、これらに限定されない（他の例が、Ｒｅｎｋｖｉｓｔ他、２００１、“Ａ ｌｉｓｔｉｎｇ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｔｕｍｏｒ ａｎｔｉｇｅｎｓ ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ ｂｙ Ｔ ｃｅｌｌｓ”、Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ、５０：３〜１５に記載される）。

刺激因子または阻害因子は様々な濃度で細胞と接触させられる。

刺激因子または阻害因子は、疑われる病状に従って選択される。例えば、体外受精適用では、その細胞外流体への胚分泌物の進行中のＭＡが調べられる。あるいは、または、加えて、母体ＰＢＬのＭＡ刺激プロフィルが胚分泌物の刺激によって調べられる。

スクリーニング試験において、細胞が複数の刺激因子または阻害因子と接触させられ、それらの酸性化プロフィルがそれぞれのそのような反応について同時にモニタされる。

したがって、上記で記載されるように、ＭＡ試験は、限定された数のサンプルに対して（例えば、組織培養ディッシュを使用して）、または、複数のサンプルに対して行うことができ、これにより、複数の刺激因子／阻害因子に対する応答をスクリーニングすることができ、あるいは、異なる患者または患者の組合せから得られる複数のサンプルをスクリーニングすることができる。高処理スクリーニングを、マルチウエルプレート、（蛍光シグナルを検出するための）マルチウエルプレート・リーダ、ＣＣＤカメラ応用の画像分析、または、光ファイバーマトリックスを使用して行うことができる。

本発明の実施形態によれば、得られた酸性化プロフィルが記録され、例えば、コンピュータ読み取り可能な媒体などでデータベースに保存され、その結果、データ操作および計算モデルの構築が可能になるようにされる。本明細書中で使用される場合、「コンピュータ読み取り可能な媒体」は、コンピュータが直接に読み取ることができ、また、アクセスすることができるいずれの媒体をも示す。そのような媒体には、磁気記憶媒体、例えば、フロッピー（登録商標）ディスク、ハードディスク記憶媒体および磁気テープなど；光学記憶媒体、例えば、光ディスクまたはＣＤ−ＲＯＭなど；電気的記憶媒体、例えば、ＲＡＭおよびＲＯＭなど；ならびに、これらのカテゴリのハイブリッド型、例えば、磁気／光学記憶媒体などが含まれるが、これらに限定されない。適切な記憶媒体の選択および使用は十分に当業者の能力の範囲内である。

本明細書中で使用される場合、「記録される（された）」は、情報をコンピュータ読み取り可能な媒体に保存するというプロセスを示す。

本発明の方法論のロバスト性および正確さにより、数多くの臨床応用におけるその使用が示唆される。

したがって、本発明の一局面によれば、変化した代謝活性に伴う疾患をその必要性のある対象において診断する方法であって、
（ａ）細胞を含む当該対象の生物学的サンプルを提供すること；
（ｂ）当該細胞の細胞外環境において、
（ｉ）不揮発性の可溶性代謝生成物；
（ｉｉ）不揮発性の可溶性代謝生成物および揮発性の可溶性代謝生成物；ならびに
（ｉｉｉ）揮発性の可溶性代謝生成物
の分泌に起因する時間依存的な酸性化プロフィルを独立して測定すること
を含み、ただし、これらの時間依存的な酸性化プロフィルの少なくとも１つにより、当該細胞の代謝活性が示され、これに対して、同一条件下で調べられた正常な非患部細胞サンプルの代謝活性と比較される代謝活性における変化により、変化した代謝活性に伴う疾患が示される方法が提供される。

対象は、健常な動物、または、日常的な健康診断を受けているヒト対象である場合がある。あるいは、対象は、変化した代謝活性に伴う疾患、例えば、ガンなどを有する危険性がある対象（例えば、遺伝的素因を有する対象、ガンの病歴および／または家族歴を有する対象、発ガン物質、職業上の危険、環境上の危険にさらされたことがある対象）、および／または、ガンの疑わしい臨床上の徴候［例えば、血便もしくは下血、原因不明の痛み、発汗、原因不明の発熱、食欲不振にまで至る原因不明の体重減少、排便習慣の変化（便秘および／または下痢）、テネスムス（具体的には直腸ガンについて、不完全な排便感）、貧血および／または全身衰弱］を示す対象である場合がある。

本明細書中で使用される場合、「変化した代謝活性に伴う疾患」は、（疾患に冒されていない）正常な健常者から採取される同一の細胞集団と比較した場合、代謝活性における変化を受けている細胞集団によって特徴づけられる疾患を示す。代謝活性における変化を受けているその細胞集団は、病原的細胞集団（すなわち、疾患を引き起こす細胞、例えば、ガン細胞）、または、非病原的細胞集団（例えば、疾患と闘っている細胞、例えば、固形腫瘍の場合などにおける免疫細胞）が可能である。例えば、本明細書中上記で記載されるように、腫瘍学では、ほとんどのガン細胞が主に、また、クローン拡大を受けている免疫系の一部の集団が、エネルギーを、ほとんどの正常な細胞と同様にミトコンドリアにおけるピルビン酸の酸化が続く糖分解の比較的低い速度によってではなく、むしろ、細胞質ゾルにおける乳酸産生が続く糖分解の大きい速度によって産生する（図１を参照のこと）。

本発明の教示に従って使用することができる細胞性の生物学的サンプルには、血液（例えば、末梢血白血球、末梢血単核細胞、全血、臍帯血）、充実性組織生検物、脳脊髄液、尿、リンパ液、ならびに、気道、腸管および尿生殖路の様々な体外分泌物、滑液、羊水および絨毛膜絨毛が含まれるが、これらに限定されない。

生検物には、切開生検または摘出生検を含む各種の外科的生検物、および、細針吸引物など、完全切除物、または、体液が含まれるが、これらに限定されない。生検物回収の様々な方法がこの技術分野では広く知られている。

本明細書中で使用される場合、用語「診断」または用語「診断する」は、病理（例えば、疾患、障害、状態または症候群）の存在または非存在を決定すること、病理または症状を分類すること、病理の重篤度を決定すること、病理の進行をモニタすること、病理の結果および／または回復の見込みを予測すること、ならびに、対象を特定の疾患についてスクリーニングすることを示す。

本発明の教示によれば、同一細胞組成の正常な健常な（非患部）サンプルの酸性化プロフィルが、対象の細胞をモニタするために使用された同一条件下で明らかにされる。

酸性化プロフィルが（例えば、刺激因子／阻害因子を用いて、または用いることなく）得られると、そのプロフィルが記録される。同一条件下で得られた酸性化プロフィルから明白であるように、対象の細胞と、対照（正常な非患部）の細胞との間での代謝活性における変化により、変化した代謝活性プロフィルに伴う疾患が示される。

代謝活性アッセイの結果は、結果を分類し、最終的な診断の助けとなる決定樹モデルを必要とする場合がある。好ましい実施形態によれば、少なくとも２つのモデルが組み合わされる（図９＆図１０を参照のこと）。そのようなモデルの例には、ＣＨＡＩＤ、Ｃ５、および、Ｃ＆Ｒツリーが含まれるが、これらに限定されない。ロジスティックモデルがさらに適用される場合がある。

本発明の教示に従って（本明細書中下記でさらに記載されるように）診断および処置することができる医学的状態の例には、ガン、病原性感染および自己免疫疾患が含まれるが、これらに限定されない。具体的な例が下記に提供される。

炎症性疾患−この疾患としては、慢性の炎症性疾患および急性の炎症性疾患が挙げられるが、これらに限定されない。

過敏症に関連する炎症性疾患
過敏症の例としては、Ｉ型過敏症、ＩＩ型過敏症、ＩＩＩ型過敏症、ＩＶ型過敏症、即時過敏症、抗体媒介過敏症、免疫複合体媒介過敏症、Ｔリンパ球媒介過敏症およびＤＴＨが挙げられるが、これらに限定されない。

Ｉ型過敏症または即時過敏症、例えば、喘息など。

ＩＩ型過敏症としては、リウマチ様疾患、リウマチ様自己免疫疾患、慢性関節リウマチ（Ｋｒｅｎｎ Ｖ．ら、Ｈｉｓｔｏｌ Ｈｉｓｔｏｐａｔｈｏｌ ２０００ Ｊｕｌ；１５（３）：７９１）、脊椎炎、強直性脊椎炎（Ｊａｎ Ｖｏｓｗｉｎｋｅｌら、Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｅｓ ２００１；３（３）：１８９）、全身性疾患、全身性自己免疫疾患、全身性エリテマトーデス（Ｅｒｉｋｓｏｎ Ｊ．ら、Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｒｅｓ １９９８；１７（１−２）：４９）、硬化症、全身性硬化症（Ｒｅｎａｕｄｉｎｅａｕ Ｙ．ら、Ｃｌｉｎ Ｄｉａｇｎ Ｌａｂ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９９ Ｍａｒ；６（２）：１５６）；Ｃｈａｎ ＯＴ．ら、Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｒｅｖ １９９９ Ｊｕｎ；１６９：１０７）、腺疾患、腺の自己免疫疾患、膵臓の自己免疫疾患、糖尿病、Ｉ型糖尿病（Ｚｉｍｍｅｔ Ｐ．Ｄｉａｂｅｔｅｓ Ｒｅｓ Ｃｌｉｎ Ｐｒａｃｔ １９９６ Ｏｃｔ；３４ Ｓｕｐｐｌ：Ｓ１２５）、甲状腺疾患、自己免疫性甲状腺疾患、グレーヴス病（Ｏｒｇｉａｚｚｉ Ｊ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ Ｍｅｔａｂ Ｃｌｉｎ Ｎｏｒｔｈ Ａｍ ２０００ Ｊｕｎ；２９（２）：３３９）、甲状腺炎、自発性自己免疫性甲状腺炎（Ｂｒａｌｅｙ−Ｍｕｌｌｅｎ Ｈ．およびＹｕ Ｓ、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２０００ Ｄｅｃ １５；１６５（１２）：７２６２）、橋本甲状腺炎（Ｔｏｙｏｄａ Ｎ．ら、Ｎｉｐｐｏｎ Ｒｉｎｓｈｏ １９９９ Ａｕｇ；５７（８）：１８１０）、粘液水腫、特発性粘液水腫（Ｍｉｔｓｕｍａ Ｔ．Ｎｉｐｐｏｎ Ｒｉｎｓｈｏ．１９９９ Ａｕｇ；５７（８）：１７５９）、自己免疫性生殖疾患、卵巣疾患、卵巣の自己免疫性（Ｇａｒｚａ ＫＭ．ら、Ｊ Ｒｅｐｒｏｄ Ｉｍｍｕｎｏｌ １９９８ Ｆｅｂ；３７（２）：８７）、自己免疫性抗精子不妊症（Ｄｉｅｋｍａｎ ＡＢ．ら、Ａｍ Ｊ Ｒｅｐｒｏｄ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０００ Ｍａｒ；４３（３）：１３４）、反復した胎児消失（Ｔｉｎｃａｎｉ Ａ．ら、Ｌｕｐｕｓ １９９８；７ Ｓｕｐｐｌ ２：Ｓ１０７−９）、神経変性疾患、神経学的疾患、神経学的自己免疫疾患、多発性硬化症（Ｃｒｏｓｓ ＡＨ．ら、Ｊ Ｎｅｕｒｏｉｍｍｕｎｏｌ ２００１ Ｊａｎ １；１１２（１−２）：１）、アルツハイマー病（Ｏｒｏｎ Ｌ．ら、Ｊ Ｎｅｕｒａｌ Ｔｒａｎｓｍ Ｓｕｐｐｌ．１９９７；４９：７７）、重症筋無力症（Ｉｎｆａｎｔｅ ＡＪ．およびＫｒａｉｇ Ｅ、Ｉｎｔ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ １９９９；１８（１−２）：８３）、運動神経障害（Ｋｏｒｎｂｅｒｇ ＡＪ．Ｊ Ｃｌｉｎ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２０００ Ｍａｙ；７（３）：１９１）、ギラン・バレー症候群、神経障害および自己免疫性神経障害（Ｋｕｓｕｎｏｋｉ Ｓ．、Ａｍ Ｊ Ｍｅｄ Ｓｃｉ．２０００ Ａｐｒ；３１９（４）：２３４）、筋無力症疾患、ランバード・イートン筋無力症症候群（Ｔａｋａｍｏｒｉ Ｍ．Ａｍ Ｊ Ｍｅｄ Ｓｃｉ．２０００ Ａｐｒ；３１９（４）：２０４）、腫瘍随伴性神経学的疾患、小脳萎縮症、腫瘍随伴性小脳萎縮症、腫瘍非随伴性スティッフマン症候群、小脳萎縮症、進行性小脳萎縮症、脳炎、ラスムッセン脳炎、筋萎縮性側索硬化症、シドナム舞踏病、ジル・ド・ラ・ツレット症候群、多発性内分泌腺症、自己免疫性多発性内分泌腺症（Ａｎｔｏｉｎｅ ＪＣ．およびＨｏｎｎｏｒａｔ Ｊ．Ｒｅｖ Ｎｅｕｒｏｌ（Ｐａｒｉｓ）２０００ Ｊａｎ；１５６（１）：２３）、神経障害、異常免疫性神経障害（Ｎｏｂｉｌｅ−Ｏｒａｚｉｏ Ｅ．ら、Ｅｌｅｃｔｒｏｅｎｃｅｐｈａｌｏｇｒ Ｃｌｉｎ Ｎｅｕｒｏｐｈｙｓｉｏｌ Ｓｕｐｐｌ １９９９；５０：４１９）；ニューロミオトニー、後天性ニューロミオトニー、先天性多発性関節拘縮症（Ｖｉｎｃｅｎｔ Ａ．ら、Ａｎｎ Ｎ Ｙ Ａｃａｄ Ｓｃｉ．１９９８ Ｍａｙ １３；８４１：４８２）、心臓血管疾患、心臓血管の自己免疫疾患、アテローム性動脈硬化（Ｍａｔｓｕｕｒａ Ｅ．ら、Ｌｕｐｕｓ．１９９８；７ Ｓｕｐｐｌ ２：Ｓ１３５）、心筋梗塞（Ｖａａｒａｌａ Ｏ．Ｌｕｐｕｓ．１９９８；７ Ｓｕｐｐｌ ２：Ｓ１３２）、血栓症（Ｔｉｎｃａｎｉ Ａ．ら、Ｌｕｐｕｓ １９９８；７ Ｓｕｐｐｌ ２：Ｓ１０７−９）、肉芽腫症、ヴェーゲナー肉芽腫症、動脈炎、高安動脈炎および川崎症候群（Ｐｒａｐｒｏｔｎｉｋ Ｓ．ら、Ｗｉｅｎ Ｋｌｉｎ Ｗｏｃｈｅｎｓｃｈｒ ２０００ Ａｕｇ ２５；１１２（１５−１６）：６６０）；抗第ＶＩＩＩ因子の自己免疫疾患（Ｌａｃｒｏｉｘ−Ｄｅｓｍａｚｅｓ Ｓ．ら、Ｓｅｍｉｎ Ｔｈｒｏｍｂ Ｈｅｍｏｓｔ．２０００；２６（２）：１５７）；血管炎、壊死性小血管血管炎、顕微鏡的多発血管炎、チャーグ・ストラウス症候群、糸球体腎炎、少免疫性巣状壊死性糸球体腎炎、半月体形成性糸球体腎炎（Ｎｏｅｌ ＬＨ．Ａｎｎ Ｍｅｄ Ｉｎｔｅｒｎｅ（Ｐａｒｉｓ）．２０００ Ｍａｙ；１５１（３）：１７８）；抗リン脂質症候群（Ｆｌａｍｈｏｌｚ Ｒ．ら、Ｊ Ｃｌｉｎ Ａｐｈｅｒｅｓｉｓ、１９９９；１４（４）：１７１）；心不全、心不全におけるアゴニスト様β−アドレナリン作動性受容体抗体（Ｗａｌｌｕｋａｔ Ｇ．ら、Ａｍ Ｊ Ｃａｒｄｉｏｌ、１９９９ Ｊｕｎ １７；８３（１２Ａ）：７５Ｈ）、血小板減少性紫斑病（Ｍｏｃｃｉａ Ｆ．Ａｎｎ Ｉｔａｌ Ｍｅｄ Ｉｎｔ．１９９９ Ａｐｒ−Ｊｕｎ；１４（２）：１１４）；溶血性貧血、自己免疫性溶血性貧血（Ｅｆｒｅｍｏｖ ＤＧ．ら、Ｌｅｕｋ Ｌｙｍｐｈｏｍａ １９９８ Ｊａｎ；２８（３−４）：２８５）、胃腸疾患、胃腸管の自己免疫疾患、腸疾患、慢性炎症性腸疾患（Ｇａｒｃｉａ Ｈｅｒｏｌａ Ａ．ら、Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ Ｈｅｐａｔｏｌ．２０００ Ｊａｎ；２３（１）：１６）、セリアック病（Ｌａｎｄａｕ ＹＥ．およびＳｈｏｅｎｆｅｌｄ Ｙ．Ｈａｒｅｆｕａｈ ２０００ Ｊａｎ １６；１３８（２）：１２２）、筋組織の自己免疫疾患、筋炎、自己免疫性筋炎、シェーグレン症候群（Ｆｅｉｓｔ Ｅ．ら、Ｉｎｔ Ａｒｃｈ Ａｌｌｅｒｇｙ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２０００ Ｓｅｐ；１２３（１）：９２）；平滑筋の自己免疫疾患（Ｚａｕｌｉ Ｄ．ら、Ｂｉｏｍｅｄ Ｐｈａｒｍａｃｏｔｈｅｒ １９９９ Ｊｕｎ；５３（５−６）：２３４）、肝疾患、肝臓の自己免疫疾患、自己免疫性肝炎（Ｍａｎｎｓ ＭＰ．Ｊ Ｈｅｐａｔｏｌ ２０００ Ａｕｇ；３３（２）：３２６）および原発性胆汁性肝硬変（Ｓｔｒａｓｓｂｕｒｇ ＣＰ．ら、Ｅｕｒ Ｊ Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ Ｈｅｐａｔｏｌ、１９９９ Ｊｕｎ；１１（６）：５９５）が挙げられるが、これらに限定されない。

ＩＶ型過敏症またはＴ細胞媒介過敏症としては、リウマチ様疾患、慢性関節リウマチ（Ｔｉｓｃｈ Ｒ、ＭｃＤｅｖｉｔｔ ＨＯ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １９９４ Ｊａｎ １８；９１（２）：４３７）、全身性疾患、全身性自己免疫疾患、全身性エリテマトーデス（Ｄａｔｔａ ＳＫ．、Ｌｕｐｕｓ １９９８；７（９）：５９１）、腺疾患、腺の自己免疫疾患、膵臓疾患、膵臓の自己免疫疾患、Ｉ型糖尿病（Ｃａｓｔａｎｏ Ｌ．およびＥｉｓｅｎｂａｒｔｈ ＧＳ．Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．８：６４７）、甲状腺疾患、自己免疫性甲状腺疾患、グレーヴス病（Ｓａｋａｔａ Ｓ．ら、Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ １９９３ Ｍａｒ；９２（１）：７７）、卵巣疾患（Ｇａｒｚａ ＫＭ．ら、Ｊ Ｒｅｐｒｏｄ Ｉｍｍｕｎｏｌ １９９８ Ｆｅｂ；３７（２）：８７）、前立腺炎、自己免疫性前立腺炎（Ａｌｅｘａｎｄｅｒ ＲＢ．ら、Ｕｒｏｌｏｇｙ、１９９７ Ｄｅｃ；５０（６）：８９３）、多腺性症候群、自己免疫性多腺性症候群、Ｉ型自己免疫性多腺性症候群（Ｈａｒａ Ｔ．ら、Ｂｌｏｏｄ、１９９１ Ｍａｒ １；７７（５）：１１２７）、神経学的疾患、自己免疫性神経学的疾患、多発性硬化症、神経炎、視神経炎（Ｓｏｄｅｒｓｔｒｏｍ Ｍ．ら、Ｊ Ｎｅｕｒｏｌ Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ、１９９４ Ｍａｙ；５７（５）：５４４）、重症筋無力症（Ｏｓｈｉｍａ Ｍ．ら、Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １９９０ Ｄｅｃ；２０（１２）：２５６３）、スティッフマン症候群（Ｈｉｅｍｓｔｒａ ＨＳ．ら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ２００１ Ｍａｒ ２７；９８（７）：３９８８）、心臓血管疾患、シャガス病における心臓の自己免疫性（Ｃｕｎｈａ−Ｎｅｔｏ Ｅ．ら、Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ １９９６ Ｏｃｔ １５；９８（８）：１７０９）、自己免疫性血小板減少性紫斑病（Ｓｅｍｐｌｅ ＪＷ．ら、Ｂｌｏｏｄ １９９６ Ｍａｙ １５；８７（１０）：４２４５）、抗ヘルパーＴリンパ球自己免疫性（Ｃａｐｏｒｏｓｓｉ ＡＰ．ら、Ｖｉｒａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ １９９８；１１（１）：９）、溶血性貧血（Ｓａｌｌａｈ Ｓ．ら、Ａｎｎ Ｈｅｍａｔｏｌ、１９９７ Ｍａｒ；７４（３）：１３９）、肝疾患、肝臓の自己免疫疾患、肝炎、慢性活動性肝炎（Ｆｒａｎｃｏ Ａ．ら、Ｃｌｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌ １９９０ Ｍａｒ；５４（３）：３８２）、胆汁性肝硬変、原発性胆汁性肝硬変（Ｊｏｎｅｓ ＤＥ．、Ｃｌｉｎ Ｓｃｉ（Ｃｏｌｃｈ）１９９６ Ｎｏｖ；９１（５）：５５１）、腎疾患、腎臓の自己免疫疾患、腎炎、間質性腎炎（Ｋｅｌｌｙ ＣＪ．Ｊ Ａｍ Ｓｏｃ Ｎｅｐｈｒｏｌ １９９０ Ａｕｇ；１（２）：１４０）、結合組織疾患、耳疾患、自己免疫性結合組織疾患、自己免疫性耳疾患（Ｙｏｏ ＴＪ．ら、Ｃｅｌｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ １９９４ Ａｕｇ；１５７（１）：２４９）、内耳の疾患（Ｇｌｏｄｄｅｋ Ｂ．ら、Ａｎｎ Ｎ Ｙ Ａｃａｄ Ｓｃｉ １９９７ Ｄｅｃ ２９；８３０：２６６）、皮膚疾患、皮膚病、真皮の疾患、水疱性皮膚疾患、尋常性天疱瘡、水疱性類天疱瘡および落葉状天疱瘡が挙げられるが、これらに限定されない。

遅発型過敏症の例としては、接触性皮膚炎および薬疹が挙げられるが、これらに限定されない。

Ｔリンパ球媒介過敏症型の例としては、ヘルパーＴリンパ球および細胞障害性Ｔリンパ球が挙げられるが、これらに限定されない。

ヘルパーＴリンパ球媒介過敏症の例としては、Ｔ_ｈ１リンパ球媒介過敏症およびＴ_ｈ２リンパ球媒介過敏症が挙げられるが、これらに限定されない。

自己免疫疾患
自己免疫疾患としては、心臓血管疾患、リウマチ様疾患、腺疾患、胃腸疾患、皮膚疾患、肝疾患、神経学的疾患、筋疾患、腎疾患、生殖関連疾患、結合組織疾患および全身性疾患が挙げられるが、これらに限定されない。

自己免疫性による心臓血管疾患の例としては、アテローム性動脈硬化（Ｍａｔｓｕｕｒａ Ｅ．ら、Ｌｕｐｕｓ．１９９８；７ Ｓｕｐｐｌ ２：Ｓ１３５）、心筋梗塞（Ｖａａｒａｌａ Ｏ．Ｌｕｐｕｓ．１９９８；７ Ｓｕｐｐｌ ２：Ｓ１３２）、血栓症（Ｔｉｎｃａｎｉ Ａ．ら、Ｌｕｐｕｓ １９９８；７ Ｓｕｐｐｌ ２：Ｓ１０７〜９）、ヴェーゲナー肉芽腫症、高安動脈炎および川崎症候群（Ｐｒａｐｒｏｔｎｉｋ Ｓ．ら、Ｗｉｅｎ Ｋｌｉｎ Ｗｏｃｈｅｎｓｃｈｒ ２０００ Ａｕｇ ２５；１１２（１５−１６）：６６０）、抗第ＶＩＩＩ因子による自己免疫疾患（Ｌａｃｒｏｉｘ−Ｄｅｓｍａｚｅｓ Ｓ．ら、Ｓｅｍｉｎ Ｔｈｒｏｍｂ Ｈｅｍｏｓｔ．２０００；２６（２）：１５７）、壊死性小血管血管炎、顕微鏡的多発血管炎、チャーグ・ストラウス症候群、少免疫性巣状壊死性糸球体腎炎および半月体形成性糸球体腎炎（Ｎｏｅｌ ＬＨ．Ａｎｎ Ｍｅｄ Ｉｎｔｅｒｎｅ（Ｐａｒｉｓ）．２０００ Ｍａｙ；１５１（３）：１７８）、抗リン脂質症候群（Ｆｌａｍｈｏｌｚ Ｒ．ら、Ｊ Ｃｌｉｎ Ａｐｈｅｒｅｓｉｓ １９９９；１４（４）：１７１）、抗体誘導の心不全（Ｗａｌｌｕｋａｔ Ｇ．ら、Ａｍ Ｊ Ｃａｒｄｉｏｌ．１９９９ Ｊｕｎ １７；８３（１２Ａ）：７５Ｈ）、血小板減少性紫斑病（Ｍｏｃｃｉａ Ｆ．Ａｎｎ Ｉｔａｌ Ｍｅｄ Ｉｎｔ．１９９９ Ａｐｒ−Ｊｕｎ；１４（２）：１１４；Ｓｅｍｐｌｅ ＪＷ．ら、Ｂｌｏｏｄ １９９６ Ｍａｙ １５；８７（１０）：４２４５）、自己免疫性溶血性貧血（Ｅｆｒｅｍｏｖ ＤＧ．ら、Ｌｅｕｋ Ｌｙｍｐｈｏｍａ １９９８ Ｊａｎ；２８（３−４）：２８５；Ｓａｌｌａｈ Ｓ．ら、Ａｎｎ Ｈｅｍａｔｏｌ １９９７ Ｍａｒ；７４（３）：１３９）、シャガス病における心臓の自己免疫性（Ｃｕｎｈａ−Ｎｅｔｏ Ｅ．ら、Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ １９９６ Ｏｃｔ １５；９８（８）：１７０９）、および、抗ヘルパーＴリンパ球による自己免疫性（Ｃａｐｏｒｏｓｓｉ ＡＰ．ら、Ｖｉｒａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ、１９９８；１１（１）：９）が挙げられるが、これらに限定されない。

自己免疫によるリウマチ様疾患の例としては、慢性関節リウマチ（Ｋｒｅｎｎ Ｖ．ら、Ｈｉｓｔｏｌ Ｈｉｓｔｏｐａｔｈｏｌ ２０００ Ｊｕｌ；１５（３）：７９１；Ｔｉｓｃｈ Ｒ、ＭｃＤｅｖｉｔｔ ＨＯ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ｕｎｉｔｓ Ｓ Ａ １９９４ Ｊａｎ １８；９１（２）：４３７）および強直性脊椎炎（Ｊａｎ Ｖｏｓｗｉｎｋｅｌら、Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｅｓ ２００１；３（３）：１８９）が挙げられるが、これらに限定されない。

自己免疫による腺疾患の例としては、膵臓疾患、Ｉ型糖尿病、甲状腺疾患、グレーヴス病、甲状腺炎、突発性自己免疫性甲状腺炎、橋本甲状腺炎、特発性粘液水腫、卵巣の自己免疫性、自己免疫性抗精子不妊症、自己免疫性前立腺炎およびＩ型自己免疫性多腺性症候群が挙げられるが、これらに限定されない。疾患としては、膵臓の自己免疫疾患、Ｉ型糖尿病（Ｃａｓｔａｎｏ Ｌ．およびＥｉｓｅｎｂａｒｔｈ ＧＳ．Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．８：６４７；Ｚｉｍｍｅｔ Ｐ．Ｄｉａｂｅｔｅｓ Ｒｅｓ Ｃｌｉｎ Ｐｒａｃｔ １９９６ Ｏｃｔ；３４ Ｓｕｐｐｌ：Ｓ１２５）、自己免疫性甲状腺疾患、グレーヴス病（Ｏｒｇｉａｚｚｉ Ｊ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ Ｍｅｔａｂ Ｃｌｉｎ Ｎｏｒｔｈ Ａｍ ２０００ Ｊｕｎ；２９（２）：３３９；Ｓａｋａｔａ Ｓ．ら、Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ １９９３ Ｍａｒ；９２（１）：７７）、突発性自己免疫性甲状腺炎（Ｂｒａｌｅｙ−Ｍｕｌｌｅｎ Ｈ．およびＹｕ Ｓ、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２０００ Ｄｅｃ １５；１６５（１２）：７２６２）、橋本甲状腺炎（Ｔｏｙｏｄａ Ｎ．ら、Ｎｉｐｐｏｎ Ｒｉｎｓｈｏ １９９９ Ａｕｇ；５７（８）：１８１０）、特発性粘液水腫（Ｍｉｔｓｕｍａ Ｔ．Ｎｉｐｐｏｎ Ｒｉｎｓｈｏ．１９９９ Ａｕｇ；５７（８）：１７５９）、卵巣の自己免疫性（Ｇａｒｚａ ＫＭ．ら、Ｊ Ｒｅｐｒｏｄ Ｉｍｍｕｎｏｌ １９９８ Ｆｅｂ；３７（２）：８７）、自己免疫性抗精子不妊症（Ｄｉｅｋｍａｎ ＡＢ．ら、Ａｍ Ｊ Ｒｅｐｒｏｄ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０００ Ｍａｒ；４３（３）：１３４）、自己免疫性前立腺炎（Ａｌｅｘａｎｄｅｒ ＲＢ．ら、Ｕｒｏｌｏｇｙ １９９７ Ｄｅｃ；５０（６）：８９３）およびＩ型自己免疫性多腺性症候群（Ｈａｒａ Ｔ．ら、Ｂｌｏｏｄ．１９９１ Ｍａｒ １；７７（５）：１１２７）が挙げられるが、これらに限定されない。

自己免疫による胃腸疾患の例には、慢性炎症性腸疾患（Ｇａｒｃｉａ Ｈｅｒｏｌａ Ａ．ら、Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ Ｈｅｐａｔｏｌ．２０００ Ｊａｎ；２３（１）：１６）、セリアック病（Ｌａｎｄａｕ ＹＥ．およびＳｈｏｅｎｆｅｌｄ Ｙ．Ｈａｒｅｆｕａｈ ２０００ Ｊａｎ １６；１３８（２）：１２２）、大腸炎、回腸炎およびクローン病が挙げられるが、これらに限定されない。

自己免疫による皮膚疾患の例としては、自己免疫による水疱性の皮膚疾患（例えば、尋常性天疱瘡、水疱性天疱瘡および落葉状天疱瘡など、これらに限定されない）が挙げられるが、これらに限定されない。

自己免疫による肝疾患の例としては、肝炎、自己免疫性慢性活動性肝炎（Ｆｒａｎｃｏ Ａ．ら、Ｃｌｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌ １９９０ Ｍａｒ；５４（３）：３８２）、原発性胆汁性肝硬変（Ｊｏｎｅｓ ＤＥ．Ｃｌｉｎ Ｓｃｉ（Ｃｏｌｃｈ） １９９６ Ｎｏｖ；９１（５）：５５１；Ｓｔｒａｓｓｂｕｒｇ ＣＰ．ら、Ｅｕｒ Ｊ Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ Ｈｅｐａｔｏｌ．１９９９ Ｊｕｎ；１１（６）：５９５）および自己免疫性肝炎（Ｍａｎｎｓ ＭＰ．Ｊ Ｈｅｐａｔｏｌ ２０００ Ａｕｇ；３３（２）：３２６）が挙げられるが、これらに限定されない。

自己免疫による神経学的疾患の例としては、多発性硬化症（Ｃｒｏｓｓ ＡＨ．ら、Ｊ Ｎｅｕｒｏｉｍｍｕｎｏｌ ２００１ Ｊａｎ １；１１２（１−２）：１）、アルツハイマー病（Ｏｒｏｎ Ｌ．ら、Ｊ Ｎｅｕｒａｌ Ｔｒａｎｓｍ Ｓｕｐｐｌ．１９９７；４９：７７）、重症筋無力症（Ｉｎｆａｎｔｅ ＡＪ．およびＫｒａｉｇ Ｅ、Ｉｎｔ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ １９９９；１８（１−２）：８３；Ｏｓｈｉｍａ Ｍ．ら、Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １９９０ Ｄｅｃ；２０（１２）：２５６３）、神経障害、運動神経障害（Ｋｏｒｎｂｅｒｇ ＡＪ．Ｊ Ｃｌｉｎ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２０００ Ｍａｙ；７（３）：１９１）；ギラン・バレー症候群および自己免疫性神経障害（Ｋｕｓｕｎｏｋｉ Ｓ．Ａｍ Ｊ Ｍｅｄ Ｓｃｉ．２０００ Ａｐｒ；３１９（４）：２３４）、筋無力症、ランバード・イートン筋無力症症候群（Ｔａｋａｍｏｒｉ Ｍ．Ａｍ Ｊ Ｍｅｄ Ｓｃｉ．２０００ Ａｐｒ；３１９（４）：２０４）；腫瘍随伴性神経学的疾患、小脳萎縮症、腫瘍随伴性の小脳萎縮症およびスティッフマン症候群（Ｈｉｅｍｓｔｒａ ＨＳ．ら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ｕｎｉｔｓ Ｓ Ａ ２００１ Ｍａｒ ２７；９８（７）：３９８８）；腫瘍非随伴性スティッフマン症候群、進行性小脳萎縮症、脳炎、ラスムッセン脳炎、筋萎縮性側索硬化症、シドナム舞踏病、ジル・ド・ラ・ツレット症候群および自己免疫性多発性内分泌腺症（Ａｎｔｏｉｎｅ ＪＣ．およびＨｏｎｎｏｒａｔ Ｊ．Ｒｅｖ Ｎｅｕｒｏｌ（Ｐａｒｉｓ）２０００ Ｊａｎ；１５６（１）：２３）；異常免疫による神経障害（Ｎｏｂｉｌｅ−Ｏｒａｚｉｏ Ｅ．ら、Ｅｌｅｃｔｒｏｅｎｃｅｐｈａｌｏｇｒ Ｃｌｉｎ Ｎｅｕｒｏｐｈｙｓｉｏｌ Ｓｕｐｐｌ １９９９；５０：４１９）；後天性ニューロミオトニー、先天性多発性関節拘縮症（Ｖｉｎｃｅｎｔ Ａ．ら、Ａｎｎ Ｎ Ｙ Ａｃａｄ Ｓｃｉ．１９９８ Ｍａｙ １３；８４１：４８２）、神経炎、視神経炎（Ｓｏｄｅｒｓｔｒｏｍ Ｍ．ら、Ｊ Ｎｅｕｒｏｌ Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ １９９４ Ｍａｙ；５７（５）：５４４）および神経変性疾患が挙げられるが、これらに限定されない。

自己免疫による筋疾患の例としては、筋炎、自己免疫性筋炎および原発性シェーグレン症候群（Ｆｅｉｓｔ Ｅ．ら、Ｉｎｔ Ａｒｃｈ Ａｌｌｅｒｇｙ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２０００ Ｓｅｐ；１２３（１）：９２）、および、平滑筋の自己免疫疾患（Ｚａｕｌｉ Ｄ．ら、Ｂｉｏｍｅｄ Ｐｈａｒｍａｃｏｔｈｅｒ １９９９ Ｊｕｎ；５３（５−６）：２３４）が挙げられるが、これらに限定されない。

自己免疫による腎疾患の例としては、腎炎、および、自己免疫性間質性腎炎（Ｋｅｌｌｙ ＣＪ．Ｊ Ａｍ Ｓｏｃ Ｎｅｐｈｒｏｌ １９９０ Ａｕｇ；１（２）：１４０）が挙げられるが、これらに限定されない。

生殖に関連する自己免疫疾患の例としては、反復した胎児消失（Ｔｉｎｃａｎｉ Ａ．ら、Ｌｕｐｕｓ １９９８；７ Ｓｕｐｐｌ ２：Ｓ１０７〜９）が挙げられるが、これに限定されない。

自己免疫による結合組織疾患の例としては、耳の疾患、自己免疫による耳の疾患（Ｙｏｏ ＴＪ．ら、Ｃｅｌｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ １９９４ Ａｕｇ；１５７（１）：２４９）、および、内耳の自己免疫疾患（Ｇｌｏｄｄｅｋ Ｂ．ら、Ａｎｎ Ｎ Ｙ Ａｃａｄ Ｓｃｉ １９９７ Ｄｅｃ ２９；８３０：２６６）が挙げられるが、これらに限定されない。

自己免疫全身性疾患の例としては、全身性エリテマトーデス（Ｅｒｉｋｓｏｎ Ｊ．ら、Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｒｅｓ １９９８；１７（１−２）：４９）および全身性硬化症（Ｒｅｎａｕｄｉｎｅａｕ Ｙ．ら、Ｃｌｉｎ Ｄｉａｇｎ Ｌａｂ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９９ Ｍａｒ；６（２）：１５６；Ｃｈａｎ ＯＴ．ら、Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｒｅｖ １９９９ Ｊｕｎ；１６９：１０７）が挙げられるが、これらに限定されない。

感染性疾患
感染性疾患の例としては、慢性の感染性疾患、亜急性の感染性疾患、急性の感染性疾患、ウイルス疾患、細菌疾患、原虫疾患、寄生虫疾患、真菌疾患、マイコプラズマ疾患およびプリオン疾患が挙げられるが、これらに限定されない。

移植片拒絶疾患
移植片の移植に関連する疾患の例としては、移植片拒絶、慢性の移植片拒絶、亜急性の移植片拒絶、超急性の移植片拒絶、急性の移植片拒絶および移植片対宿主病が挙げられるが、これらに限定されない。

アレルギー性疾患
アレルギー性疾患の例としては、喘息、皮疹、じんま疹、花粉アレルギー、ほこり・ダニアレルギー、毒液アレルギー、化粧品アレルギー、ラテックスアレルギー、化学物質アレルギー、薬物アレルギー、昆虫咬傷アレルギー、動物鱗屑アレルギー、刺毛植物アレルギー、ツタウルシアレルギーおよび食物アレルギーが挙げられるが、これらに限定されない。

特定の実施形態によれば、疾患はガンである。

癌性疾患
癌の例としては、癌腫、リンパ腫、芽細胞腫、肉腫および白血病が挙げられるが、これらに限定されない。癌性疾患の具体的な例としては、骨髄性白血病、例えば、慢性骨髄性白血病、成熟に伴う急性骨髄性白血病、急性前骨髄球性白血病、増大した好塩基球を伴う急性非リンパ球性白血病、急性単球性白血球、好酸球増加症を伴う急性骨髄単球性白血病など；悪性リンパ腫、例えば、バーキットリンパ腫、非ホジキンリンパ腫など；リンパ性白血病、例えば、急性リンパ芽球性白血病、慢性リンパ性白血病など；骨髄増殖性疾患、例えば、固形腫瘍、良性髄膜腫、唾液腺の混合腫瘍、慢性腺腫など；腺癌、例えば、小細胞肺癌、腎臓癌、子宮癌、前立腺癌、膀胱癌、卵巣癌、結腸癌、肉腫、脂肪肉腫、粘液様肉腫、滑膜肉腫、横紋筋肉腫（肺胞）、骨外性粘液様軟骨肉腫、ユーイング肉腫などが挙げられ、他の癌には、精巣および卵巣の未分化胚細胞腫、網膜芽細胞腫、ウィルムス腫瘍、神経芽細胞腫、悪性メラノーマ、中皮腫、乳癌、皮膚癌、膵癌、子宮頸癌、前立腺癌および卵巣癌が挙げられるが、これらに限定されない。

したがって、本発明の教示は疾患検出において使用することができる。下記は、早期のガン検出に関する限定されない実施形態である。

本発明の教示は、ガンの早期検出および病期分類のための非侵襲的な診断ツールとしての免疫系に基づく取り組みを規定する。従来の診断法は主として、悪性組織の病理ならびにガン特異的な抗原および遺伝子に集中している。対照的に、本発明の教示は、ガン（同様にまた、他の疾患）の早期検出および病期分類のための生来的に利用可能なツールとして、免疫系の正常な応答対異常な応答に集中する。したがって、本発明の教示は、種々の濃度での広範囲の刺激因子／阻害因子（代謝産物、栄養物、分裂促進因子、天然ペプチドおよび合成ペプチド、サイトカイン、ホルモン、ビタミン、薬物、抗体、神経伝達物質、ガン特異的抗原、ならびに、疾患に伴う様々な組織特異的な正常な抗原（ＴＮＡ））に対する応答における免疫系のＰＢＬの代謝活性刺激プロフィル（ＭＡＳＰ）を測定することによって、処理能力が大きい機能的な生理学的血液試験を規定する。免疫学的応答の従来的見方によって、比較的小さい影響がＰＢＬのエフェクタ亜集団の「クローン拡大」下でさえ予想される。しかしながら、「システム生物学」の観点から、微弱なサブグループ応答がネットワーク刺激の全体にわたって増幅される場合がある。免疫系は、様々なＴＮＡの異常な高レベルの検出におけるその常備機能によってガンと闘うことが示唆される。ＰＢＬの代謝活性はまた、ガン発達の進行した段階を診断するために使用される場合がある。局所的腫瘍の段階では、免疫系の効果的な殺傷応答が既に制限されており、このため、特異的な腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）が認められても、腫瘍組織を破壊することができない。それにもかかわらず、この段階において、そのような循環Ｔリンパ球が依然として、個々の循環しているガン細胞の破壊に関与している場合がある。局所的腫瘍から転移期への変化は免疫系の完全な特異的失敗を示しており、この移行がＭＡ刺激プロフィルにおける特徴的な変化によって測定され得る。

本発明の教示に従って行われる疾患診断の後には、スクリーニング結果を、ゴールドスタンダード方法を使用して具体化することが続く。診断が本発明の教示に依拠して確立されるか、または、ゴールドスタンダード方法を使用して具体化されると、対象は、診断結果が知らされ、必要に応じて処置される。

本発明の教示は、疾患処置を個々に最適化すること、対象における疾患処置をモニタすること、対象のための処置を決定すること、および、異常な代謝活性に伴う疾患を処置することができる作用因を特定することに関連する様々な応用を有することが理解されるであろう。

したがって、本発明の一局面によれば、その必要性のある対象における疾患処置の方法であって、
（ａ）対象における疾患の存在を上記方法に従って診断すること；および
（ｂ）対象をその診断に基づいて処置すること
を含む方法が提供される。

本明細書で使用される場合、用語「治療する／処置する」には、状態の進行を取り消すこと、実質的に阻害すること、遅くすること、または、逆向きにすること、状態の臨床的症状または審美的症状を実質的に改善すること、あるいは、状態の臨床的症状または審美的症状の出現を実質的に防止することが含まれる。

本発明の別の局面によれば、疾患処置を個々に最適化する方法であって、
（ａ）細胞を含む対象の生物学的サンプルを少なくとも１つの医薬品と接触させること；
（ｂ）当該細胞の細胞外環境において、
（ｉ）不揮発性の可溶性代謝生成物；
（ｉｉ）不揮発性の可溶性代謝生成物および揮発性の可溶性代謝生成物；ならびに
（ｉｉｉ）揮発性の可溶性代謝生成物
の分泌に起因する時間依存的な酸性化プロフィルを独立して測定すること
を含み、ただし、これらの時間依存的な酸性化プロフィルの少なくとも１つにより、当該細胞の代謝活性が示され、これに対して、同一条件下で調べられた正常な健常な細胞サンプルの代謝活性に向かう、当該細胞の代謝活性における変化により、当該疾患のための有効な医薬品が示される方法が提供される。

本明細書中で使用される場合、「処置を個々に最適化する」は、処置療法（例えば、医薬品のタイプ、用量）を調整するというエクスビボ方法を示す。

本明細書中で使用される場合、「医薬品」は、本明細書中では交換可能に使用されるように、薬剤、薬効薬物または薬物療法薬の配合物を示す。医薬品の例には、化学療法剤、抗生物質、抗寄生虫薬物および抗ウイルス剤などが含まれるが、これらに限定されない。

本明細書中で使用される場合、用語「接触させる」は、医薬品を、医薬品が細胞膜と接触し、そして、必要ならば、そこに内在化するような条件下で、細胞の近傍にもたらすことを示す。したがって、例えば、接触が、医薬品が細胞の表現型に影響を与えること（例えば、細胞傷害性効果または細胞増殖抑制効果）を可能にするために十分な温度および時間で、緩衝条件下で行われるべきである。接触が、インビトロ、エクスビボまたはインビボで行われる場合がある。接触が、酵素反応の生成物を検出することもまた可能である容器（すなわち、電気化学的セル）において行われる場合があり、その結果、電気シグナルがオンラインで検出される。そのような容器が本明細書中下記でさらに記載される。あるいは、接触が、別個の容器において行われる場合があり、この場合には、サンプルを特定の時点で連続して抜き出し、また、そのようなサンプルを電気化学セル内に入れることが可能であるように、その容器において検出が行われる。したがって、接触が、試験管、フラスコ、組織培養、チップ、アレー、プレート、マイクロプレートまたはキャピラリなどで行われる場合がある。セルは、基質添加後、セルの内容物の連続する徹底的な混合のために振動板に置かれる場合がある。

具体的な実施形態によれば、「同一条件下で調べられた正常な健常な細胞サンプルの代謝活性に向かう、当該細胞の代謝活性における変化」は、好ましくは、対照の正常な健常な細胞サンプルと１００％同一であることに向かう少なくとも１０％の局所的または全体的（プロフィル全般）な変化を示す。

当業者によって決定される所定の閾値を超える変化により、有効な処置が示される。

同様に、疾患処置を対象においてモニタする方法であって、
（ａ）当該疾患に対する少なくとも１つ医薬品を当該対象に投与すること；
（ｂ）投与後の当該対象の細胞を含む生物学的サンプルを回収すること；
（ｃ）当該細胞の細胞外環境において、
（ｉ）不揮発性の可溶性代謝生成物；
（ｉｉ）不揮発性の可溶性代謝生成物および揮発性の可溶性代謝生成物；ならびに
（ｉｉｉ）揮発性の可溶性代謝生成物
の分泌に起因する時間依存的な酸性化プロフィルを独立して測定すること
を含み、ただし、これらの時間依存的な酸性化プロフィルの少なくとも１つにより、当該細胞の代謝活性が示され、これに対して、同一条件下で調べられた正常な健常な細胞サンプルの代謝活性に向かう、当該細胞の代謝活性における変化により、当該疾患の有効な処置が示される方法が提供される。例えば、転移期では、ＭＡプロフィルが逆戻りして、正常なプロフィルに近づく場合があることが示唆される。

同様に、細胞の代謝活性を変化させることができる作用因を特定する方法であって、
（ａ）細胞を作用因に供すること；
（ｂ）（ａ）の後、および、必要な場合には（ａ）の前における当該細胞の代謝活性を請求項１の方法に従って測定すること
を含み、ただし、酸性化プロフィルにおける変化により、細胞の代謝活性を変化させることができる作用因が示される方法が提供される。

本明細書中で使用される用語「薬剤」は、生物学的薬剤または化学的薬剤を含む試験組成物を示す。

可能性のある代謝活性の調節剤として本発明の方法に従って試験することができる生物学的薬剤の例には、核酸、例えば、ポリヌクレオチド、リボザイム、ｓｉＲＮＡおよびアンチセンス分子（これらには、ＲＮＡ、ＤＮＡ、ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッド、ペプチド核酸、ならびに、変化した骨格構造および／もしくは塩基構造または他の化学的修飾を有するポリヌクレオチドアナログが含まれるが、これらに限定されない）；タンパク質、ポリペプチド（例えば、ペプチド）、炭水化物、脂質および「小分子」薬物候補物が含まれるが、これらに限定されない。「小分子」として、例えば、約１００００ダルトン未満の分子量（好ましくは約５０００ダルトン未満の分子量、最も好ましくは約１５００ダルトン未満の分子量）を有する天然に存在する化合物（例えば、植物抽出物、微生物培養液およびその他に由来する化合物）または合成された有機化合物もしくは有機金属化合物を挙げることができる。

本発明のこの態様の好ましい実施形態によれば、作用因は抗ガン剤、抗ウイルス剤または抗生物質剤である。

可能性のある抗ガン剤として本発明の方法に従って試験することができる条件の例には、放射線暴露（例えば、ガンマ線、ＵＶ線、Ｘ線など）が含まれるが、これらに限定されない。

本明細書中で使用される場合、変化はまた、同じプロフィルにおけるＭＡの異なるレベル（例えば、より大きいレベル）、基礎状態における変化、および／または、最大のＭＡ影響を誘導する作用因濃度における変化であり得ることが理解されるであろう。

細胞の代謝活性を変化させることができる作用因が上記教示に従って特定されると、本発明はさらに、その作用因を合成すること、または、その作用因を天然の供給源から単離することを含む。

本明細書中で使用される用語「約」は、±１０％を示す。

用語「含む／備える（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ、ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ、ｉｎｃｌｕｄｅｓ、ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」、およびそれらの同根語は、「含むが、それらに限定されない（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ ｂｕｔ ｎｏｔ ｌｉｍｉｔｅｄ ｔｏ）」ことを意味する。

用語「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」は、「含み、それらに限定される（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ ａｎｄ ｌｉｍｉｔｅｄ ｔｏ）」ことを意味する。

表現「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」は、さらなる成分、工程および／または部分が、主張される組成物、方法または構造の基本的かつ新規な特徴を実質的に変化させない場合にだけ、組成物、方法または構造がさらなる成分、工程および／または部分を含み得ることを意味する。

本明細書中で使用される場合、単数形態（「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」）は、文脈がそうでないことを明確に示さない限り、複数の参照物を包含する。例えば、用語「化合物（ａ ｃｏｍｐｏｕｎｄ）」または用語「少なくとも１つの化合物」は、その混合物を含めて、複数の化合物を包含し得る。

本開示を通して、本発明の様々な態様が範囲形式で提示され得る。範囲形式での記載は単に便宜上および簡潔化のためであり、本発明の範囲に対する柔軟性のない限定として解釈すべきでないことを理解しなければならない。従って、範囲の記載は、具体的に開示された可能なすべての部分範囲、ならびに、その範囲に含まれる個々の数値を有すると見なさなければならない。例えば、１〜６などの範囲の記載は、具体的に開示された部分範囲（例えば、１〜３、１〜４、１〜５、２〜４、２〜６、３〜６など）、ならびに、その範囲に含まれる個々の数値（例えば、１、２、３、４、５および６）を有すると見なさなければならない。このことは、範囲の広さにかかわらず、適用される。

数値範囲が本明細書中で示される場合には常に、示された範囲に含まれる任意の言及された数字（分数または整数）を含むことが意味される。第１の示された数字および第２の示された数字「の範囲である／の間の範囲」という表現、および、第１の示された数字「から」第２の示された数「まで及ぶ／までの範囲」という表現は、交換可能に使用され、第１の示された数字と、第２の示された数字と、その間のすべての分数および整数とを含むことが意味される。

本明細書中で使用される用語「方法（ｍｅｔｈｏｄ）」は、所与の課題を達成するための様式、手段、技術および手順を示し、これには、化学、薬理学、生物学、生化学および医学の技術分野の実施者に知られているそのような様式、手段、技術および手順、または、知られている様式、手段、技術および手順から、化学、薬理学、生物学、生化学および医学の技術分野の実施者によって容易に開発されるそのような様式、手段、技術および手順が含まれるが、それらに限定されない。

明確にするため別個の実施形態の文脈で説明されている本発明の特定の特徴が、単一の実施形態に組み合わせて提供されることもできることは分かるであろう。逆に、簡潔にするため単一の実施形態で説明されている本発明の各種の特徴は別個にまたは適切なサブコンビネーションで、あるいは本発明の他の記載される実施形態において好適なように提供することもできる。種々の実施形態の文脈において記載される特定の特徴は、その実施形態がそれらの要素なしに動作不能である場合を除いては、それらの実施形態の不可欠な特徴であると見なされるべきではない。

本明細書中上記に描かれるような、および、下記の請求項の節において特許請求されるような本発明の様々な実施形態および態様のそれぞれは、実験的裏付けが下記の実施例において見出される。

次に下記の実施例が参照されるが、下記の実施例は、上記の説明と一緒に、本発明のいくつかの実施形態を非限定様式で例示する。

本願で使用される用語と、本発明で利用される実験方法には、分子生化学、微生物学および組み換えＤＮＡの技法が広く含まれている。これらの技術は文献に詳細に説明されている。例えば以下の諸文献を参照されたい：「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」Ｓａｍｂｒｏｏｋら、（１９８９）；「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」Ｉ〜ＩＩＩ巻、Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｒ．Ｍ．編（１９９４）；Ａｕｓｕｂｅｌら、「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ、米国メリーランド州バルチモア（１９８９）；Ｐｅｒｂａｌ「Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ」、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ、米国ニューヨーク（１９８８）；Ｗａｔｓｏｎら、「Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＤＮＡ」Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｂｏｏｋｓ、米国ニューヨーク；Ｂｉｒｒｅｎら編「Ｇｅｎｏｍｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ Ｓｅｒｉｅｓ」１〜４巻、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、米国ニューヨーク（１９９８）；米国特許の第４６６６８２８号、同第４６８３２０２号、同第４８０１５３１号、同第５１９２６５９号および同第５２７２０５７号に記載される方法；「Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｈａｎｄｂｏｏｋ」Ｉ〜ＩＩＩ巻、Ｃｅｌｌｉｓ，Ｊ．Ｅ．編（１９９４）；「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」Ｉ〜ＩＩＩ巻、Ｃｏｌｉｇａｎ，Ｊ．Ｅ．編（１９９４）；Ｓｔｉｔｅｓら編「Ｂａｓｉｃ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」（第８版）、Ａｐｐｌｅｔｏｎ ＆ Ｌａｎｇｅ、米国コネティカット州ノーウォーク（１９９４）；ＭｉｓｈｅｌｌとＳｈｉｉｇｉ編「Ｓｅｌｅｃｔｅｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」、Ｗ．Ｈ． Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏ．、米国ニューヨーク（１９８０）；利用可能な免疫アッセイ法は、特許と科学文献に広範囲にわたって記載されており、例えば：米国特許の第３７９１９３２号、同第３８３９１５３号、同第３８５０７５２号、同第３８５０５７８号、同第３８５３９８７号、同第３８６７５１７号、同第３８７９２６２号、同第３９０１６５４号、同第３９３５０７４号、同第３９８４５３３号、同第３９９６３４５号、同第４０３４０７４号、同第４０９８８７６号、同第４８７９２１９号、同第５０１１７７１号および同第５２８１５２１号；「Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」Ｇａｉｔ，Ｍ．Ｊ．編（１９８４）；「Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ」Ｈａｍｅｓ，Ｂ．Ｄ．およびＨｉｇｇｉｎｓ Ｓ．Ｊ．編（１９８５）；「Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｎｄ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ」Ｈａｍｅｓ，Ｂ．Ｄ．およびＨｉｇｇｉｎｓ Ｓ．Ｊ．編（１９８４）；「Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ」Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，Ｒ．Ｉ．編（１９８６）；「Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ Ｃｅｌｌｓ ａｎｄ Ｅｎｚｙｍｅｓ」ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ（１９８６）；「Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ」Ｐｅｒｂａｌ，Ｂ．（１９８４）および「Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ」１〜３１７巻、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ；「ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ Ｇｕｉｄｅ Ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、米国カリフォルニア州サンディエゴ（１９９０）；Ｍａｒｓｈａｋら、「Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｆｏｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ−Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｃｏｕｒｓｅ Ｍａｎｕａｌ」ＣＳＨＬ Ｐｒｅｓｓ（１９９６）；これらの文献の全ては、あたかも本願に完全に記載されているように援用するものである。その他の一般的な文献は、本明細書を通じて提供される。それらの文献に記載の方法は当業技術界で周知であると考えられ、読者の便宜のために提供される。それらの文献に含まれるすべての情報は本願に援用するものである。

実施例１
実験手順
Ａ．血液ドナー要件および医療従事者による採血
血液サンプルをＥＤＴＡ含有Ｖａｃｕｔｕｂｅ（９ｍｌ）（Ｇｒｅｉｎｅｒ Ｂｉｏ−Ｏｎｅ、４５５０３６）において集めた。研究は、Ｓｈｅｂａ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｅｎｔｅｒ（Ｒａｍａｔ Ｇａｎ、イスラエル）およびイスラエル保健省の治験審査委員会によって承認された（ヘルシンキ承認番号７７８０−１０−ＳＭＣ）。

Ｂ．ドナーの人口統計学情報および臨床情報の収集
秘密性保護のために、すべての集められた血液サンプルはラベルが貼られ、直ちにコード化されて、データベース記録および診断分析において使用された。

ＭＡ試験の結果が、年齢が２２歳〜８１歳である４２名の健常者ドナーおよび２５名のガン患者（表２）から集められた。健常者ドナーは、高血圧、高コレステロールレベル、軽いインフルエンザおよび炎症の処置をされた事例者を含む混合集団である。

Ｃ．血液サンプルの輸送
血液細胞の生存能を温度自動調節条件で保つための対策が取られる（熱電冷却（１０℃〜１８℃に）およびＰＢＭＣ分離までの穏やかな振とう）。

Ｄ_１．末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）の分離
新鮮な末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）をＦｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ（ＵＮＩ−ＳＥＰ、Ｎｏｖａｍｅｄ）およびグラジエント遠心分離によって単離した。ペレットを、５×１０^６細胞／ｍｌの最終濃度で、蛍光プローブ（ＨＰＴＳ）を含む作業溶液（ＷＳ）（カルシウムおよびマグネシウムを含むＰＢＳ）に再懸濁した。

Ｄ_２．ＭＡ試験の高処理並行測定
黒色の、非結合性である、小容量の３８４マルチウエルプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ Ｂｉｏ−Ｏｎｅ）におけるそれぞれのウエルに、１０μｌのＰＢＭＣ溶液と、１０個の試薬のうちの１個を８つの増大する濃度で含む１０μｌの作業溶液＋ＨＰＴＳとを負荷した。したがって、それぞれのウエルにおけるプローブの最終濃度が１μＭであり、ＰＢＭＣの最終濃度が、ｐＨ７．３前後の１０ｍＭのリン酸塩緩衝剤を含有する２０μｌの生理学的作業溶液において２．５×１０^６細胞／ｍｌであった。成人の末梢血における平均ＰＢＭＣ濃度を考慮して、２．５×１０^６細胞／ｍｌの作業濃度が選択された。ＰＢＭＣのこの濃度は２つの側面を保証するとみなされる：第１に、少なくとも１時間の期間中における生成物蓄積に起因する妥当なシグナル対ノイズ比を得るために、そして、第２に、細胞間の相互作用を可能にさせるために。１０μｌ負荷の同じプロトコルを、最初にＰＢＭＣサンプルに対して、次に試薬に対して、少なくとも三連で行い、その結果、要求される濃度における最終的な２０μｌの容量をそれぞれのウエルにおいて正確に得るようにした。さらに、それぞれの試験において、２つのタイプの対照を含めた：１つは、８個のウエルにおいて、細胞を伴わず、かつ、刺激因子を伴わず、プローブ（１μＭ）のみを含んだ；もう一方は、８個のウエルにおいて、刺激因子を伴わない細胞のみを含んだ（基礎状態）。酸性化過程を、市販の蛍光スキャナ（ＴＥＣＡＮ Ｉｎｆｉｎｉｔｅ Ｍ２００）によって、３７℃での１時間のインキュベーションの期間中、それぞれ５分間モニタした。最初、スキャナは、酸性化過程を、３０分の期間中（６サイクル）、封止することなく（“ＯＰＥＮ”モードで）モニタし、その後、それぞれのウエルからのＣＯ_２およびＮＨ_３の換気を避けるためにマルチウエルプレートを気密封止した（ＴｈｅｒｍａｌＳｅａｌ ＲＴ（商標）、ＥＸＣＥＬ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｉｎｃ．）（“ＣＬＯＳＥ”モード）。次に、酸性化過程を、再び３０分の期間中モニタした（６サイクル）。シグナル対ノイズ比を増大させるために、５１３ｎｍにおける蛍光強度を各ウエルについて４５５ｎｍおよび４０３ｎｍにおける励起下で連続して測定した。

Ｄ_３．試薬のタイプ、スペクトルおよび調製
それぞれの試験において、ＰＢＭＣの代謝活性プロフィルを、基礎状態で、また、８つの異なる濃度において作業溶液で希釈された下記の１０個の試薬の影響下でモニタした：ＰＨＡ、ＣＯＮＡ、ＰＭＡ、ＬＰＳ、ＭＢＰ（２８）、メランＡ、ＰＳＡ（２９）、グルコース（２４）、Ｌ−グルタミンおよびラパマイシン（Ｓｔｒａｕｓｓ Ｌ、Ｃｚｙｓｔｏｗｓｋａ Ｍ、Ｓｚａｊｎｉｋ Ｍ、Ｍａｎｄａｐａｔｈｉｌ Ｍ ＆ Ｗｈｉｔｅｓｉｄｅ ＴＬ（２００９）、Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ Ｔ ｃｅｌｌｓ（Ｔｒｅｇ）ａｎｄ ｅｆｆｅｃｔｏｒ Ｔ ｃｅｌｌｓ ｔｏ ｒａｐａｍｙｃｉｎ、ＰＬｏＳ Ｏｎｅ、４（６）：ｅ５９９４）。試薬選択を免疫系に対するそれらの関連によって行った（表１（上記）、備考：濃度は、表における濃度に限定されない。濃度＝０〜非毒性用量）。

他の試薬が校正中であることに言及しなければならない：例えば、ホルモン（例えば、エストラジオールなど）、ガン特異的抗原（例えば、ガン胎児性抗原（ＣＥＡ）など）、サイトカインおよびケモカイン（例えば、ｉｌ−２など）、ビタミン、ホルモン、薬物、免疫系の抗体、神経伝達物質、種々のガンペプチド、および、特定のウイルスまたはその断片（例えば、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）など）（データは示されず）。

Ｄ_４．ｐＨ感受性蛍光プローブのレシオメトリック測定およびＷＳ酸性度校正
この試験で使用されるプローブは８−ヒドロキシピレン−１，３，６−トリスルホン酸（ＨＰＴＳ）である。

ＨＰＴＳは、ｐＫａが水性緩衝液において約７．３である、費用効果的な非毒性の、非常に水溶性の膜不透過性ｐＨ指示薬である。ＨＰＴＳはｐＨ依存的な吸収移動を示し、これにより、レシオメトリックｐＨ測定を、４５５ｎｍおよび４０３ｎｍにおける励起下で連続して測定される５１３ｎｍにおける蛍光強度の比率の関数として可能にする。この方法は、ｐＨ７前後の生理学的範囲における微小ｐＨ変化の本発明の高感度測定には不可欠である。

プローブの感度を定量化するために、ＨＰＴＳのストック溶液を水で希釈して１００μＭの濃度にし、その後、１μＭおよび１０μＭの最終濃度にした。ＷＳの酸性度校正を２つの緩衝剤濃度について、すなわち、ＷＳ（１０ｍＭリン酸塩緩衝液）と、生理食塩水によって５倍希釈されたＷＳ（２ｍＭリン酸塩緩衝液）とについて行った（図３Ａ〜３Ｄ、図４Ａ〜図４Ｂ）。

ＭＡ試験で使用される最終的な校正曲線をＷＳ（２μＭのＨＰＴＳを含有する）の連続滴定のｐＨガラス電極測定によって行った。滴定されたサンプルのｐＨ測定および蛍光測定が３７℃で行われる。サンプルをマルチウエルプレートに負荷し、ＥＸ４０３ｎｍおよびＥＸ４５５ｎｍ下での蛍光強度を、蛍光スキャナを使用して５１３ｎｍで測定する。

“ＯＰＥＮ”状態および“ＣＬＯＳＥ”状態について、多項式の校正曲線を構築し（図３Ｃ〜図３Ｄ）、これにより、ｐＨ値および蓄積酸性度当量を、４０３ｎｍおよび４５５ｎｍにおける励起下で５１３ｎｍにおいてそれぞれ測定される蛍光強度の比率の関数として測定することが可能になる。

得られた式をすべての新しいドナーの分析のために使用した（表３、下記）。

Ｅ．データ分析
コンピュータ計算、分析およびデータマイニング（Ｎｉｓｂｅｔ Ｒ、ＩＶ ＪＥ、＆ Ｍｉｎｅｒ Ｇ（２００９）、Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ Ａｎａｌｙｓｉｓ ａｎｄ Ｄａｔａ Ｍｉｎｉｎｇ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ）を、下記の統計学パッケージを使用することによって行った：ＥＸＣＥＬ ２００７、ＯｒｉｇｉｎＰｒｏ ８、ＳＡＳ Ｅｄｉｔｉｏｎ ９．２、ＰＡＳＷ Ｍｏｄｕｌａｒクライアント１３．０（以前はＣｌｅｍｅｎｔｉｎｅ（ＳＰＳＳの一部）と呼ばれていた）。図６Ａ〜図６Ｃから図８Ａ〜図８Ｄまで、および、図１３における結果は、平均±平均の標準誤差として表される。種々のモデルについての、健常者と、ガン患者との間における統計学的有意性を、χ二乗を使用して計算した。結果は、ｐ＜０．０５であるとき、統計学的に差があると見なされた。

ドナーのデータ分析（ＭＡ試験枠組みのフローチャートにおいて要約される−図１２）
データ準備−
ステップ０：ドナーデータの処理および正規化
各記録（ドナー）の生データを処理して、ｐｍｏｌｅ Ｈ^＋／μｌ／時間／２５００個ＰＢＭＣを単位とする代謝活性の酸性化速度に換算された結果を得た。

前処理−ステップ１ａ：プローブ分析およびドナーデータ正規化
シグナル対ノイズ比を改善するために、プローブの分析を、ｋ−平均クラスタ分析をすべてのドナーから集められたすべての観測結果（ｎ＝７３０）に対して行うことによって行った（図５Ａ〜図５Ｄ）。これらの処理された結果を、ドナー値を、プローブの外れ値を除いた（結果の５％以下が除かれた）後のＨＰＴＳ平均値から引くことによって正規化した。

前処理−ステップ１ｂ：ドナーのデータにおける除外された外れ値
“ＯＰＥＮ”および“ＣＬＯＳＥ”での値を、ドナー、用量および刺激因子の各組合せについての“ＯＰＥＮ”および“ＣＬＯＳＥ”での平均値によって正規化する。標準スコア＞｜１．７｜である観測結果を棄却した（結果の１．７７％）。

データ準備−ステップ１ｃ：ドナーの代謝活性の結果の表示
それぞれのドナーにおける外れ値を除いた後、“ＯＰＥＮ”および“ＣＬＯＳＥ”の平均値を、ドナーあたりのそれぞれの用量およびそれぞれの試薬についての少なくとも三連の結果の平均に基づいてそれぞれのドナーについて別個に計算した。これらの結果が、それぞれの試薬および用量についてのドナーの代謝活性を表すものとして後で使用されるであろう。結果が２Ｄグラフおよび３Ｄグラフで配置され、すべてのドナーに関して自動的に更新されるであろう。

分類モデルについての探索−ステップ２：データマイニングアルゴリズム
研究されたガン患者のほとんどが３９歳以上であったので、また、年齢の影響をできる限り最小限に抑えるために、男性および女性を含む血液ドナーの２つのコホートを試験し、分析した。第１のコホートは、年齢が４０歳を超えるドナーを含み（ｎ＝４２（２１名の健常者ドナーおよび２１名のガン患者）、第２のコホートは２２歳〜８１歳のドナーのすべてを含む（ｎ＝６７（４２名の健常者ドナーおよび２５名のガン患者）。ステップ３の結果を分類するために、一群の決定樹／規則誘導（Ｃ５、ＣＡＲＴ、ＣＨＡＩＤ、連係ルール）と、対数線形モデル（ロジスティック回帰）とから得られる一組のアルゴリズムを使用した。予備的な分析方法を使用して、データにおける隠れた関係および隠されていない関係を精査した。

モデル評価−ステップ３：モデル構築および分類
ドナーを健常者およびガン患者に分類するために、データマイニング、機械学習および統計学的モデル化を含む１０個の異なるモデルの一群からの一組を、ＳＡＳ９．３およびＣｌｅｍｅｎｔｉｎｅソフトウエア（Ｖ１３．０）を適用して使用した。モデルの成績を評価し、比較するために、Ｃｌｅｍｅｎｔｉｎｅソフトウエア（Ｖ１３．０）によってもたらされる累積増加チャートに基づくグラフィカル方法を使用することが決定された（図９Ａ〜９Ｄ）。

予測的モデル化−ステップ４：血液ドナーの３０％の検証集合を使用する評価
ステップ３で記載されるようなデータを、Ｃｌｅｍｅｎｔｉｎｅソフトウエア（Ｖ１３．０）を使用して“学習”および“試験”の２つの群にランダムに仕分けた。“学習集合”は、データマイニングモデルを組み立てるために使用され、ドナーの７０％を含む。ドナーの残る３０％が、学習集合で得られたモデルを使用して「試験」集合に対する分類結果を評価するために使用される（図１０Ａ〜図１０Ｄ）。

データ分析プロセス全体が、ＭＡ試験プロトコルおよび分析枠組みのフローチャート（図１２）において要約される。

実施例２
ＭＡ試験の設計および特徴
新鮮な末梢血単核細胞（ｈＰＢＭＣ）を４２名の健常者ドナーおよび２５名のガン患者（表２、上記）からＦｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅおよびグラジエント遠心分離によって単離した。それぞれの血液サンプルについて、３８４マルチウエルプレートに、ｐＨ７．３前後の１０ｍＭ緩衝剤での生理学的作業溶液、約２．５×１０^６細胞／ｍｌの最終濃度でのｈＰＢＭＣ、１μＭのｐＨプローブ（ＨＰＴＳ）、および、８つの増大する濃度での１０個の刺激試薬のうちの１つ（表３、上記）を含有する２０μｌを負荷した。ＭＡ試験を、市販の蛍光スキャナを使用して行う。細胞外酸性化の速度論的プロフィルを空気開放（“ＯＰＥＮ”）状態または気密封止閉鎖（“ＣＬＯＳＥ”）状態のどちらでも測定した。両方の記録は、‘揮発性’代謝生成物に対する‘可溶性’代謝生成物（ＣＯ_２およびＮＨ_３に対する乳酸）のリアルタイム蓄積を測定し、それにより、酸化リン酸化、嫌気的糖分解および好気的糖分解（“Ｗａｒｂｕｒｇ効果”）を区別することを可能にする（Ｖａｎｄｅｒ Ｈｅｉｄｅｎ ＭＧ、Ｃａｎｔｌｅｙ ＬＣ、＆ Ｔｈｏｍｐｓｏｎ ＣＢ（２００９）、Ｕｎｄｅｒｓｔａｎｄｉｎｇ ｔｈｅ Ｗａｒｂｕｒｇ ｅｆｆｅｃｔ：ｔｈｅ ｍｅｔａｂｏｌｉｃ ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔｓ ｏｆ ｃｅｌｌ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ、Ｓｃｉｅｎｃｅ、３２４（５９３０）：１０２９〜１０３３）。ＭＡ速度プロフィルを計算し、データマイニングツールを含む動的オンライン分析によってガン診断について調べた（図１２）。

実施例３
レシオメトリック蛍光での細胞外ｐＨ測定および酸性度校正
このＭＡ試験で使用される非毒性の、膜不透過性のレシオメトリック分子ｐＨプローブは、ｐＫ_ａが水性生理学的緩衝液において約７．３である８−ヒドロキシピレン−１，３，６−トリスルホン酸（ＨＰＴＳ）である（Ｈａｋｏｎｅｎ Ａ ＆ Ｈｕｌｔｈ Ｓ（２００８）、Ａ ｈｉｇｈ−ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ ｒａｔｉｏｍｅｔｒｉｃ ｆｌｕｏｒｏｓｅｎｓｏｒ ｆｏｒ ｐＨ：ｉｍｐｌｅｍｅｎｔｉｎｇ ｔｉｍｅ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｎｏｎ−ｌｉｎｅａｒ ｃａｌｉｂｒａｔｉｏｎ ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｆｏｒ ｄｒｉｆｔ ｃｏｍｐｅｎｓａｔｉｏｎ、Ａｎａｌ Ｃｈｉｍ Ａｃｔａ、６０６（１）：６３〜７１；Ｈａｎ Ｊ ＆ Ｂｕｒｇｅｓｓ Ｋ、Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｉｎｄｉｃａｔｏｒｓ ｆｏｒ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｐＨ、Ｃｈｅｍ Ｒｅｖ、１１０（５）：２７０９〜２７２８）。これは、その低い毒性によって、多くの細胞型における細胞内ｐＨ測定から、２ｍＭでの一晩のインキュベーション下まで広く知られている（Ｏｖｅｒｌｙ ＣＣ、Ｌｅｅ ＫＤ、Ｂｅｒｔｈｉａｕｍｅ Ｅ、＆ Ｈｏｌｌｅｎｂｅｃｋ ＰＪ（１９９５）、Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ ｏｆ ｉｎｔｒａｏｒｇａｎｅｌｌｅ ｐＨ ｉｎ ｔｈｅ ｅｎｄｏｓｏｍａｌ−ｌｙｓｏｓｏｍａｌ ｐａｔｈｗａｙ ｉｎ ｎｅｕｒｏｎｓ ｂｙ ｕｓｉｎｇ ｒａｔｉｏｍｅｔｒｉｃ ｉｍａｇｉｎｇ ｗｉｔｈ ｐｙｒａｎｉｎｅ、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ、９２（８）：３１５６〜３１６０）。本発明では、ＨＴＰＳはむしろ、１μＭの低い濃度（これにより、その非毒性がさらに保証される）で、細胞外ｐＨ測定のために使用される。多項式の校正曲線を“ＯＰＥＮ”状態および“ＣＬＯＳＥ”状態について構築し（図３Ａ〜図３Ｄ）、これにより、ｐＨ値および累積酸性化当量を、４０３ｎｍおよび４５５ｎｍにおける励起下で５１３ｎｍにおいてそれぞれ測定される蛍光強度の比率の関数として測定することを可能にした。酸性化校正曲線を、作業溶液（ＷＳ）と、生理食塩水により５倍希釈されたＷＳ（それぞれ、１０ｍＭおよび２ｍＭのリン酸塩緩衝剤）とについて得た（図３Ａ〜図３Ｄ）。予想されたように、この図により、１０ｍＭの緩衝能は、ｐＨ変化と同じ範囲において、２ｍＭの緩衝能の酸性化値と比較して約５倍の酸性化値を可能にすることが確認される。これらの結果は、６．５〜７．５の生理学的ｐＨ範囲における酸性化に対する適正な感度を示している。さらなる結果により、この測定方法が１μＭ〜１０μＭの間での蛍光プローブ濃度に依存しないことが示される。この系は、ＨＰＴＳの細胞外最終濃度がほんの１μＭにすぎないとき、高いシグナル対ノイズ比をもたらすために十分に高感度である（図４Ａ〜図４Ｂ）。

最終的な校正曲線から得られる式（図３Ａ〜図３Ｄ、表４）を、全６７名のドナー（４２名の健常者および２５名のガン患者）から得られたＰＢＭＣ代謝活性記録における有意な測定変化の定量的分析のために使用した。

実施例４
ＨＰＴＳバックグラウンドの動的ｋ−平均クラスタ分析によるシグナル対ノイズ比の改善
ＭＡ試験結果の動的臨床評価を目指して、それぞれのドナーについてのいずれかのＭＡ試験をＨＰＴＳシグナルの参照速度値に関して以前の試験と比較する信頼性のある方法を開発した（ｎ＝７３０の観測結果）。このデータ収集によって、ＭＡ試験のシグナル対ノイズ比を、例外的な参照結果をフィルタリング処理することによって改善することが可能である。その目的のために、ｋ−平均クラスタ分析（Ｎｉｓｂｅｔ Ｒ、ＩＶ ＪＥ、＆ Ｍｉｎｅｒ Ｇ（２００９）、Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ Ａｎａｌｙｓｉｓ ａｎｄ Ｄａｔａ Ｍｉｎｉｎｇ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ）をＨＰＴＳプローブの蓄積する正規化された速度値について適用した。それぞれの試験において、少なくとも８個の対照ウエルを調べた。これらの対照ウエルは１μＭのＨＰＴＳを作業溶液に含有し、細胞を伴わず、かつ、刺激因子を伴わなかった。それぞれの値を、標準スコアを使用する蓄積した観測結果を考慮に入れて正規化した。図５Ａは、すべてのＭＡ試験の“ＯＰＥＮ”および“ＣＬＯＳＥ”での速度値についての標準スコアの分布を示す。ｋ−平均クラスタ分析によって、２６個のクラスタが得られ（図５Ｂ）、ここで、それぞれの観測結果が、最も近い平均を有するクラスタに属している。図５Ｄに報告される結果により、プローブの安定した性能が評価される。すべてのＨＰＴＳ参照結果（ｎ＝７３０）のうち、５つのクラスタ（４．６６％）のみが棄却された。残る２１個のクラスタ（９５．３４％）が最終的には、正常な参照範囲を構成すると見なされた。“ＯＰＥＮ”状態の平均値および“ＣＬＯＳＥ”状態の平均値をそれぞれのドナーについて再計算した。ｋ−平均クラスタ分析により、プローブのバックグランド速度シグナルを細胞データから取り出すことができ、それにより、進行中のＭＡ試験結果の実際の速度値を得ることができる。

実施例５
対照サンプルのＭＡプロフィル：（ｉ）細胞非存在下での増大する試薬濃度において；（ｉｉ）細胞を伴うが、試薬を伴わない場合
（ｉ）細胞非存在下での対照実験では、細胞存在下で得られる酸性化プロフィルにより、細胞の代謝活性の速度が実際に測定されることが確認された。したがって、酸性化は、細胞を伴うサンプルにおける明瞭な酸性化変化と比較して、プローブ、緩衝剤、および、増大する濃度でのそれぞれの試薬の存在下で、しかし、細胞を何ら伴うことなく適用された同じプロトコル下では何ら得られなかった（例えば、グルコース（図６Ａ）およびＰＳＡ（図８Ａ））。同じ対照結果が、すべての試薬について得られた。（ｉｉ）細胞存在下における酸性化の基礎レベルを、グルコースを含む試薬のいずれもが存在しない状態で測定した。一般に、この基礎レベルはグルコース濃度の増大とともに増大し、これにより、細胞の代謝活性の明確な側面が確認された（図６Ｂ〜図６Ｃ）。そのうえ、基礎状態でのＭＡプロフィルは既に、健常者ドナーの６９％のナイーブなｈＰＢＭＣによって好まれる優勢的な酸化的リン酸化から、様々なガン患者の６０％の活性化されたｈＰＢＭＣによって好まれる優勢的な好気的糖分解（“Ｗａｒｂｕｒｇ”効果）への診断的変化の一般的な傾向を明らかにしていた。これらの結果は、インビボ状態により近い状況である基礎状態において既に診断ツールとしてのＭＡ試験の潜在的可能性を強調している。しかしながら、基礎状態だけでは、健常者およびガン患者を明確に識別するには十分でない（χ二乗、ｐ＝０．４５）。試薬のネットワークに対する応答におけるＭＡ試験プロフィルのすべての今回のデータマイニングによって（図１０Ａ〜図１０Ｄ）、このデータマイニングは、健常者ドナーの９５．２４％およびガン患者の８８％（年齢≧４０歳、χ二乗、ｐ＜０．０００１）、ならびに、健常者ドナーの９０．４８％およびガン患者の９５．２４％（２２歳≦年齢≦８１歳、χ二乗、ｐ＜０．０００１）について有意であると示すことができる。

実施例６
典型的な健常者ドナーおよび乳ガン患者について得られる、増大するグルコース濃度でのＭＡプロフィルの比較
第１に、健常者ドナーのＭＡプロフィル（図６Ｂ、図７Ａ）は、年齢（４５歳（図６Ｂ）対６９歳（図７Ａ））および性別における有意な差にもかかわらず、著しく類似している。第２に、図６Ａ〜図６Ｃにおける結果は、典型的な健常者ドナーと、乳房上皮内ガン患者（第２期で、何らかの処置の前）とを表す２名のドナーの間におけるＭＡプロフィルの有意な差を明らかにしている。加えて、ＭＡ試験が自己免疫疾患およびさらなるガン非関連感染疾患の少数の事例に関して適用された予備実験では、健常者およびガン患者について得られる代謝活性プロフィルと比較して、異なる代謝活性プロフィル（データは示されず）が既に明らかにされた。これらの差により、ガンの３つの臨床診断指標が示される（図４Ａ〜図４Ｃ）。指標１：基礎状態（試薬を伴わない作業溶液における細胞）において、ＭＡ速度“ＯＰＥＮ”＞ＭＡ速度“ＣＬＯＳＥ”。指標２：すべてのグルコース濃度について、ＭＡ速度“ＯＰＥＮ”＞ＭＡ速度“ＣＬＯＳＥ”。指標３：ガンのＭＡ速度“ＯＰＥＮ”＞健常者のＭＡ速度“ＯＰＥＮ”、および、ガンのＭＡ速度“ＣＬＯＳＥ”＞健常者のＭＡ速度“ＣＬＯＳＥ”。したがって、酸化的リン酸化のより大きい値が、ガンサンプルの新鮮なＰＢＭＣにおける好気的糖分解のより大きい値と比較して健常者サンプルの新鮮なＰＢＭＣにおいて得られる。導入部で述べられたように（Ｖａｎｄｅｒ Ｈｅｉｄｅｎ ＭＧ、Ｃａｎｔｌｅｙ ＬＣ、＆ Ｔｈｏｍｐｓｏｎ ＣＢ（２００９）、Ｕｎｄｅｒｓｔａｎｄｉｎｇ ｔｈｅ Ｗａｒｂｕｒｇ ｅｆｆｅｃｔ：ｔｈｅ ｍｅｔａｂｏｌｉｃ ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔｓ ｏｆ ｃｅｌｌ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ、Ｓｃｉｅｎｃｅ、３２４（５９３０）：１０２９〜１０３３；Ｆｏｘ ＣＪ、Ｈａｍｍｅｒｍａｎ ＰＳ、＆ Ｔｈｏｍｐｓｏｎ ＣＢ（２００５）、Ｆｕｅｌ ｆｅｅｄｓ ｆｕｎｃｔｉｏｎ：ｅｎｅｒｇｙ ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ ａｎｄ ｔｈｅ Ｔ−ｃｅｌｌ ｒｅｓｐｏｎｓｅ、Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ、５（１１）：８４４〜８５２；Ｍｉｃｈａｌｅｋ ＲＤ ＆ Ｒａｔｈｍｅｌｌ ＪＣ、Ｔｈｅ ｍｅｔａｂｏｌｉｃ ｌｉｆｅ ａｎｄ ｔｉｍｅｓ ｏｆ ａ Ｔ−ｃｅｌｌ、Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｒｅｖ、２３６：１９０〜２０２）、これらの結果からおそらくは、ガン患者の活性化されたｈＰＢＭＣにおける“Ｗａｒｂｕｒｇ効果”のインビボでの発達が示される。ガン患者について得られるＭＡ試験結果のより詳細な観察結果（図６Ｃおよび図７Ｂ〜図７Ｄ）により、“ＣＬＯＳＥ”状態では、全体的な酸性化速度が“ＯＰＥＮ”状態の場合よりも小さいことが明らかにされる。これらの結果から、乳酸およびＣＯ_２に起因する酸性度の部分的滴定にかかわる揮発性の塩基性生成物が示される。この滴定が、不揮発性乳酸の産生への代謝スイッチのときに生理学的に必要となり得る。この役割が、タンパク質異化ならびにプリン化合物およびピリミジン化合物の代謝経路の主要な生成物の１つであるアンモニア（ＮＨ_３）に関連づけられる。この測定系では、インビボと同様に、生細胞は、細胞質を、下記のような酸性生成物および塩基性生成物の両方を同時に代謝により分泌することによって約７．２〜７．４の一定ｐＨで維持しなければならない。

上記３つの指標分析において、種々の組合せが様々なガン（例えば、結腸、乳房、肺および膵臓）の種々の段階で見出されたことには言及しなければならない（表２、上記）。したがって、これらの変動によって、個々のドナーの十分なデータ収集の検査および追跡調査は、下記の事例研究において明らかにされるように（図７Ａ〜図７Ｄ）、信頼性のある、より多くの情報を提供する診断用プロフィルをもたらすと考えられる。

実施例７
乳ガンの６５歳女性について得られる、増大するグルコース濃度でのＭＡプロフィルの事例研究追跡調査
予備的なＭＡ試験測定に関して、甲状腺ガンの１つの事例および乳ガンの１つの事例が医師よりも前に本発明の試験によって診断されたことには言及しなければならない。この乳ガン事例を、ＭＡ試験が、病期分類および処置の典型的な分類と比較して、微妙な情報を提供可能である証拠として２年間、追跡調査した。これは、ＭＡ試験がガンの状態を明らかにした１年後に乳ガンを有すると臨床的に診断された女性ドナーの２年間の追跡調査研究の最初の報告である。比較のために、典型的な健常な６９歳男性のＭＡプロフィルが示される（図７Ａ）。時間ゼロにおけるこのガン患者のＭＡプロフィル、すなわち、ＭＡ試験がガンの状態を明らかにした１年後に乳ガンを有すると臨床的に診断された患者のＭＡプロフィル（すなわち、）（図７Ｂ）。上記３つのガン診断指標により、健常者のプロフィル（図７Ａ）に認められる酸化的リン酸化から、ガン事例のプロフィル（図７Ｂ）に認められる好気的糖分解への変化が示される。すなわち、健常者のプロフィルの“ＣＬＯＳＥ−ＯＰＥＮ”についての陽性の値（図７Ａ）、および、ガンのプロフィルについて得られる“ＣＬＯＳＥ−ＯＰＥＮ”についての陰性の値（図７Ｂ）。この研究事例について得られる次回のＭＡ試験を１０．５ヶ月後に行った（図７Ｃ）。これは、第２期でのｉｄｃ乳ガンの日常的マンモグラフィ診断の直後であった。その時点で、患者は生理学的または触診可能な症状を何ら報告しなかったことは強調されなければならない。

この時点以降は、追跡調査でのＭＡ試験を３週間毎に行った。１ヶ月後、腫瘍の外科的除去が行われた。さらに１ヶ月後、化学療法処置が３週間毎に施された。それぞれのＭＡ試験がそれぞれの処置の約２０日後および次回の処置の２日前に行われた。ここに示される最後のＭＡ試験（図７Ｄ）は、３回目の化学療法処置の後で、すなわち、化学療法プロトコルを開始した約２ヶ月後に行われた（時間＝（＋）１４．５ヶ月）。ＭＡ試験の３つの指標によれば、この最後の試験は既に、健常者ドナー（図７Ａ）に特徴的なＭＡプロフィル（図７Ｄ）を明らかにすることに留意しなければならない。明白なことに、ＭＡ試験により、進行中の処置に伴い肯定的な傾向が確認される。これらの結果によって、ＭＡ試験を、化学療法の期間中および化学療法が完了したはるか後での臨床評価と比較した場合のＭＡ試験プロフィルの傾向挙動を明らかにするために、追跡調査手順において使用することは重要であろう。この追跡調査プログラムが、簡便で、非侵襲的で、かつ、安価である臨床指向のＭＡ試験によって利用可能になる。

実施例８
典型的な健常者、乳ガン患者および乳ガン回復ドナーについて得られる、増大するＰＳＡ濃度でのＭＡプロフィルの比較
今日に至るまで、ＭＡプロフィルを、ガン診断のための一般的な非特異的臨床ツールとして明確に見出されたグルコースの増大する濃度下で調べた。より特異的なガン分類を得るために、ＭＡ試験では、組織特異的な正常な抗原（例えば、ＰＳＡ、メランＡ）などの様々な試薬（表３）が同時に探索される。

前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）は、前立腺の細胞によって産生される正常なタンパク質である。ＰＳＡは、ガンに伴う組織特異的な正常な抗原である。このペプチドが細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）によって認識される。このペプチドのヒト末梢血における増大するレベルが、男性のための前立腺ガンの生化学的診断マーカとして臨床的に使用されている（Ｇｒｅｅｎｅ ＫＬ他（２００９）、Ｐｒｏｓｔａｔｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ ｂｅｓｔ ｐｒａｃｔｉｃｅ ｓｔａｔｅｍｅｎｔ：２００９ ｕｐｄａｔｅ、Ｊ Ｕｒｏｌ、１８２（５）：２２３２〜２２４１）。しかし、低レベルのＰＳＡが女性の循環に放出されており、今日まで、臨床でのＰＳＡ血液試験は女性のための診断因子としては使用されていない。しかしながら、数多くの研究では、ＰＳＡが前立腺特異的でなく、女性の一部のホルモン調節組織であって、主に乳房およびその分泌物に存在することが示されている（Ｂｌａｃｋ ＭＨ ＆ Ｄｉａｍａｎｄｉｓ ＥＰ（２０００）、Ｔｈｅ ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ ａｎｄ ｐｒｏｇｎｏｓｔｉｃ ｕｔｉｌｉｔｙ ｏｆ ｐｒｏｓｔａｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ ｆｏｒ ｄｉｓｅａｓｅｓ ｏｆ ｔｈｅ ｂｒｅａｓｔ、Ｂｒｅａｓｔ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ Ｔｒｅａｔ、５９（１）：１〜１４；Ｂｌａｃｋ ＭＨ他（２０００）、Ｓｅｒｕｍ ｔｏｔａｌ ａｎｄ ｆｒｅｅ ｐｒｏｓｔａｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ ｆｏｒ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ｉｎ ｗｏｍｅｎ、Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ、６（２）：４６７〜４７３）。女性において、ＰＳＡが、男性精液に見出される濃度にほぼ等しい濃度で女性の射精物に見出される（Ｗｉｍｐｉｓｓｉｎｇｅｒ Ｆ、Ｓｔｉｆｔｅｒ Ｋ、Ｇｒｉｎ Ｗ、＆ Ｓｔａｃｋｌ Ｗ（２００７）、Ｔｈｅ ｆｅｍａｌｅ ｐｒｏｓｔａｔｅ ｒｅｖｉｓｉｔｅｄ：ｐｅｒｉｎｅａｌ ｕｌｔｒａｓｏｕｎｄ ａｎｄ ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ｓｔｕｄｉｅｓ ｏｆ ｆｅｍａｌｅ ｅｊａｃｕｌａｔｅ、Ｊ Ｓｅｘ Ｍｅｄ、４（５）：１３８８〜１３９３、考察 １３９３）。３つのＭＡプロフィルが図８Ａ〜図８Ｄに示される：典型的な健常者女性（図８Ｂ）、第２期の乳ガンｉｄｃを有し、処置を行う前の女性（図８Ｃ）、および、第２期の乳ガンから１８年前に回復した女性（図８Ｄ）。組織特異的な刺激因子（例えば、ＰＳＡ）が、顕著なピークをガン患者のＭＡ試験プロフィルにおいて最適な濃度で誘導することが認められる（図８Ａ〜図８Ｄ）。そのようなプロフィルは、疾患特異的な受容体媒介刺激を反映し、それにより、特定の腫瘍（例えば、ＰＳＡ刺激による乳房、メランＡ刺激によるメラノーマ）を検出することを可能にすると考えられる。結果から、いくつかの重要なことが明らかにされる。第１に、健常者女性のＭＡプロフィルでは、グルコースのＭＡプロフィルについて上記で既に報告されているように（図６Ａ〜図６Ｃおよび図７Ａ〜図７Ｄ）、より高いレベルの酸化的リン酸化が示される。第２に、図８Ｃでは、第２期でのｉｄｃ乳ガンを有し、何らかの処置を行う前の女性によるＰＳＡに対するＰＢＭＣ応答が示される。このプロフィルは、高い代謝活性速度を、既に基礎状態からではあるが、“ＯＰＥＮ”状態で表す。これらのプロフィルは高レベルの好気的糖分解を示しており、これは、ガン患者のグルコースＭＡプロフィルについて得られるような活性化されたＴ細胞と類似する現象である。ＭＡ試験のもう１つの特有なプロフィルが、乳ガンから１８年前に回復した５０歳女性について明らかにされた（図８Ｄ）。ＰＳＡ刺激についてのこのプロフィルはむしろ、健常者ドナーのプロフィル（図８Ｂ）と同様に挙動する。さらに、このプロフィルは、健常者ドナーについての特徴的なプロフィル（図８Ｂ）よりも大きいＭＡ速度を、増大するＰＳＡ濃度では優勢的な酸化的リン酸化経路を示す“ｃｌｏｓｅ”状態で明らかにする。このプロフィルは、抗乳ガン記憶細胞の増大した集団に関連づけられるかもしれない。この関連は、病原体排除後では、生存するエフェクタ細胞が長命の記憶細胞に分化し、酸化的な代謝状態に戻るという観測結果（Ｍｉｃｈａｌｅｋ ＲＤ ＆ Ｒａｔｈｍｅｌｌ ＪＣ、Ｔｈｅ ｍｅｔａｂｏｌｉｃ ｌｉｆｅ ａｎｄ ｔｉｍｅｓ ｏｆ ａ Ｔ−ｃｅｌｌ、Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｒｅｖ、２３６：１９０〜２０２）と一致している。

実施例９
データマイニングツールによるＭＡ試験結果のためのモデル構築および分類評価
膨大な数のＭＡ速度値を含む多数のＭＡプロフィルがそれぞれのドナーについて得られる。新しいドナー毎に更新される動的な臨床分析を開発し、また、様々なパターンをこの大きいデータベースから取り出すために、統計学および人工知能から得られる様々な方法をデータベース管理と組み合わせるデータマイニングツールを使用するコンピュータプログラミングを開発した（Ｎｉｓｂｅｔ Ｒ、ＩＶ ＪＥ、＆ Ｍｉｎｅｒ Ｇ（２００９）、Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ Ａｎａｌｙｓｉｓ ａｎｄ Ｄａｔａ Ｍｉｎｉｎｇ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ）。男性および女性の両方についてのＭＡ試験結果の２つの選択されたコホートを分析した。研究されたガン患者のほとんどが３９歳以上だったので、また、年齢の影響を最小限に抑えるために、この分析は、年齢が４０歳を超える４２名のドナー（２１名の健常者ドナーおよび２１名のガン患者）のサブグループに集中した。第２のコホートでは、２２歳〜８１歳のドナーのすべてが使用された（ｎ＝６７、４２名の健常者ドナーおよび２５名のガン患者）。ドナーを健常者個体およびガン個体に分類するために、データマイニング、機械学習および統計学的モデル化を含む１０個の異なるモデルの一群からの一組を、ＳＡＳ９．３およびＣｌｅｍｅｎｔｉｎｅソフトウエア（Ｖ１３．０）を適用して使用した。これら１０個のモデルのうち、４つのみが、最も高い精度で、健常者ドナーおよびガン患者の両方を分類することができた。これら４つのモデルのうち、３つが一群の決定樹（ＣＨＡＩＤ、Ｃ５、Ｃ＆Ｒツリー）に由来し、１つが対数線形モデル（ロジスティック回帰）のものであった。４つすべてが図９Ａ〜図９Ｄに示される。これらの決定樹モデルは、最も良く分類するものであると見なされる。これは、これらのモデルは、何らかの分布も、また、何らかの仮定も仮定しないからである。他のモデルと同等には良好に機能しなかった第４のモデルが、ロジスティック回帰であった。この種のモデルは、入力データがモデルの仮定（例えば、分布および独立性に関する仮定など）として正確に挙動するときに最も良く適する。過度な適合化をできる限り最小限に抑えるために、ロジスティック回帰モデルは、変数を重要度によって順序づけ、選択された変数の数をできる限り最小限に抑えることを可能にする変数増加法を使用して操作された。それぞれのモデルが、種々の変数／特徴を、それぞれが異なる濃度である種々の抗原の関数として示すので、２つ以上のモデルの関数としての本発明の予測を組み合わせることが可能であるかもしれない。モデルの精度に対する種々の濃度での試薬全体の影響を調べたとき、選ばれた変数の最大数が５個以下であった（図９Ａ、図９Ｃ）。これは、サンプルサイズが、過度な適合化をできる限り最小限に抑えるために十分でないときには推奨される。これらの初期結果によって、１０個の試薬を様々なモデルにおけるそれらの出現頻度によって予測変数として順序づけることが可能であった（図９Ａ、図９Ｃ）。現在、グルコース、ＭＢＰ、ラパマイシン、ＰＳＡおよびＰＭＡをＭＡ試験において、また、免疫系に関連して、極めて重要な関与体として突き止めることが可能である（表３）。それら以外の５つの試薬（表３）の免疫学的関連性が依然として、特別な場合のモデルの選定によって明らかにされる。モデルの成績を評価し、比較するために、本発明者らは、Ｃｌｅｍｅｎｔｉｎｅソフトウエア（Ｖ１３．０）によってもたらされる累積増加チャートに基づくグラフィカル方法を使用することを決定した。この増加チャート（図９Ｂ、図９Ｄ）は、２つの組み込まれた曲線、すなわち、ランダム曲線（黒色線）および最良の適合曲線（青色線）を含有する。すべてのモデルがこれら２つの曲線の間に収まる。この方法では、所与の曲線と、ランダム曲線（黒色の曲線）との間におけるより大きい面積により、より良好なモデルが示される。血液ドナーのモデル化および分類結果により、最良モデルと類似する成績を有するモデルが示される（図９Ａ〜図９Ｄ）。

実施例１０
血液ドナーの３０％の検証集合を使用する、ＭＡ試験のモデル結果の評価
下記に記載される仕分けプロセスは、モデルのロバストなレベルを評価するために、また、小さいサンプリング（ｎ＝６７の血液サンプル提供者）に起因する過度な適合化を最小限に抑えるために、モデルを、ＭＡ試験結果の精度におけるより大きい信頼性を得るように組み合わせ、比較することを可能にする。図９Ａ〜図９Ｄに記載されるようなデータを、Ｃｌｅｍｅｎｔｉｎｅソフトウエア（Ｖ１３．０）を使用して“学習”および“試験”の２つの群にランダムに仕分けた（図１０Ａ〜図１０Ｄ）。検証集合には、ドナーの７０％が両方のコホートについて含まれた。第１のコホートには、年齢が４０歳を超える４２名のドナーが含まれ（図１０Ａ〜図１０Ｂ）、第２のコホートには、２２歳〜８１歳の年齢のドナーのすべて（ｎ＝６７）が含まれる（図１０Ｃ〜図１０Ｄ）。ドナーの最初の７０％が“学習集合”で記載される。“学習集合”が、図９Ａ〜図９Ｄに記載されるようなデータマイニングモデルを構築するために使用される。ドナーの残る３０％（“試験集合”）により、“試験集合”に対する分類結果を、“学習集合”で得られたモデル（ＣＨＡＩＤ、ロジスティック、Ｃ５、Ｃ＆Ｒツリー）を使用して評価することができる（図１０Ａ、図１０Ｃ）。“学習”集合および“試験”集合は、モデルの結果をより大きい信頼性により評価し、過度の適合化の問題をできる限り除くことを可能にする。両方のコホートにおいて、“試験”集合の曲線が“学習”集合に類似した場合、Ｃ５モデルがよりロバストな結果を与えたことが見出された（図１０Ｂ、図１０Ｄ）。Ｃ５モデルは、“試験”集合において最良の成績を与えるものであり、一方、“学習”集合では、Ｃ＆Ｒツリーが、最良の成績を与えるものであった。これらの結果によって、グルコース、ＭＢＰ、ＰＭＡ、ＰＨＡ、ＣＯＮＡおよびＬ−グルタミンをＭＡ試験において、また、免疫系に関連して、極めて重要な関与体として突き止めることが可能である（表３）。図９Ａ〜図９Ｄにおける最良モデルと同様に、これらの結果（図１０Ａ〜図１０Ｄ）は図９Ａ〜図９Ｄの結果を裏付けている。

ガン診断に対する生理学的取り組みが、健常者およびガン患者のｈＰＢＭＣについて得られる代謝活性プロフィルの予備的な実験結果に依拠することによってここに示される。この取り組みによって、本発明者らは、１０ｍｌ〜２０ｍｌの血液サンプルから取り出される新鮮なｈＰＢＭＣを使用するＭＡ試験の簡便な高処理能の短時間かつ費用効果的な光学的方法を設計するに至った。ｈＰＢＭＣの指紋ＭＡパターンの驚くべき差が、２つの臨床群（４２名の健常者個体および２５名のガン患者）を予備的に調べることによって明らかにされた。４２名の健常者ドナーのｈＰＢＭＣのＭＡプロフィルは、類似している好まれる酸化的リン酸化経路を示す一方で、２５名のガン患者のｈＰＢＭＣは、病期分類および処置との相関において好気的糖分解を好む広範囲のＭＡプロフィルを有する。甲状腺ガンの１つの事例および乳ガンの１つの事例が医師より前にＭＡ試験によって診断された。この乳ガン事例を、病期分類および処置の典型的な分類に関して、ＭＡ試験は微妙な情報を提供可能である証拠として２年間、ＭＡ試験によって追跡調査した。

ここに報告される結果により、腫瘍発達の鏡像としてのｈＰＢＭＣの代謝活性（図９Ａ〜図９Ｄ）のさらなる探査が促される。予備的な結果は、種々の腫瘍の病理学的発達の期間中における免疫系のガン誘導による回避下では、ｈＰＢＭＣの代謝経路の、特異的な特徴と同様に、共通する特徴を明瞭に反映している。

組織特異的なガン診断指標が、健常者ドナーについて認められるＭＡ速度に対するＭＡ速度の増大（または低下）により、局所的腫瘍発達の早期段階および後期段階でのＭＡ試験プロフィルによって提供されるかもしれない。組織特異的抗原のある特定の最適濃度がＭＡ試験プロフィルのために探し出されるにちがいない。初期の攻撃的な抗腫瘍免疫応答が予想されるときには、そのような組織特異的診断プロフィルが腫瘍発達の早期段階でもまた予想される。この取り組みによって、健常な状態において、免疫系が、すべての体組織を精査することによって、その正常な機能の状況におけるガン細胞の進行の早期検出および効果的な根絶に関与していることが仮定され得る。したがって、免疫系は、ガン細胞を組織特異的な正常な抗原のそれらの過度な発現によって検出し、排除することが提案される。したがって、恒常性において、釣り合ったレベルの効果的な免疫応答が、効果的な細胞溶解機能の低下、または、それどころか、自己免疫疾患を突如として引き起こすかもしれない自身の正常な細胞に対するそのような攻撃的活性のいずれをも回避するように十分に制御されなければならない。したがって、残念ながら、ガンの進行した段階では、免疫系が抑制されることが知られているか、または、循環しているｈＰＢＭＣの一部であるかもしれない腫瘍浸潤性リンパ球によってガン発達を支援するように教育さえされる。この見方では、ガンの致死的な転移期において、ｈＰＢＭＣのＭＡ試験プロフィルは、慢性的な炎症と異なって、組織特異的免疫寛容およびアネルギーに起因する見かけの健常な状態を反映するように戻るかもしれないことがさらに予想される。この見かけの健常な状態が、関連のある組織特異的な抗原刺激の消耗によって露呈されるかもしれない。

実施例１１
典型的な健常者ドナー、ガンドナーおよび自己免疫狼瘡ドナーについて得られる増大するグルコース濃度についてのＰＢＭＣの代謝活性プロフィル
恒常性において、免疫系の活性は十分に制御されなければならない：活性亢進が自己免疫疾患には伴い、その一方で、ガン発達はおそらくは、免疫系の活性低下に関連づけられる。

著しく異なるＭＡプロフィルが、典型的な健常者ドナー、ガンドナーおよび自己免疫狼瘡ドナーについて得られる増大するグルコース濃度について得られた（図１３）。

本発明はその特定の実施態様によって説明してきたが、多くの別法、変更および変形があることは当業者には明らかであることは明白である。従って、本発明は、本願の請求項の精神と広い範囲の中に入るこのような別法、変更および変形すべてを包含するものである。

本明細書で挙げた刊行物、特許および特許出願はすべて、個々の刊行物、特許および特許出願が各々あたかも具体的にかつ個々に引用提示されているのと同程度に、全体を本明細書に援用するものである。さらに、本願で引用または確認したことは本発明の先行技術として利用できるという自白とみなすべきではない。節の見出しが使用されている程度まで、それらは必ずしも限定であると解釈されるべきではない。

Claims (15)

1. 非病原性免疫細胞の代謝活性（ＭＡ）を測定する方法であって、非病原性免疫細胞の細胞外環境において、
   （ｉ）不揮発性の可溶性代謝生成物および揮発性の可溶性代謝生成物；
   （ｉｉ）不揮発性の可溶性代謝生成物；ならびに
   （ｉｉｉ）揮発性の可溶性代謝生成物
   の分泌に起因する時間依存的な酸性化プロフィルを独立して測定すること
   を含み、前記（ｉｉ）の酸性化プロフィルの測定が空気暴露チャンバで行われ、前記（ｉ）の酸性化プロフィルの測定が空気封止チャンバで行われ、前記（ｉｉｉ）の酸性化プロフィルを測定することが、前記（ｉ）の酸性化プロフィルから前記（ｉｉ）の酸性化プロフィルを控除することによって行われ、前記時間依存的な酸性化プロフィルの少なくとも１つにより、非病原性免疫細胞の代謝活性が示される方法。
2. 非病原性免疫細胞の代謝活性（ＭＡ）を測定する方法であって、細胞の細胞外環境において、
   （ｉ）不揮発性の可溶性代謝生成物および揮発性の可溶性代謝生成物；
   （ｉｉ）不揮発性の可溶性代謝生成物；ならびに
   （ｉｉｉ）揮発性の可溶性代謝生成物
   の分泌に起因する時間依存的な酸性化プロフィルを独立して測定すること
   を含み、前記（ｉｉ）の酸性化プロフィルの測定が空気暴露チャンバで行われ、前記（ｉ）の酸性化プロフィルの測定が空気封止チャンバで行われ、前記（ｉｉｉ）の酸性化プロフィルを測定することが、前記（ｉ）の酸性化プロフィルから前記（ｉｉ）の酸性化プロフィルを控除することによって行われる方法。
3. 非病原性免疫細胞の代謝活性（ＭＡ）を測定する方法であって、細胞の細胞外環境において、
   （ｉ）不揮発性の可溶性代謝生成物および揮発性の可溶性代謝生成物；
   （ｉｉ）不揮発性の可溶性代謝生成物；ならびに
   （ｉｉｉ）揮発性の可溶性代謝生成物
   の分泌に起因する時間依存的な酸性化プロフィルを独立して測定すること
   を含み、前記（ｉｉ）の酸性化プロフィルの測定が空気暴露チャンバで行われ、前記（ｉ）の酸性化プロフィルの測定が空気封止チャンバで行われ、前記（ｉｉｉ）の酸性化プロフィルを測定することが、前記（ｉ）の酸性化プロフィルから前記（ｉｉ）の酸性化プロフィルを控除することによって行われ、前記揮発性の可溶性代謝生成物の分泌に起因する時間依存的な酸性化プロフィルおよび／または前記不揮発性の可溶性代謝生成物の分泌に起因する時間依存的な酸性化プロフィルにより、細胞の代謝活性が示される方法。
4. 前記細胞外環境は、校正された緩衝能を有する規定された溶液を含む、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
5. 前記非病原性免疫細胞は白血球である、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
6. 前記測定が、ｐＨプローブ、ＣＯ_２プローブおよびＮＨ_３プローブ、ならびに、乳酸プローブからなる群から選択される非毒性の膜不透過性プローブを使用して行われる、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
7. 前記ｐＨプローブはレシオメトリックｐＨプローブを含む、請求項６に記載の方法。
8. 前記不揮発性の代謝産物は乳酸を含む、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
9. 前記揮発性の代謝産物はＮＨ_３およびＣＯ_２を含む、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
10. 前記細胞を前記酸性化プロフィルの測定の前または測定と同時に刺激因子または阻害因子に供することをさらに含む、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
11. 前記刺激因子または阻害因子は細胞を含む、請求項１０に記載の方法。
12. 前記刺激因子または阻害因子は無細胞抗原を含む、請求項１０に記載の方法。
13. 前記細胞を刺激因子または阻害因子に供することはリンパ球を含み、前記刺激因子または阻害因子細胞は、前記リンパ球に関して非同系のリンパ球を含む、請求項１１に記載の方法。
14. 疾患処置を最適化する方法であって、
    （ａ）細胞を含む対象の生物学的サンプルを少なくとも１つの医薬品と接触させること；
    （ｂ）前記細胞の代謝活性を、請求項１〜１３のいずれかの方法に従って測定し、これに対して、同一条件下で調べられた正常な健常な細胞サンプルの代謝活性に向かう、前記細胞の前記代謝活性における変化により、前記疾患のための有効な医薬品が示される方法。
15. 疾患処置を対象においてモニタする方法であって、
    （ａ）前記疾患に対して少なくとも１つの医薬品で処置された対象の生物学的サンプルを提供すること、ただし、前記生物学的サンプルは、対象の細胞を含む；
    （ｂ）前記細胞の代謝活性を、請求項１〜１３のいずれかの方法に従って測定し、これに対して、同一条件下で調べられた正常な健常な細胞サンプルの代謝活性に向かう、前記細胞の前記代謝活性における変化により、前記疾患の有効な処置が示される方法。