KR20140014068A - 박테리아 독소에서 유래된 수송 서열을 이용한 생물활성제 시스템 및 방법 - Google Patents

박테리아 독소에서 유래된 수송 서열을 이용한 생물활성제 시스템 및 방법 Download PDF

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Abstract

비브리오 콜레라의 콜릭스 유전자의 무독성 돌연변이 형태(nt콜릭스), 아미노산 A386에서 절삭된 콜릭스 변이형(콜릭스386) 및 생물학적으로 활성이 있는 치료제의 장내 전달을 향상시키기 위한 기타 다양한 콜릭스 유래 폴리펩티드 서열의 용도. 본원에 기술된 시스템 및 방법은 다음을 제공한다: 주사 없이 거대분자 투여량을 전달하는 능력; siRNA 또는 안티센스 분자와 같은 (그러나 이에 한정되지 않는) 수송 대상(cargo)을 그 활성이 요구되는 세포 내 구획으로 전달하는 능력; 및 본 발명이 아니었다면, 대부분 생물학적 막의 장벽성 때문에 방해 받았을, 나노 입자 및 덴드리머 기반 전달체의 그러한 막을 가로지른 전달.

Description

박테리아 독소에서 유래된 수송 서열을 이용한 생물활성제 시스템 및 방법{SYSTEMS AND METHODS OF DELIVERY OF BIOACTIVE AGENTS USING BACTERIAL TOXIN-DERIVED TRANSPORT SEQUENCES}
<관련 특허 출원>
본 출원은 전체로서 본원에 참조로 통합된, 2010년 9월 15일 출원된 미국 가출원번호 제61/403,394호의 이익을 주장한다.
<기술분야>
본 발명의 분야는 부분적으로는 신규한 제약학적 응용을 위한 전략에 관한 것이다. 더욱 구체적으로는, 본 발명은 비브리오 콜레라(Vibrio cholera)의 콜릭스(Cholix) 유전자의 무독성 돌연변이 형태(nt콜릭스), 아미노산 A386에서 절삭된 콜릭스 변이형(콜릭스386) 및 생물학적으로 활성이 있는 치료제의 장내 전달을 향상시키기 위한 기타 다양한 콜릭스 유래 폴리펩티드 서열의 용도에 관한 것이다. 중요하게는, 본원에 기술된 시스템 및 방법은 다음을 제공한다: 주사 없이 거대분자 투여량을 전달하는 능력; siRNA 또는 안티센스 분자와 같은 (그러나 이에 한정되지 않는) 수송 대상(cargo)을 그 활성이 요구되는 세포 내 구획으로 전달하는 능력; 및 본 발명이 아니었다면, 대부분 생물학적 막의 장벽성(barrier property) 때문에 방해 받았을, 나노 입자 및 덴드리머 기반 전달체의 그러한 막을 가로지른 전달.
현재 승인된 저분자 약물 대부분은 체순환에 전달을 제공하고자 소장의 점막을 가로질러 흡수된다. 사실, 저분자 약물은 안정성 및 소장 점막을 가로지른 효율적인 흡수를 기초로 하여 선택된다. 생물학적으로 활성이 있는 폴리펩티드(아미노산 잔기로 이루어진 고분자를 일컬으며, 전형적으로 단백질 또는 펩티드로 정의됨)의 비슷한 경구 전달은 제약 산업의 오랜 목표였다. 위장관(GI tract)은 식이 단백질과 펩티드를 소화시키고자 설계된 것이므로, 저분자로 달성할 수 있는 것과 마찬가지 방식으로, 소장으로부터 치료용 단백질과 펩티드 흡수의 실현 가능성을 제한하는 물리적, 생리적 및 생물학적 장벽들은 매우 많다(Mahato, R.I., et al., Crit Rev Ther Drug Carrier Syst , 20(2-3):p. 153-214 (2003)).
치료용 단백질과 펩티드를 위를 통과하여 보호하는 데 이용될 수 있는 여러 가지 기술들이 밝혀져, 그것들이 소장의 상피세포의 흡수표면에 도달할 수 있게 하고, 식이 단백질과 펩티드를 분해하는 기능을 하는 위와 장 환경으로부터 그것들을 분리할 수 있게 한다. 그러나 불행히도, 이러한 단일막의 단순 세포를 가로지르는 효율적인 수송은, 내강 표면에서 폴리펩티드의 엔도솜 흡수 후, 파괴적인 리소좀 구획으로의 세포 내 이동 때문에 상당한 장벽으로 남아 있다(Woodley, J.F., Crit Rev Ther Drug Carrier Syst , 11(2-3):p. 61-95 (1994)). 사실, 이 장벽은 이들 거대분자들이 아미노산 및 디펩티드 또는 트리펩티드 수송체를 통한 흡수를 위해 충분히 분해될 수 있을 때까지 단백질과 펩티드의 흡수를 저해하고자 설계된 것이다. 이러한 관점에서, 소장 점막의 물리적, 생리적 및 생물학적 장벽을 극복하기 위한 여러 가지 노력들이 조사되었다.
소장 점막의 세포 장벽을 구성하는 단순 상피를 가로지르는 두 가지 기본적인 경로가 있다. 구체적으로, 일단 상피를 덮고 있는 점액층을 가로지르면, 분자는 인접한 상피세포 사이를 이동할 수 있거나(부세포 경로), 세포질의 내용물을 수송하지만, 그것들과 섞이지 않는, 일련의 소포를 통해 세포들을 통과하여 이동할 수 있다(경세포 경로)(T. Jung et al., Eur J Pharm Biopharm , 50:147-160 (2000)). 다시 말하면, 두 가지 경로에서, 수송 단백질 또는 펩티드 치료제는 세포 안으로 들어가지 않고, 오히려 세포의 세포질 외부에 있는 환경에 머무른다.
부세포 경로를 통한 펩티드의 이동과 치료용 단백질의 일상적인 이동에 대한 일차적인 장벽은 이러한 세포들의 치밀이음부(tight junction, TJ)로 알려진 꼭대기쪽의 목 부분에 있는 단백질 복합체이다. 치밀이음부 구조의 일시적인 개폐는 장 상피를 가로지르는 펩티드의 수송을 촉진할 수 있지만, 이러한 접근법은 핵심적인 한계가 있다. 예를 들어, 그것은 약 5kDa을 넘는 분자에는 그다지 잘 작동하지 않고, 장 내강으로부터 신체로 물질의 비선택적인 진입 가능성이 있으며, 장 상피의 표면 영역의 매우 작은 부분만이 관여되는 경로를 나타낸다.
경세포 경로를 통한 세포들을 가로지르는 단백질 또는 펩티드 치료제의 일상적인 이동에 대한 일차적인 장벽은 이러한 소포들의 내용물을 파괴적인 (리소좀) 경로로 전달하는 불이행 소포 이동(default vesicle trafficking)이다. 부세포 경로와 비교하여, 소포 경세포 경로를 통한 이동은 지름이 100nm 정도의 큰 물질을 수용할 수 있고, 필수적으로 전체 상피 세포 표면이 관여하며, 소포 진입을 위한 수용체-리간드 상호작용의 활용을 통한 물질의 흡수에서 매우 선택적일 수 있다. 따라서, 경세포 경로는 파괴적인 경로가 회피될 수 있다면, 단백질 또는 펩티드 치료제의 상피 수송에 있어 매우 매력적이다.
일부 병원균은 숙주의 감염을 촉진 및/또는 안정화하는 기능을 하는, 분비된 폴리펩티드 독성 인자의 효율적인 트랜스시토시스(transcytosis)에 의해 보여지는 바와 같이 이동 장벽 문제를 해결했다. 균체외 독소는 강력한 독성 인자로 기능하는 다양한 미생물에 의해 방출되는 단백질 부류를 나타낸다. 균체외 독소는 인간에서 강력한 독소로 작용하는 능력으로 다세포생물에 기능한다(Roszak, D.B., and Colwell, R.R., Microbiol Rev 51:365-379 (1987)). 이들 단백질은 보통 단백질 합성의 선택적인 붕괴를 수반하는 메커니즘을 통해 숙주세포를 죽이거나 불활성화시킨다. 따라서, 숙주세포를 죽이는 데 겨우 소수의 분자가 필요하고, 이는 박테리아의 균체외 독소가 알려진 가장 독성이 큰 물질 중 일부라는 관찰 결과와 일치한다. 코리네박테리움 디프테리아(Corynebacterium diphtheria)의 디프레리아 독소(DT), 슈도모나스 애루기노사(Pseudomonas aeruginosa , PE)의 균체외 독소 A, 및 비브리오 콜레라(Vibrio cholera)의 콜릭스라는 최근에 밝혀진 단백질로 이루어진 단백질 패밀리로 구성된 이들 단백질의 부분집합은 신장인자2(EF2)의 ADP-리보실화를 통해 숙주세포를 중독시키는 기능을 한다(Yates, S.P., et al., Trends Biochem Sci , 31:123-133 (2006)). 이러한 균체외 독소들은 숙주세포의 표적화, 진입 및 중독에 있어서 특이적인 기능들을 나타내는 것으로 밝혀진, 별개의 도메인들로 접히는 단일 사슬 아미노산으로 합성된다.
슈도모나스 애루기노사(PE)의 균체외 독소 A의 생물학은 최근 기술된 바 있다(Mrsny, R.J., et al., Drug Discov Today , 7(4): p. 247-58 (2002)). PE는 66828.11Da의 이론적인 분자량(MW)과 등전점(pI) 5.28을 나타내며, 도메인 I(Ala1-Glu252), 도메인 II(Gly253-Asn364), 도메인 III(Gly405-Lys613, ADP-리보실기 전달효소(ribosyltransferase) 활성부위 함유)와 Ib 루프(Ala365-Gly404)로 알려진, 도메인 II와 도메인 III를 연결하는 짧은 이황화 연결된 루프로 표시된, 세 개의 분리된 도메인으로 기능적으로 접히는 613개 아미노산의 단일 사슬로 이루어져 있다. pH 8.0에서 이들 도메인의 구조화는 약 1.5Å의 해상도에서 결정 회절로부터 결정되었다(Wedekind, J.E. et al., J Mol Biol , 314:823-837 (2001)). 도메인 I(Ia + Ib)은 13가닥으로 된 β-롤로 이루어진 핵을 가지고 있고, 도메인 II는 여섯 개의 α-나선 구조로 이루어져 있으며, 도메인 III는 복잡한 α/β-접힘 구조를 가지고 있다. 여러 연구 결과는 PE의 모듈식 속성이 개별적인 도메인 기능을 가능하게 한다는 아이디어를 지지했다. 즉, 도메인 I은 숙주세포 수용체와 결합하고, 도메인 II는 막 위치 변경에 관여하며, 도메인 III은 ADP-리보실기 전달효소로 기능한다. PE는 아마도 환경적 단서 및/또는 세포 신호에 반응하여, 슈도모나스 애루기노사에 의해 상피세포 선단 표면에 아주 가까운 곳에서 분비되는 것으로 보인다(Deng, Q. and J.T. Barbieri , Annu Rev Microbiol , 62:p. 271-88 (2008)). 일단 분비되면, PE의 도메인 I이 저밀도 지질단백질 수용체 관련 단백질 1(low-density lipoprotein receptor-related protein 1, LRP1) 또는 CD91로도 알려져 있는 단백질인 막 단백질 α2-매크로글로불린에 결합한 후에 세포로의 내재화(internalization)가 일어난다. 예컨대, FitzGerald, D.J., et al., J Cell Biol, 129(6):p. 1533-41 (1995); Kounnas, M.Z., et al., J Biol Chem , 267(18): p. 12420-3 (1992) 참조. 내재화 후, PE는 리소좀으로 이동되는 것을 피하고, 그 대신, 세포의 기저측 표면으로 효율적으로 전달되며, 그곳에서 생물학적으로 활성이 있는 형태로 분비된다(Mrsny, R.J., et al., Drug Discov Today , 7(4): p. 247-58 (2002)). 일단 상피세포를 가로지르면, PE는 점막 하 공간 내의 CD91 양성 세포(대식세포와 수지상 세포)로 들어가 독성 인자로서 기능하며, 그런 다음 그곳에서 도메인 III의 세포질 전달로 이어지는 풀림 경로(unfolding pathway)와 교차한다. 예컨대, Mattoo, S., Y.M. Lee, and J.E. Dixon, Curr Opin Immunol , 19(4): p. 392-401 (2007); Spooner, R.A., et al., Virol J, 3: p.26 (2006) 참조.
비브리오 콜레라 박테리아는 동명의 독성 물질인 콜레라 독소(CT)로 가장 잘 알려져 있으며, 이 독소는 급성의 생명을 위협하는 심각한 수성 설사를 유발할 수 있다. CT는 B 서브유닛의 오량체로 조직화된 단일 A 서브유닛으로 이루어진 단백질 복합체로, 상피의 선단 표면에 있는 세포 표면의 GM1 갱글리오사이드 구조에 결합한다. CT는 CTXf 또는 CTXφ라는 용원성 박테리오파지의 변이형을 전달하는 비브리오 콜레라의 악성 균주와의 수평적 유전자 이동 후에 비브리오 콜레라에 의해 분비된다. 그러나 최근의 콜레라 집단발병은 일부 혈청군의 균주들(non-O1, non-O139)이 CT를 발현하지 않고, 오히려 다른 독성 인자를 이용한다는 점을 시사했다. non-O1, non-O139의 환경 데이터와 임상 데이터에 대한 상세한 분석 결과는, PE와 일부 유사점이 있는, 신규 추정 분비 균체외 독소의 존재를 시사하였다.
문헌(Jorgensen, R. et al., J Biol Chem , 283(16):10671-10678 (2008))에서는, 비브리오 콜레라의 일부 균주가 실제로 PE와 유사점을 가지고 있는 단백질 독소를 함유하고 있음을 보고하였으며, 그들은 이를 콜릭스 독소(Cholix)라고 이름 붙였다. PE와 비교하여, 콜릭스는 약간 더 큰 이론상의 분자량(70703.89 Da)과 약간 더 산성인 이론상의 pI(5.12)를 나타낸다. 634개 아미노산의 콜릭스 단백질의 결정 구조는 약 2Å까지 분석되었다. 도메인 구조와 조직화는 도메인 I(Val1-Lys265), 도메인 II(Glu266-Ala386), 도메인 III(Arg426-Lys634) 및 Ib 루프(Ala387-Asn425)로 이루어져, PE와 다소 비슷한 것으로 밝혀졌다. PE와의 추가적인 구조적 유사점으로 세포 활성화를 위한 퓨린 단백질 분해효소 부위, 숙주세포의 소포제로 독소를 보낼 수 있는 C-말단 KDEL 서열, 그리고 도메인 III 내의 ADP-리보실기 전달효소 활성부위를 포함한다.
놀랍게도, PE와 콜릭스는 아미노산 정렬에 의한 유의미한 유전적 및 한정된 유사점을 전혀 공유하지 않는다. PE 유사 뉴클레오티드 서열에 대한 비브리오 콜레라의 게놈 검색은 임의의 종류의 일치점을 찾는 데 실패했다. PE 유사 단백질이 이 박테리아에 의해 생산될 수 있다는 힌트는 단백질 서열 수준에서만 존재한다. 이 점에 있어서도, 도메인 III의 ADP 리보실화 부위에 초점을 둔 유사점(42% 상동성)이 있는 PE와 콜릭스의 아미노산 사이에는 겨우 32% 상동성이 있을 뿐이고, 두 단백질의 도메인 I과 도메인 II의 대부분 세그먼트에 대해서는 낮은 수준의 아미노산 상동성(약 15~25%)이 있다. 더구나, 비슷한 요소들이 있는 이들
두 단백질은 슈도모나스 애루기노사는 GC가 많은 박테리아지만, 비브리오 콜레라는 AT가 많다는 두 개의 구별되는 방향으로부터 유래되었기 때문에 PE에 대한 콜릭스의 이러한 전반적인 정렬 결과는 훨씬 더 놀랍다. 이들 두 독소가 두 가지 서로 다른 유전적 방향으로부터 발달하여, 거의 동일한 구조이지만, 겨우 32%의 상동성을 나타내는 결과에 이르렀다는 점은 콜릭스와 PE의 구조적 유사점과 기능적 유사점은 비슷한 유전적 배경을 통해서라기 보다는 비슷한 생존적 압박을 기초로 했을 가능성이 높다는 점을 시사한다. 이들 두 단백질의 도메인 I과 도메인 II의 매우 낮은 아미노산 상동성은 이들 두 단백질의 아미노산 서열이 아닌, 접힌 구조의 기능적 중요성을 강조한다.
콜릭스와 PE의 C-말단 부분은 EF2의 ADP-리보실화를 통한 세포의 중독에서 비슷한 방식으로 기능하는 것으로 보인다. 트랜스페린 수용체를 대상으로 한 항체와의 접합을 통해 콜릭스의 후반부(도메인 I 결실)로 암세포를 표적화한 최근 연구는 EF2의 ADP-리보실화에 관여하는 PE와 콜릭스의 C-말단 부분이 실제로 기능적으로 유사하다는 점을 시사한다(Sarnovsky, R., et al., Cancer Immunol Immunother 59:737-746 (2010)). 콜릭스의 이러한 원위부는 PE와 36% 동일하고 50% 유사하지만, PE의 이러한 동일한 원위부에 대해 중화 면역 반응을 나타내는 환자의 혈청뿐만 아니라 동물에서 형성시킨 다클론성 항형철은 콜릭스의 이 후반부와 교차 반응하는 데 실패했다. 유사하게, 이러한 콜릭스로 형성된 혈청은 PE와 교차 반응하는데 실패하였다. 이러한 데이터는 PE와 콜릭스는 모두 비슷한 메커니즘을 통해 세포를 중독시키는 능력을 공유하고, 이들 두 단백질은 공통적인 핵 구조를 공유하지만, 이들 단백질 표면에서 발현되는 요소들에는 현저한 차이가 있음을 시사한다.
PE를 이용한 이전의 연구 결과, 이러한 독소는 중독 없이 시험관 내에서 그리고 생체 내에서 상피세포의 분극화된 단일 층들을 가로질러 용이하게 수송한다는 점을 증명함에 따라(Mrsny, R.J., et al., Drug Discov Today , 7(4): p. 247-58 (2002)), 본 발명자들은 콜릭스의 근위부의 기능적 측면, 구체적으로, 장 상피 단일층을 가로지르는 수송을 촉진하기 위한 도메인 I과 도메인 II의 이용 에 특별히 초점을 두어 콜릭스의 성질과 생물학을 더 평가하고자 연구를 시작하였다. 도메인 I과 도메인 IIa가 상피 트랜스시토시스에 필요한, 유일한 PE의 필수적인 요소로 보이므로, 콜릭스에서 이러한 동일한 도메인을 조사하는 것이 특히 중요했다. 앞서 언급한 바와 같이, 도메인 I과 도메인 IIa의 일부분으로 여겨지는 영역들 대부분에 대해서는 약 15% ~ 25%의 아미노산 상동성이 있다. 본 발명자들은 생체 내에서 상피 표면으로의 콜릭스 적용 후의 콜릭스의 생물학적 분포 모니터링, 시험관 내에서 분극화된 상피세포 단일층을 가로지르는 콜릭스의 경세포 수송 특성 평가, 및 콜릭스 단백질의 C-말단에 유전적으로 통합시킨, 생물학적으로 활성이 있는 수송 대상의 전달이라는 일련의 연구를 통해 도메인을 조사하였다. 콜릭스의 처음 두 개의 도메인(아미노산 1~386)을 녹색 형광 단백질(GFP)에 유전적으로 융합시키거나 또는 이렇게 발현된 도메인을 100nm 지름의 라텍스 비드에 화학적으로 결합시켜 발생시킨 예비 데이터는 100nm 라텍스 비드에 부착된 콜릭스가 시험관 내와 생체 내에서 장의 상피 단일층을 가로질러 이동하는 것이 관찰되었다는 점을 증명하였다. GFP 수송 대상이 트랜스시토시스 과정 도중 및 이러한 과정 후, 자신의 형광 특성을 보유한다는 점도 콜릭스가 분극화된 상피 세포 사이로 비파괴적인(또는 특별한) 이동 경로를 활용한다는 주장을 지지한다. 이러한 결과는 기도와 위장관에 있는 것들과 같은, 신체의 상피 장벽을 가로질러 생물학적으로 활성이 있는 수송 대상을 전달하는 도구로서 그것의 (반복된) 적용에 좋은 징조이다.
또한, 예비적인 연구에서 나온 중요한 언급사항은 PE와 콜릭스 사이의 명백한 세포 수용체 상호작용의 차이를 시사하는 관찰 내용이다. 이전에 언급한 바와 같이, PE는 PE의 도메인 I이 저밀도 지질단백질 수용체 관련 단백질 1(LRP1) 또는 CD91로도 알려져 있는 단백질인 막 단백질 α2-매크로글로불린과 결합한 후에 상피세포로 들어간다. 콜릭스의 표면 수용체의 정확한 정체가 아직 확립되지는 않았지만, 예비적인 연구결과는 콜릭스가 CD91을 발현하는 일부 세포주는 중독시키지 않지만, CD91을 발현하는 일부 세포주를 중독시킨다는 점을 시사한다. CD91 이외의 다른 어떤 수용체가 PE의 상피 트랜스시토시스와 관련이 있는지는 현재로서는 불분명하다. 그럼에도, 콜릭스와 PE는 별개의 세포 수용체 상호작용을 나타내는 것으로 보여, 경구 생물제제, 그리고 생물활성제제의 세포 내 전달 모두를 위한, 매우 상이하고 예상하지 못한 적용을 시사하기에 충분한 명백한 차이를 보여준다.
본 발명은 콜릭스의 막 이동 성질 및 콜릭스가 기도 및 장의 분극화된 상피세포를 가로질러 효율적으로 이동한다는 점에 관한 설명을 기초로 한 것으로, 콜릭스 유래 폴리펩티드 서열(단백질의 근위 요소들을 포함)이 단백질 및 나노 입자의 효율적인 트랜스시토시스에 이용될 수 있음을 시사하고, 신규한 제약적 적용을 위한 전략을 제시한다.
그와 같이, 본 발명의 일 양상은 수송체 도메인(예컨대, 콜릭스 유래 폴리펩티드 서열)과 수송 대상(cargo)을 포함한 분리된 전달 구조체(예컨대, 유전자 융합 또는 화학적 구조체)를 제공하는 데에 있다. 수송 도메인과 수송 대상은 모두 다양한 화학량론적 비(stoichiometric ratio)와 공간 구성으로 발현/연결될 수 있다. 또한, 상이한 수송 대상이 동일한 구조체 위에 발현/연결될 수 있다. 바람직한 구현예에서 그러한 수송 대상은 단백질, 펩티드, 저분자, siRNA, PNA, miRNA, DNA, 플라스미드 및 안티센스 중 하나 또는 임의의 하나를 포함할 수 있다.
본 발명의 다른 양상은 주사 없이 거대분자와 같은 수송 대상을 전달하는 능력을 제공하는 데에 있다.
본 발명의 다른 양상은 거대분자, 저분자, siRNA, PNA, miRNA, DNA, 플라스미드 및 안티센스 분자와 같은(그러나 이에 한정되지 않음) 수송 대상을 그들의 활성이 필요한 세포 내 구획으로 전달하는 능력을 제공하는 데에 있다.
본 발명의 다른 양상은 생물학적 막을 가로질러 나노 입자 및/또는 덴드리머 기반 전달체의 전달을 통한 수송 대상의 수송을 제공하는 데에 있다.
본 발명에 이용하고자 고려되는 투여/전달 방법은 예컨대, 경구 투여, 폐 투여, 비강 내 투여, 협측 투여, 혀밑 투여, 안구 내 투여(유리체, 각막, 결막, 공막 및 안구의 앞뒤 구획을 포함하나, 이에 한정되지 않음), 국소 적용, 주사(바늘 또는 바늘 없는), 정맥 내 주입, 미세침 적용, 약물 데포형 제제(depot formulation)를 통한 투여, 척수관 내 적용을 통한 투여, 복강 내 적용을 통한 투여, 관절 내 적용을 통한 투여, 세포 내 전달, 혈액뇌장벽을 가로지른 전달, 국소 전달 및 작용을 위한 투여 및/또는 전신 전달을 위한 전달을 포함한다.
또 다른 양상에서, 본 발명은 전달 구조체 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 제약 조성물을 제공한다.
도 1은 수송 대상과의 융합을 촉진하기 위한 nt콜릭스의 C-말단 변경에 이용되는 전략의 개요도를 도시한 것으로, 이 예에서, 수송 대상은 알렉사488 형광 염료이다.
도 2는 시험관 내에서 분극화된 장 상피세포를 가로지르는 nt콜릭스-알렉사488®의 수송을 도시한다. Caco-2 세포 단일막을 시험 물질에 4시간 동안 노출시켰다. 수송된 물질의 백분율을 시료 내에 존재하는 형광의 표준 곡선 분석으로 결정하여, 평균값(N=4)으로 표시하였다. BSA-알렉사488을 대조군으로 이용하였다.
당해 분야의 기술자가 인정하는 바와 같이, 전술한 설명은 본 발명의 특정 바람직한 구현예를 상세히 기술한 것으로, 대표적인 사례가 되는 것일 뿐, 본 발명의 실제 범위를 서술한 것이 아니다. 또한, 본원에 사용된 용어는 특정 구현예를 설명하기 위한 목적일 뿐, 첨부된 청구항에 의해 정의된 본 발명의 범위를 한정하고자 의도한 것이 아니라고 이해하여야 한다.
달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 일반적으로 이해하는 의미를 가지고 있다. 본원에 사용된 바와 같이, 별도로 명시되지 않는 한, 다음 용어는 그것들에 속하는 의미를 가지고 있다.
본 발명의 근간이 되는 연구는 생물학적으로 활성이 있는 치료제의 장 전달을 향상시키기 위한 분리 전달 구조체 제조에 이용될 수송체 도메인으로서 콜릭스 유래 폴리펩티드 서열의 이용에 관한 것이다. 중요하게도, 본원에 기술된 시스템 및 방법은 다음을 제공한다: 주사 없이 거대분자 투여량을 전달하는 능력; “수송 대상”을 그 활성이 요구되는 세포 내 구획으로 전달하는 능력; 및 본 발명이 아니었다면, 대부분 생물학적 막의 장벽성 때문에 방해 받았을, 나노 입자 및/또는 덴드리머 기반 전달체의 그러한 막을 가로지른 전달.
성숙한 콜릭스 독소(“콜릭스”)는 비브리오 콜레라에 의해 분비되는 대단히 활성이 강한 단량체 단백질(분자량 70kD)로서, 세 개의 두드러진 구 모양의 도메인(Ia, II 및 III)과, 도메인 II와 도메인 III을 연결하는 하나의 작은 서브도메인(Ib)로 이루어져 있다. 성숙한 콜릭스의 아미노산 서열은 문헌(Jorgensen, R. et al., J Biol Chem , 283(16):10671-10678 (2008)) 및 그것에 인용된 참조에 제공되어 있다. 본 발명의 분리된 전달 구조체의 제조에 이용되는 콜릭스 유래 폴리펩티드 서열은 성숙한 콜릭스의 보고된 634개 아미노산 단백질 서열로부터 유래될 것이다.
따라서, 본 발명의 전달 구조체는 수송체 도메인을 포함한다. 본원에 이용된 “수송체 도메인”은 특정 기능, 예컨대, 세포 인식(즉, 수용체 결합 도메인을 포함한다) 및 트랜스시토시스(즉, 트랜스시토시스 도메인을 포함한다)를 수행할 수 있는 구조적인 도메인을 나타낸다. 일반적으로, 본 발명의 전달 구조체 제조에 이용될 수송체 도메인은 콜릭스의 기능적 도메인, 예컨대, Ia 및 II에 대응하는 구조적 도메인을 가지고 있는 콜릭스 유래 폴리펩티드 서열이다.
콜릭스 구조 도메인에 대응하는 분자 부분 이외에도, 본 발명의 전달 구조체는 대상자의 생물학적 구획으로 전달하기 위한 거대분자를 더 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, 거대분자는 핵산, 펩티드, 폴리펩티드, 단백질, 다당류 및 지질로 이루어진 군으로부터 선택된다. 추가적인 구현예에서, 폴리펩티드는 주사에 의해 대상자에 흔히 투여되는 폴리펩티드 호르몬, 사이토카인, 케모카인, 성장인자 및 응고인자로 이루어진 군으로부터 선택된다. 이러한 모든 거대분자의 서열은 당업자에게 잘 알려져 있으며, 이러한 거대분자의 전달 구조체로의 부착은 표준 기법을 이용하여 당업자의 기술로 충분히 할 수 있다.
거대분자는 세포 결합 또는 트랜스시토시스 활성을 방해하지 않는, 전달 구조체의 임의의 부분으로 도입될 수 있다. 거대분자는 분할 가능한 링커를 통해 전달 구조체의 나머지와 연결된다. “링커”는 두 개의 다른 분자들을 공유적으로, 또는 이온결합, 반 데르 발스 결합 또는 수소결합을 통해 결합시키는 분자로, 예컨대, 5' 말단에서 하나의 상보적인 서열과 3' 말단에서 다른 상보적인 서열과 혼성화하여 두 개의 비상보적인 서열을 결합시키는 핵산 분자를 나타낸다. “분할 가능한 링커”는 분해될 수 있거나, 그렇지 않으면 절단되어 분할 가능한 링커에 의해 연결된 두 개의 구성성분들을 분리시키는 링커를 나타낸다. 분할 가능한 링커는 일반적으로 효소에 의해, 전형적으로는 펩티드 분해효소, 단백질 분해효소, 핵산 분해효소, 지질 분해효소 등에 의해 분할된다. 또한, 분할 가능한 링커는 예를 들어, 온도, pH, 염 농도의 변화 등과 같은 환경적 단서에 의해, 분극화된 상피 막을 가로지르는 전달 구조체의 트랜스시토시스 후에 그러한 환경적 변화가 있을 때, 분할될 수 있다.
특정 구현예에서, 전달 구조체는 핵산, 펩티드, 폴리펩티드, 단백질, 지질 및 작은 유기분자로 이루어진 군으로부터 선택되는 제2 거대분자와 제2 분할 가능한 링커를 더 포함하며, 이때, 상기 제2 분할 가능한 링커에서의 분할은 상기 제2 거대분자를 상기 구조체의 나머지로부터 분리시킨다. 특정 구현예에서, 제1 거대분자는 제1 폴리펩티드이고, 상기 제2 거대분자는 제2 폴리펩티드이다. 특정 구현예에서, 제1 폴리펩티드와 제2 폴리펩티드는 회합하여 다합체를 형성한다. 특정 구현예에서, 다합체는 이량체, 사량체 또는 8량체이다. 추가적인 구현예에서, 이량체는 항체이다.
특정 구현예에서, 거대분자는 상피세포의 기초 측면 막(basal-lateral membrane)에 존재하는 효소에 의해 분할될 수 없도록 선택될 수 있다. 예를 들어, 실시예에 기술된 분석법이 그러한 분할 효소가 전달될 거대분자를 분할할 수 있는지를 일상적으로 시험하는 데 이용될 수 있다. 그러한 경우, 거대분자는 분할 효소에 의해 인식된, 문제가 되는 아미노산 서열을 제거하기 위해 일상적으로 변경될 수 있다. 그런 다음, 변경된 거대분자를 당해 분야의 일상적인 방법을 이용하여 활성을 보유하는지를 확인하기 위하여 시험할 수 있다.
특정 구현예에서, 제1 및/또는 제2 분할 가능한 링커는 분극화된 상피 세포의 선단 쪽에서보다 분극화된 상피 세포의 기초 측면쪽에서 더 높은 활성을 나타내는 효소에 의해 분할 가능하다. 특정 구현예에서, 제1 및/또는 제2 분할 가능한 링커는 분극화된 상피 세포의 선단 쪽에서보다 혈장에서 더 높은 활성을 나타내는 효소에 의해 분할 가능하다.
특정 구현예에서, 분할 가능한 링커는, 전달을 위한 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질 거대분자의 경우, 전달될 거대분자에 존재하는 서열을 포함하는 분할 가능한 링커 이용을 피하기 위한 서열을 기초로 하여 선택될 수 있다. 예를 들어, 거대분자가 AAL을 포함한다면, 분할 가능한 링커는 이러한 서열을 인식하지 않는 효소에 의해 분할되도록 선택될 수 있다.
콜릭스 기능 도메인에 대응하는 분자 부분 이외에도, 본 발명의 전달 구조체는 그 활성이 필요한 세포 내 구획으로 전달하기 위한 “수송 대상”을 더 포함할 수 있다. 본원에 사용된 “수송 대상”은 거대분자, 저분자, siRNA, PNA, miRNA, DNA, 플라스미드 및 안티센스 분자를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 본 발명에 따라 전달될 수 있는 수송 대상의 다른 예로는 니트로소우레아, 예컨대, 카르무스틴, 로무스틴, 세무스틴, 스트렙토조토신과 같은 항신생물성 화합물; 메킬하이드라진, 예컨대, 프로카바진, 다카바진; 스테로이드 호르몬, 예컨대, 글루코코르티코이드, 에스트로겐, 프로제스틴, 안드로겐, 테트라하이드록데스옥시카리코스테론; 예컨대, 피리메타민, 트리메토프테린, 페니실라민, 시클로스포린, 아자티오프린 등 면역억제제; 그리고 예컨대, 레바미솔, 디에틸 디티오카바메이트, 엔케팔린, 에돌핀 등 면역자극제와 같은 면역활성 화합물; 베타-락탐, 페니실린, 세팔로스포린, 카르바페님 및 모노박탐, 베타-락타마제 억제제, 아미노글리코사이드, 마크로라이드, 테트라사이클린, 스펙티노마이신 등 항생제와 같은 항미생물 화합물; 항말라리아제, 아메바구제제; 항원충제; 항진균제, 예컨대, 암포테리신 베타, 항바이러스제, 예컨대, 아시클로버, 이독수리딘, 리바비린, 트리플루리딘, 비다라빈, 갱시클로버; 기생충 구제약(parasiticide); 장내 구충제(antihalmintic); 방사성 의약품; 장관 약제; 혈액 화합물; 면역글로불린; 혈액응고단백질, 예컨대, 항혈우병인자, 제9인자 복합체; 항응고제, 예컨대, 디쿠마롤, 헤파린 나트륨; 피브로리신 억제제, 예컨대, 트라넥사민산; 심장혈관제; 말초 항아드레날린작용제; 중추작용 항고혈압제, 예컨대, 메틸도파, 메틸도파 HCl; 항고혈압 직접 혈관확장제, 예컨대, 디아족사이드, 하이드랄라진 HCI; 레닌-안지오텐신 시스템에 영향을 미치는 약물; 말초 혈관확장제, 예컨대, 펜토라민; 항협심증제; 심장 글리코사이드; 수축성 혈관확장제(inodilator), 예컨대, 암리논, 밀리논, 에녹시몬, 페녹시몬, 이마조단, 술마졸; 부정맥치료제; 칼슘 차단제; 혈액 지질에 영향을 미치는 약물, 예컨대, 라니티딘, 보센탄, 레줄린; 호흡제; 교감신경흥분제, 예컨대, 알부테롤, 비톨테롤 메실레이트, 도부타민 염산염, 도파민 염산염, 에페드린 So, 에피네프린, 펜플루라민 염산염, 이소프로테레놀 염산염, 메톡사민 염산염, 노르에피네프린 바이타르트레이트, 페닐에프린 염산염, 리토드린 염산염; 콜린유사성 제제, 예컨대, 염화아세틸콜린; 항콜린에스테라아제, 예컨대, 염화에트로포늄; 콜린에스테라아제 재활성제; 아드레날린 작용성 차단제, 예컨대, 아세부톨롤 염산염, 아테놀롤, 에스몰롤 염산염, 라베탈롤 염산염, 메토프롤롤, 나돌롤, 펜토라민 메실레이트, 프로파놀롤 염산염; 항무스카린제, 예컨대, 아니소트로핀 메틸브로마이드, 아트로민 SO4, 브롬화클리니듐, 글리코피롤레이트, 브롬화이프라트로피움, 스코폴라민 브롬산염; 신경근 차단제; 탈분극제, 예컨대, 아트라큐리움 베실레이트, 브롬화헥사플루오레늄, 메토큐린 요오드, 염화석시닐콜린, 염화투보큐라린, 브롬화베큐로늄; 중추작용 근육이완제, 예컨대, 바클로펜; 신경전달물질 및 신경전달물질 작용제, 예컨대, 아세틸콜린, 아데노신, 아데노신 트리포스페이트; 아미노산 신경전달물질, 예컨대, 흥분성 아미노산, GABA, 글리신; 생체아민 신경전달물질, 예컨대, 도파민, 에피네프린, 히스타민, 노르에피네프린, 옥토파민, 세로토닌, 타이라민; 신경펩티드, 산화질소, K+ 통로 독소; 항파킨슨제 약물, 예컨대, 아말티딘 염산염, 벤즈트로핀 메실레이트, 카르비도파; 이뇨제, 예컨대, 디클로르펜아미드, 메타졸아미드, 벤드로플루메티아지드, 폴리티아지드; 항편두통 약물, 예컨대, 카르보프로스트 트로메타민 메실레이트, 메티세르지드 말레산염을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 본 발명의 전달 구조체의 수송체 도메인은 일반적으로 수용체 결합 도메인을 포함한다. 수용체 결합 도메인은 상피세포의 선단 막 위에 존재하는 세포 표면 수용체에 결합하는, 제한 없이 당해 분야의 통상의 지식을 가진 자에게 공지된 임의의 수용체 결합 도메인일 수 있다. 바람직하게는, 수용체 결합 도메인은 세포 표면 수용체에 특이적으로 결합한다. 수용체 결합 도메인은 전달 구조체의 엔도시토시스를 가능하게 하는 충분한 친화도로 세포 표면 수용체에 결합해야 한다.
특정 구현예에서, 수용체 결합 도메인은 펩티드, 폴리펩티드, 단백질, 지질, 탄수화물, 또는 작은 유기분자, 또는 이의 조합을 포함할 수 있다. 상피세포의 선단 막 위에 존재하는 세포 표면 수용체에 결합하는 이러한 분자들 각각의 예는 당해 분야의 통상의 지식을 가진 자에게 잘 알려져 있다. 적합한 펩티드 또는 폴리펩티드는 PE, 콜레라 독소, 콜릭스 독소, 보툴리늄 독소, 디프테리아 독소, 쉬가 독소, 쉬가 유사 독소 등의 수용체 결합 도메인과 같은 박테리아 독소 수용체 결합 도메인; 단일클론성, 다클론성 및 단일사슬 항체, 또는 이의 유도체를 포함하는 항체, EGF, IGF-I, IGF-II, IGF-III 등과 같은 성장인자; IL-1, IL-2, IL-3, IL-6 등과 같은 사이토카인; MIP-1a, MIP-1b, MCAF, IL-8 등과 같은 케모카인; 및 CD4, 면역글로불린 슈퍼패밀리의 세포 부착 분자, 인테그린, IgA 수용체에 특이적인 리간드 등과 같은 기타 리간드를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 당업자는 수용체 결합 도메인이 결합하는 수용체의 발현 패턴을 기초로 하여 적당한 수용체 결합 도메인을 선택할 수 있다.
수용체 결합 도메인은 제한 없이, 그러한 분자들을 부착시키는 데 유용할, 당해 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 공지된 임의의 방법 또는 수단에 의해 전달 구조체의 나머지에 부착될 수 있다. 특정 구현예에서, 수용체 결합 도메인은 융합 단백질로서 전달 구조체의 나머지와 함께 발현된다. 그러한 구현예는 특히, 수용체 결합 도메인과 구조체의 나머지가 펩티드 또는 폴리펩티드로부터 형성될 때, 유용하다.
본 발명의 전달 구조체의 수송체 도메인은 트랜스시토시스 도메인을 추가로 포함한다. 트랜스시토시스 도메인은 상피세포의 선단 막 위에 있는 세포 표면 수용체에 결합했던 키메라 단백질의 트랜스시토시스를 가져오는, 당해 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 공지된 임의의 트랜스시토시스 도메인일 수 있다. 바람직한 구현예에서, 트랜스시토시스 도메인은 콜릭스의 도메인 II이다.
임의의 특정 이론 또는 작용 메커니즘으로 한정되기를 의도하지는 않지만, 트랜스시토시스 도메인은 전달 구조체가 분극화된 상피세포의 선단 표면에 존재하는 수용체에 결합한 후, 분극화된 상피세포를 통해 구조체가 이동하는 것을 허용하는 것으로 여겨진다. 분극화된 상피세포를 통한 그러한 이동을 본원에서 “트랜스시토시스”라 한다. 이러한 이동은 분극화된 상피세포의 기초-측면 막으로부터 전달 구조체가 방출되는 것을 허용한다.
세포 내 활성을 위해 의도된 수송 대상의 전달을 위해, 전달 구조체는 수송 대상을 세포로 수송하는 엔토시토시스 도메인을 포함하며, 분할 가능한 링커도 포함할 수 있다. 이것은 링커를 이용하여 또는 링커를 이용하지 않고, 하나 이상의 엔도시토시스 도메인 카피로 나노 입자 및/또는 덴드리머 기반 전달체 표면을 장식함으로써, 세포 표면 수용체를 표적화한 전달체를 이용하는 수송 대상의 세포 내 전달을 포함한다.
임의의 특정 이론 또는 작용 메커니즘으로 한정되기를 의도하지는 않지만, 엔토시토시스 도메인은 전달 구조체가 세포 표면 위에 존재하는 수용체와 결합한 후, 세포 안으로 구조체가 이동하는 것을 허용하는 것으로 여겨진다. 세포 안으로의 그러한 이동을 본원에서 “엔토시토시스”라 한다. 이러한 이동은 핵과 핵막, 리보솜 소포, 소포체, 미토콘드리아, 골지체 및 세포기질을 포함하는 (그러나 이에 한정되지 않는) 관련 있는 세포 내 구획으로 전달 구조체가 방출되는 것을 허용한다.
본 발명의 특정 구현예에서, 이러한 세포들의 기저측 표면에서 일어나는 생물학적 과정에서 기능하는 단백질 분해효소와 펩티드 분해효소의 동정이 평가된다. 이러한 단백질 분해효소와 펩티드 분해효소는 기질에 의해 정의될 수 있는 몇 가지 카테고리로 나뉜다: 1) 상피의 기저측 표면으로부터 분비되며, 활성화를 위해 마름질(trimming)이 필요한 전프로호르몬(pre-pro-hormone)과 효소, 2) 활성을 조절하기 위해서는 분할 사건에 의해 그 활성이 중화되는 활성 호르몬 또는 효소 및 3) 기저측 표면에서의 작용이 효소적 개질에 의해 변경되는 전신성 효소 또는 성장인자. 이러한 다양한 카테고리로 나뉘며, 전달체-링커-수송 대상 구조체의 기저측 분할에 유용할 수 있는 몇 가지 잠재적인 활성들의 예는 당해 분야에서 설명된 바 있는, S9B 프롤릴 올리고펩티드 분해효소 서브패밀리의 구성원, 예컨대, FAP 및 DDP IV를 포함한다.
본 발명의 핵산 서열 및 폴리뉴클레오티드는 예를 들어, 적당한 서열의 클로닝을 포함하는 임의의 적합한 방법에 의해, 또는, 예를 들어, Narang, et al., Meth. Enzymol., 68:90-99 (1979)의 포스포트리에스테르 방법; Brown, et al., Meth. Enzymol., 68:109-151 (1979)의 포스포디에스테르 방법; Beaucage, et al., Tetra. Lett., 22:1859-1862 (1981)의 디에틸포스포아미다이트 방법; 예를 들어, Needham-VanDevanter, et al. Nucl . Acids Res. 12:6159-6168 (1984)에 기술된 바와 같이, 예컨대, 자동화 합성기를 이용하는, Beaucage & Caruthers, Tetra. Letts., 22(20):1859-1862 (1981)에 의해 기술된 고체상 포스포아미다이트 트리에스테르 방법; 및 미국 특허번호 제4,458,066호의 고체 지지법:과 같은 방법에 의한 직접적인 화학적 합성법에 의해 제조될 수 있다. 화학적 합성은 단일 가닥 올리고뉴클레오티드를 생산한다. 이것은 상보적인 서열과의 하이브리드 형성에 의해, 또는 단일 가닥을 주형으로 이용하는, DNA 중합효소와의 중합반응에 의해 이중 가닥 DNA로 전환될 수 있다. 당업자는 DNA의 화학적 합성이 약 100개의 염기로 이루어진 서열에 한정되지만, 짧은 서열을 연결하여 더 긴 서열이 얻어질 수 있음을 인식할 것이다.
바람직한 구현예에서, 본 발명의 핵산 서열은 클로닝 기법에 의해 제조된다. 적당한 클로닝 및 서열분석 기법의 예와 많은 클로닝 연습을 통해 당업자를 안내하기에 충분한 설명은 문헌(Sambrook, et al., MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL (2ND ED.), Vols. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory (1989)), Berger and Kimmel (eds.), GUIDE TO MOLECULAR CLONING TECHNIQUES, Academic Press, Inc., San Diego Calif. (1987)), 또는 Ausubel, et al. (eds.), CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, Greene Publishing and Wiley-Interscience, NY (1987))에서 볼 수 있다. 생물학적 시약 및 실험장비 제조업체의 제품 정보도 유용한 정보를 제공한다. 그러한 제조업체는 SIGMA 화학물질 회사(미국 미주리 주 세인트 루이스), R&D systems(미국 미네소타 주 미니애폴리스), Pharmacia LKB Biotechnology(미국 뉴저지주 피스카타웨이), CLONTECH Laboratories, Inc.(미국 캘리포니아 주 팔로앨토), Chem Genes Corp., Aldrich Chemical Company(미국 위스콘신 주 밀워키), Glen Research, Inc., GIBCO BRL Life Technologies, Inc.(미국 메릴랜드 주 게이더스버그), Fluka Chemica-Biochemika Analytika(Fluka Chemie AG, Buchs, 스위스), Invitrogen(미국 캘리포니아 주, 샌디에고) 및 Applied Biosystems(미국 캘리포니아 주 포스터 시티)뿐만 아니라, 당업자에게 알려진 많은 다른 상업용 공급원을 포함한다.
복제 및 단백질의 재조합 발현 지지에 적합한 세포는 당해 분야에 잘 알려져 있다. 그러한 세포는 특별한 발현 벡터로 적절히 형질감염 또는 형질변환될 수 있으며, 임상적 적용을 위한 충분한 양의 단백질을 획득할 수 있도록 벡터를 함유하는 많은 양의 세포를 대규모 발효기에 접종하기 위해 성장시킬 수 있다. 그러한 세포는 대장균과 같은 원핵 미생물; 중국 햄스터 난소 세포(CHO), NSO, 292와 같은 다양한 진핵세포; 효모; 곤충 세포; 및 형질전환 동물 및 형질전환 식물 등을 포함할 수 있다. 이러한 시스템에서 외래 유전자를 발현하기 위한 표준 기술은 당해 분야에 공지되어 있다.
본 발명의 제약 조성물은 본 발명의 유전자 융합 또는 화학적 구조체 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함한다. 본원에 사용된 “약학적으로 허용 가능한 담체”는 생리학적으로 적합한 임의의 및 모든 용매, 분산매, 코팅제, 항균제 및 항진균제, 등장성 및 흡수 지연제 등을 의미한다. 약학적으로 허용 가능한 담체의 일부 예는 물, 식염수, 인산 완충 식염수, 덱스트로스, 글리세롤, 에탄올 등과 그의 조합들이다. 여러 사례에서, 예를 들어, 당류, 만니톨, 소르비톨과 같은 폴리알코올, 또는 염화나트륨과 같은 등장성 작용제를 조성물에 포함하는 것이 바람직할 것이다. 약학적으로 허용 가능한 물질의 추가적인 예는 습윤제 또는, 항체의 유통기한 또는 효과를 향상시키는, 습윤제 또는 유화제, 보존제 또는 완충액과 같은 소량의 보조 물질이다. 임의의 종래의 부형제, 담체 또는 용제가 본 발명의 전달 구조체와 맞지 않는 경우를 제외하고, 본 발명의 제약 제제에서 그 사용이 고려된다.
특정 구현예에서, 활성 화합물의 제약 조성물은 임플란트, 경피성 패치 및 마이크로캡슐화 전달 시스템을 포함하는 제어된 방출 제형과 같은, 속성 방출에 대항하여 조성물을 보호하는 담체로 제조될 수 있다. 에틸렌 비닐 아세테이트, 폴리무수물, 폴리글리콜산, 콜라겐, 폴리오르토에스테르 및 폴리락트산과 같은, 생분해성, 생체적합성 중합체가 이용될 수 있다. 그러한 제형의 제조를 위한 여러 가지 방법들이 특허를 받았거나, 당해 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 일반적으로 알려져 있다. 예컨대, Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems (J. R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978) 참조.
특정 구현예에서, 본 발명의 전달 구조체는 예를 들어, 불활성 희석제 또는 동화할 수 있는 식용 담체와 함께, 경구로 투여될 수 있다. 화합물 (및 원한다면, 기타 성분들) 또한 경질 또는 연질 젤라틴 캡슐제에 동봉, 정제로 압축, 또는 대상자의 식단에 직접 포함시킬 수 있다. 경구 치료제 투여의 경우, 전달 구조체는 부형제와 함께 포함되어, 섭취할 수 있는 정제, 버컬정제, 구내정, 캡슐제, 엘릭시르, 현탁액, 시럽, 웨이퍼제 등의 형태로 이용될 수 있다. 비경구적 투여 이외의 방식으로 본 발명의 화합물을 투여하기 위하여, 화합물을 그것의 불활성화를 방지하는 물질로 코팅하거나 그것의 불활성화를 방지하는 물질과 함께 공동 투여하는 것이 필요할 수 있다.
일반적으로, 약학적으로 유효한 양의 본 발명의 전달 구조체가 대상자에 투여된다. 통상의 지식을 가진 당업자는 전달 구조체의 투여량이 아래에 기술한 바와 같이 효과적인 양의 거대분자를 전달하기에 충분한지를 용이하게 결정할 수 있다. 특정 구현예에서, 약 1㎍ 내지 약 1g 사이의 전달 구조체가 투여된다. 다른 구현예에서, 약 10㎍ 내지 약 500mg 사이의 전달 구조체가 투여된다. 또 다른 구현예에서, 약 10㎍ 내지 약 100mg 사이의 전달 구조체가 투여된다. 또 다른 구현예에서, 약 10㎍ 내지 약 1000㎍ 사이의 전달 구조체가 투여된다. 또 다른 구현예에서, 약 10㎍ 내지 약 250㎍ 사이의 전달 구조체가 투여된다. 또 다른 구현예에서, 약 10㎍ 내지 약 100㎍ 사이의 전달 구조체가 투여된다. 바람직하게는, 약 10㎍ 내지 약 50㎍ 사이의 전달 구조체가 투여된다.
본 발명의 전달 구조체는 거대분자의 국소 또는 전신 전달을 위한 종래의 기법에 비해 몇 가지 장점들을 대상자에 제공한다. 그러한 장점들 중 가장 중요한 장점은 대상자의 피부에 상처를 내는 바늘을 이용하지 않고 거대분자를 전달할 수 있는 능력이다. 많은 대상자들은 반복된, 정기적인 거대분자 투여량을 필요로 한다. 예를 들어, 당뇨병 환자는 혈당 농도를 제어하기 위하여 하루에 몇 차례 인슐린을 주사해야 한다. 주사 없이, 통증 또는 그것과 관련된 잠재적인 합병증을 피함으로써, 거대분자의 전달이 이루어질 수 있다면, 그러한 환자들의 삶의 질은 크게 향상될 것이다.
나아가, 전달 구조체의 여러 가지 구현예들은 재조합 시스템으로 구축되고 발현될 수 있다. 재조합 기술은 임의의 적합한 거대분자의 도입을 위해 설계된 삽입 부위를 가지고 있는 전달 구조체를 제조할 수 있게 한다. 그러한 삽입 부위는 통상의 지식을 가진 당업자가 새로운 거대분자의 전달을 위한 전달 구조체를 생산할 필요가 발생하면, 빠르고 용이하게 그렇게 할 수 있게 한다.
또한, 상피세포의 기초 측면 막에 존재하는 효소에 의해 분할되는 링커가 있는 전달 구조체의 나머지와 거대분자의 연결은 상피 막을 가로지르는 트랜스시토시스 후에 곧 전달 구조체로부터 거대분자를 해방시켜, 전달 구조체의 나머지로부터 방출되게 한다. 그러한 해방은 거대분자에 대한 면역반응 유도 가능성을 감소시킨다. 그것은 또한 거대분자가 전달 구조체의 나머지로부터 자유롭게 그 표적과 상호작용할 수 있게 한다.
본 발명의 전달 구조체의 다른 장점들은 당업자에게 명백할 것이다.
실시예 1
성숙한 비브리오 콜레라 콜릭스를 암호화하는 플라스미드 구조체를 제조하여, 이전에 설명한 바와 같이 대장균 발현 시스템에서 성숙한 콜릭스 단백질을 발현시키는 데 이용하였다. 예컨대, Jorgensen, R. et al., J Biol Chem , 283(16):10671-10678 (2008) 참조. 또한, 구조를 크게 변경하지 않고 무독성으로 만드는, PE 단백질에서의 결실(ΔE553)과 유사한, 아미노산 위치 581번(ΔE581)에서의 글루탐산의 유전자 결실에 의해 콜릭스 유전자의 무독성 돌연변이 형태(이하 “nt콜릭스”라 함)도 제조하였다(Killeen, K.P. and Collier, R.J., Biochim Biophys Acta , 1138:162-166 (1992)). 대장균 DH5α 세포(Invitrogen, 미국 캘리포니아 주 칼즈배드)를 이용하여 적당한 플라스미드와 함께 열 충격(42℃에서 1분)으로 형질변형시킨 후, 단백질을 발현시켰다. 항생제를 함유하는 배지에서 선택된 형질변형 세포를 분리하여 루리아-베르타니 배지(Difco)에서 성장시켰다. 1mM 이소프로필-D-티오갈락토피라노시드(IPTG)를 첨가하여 단백질 발현을 유도하였다. IPTG 유도 2시간 후, 세포를 4℃에서 10분 동안 5,000 xg에서 원심분리하여 수확하였다. 세포 용해 후 봉입체를 분리하고, 단백질을 6M 구아니딘 염산염과 2mM EDTA(pH 8.0) 및 65mM 디티오트레이톨에 용해시켰다. 재접힘 및 정제 후, 단백질을 -80℃에서 Ca2 + 및 Mg2 + 결핍 PBS(pH 7.4)에 약 5ml/ml로 저장하였다. 이러한 연구에 사용된 모든 단백질은 크기 배제 크로마토그래피를 기초로 하여 >90% 순도임을 확인하였다.
그런 다음, nt콜릭스 형태를, 단백질의 C-말단 근처에 위치한 유리 설프하이드릴 잔기를 통해 직접적인 화학적 결합을 하도록 C-말단에서 개질시켰다. C-말단 개질 전략은 도 1에 도시하였다. C-말단 개질은 담배 식각 바이러스(TEV)의 고도로 선택적인 단백질 분해효소에 대해 공통 분할 서열을 가지고 있는 시스테인 제한 루프(ENLFQS), 제2 시스테인 및 헥사히스티딘(His6) 꼬리표를 포함하였다. 제2 Cys는 궁극적으로 결합을 위해 이용된 Cys와 이황화다리를 형성하도록 포함되었다. 단백질에 His6 서열을 첨가하자 정제가 단순해졌고, TEV 분할 서열은 경미한 환원 후 말단 Cys 잔기를 선택적으로 제거하는 메커니즘을 제공하였다. 발현 및 nt콜릭스 구조체의 분리 후, 0.1mM 디티오트레이톨을 이용한 TEV 분할 및 경미한 환원은 수송 대상 부착의 일반적인 메커니즘으로 말레이미드 기반 반응을 통해 수송 대상인, 알렉사 플루오르® 488 형광 염료의 직접적인 화학적 결합이 일어나게 하였다. 그 결과로 얻어진 구조체를 본원에서 nt콜릭스-알렉사488이라 한다. TEV 단백질 분해효소 분할, 환원 및 유리 설프하이드릴과의 말레이미드 반응을 통한 수송 대상 결합 후, 유리된 C-말단 서열의 제거는 제2 Ni2 + 컬럼 크로마토그래피 단계에 의해 이루어졌다.
실시예 2
nt콜릭스-알렉사488의 경상피 수송을 시험관 내에서 Caco-2 단일층을 이용하여 평가하였다. 먼저, Caco-2 세포(배양 수 25~35)를 이전에 설명된 바와 같이 융합 단일층(confluent monolayer)으로 성장시켰다(Rubas, W. et al., Pharm Res , 10:113-118 (1993)). 간단히 말하면, 5% CO2와 90% 습도의 공기에서 세포를 2mM L-글루타민, 10% 우태아혈청 및 100단위의 페니실린/스트렙토마이신이 강화된 DMEM/고성장 배지에 37℃에서 유지시켰다. 매주 세포를 75㎠ 플라스크에 1:3의 분할 비율로 계대배양하고, Corning Costar(미국 매사추세츠 주 캠브리지)의 미리 적신, 콜라겐 코팅된 투과성(0.4㎛ 기공 크기) 폴리카보네이트(트랜스웰TM) 필터 지지체에 63,000개 세포/㎠의 밀도로 접종하였다. 생장 배지는 이틀마다 교체하였다. 볼트-옴-미터(World Precision Instruments, 미국 플로리다 주 새러소타)를 이용하여 측정한 상당한 경상피 저항(trans-epithelial resistance, TEER) 획득으로 결정된 융합 단일층을 접종 20 ~ 26일 후 이용하였다.
콜릭스의 시험관 내 수송을 평가하기 위하여 대조군으로 사용하고자 두 가지 추가적인 물질 또한 제조하였다. 필터 손상에 대한 내부 대조군으로, 테트라메틸로다민 이소티오시아네이트(TRITC)가 표지된 70kDa 덱스트란을 상업용 공급원(Sigma)으로부터 얻었다. 비특이적인 염료 매개성 수송에 대한 대조군으로, 본 발명자들은 우태아혈청(BSA; Sigma) 표면 위의 유리 아민 중 일부를 알렉사488 카르복시산 석신이미딜 에스테르(A488-CASE; Invitrogen)와 반응시켰다. 결합반응은 반응을 억제하기 위해 과잉의 글리신을 첨가한 시점에서 10:1의 A488-CASE:BSA 몰 비율로 중성 pH의 실온에서 4시간 동안 이루어졌다. 그 결과로 얻어진 정제된 생성물은 BSA 분자당 약 3개의 알렉사488 분자를 함유하였다. 테트라메틸로다민 이소티오시아네이트(TRITC)가 표지된 70kDa 덱스트란(Sigma)을 필터 손상에 대한 내부 대조군으로 이용하였다. TRITC-덱스트란(최적 Ex=547 및 Em = 572)에 대해 540nm의 여기파장과 610nm의 방출파장으로, 알렉사488 단백질(최적 Ex = 496 및 Em = 519)에 대해 480nm의 여기파장과 520nm의 방출파장으로 설정된 BMG 랩테크 플루오스타 오메가 기기(BMG labtech FLUOstar Omega instrument)를 이용하여 형광을 측정하였다.
경상피 수송 유동 속도를 분극화된 Caco-2 세포의 단일층을 이용하여 점막에서 장막으로 그리고 장막에서 점막으로의 유동 사건을 설명하기 위하여 각각 선단(Ap)에서 기저측(Bl) 방향으로, 그리고 Bl에서 Ap 방향으로 시험관 내에서 측정하였다. 수송 연구를 개시하기 직전, 각 필터의 경상피 저항(TEER)을 측정하였다. <200 Ω·㎠의 단일층 TEER 판독치는 연구에서 배제하였다. Ap와 Bl 배지를 포함된 단일층으로부터 제거하고, 이들 표면을 인산 완충액 식염수(PBS)로 1회 세척하였다. 그런 다음, 단일층 일 세트에 10㎍ nt콜릭스-A488 및 10㎍ TRITC-덱스트란, 또는 10㎍ BSA-A488 및 10㎍ TRITC-덱스트란을 함유한 100㎕ PBS의 Ap(공여체)를 적용하였다. 그런 다음, 수용체(Bl) 구획에는 수송 연구를 위한 T0를 설정하기 위하여 500μL PBS를 제공하였다. 공여체 구획과 수용체 구획 모두를 37℃에서 4시간 배양한 후, 단일층을 가로질러 수송된 물질의 양과 선단 표면에 보유된 양을 각각 결정하기 위하여 시료를 채취하였다.
4시간의 노출 후, 본 발명자들은 이들 단일층의 선단 표면에 첨가된 물질의 약 5%가 수송되었음을 관찰하였다(도 2 참조). 기저 구획에서 75kDa TRITC-덱스트란의 수준을 나타내는 임의의 필터는 분석에서 배제하였다. BSA-알렉사488의 대조군 단백질은 동일한 4시간의 기간에 걸쳐 기저 구획에 임의의 상당한 수준을 나타내지 못했다(도 2 참조). 수송 평균값은 콜릭스는 5.025 ± 1.13 %, BSA는 0.56 ± 0.33 이었다(N=4). 이러한 데이터로부터 유전적으로 독성을 제거한 콜릭스 형태가 시험관 내에서 인간 장암 세포주 Caco-2의 분극화된 단일층을 가로질러 효율적으로 수송할 수 있음이 발혀졌다.
실시예 3
아미노산 A386에서 절삭된 콜릭스 변이형(콜릭스386)뿐만 아니라, 콜릭스386의 C-말단에 녹색 형광 단백질(GFP)을 유전자 연결한 콜릭스386GFP 또한 제조하여 대장균에서 발현시켰다. 적당한 플라스미드와 함께 열 충격(42℃에서 1분)으로 형질변형시킨 후 대장균 DH5α 세포(Invitrogen, 미국 캘리포니아 주 칼즈배드)를 이용하여 단백질을 발현시켰다. 항생제를 함유하는 배지에서 선택된 형질변형 세포를 분리하여 루리아-베르타니 배지(Difco)에서 성장시켰다. 1mM 이소프로필-D-티오갈락토피라노시드(IPTG)를 첨가하여 단백질 발현을 유도하였다. IPTG 유도 2시간 후, 세포를 4℃에서 10분 동안 5,000 xg에서 원심분리하여 수확하였다. 세포 용해 후 봉입체를 분리하고, 단백질을 6M 구아니딘 염산염과 2mM EDTA(pH 8.0) 및 65mM 디티오트레이톨에 용해시켰다. 재접힘 및 정제 후, 단백질을 -80℃에서 Ca2 + 및 Mg2 + 결핍 PBS(pH 7.4)에 약 5ml/ml로 저장하였다. 이러한 형광 단백질과 관련된 형광 특징의 획득과 보유에 의해 콜릭스386GFP 재접힘을 모니터링 하였다(Sample et al., Chem Soc Rev , 38(10): p. 2852-64 (2009)). 녹색 형광 단백질(GFP)은 Upstate(미국 버지니아 주 샬롯스빌)에서 구입하였다. 이들 연구에 이용된 모든 단백질은 크기 배제 크로마토그래피를 기초로 하여 >90% 순도임을 확인하였다.
공유적으로 통합된, 468/508nm의 여기/방출 특성을 나타내는 적색 형광 염료를 함유하고 알데히드 표면 기능기를 가지고 있는 폴리스티렌 비드(지름 10nm)(XPR-582)를 Duke Scientific(미국 캘리포니아 주 팔로앨토)에서 얻었다. (2% 고체) XPR-582 비드 100㎕를 최종 부피 200㎕의 중성(pH 7.0) 인산 완충 식염수(PBS)에 용해되어 있는 대략 2.5nmol GPF 또는 콜릭스386GFP와 혼합하였다. 실온에서 조심스럽게 2시간 동안 진동시킨 후, PBS에 용해시킨 2mg/ml의 소혈청 알부민(BSA; Sigma, 미국 미주리 주 세인트루이스) 용액 20㎕를 첨가하였다. 그런 다음, 제조물을 Millipore(미국 매사추세츠 주 베드포드)의 100,000 분자량 컷오프 Microcon 여과장치를 이용하여 PBS를 이용한 희석 및 농축의 3회 사이클로 투석하였다. 코팅된 비드의 최종 제조물은 1% 고체였다.
실시예 4
A549(ATCC CCL-185™), L929(ATCC CRL-2148™) 및 Caco-2(ATCC HTB-37™) 세포를 완전배지(10% 우태아혈청, 2.5mM 글루타민, 페니실린/ml 100U 및 스트렙토마이신/ml 100㎍을 추가한 DMEM F12(Dulbecco’s modified Eagle’s medium F12)(Gibco BRL, 미국 뉴욕 주 그랜드아일랜드))에서 37℃, 5% CO2에 유지시켰다. 세포에 이 배지(소정의 완전배지)를 2일 내지 3일마다 공급하고, 5일 내지 7일마다 계대배양하였다. 분석을 위해, 세포를 24웰 플레이트 또는 96웰 플레이트에 접종하고 융합 시까지 성장시켰다.
Cacp-2 세포를 콜라겐이 코팅된 0.4㎛ 공극 크기의 폴리카보네이트 막 트랜스웰 지지체(Corning-Costar, 미국 매사추세츠 주 캠브리지) 상에 융합된 단일층으로 성장시키고, 젓가락형 Millicell-ERS® 전압계(Millipore)를 이용하여 측정한 >250 Ω·㎠의 경상피세포 전기저항(TEER)을 얻고 18 ~ 25일 후에 이용하였다. 이들 단일층을 가로지르는 콜릭스 또는 콜릭스386GFP의 선단에서 기저측(A→B) 및 기저측에서 선단(B→A)으로의 수송을 37℃에서 20㎍을 적용하고 4시간 후에 수송된 단백질의 양을 측정함으로써 결정하였다. TEER 측정값과 (HPLC 크기 배제 프로토콜을 이용하여 측정한)10kDa 형광 덱스트란의 규모를 연구기간 중 단일층 장벽 성질을 검증하는 데 이용하였다. 콜릭스 수송의 규모는 세포 기반 세포독성 분석에서 수집된 배지의 적정에 의해 결정하였다. 수송된 콜릭스386GFP는 포획을 위한 항-GFP 항체와, 검출을 위한 콜릭스에 대한 다클론성 혈청을 이용한 효소 표식 면역검사법(ELISA)에 의해 측정하였다.
시험관 내에서 분극화된 Caco-2 세포 단일층을 가로지르는 수송 속도를 ELISA 포맷 분석법에 의해 평가한 결과, 콜릭스, nt콜릭스 및 콜릭스386GFP가 비슷하였다. 세포 사멸의 TUNEL 검출 또는 락트산 탈수소효소(LDH) 방출을 조사하였을 때, 콜릭스의 경우, 분극화된 Caco-2 세포는 단백질에 의해 중독되지 않았다. 중요하게도, 콜릭스와 콜릭스 기반 단백질 키메라는 Caco-2 단일층의 선단으로부터 기저측 표면으로는 효율적으로 수송하나, 기저측으로부터 선단 방향으로는 그렇지 않는다는 점이 발견되었다. 이러한 수송 속도와 방향성은 이러한 동일 포맷에서 시험한 PE에 대해 이전에 관찰했던 것과 비슷하였다. 추가적으로, 본 발명자들은 토끼 항-콜릭스 항혈청의 추가가 시험관 내에서 Caco-2 단일층을 가로지르는 콜릭스 또는 콜릭스 관련 단백질의 효율적인 수송을 차단하지 못하였음을 관찰하였다.
시험관 내에서 Caco-2 단일층을 가로지르는 콜릭스386GFP 트랜스시토시스의 속성을 조사하기 위하여, 공초점 형광 현미경을 이용하였다. 시간별 연구는 콜릭스386GFP가 선단 적용 5분 이내에 상피세포로 들어가, 세포를 통과하여 15분 이내에 세포의 기저측 영역으로 이동함을 보여주었다. 선단의 콜릭스386GFP에 15분 동안 노출시킨 후, 선단측 챔버로부터 과잉의 콜릭스386GFP를 제거한 시료에서, GFP 형광이 세포의 기저측 표면의 방향으로 계속되고, 선단측 표면으로 되돌아가지 않는 것으로 관찰되었다. 이 시간 동안 선단측 및 기저측 구획에서 콜릭스386GFP의 함량을 측정하여 이러한 콜릭스386GFP의 단방향 이동을 확인하였다. Caco-2 단일층의 기저측 표면에 콜릭스386GFP를 적용하자 세포 내로 들어가는 어떠한 유의미한 형광도 나타나지 않아, 수송 연구와 일치하였다. 수송된 콜릭스, nt콜릭스 및 콜릭스386GFP의 웨스턴 블롯 분석 결과는, 이러한 단백질이 큰 변경 없이 이동하였음을 시사하였다.
또한, 시험관 내 연구는 콜릭스386GFP에 화학적으로 결합된 100nm 지름의 형광 라텍스 비드가 선단 적용 후, Caco-2 단일층을 가로질러 효율적으로 이동하였음을 보여주었다. 100nm 지름의 라텍스 비드 선택은 클라트린 피복 소공으로부터 유래한 125nm 지름의 엔도솜의 내강 내에 용이하게 들어맞을 수 있는 물질을 제공하였다. 따라서, 이들 연구결과는 콜릭스386GFP-라텍스 비드가, 선단 세포 표면에서의 엔도솜 흡수 후, 엔도솜을 기반으로 한 세포 내 이동과 일치하는 메커니즘에 의해 분극화된 Caco-2 세포들을 통해 이동함을 시사한다. 항-콜릭스 항혈청을 콜릭스386GFP가 결합된 100nm 지름의 형광 라텍스 비드와 전 배양할 경우, 이러한 비드의 수송을 변경하지 못하였다. 100nm 지름의 형광 라텍스 비드에 화학적으로 결합시킨 비슷한 양의 GFP는 Caco-2 단일층을 가로지르는 이들 입자들의 시험관 내 수송을 촉진시키지 않았다. 공초점 형광 현미경 연구결과는 콜릭스386GFP 대 GFP로 코팅된 트랜스시토시스 라텍스 비드에서 관찰된 차이와 일치하였다.
콜릭스가 PE와 비슷하게 분극화된 상피 장벽을 가로질러 수송할 수 있다는 결과는 예상하지 못한 것이다. 그들의 구조가 결정학적 분석에 의해 제안된 바와 같이 비슷하지만, 그들의 표면 아미노산 조성은 놀랍게도 다르다. 사실, 아미노산 유사상을 기초로 한 정렬법은 이들 두 단백질을 용이하게 연결시키지 못한다. 이러한 두 가지 독성 인자와 같은 병원균 유래 단백질의 숙주 세포 수용체와 상호작용하는 능력은 표면에서 발현된 아미노산 성분들과 관련이 있다고 추정된다는 점에서 이것은 중요하다. (상당히 상이한 아미노산 서열을 가지고 있는) 이들 단백질이 모두 분극화된 상피를 가로질러 효율적으로 수송하므로, 일부 다른 메커니즘이 이러한 수송 능력에 대한 기초를 형성할 가능성이 매우 높다. PE와 콜릭스가 공유한 구조적 관계가 그들의 효율적인 트랜스시토시스를 위한 고유한 능력의 기초를 이룬다는 것이 본 발명자들의 견해이다. PE와 콜릭스 단백질은 모두 엔도솜 구획으로의 접근권을 얻기 위하여 선단 표면 수용체에 결합하는 능력을 가지고 있겠지만, 이러한 상호작용과 이들 단백질의 세포 내 이동과 관련된 다른 수용체에 대한 가능성은 단백질 표면 위의 특이적인 아미노산보다는 입체적 구조를 기초로 할 가능성이 훨씬 더 높다.
본원에 개시되고 청구된 물건 및 방법 전부는 본 개시의 관점에서 지나친 실험 없이 제조되고 실행될 수 있다. 본 발명의 물건 및 방법은 바람직한 구현예에 관하여 설명되었지만, 본 발명의 정신 및 범위로부터 벗어나지 않고 물건 및 방법에 변경을 가할 수 있음은 본 발명이 속하는 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 명백할 것이다. 본 발명이 속하는 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 명백한 그러한 변경 및 균등물 전부는 이미 존재하건 또는 나중에 개발되건 간에 첨부된 청구항에 의해 정의된 바와 같이 본 발명의 정신 및 범위 내에 해당된다고 간주된다. 본 명세서에 언급된 모든 특허, 특허 출원 및 출판물은 본 발명이 속하는 분야에서 통상의 지식을 가진 자의 수준을 보여준다. 모든 특허, 특허 출원 및 출판물은 모든 목적을 위해, 그리고 마치 각 개별적인 출판물이 임의의 및 모든 목적을 위해 전체로서 참조로 통합되도록 구체적으로 그리고 개별적으로 표시된 것과 같은 정도로, 본원에 전체로서 참조로 통합된다. 본원에 예시적으로 설명된 본 발명은 본원에 구체적으로 개시되지 않은 임의의 요소(들)의 부재 시에 적절하게 실현될 수 있다. 따라서, 예를 들어, 본원의 각 예에서,“포함하는(comprising)”, “필수적으로 이루어진(consisting essentially of)” 및 “이루어진(consisting of)”이라는 용어들 중 어느 하나는 나머지 두 개의 용어들 중 어느 하나로 교체될 수 있다. 이용되었던 용어 및 표현은 한정이 아닌 설명을 위한 용어로서 이용되며, 그러한 용어 및 표현의 사용에는 표시되고 설명된 특징들 또는 그의 부분들의 임의의 균등물을 배제하려는 의도는 없으나, 청구된 본 발명의 범위 내에서 다양한 변경이 가능함은 인식된다. 따라서, 본 발명이 바람직한 구현예와 선택적인 특징들에 의해 구체적으로 개시되어 있지만, 본원에 개시된 개념의 수정 및 변경은 당업자에 의해 재구분될 수 있고, 그러한 수정 및 변경은 첨부된 청구항에 의해 정의된 바와 같은 본 발명의 범위 내인 것으로 간주됨을 이해하여야 한다.

Claims (12)

  1. 수송체 도메인 및 수송 대상을 포함하는 분리된 전달 구조체로서, 상기 구조체는 상기 수송 대상을 표적화된 세포 내 구획으로 전달할 수 있는, 분리된 전달 구조체.
  2. 수송체 도메인 및 거대분자를 포함하는 분리된 전달 구조체로서, 상기 구조체는 주사 없이 대상자의 생물학적 구획으로 상기 거대분자를 전달할 수 있는, 분리된 전달 구조체.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    분할 가능한 링커를 더 포함하는, 구조체.
  4. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 수송체 도메인은 콜릭스 유래 폴리펩티드 서열을 포함하는, 구조체.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 수송 대상은 거대분자, 작은 분자, siRNA, PNA, miRNA, DNA, 플라스미드 및 안티센스 분자로 이루어진 군으로부터 선택되는, 구조체.
  6. 표적화된 세포 내 구획으로 수송 대상을 전달하기 위한, 제1항에 따른 구조체의 용도.
  7. 생물학적 막을 가로지르는 나노 입자 및 덴드리머 기반 전달체의 전달을 통한 수송 대상의 전달을 위한, 제1항에 따른 유전자 융합 또는 구조체의 용도.
  8. 생물학적 막을 가로지르는 수송 대상의 전달을 위한, 링커를 이용하거나 링커를 이용하지 않고, 수송체 도메인으로 장식한, 제6항에 따른 나노 입자 및 덴드리머 기반 전달체의 용도.
  9. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 따른 전달 구조체 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 제약 조성물.
  10. 전달 구조체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드로서, 상기 전달 구조체는 수송체 도메인 및 수송 대상을 포함하고, 상기 구조체는 상기 수송 대상을 표적화된 세포 내 구획으로 전달할 수 있는, 폴리뉴클레오티드.
  11. 제10항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터.
  12. 제11항의 발현 벡터를 포함하는 분리된 숙주 세포.
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