CN103620054A - 凝血酶传感器存储寿命的增长 - Google Patents

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Abstract

一种凝血时间测量传感器，包括表面、施加于其上的树脂层，所述树脂层包含至少一种具有检测功能的物质，其特征在于所述树脂层包含一种漆体系，其中所述漆体系：i）适于将所述至少一种具有检测功能的物质固定在所述表面上；和ii）提供带有负电荷的表面层；iii）和允许用非生物化学惰性和稳定的化合物代替生物凝血促进剂。

Description

凝血酶传感器存储寿命的增长
发明背景
本发明涉及一种具有增长的存储寿命的凝血时间测量传感器，所述增长的存储寿命是通过用非生物化学惰性和稳定的合成化合物代替主要的生物组分实现的。
本发明更特别地涉及一种凝血时间测量传感器，其使得当沉积在传感器上的试剂组合物包括其末端部分可以选择性地被凝血酶通过释放带电荷的/或氧化还原活性基团切掉的化学底物时能够通过电分析方法例如电流法测定凝血酶原时间（PT）。
检查凝血时间，即血液成分形成血块以避免出血危险的能力，是常规检查的一部分。例如在心脏病的情况下在用抗凝血剂治疗期间能够准确地调整药物的剂量是必要的以避免在过量用药的情况下出血的危险或反之如果施加的抗凝血剂的量不足血栓的危险。
凝血级联系统涉及两种途径，内在途径和外在途径。两种途径均是复杂的并且涉及多个不同的凝血因子。因此，为了测量所谓的“快速（Quick）”-时间作为患者凝血时间的值，通常需要口服抗凝血治疗，通常在化学上很复杂。该化学通常包括提供带负电荷的脂质表面和凝血促进剂例如来自生物来源的促凝血酶原激酶（组织因子）的物质。
为了进行该测定已经保留了不同的参数，但最通常的是在活化后测量凝血酶原时间（PT），即取自患者的血液样品观察到形成血块的时间。在这种体外测量系统中，可以通过添加带负电荷的磷脂和“促凝血酶原激酶”的乳液、包含组织因子的盐脑提取物来缩短结块时间以减少测量时间。
尽管这一类型的化学对于使用和生产那些测量系统的人员是众所周知的，特别地家庭护理凝血测量系统的发展促进了更稳健化学的发展。
因此，本发明的一个目的是规避这种凝血时间测量传感器的固有的不稳定性，该不稳定性是由在生物凝血级联中涉及的不稳定的生物成分造成的。
US6352639公开了一种用于测量代表一滴全血的凝结时间的值的电化学系统，其中固定了特定的试剂，包括至少一种化学底物，其一个末端连接可以被凝血酶切掉得到氧化还原活性基团。在通过凝血酶消化凝血酶底物之后，释放出带电荷的基团并且迁移到工作电极。在工作电极上测量通过释放基团的氧化或还原产生的电流并且其与代表凝结时间的值相关。
根据US6352630的传感器系统要求大量的优化。尤其是生物凝血促进剂的使用要求限定的和稳定的反应环境，其中所述介质保持在限定的pH下并具有足够的离子强度。此外，所述生物凝血促进剂的稳定性有限，尤其是在变化的或提高的温度下，这限制了相关传感器的存储稳定性。此外，生物凝血促进剂由天然来源获得，其明确地导致了在其性质上批与批之间的变化。因此，涉及生物凝血促进剂的可再生的传感器的优化和制造仍然是困难的。US6352630还公开了所使用的组织因子的磷脂组成成对测定凝血酶原时间具有影响。磷脂具有反向PS/PC比(其中负磷脂的量大于正磷脂的量)的组织因子允许更好的信号测量（信号高度和信号的线性度）。这种复杂化学的缺点，即在系统中必须具有生物化合物作为凝血促进剂，是显而易见的。
尤其是用于测量患者凝血时间的家庭护理系统的发展要求传感器化学尽可能地稳健，以使得诸如存储时间的因子的监测变得不那么重要和存储条件，例如温度和湿度不再重要。在现有技术中描述的凝血时间测量系统通常需要在4℃存储并且它们的存储时间通常不能超过一年多少。当然这种存储条件也意味着在完整的冷链中分配这种传感器。此外，由于在传感器制备期间生物凝血促进剂的整合，传感器制造方案必须避免升高的温度、有机溶剂和快速干燥。最终，生物材料的使用引起在生产工艺期间绝对需要单独校准许多传感器，因为生物物质彼此之间不相同。在完全移除生物来源的所有材料的情况下，存储的调节要求和最大存储时间本身都变得不那么关键。
出于以上原因，需要可以克服在现有技术中公开的凝血时间测量传感器的缺点并且适用于家庭护理系统以测量凝血时间的系统。本发明所要解决的问题是提供具有增长的存储寿命的凝血时间测量传感器。
检测元件在表面上的固定可以通过吸收、交联或通过包括在聚合物膜中实现（如在US 3,839,175, Strike 等. Biosens. Bioelectron., 10 (1995) 61-66和 Schuhmann, Mikrochim. Acta, 121 (1995) 1-29中分别公开的）。检测元件通常包埋在通过自由基聚合（例如公开在EP-A0691408中）、平版印刷方法（如公开在McGall 等, J.Am.Chem.Soc., 119 (1997) 5081中）或打印方法（如公开在G.F. Khan, Electroanalysis, 9 (1997) 325-329中）沉积在表面的基质中。
US2003/0153061公开了使用更通用的电沉积方法来将检测元件固定在传感器表面上。由US2003/0153061可知可以使用多种类型的电-可聚合的漆来在食品罐内侧电沉积用作保护层的类型的层，也用于固定酶，从而保存它们的酶活性。
这种方法的另一实例在Shkotova 等. (2006), Material Science and Engineering, Volume 26, Issues 2-3, 411-414中给出，其中公开了检测乙醇的电流传感器。醇氧化酶被电化学沉积在resydrol漆膜内的传感器表面。Smutok 等. (2005), Biosensors and Bioelectronics Volume 20, 1285-1290公开了用电沉积漆例如阳极电沉积resydrol漆来电沉积黄素细胞色素b 2。在Ngounou 等. (2004), Electrochimica Acta, Volume 49, 3855-3863的另一实例中，公开了丙烯酸基聚合物库的组合合成和它们作为电流生物传感器固定基质的评价。
在本发明中，一个目的是开发一种如上所述的漆体系，其允许将如在US6352630中公开的电流型(amperagenic)凝血酶底物固定。
本发明的另一个目的是通过所述漆材料同时提供作为凝血级联继续的要求所提到的带负电荷的表面。
发明概述
本发明的目的是通过提供一种具有增长的存储寿命的改进的传感器克服在现有技术的凝血测量系统中存在的缺点。
因此，本发明涉及一种凝血时间测量传感器传感器，包括表面、施加于其上的树脂层，所述树脂层包含至少一种具有检测功能的物质，其特征在于所述树脂层包含一种漆体系，其中所述漆体系：
i）适于将所述至少一种具有检测功能的物质固定在所述表面上；和
ii）提供带有负电荷的表面层；和
iii）允许用非生物化学惰性和稳定的化合物代替生物凝血促进剂。
根据本发明，增长的存储寿命是通过用非生物化学惰性和稳定的化合物代替凝血级联的主要生物组分实现的。同时，这种系统的测量时间与基于起凝血促进剂功能的生物化合物的传感器相比没有显著地延长。
根据本发明，适于被固定在传感器表面的树脂层允许用非-生物化学惰性和稳定的合成化合物代替主要的生物组分而不损害传感器在测量凝血时间方面的功能。
优选地，所述生物化学惰性和稳定的合成化合物由该树脂本身形成，该树脂可以被设计为通过将合适的带负电荷的侧链引入到其聚合物主链中而本身带负电。
在本发明的另一实施方案中，所述带负电荷的表面层是通过非生物化学惰性和稳定的化合物提供的，所述化合物被整合在漆体系中。带负电荷的材料可以与上述凝血酶底物一起共同固定在树脂中。这些所述非-生物化学惰性和稳定的化合物选自带负电荷的粘土材料(如膨润土、硅藻土)或其它带负电荷的添加剂(如氧化的碳纳米管)。
在本发明的优选实施方案中，所述漆体系包括非导电的阳极电沉积漆，优选所述漆选自具有可变单体组成的带负电荷的丙烯酸基电沉积聚合物。在变化pH值之后所述漆体系变得不那么可溶。在提高pH值之后变得不那么可溶的漆体系被称为阴极电沉积聚合物而在降低pH值之后变得不那么可溶的漆体系被称为阳极电沉积聚合物。
在本发明的一个实施方案中，所述至少一种具有检测功能的物质包括一种具体试剂，所述试剂包括至少一种具有一个末端连接的化学底物，所述末端连接可被酶切掉以产生自由扩散氧化还原活性化合物，优选地其中所述具有一个可被酶切掉以产生氧化还原活性化合物的末端连接的化学底物试剂是电流凝血酶底物且所述酶是凝血酶。
本发明进一步包括制备这种凝血测量传感器的方法。
在优选的实施方案中，该方法包括将包括漆体系的树脂层沉积在表面上并且通过干燥将该树脂层固定在该表面上。
附图简要说明
图1: 使用本发明的传感器测量样品中的凝血时间的测量装置的透视图。
图2: 如已经在US6352630中显示的描述该化学反应的示意图，其允许在传感器的电极之间产生电流。
图3A-D: 传感器表面上沉积溶液的固定方法的比较。在没有凝血酶原时间测试试剂（Thromborel）的存在下电沉积对比干燥。A）10沉积脉冲的聚合物沉降；B）通过干燥进行的聚合物沉降；C）电沉积的测量结果；C）干燥的测量结果。
图4A和4B: 传感器的一个月存储稳定性的比较，其中沉积溶液通过电沉积和通过简单的干燥固定在传感器表面上。
图5A和5B: 添加少量碳纳米管制造的传感器。
图6A和6B: 在增加量的带负电荷的碳纳米管的存在下制造的传感器。
发明详述
本发明涉及一种凝血时间测量传感器。图1中所示的测量装置显示了一种设置的一个实例，其中根据本发明的凝血时间测量传感器可以用于在样品中测量凝血时间。这种测量装置由US6352630已知。
测量装置1包括通过组装两个模制的塑料元件4a和4b构建的壳体3，其中顶元件4a包括用于显示面板5的窗口，和用于控制按钮6的开口，该控制按钮6允许进入不同显示模式。
包括在所述壳体中的电子电路是用于葡萄糖分析(例如通过如先前指明的电流法)的电路的变体，并且与它的区别仅在于不同的电信号参数以显示凝结时间。
测量装置1还包括基本设置在壳体3的两个部分4a和4b之间的狭缝7，将包括接触区域8的传感器2的一部分引入其中。包括旨在接收血液样品的测量区域9的传感器2的其它部分在整个测量时间期间保持在装置1之外。在大多数现有技术的测量装置中，将样品引入到装置中进入通常在37℃温控的封闭空间中，这导致另外的功率损耗。
在根据本发明的系统中，其中不将样品引入到温控的封闭空间中，如果必要，很容易在装置上接近狭缝7提供一个加热探针10以作为环境温度的函数调节电信号参数，这比温控封闭空间所需的功率损耗低得多。
传感器2包括薄的塑料支持物11，例如由PET制成，在其整个长度支撑两个被小的间隙14分隔的集流器12、13，所述间隙14使得它们电绝缘。
支持物11和集流器12、13涂覆有绝缘层15，在其上切出两个接近各端的窗口8,9，允许部分集流器12、13露出。第一窗口8允许传感器2电连接到测量装置1上，而第二窗口9构成了测量区域，可见的集流器部分分别构成了工作电极16和参比电极17。
工作电极16例如通过层压薄的铂条制成而参比电极17通过层压薄的随后氯化的银条以同时形成参比电极来制成。还可以在测量区域9中分别提供工作电极、参比电极和对电极。工作电极涂覆有之后更详细描述的具体的试剂18以允许测量凝血酶原时间（PT）。
沉积在传感器上的本发明的试剂组合物包括一种化学底物，其末端部分可以通过释放带电的和/或氧化还原活性的基团被凝血酶选择性切除。
合适的底物和底物的组已经先前描述在US6352630和特别是在US6495336中。
如在US6352630中描述的，合适的寡肽底物具有立体有择结构的凝血酶位点以允许切除通常被指定为离去基团（LG）的带电末端部分。所使用的底物的特征在于寡肽衍生物或其盐的一种除了精氨酸之外还包含至少一种其它自由基氨基酸，选自2-氨基丁酸 (Abu)、丙氨酸 (Ala)、3-环己基丙氨酸 (Cha)、2-环己基甘氨酸 (Chg)、苯丙氨酸 (Phe)、哌酸(Pip)、脯氨酸 (Pro)、缬氨酸(Val)和甘氨酸 (Gly)，所述氨基酸能够呈L、D或DL的形式。
同样地，在本发明的条件下必须容易与精氨酸（Arg）的酸官能反应、能够被凝血酶切除和具有足够的电荷二者的离去基团（LG）优选选自可以被一个或多个取代基取代的苯胺、氨基喹啉和萘胺衍生物，所述一个或多个取代基选自卤素、羟基、氨基、硝基、烷基、烷氧基、烷酰基、苯胺基和氨基苯基，其可以被取代。
所述寡肽通过其链的与包括离去基团LG的末端相反的末端固定在工作电极上。寡肽链的第一氨基酸，但优选其末端氨基官能的氢由此被保护基团R代替，所述保护基团R选自Boc（叔丁氧基羰基）、Tos（对甲苯磺酸）、t-Bups（叔丁基苯磺酰基）、Mes（甲基磺酰基）、Naps（2-萘基磺酰基）、Bzo（苯甲酰）、Z（苄氧基羰基）、异丙基磺酰基、樟脑磺酰基酸。
根据优选的实施方案，选择保护基团、α-氨基酸和它们的链形成以及离去基团以具有以下寡肽底物：
Z-Gly-Pro-Arg-3-氯-4- 羟基酰苯胺
Tos-Gly-Pro-Arg-3-铝-4-羟基酰苯胺
Boc-(D)-Chg-Gly-Arg-3-氯-4-羟基酰苯胺
H-(D)-Chg-Gly-Arg-3-氯-4-羟基酰苯胺
Z-Gly-Pro-Arg-2-氯-4-羟基酰苯胺
以及和它们相容的无机或有机盐。
在具体试剂的组成中的寡肽通常以它们的一种盐的形式使用，所述盐是例如与盐酸（HCl）、乙酸或三氟乙酸（TFA）形成的。
图2是如已经在US6352630中显示的描述该化学反应的示意图，其允许在电极20和21之间产生电流，电极20和21通过电子检测电路连接（未示出）。可以通过式R1-AA2-AA1-Arg-LG（其中AA1和AA2表示如之前指明的其它氨基酸）示意性表示的底物通过R1基团连接到工作电极20上，所述R1基团朝向寡肽，寡肽链的另一末端包括如先前限定的离去基团LG。在图的左边部分，可以看到凝血酶选择性的切掉了精氨酸和所述离去基团LG之间的连接。在图的右边部分，可以看到释放的离去基团可以向电极21迁移并产生电流，所述电流将与释放的离去基团LG的数量成比例，并由此与在样品中形成的凝血酶的量成比例。
已经在US6495336中描述的适用于本发明的传感器的其它凝血酶底物为：
式（I）的寡肽衍生物
Figure 97592DEST_PATH_IMAGE001
其中
R1 是
(a) 氢原子；任选在ω位置具有氨基基团的C2-8-烷酰基；其苯基基团任选在p位置被氨基基团取代的苯基-C2-4-烷酰基；或
(b) 环己基羰基，其任选地在4位置被氨基甲基取代；苯甲酰基，其任选地在o或p位置被甲基、氨基或卤素取代；C1-8-烷氧基羰基；苄氧基羰基，其任选地在p位置被甲氧基、甲基或氯取代；或
(c) 式-SO2-R5的基团，其中R5可以是C1-6-烷基，任选地取代的芳基或杂芳基或双环萜烯衍生物的基团；或
(d) 式-CO-CH(R6)-NH-R7的基团，其中R6是氢、C1-6-烷基、1-或2-羟乙基、甲基巯基乙基、氨基丁基、胍基丙基、羧基-C1-4-烷基、甲酰胺基-C1-4-烷基、苯基-C1-4-烷基，其苯基任选被OH、卤素、C1-4-烷基或甲氧基取代，或环己基或环己基甲基，其环任选被OH、卤素、C1-4-烷基或甲氧基取代，或含氮的杂芳基-C1-4-烷基，其在杂环体系中具有3-8个碳原子，其中-CO-CH(R6)-NH-R7基团可以是外消旋的或具有D或L构型，和R7 可以是（a）、（b）或（c）类型的基团；或
(e) 下式的基团
Figure 14732DEST_PATH_IMAGE002
其中R7具有以上含义，m可以是1或2，和亚甲基之一可以被羟基、羧基、C1-4-烷基或芳基-C1-4-烷基取代；
R2是氢、C1-6-烷基、C1-2-羟烷基、C1-4-烷氧基-C1-6-烷基、苄氧基-C1-2-烷基、ω-羧基-C1-3-烷基、ω-C1-4-烷氧基羰基-C1-3-烷基、ω-苄氧基羰基-C1-3-烷基或环己基、环己基甲基、4-羟基环己基甲基、苯基、苄基、4-羟基苄基或咪唑基-4-甲基；
R3 为
(a) 氢或C1-4-烷基和R3'为氢；或
(b)与R3'一起为三或四亚甲基，其中亚甲基之一可以被羟基、羧基、C1-4-烷基或芳基-C1-4-烷基取代；和
R4为
(a) 下式的苯胺残基
Figure 856786DEST_PATH_IMAGE003
其中R8可以是羟基或氨基，和R9可以是氢、卤素、氨基、硝基、C1-4-烷基、C1-4-烷氧基或C1-4-烷酰基；或
(b) 下式的喹啉残基
其中R10、R11和R12之一为-NH基团，喹啉残基通过其连接到Arg残基，另一个可以是羟基或氨基，剩下一个可以是氢、羟基或氨基；
和它们的盐。
这些寡肽衍生物通过肽水解酶类的酶裂解（E.C. 3.4.），特别是蛋白酶（E.C. 3.4.21-99）和其抑制剂，凝血系统、纤溶系统和补体的酶，特别是凝血酶。它们由此充当复杂样品液体，特别是毛细血，中的上述酶，特别是凝血酶，的定量和定性检测的底物。
如在US6352630中详细描述的，需要生物因子，例如促凝血酶原激酶来使得凝血酶级联进行，从而可以测量凝血酶原时间。
与之相比，本发明基于以下原则，即用非生物化学惰性和稳定的化合物代替凝血级联的主要生物组分。因此，本发明的具体试剂混合物不包含促凝血酶原激酶，而是包含一种漆材料，其一方面允许将如上所述的电流凝血酶底物固定并且同时提供所述的凝血级联进行所要求的带负电的表面。本发明出人意料地显示了在这样的试剂混合物中不要求添加另外的生物因子来引发凝血。
优选地，所述非生物化学惰性和稳定的合成化合物通过由本身形成，所述树脂可以被设计为通过向其聚合物主链引入合适的带负电荷的侧链而本身带负电荷。
提供有这种优点并且适用于本发明的传感器的漆材料描述在US2003/0153061中。本发明的试剂混合物包括沉淀在底物表面上的阳极电沉积漆。
可以使用不同的方法将本发明的试剂混合物沉积在底物表面上。所述传感器可以例如通过使用微量吸液管手动分配，通过使用微型泵和可移式注射器自动分配，通过在凝血酶底物和添加剂的存在下电化学诱导沉积电沉积漆，通过滴涂沉积溶液然后干燥或压电点样（piezospotting）制备。
在本发明的优选的实施方案中，该方法包括在表面上沉积包括漆体系的树脂层并且通过干燥固定该树脂层。实验已经表明这种简单的方法对于制备如在实施例3和图3和图4中所示的高度稳定的传感器是合适的。主要优点是该仍然高度有效的方法的简单性。
在本发明的实施例中所使用的另一种方法是电沉积涂漆的方法，其在工业上被用于防止汽车底盘和零部件、散热器和饮料罐的腐蚀。在阳极电沉积中通过在阳极的水的分解释放的质子被用于中和并且由此沉积可溶的聚合物，由于羧酸盐基团而带有负电荷。随后在表面上交联该膜以形成不渗透性的涂层，其具有极好的耐机械和化学性。
为了电沉积，本发明的试剂混合物包含适于电沉积的树脂。由于在目标电极的表面上的质子的产生，产生了树脂沉积，其并入并且从而固定试剂混合物中同时存在的任何分子或化合物。
可以使用任意的适于阳极电沉积的已知的树脂乳液作为树脂乳液。这些当中包括具有在300-50000；600-30000；1000-20000；800-10000；1000-15000范围的更高分子量的有机化合物，然而也可以是更高的分子量，只要它们可以溶解或乳化，由先前给定的值直至50000,70000,100000,250000或甚至1000000，尤其是具有离子本性的电荷的树脂，它们是由组成单体上的官能团产生的。实例为改性的聚苯乙烯、烯烃、聚酰胺以及乙烯基和丙烯酰基化合物，然而也可以是生物化学上感兴趣的聚合物，例如蛋白质、具有官能团的多糖、植物胶、寡核苷酸和多核苷酸。α，β烯属不饱和羧酸聚合物已经证明特别是适用于阳极沉积。
用于阳极电沉积的树脂乳液优选的树脂是基于包含羧基、遮掩的异氰酸酯基、羟基和醚基的共聚合物的树脂制剂，其可以通过与氨水或有机碱至少部分形成盐而溶解或分散在水中，其中该共聚合物包含聚合的：
1. 至少一种具有3-5个碳原子的α，β烯属不饱和羧酸或包含3-5个碳原子的α，β烯属不饱和二羧酸的半酯，
2. 10-35wt%的用CH-，OH-或NH-活性遮掩手段遮掩的N（1-烯基）异氰酸酯，
3. 20-50wt%的380-3500分子量的基于双酚A和环氧氯丙烷的环氧树脂与包含3-5个碳原子的烯属不饱和醇的加合物，
4. 5-64wt%的一种或多种未在1-3中列举的烯属不饱和化合物，其可以是共聚的，条件是共聚合物具有1000和20000之间的平均分子量，包括以使得共聚合物的酸值达到35-150mgKOH/g的量聚合的组分（1）并且在1-4下列举的百分数的总计为100。
上述共聚合物具有1000和20000之间的平均分子量。所述组分以使得共聚合物的酸值达到35-150mg KOH/g的量聚合。在1-4下列举的百分数总计为100。应当强调组分（3）的反应性氢原子与在共聚合物中的遮掩的异氰酸酯基团的当量比优选达到约1:1。此外，乙烯基异氰酸酯或丙烯基异氰酸酯与环己醇、叔丁醇、triazabenzol或[ε]-己内酰胺的加合物优选以异氰酸酯/遮掩手段的摩尔比为1:1使用。特别地，所述共聚合物包含丙烯酸或甲基丙烯酸作为组分（1），用[ε]-己内酰胺遮掩的乙烯基异氰酸酯作为组分（2），约900平均分子量的双酚A和环氧氯丙烷的环氧树脂与烯丙基醇的转化产物作为组分（3），以及聚合的丙烯酸2-乙基己酯或丙烯酸丁酯作为组分（4）。
还优选的是类树脂的物质，其被作为水溶性的类树脂材料和水不可溶性和类树脂物质的混合物使用。所述混合物被分散在水性介质中，其中水是主要组成物。所述水溶性的类树脂材料是聚合物并且通过向聚合物中并入足够的亲水基团来实现水溶性。亲水基团可以是离子盐基团，例如阴离子盐基团，例如羧酸和磺酸盐基团，或阳离子盐基团，例如胺盐基团和季铵盐基团。优选的亲水基团是阴离子基团和特别优选的是羧酸基团的盐。聚合物通常用羧酸基团制备并且随后用水溶性的碱化合物中和，例如有机胺或碱金属氢氧化物。
在这方面“水溶性的”概念是指在没有外部添加的表面活性剂的帮助下，类树脂的材料（可以在水中变得可溶）可以以最高25%的树脂固体组分分散，通常为1-20wt。通常溶液或分散体看起来是光学透明的或半透明的，其中树脂在分散相中存在并且具有0.12μm和更小的平均粒度，通常小于0.03μm。水溶性的类树脂材料的平均粒度可以通过光散射方法确定。
优选的较低分子的水溶性聚合物是丙烯酸共聚物，其具有阴离子电荷，优选羧酸盐基团和尤其优选被有机胺中和的羧酸基团。
在较低分子丙烯酸共聚物之中有通过α，β烯属不饱和羧酸与甲基丙烯酸酯和/或丙烯酸酯的共聚合制备的聚合物，并且通常包括C1-C8的醇的甲基丙烯酸酯作为主要组分和少部分的C1-C8醇的丙烯酸酯的丙烯酸聚合物是合适的。以下化合物是通常的甲基丙烯酸酯和丙烯酸酯：丙烯酸乙酯、丙烯酸丙酯、丙烯酸异丙酯、丙烯酸丁酯、丙烯酸异丁酯、丙烯酸仲丁酯、丙烯酸己酯、丙烯酸2-乙基己酯、丙烯酸辛酯、甲基丙烯酸甲酯、甲基丙烯酸丙酯、甲基丙烯酸异丁酯、甲基丙烯酸丁酯、甲基丙烯酸仲丁酯和甲基丙烯酸叔丁酯。
所采用的丙烯酰聚合物包含0.1-20wt%的聚合的α,β烯属不饱和羧酸单元。可以使用的α,β烯属不饱和羧酸单体是甲基丙烯酸、丙烯酸、衣康酸、乙基丙烯酸、丙基丙烯酸、异丙基丙烯酸和这些酸的同系物。优选甲基丙烯酸和丙烯酸。设置酸的百分数使得在丙烯酸聚合物中产生所需的酸值。丙烯酸聚合物的酸值应当通常以其达到树脂固体组分的约30-100%的方式调节。水溶性的丙烯酸聚合物的数均分子量优选在10000至30000的范围内。
丙烯酸聚合物还可以包含羟基侧基，其通过羟基烷基丙烯酸酯或羟基烷基甲基丙烯酸酯与上述丙烯酸酯的共聚合获得。羟基-侧基提供了用于后续固化(例如与氨基塑料或遮掩的异氰酸酯)的位置。5-15wt%的利用的丙烯酸聚合物优选来自羟基烷基丙烯酸酯或甲基丙烯酸酯。通常可用的羟基烷基丙烯酸酯和甲基丙烯酸酯在烷基中包含1-8个碳原子并且例如为羟乙基丙烯酸酯、羟丙基丙烯酸酯、羟丁基丙烯酸酯、羟乙基甲基丙烯酸酯、羟丙基甲基丙烯酸酯、羟丁基甲基丙烯酸酯、羟己基甲基丙烯酸酯和羟辛基甲基丙烯酸酯。
另外，可以使用乙烯基可共聚化合物来形成可用的丙烯酸聚合物的一部分，例如苯乙烯、乙烯基甲苯、丙烯酰胺、乙烯基二甲苯、烯丙基醇和丙烯腈。
在尤其适合的丙烯酸聚合物中，该聚合物基本上由硬组分（即苯乙烯或低级烷基甲基丙烯酸酯，其中丙烯酰基基团包括1-2个碳原子，或苯乙烯与低级烷基甲基丙烯酸酯（例如乙基丙烯酸酯）的混合物），软组分（即在烷基基团中具有3-8个碳原子的低级烷基甲基丙烯酸酯或在烷基基团中具有2-8个碳原子的低级烷基丙烯酸酯，在烷基基团中具有1-4个碳原子的羟基低级烷基甲基丙烯酸酯或丙烯酸酯，和如上所述的[α],β-烯属不饱和羧酸）组成。
除了水溶性的丙烯酸树脂，由饱和或芳香多羧酸和多醇制备的聚酯也适用于具有较低分子量的聚合物。典型的饱和酯族二羧酸是具有2-10个碳原子的酸酐，例如丁二酸、壬二酸和己二酸，它们适用于这些聚酯的制备。芳香二元酸或它们的酸酐的实例为邻苯二甲酸和偏苯三酸。设置聚酯的酸量使得获得理想的酸值，其对于聚酯应当是20-85。可以用上述酸转化许多多醇以制备想要的酯。尤其适合的二醇例如为乙二醇、1,4-丁二醇、新戊二醇、山梨糖醇、季戊四醇和三羟甲基丙烷。
通过多元醇(如甘油乙二醇)与干燥脂肪酸(如亚麻籽油和妥尔油)缩合制备的醇酸树脂，如聚合物酯，也适合作为水溶性的聚合物。通常加入以获得期望的酸值的另外的组分例如为α,β-烯属不饱和二羧酸或该酸的酸酐，例如马来酸或马来酸酐。
这些醇酸树脂应当优选具有1000-2500的数均分子量和20-85的酸值。
可以用于制备电沉积的另外的较低分子羧酸聚合物是苯乙烯与具有3-10个碳原子的烯属不饱和醇的聚合物，所述烯属不饱和醇例如为烯丙基醇。此外，所述聚合物可以用干燥脂肪酸和用酸组分，例如已经在以上陈述的那些，来转化以获得要求的酸值，通常在20-80的范围。苯乙烯-烯丙基-醇聚合物的数均分子量通常在1000-10000的范围。
环氧酯也适合作为较低分子量的水溶性的树脂。这些材料通过环氧树脂与通常的干燥脂肪酸（例如以上已经叙述的那些）的部分酯化获得，并且该树脂随后用[α],β-烯属不饱和二羧酸或它们的酸酐（例如已经如上所述的那些）酯化。环氧树脂本身优选双酚(如双酚A)的聚缩水甘油醚。
另外的合适的较低分子量类树脂聚合物的实例为不饱和羧酸与干燥油的中和产物，所述不饱和羧酸例如为马来酸或酸酐，所述干燥油例如为亚麻籽油。
另外的阳极电沉积组合物包含（A）15-60wt%的水，（B）15-60wt%的一种或多种有机溶剂，（C）0.1-20wt%的共聚物，所述共聚物是（a）10-75wt%的一种或多种可共聚合的[α],β-烯属不饱和化合物，其与水是不混溶的或部分混溶的，与（b）25-90wt%的一种或多种水溶性的可共聚合的N-乙烯基化合物的共聚物，和（D）10-79wt%的分散在混合物（A）、（B）、（C）中的一种或多种细碎的颜料或填料或颜料和填料的混合物，其中（A）、（B）、（C）和（D）的百分数总和是100。特别地，在这之中的组分（C）是可以通过例如溶剂聚合制备的共聚物。其以0.1-20wt%的量使用，优选3-8wt%，并且包含（a）10-75wt%、优选20-40wt%的一种或多种可共聚合的α,β-烯属不饱和化合物，其与水是不混溶的或仅部分混溶的，和（b）25-90wt%、优选60-80wt%的一种或多种水溶性的可共聚合的N-乙烯基化合物作为可共聚合的单元。
（a）和（b）的百分数总和是100。优选的与水是不混溶的或仅部分混溶的αβ-烯属不饱和化合物（a）为C2-C18-单羧酸的乙烯基酯，例如乙酸乙烯酯、丙酸乙烯酯、新戊酸乙烯酯、己酸乙烯基-2-乙酯和硬脂酸乙烯酯，和/或C4-C18-醇的丙烯酸酯或甲基丙烯酸酯，例如丙烯酸丁酯和甲基丙烯酸丁酯、丙烯酸2-乙基己酯、丙烯酸辛酯和丙烯酸十八酯。特别优选的单体是丙酸乙烯酯。丙烯酰胺或甲基丙烯酰胺、乙烯基醚和/或乙烯基芳烃(如苯乙烯)的衍生物也是合适的，其在水中是不溶的或微溶的。
优选的水溶性的N-乙烯基化合物（b）的实例为N-乙烯基吡咯烷酮、N-乙烯基哌啶酮和N-乙烯基咪唑。
根据本发明优选的电沉积乳液选自Resydrol漆、Resydrol AY 498w/35WA、 Resydrol AM 410w/67WABG、Cathodip GY83-0270 0005、WA-Tauchlack von FreiLack GmbH、Freitherm-Elektrotauchlack KTL automotive ?upgrade“、BASF GY80-0636-0001 KM1。
可以任选地将水加入到可商业获得的电沉积漆悬浮液中，其中水应当尽可能地纯。优选HPLC质量的水。此外，可以使用任何其它通常添加到树脂层的材料。这种材料例如为软化剂、乳化剂、粘合促进剂、疏水化或亲水性的材料、交联剂、防沫剂等。
在电沉积漆悬浮体的生产和制备中主要发挥乳化剂或交联剂功能的合适的添加剂为阴离子、阳离子或两性表面活性剂，尤其是非-离子化(non-ionogen)表面活性剂。在这方面，合适的可商购的产品在以下列出：
1. Triton (X-100, X-114, X-405 etc.)：烷基苯基聚乙二醇 (Fluka)
2. Tween (20, 40, 60 等)：
Tween 20：聚氧乙烯山梨醇酐单月桂酸酯 (Merck)
Tween 40：聚氧乙烯山梨醇酐单棕榈酸酯 (Merck)
Tween 60：聚氧乙烯山梨醇酐单硬脂酸酯 (Merck)
Tween 65：聚氧乙烯山梨醇酐三硬脂酸酯 (Merck)
Tween 80：聚氧乙烯山梨醇酐单油酸酯 (Merck)
Tween 85：聚氧乙烯山梨醇酐三油酸酯 (Merck)
3. Nonidet P40：辛基-苯基-聚乙二醇 (Fluka)
4. Brij (35, 56, 58 等)：(Merck)
Brij 35：聚氧乙烯月桂基醚
Brij 56：聚氧乙烯-(10)-十六烷基醚
Brij 58：聚氧乙烯-(20)-十六烷基醚
5. 辛基 [β]-葡萄糖苷 (Pierce)
6. 辛基 [β]-硫代吡喃葡萄糖苷 (Pierce)
7. SDS：十二烷基硫酸钠 (Fluka)
8. CHAPS：3-[(3-胆酰胺丙基)-二甲基氨基]-丙磺酸盐 (Fluka)
9. CHAPSO：3-[(3-胆酰胺丙基)-二甲基氨基]-2-羟基-丙磺酸盐 (Fluka)。
实施例
实施例1: 用于沉积在传感器上和将感应组分固定在传感器表面上的树脂层的制备
为了传感器的形成制备了以下溶液（#1至#5）：
#1.　Hepes-缓冲液 (50 mM，pH7.4，KCl 100 mM): 在90ml的DI水中1.19g HEPES和 0.75g KCl。用NaOH将pH值调节至7.4。并且用DI水增加体积至100ml。   
#2.　钠-脱氧胆酸盐溶液: 在1500μl 的Hepes-缓冲液（#1）中的3.8 mg钠脱氧胆酸盐。   
#3.　10 μl磷脂酰丝氨酸+ 35 μl钠-脱氧胆酸盐溶液(#2)。   
#4.　活化溶液: 45 μl #3溶液 + 1080 μl Hepes-缓冲液 (#1)。   
#5.　沉积溶液: 0.3 mg 凝血酶底物 + 890 μl #4 活化溶液(在超声浴中5分钟) + 30 mg光谱煤(spectral coal)，4 mg 膨润土 SF和110 μl resydrol AY。
可以变化沉积溶液以将另外的化合物共同固定在传感器表面上。在那种情况下，#5溶液的组成在凝血酶底物的量、活性溶液#4的体积和resydrol AY的量方面保持恒定。如果不同于溶液#5，则对于每一实施例给出了沉积溶液的确切组成。
实施例2: 通过电沉积将感应组分固定在传感器表面上。
在超声波浴中在异丙醇中洗涤传感器15分钟，用水冲洗并且干燥。用移液管将50μl的沉积溶液（#5）的液滴移到传感器的表面上，所述传感器表面水平固定在支架上。将Ag/AgCl/3 M KCl 参比电极和铂丝对电极插入该液滴中。为了电沉积，质子必须在工作电极的表面本地产生，其通过电势脉冲引发至至少2.2V的电位，引起水氧化。至沉积电位的持续时间为最多2s、优选0.5s随后是在小于1V优选小于0V的无效果电位下至少2s、优选5s的休止期的脉冲的数目可以变化并且决定了沉积漆膜的厚度。电势脉冲的数目为至少1，更好为5和优选在10-50个脉冲之间。在电沉积之后，用缓冲溶液（#1）冲洗传感器。
实施例3: 通过分配和干燥将传感元件固定在传感器表面上。
在超声波浴中在异丙醇中洗涤传感器15分钟，用水冲洗并且干燥。使用移液管手动或使用基于注射器泵的分配器自动将5μl的沉积溶液（溶液#5）沉积在传感器的工作电极上。在将沉积溶液放置在工作电极的表面上之后，将改性的传感器在37℃下干燥3小时。
实施例4: 凝血时间的电流测定。
为了测定凝血时间，将传感器与稳压器接触，优选如在图1中所示的仪器。使用移液管，将7μl对照血浆N（N），对照血浆P（P）或血液（B）滴在干燥传感器表面上。在样品添加的时刻，关闭该电路并且将+0.3V的工作电位施加到工作电极上，同时检测电流。设置添加样品的时刻为测量的零点。随着时间记录电流并且通过凝血酶底物的氧化电流可以监控凝血的过程。在血液凝固期间，凝血酶底物被劈开并且由此移动的氧化还原活性标记(tag)可以到达待在施加的电位下氧化的电极表面。电流代表了及时地劈开的凝血酶底物分子的数目并且由此与凝结相关。
实施例5: 固定方法的比较。
测试了是否可以省略电沉积步骤（如在实施例2中所描述的）并且作为替代仅在传感器表面上干燥沉积溶液（如在实施例4中所描述的）以简化传感器的制备。为了测量，使用了如在图1中所描述的设置。施加的电势脉冲图为2.2V 0.2秒和0V 5秒，并且重复10次。将电压施加到传感器的工作电极以及参比电极和对电极上，它们被浸没在底物溶液。在图3中显示了通过用电沉积步骤固定沉积溶液或通过简单干燥制备的传感器的测量结果。
图3显示了传感器的随时间的电流响应曲线，所述传感器通过以下制备A）10个沉积脉冲由#5溶液的聚合物沉淀（在沉积溶液中不存在生物活化剂Thromborel S）；虚线（a）血浆N；点线（b）：全血；黑线（c）：血浆P；B）通过干燥而在沉积溶液中无Thromborel S的聚合物沉淀；虚线（a）：血浆N；点线（b）：全血；黑线（c）：血浆P；C）总结电沉积的传感器的结果的条状图（200s后的电流；1.血液（n=2）；2）血浆N（n=9）；血浆P（n=7）；D）总结干燥的传感器的结果的条状图，1）血浆N（n=17）；2）血液（n=2）；3）血浆P（n=14））。
实施例6: 通过电沉积（参见实施例2）和通过干燥（参见实施例3）制备的传感器的长期稳定性的比较。
将传感器置于通常用于分配这种传感器的塑料管中（具有2cm直径的圆柱体，用螺丝帽密封）。将这些容器置于擦板（wip-board）上，以0.1Hz的频率擦拭它们并且允许其从右滚到左并返回最多33天。将另一组相似制造的传感器置于37℃的温育箱中最多33天。使用如图1中所示的设置将温育或摇动了0、3和33天的传感器用于实施例4中所描述的测量。图4显示了在不同温育时间后传感器测量的随时间变化的电流以及在200和350s之后测量的电流和迁移的电荷。
A) 200s之后的电流
a) 直接在传感器制备后，血浆 N (n=6)；b) 直接在传感器制备后，血浆 P (n=6)；c) 在3天后，血浆 N (n=8)；d) 在3天后，血液(n=1)；e) 在3天后，血浆 P (n=6)；f) 在33天后，血浆 N (n=5)；g) 在33天后，血液(n=4)；h) 在33天后，血浆 P (n=2)；i) 在33天连续摇动后，血浆 N (n=4)；j) 在33天连续摇动后，血液(n=2)；k) 在33天连续摇动后，血浆 P (n=2)；
沉积溶液#5a: 0.3 mg 凝血酶底物+ 890 μl 活性溶液B (在超声波浴中15 分钟) + 29.9 mg 光谱煤，4 mg Kieselguhr和110 μl resydrol AY。
B) 在200秒和300秒之后的电荷
a) 直接在传感器制备后，血浆 N (n=6)；b) 直接在传感器制备后，血浆 P (n=6)；c) 在3天后，血浆 N (n=8)；d) 在3天之后，血液(n=1)；e) 在3天之后，血浆 P (n=6)；f) 在33天之后，血浆 N (n=5)；g) 在33天之后，血液(n=4)；h) 在33天之后，血浆 P (n=2)；i) 在33天连续摇动后，血浆 N (n=4)；j) 在33天连续摇动后，血液 (n=2)；k) 在33天连续摇动后，血浆 P (n=2)；
沉积溶液#5a：0.3 mg 凝血酶底物+ 890 μl活性溶液B (在超声波浴中15分钟) + 29.9 mg 光谱煤，4 mg Kieselguhr和110 μl resydrol AY。
实施例7: 在带负电荷的碳纳米管的存在下制造的传感器。
按照实施例3（分配和干燥）额外地使用带负电荷的碳纳米管的溶液（溶液#6）制造传感器，将其添加到沉积溶液中形成溶液#5c：
·溶液#6：将15.7mg的碳纳米管在110℃100ml HNO3中搅拌90分钟；过滤所述溶液，用DI水洗涤纳米管并且在80℃下干燥3小时。
沉积溶液#5c：0.4 mg 凝血酶底物+ 1000 μl活化溶液#4 (在超声波浴中15分钟)。向445μl的此溶液中添加1mg带负电荷的纳米管和55mg的resydrol AY。将该溶液在超声波浴中悬浮5分钟。
图5显示了在带负电荷的碳纳米管的存在下制造的传感器获得的凝血时间。A）实线（a）：血浆N；点线（c）：血液；虚线（b）：血浆P，B）在200s后的电流：a）血浆N（n=4）；b）血浆P（n=2）；c）血液（n=1）。
实施例8：在增加量的带负电荷的碳纳米管的存在下制造的传感器。
按照实施例3（分配和干燥）额外地使用如实施例7中所示的带负电荷的碳纳米管的溶液制造传感器，然而，将增加量的带负电荷的碳纳米管（溶液#6）加入到沉积溶液中形成溶液#5d：
沉积溶液#5c：0.4mg凝血酶底物+1000μl活化溶液#4 (在超声波浴中15分钟)。向510μl的沉积溶液中加入6.9mg带负电荷的碳纳米管和63.2μl的resydrol AY。将该溶液在超声波浴中悬浮5分钟。
图6显示了在带负电荷的碳纳米管的存在下制造的传感器获得的凝血时间。A）实线（a）：血浆N；点线（c）：血液；虚线（b）：血浆P。B）在200秒之后的电流：血浆N（n=4）；b）血浆P（n=2）；c）血液（n=1）。

Claims (7)

1.一种凝血时间测量传感器，包括表面、施加于其上的树脂层，所述树脂层包含至少一种具有检测功能的物质，其特征在于所述树脂层包含一种漆体系，其中所述漆体系：
i）适于将所述至少一种具有检测功能的物质固定在所述表面上；和
ii）提供带有负电荷的表面层；
iii）和允许用非生物化学惰性和稳定的化合物代替生物凝血促进剂。
2.根据权利要求1的凝血测量传感器，其中通过非生物化学惰性和稳定的化合物提供带有负电荷的表面层。
3.根据权利要求1-2中任一项的凝血测量传感器，其中所述漆体系是带有负电荷的丙烯酸基电沉积聚合物。
4.根据权利要求3的凝血测量传感器，其中带有负电荷的丙烯酸基电沉积漆选自Resydrol漆家族。
5.根据权利要求1-4中任一项的凝血测量传感器，其中所述树脂层进一步包含带有负电荷的粘土材料，如膨润土、硅藻土，或其它带有负电荷的添加剂，如氧化的碳纳米管。
6.根据权利要求1-5中任一项的凝血测量传感器，其中所述至少一种具有检测功能的物质包括至少一种具有一个末端连接的化学底物，所述末端连接可被酶切掉以产生带电荷的化合物。
7.根据权利要求6的凝血测量传感器，其中所述具有一个可被酶切掉以产生带电荷的化合物的末端连接的化学底物试剂是电流型凝血酶底物且所述酶是凝血酶。
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