KR20200038022A - 미각 세포 및 신경 세포를 포함하는 미각 바이오센서 - Google Patents

Abstract

본 발명은 맛을 감지하는 세포 기반의 바이오센서로서 맛 신호에 의해 자극된 미각 세포에서 발생한 신호가 신경 세포를 통해 미세 전극에 전달되어 발생된 전기적 신호를 측정하는 과정을 통하여 생체의 미각 조직과 유사한 미각 감지 효과를 발휘하는 바이오센서 기술을 제공한다.

Description

미각 세포 및 신경 세포를 포함하는 미각 바이오센서 {Taste biosensor comprising gustatory and neuronal cells}

본 발명은 미세 전극 어레이 상에서 배양된 미각 세포와 신경 세포를 이용한 미각 신호 측정용 바이오센서 및 그 제조방법에 관한 것이다.

미각의 기본 맛은 단맛, 짠맛, 신맛, 쓴맛, 감칠맛 5가지로 분류되며, 혀의 점막에 위치한 미뢰(맛봉오리, taste bud)를 통해 맛을 느낄 수 있다. 미뢰에는 맛을 내는 성분이 결합할 수 있는 미각 수용체(taste receptor)를 표면에 갖고 있는 50~100 개의 미각 세포(gustatory cell 또는 taste receptor cell)들과 미각 신호를 받아서 중추신경계로 전달하는 신경 세포들이 세포 클러스터를 형성하며 맛을 감지하는 기능을 하는 것으로 알려져 있다. 맛을 느끼는 과정은 세포 내부와 세포 간의 증폭, 피드백, 수렴, 확산 등 복잡한 신호전달을 통해 이루어진다. 여기에 관여하는 세포 간의 신호전달 물질로는 세로토닌(serotonin, 5-hydroxytryptamine), 아데노신 삼인산 (adenosine triphosphate, ATP) 등이 있는 것으로 밝혀졌다 (Finger et al. Science, 2005, 310(5753), 1495-1499; Taruno et al. Nature, 2013, 495, 223-226). 다만, 맛을 구별하는 기작은 아직 정확하게 밝혀지지 않았다.

기본 맛을 인지하는 데에 관여하는 미각 수용체들이 점차 규명되고 있고, 그 기능에 대한 연구가 활발하게 진행되고 있다. 지금까지 밝혀진 미각 수용체는 화학 물질을 감지하는 G 수용체의 일종으로 크게 T1R과 T2R로 구별되며, 모두 합쳐 40종 정도가 있다. 이 중에서 작동하는 수용체는 30종 정도이고, 단맛은 1종의 T1R 수용체가, 감칠맛은 2종의 T1R 수용체가, 쓴맛은 25종의 T2R 수용체가 맛을 감지하는 데에 관여하는 것으로 밝혀졌다. 짠맛과 신맛은 G 수용체가 아닌 채널형 수용체에 의해 감지된다. 아직 기본 맛으로 인정되지 못했으나, 6번째 기본 맛으로 활발하게 논의 중인 지방맛은 GPR40, GPR120, CD36 등이 수용체로 작동하는 것으로 추정되고 있다.

이렇게 밝혀진 미각 수용체들을 이용하여 맛을 감지하는 센서를 개발하고자 하는 연구들이 최근에 보고되고 있다. 미각을 구별하는 기존의 방법은 훈련된 전문 관능검사사에 의한 검사로 객관적인 판별이 어렵다는 한계를 지니고 있는 반면, 미각 수용체에 기반한 센서는 객관적이고 정량화된 지표를 기준으로 맛을 판별할 수 있다는 점에서 강점을 가진다.

미각 센서의 기본 원리는 미각 수용체를 반도체 소재 등에 결합시켜 맛 성분이 미각 수용체에 선택적으로 결합하게 되면서 발생하는 전기 신호의 변화를 감지하는 것이다. 즉, 다양한 성분들 중에서 특정한 맛 성분의 농도를 정량 분석하여 맛을 판별하는 개념에 기반한다.

한편, 생물체가 느끼는 맛이란 앞서 언급한 바와 같이 미각 세포들과 신경 세포들의 복잡한 신호 전달에 의해 형성되는 결과인 것으로 단순히 특정 성분의 농도에 따른 차이가 아니다. 신호 전달체계는 생물체의 뇌가 미각 세포 하나하나와 직접 연결되는 것이 아니라, 미각 세포에서 감지한 맛 신호를 세포 차원의 프로세스를 통해 노이즈는 제거하고 신호는 증폭하는 등의 양성 및 음성 피드백 과정을 거쳐 뇌에 전달하게 된다.

따라서, 종래의 미각 바이오센서 기술은 세포 수준의 미각 세포의 맛 신호 처리 과정을 거치지 않고, 맛 성분의 농도에 대한 정보만을 제공하는 한계가 있다. 이에, 세포 수준의 맛 신호 처리과정을 도입하여 보다 정확한 맛 신호를 감지하고, 이를 바탕으로 본질적인 맛의 차이를 구별할 수 있는 기술의 필요성이 대두되고 있다.

Finger et al. Science 2005, 310(5753), pp. 1495-1499 Taruno et al. Nature 2013, 495, pp. 223-226

본 발명의 목적은 맛을 감지하는 세포 기반의 바이오센서를 제공하는 것으로, 미각 세포에서 발생한 맛 신호가 신경 세포를 통해 미세 전극에 전달되어 전기 신호로 측정될 수 있는 바이오센서를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 미각 세포와 신경 세포가 안정적으로 근접하여 결합되고, 각 세포의 활성을 유지할 수 있는 공배양 조건을 통해 미각 바이오센서를 제조하는 방법을 제공하기 위한 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명에 따른 미각 바이오센서는 미세 전극 어레이(microelectrode array) 상에 네트워크로 형성된 신경 세포; 및 상기 신경 세포와 근접하여 부착된 미각 세포;를 포함하는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 일 예에 따른 상기 미세 전극은 전도성 고분자 및 세포 점착 성분으로 코팅된 코팅층으로 이루어지는 군에서 선택된 어느 하나 또는 둘의 조합을 더 포함하는 것일 수 있다.

본 발명의 일 예에 따른 상기 세포 점착 성분은 폴리라이신(polylysine), 폴리도파민(polydopamine), 라미닌(laminin), 폴리노르에피네프린(polynorepinephrine) 및 파이브로넥틴(fibronectin)으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 또는 둘 이상의 조합인 것일 수 있다.

본 발명의 일 예에 따른 상기 신경 세포 및 미각 세포는 공배양되어 미세 전극 어레이 상에 안정적으로 형성된 것일 수 있다.

본 발명의 일 예에 따른 상기 신경 세포 및 미각 세포는 서로 인접하여 물리적 또는 화학적으로 결합된 것일 수 있다.

본 발명의 일 예에 따른 상기 신경 세포 및 미각 세포는 단일가닥 올리고데옥시뉴클레오타이드(ssODN)가 결합된 제1지질 분자 및 상기 ssODN에 대하여 상보적인 ssODN(complementary ssODN, cssODN)이 결합된 제2지질 분자를 각각 포함하는 것일 수 있다.

본 발명의 일 예에 따른 상기 미각 바이오센서는 신경 세포의 자극을 감소시키는 수단을 더 포함하는 것일 수 있다.

또한 본 발명에 따른 미각 바이오센서의 제조방법은 a) 미세 전극 어레이의 표면에 신경 세포가 네트워크를 형성하며 부착하는 단계; b) 상기 미세 전극 어레이에 부착된 신경 세포에 미각 세포를 근접하여 결합하는 단계; 및 c) 상기 신경 세포 및 미각 세포를 안정적으로 공배양하여 신경 세포 및 미각 세포를 포함하는 안정한 세포층을 형성하는 단계;를 포함한다.

본 발명의 일 예에 따른 미각 바이오센서의 제조방법은 상기 c) 단계 이후에, d) 상기 안정한 세포층 상에 고분자 박막을 형성하여 맛 신호 물질에 의한 신경 세포의 자극을 감소시키는 단계; 를 더 포함하는 것일 수 있다.

또한 본 발명에 따른 미각 자극물질의 스크리닝 방법은 미각 자극물질을 본 발명에 따른 미각 바이오센서에 접촉시키고, 이를 통해 발생되는 전기 신호를 처리하는 것을 포함하는 것일 수 있다.

또한 본 발명에 따른 식품의 검사방법은 식품을 본 발명에 따른 미각 바이오센서에 접촉시키고, 이를 통해 발생되는 전기 신호를 처리하는 것을 포함하는 것일 수 있다.

본 발명에 따른 미각 바이오센서는 맛 신호 물질의 첨가 시 미각 세포와 신경 세포가 순차적으로 반응하여 전기 신호를 발생시킴으로써 생체의 미각 조직과 유사한 미각 감지를 통해 복잡한 맛을 정밀하게 구별할 수 있다.

본 발명에 따른 미각 바이오센서는 생체의 미각을 모사함으로써 생체의 미각 메커니즘에 대한 연구를 할 수 있는 플랫폼으로 활용될 수 있다.

본 발명에 따른 미각 바이오센서는 복잡하고 다양한 맛을 정밀하게 구별하여 식품을 검사하거나 새로운 식품을 개발하는 용도로 유용하게 활용될 수 있다.

본 발명에 따른 미각 바이오센서의 제조방법은 미각 세포와 신경 세포가 안정적으로 근접하여 결합되고, 각 세포의 활성을 유지할 수 있도록 공배양됨으로써 높은 감도 및 안정성을 가지는 미각 바이오센서를 제공할 수 있다.

도 1은 Mal-PEG24-NHS ester (black)와 Mal-PEG24-DPPE (red)의 mass spectra를 나타낸 것이다.
도 2는 3가지 다른 시퀀스의 thiolate-ssODN과 ssODN-PEG-DPPE의 PAGE 이미지를 나타낸 것이다.
도 3은 미각 세포(Cy3으로 표지)와 신경 세포(Cy5로 표지)에 대한 형광 현미경 이미지를 나타낸 것이다. (A)는 상보적 DNA, (B)는 상보적이지 않은 DNA 시퀀스를 처리한 후 비교한 것이다.
도 4는 DNA-매개 미각-신경 세포 결합의 모식도이다.
도 5는 5 mM 데나토니움 벤조산에서의 DNA-매개 미각-신경 세포 결합 후 칼슘 influx 이미징 분석을 나타낸 것이다. (A)는 분석 영역 내 미각-신경 세포에 해당하고, (B)는 상대적 형광 세기의 시간별 변화를 나타낸 그래프이다. (C)는 피크 세기의 연속적 이미지를 나타낸다. 화살표와 동그라미는 반응하는 미각 세포와 신호 전달의 방향을 의미한다.
도 6은 미각 신호를 측정하는 전체 모식도이다.
도 7은 아가로즈(agarose) 하이드로젤 도입 전후의 신경 세포 및 미각-신경 세포로부터 추출된 spike rate를 비교한 그래프이다.
도 8은 미각-신경 세포 공배양 세포에 맛 자극을 처리한 후 전기 신호를 DNA 처리 여부에 따라 비교한 그래프이다.

이하에서 본 발명에 대하여 구체적으로 설명한다. 본 명세서에서 사용되는 용어는 따로 정의하지 않는 경우 해당 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 일반적으로 이해하는 내용으로 해석되어야 할 것이다. 본 명세서의 도면 및 실시예는 통상의 지식을 가진 자가 본 발명을 쉽게 이해하고 실시하기 위한 것으로 도면 및 실시예에서 발명의 요지를 흐릴 수 있는 내용은 생략될 수 있으며, 본 발명이 도면 및 실시예로 한정되는 것은 아니다.

미각 수용체를 미세 전극 상에 배치하여 바이오센서로 활용할 경우 맛 성분에 대해 미각 수용체가 감지하고 전기 신호를 발생시켜 기본 맛을 판별할 수 있다. 그러나 상기 바이오센서의 경우 생체가 느끼는 미각에 관련된 복잡한 신호전달 메커니즘을 반영하지 못하였기 때문에 정확한 맛을 판별하기 어려운 문제가 있었다. 정확한 맛을 판별하고 유사한 맛의 차이를 구별하기 위한 가장 바람직한 방법은 미각 세포와 신경 세포를 직접적인 방법으로 신경칩 전자소자에 도입하여, 맛 성분이 미각 수용체에 결합해서 발생한 생물학적 맛 신호 처리과정을 통해 전기 신호를 유도하는 것이라고 할 수 있다. 특히 미각 세포와 신경 세포를 근접하여 부착함으로써 맛 신호가 미각 세포에서 신경 세포로 효율적으로 전달될 수 있으며, 이를 통해 자극된 신경 세포의 전기적 활성을 전자 소자를 이용하여 정확하게 측정할 수 있다.

이러한 원리에 기초하여 본 발명의 발명자들은 미세 전극 어레이(microelectrode array)에서 미각 세포와 신경 세포를 근접하게 부착하여 안정적으로 접합시키고, 각 세포의 활성을 유지하는 공배양 조건을 안출하여, 맛 신호가 신경 세포가 아닌 미각 세포 만을 자극시켜 맛 신호에 의한 세포의 반응을 측정할 수 있는 세포 기반의 전자소자 센서를 개발함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명에 따른 미각 바이오센서는 미세 전극 어레이(microelectrode array) 상에 네트워크로 형성된 신경 세포; 및 상기 신경 세포와 근접하여 부착된 미각 세포;를 포함하는 것을 특징으로 한다.

상기 미각 세포와 신경 세포는 직접적으로 신경칩 전자 소자에 도입됨으로써 맛 성분이 미각 수용체에 결합하여 발생한 맛 신호의 처리과정에 전기 신호를 유도하는 것이다. 특히, 미각 세포와 신경 세포를 접합하여 맛 신호가 미각 세포에서 신경 세포로 효율적으로 전달될 수 있도록 하고, 이를 통해 자극된 신경 세포의 전기적 활성을 전자 소자를 이용하여 측정한다.

상기 미세 전극 어레이는 미세 패턴이 형성된 멀티 웰(multi-well) 기판의 미세 전극 어레이일 수 있으며, 전기 신호의 발생 및 전달을 위해 미세 패턴 상에 금속, 그래핀, 탄소나노튜브 등이 포함된 것일 수 있다. 상기 미세 전극 어레이의 기판은 실리콘, 게르마늄, 유리, 금속, 플라스틱, 금속 산화물 및 이들의 혼합물로 구성된 군에서 선택된 것으로 제조될 수 있다. 미각 바이오센서가 유연성을 가지기 위해서 상기 플라스틱은 폴리아크릴레이트, 실리콘(silicone)계, 폴리카보네이트, 폴리에스터 등에서 바람직하게 선택될 수 있으나 상기 특정 고분자로 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 일 예에 따른 상기 미세 전극은 전도성 고분자 및 세포 점착 성분으로 코팅된 코팅층으로 이루어지는 군에서 선택된 어느 하나 또는 둘의 조합을 더 포함하는 것일 수 있다. 바람직하게 전도성 고분자 및 세포 점착 성분을 모두 포함할 수 있다.

상기 전도성 고분자는 자체적으로 전도성을 가지거나 도핑을 통해서 전도성을 가질 수 있는 고분자라면 제한받지 않고 사용될 수 있다. 구체적인 일 예로 폴리아세틸렌계 중합체, 폴리피롤계 중합체(polypyrole), 폴리티오펜계 중합체(polythiophene) 또는 폴리아닐린계 중합체(polyaniline)일 수 있고, 보다 구체적으로 PEDOT:PSS(poly(3,4-ethylenedioxythiophene):polystyrene sulfonate)일 수 있으나 이에 한정되지는 않는다. 전도성 고분자는 우수한 전기전도성을 기반으로 생체 재료를 활용한 전극 사용시 전기적 신호의 매개가 용이하다. 또한 일반적인 전도성을 가지는 금속성 재료에 비해 유연성과 연성을 나타내므로 상대적으로 생체 조직과 계면을 이루는 경우 금속에 비해 생체 적합성이 우수한 점에서 바람직하다.

상기 전도성 고분자는 코팅되는 미세 전극 위에 1 내지 3000 nC 증착 조건 으로 포함될 수 있다.

신경 세포를 안정적으로 전극 표면에 점착시키기 위한 세포 점착 성분의 경우 폴리라이신(polylysine), 폴리도파민(polydopamine), 라미닌(laminin), 폴리노르에피네프린(polynorepinephrine) 및 파이브로넥틴(fibronectin)으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 또는 둘 이상의 조합인 것일 수 있으나 이에 제한받지 않는다. 바람직하게는 PLL(poly-L-lysine) 또는 PDL(poly-D-lysine)이 선택될 수 있다.

상기 세포 점착 성분은 코팅되는 미세 전극의 단위 면적당 0.01 내지 1 μg/ mm²의 함량으로 포함될 수 있다.

본 발명의 일 예에 따른 상기 신경 세포 및 미각 세포는 공배양되어 미세 전극 어레이 상에 안정적으로 형성된 것일 수 있다.

공배양은 한 배양기에서 이종의 세포를 함께 배양하는 것으로서, 본 발명의 경우 공배양을 통하여 신경 세포와 미각 세포는 근접하여 부착된 형태를 유지하고 안정적으로 미세 전극 배열 상에 형성될 수 있다. 공배양 후 미세 전극 어레이 상에 형성된 미각 세포는 1x10³ cell/mm² 내지 1x10⁶ cell/mm²의 농도로 포함될 수 있고, 신경 세포는 1x10³ cell/mm² 내지 1x10⁵ cell/mm²의 밀도로 포함될 수 있다. 바람직하게 신경 세포와 미각 세포는 1:0.1 내지 1:10의 비율일 수 있다.

본 발명의 일 예에 따른 상기 신경 세포 및 미각 세포는 서로 인접하여 물리적 또는 화학적으로 결합된 것일 수 있다. 보다 상세하게, 신경 세포의 세포막과 미각 세포의 세포막에 각각 서로 결합할 수 있는 분자를 표지하여 노출시킴으로써 신경 세포와 미각 세포가 상호 근접하여 물리적 또는 화학적인 결합을 형성하는 것이다.

상기 신경 세포 및 미각 세포는 각 세포막에 결합할 수 있는 분자로서, 단일가닥 올리고데옥시뉴클레오타이드(ssODN)가 결합된 제1지질 분자 및 상기 ssODN에 대하여 상보적인 ssODN(complementary ssODN, cssODN)이 결합된 제2지질 분자를 각각 포함할 수 있다.

상기 제1지질 분자 및 제2지질 분자는 인지질에서 유래된 것일 수 있으며 ssODN이 결합되기 전의 인지질은 히드록실기나 아민기 등의 반응성 작용기를 포함하는 인지질이 바람직할 수 있다. 상기 아민기를 포함하는 인지질로는 포스파티딜에탄올아민(Phosphatidylethanolamine) 유래의 인지질일 수 있으며, 상기 히드록실기를 포함하는 인지질로는 포스파티딜세린(Phosphatidylserine) 유래의 인지질일 수 있고, 상기 인지질은 2개의 아실기를 포함하는 형태일 수 있다.

상기 인지질과 ssODN은 직접결합될 수도 있지만, 바람직하게 링커가 개재될 수 있다. 상기 링커는 인지질의 반응성 작용기와 ssODN을 서로 결합하기 위한 분자로서 수평균분자량 100 내지 5000 g/mol의 분자량을 가질 수 있다. 구체적인 일 예로 폴리에틸렌글리콜(PEG) 및 DNA 등을 비롯한 다양한 친수성 올리고머 분자가 사용할 수 있다. 구체적인 예를 들어 PEG를 사용하는 경우, PEG 히드록시기 일측 말단은 인지질의 반응성 작용기와 공유결합하고, PEG의 히드록시기 다른 일측 말단은 상기 ssODN과 공유결합을 형성하여 인지질-(PEG)n-ssODN이 제조될 수 있다.

상기 PEG는 반복단위의 수 n을 2 내지 50으로 조절함으로써 링커의 길이 변화를 줄 수 있으며, 이는 미각 세포와 신경 세포 간격 조절에 활용된다. 링커의 길이는 다양하게 조절될 수 있으나, 링커의 길이가 너무 짧게 되면 세포 간의 거리가 지나치게 가까워 ssODN 및 상보적 서열의 ssODN(complementary ssODN, cssODN) 사이의 상보적 결합이 형성되지 않아 세포 간의 결합이 방해될 수 있어 전기적 신호 전달이 저해될 수 있다. 또한 링커의 길이가 너무 길 경우 ssODN 및 cssODN 사이의 상보적 결합이 효과적으로 형성되지 않아 세포 간의 결합 효과가 떨어져 전기적 신호 전달이 저해될 수 있다.

보다 상세하게, 인지질-(PEG)n-ssODN이 미각 세포에 포함되고, 인지질-(PEG)n-cssODN이 신경 세포에 포함될 경우, 서로 근접하여 부착된 미각 세포 및 신경 세포는 ssODN 및 cssODN 사이의 상보적 결합에 의해 강하게 결합이 형성될 수 있다. 상기 결합은 미각세포 인지질-(PEG)n-ssODN-cssODN-(PEG)n-신경 세포 인지질의 형태로 도시될 수 있으며, 반대의 경우도 가능함은 자명하므로 상세한 설명은 생략한다.

본 발명의 일 예에 따른 미각 바이오센서는 신경 세포의 자극을 감소시키는 수단을 더 포함할 수 있다. 상기 신경 세포의 자극을 감소시키는 수단으로서 고분자 박막이 포함될 수 있는데, 이를 포함함으로써 신경 세포에 도달하는 전기적 신호 중 노이즈에 해당되는 자극을 제거할 수 있다.

상기 고분자 박막으로는 하이드로젤 타입의 고분자가 예시될 수 있다. 즉 신경 세포와 미각 세포가 공배양된 후, 배양된 신경 세포 및 미각 세포를 포함하는 안정한 세포층 위에 하이드로젤 타입의 고분자 박막이 코팅될 수 있다. 이 때, 맛 자극이 신경 세포에 직접적으로 닿는 것을 방지 혹은 지연시키기 위하여 하이드로젤 공극의 크기는 매우 작은 것이 바람직하다. 상기 하이드로젤 타입의 고분자로는 아가로즈 젤(agarose gel), 탈세포화 혀 세포외 기질 (decellularized tongue extracellular matrix, dTEM) 등이 사용할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.

상기 고분자 박막은 세포층 위에 고형분 함량 기준으로 단위 면적당 0.001 내지 1.0 mg/mm²의 함량으로 포함될 수 있다. 또한 상기 안정한 세포층 위에 고분자 박막을 형성하기 위해, 0.001 mg/ml 내지 1.0 mg/ml 농도의 하이드로젤 수용액을 상기 안정한 세포층 위에 도포하는 단계를 포함할 수 있다.

또한, 본 발명은 미각 바이오센서의 제조방법을 제공하며, 상기 미각 바이오센서의 제조방법은 a) 미세 전극 어레이의 표면에 신경 세포가 네트워크를 형성하며 부착하는 단계; b) 상기 미세 전극 어레이에 부착된 신경 세포에 미각 세포를 근접하여 결합하는 단계; 및 c) 상기 신경 세포 및 미각 세포를 안정적으로 공배양하여 신경 세포 및 미각 세포를 포함하는 안정한 세포층을 형성하는 단계; 를 포함한다.

상기 a) 단계 또는 a) 단계 이후 b) 단계 이전에 상기 신경 세포는 단일가닥 올리고데옥시뉴클레오타이드(ssODN)가 결합된 제1지질 분자와 혼합하여 신경 세포의 세포막에 ssODN 분자를 도입하는 단계를 더 포함할 수 있다.

상기 b) 단계 이전에 상기 미각 세포는 상기 ssODN에 대하여 상보적인 ssODN(complementary ssODN, cssODN)이 결합된 제2지질 분자와 혼합하여 미각 세포의 세포막에 cssODN 분자를 도입하는 단계를 더 포함할 수 있다. 상기 cssODN 분자가 도입된 미각 세포는 상기 ssODN이 도입된 신경 세포와 상호작용함으로써 신경 세포와 미각 세포가 근접하여 결합하는 세포층이 형성될 수 있다. 상기 세포층의 형성을 위해 상기 미각 세포 및 신경 세포는 비한정적인 일 예로, 10 분 내지 300 분 동안 체온 범위에서 유지함으로써 ssODN과 cssODN 사이의 강한 DNA 결합을 유도할 수 있다.

상기 c) 단계에서 서로 결합된 미각 세포 및 신경 세포는 공배양을 통해 세포 사이의 연접을 유도할 수 있으며, 세포 사이의 연접을 통해 신경 세포와 미각 세포가 동시에 포함되는 안정적인 세포층이 형성될 수 있고, 이는 도 4에 예시되어 있다.

본 발명의 일 예에 따른 미각 바이오센서의 제조방법은 상기 c) 단계 이후에, d) 상기 안정한 세포층 상에 고분자 박막을 형성하여 맛 신호 물질에 의한 신경 세포의 자극을 감소시키는 단계; 를 더 포함하는 것일 수 있다.

또한, 본 발명은 미각 자극 물질의 스크리닝 방법을 제공하며, 본 발명에 따른 미각 바이오센서에 미각 자극물질을 접촉시키고, 이를 통해 발생되는 전기 신호를 처리하여 미각 자극 물질을 스크리닝하는 것을 특징으로 한다.

상기 미각 자극물질은 수용액 또는 수분산된 형태의 수상 조성물로 제공될 수 있고, 상기 미각 자극물질을 포함하는 수상 조성물을 미각 바이오센서에 일정량 접촉시키는 단계를 포함할 수 있다. 상기 수상 조성물과 접촉하는 미각 바이오센서는 미각 세포 및 신경 세포를 통해 발생되는 전기신호를 처리하여 각각의 맛에 대한 정량적인 정보를 제공하여 맛의 유사한 정도를 판별할 수 있고, 복잡한 맛을 정밀하게 구별할 수 있다.

또한, 본 발명은 식품의 검사방법을 제공하며, 본 발명에 따른 미각 바이오센서에 식품을 접촉시키고, 이를 통해 발생되는 전기 신호를 처리하여 식품을 검사하는 것을 특징으로 한다.

상기 식품은 고체 및 액체 등의 다양한 형태를 취할 수 있으나, 식품을 물과 혼합하여 수용액 또는 수분산된 형태의 수상 조성물로 제공될 수 있고, 상기 미각 자극물질을 포함하는 수상 조성물을 미각 바이오센서에 일정량 접촉시키는 단계를 포함할 수 있다. 구체적인 일 예로, 기준 식품의 수상 조성물로 미각 바이오센서를 접촉시킨 후, 이를 통해 발생되는 전기신호를 처리하여 기준 식품의 맛에 대한 정량적인 정보를 획득하여 제1미각 정보를 다면적으로 산출한다. 이어서 검사하고자 하는 검사 식품의 수상 조성물로 미각 바이오센서를 접촉시킨 후, 이를 통해 발생되는 전기신호를 처리하여 검사 식품의 맛에 대한 정량적인 정보를 획득하여 제2미각 정보를 다면적으로 산출한다. 이어서 상기 제1미각 정보 및 제2미각 정보를 대조하여 허용치 내외에 포함되는지를 판별하여 식품의 부패 여부, 식품의 품질 준수 여부 등에 대한 정보를 제공할 수 있다.

이하 본 발명을 하기 실시예에 의해 상세히 설명한다. 다만, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것은 아니다.

ssODN -PEG- DPPE 합성 및 특성 분석

1,2-디팔미토일-sn-글리세롤-3-포스파티딜에탄올아민(1,2-Dipalmitoyl-sn-glycerol-3-phosphatidylethanolamine, DPPE, TCI Co., Tokyo, Japan) 4 mg과 숙신이미딜-[(N-말레이미도프로피온아미도)-테트라코사에틸렌글리콜]에스터(Succinimidyl-[(N-maleimidopropionamide)-tetracosaethyleneglycol] ester, Mal-PEG₂₄-NHS ester, TCI Co., Tokyo, Japan) 8 mg을 둥근 바닥 플라스크 내 디클로로메탄(dichloromethane) 5 mL에 녹였다. 이후 트리메틸아민(trimethylamine) 10 μL를 넣고 상온에서 72 시간 동안 마그네틱 바로 교반시켰다. 교반된 용액 내 Mal-PEG₂₄-DPPE는 차갑게 준비된 디에틸에터(diethyl ether)에서 침전시켰다. 종이 필터로 침전물인 Mal-PEG₂₄-DPPE를 걸러낸 후, 비이온수에 녹인 뒤 동결 건조시켜 고체 가루 형태인 Mal-PEG₂₄-DPPE를 얻었다. Mal-PEG₂₄-DPPE는 -25 ^oC에 보관하였고, 분자량은 α-시아노-4-히드록시시안산(α-Cyano-4-hydroxycinnamic acid, CHCA)에서 매트릭스 보조 레이저 탈착 이온화 질량 분석기(matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry, MALDI-TOF, Bruder Autoflex III, Bruker Daltonics, USA)로 positive-ion mode에서 분석되었다(도 1).

보호기로 보호된 ssODN의 싸이올 그룹은 몰 비 1:100으로 Bond-breaker^TM TCEP로 환원되었고, 이 ssODN에 3 M 소듐 아세트산(pH 6.0) 10 μL를 첨가하였다. 에탄올(99 %) 500 μL를 첨가하여 강하게 교반 시킨 후, 1 시간 동안 -75 ^oC에서 ssODN을 침전시켰다. ssODN이 침전된 용액을 10 분 동안 20,000 rpm, 4 ^oC에서 원심분리(Supra 22K centrifuge, A1.5S-36 rotor, Hanil, Republic of Korea)하고, 상등액을 제거한다. 원심분리를 한 번 더 반복하고, 상온에서 20 분 동안 침전물을 건조시킨다. 건조된 ssODN(100 μM)에 멸균된 비이온수에 녹여진 Mal-PEG₂₄-DPPE (1 mM)를 첨가한다. ssODN의 농도는 NanoDrop^TM 분광광도계(ND-1000, Thermo Scientific)를 통해 측정되었다. ssODN과 Mal-PEG24-DPPE이 섞인 용액은 상온에서 12 시간 동안 교반시켜 ssODN-PEG-DPPE이 합성 되도록 하였다. 합성된 ssODN-PEG-DPPE는 15 % 폴리아크릴아마이드 겔 전기영동기(polyacrylamide gel electrophoresis, BioRad, USA)를 통해 분석되었다. ssODN는 GelRed^TM로 염색되었고, 겔 이미징 시스템을 통해 이미지를 얻었다(GelDoc-It^TM, UVP, LCC, USA)(도 2).

미각 세포 초대배양(primary culture) 및 특성 분석

미각 세포 배양을 위해 0.5 % (v/v) B27 (17504-044, Gibco, CA, USA), 1 % (v/v) N2 (175020-048, Gibco, CA, USA), 1 vol-% 페니실린/스트렙토마이신(penicillin/streptomycin, 15140, Gibco, CA, USA), 100 ng mL^-1 EGF가 함유된 DMEM/F12 배양액(Dulbecco's Modified Eagle Medium, 10565-018, Gibco, CA, USA) (taste cell culture medium, TM)을 사용하였다. Digestion 효소는 1 Х Hank's Balanced Salt Solution (HBSS, WelGENE, Republic of Korea) 1 mL에 Accutase® 1 mL, 0.025 % 트립신/EDTA (trypsin/EDTA), DNase I (40 U)를 첨가하여 준비하였다. 배양액과 digestion 용액은 15 분 동안 37 ^oC에서 인큐베이션 되었다. 6-웰 플레이트는 상온에서 2 시간 동안 50 μg mL^-1 콜라겐 용액으로 코팅되었다. 콜라겐을 제거한 뒤, 30 분 동안 플레이트를 건조시켰다.

일차 미각 세포는 생후 2일차 마우스의 혀로부터 얻었다. 얻어진 혀는 1 Х HBSS로 3회 세척한다. 세척된 혀는 수술용 칼날을 이용하여 잘게 부수고 HBSS로 세척한다. 잘려진 조직은 15 분 동안 37 ^oC에서 digestion 효소 용액에 의해 처리되었다. 상등액을 제거하고 효소 활성을 막기 위해 0.1 mg mL^-1 트립신 저해제(trypsin inhibitor)를 첨가하였다. 효소 처리된 조직을 미각 세포 배양액 2 mL에 풀고 플레이트 웰에 균등하게 나눠 분배했다. 배양 5-6일차에 새로운 플레이트로 계대배양 했다. 계대배양을 위해 0.25 % 트립신/EDTA를 첨가하여 3 분 동안 37 ^oC에서 인큐베이션한 후, 트립신 저해제를 첨가하고 세포를 플레이트로부터 떼어냈다. 떼어낸 세포는 40 μm 세포 여과기로 불순물을 걸러냈다. 세포는 3 분 동안 1,000 rpm로 원심분리 시키고 침전된 세포는 미각 세포 배양액에 재분산 되었다. 세포는 균등하게 플레이트에 분배시켰고, 이틀 동안 37 ^oC로 유지되는 CO₂ 인큐베이터에서 배양되었다. 계대배양 후 이틀이 지난 미각 세포는 0.05 % 트립신/EDTA를 첨가하여 4 분 동안 37 ^oC에서 인큐베이션 한 후, 미각 세포 배양액을 첨가하고 세포를 플레이트로부터 떼어냈다. 세포는 3 분 동안 1,000 rpm로 원심분리 시키고 침전된 세포는 미각 세포 배양액에 재분산되었다.

신경 세포 배양

신경 세포 배양을 위해 0.5 % (v/v) B27, 1 % (v/v) N2, 1 vol-% 페니실린/스트렙토마이신, 10 % 말 혈청(horse serum, 26050-088, Gibco, CA, USA), DMEM/F12 배양액(nuronal cell culture medium, NM)을 사용하였다. 세포 플레이팅용 배양액을 위해 12.5 μM이 되도록 L-글루탐산(L-glutamic acid, Sigma-Aldrich, MO, USA)을 배양액에 첨가하였다. MEA 기판은 1 분동안 에어 플라즈마(CUTE, Republic of Korea) 처리 후, 1 시간 30 분 동안 100 μg mL^-1 폴리-D-라이신(poly-D-lysine, in borate buffer pH8.5, Sigma-Aldrich, MO, USA)으로 코팅하였다. 그 후, 1 시간 동안 10 μg mL-1 라미닌(laminin, in PBS)으로 추가 코팅하였다. 해마 조직은 E18 스프래그 다우리 랫(Koatech, Republic of Korea)에서 얻었고, HBSS 1 mL에서 37 ^oC에서 15 분 동안 0.5 % 트립신/EDTA를 처리한 후, 물리적으로 피펫팅하여 잘게 부수었다. 세포는 2 분 동안 1000 rpm으로 원심분리 시켰고, 상등액을 제거한 뒤, 플레이팅용 배양액으로 재분산하였다. 분산된 세포는 40 μm 세포 여과기로 불순물을 걸러냈고, 코팅된 MEA 기판 위에 약 2000 cells mm^-²로 분배시켰다. 16-웰 각각에 배양액을 80 μL로 채우고 약 0.7 mm 정도의 얇은 PDMS 덮개를 이용하여 산소와 이산화탄소의 유출입이 용이하고 증발을 방지하도록 하였다. 신경 세포는 37 ^oC로 유지되는 CO₂ 인큐베이터에서 배양되었다. 플레이팅용 배양액은 배양 3일차에 교체되었고, 이때 신경 아교 세포(glial cell)의 과증식을 방지하기 위해 20 uM FUdR (2′-Deoxy-5-fluorouridine, Sigma-Aldrich, MO, USA)을 첨가하였다. 그로부터 일주일 후 배양액을 교체하였다.

미각-신경 세포 공배양 및 특성 분석

신경 세포 배양액을 제거하고 HBSS로 세포를 세척한다. 신경 세포막에 ssODN-PEG-DPPE (GTCAGTCAGTCAGTCAGTCA, 200 μL in HBSS)를 표지하기 위해 신경 세포에 첨가하였다. 동시에 상보적인 ssODN-PEG-DPPE (TGACTGACTGACTGACTGAC, 200 μL in HBSS)를 미각 세포에 첨가하였다. 신경 세포는 30 분 동안 37 ^oC에서 인큐베이션 되었고, 미각 세포는 오피탈 쉐이커에서 30 분 동안 60 rpm으로 인큐베이션 되었다. 신경 세포는 HBSS로 세척하여 잔여 ssODN-PEG-DPPE를 제거하였다. 미각 세포는 5 분 동안 1000 rpm으로 원심분리하고 미각 세포 배양액에 재분산 하였다. 재분산된 미각 세포는 상보적인 DNA가 처리된 신경 세포에 도입하여 30 분 동안 37 ^oC에서 DNA 결합 시켰다. 결합되지 않은 미각 세포는 제거시키고, 미각 세포 배양액을 새롭게 첨가하였다.

미각-신경 세포의 시각화를 위해 ssODN에 Cy5 혹은 Cy3를 도입하였다. 공배양된 세포는 형광 현미경(DMI 3000B, Leica, USA)을 통해 분석되었고, Cy3와 Cy5는 각각 Y3 필터(green, excitation range: BP 545/30, emission range: BP 610/75)와 Y5 필터(red, excitation: Band Pass 620/60, emission range: Band Pass 700/75)를 이용하였다. 도 3에서 이에 대한 형광 현미경 이미지를 확인할 수 있다.

DNA 매개 미각-신경 세포는 세포 간 연접을 위해 1-2일 동안 공배양 하였다. DNA 매개 미각-신경 세포의 결합 모식도가 도 4에 나타나 있다. 칼슘 염색 시약인 1 μg mL^-1 Fluo-4 AM을 1 Х PowerLoad?가 함유된 HBSS에 첨가하였다. 기존의 배양액을 제거하고, HBSS로 세척한 후, 칼슘 염색 시약이 있는 HBSS를 15 분 동안 37 ^oC에서 처리하였다. 잔여 칼슘 염색 시약을 제거하고 미각 세포 배양액을 첨가한다. 맛 자극 물질(쓴 맛 자극 물질 = 50 mM 데나토니움 벤조산, denatonium benzoate)을 10 μM로 조절하여 첨가하여 주면서 형광 현미경으로 칼슘 반응을 관찰하였다. 관찰 결과는 도 5에서 확인할 수 있다. 칼슘 염색 시약을 관찰하기 위해 I3 필터(blue, excitation range: band pass 450 - 490 nm, emission range: long pass 515 nm)를 사용하였다. 신호의 상대적 세기(F/F₀)는 0 초 때의 ROI 값을 normalization하여 계산하였다.

공배양된 세포로부터 전기 신호 측정 및 특성 분석

낮은 겔화 온도를 가진 아가로즈(A9414, Sigma-Aldrich, MO, USA) 10 mg가 함유된 ACSF (magnesium free buffered) 1 mL로 1% 아가로즈 젤을 준비하였다.　아가로즈 젤은 맛 자극이 신경 세포에 직접 닿는 것을 방지하기 위함이다. 또한, 맛 자극 물질의 농도를 10배 늘리는 경우에도 세포에 대해 독성이 적어진다. 30 분 동안 80 ^oC 오븐에 인큐베이션하여 적절히 섞어주었다. 37 ^oC 히팅 플레이트 위에서 겔 30 μL를 도입하고 20 μL를 제거하여 세포 위에 겔이 매우 얇게 깔리도록 하였다. 5 분 동안 상온에서 겔화 시킨다. ACSF 50 μL를 첨가하여 신경 세포 신호를 증폭하였다.

신경 세포로부터의 전기 신호 수집을 위해 각 채널 25 kHz의 샘플링 레이트(sampling rate)와 16-bit 해상도가 사용되었다. 디지털 필터의 대역폭(bandwidth)은 150 Hz 에서 5500 Hz로 신경 스파이크를 레코딩 하였다. 레코딩은 37 ^oC로 유지되는 CO₂ 인큐베이터(NB-203C, N-BIOTEK inc., Republic of Korea)에서 진행되었다.

스파이크는 MATLAB (USA)을 통해 추출되었고, 백그라운드 노이즈의 표준 편차의 n=6으로 설정하였다. 평균 firing rate의 0.1 Hz 이상인 것만을 평가하였다. 도 7에 신경 스파이크의 비교 데이터가 그래프로 도시되어 있다. 도 8은 상기 실시예에 대한 결과를 나타낸 그래프로서 DNA 처리 여부에 따른 비교 그래프이다. DNA를 처리하여 공배양하는 경우 맛 자극 농도를 1/10으로 낮추어도 스파이크 비율이 증가하게 되어 민감도가 증가한다.

상술한 바와 같이 본 발명에 따른 제조방법으로 제조된 미각 바이오센서는 기본 맛에 해당하는 단맛, 짠맛, 신맛, 쓴맛, 감칠맛의 정확한 맛을 판별하고 여러가지 맛이 혼합된 유사한 맛의 차이를 구별할 수 있다. 이러한 작용효과는 미각 세포와 신경 세포가 직접적으로 안정되게 신경칩 전자소자에 도입됨으로써 맛 성분이 미각 수용체에 결합해서 발생한 생물학적 맛 신호 처리과정을 통해 신경 세포 수준에서 전기 신호를 유도하는 점에서 유래한다.

Claims (11)

1. 미세 전극 어레이(microelectrode array)상에 네트워크로 형성된 신경 세포; 및
   상기 신경 세포와 근접하여 부착된 미각 세포; 를 포함하는 미각 바이오센서.
   
2. 제 1항에 있어서,
   상기 미세 전극은 전도성 고분자 및 세포 점착 성분으로 코팅된 코팅층으로 이루어지는 군에서 선택된 어느 하나 또는 둘의 조합을 더 포함하는 미각 바이오센서.
   
3. 제 2항에 있어서,
   상기 세포 점착 성분은 폴리라이신(polylysine), 폴리도파민(polydopamine), 라미닌(laminin), 폴리노르에피네프린(polynorepinephrine) 및 파이브로넥틴(fibronectin)으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 또는 둘 이상의 조합인 미각 바이오센서.
   
4. 제 1항에 있어서,
   상기 신경 세포 및 미각 세포는 공배양되어 미세 전극 어레이 상에 안정적으로 형성된 것인 미각 바이오센서.
   
5. 제 1항에 있어서,
   상기 신경 세포 및 미각 세포는 서로 인접하여 물리적 또는 화학적으로 결합된 것인 미각 바이오센서.
   
6. 제 1항에 있어서,
   상기 신경 세포 및 미각 세포는 단일가닥 올리고데옥시뉴클레오타이드(ssODN)가 결합된 제1지질 분자 및 상기 ssODN에 대하여 상보적인 ssODN(complementary ssODN)이 결합된 제2지질 분자를 각각 포함하는 미각 바이오센서.
   
7. 제 1항에 있어서,
   상기 미각 바이오센서는 신경 세포의 자극을 감소시키는 수단을 더 포함하는 미각 바이오센서.
   
8. a) 미세 전극 어레이의 표면에 신경 세포가 네트워크를 형성하며 부착하는 단계;
   b) 상기 미세 전극 어레이에 부착된 신경 세포에 미각 세포가 근접하여 결합하는 단계; 및
   c) 상기 신경 세포 및 미각 세포를 안정적으로 공배양하여 신경 세포 및 미각 세포를 포함하는 안정한 세포층을 형성하는 단계; 를 포함하는 미각 바이오센서의 제조방법.
   
9. 제 8항에 있어서,
   상기 c) 단계 이후에, d) 상기 안정한 세포층 상에 고분자 박막을 형성하여 맛 신호 물질에 의한 신경 세포의 자극을 감소시키는 단계; 를 더 포함하는 미각 바이오센서의 제조방법.
   
10. 제1항 내지 제7항에서 선택되는 어느 한 항의 미각 바이오센서에 미각 자극물질을 접촉시키고, 발생되는 전기 신호를 처리하여 미각 자극 물질을 스크리닝하는 것을 특징으로 하는 미각 자극 물질의 스크리닝 방법.
    
11. 제1항 내지 제7항에서 선택되는 어느 한 항의 미각 바이오센서에 식품을 접촉시키고, 발생되는 전기 신호를 처리하여 식품을 검사하는 것을 특징으로 하는 식품의 검사방법.
    
    
    
    
    
    

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