KR20140015513A - 트롬빈 센서의 저장 수명의 증가 - Google Patents

Abstract

검출 기능을 갖는 적어도 하나의 물질을 포함하는, 수지층이 도포된 표면을 포함하는 혈액 응고 시간 측정 센서로서, 수지층은 래커 (lacquer) 시스템을 포함하고, 상기 래커 시스템은,
i) 표면 상의 검출 기능을 갖는 적어도 하나의 물질의 고정화에 적합하고;
ii) 음으로 하전된 표면층을 제공하고; 그리고
iii) 비생물학적이고 화학적으로 불활성 및 안정한 화합물들에 의한 생물학적 혈액 응고 촉진제들의 대체를 허용하는 것을 특징으로 하는 혈액 응고 시간 측정 센서.

Description

트롬빈 센서의 저장 수명의 증가{INCREASE IN STORAGE LIFETIME OF A THROMBIN SENSOR}

본 발명은, 비생물학적이고 화학적으로 불활성 및 안정한 합성 화합물에 의해 주요 생물학적 성분을 대체함으로써 증가된 저장 수명을 갖는 혈액 응고 시간 측정 센서에 관한 것이다.

더욱 구체적으로, 본 발명은, 혈액 응고 시간 측정 센서 상에 피착되는 (deposited) 시약 조성물이, 하전된 및/또는 산화환원 활성기를 방출시킴으로써 말단 일부가 트롬빈 효소에 의해 선택적으로 컷오프될 수 있는 화학적 기재를 포함할 때에 암페로메트리 (amperometry) 와 같은 전기분석 방법에 의해 프로트롬빈 시간 (PT; Prothrombin time) 이 결정될 수 있게 하는 혈액 응고 시간 측정 센서에 관련된다.

출혈의 위험을 방지하기 위해 혈액 응고 시간, 즉 응어리 (clot) 를 형성하는 혈액 구성요소들의 적성을 확인하는 것은, 일상적 검진의 부분이 된다. 예를 들어, 심장 질환의 경우에 항응고제들 (anticoagulants) 을 이용한 치료 (treatment) 동안 과다복용의 경우의 출혈의 위험을 회피하기 위해 또는 역으로 항응고제의 투여량이 충분하지 않은 경우의 혈전증 (thrombosis) 의 위험을 회피하기 위해 약의 복용량을 정확하게 조절할 수 있을 필요가 있다.

혈액 응고 캐스케이드는 내인성 경로 및 외인성 경로라는 2개의 경로들을 수반한다. 두 경로들은 복잡하고 많은 상이한 응고 인자들을 수반한다. 따라서, 환자들의 혈액 응고 시간에 대한 값으로서 이른바 "퀵(Quick)" 타임을 측정하기 위해, 종종 구강 항응고 치료의, 일반적으로 복잡한 화학물질이 필요하다. 이 화학물질은 생물학적 근원으로부터 트롬보플라스틴들 (조직 인자들) 과 같은 혈액 응고 촉진제들 및 음으로 하전된 지질 (lipid) 표면을 제공하는 물질들을 일반적으로 포함한다.

이러한 결정을 수행하기 위해 상이한 파라미터들이 보유되어 있지만, 가장 흔한 것은 활성화 이후의 프로트롬빈 시간 (PT), 즉, 환자로부터 취해진 혈액 샘플에서 응어리의 형성이 관찰되기 시작하는 시간의 기간을 측정하는 것이다. 이러한 시험관내 (in vitro) 측정 시스템들에서, 측정 시간을 감소시키기 위한 조직 인자를 함유하는 뇌 염수 추출액 (saline brain extract), "트롬보플라스틴" 및 음으로 하전된 인지질들의 에멀션을 첨가함으로써 응고 시간이 단축될 수 있다.

이러한 종류의 화학물질은 그들 측정 시스템들을 사용하고 제조하는 사람들에게 주지되어 있지만, 특히 자택 간호 (home-care) 혈액 응고 측정 시스템들의 개발은 더 강건한 화학물질의 개발을 촉구하였다.

그리하여, 본 발명의 하나의 목적은, 생물학적 혈액 응고 캐스케이드에 수반되는 불안정한 생물학적 성분들에서 기인하는 이러한 혈액 응고 시간 측정 센서들의 고유 불안정성을 면하는 것이다.

US 6,352,630 에는, 트롬빈 효소에 의해 컷오프되어 산화환원 활성기들을 제공할 수 있는 하나의 말단 링크를 갖는 적어도 하나의 화학적 기재를 포함하는 특정 시약이 고정화되는 경우 전혈 한 방울의 응고 시간을 나타내는 값을 측정하는 전기화학 시스템이 개시되어 있다. 트롬빈에 의한 트롬빈 기재의 소화시에, 하전된 기들이 방출되어 작용 전극으로 이동한다. 방출된 기들의 산화 또는 환원에 의해 생성된 전류가 작용 전극에서 측정되고, 응고 시간을 나타내는 값과 상관된다.

US 6,352,630 에 따른 센서 시스템은 다량의 최적화를 요구한다. 특히 생물학적 혈액 응고 촉진제의 사용은, 매질이 정의된 pH 에서 유지되고 충분한 이온 강도를 갖고 있는, 정의되고 안정한 반응 환경을 요구한다. 또한, 생물학적 혈액 응고 촉진제는 관련 센서의 저장 안정성을 제한하는 특히 가변적이거나 또는 상승된 온도에서 제한된 안정성을 갖는다. 게다가, 생물학적 혈액 응고 촉진제는 그것의 특성들의 일괄 변화를 명백하게 야기하는 천연 자원들로부터 획득된다. 그리하여, 생물학적 혈액 응고 촉진제들을 수반하는 재생 센서들의 최적화 및 제조는 어려움이 있다. US 6,352,630 에는 또한 사용된 조직 인자의 인지질 조성물이 프로트롬빈 시간의 결정에 영향을 미친다는 것이 개시되어 있다. 음의 인지질들의 양이 양의 인지질들의 양보다 더 큰, 역 PS/PC 비를 갖는 인지질들을 가진 조직 인자가, 신호 (신호 높이 및 신호의 선형성) 의 더 양호한 결정을 가능하게 한다. 이러한 복잡한 화학물질의 결점들, 즉, 시스템 내에 혈액 응고 촉진제들로서 생물학적 화합물들을 가질 필요가 있다는 것은 자명하다.

특히 환자들의 혈액 응고 시간의 측정에 대한 자택 간호 시스템들의 개발은, 센서 화학물질이 가능한 한 강건할 것을 요구하므로, 저장 기간들과 같은 인자들의 감시는 덜 중요하게 되고, 온도 및 습도와 같은 저장 조건들은 더 이상 필수적이지 않다. 종래 기술에 기재된 혈액 응고 시간 측정 시스템들은 일반적으로 4 ℃ 에서의 저장을 필요로 하며, 그들의 저장 기간은 일반적으로 1 년보다 휠씬 더 많이 초과할 수 없다. 이러한 저장 조건들은 물론 또한 언컷 (uncut) 냉각 체인에서의 이러한 센서들의 분배를 암시한다. 추가적으로, 센서 제작 동안 생물학적 혈액 응고 촉진제의 통합으로 인해, 센서 제조 프로토콜들은 상승된 온도들, 유기 용매들 및 급속한 건조를 회피해야 한다. 최종적으로 생물학적 재료들의 사용은 제조 프로세스 동안 많은 센서들의 개별 캘리브레이션에 대한 절대적인 필요성을 가지게 하며, 그 이유는 생물학적 물질들이 서로 동일하지 않기 때문이다. 생물학적 근원으로부터의 모든 재료의 전체 제거의 경우에, 저장을 위한 컨디셔닝 요건들 및 최대 저장 시간 둘다는 그 자체가 휠씬 덜 임계적이게 된다.

이상의 이유 때문에, 종래 기술에 개시된 혈액 응고 시간 측정 센서의 결점들을 극복할 수 있고 혈액 응고 시간의 측정에 대한 자택 간호 시스템에서의 사용에 적합한 시스템에 대한 필요성이 존재하였다. 본 발명에 의해 대처되는 과제는 증가된 저장 수명을 갖는 혈액 응고 시간 측정 센서를 제공하는 것이었다.

표면들 상의 검출 엘리먼트들의 고정화는, US 3,839,175, Strike 등, Biosens. Bioelectron., 10 (1995) 61-66 및 Schuhmann, Mikrochim. Acta, 121 (1995) 1-29 각각에 개시된 바와 같이 폴리머 필름에서의 흡수, 가교 또는 포함에 의해 영향을 받을 수 있다. 검출 엘리먼트들은, 예를 들어 EP-A0691408 에 개시된 바와 같은 라디칼 중합, McGall 등, J.Am.Chem.Soc., 119 (1997) 5081 에 개시된 바와 같은 리소그래픽 방법들, 또는 G.F. Khan, Electroanalysis, 9 (1997) 325-329 에 개시된 바와 같은 프린팅 방법들에 의해 표면 상에 피착되는 매트릭스에 일반적으로 매립된다.

US2003/0153061 에는 센서 표면들 상에 검출 엘리먼트들을 고정화하기 위한 보다 다양한 전착 (electro deposition) 방법의 사용이 개시되어 있다. US2003/0153061 로부터, 또한 효소들의 고정화를 위해 통조림통들 (food cans) 의 내부에서의 보호층으로서 사용되는 종류의 층들의 전착을 위한 다양한 종류들의 전기-중합가능한 래커들 (lacquers) 을 사용함으로써, 그들의 효소 활성을 보존하는 것이 가능하다는 것이 공지되어 있다.

이러한 방법에 대한 다른 예들은 Shkotova 등 (2006), Material Science and Engineering, Volume 26, Issues 2-3, 411-414 에서 주어지며, 여기서 에탄올 검출을 위한 암페로메트릭 (amperometric) 센서가 개시되어 있다. 알코올 산화효소가 레시드롤 (resydrol) 래커 필름 내의 센서 표면 상에 전기화학적으로 피착된다. Smutok 등 (2005), Biosensors and Bioelectronics Volume 20, 1285-1290 에는 애노딕 전착 레시드롤 래커들와 같은 전착 래커들을 이용한 플라보시토크롬 b₂ 의 전착이 개시되어 있다. Ngounou 등 (2004), Electrochimica Acta, Volume 49, 3855-3863 에 의한 다른 예에서는, 암페로메트릭 바이오센서들에 대한 고정화 매트릭스로서의 아크릴산계 폴리머들의 라이브러리의 조합적 합성 및 그들의 평가가 개시되어 있다.

본 발명에 있어서, 하나의 목적은 US 6,352,630 에 개시된 바와 같이 암페로제닉 (amperogenic) 트롬빈 기재의 고정화를 가능하게 하는 상기 기재된 바와 같은 래커 시스템을 개발하는 것이었다.

본 발명의 다른 목적은 상기 래커 재료를 통해 동시에 혈액 응고 캐스케이드가 진행하는 요건으로서 언급된 바와 같은 음으로 하전된 표면을 제공하는 것이다.

본 발명의 목적은 증가된 저장 수명을 갖는 개선된 센서를 제공함으로써 종래 기술의 혈액 응고 시간 측정 시스템들에 존재하는 결점들을 극복하는 것이다.

그리하여 본 발명은, 검출 기능을 갖는 적어도 하나의 물질을 포함하는, 수지층이 도포된 표면을 포함하는 혈액 응고 시간 측정 센서로서, 수지층은 래커 시스템을 포함하고, 상기 래커 시스템은,

i) 표면 상에 검출 기능을 갖는 적어도 하나의 물질의 고정화에 적합하고;

ii) 음으로 하전된 표면층을 제공하고; 그리고

iii) 비생물학적이고 화학적으로 불활성 및 안정한 합성 화합물들의 통합에 의한 생물학적 혈액 응고 촉진제들의 대체를 허용하는 것을 특징으로 하는 혈액 응고 시간 측정 센서에 관련된다.

본 발명에 따르면, 비생물학적이고 화학적으로 불활성 및 안정한 화합물들에 의한 혈액 응고 캐스케이드의 주요 생물학적 성분들의 대체를 통해 증가된 저장 수명이 달성된다. 동시에, 이러한 시스템의 측정 시간은, 혈액 응고 촉진제들로서 기능하는 생물학적 화합물들에 기초한 센서들과 비교할 때에 크게 연장되지 않는다.

본 발명에 따르면, 센서 표면 상에 고정되기에 적합한 수지층은, 혈액 응고 시간을 측정할 때에 센서의 기능을 손상시키지 않고 비생물학적이고 화학적으로 불활성 및 안정한 합성 화합물들에 의한 주요 생물학적 성분들의 대체를 허용한다.

바람직하게는, 상기 비생물학적이고 화학적으로 불활성 및 안정한 합성 화합물들은 수지 자체에 의해 형성되고, 수지는 적합한 음으로 하전된 측사슬들을 그것의 폴리머 백본에 도입함으로써 그 자신이 음으로 하전되도록 설계될 수 있다.

본 발명의 다른 실시형태에 있어서, 음으로 하전된 표면층은, 래커 시스템 내에 통합되는 비생물학적이고 화학적으로 불활성 및 안정한 화합물들에 의해 제공된다. 음으로 하전된 재료들은 상기 언급된 트롬빈 기재와 함께 수지 내부에 공동 고정화될 수 있다. 이들 상기 비생물학적이고 화학적으로 불활성 및 안정한 화합물들은, 벤토나이트, 키에젤구어 (Kieselgur), 또는 산화된 탄소 나노튜브들과 같이 음으로 하전된 다른 첨가제들과 같은 음으로 하전된 점토 재료들로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.

본 발명의 바람직한 실시형태에 있어서, 상기 래커 시스템은 비전도성 애노딕 전착 래커를 포함하고, 바람직하게는 상기 래커는 다양한 모노머 조성을 갖는 음으로 하전된 아크릴산계 전착 폴리머들로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 상기 래커 시스템은 pH 값을 변화시킬 때에 덜 가용성이 되게 된다. pH 값을 증가시킬 때에 덜 가용성이 되는 래커 시스템들은 캐소딕 전착 폴리머들이라고 불리며, 한편 pH 값을 감소시킬 때에 덜 가용성이 되는 래커 시스템들은 애노딕 전착 폴리머들이라고 불린다.

본 발명의 일 실시형태에 있어서, 검출 기능을 갖는 적어도 하나의 물질은, 효소에 의해 컷오프되어 자유 확산 산화환원 활성 화합물을 제공할 수 있는 하나의 말단 링크를 갖는 적어도 하나의 화학적 기재를 포함하는 특정 시약을 포함하고, 바람직하게는, 상기 효소에 의해 컷오프되어 산화환원 활성 화합물을 제공할 수 있는 하나의 말단 링크를 갖는 화학적 기재 시약은 암페로제닉 트롬빈 기재이고, 효소는 트롬빈이다.

본 발명은 이러한 혈액 응고 측정 센서를 제조하는 방법을 또한 포괄한다.

바람직한 실시형태에 있어서, 이 방법은 표면 상에 래커 시스템을 포함하는 수지층을 피착하는 단계 및 표면 상의 수지층을 건조에 의해 고정시키는 단계를 포함한다.

도 1 은 본 발명의 센서를 사용하여 샘플에서의 혈액 응고 시간을 측정하는 측정 장치의 사시도이다.
도 2 는 센서의 전극들에 걸쳐 전류가 생성되는 것을 허용하는 화학 반응을 나타내는 US6352630 에 이미 나타낸 바와 같은 개략도이다.
도 3a 내지 도 3d 는 센서 표면 상의 피착 용액의 고정화 방법들의 비교이다. Thromborel 이 없을 때의 전착 대 건조. 도 3a 는 10개의 피착 펄스들을 이용한 폴리머 석출; 도 3b 는 건조에 의한 폴리머 석출; 도 3c 는 전착에 대한 측정 결과; 도 3d 는 건조에 대한 측정 결과이다.
도 4a 및 도 4b 는 피착 용액이 전착에 의해 그리고 간단한 건조에 의해 센서 표면 상에 고정화된 경우 센서들의 1개월 저장 안정성의 비교이다.
도 5a 및 도 5b 는 소량의 탄소 나노튜브들의 첨가에 의해 제조된 센서들이다.
도 6a 및 도 6b 는 증가된 양의 음으로 하전된 탄소 나노튜브들의 존재시에 제조된 센서들이다.

본 발명은 혈액 응고 시간 측정 센서에 관한 것이다. 도 1 에 나타낸 측정 장치는, 본 발명에 따른 혈액 응고 시간 측정 센서가 샘플에서의 혈액 응고 시간을 측정하기 위해 사용될 수 있는 셋업의 일례를 나타낸다. 이 측정 장치는 US 6,352,630 으로부터 공지되어 있다.

측정 장치 (1) 는 2개의 성형된 플라스틱 엘리먼트들 (4a 및 4b) 을 어셈블리함으로써 구성된 케이스 (3) 를 포함하는데, 그 엘리먼트들 중의 상부 엘리먼트 (4a) 는 디스플레이 패널 (5) 을 위한 윈도우, 및 다양한 디스플레이 모드들에 대한 액세스를 허용하는 제어 버튼 (6) 을 위한 개구부를 포함한다.

케이스 내에 포함된 전자 회로는, 예를 들어 앞서 나타낸 바와 같은 암페로메트리에 의한, 포도당 분석을 위해 사용되는 회로들의 개작이고, 포도당 분석을 위해 사용되는 회로들과는 응고 시간을 디스플레이하기 위해 상이한 전기 신호 파라미터들만이 다르다.

측정 장치 (1) 는 실질적으로 케이스 (3) 의 2개의 부분들 (4a, 4b) 사이에 배치된 슬릿 (7) 을 또한 포함하며, 슬릿 내로 콘택트 존 (8) 을 포함하는 센서 (2) 의 일부가 도입된다. 혈액 샘플을 수용하도록 의도된 측정 존 (9) 을 포함하는 센서 (2) 의 다른 부분은, 전체 측정 시간 동안 장치 (1) 외부에 유지될 것이다. 종래 기술의 대부분의 측정 장치들에 있어서, 샘플은 37 ℃ 로 일반적으로 열조절된 외장체 내의 장치 내부로 도입되어, 추가적인 전력 소비를 야기한다.

샘플이 열조절된 외장체 내로 도입되지 않는 본 발명에 따른 시스템에 있어서, 필요에 따라 슬릿 (7) 에 근접하여 장치 상에 히트 프로브 (10) 를 제공하여 주변 온도에 따라 전기 신호 파라미터들을 조절하는 것이 용이하며, 외장체를 열조절하는데 필요한 것보다 휠씬 더 낮은 전력 소비를 갖는다.

센서 (2) 는, 작은 스페이스 (14) 에 의해 분리된 2개의 집전체들 (12, 13) 을 전체 길이에 걸쳐 지지하는, 예를 들어 PET 로 제작된 얇은 플라스틱 지지체 (11) 를 포함하며, 작은 스페이스는 2개의 집전체들을 전기적으로 절연시킨다.

지지체 (11) 및 집전체들 (12, 13) 은 절연 코팅 (15) 으로 코팅되며, 절연 코팅 내로 각각의 단부에 가깝게 2개의 윈도우들 (8, 9) 이 잘라내져, 집전체들 (12, 13) 의 일부들이 나타나게 한다. 제 1 윈도우 (8) 는 센서 (2) 가 측정 장치 (1) 에 전기적으로 접속되는 것을 허용하고, 한편 제 2 윈도우 (9) 는 측정 존, 다시 말해 작용 전극 (16) 및 기준 전극 (17) 을 각각 형성하는 가시적인 집전체 부분들을 구성한다.

작용 전극 (16) 은 예를 들어 백금의 얇은 스트립을 적층함으로써 제작되며, 기준 전극 (17) 은 후속하여 염소처리된 은의 얇은 스트립을 적층함으로써 제작되어 동시에 기준 전극을 형성한다. 측정 존 (9) 에 작용 전극, 기준 전극 및 카운터 전극을 별도로 제공하는 것이 또한 가능하다. 작용 전극은 이후 더욱 상세하게 기재되는 특정 시약 (18) 으로 코팅되어 프로트롬빈 시간 (PT) 이 측정되는 것을 허용한다.

센서 상에 피착되는 본 발명의 시약 조성물은, 하전된 및/또는 산화환원 활성기를 방출시킴으로써 트롬빈 효소에 의해 말단 일부가 선택적으로 컷오프될 수 있는 화학적 기재를 포함한다.

적합한 기재들 및 기재들의 그룹들은 앞서 US 6,352,630 에 그리고 특히 US 6495336 에 기재되어 있다.

US6352630 에 기재된 바와 같이, 적합한 올리고펩타이드 기재들은, 이탈기 (LG; leaving group) 라고 일반적으로 지정되는 하전된 말단 부분의 컷오프를 허용하는 트롬빈 효소의 부위의 입체특이적 구성을 갖는다. 사용된 기재는, 올리고펩타이드 유도체 또는 그 염들 중 하나가, 아르기닌에 더하여, 2-아미노부티르산 (Abu), 알라닌 (Ala), 3-시클로헥실알라닌 (Cha), 2-시클로헥실글리신 (Chg), 페닐알라닌 (Phe), 피페콜산 (Pip), 프롤린 (Pro), 발린 (Val) 및 글리신 (Gly) 중에서 선택된 적어도 하나의 다른 라디칼 아미노산을 포함하고, 상기 아미노산들은 L, D 또는 DL 형태로 존재할 수 있는 것을 특징으로 한다.

마찬가지로, 본 발명의 조건들에서, 아르기닌 (Arg) 의 산 작용부와 용이하게 반응하여야 하고, 트롬빈에 의해 컷오프될 수 있어야 하고, 충분한 전하를 가져야 하는 이탈기 (LG) 는, 치환될 수도 있는, 할로겐, 히드록시, 아미노, 니트로, 알킬, 알콕시, 알카노일, 아닐리노 및 아미노페닐 라디칼 중에서 선택되는 하나 이상의 치환기들에 의해 가능한 한 치환된 아닐린, 퀴놀릴아민 및 나프틸아민 유도체들로부터 선택되는 것이 바람직하다.

올리고펩타이드는 이탈기 (LG) 를 포함하는 단부에 대해 그 사슬의 대향 단부를 통해 작용 전극 상에 고정화된다. 따라서, 올리고펩타이드 사슬의 제 1 아미노산, 바람직하게는 그 말단 아미노 작용부의 수소는, Boc (터부톡시카르보닐), Tos (파라톨루엔술포닉), t-Bups (터부틸페닐술포닐), Mes (메틸술포닐), Naps (2-나프틸술포닐), Bzo (벤조일), Z (벤질옥시카르보닐), 이소프로필술포닐, 캠포술포닐산들 중에서 선택되는 보호기 (R) 에 의해 대체된다.

바람직한 실시형태에 따르면, 이탈기 뿐만 아니라, 보호기, α-아미노산들 및 그들의 사슬 형성은, 하기 올리고펩타이드 기재들:

Z-Gly-Pro-Arg-3-클로로-4-히드록시아닐리드

Tos-Gly-Pro-Arg-3-클로로-4-히드록시아닐리드

Boc-(D)-Chg-Gly-Arg-3-클로로-4-히드록시아닐리드

H-(D)-Chg-Gly-Arg-3-클로로-4-히드록시아닐리드

Z-Gly-Pro-Arg-2- 클로로-4-히드록시아닐리드

및 그들의 상용성 무기 또는 유기 염들

을 갖도록 선택된다.

특정 시약의 조성물에서의 올리고펩타이드들은, 예를 들어 염산 (HCl), 아세트산 또는 트리플루오로아세트산 (TFA) 을 이용하여 형성되는, 그들의 염들 중 하나의 형태로 일반적으로 사용된다.

도 2 는, 전자 검출 회로 (도시하지 않음) 에 의해 접속되는 전극들 (20 및 21) 에 걸쳐 전류가 생성되는 것을 허용하는 화학 반응을 나타내는 US6352630 에 이미 나타낸 바와 같은 개략도이다. 식 R1-AA2-AA1-Arg-LG (여기서 AA1 및 AA2 는 앞서 나타낸 바와 같은 다른 아미노산들을 나타낸다) 에 의해 개략적으로 나타내질 수 있는 기재는, 기 (R1) 에 의해 작용 전극 (20) 에 접속되고, 기 (R1) 은 올리고펩타이드를 배향시키며, 그 사슬의 다른 단부는 앞서 정의된 바와 같은 이탈기 (LG) 를 포함한다. 이 도면의 왼쪽 부분에서, 트롬빈 효소가 아르기닌과 상기 이탈기 (LG) 사이의 연결을 선택적으로 컷오프하는 것을 알 수 있다. 이 도면의 오른쪽 부분에서, 방출된 이탈기는 전극 (21) 을 향해 이동할 수 있고 방출된 이탈기들 (LG) 의 수 및 그에 따라 샘플에 형성된 트롬빈의 양에 비례할 것인 전류를 생성할 수 있다는 것을 알 수 있다.

US 6495336 에 이미 기재된 바와 같이 본 발명의 센서에 사용하기에 다른 적합한 트롬빈 기재들은:

하기 식 (I) 의 올리고펩타이드 유도체들

여기서

R¹ 은

(a) 수소 원자, ω 위치에 아미노기를 선택적으로 갖는 C_{2 -8}-알카노일기, 페닐 라디칼이 p 위치에서 아미노기에 의해 선택적으로 치환되는 페닐-C_{2 -4}-알카노일기; 또는

(b) 4 위치에서 아미노메틸 라디칼에 의해 선택적으로 치환되는 시클로헥실카르보닐기, o 또는 p 위치에서 메틸, 아미노 또는 할로겐에 의해 선택적으로 치환되는 벤조일기, C_{1 -8}-알콕시카르보닐기, p 위치에서 메톡시, 메틸 또는 염소에 의해 선택적으로 치환되는 벤질옥시카르보닐기; 또는

(c) 식 -SO₂-R⁵ 의 라디칼 (여기서 R⁵ 는 C_{1 -6}-알킬 라디칼, 선택적으로 치환된 아릴 또는 헤테로아릴 라디칼 또는 2고리형 테르펜 유도체의 라디칼일 수 있다); 또는

(d) 식 -CO-CH(R⁶)-NH-R⁷ 의 기 (여기서 R⁶ 은 수소, C_{1 -6}-알킬 라디칼, 1- 또는 2-히드록시에틸 라디칼, 메틸메르캅토에틸 라디칼, 아미노부틸 라디칼, 구아니디노프로필 라디칼, 카르복시-C_{1 -4}-알킬 라디칼, 카르복사미도-C_{1 -4}-알킬 라디칼, 페닐 라디칼이 OH, 할로겐, C_{1 -4}-알킬 또는 메톡시에 의해 선택적으로 치환되는 페닐-C_1-4-알킬 라디칼, 또는 고리가 OH, 할로겐, C_{1 -4}-알킬 또는 메톡시에 의해 선택적으로 치환되는 시클로헥실 또는 시클로헥실메틸 라디칼, 또는 헤테로고리 시스템에 3 내지 8개의 탄소 원자들을 갖는 질소 함유 헤테로아릴-C_{1 -4}-알킬 라디칼이고, 여기서 기 -CO-CH(R⁶)-NH-R⁷ 은 라세미산에서 얻을 수 있거나 또는 D 또는 L 구성을 가질 수도 있고, R⁷ 은 타입 (a), (b) 또는 (c) 의 기일 수 있다); 또는

(e) 하기 식의 기

(여기서 R⁷ 은 상기 의미를 가지며, m 은 1 또는 2 일 수 있고, 메틸렌기들 중 하나는 히드록실, 카르복실, C_{1 -4}-알킬 또는 아릴-C_{1 -4}-알킬에 의해 치환될 수 있다) 이고;

R² 는 수소, C_{1 -6}-알킬, C_{1 -2}-히드록시알킬, C_{1 -4}-알콕시-C_{1 -6}-알킬, 벤질옥시-C_1-2-알킬, ω-카르복시-C_{1 -3}-알킬 라디칼, ω-C_{1 -4}-알콕시카르보닐-C_{1 -3}-알킬 라디칼, ω-벤질옥시카르보닐-C_{1 -3}-알킬 라디칼 또는 시클로헥실, 시클로헥실메틸, 4-히드록시시클로헥실메틸, 페닐, 벤질, 4-히드록시벤질 또는 이미다졸릴-4-메틸 라디칼이고;

R³ 은

(a) 수소 또는 C_{1 -4}-알킬이고 R^3' 은 수소이고; 또는

(b) R^3' 와 함께 트리- 또는 테트라메틸렌기 (여기서 메틸렌기들 중 하나는 히드록실, 카르복실, C_{1 -4}-알킬 또는 아릴-C_{1 -4}-알킬에 의해 치환될 수 있다) 이며;

R⁴ 는

(a) 하기 식의 아닐린 잔기

(여기서 R⁸ 은 히드록실 또는 아미노일 수 있고, R⁹ 는 수소, 할로겐, 아미노, 니트로, C_{1 -4}-알킬, C_{1 -4}-알콕시 또는 C_{1 -4}-알카노일일 수 있다); 또는

(b) 하기 식의 퀴놀린 잔기

(여기서 R¹⁰, R¹¹ 및 R¹² 중 하나는 -NH 기이며, -NH 기를 통해 퀴놀린 잔기가 Arg 잔기에 링크되며, R¹⁰, R¹¹ 및 R¹² 중 다른 하나는 히드록실 또는 아미노일 수 있고, R¹⁰, R¹¹ 및 R¹² 중 또 다른 하나는 수소, 히드록실 또는 아미노일 수 있다);

및 그 염들이다.

이들 올리고펩타이드 유도체들은, 혈액 응고 시스템의, 섬유소용해 (fibrinolytic) 시스템의 및 보완물의, 특히 트롬빈의, 펩티드 가수분해 효소 클래스 (E.C. 3.4.) 의 효소들, 특히 단백질가수분해효소 (E.C. 3.4.21-99) 및 그것의 저해제들에 의해 쪼개진다. 그리하여 이들은 복합 샘플 액체들, 특히 모세관 혈액에서, 상기 언급된 효소들, 특히 트롬빈의 정량적 및 정성적 결정을 위한 기재들로서 작용한다.

US6352630 에 자세하게 기재된 바와 같이, 트롬보플라스틴과 같은 생물학적 인자는, 프로트롬빈 시간을 측정할 수 있도록 하기 위해 트롬빈캐스케이드가 진행하게 허용할 필요가 있다.

대조적으로, 본 발명은 혈액 응고 캐스케이드의 주요 생물학적 성분들이 비생물학적이고 화학적으로 불활성 및 안정한 화합물들에 의해 대체되는 원리에 기초한다. 따라서, 본 발명의 특정 시약 혼합체는, 트롬보플라스틴을 함유하지 않으며, 그 대신에 한편으로 상기 기재된 바와 같이 암페로제닉 트롬빈 기재의 고정화를 허용하고 동시에 혈액 응고 캐스케이드가 진행하는 요건으로서 언급된 바와 같은 음으로 하전된 표면을 제공하는 래커 재료를 함유한다. 본 발명은, 놀랍게도 혈액 응고를 개시하기 위해 이러한 시약 혼합체에 추가적인 생물학적 인자들이 요구되지 않는다는 것을 나타낸다.

바람직하게는, 상기 비생물학적이고 화학적으로 불활성 및 안정한 합성 화합물들은 수지 자체에 의해 형성되고, 수지는 적합한 음으로 하전된 측사슬들을 그것의 폴리머 백본에 도입함으로써 그 자신이 음으로 하전되도록 설계될 수 있다.

이러한 이점들을 제공하고 본 발명의 센서에 사용하기에 적합한 래커 재료들은 US2003/0153061 에 기재되어 있다. 본 발명의 시약 혼합체는 기재 표면 상에 피착되는 애노딕 전착 래커들을 포함한다.

기재 표면 상에 본 발명의 시약 혼합체를 피착하기 위해 상이한 방법들이 사용될 수 있다. 예를 들어 센서는 마이크로피펫을 사용하여 수동으로 디스펜싱함으로써, 마이크로펌프 및 위치조절가능한 시린지를 사용하여 자동으로 디스펜싱함으로써, 트롬빈 기재 및 첨가제들의 존재시에 전착 래커의 전기화학적으로 유도된 피착에 의해, 피착 용액의 적하 코팅에 이어서 건조함으로써, 또는 피에조스포팅 (piezospotting) 에 의해 제작될 수 있다.

본 발명의 바람직한 실시형태에 있어서, 방법은 표면 상에 래커 시스템을 포함하는 수지층을 피착하는 단계 및 표면 상의 수지층을 건조에 의해 고정시키는 단계를 포함한다. 이러한 간단한 방법이 실시예 3 그리고 도 3 및 도 4 에 나타낸 바와 같이 고도로 안정한 센서들을 제조하기에 적합하다는 것이 실험들로부터 드러났다. 주요 이점은 이러한 매우 고도로 효과적인 방법의 간단함이다.

본 실시예들에 사용된 바와 같은 다른 방법은 전착 래커링의 방법이며, 이 방법은 자동차 샤시와 부품들, 라디에이터들 및 음료캔들에서의 부식에 대한 보호를 위해 산업적으로 사용된다. 애노딕 전착에서, 애노드에서의 물의 분해에 의해 방출된 양성자들이 가용성 폴리머를 중화시켜 석출시키는데 사용되어, 카르복실레이트기들 때문에 음으로 하전된다. 그 후 그 필름이 표면 상에 가교되어 불투과성 코팅을 형성하여, 큰 기계적 및 화학적 내성을 갖게 된다.

전착을 위해, 본 발명의 시약 혼합체는 전착에 적합한 수지를 함유한다. 타겟 전극의 표면에서의 양성자들의 생성 때문에, 수지 피착물들이 생성되어, 시약 혼합체에 동시에 존재하는 임의의 분자들 또는 화합물들을 혼입시키고 이에 따라 고정화시킨다.

애노딕 전착에 적합한 임의의 공지된 수지 에멀션들이 수지 에멀션으로서 사용될 수 있다. 그 중에서도, 이들로는 300 내지 50000; 600 내지 30000; 1000 내지 20000; 800 내지 10000; 1000 내지 15000 범위의 보다 고분자량의 유기 화합물들이 있지만, 또한 그들이 용해되거나 또는 에멀션화될 수 있는 한, 이미 주어진 값들으로부터 50000, 70000, 100000, 250000 또는 심지어 1000000 에 이르는 보다 고분자량들의 유기 화합물들이 있고, 특히 구성요소 모노머들 상의 작용기들에 의해 생성되는 이온 성질의 전하를 갖는 수지들이 있다. 예들로는 변성된 폴리스티롤류, 올레핀류, 폴리아미드류 그리고 비닐 및 아크릴 화합물들이 있지만, 또한 단백질류, 작용기들을 갖는 다당류들, 식물성 검들 (vegetable gums), 올리고 및 폴리뉴클레오티드류와 같은 생물학적으로 관심있는 폴리머들이 있다. α, β-올레핀성 불포화 카르복실산 폴리머들이 특히 애노딕 피착에 대해 자체를 입증했다.

애노딕 전착에 대해 사용된 수지 에멀션을 위한 바람직한 수지는, 카르복실기, 마스킹된 이소시아네이트기들, 히드록실 및 에테르기들을 함유하는 공중합체에 기초한 수지 조제물이고, 이는 암모니아 또는 유기 염기에 의한 적어도 부분적인 염 형성에 의해 물에 용해되거나 또는 확산될 수 있으며, 여기서 공중합체는 중합된 하기 성분:

1. 3 내지 5개의 탄소 원자들을 갖는 적어도 하나의 α,β-올레핀성 불포화 카르복실산 또는 3 내지 5개의 탄소 원자들을 함유하는 α,β-올레핀성 불포화 디카르복실산의 하프 에스테르;

2. CH-, OH- 또는 NH-활성 마스킹 수단으로 마스킹된 N(1-알케닐) 이소시아네이트의 10 내지 35 중량%;

3. 3 내지 5개의 탄소 원자들을 함유하는 올레핀성 불포화 알코올과, 380 과 3500 사이의 분자량을 갖는 에피클로르히드린 및 비스페놀 A 에 기초한 에폭시드 수지의 부가물의 20 내지 50 중량%;

4. 공중합될 수 있고, 상기 1. 내지 3. 에서 언급되지 않은 하나 이상의 올레핀성 불포화 화합물들의 5 내지 64 중량%

을 함유하고, 다만, 공중합체는 1000 과 20000 사이의 평균 분자량을 가지며, 공중합체의 산가 (acid number) 가 35 내지 150 mg KOH/g 에 상당하고 상기 1. 내지 4. 에서 언급된 퍼센트의 합계가 100 인 양으로 중합된 성분 (1) 을 포함한다.

상기 언급된 공중합체는 1000 과 20000 사이의 평균 분자량을 갖는다. 성분들은 공중합체의 산가가 35 내지 150 mg KOH/g 에 상당하는 양으로 중합된다. 상기 1. 내지 4. 에서 언급된 퍼센트들의 합계는 100 에 상당한다. 공중합체에서의 성분 (3) 의 반응성 수소 원자들 대 마스킹된 이소시아네이트기들의 당량비가 약 1:1 에 상당하는 것이 바람직하다는 것이 강조되어야 한다. 또한, 비닐이소시아네이트 또는 프로페닐이소시아네이트와, 시클로헥사놀, 터부타놀, 트리아자벤졸 또는 ε-카프로락탐의 부가물이 몰비 1:1 의 이소시아네이트/마스킹 수단으로 사용되는 것이 바람직하다. 특히 공중합체는 성분 (1) 로서 아크릴 또는 메타크릴산, 성분 (2) 로서 ε-카프로락탐으로 마스킹된 비닐이소시아네이트, 성분 (3) 으로서 알릴 알코올과 평균 분자량이 약 900 인 에피클로르히드린 및 비스페놀 A 의 에폭시드 수지의 변환 생성물, 그리고 성분 (4) 로서 중합된 2-에틸헥실아크릴레이트 또는 부틸아크릴레이트를 함유한다.

수용성 수지류 (resin-like) 재료와 불수용성 수지류 매스 (mass) 의 혼합물로서 사용되는 수지류 매스가 또한 바람직하다. 이 혼합물은 물이 주요 구성요소인 수계 매질에 분산된다. 수용성 수지류 재료들은 폴리머들이며, 그 폴리머 내로의 충분한 친수성 기들의 혼입을 통해 수용성이 된다. 친수성 기들은 이온성 염 기들, 예를 들어 카르복실산 및 술폰산 염 기들과 같은 음이온성 염 기들, 또는 아민염 기들 및 4급 암모늄염 기들과 같은 양이온성 염 기들일 수 있다. 바람직한 친수성 기들은 음이온성 기들이며, 카르복실산 기들의 염들인 것이 특히 바람직하다. 폴리머가 일반적으로 카르복실산 기들을 이용하여 제조된 후에, 유기 아민 또는 알칼리 금속 수산화물과 같은 수용성 염기 화합물에 의해 중화된다.

이것과 관련하여 "수용성" 이라는 개념은, 물에 가용성이 된 수지류 재료들이, 외부적으로 첨가된 텐시드 (tensids) 의 도움없이, 25% 에 이르는, 통상 1 내지 20 중량% 인 수지 고체 성분을 가지고 분산될 수 있는 것을 의미한다. 용액 또는 분산액은 자주 시각적으로 투명하거나 또는 반투명하게 보이고, 여기서 수지는 분산된 페이즈로 존재하고 0.12 ㎛ 이하인, 통상 0.03 ㎛ 미만인 평균 입자 사이즈를 갖는다. 수용성 수지류 재료들의 평균 입자 사이즈는 광 산란 방법에 의해 결정될 수 있다.

바람직한 보다 저분자량의 수용성 폴리머들은 아크릴 코폴리머들이며, 이들은 음이온 전하, 바람직하게는 카르복실산 염 기, 특히 바람직하게는 유기 아민에 의해 중화된 카르복실산기를 갖는다.

그 중에서도, 보다 저분자량 아크릴 코폴리머들은, α,β-에틸렌성 불포화 카르복실산과 메타크릴산 에스테르 및/또는 아크릴산 에스테르의 공중합에 의해 제조된 폴리머들이고, 일반적으로 C₁-C₈ 알코올의 메타크릴레이트 에스테르를 주요 성분으로 포함하고 C₁-C₈ 알코올의 아크릴레이트 에스테르를 작은 비율로 포함하는 아크릴 폴리머들이 적합하다. 하기 화합물들이 통상의 메타크릴레이트 에스테르류 및 아크릴레이트 에스테르류이다: 에틸 아크릴레이트, 프로필아크릴레이트, 이소프로필아크릴레이트, 부틸아크릴레이트, 이소부틸아크릴레이트, 2차 부틸아크릴레이트, 헥실아크릴레이트, 2-에틸헥실아크릴레이트, 옥틸아크릴레이트, 메틸메타크릴레이트, 프로필메타크릴레이트, 이소부틸메타크릴레이트, 부틸메타크릴레이트, 2차 부틸메타크릴레이트 및 3차 부틸메타크릴레이트.

채용되는 아크릴 폴리머들은 중합된 α,β-에틸렌성 불포화 카르복실산 단위의 0.1 내지 20 중량% 를 함유한다. 사용될 수 있는 α,β-에틸렌성 불포화 카르복실산 모노머들은 메타크릴산, 아크릴산, 이타콘산, 에타크릴산, 프로필아크릴산, 이소프로필아크릴산 및 이들 산들의 동족체들 (homologues) 이다. 메타크릴산 및 아크릴산이 바람직하다. 산의 퍼센트는 아크릴 폴리머에 필요한 산가가 생성되도록 설정된다. 아크릴 폴리머의 산가는 일반적으로 수지 고체 성분의 약 30 내지 100 % 에 상당하는 방식으로 조절되어야 한다. 수용성 아크릴 폴리머들의 수평균 분자량들은 10,000 내지 30,000 범위 내에 있는 것이 바람직하다.

아크릴 폴리머들은, 히드록시알킬아크릴레이트류 또는 히드록시알킬메타크릴레이트류와 상기 언급된 아크릴산 에스테르류의 공중합에 의해 획득되는 히드록실 측기들을 또한 함유할 수 있다. 히드록실기들 측기들은, 아미노플라스트 또는 마스킹된 이소시아네이트를 이용하는 것과 같은, 후속 경화를 위한 장소들을 제공한다. 이용된 아크릴 폴리머의 5 내지 15 중량% 가 히드록시알킬아크릴레이트 또는 메타크릴레이트 에스테르로부터 도출된 것이 바람직하다. 일반적으로, 사용가능한 히드록시알킬아크릴레이트류 및 메타크릴레이트류는 그 알킬기에 1 내지 8 개의 탄소 원자들을 함유하고, 예를 들어 히드록시에틸아크릴레이트, 히드록시프로필아크릴레이트, 히드록시부틸아크릴레이트, 히드록시에틸메타크릴레이트, 히드록시프로필메타크릴레이트, 히드록시부틸메타크릴레이트, 히드록시헥실메타크릴레이트 및 히드록시옥틸메타크릴레이트가 있다.

또한 사용가능한 아크릴 폴리머들의 부분을 형성하기 위해 비닐 공중합가능한 화합물들, 이를테면 스티롤, 비닐톨루올, 아크릴아미드, 비닐크실롤, 알릴 알코올 및 아크릴니트릴이 사용될 수 있다.

특히 적합한 아크릴 폴리머에 있어서, 폴리머는 본질적으로 경질 성분, 즉 스티롤 또는 저급 알킬메타크릴레이트 (여기서 아크릴기는 1 내지 2개의 탄소 원자들을 함유한다), 또는 스티롤과 저급 알킬메타크릴레이트의 혼합물, 이를테면 에틸아크릴레이트; 및 연질 성분, 즉 알킬기에 3 내지 8개의 탄소 원자들을 갖는 저급 알킬메타크릴레이트 또는 알킬기에 2 내지 8개의 탄소 원자들을 갖는 저급 알킬아크릴레이트, 알킬기에 1 내지 4개의 탄소 원자들을 갖는 히드록시 저급 알킬메타크릴레이트 또는 아크릴레이트 및 상기 기재된 바와 같은 α,β-에틸렌성 불포화 카르복실산으로 이루어진다.

수용성 아크릴 수지들뿐만 아니라, 폴리올 및 포화 또는 방향족 폴리카르복실산들로부터 제조된 폴리에스테르류가 보다 저분자량을 갖는 폴리머들에 대해 적합하다. 일반적인 포화 지방족 디카르복실산들은, 이들 폴리에스테르류의 제조에 적합한, 부탄디오산, 아젤라인산 및 아디핀산과 같이 2 내지 10개의 탄소 원자들을 갖는 무수물들이다. 방향족 이염기산들 또는 그들의 무수물들의 예들은 프탈산 및 트리멜리트산이다. 폴리에스테르에 대한 산가는 원하는 산가가 달성되도록 설정되는데, 폴리에스테르에 대해 20 내지 85 이어야 한다. 많은 폴리올류가 상기 언급된 산들에 의해 변환되어 원하는 에스테르류를 제조할 수 있다. 특히 적합한 디올류로는 예를 들어 에틸렌글리콜, 1,4-부탄디올, 네오펜틸글리콜, 소르비톨, 펜타에리트로톨 및 트리메틸올프로판이 있다.

아마인유 (linseed oil) 및 탈롤 (tallol) 과 같은 건조 지방산, 및 글리세린에틸렌글리콜과 같은 다가 알코올의 축합에 의해 제조된, 폴리머 에스테르류와 같은 알키드 수지들이 또한 수용성 폴리머들로서 적합하다. 원하는 산가를 달성하기 위해서 일반적으로 첨가되는 추가 성분으로는, 예를 들어, α,β-에틸렌성 불포화 디카르복실산 또는 그 산의 무수물, 이를테면 말레산 또는 말레산 무수물이 있다.

이들 알키드 수지들은 수평균 분자량 1,000 내지 2,500 및 산가 20 내지 85 를 가져야 하는 것이 바람직하다.

전착을 생성하기 위해 사용될 수 있는 다른 보다 저분자량 카르복실산 폴리머는, 알릴 알코올과 같이 3 내지 10개의 탄소 원자들을 갖는 에틸렌성 불포화 알코올과 스티롤의 폴리머이다. 일반적으로 20 내지 80 범위인 요구되는 산가를 달성하기 위해서, 그 폴리머는 상기 언급되었는 것들과 같은 산 성분에 의해 그리고 건조 지방산들에 의해 또한 변환될 수 있다. 스티롤-알릴-알코올 폴리머들의 수평균 분자량들은 일반적으로 1,000 내지 10,000 범위 내에 있다.

에폭시드 에스테르류가 보다 저분자량의 수용성 수지들로서 또한 적합하다. 이들 재료들은 상기 언급되었는 것들과 같은 일반적인 건조 지방산에 의한 에폭시드 수지의 부분 에스테르화에 의해 획득되며, 이 수지는 그 후 상기 언급되었는 것들과 같은 α,β-에틸렌성 불포화 디카르복실산 또는 그것의 무수물에 의해 에스테르화된다. 에폭시드 수지 자체는 비스페놀 A 와 같은 비스페놀의 폴리글리시딜에테르인 것이 바람직하다.

보다 저분자량의 다른 적합한 수지류 폴리머들의 예들은, 말레산 또는 무수물과 같은 불포화 카르복실산들 및 아미인유와 같은 건조 오일의 중화 생성물들이다.

애노딕 전착을 위한 다른 조성물은, (A) 물 15 내지 60 중량%, (B) 하나 이상의 유기 용매들 15 내지 60 중량%, (C) (a) 물에 혼화되지 않거나 또는 부분적으로 혼화되는 하나 이상의 공중합가능한 α,β-올레핀성 불포화 화합물들 10 내지 75 중량% 및 (b) 하나 이상의 수용성 공중합가능한 N-비닐 화합물들 25 내지 90 중량% 의 코폴리머 0.1 내지 20 중량%, 그리고 (D) 상기 (A), (B) 및 (C) 의 혼합물에 분산된, 하나 이상의 미분된 안료들이나 필러들 또는 안료들과 필러들의 혼합물들 10 내지 79 중량% 를 포함하고, (A), (B), (C) 및 (D) 의 퍼센트의 합계는 100 이다. 특히, 이 중 성분 (C) 는 예를 들어 용매 중합에 의해 제조될 수 있는 코폴리머이다. 이것은 0.1 내지 20 중량%, 바람직하게는 3 내지 8 중량% 의 양으로 사용되며, 공중합가능한 단위들로서 (a) 물에 혼화되지 않거나 또는 부분적으로만 혼화되는 하나 이상의 공중합가능한 α,β-에틸렌성 불포화 화합물들 10 내지 75 중량%, 바람직하게는 20 내지 40 중량% 및 (b) 하나 이상의 수용성 공중합가능한 N-비닐 화합물들 25 내지 90 중량%, 바람직하게는 60 내지 80 중량% 를 함유한다.

(a) 및 (b) 의 퍼센트의 합계는 100 이 된다. 물에 혼화되지 않거나 또는 부분적으로만 혼화되는 바람직한 α,β-에틸렌성 불포화 화합물들 (a) 로는, C₂-C₁₈-모노카르복실산들의 비닐 에스테르류, 예를 들어 비닐아세테이트, 비닐프로피오네이트, 비닐피발레이트, 비닐-2-에틸헥사노에이트 및 비닐스테아레이트 및/또는 C₄-C₁₈-알코올류의 아크릴산 에스테르류 또는 메타크릴산 에스테르류, 예를 들어 부틸아크릴레이트 및 부틸메타크릴레이트, 2-에틸헥실아크릴레이트, 옥틸아크릴레이트 및 옥타데실아크릴레이트가 있다. 특히 바람직한 모노머는 비닐프로피오네이트이다. 물에 용해되지 않거나 또는 약간만 용해되는, 아크릴아미드 또는 메타크릴아미드의 유도체들, 비닐에테르 및/또는 비닐 방향족류 이를테면 스티롤이 또한 적합하다.

바람직한 수용성 N-비닐 화합물들 (b) 의 예들로는 N-비닐피롤리돈, N-비닐피페리돈 및 N-비닐이미다졸이 있다.

본 발명에 따른 바람직한 전착 에멀션들은 래시드롤 (Resydrol) 래커들, 레시드롤 AY 498w/35WA, 레시드롤 AM 410w/67WABG, Cathodip GY83-0270 0005, WA-Tauchlack von FreiLack GmbH, Freitherm-Elektrotauchlack KTL automotive "upgrade", BASF GY80-0636-0001 KM1 로부터 선택된다.

상업적으로 입수가능한 전착 래커 현탁액에 물이 선택적으로 첨가될 수 있으며, 여기서 물은 가능한 한 순수해야 한다. HPLC 품질의 물이 바람직하다. 또한, 수지층들에 일반적으로 첨가되는 임의의 다른 재료들도 사용될 수 있다. 이러한 재료들로는 예를 들어 연화제들, 유화제들, 접착 촉진제들, 소수성 또는 친수성 재료들, 가교제들, 포밍방지제들 등이 있다.

전착 래커 현탁액의 제조 및 조제시에 유화제 또는 가교제의 기능을 주로 발휘하는 적합한 첨가제들은 음이온성, 양이온성 또는 양친매성 (amphophilic) 텐시드, 그 중에서도 비-이오노겐 텐시드 (non-ionogen tensids) 이다. 이와 관련하여, 적합한 시판되는 제품들을 이하에 나열한다:

1. Triton (X-100, X-114, X-405 등): 알킬페닐폴리에틸렌글리콜 (Fluka)

2. Tween (20, 40, 60 등):

Tween 20: 폴리옥시에틸렌소르비탄모노라우레이트 (Merck)

Tween 40: 폴리옥시에틸렌소르비탄모노팔미테이트 (Merck)

Tween 60: 폴리옥시에틸렌소르비탄모노스테아레이트 (Merck)

Tween 65: 폴리옥시에틸렌소르비탄트리스테아레이트 (Merck)

Tween 80: 폴리옥시에틸렌소르비탄모노올레이트 (Merck)

Tween 85: 폴리옥시에틸렌소르비탄트리올레이트 (Merck)

3. Nonidet P40: 옥틸-페닐-폴리에틸렌글리콜 (Fluka)

4. Brij (35, 56, 58 등): (Merck)

Brij 35: 폴리옥시에틸렌라우릴에테르

Brij 56: 폴리옥시에틸렌-(10)-세틸에테르

Brij 58: 폴리옥시에틸렌-(20)-세틸에테르

5. 옥틸 β-글루코시드 (Pierce)

6. 옥틸 β-티오글루코피라노시드 (Pierce)

7. SDS: 소듐라우릴-설페이트 (Fluka)

8. CHAPS: 3-[(3-콜아미도프로필)-디메틸암모니오]-프로판술포네이트 (Fluka)

9. CHAPSO: 3-[(3-콜아미도프로필)-디메틸암모니오]-2-히드록시-프로판술포네이트 (Fluka)

실시예들

실시예 1 : 센서 상의 피착 및 센서 표면 상의 센싱 컴포넌트들의 고정화를 위한 수지층의 제작.

센서들의 형성을 위해 하기 용액들 (#1 내지 #5) 이 제작되었다.

#1. Hepes-버퍼 (50 mM, pH7.4, KCl 100 mM): 90 ml 탈이온수 중의 1.19g HEPES 및 0.75g KCl. pH 값은 NaOH 에 의해 7.4 로 조정되었고, 탈이온수의 체적을 100 ml 로 증가시켰다.

#2. Na-데옥시콜레이트 (deoxycholat) 용액: 1500 ㎕ Hepes 버퍼 (#1) 중의 3.8 mg Na-데옥시콜레이트

#3. 10 ㎕ 포스파티딜세린 (phosphatidylserin) + 35 ㎕ Na-데옥시콜레이트 용액 (#2)

#4. 활성화 용액: 45 ㎕ 용액 #3 + 1080 ㎕ Hepes 버퍼 (#1)

#5. 피착 용액: 0.3 mg 트롬빈 기재 + 890 ㎕ 활성화 용액 #4 (초음파 배쓰에서 5 분) + 30 mg 스펙트럴 콜 (spectral coal), 4 mg 벤토나이트 SF 및 110 ㎕ 레시드롤 AY

센서 표면 상에 추가적인 화합물들을 공동 고정화하기 위해 피착 용액은 변화될 수 있다. 그 경우에, 용액 #5 의 조성물은 트롬빈 기재의 양, 활성화 용액 #4 의 체적 및 레시드롤 AY 의 양에 대해 일정하게 유지되었다. 만약 다르다면 피착 용액의 정확한 조성이 용액 #5 으로부터 각각의 예에 대해 주어진다.

실시예 2: 전착에 의한 센서 표면 상의 센싱 컴포넌트들의 고정화.

센서들을 초음파 배쓰에서 15 분간 이소프로판올로 세정하고, 물로 린싱하고 건조시켰다. 센서 표면 상에 피착 용액 (#5) 50 ㎕ 의 액적을 피펫을 사용하여 투입하고, 홀더에 수평으로 고정시켰다. Ag/AgCl/3 M KCl 기준 전극 및 Pt 와이어 카운터 전극을 액적 내에 삽입하였다. 적어도 2.2 V 의 전위에 대한 전위 펄스들에 의해 개시되는, 작용 전극 표면에서 전착 양성자들이 국부적으로 생성되어야 하기 때문에, 수 산화 (water oxidation) 를 적용한다. 피착 전위에 대한 최대 2초, 우선적으로는 0.5초의 지속기간에 후속하여 1V 미만의 무효 전위, 우선적으로 0V 에서의 적어도 2초, 우선적으로 5초의 휴지 페이즈 (resting phase) 를 갖는 펄스들의 수는 변화될 수 있고, 피착된 래커 필름의 두께가 결정된다. 전위 펄스들의 수는 적어도 1, 보다 양호하게는 적어도 5, 우선적으로 10 과 50 사이의 펄스들이다. 전착 이후에, 센서는 버퍼 용액 (#1) 으로 린싱된다.

실시예 3: 디스펜싱 및 건조에 의해 센서 표면 상의 센싱 컴포넌트들의 고정화

센서들을 초음파 배쓰에서 15 분간 이소프로판올로 세정하고, 물로 린싱하고 건조시켰다. 피착 용액 (용액 #5) 5 ㎕ 를, 피펫을 사용하여 수동으로 또는 시린지 펌프계 디스펜서를 사용하여 자동으로 센서의 작용 전극 상에 피착하였다. 작용 전극의 표면 상에 피착 용액을 배치한 후에, 변성된 센서를 37℃에서 3시간 동안 건조시켰다.

실시예 4: 혈액 응고 시간의 암페로메트릭 결정.

혈액 응고 시간의 결정을 위해, 도 1 에 나타낸 바와 같이 센서를 퍼텐쇼스탯 (potentiostat), 우선적으로 계량기 (meter) 에 접촉시켰다. 피펫을 사용하여, 7 ㎕ 제어 플라즈마 N (N), 제어 플라즈마 P (P) 또는 혈액 (B) 중 어느 것을 건조 센서 표면 상에 적하하였다. 샘플 첨가의 순간에, 전기 회로를 폐쇄하고 +0.3 V 의 작용 전위를 작용 전극에 인가하면서 전류를 동시에 검출한다. 샘플 첨가의 시간은 측정의 제로 지점으로 설정되었다. 시간 경과에 따라 전류를 기록하였고, 트롬빈 기재의 산화 전류를 통해 혈액 응고의 과정을 모니터링할 수 있다. 혈액 응고 동안, 트롬빈 기재는 쪼개지므로, 모바일 산화환원 활성 태그가 전극 표면에 도달하여 인가된 전위에서 산화된다. 전류는 시간에서의 쪼개진 트롬빈 기재 분자들의 수를 나타내므로, 응고와 상관된다.

실시예 5: 고정화 방법들의 비교.

센서들의 제조를 간략화하기 위해서 (실시예 2 에 기재된 바와 같은) 전착 단계를 생략하고 그 대신에 (실시예 4 에 기재된 바와 같은) 센서 표면 상의 피착 용액을 건조만시키는 것이 가능한지의 여부를 테스트하였다. 측정을 위해 도 1 에 나타낸 바와 같은 셋업을 사용하였다. 인가된 전위 펄스 프로파일은 0.2초간 2.2 V 및 5초간 0 V 이었고, 10회 반복하였다. 기재 용액 속에 침지된, 센서의 작용 전극 및 기준 전극과 카운터 전극에 이 전위를 인가하였다. 도 3 에서, 전착 단계를 이용하여 피착 용액을 고정시킴으로써 또는 간단 건조에 의해 제조되었는 센서들에 의한 측정 결과들을 나타낸다.

도 3 은 센서들에 대한 시간 경과에 따른 전류 응답 곡선들을 나타내는데, 도 3a 는 용액 #5 로부터의 10개의 피착 펄스들을 이용한 폴리머 석출 (피착 용액 내에 생물학적 활성화제 Thromborel S 없음) 에 의해 제작된 센서들에 대한 시간 경과에 따른 전류 응답 곡선들을 나타내고; 파선 (a): 플라즈마 N; 점선 (b): 전혈; 검은 선 (c): 플라즈마 P; 도 3b 는 피착 용액 내에 Thromborel S 없이 건조시킴으로써 폴리머 석출에 의해 제작된 센서들에 대한 시간 경과에 따른 전류 응답 곡선들을 나타내고; 파선 (a): 플라즈마 N; 점선 (b): 전혈; 검은 선 (c): 플라즈마 P; 도 3c 는 전착된 센서들에 대한 결과들을 요약한 막대 그래프이고 (200초 후의 전류); 1) 혈액 (n=2); 2) 플라즈마 N (n=9); 3) 플라즈마 P (n=7); 도 3d 는 건조된 센서들에 대한 결과들을 요약한 막대 그래프이다; 1) 플라즈마 N (n=17); 2) 혈액 (n=2); 3) 플라즈마 P (n=14).

실시예 6: 전착 (실시예 2) 에 의해 그리고 건조 (실시예 3 참조) 에 의해 제조된 센서들의 장기 저장성의 비교

센서들을 이러한 센서들을 분배하기 위해 통상 사용되는 바와 같은 플라스틱 튜브 (스크류 캡으로 폐쇄되는 2 cm 직경을 갖는 실린더들) 내에 배치하였다. 이들 용기들은, 0.1 Hz 주파수로 와이핑되고 있는 윕보드 (wip-board) 상에 배치되었고, 33일에 이르는 동안 오른쪽에서 왼쪽으로 그리고 반대로 롤링하도록 허용되었다. 유사하게 제조된 센서들의 다른 세트가 33일에 이르는 동안 37℃ 에서 인큐베이터 내에 배치되었다. 0, 3 및 33일 동안 인큐베이션되거나 또는 요동된 센서들이, 도 1 에 나타낸 바와 같은 셋업을 사용하여 실시예 4 에 기재된 바와 같은 측정을 위해 사용되었다. 도 4 는 상이한 인큐베이션 시간들 이후의 센서들에서 측정된 시간 경과에 따른 전류 그리고 200초 및 350초 후에 측정된 전류 및 이동 전하를 나타낸다.

도 4a) 200초 후의 전류

a) 센서 제작 직후, 플라즈마 N (n=6); b) 센서 제작 직후, 플라즈마 P (n=6); c) 3일 후, 플라즈마 N (n=8); d) 3일 후, 혈액 (n=1); e) 3일 후, 플라즈마 P (n=6); f) 33 일 후, 플라즈마 N (n=5); g) 33일 후, 혈액 (n=4); h) 33일 후, 플라즈마 P (n=2); i) 33일 연속적인 동요 후, 플라즈마 N (n=4); j) 33일 연속적인 동요 후, 혈액 (n=2); k) 33일 연속적인 동요 후, 플라즈마 P (n=2);

■ 피착 용액 #5a: 0.3 mg 트롬빈 기재 + 890 ㎕ 활성화 용액 B (초음파 배쓰에서 15분) + 29.9 mg 스펙트럴 콜, 4 mg 키에젤구어 및 110 ㎕ 레시드롤 AY

도 4b) 200초 및 300초 후의 변화

a) 센서 제작 직후, 플라즈마 N (n=6); b) 센서 제작 직후, 플라즈마 P (n=6); c) 3일 후, 플라즈마 N (n=8); d) 3일 후, 혈액 (n=1); e) 3일 후, 플라즈마 P (n=6); f) 33일 후, 플라즈마 N (n=5); g) 33일 후, 혈액 (n=4); h) 33일 후, 플라즈마 P (n=2); i) 33일 연속적인 동요 후, 플라즈마 N (n=4); j) 33일 연속적인 동요 후, 혈액 (n=2); k) 33일 연속적인 동요 후, 플라즈마 P (n=2);

■ 피착 용액 #5a: 0.3 mg 트롬빈 기재 + 890 ㎕ 활성화 용액 B (초음파 배쓰에서 15분) + 29.9 mg 스펙트럴 콜, 4 mg 키에젤구어 및 110 ㎕ 레시드롤 AY

실시예 7: 음으로 하전된 탄소 나노튜브들의 존재시에 제조된 센서들.

용액 #5c 를 형성하는 피착 용액에 첨가되는, 음으로 하전된 탄소 나노튜브들의 용액 (용액 #6) 을 추가적으로 사용하여 실시예 3 (디스펜싱 및 건조) 에 따라 센서들을 제조하였다:

■ 용액 #6: 15.7 mg 탄소 나노튜브들을 90분간 110℃ 에서 100 ml HNO₃ 중에서 교반하였고; 용액을 여과하였고, 이 나노튜브들을 탈이온수로 세정하였고 80℃ 에서 3 시간 동안 건조시켰다.

■ 피착 용액 #5c: 0.4 mg 트롬빈 기재 + 1000 ㎕ 활성화 용액 #4 (초음파 배쓰에서 15분). 이 용액 445 ㎕ 에, 1 mg 음으로 하전된 나노튜브들 및 55 mg 레시드롤 AY 를 첨가하였다. 이 용액을 초음파 배쓰에서 5분 현탁하였다.

도 5 는 음으로 하전된 탄소 나노튜브들의 존재시에 제조된 센서들에 대해 획득되는 혈액 응고 시간을 나타내고 있다. 도 5a) 실선 (a): 플라즈마 N; 점선 (c): 혈액; 파선 (b): 플라즈마 P. 도 5b) 200초 후 전류: a) 플라즈마 N (n=4); b) 플라즈마 P (n=2); c) 혈액 (n=1).

실시예 8: 증가된 양의 음으로 하전된 탄소 나노튜브들의 존재시에 제조된 센서들.

실시예 7 에 나타낸 바와 같이 음으로 하전된 탄소 나노튜브들의 용액을 추가적으로 사용하여 실시예 3 (디스펜싱 및 건조) 에 따라 센서들을 제조하였지만, 증가된 양의 음으로 하전된 탄소 나노튜브들 (용액 #6) 을, 용액 #5d 를 형성하는 피착 용액에 첨가하였다:

■ 피착 용액 #5c: 0.4 mg 트롬빈 기재 + 1000 ㎕ 활성화 용액 #4 (초음파 배쓰에서 15분). 이 피착 용액 510 ㎕ 에, 6.9 mg 의 음으로 하전된 나노튜브들 및 63.2 ㎕ 레시드롤 AY 를 첨가하였다. 이 용액을 초음파 배쓰에서 5분 현탁하였다.

도 6 은 음으로 하전된 탄소 나노튜브들의 존재시에 제조된 센서들에 대해 획득되는 혈액 응고 시간을 나타내고 있다. 도 6a) 실선 (a): 플라즈마 N; 점선 (c): 혈액; 파선 (b): 플라즈마 P. 도 6b) 200초 후 전류: a) 플라즈마 N (n=4); b) 플라즈마 P (n=2); c) 혈액 (n=1).

Claims (7)

1. 검출 기능을 갖는 적어도 하나의 물질을 포함하는, 수지층이 도포된 표면을 포함하는 혈액 응고 시간 측정 센서로서,
   상기 수지층은 래커 (lacquer) 시스템을 포함하고,
   상기 래커 시스템은,
   i) 상기 표면 상에 상기 검출 기능을 갖는 적어도 하나의 물질의 고정화에 적합하고;
   ii) 음으로 하전된 표면층을 제공하고; 그리고
   iii) 비생물학적이고 화학적으로 불활성 및 안정한 화합물들에 의한 생물학적 혈액 응고 촉진제들의 대체를 허용하는 것을 특징으로 하는 혈액 응고 시간 측정 센서.
2. 제 1 항에 있어서,
   상기 음으로 하전된 표면층은 상기 비생물학적이고 화학적으로 불활성 및 안정한 화합물들에 의해 제공되는, 혈액 응고 측정 센서.
3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
   상기 래커 시스템은 음으로 하전된 아크릴산계 전착 (electrodeposition) 폴리머인, 혈액 응고 측정 센서.
4. 제 3 항에 있어서,
   음으로 하전된 아크릴산계 전착 래커는 레시드롤 (Resydrol) 의 래커 패밀리로부터 선택되는, 혈액 응고 측정 센서.
5. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서,
   상기 수지층은, 벤토나이트, 키에젤구어 (Kieselgur), 또는 산화된 탄소 나노튜브들과 같은 음으로 하전된 다른 첨가제들과 같은 음으로 하전된 점토 재료들을 더 포함하는, 혈액 응고 측정 센서.
6. 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서,
   상기 검출 기능을 갖는 적어도 하나의 물질은, 효소에 의해 컷오프되어 하전된 화합물을 제공할 수 있는 하나의 말단 링크를 갖는 적어도 하나의 화학적 기재를 포함하는, 혈액 응고 측정 센서.
7. 제 6 항에 있어서,
   상기 효소에 의해 컷오프되어 하전된 화합물을 제공할 수 있는 하나의 말단 링크를 갖는 화학적 기재 시약은 암페로제닉 (amperogenic) 트롬빈 기재이고,
   상기 효소는 트롬빈인, 혈액 응고 측정 센서.

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