KR20140013973A - Ｓｋｐ 단백질을 포함하는 줄기세포 분화 유도용 조성물 및 이의 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 SKP(Seventeen kilodaltone protein) 단백질을 유효성분을 포함하는 줄기세포 분화 유도용 조성물 및 이를 이용한 줄기세포 분화 유도 방법에 관한 것으로, 기존의 줄기세포 분화 촉진제를 사용하지 않고 줄기세포의 분화를 유도할 수 있을 뿐만 아니라, 외배엽 세포, 중배엽 세포, 내배엽 세포, 신경 세포, 심근 세포 등 다양한 세포로의 분화가 가능하기 때문에, SKP 단백질을 이용한 다양한 배양조건을 확립한다면 다양한 세포로의 분화를 가능하게 할 것으로 기대되며, 이를 이용하여 줄기세포치료제, 암치료제 등 다양한 분야에 적용가능할 것으로 기대된다.

Description

ＳＫＰ 단백질을 포함하는 줄기세포 분화 유도용 조성물 및 이의 용도{Composition comprising SKP protein for inducing the differentiation of stem cell and uses thereof}

본 발명은 SKP(Seventeen kilodaltone protein) 단백질을 유효성분으로 포함하는 줄기세포 분화 유도용 조성물 및 이의 용도 등에 관한 것이다.

줄기세포(Stem cell)란, 각종 세포로 분화(differentiation)할 수 있는 줄기성(stemness)을 가지고 있는 미분화 세포들을 총칭하며, 줄기세포는 특정 분화 인자 및/또는 환경에 의해 특정 세포로의 분화가 진행된다. 줄기세포의 종류에는 배아줄기세포(embryonic stem cell), 배아생식세포(embryonic germ cell), 성체줄기세포(adult stem cell), 암줄기세포(cancer stem cell) 등이 있다. 최근에는 다양한 세포로 분화가 가능한 줄기세포를 이용하여 손상된 조직의 재생, 당뇨병, 백혈병, 파킨슨병, 심장병, 척수외상 등을 비롯한 다양한 질환을 치료하고자 하는 연구가 활발히 진행되고 있고, 이에 따라 줄기세포를 특정 세포로 분화시키고자 하는 연구들이 시도되고 있다. 또한 분화가 끝난 세포를 역분화를 통해 줄기세포로 만든 역분화줄기세포(induced Pluripotent Stem Cell, iPS) 등도 세포분화에 사용되고 있다.

일반적으로 줄기세포의 분화를 유도하는 방법으로는 분화 촉진제를 이용하는 방법들이 사용되고 있다. 대표적으로는 레티온산(retionic acid)을 이용하여 배아줄기세포를 신경세포로 분화시키는 방법(Dev. Dyn. (2007) 236: 3255-3266), 액티빈 A(activin A)를 이용하여 간세포로 분화시키는 방법(Nat. Biotechnol. (2005) 23: 1534-1541), 아스코르브산(ascorbic acid)를 이용하여 심근세포로 분화시키는 방법(Circulation (2003) 107: 1912-1916) 등이 있다. 그러나 종래의 기술은 사이토카인(cytokine)과 같은 고가의 시약을 사용하기 때문에 비용이 많이 든다는 단점뿐 아니라, 낮은 분화율 및 특정 세포로의 분화만을 촉진하여 다양한 세포로의 분화에 적용이 어렵다는 등의 한계점을 가지고 있다. 따라서 줄기세포의 분화 효율을 높이고, 다양한 세포의 분화에 광범위하게 적용이 가능한 일반화된 방법을 개발할 필요가 있다.

이와 같이 줄기세포를 다양한 분야에서 효과적으로 이용하기 위해서는, 줄기세포를 다양한 세포로 분화시킬 수 있는 저렴하고 용이한 분화 유도 방법의 개발이 요구되고 있는 실정이다.

본 발명은 상기와 같은 종래 기술상의 문제점을 해결하기 위해 안출된 것으로, 줄기세포를 다양한 세포로 분화시킬 수 있는 저렴하고 용이한 분화 유도 방법의 개발하기 위하여, 박테리아(bacteria) 유래의 SKP(Seventeen kilodaltone protein) 단백질의 유효성분을 포함하는 줄기세포 분화 유도용 조성물 및 이를 이용한 줄기세포 분화 유도 방법 등을 제공하는 것을 그 목적으로 한다.

그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

본 발명은 SKP(Seventeen kilodaltone protein) 단백질을 유효성분을 포함하는 줄기세포 분화 유도용 조성물을 제공한다.

또한 본 발명은 상기 줄기세포 분화 유도용 조성물에 줄기세포를 배양하는 단계를 포함하는 줄기세포 분화 유도 방법을 제공한다.

본 발명의 일 구현예로, 상기 17Kd 단백질은 Nanog(the protein Nanog, named after the mythological Celtic land of the ever young Tir nan Og) 단백질, Sox2(SRY (sex-determinating region Y) -related HMG-box 2) 단백질, 및 Oct4(octamer-binding transcription factor 4) 단백질로 이루어진 군으로 부터 선택되는 단백질의 전사활성부위(transactivation domain)와 결합하는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 다른 구현예로, 상기 17Kd 단백질은 박테리아(bacteria) 유래인 것을 특징으로 한다.

본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 박테리아(bacteria)는 대장균인 것을 특징으로 한다.

본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 17Kd 단백질은 거대분자 세포내 전달도메인(macromolecule transduction domain)과 결합되어 있는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 거대분자 세포내 전달 도메인은 서열번호 8의 아미노산 서열을 포함하는 TAT(transactivator of transcription) 펩타이드, 서열번호 18의 아미노산 서열을 포함하는 PTD(protein transduction domain) 펩타이드, 서열번호 19의 아미노산 서열을 포함하는 Isl-1 PTD(protein transduction domain) 펩타이드, 서열번호 20의 아미노산 서열을 포함하는 PTD-4(protein transduction domain-4) 펩타이드, 및 서열번호 21의 아미노산 서열을 포함하는 L-R9 펩타이드로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 하나 이상인 것을 특징으로 한다.

본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 17Kd 단백질은 핵위치신호(nuclear localization signal) 서열과 결합되어 있는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 줄기세포는 배아줄기세포(embryonic stem cell), 성체줄기세포(adult stem cell), 역분화줄기세포(induced Pluripotent Stem Cell) 및 암줄기세포(cancer stem cell)로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나인 것을 특징으로 한다.

본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 줄기세포는 외배엽 세포(ectodermal cell), 중배엽 세포(mesodermal cell), 및 내배엽 세포(endodermal cell)로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나의 세포로 분화되는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 SKP(Seventeen kilodaltone protein) 단백질을 유효성분을 포함하는 줄기세포 분화 유도용 조성물 및 이를 이용한 줄기세포 분화 유도 방법은, 기존의 줄기세포 분화 촉진제를 사용하지 않고 줄기세포의 분화를 유도할 수 있을 뿐만 아니라, 외배엽 세포, 중배엽 세포, 내배엽 세포, 신경 세포, 심근 세포 등 다양한 세포로의 분화가 가능하기 때문에, SKP 단백질을 이용한 다양한 배양조건을 확립한다면 다양한 세포로의 분화를 가능하게 할 것으로 기대되며, 이를 통해 줄기세포를 이용한 다양한 치료에 사용가능할 것으로 기대된다. 또한 암세포에 존재하는 암 줄기 세포의 분화를 유도할 수 있으므로, 기존의 항암제와 병행 사용하여 암의 전이 및/또는 재발을 효과적으로 억제할 수 있을 것으로 기대된다.

도 1 은 Sox2 단백질-SKP 단백질의 결합을 SDS-page로 확인한 결과를 나타내는 도면이다. Sox2 단백질과 SKP 단백질은 복합체(complex)를 이루고 있으므로 크로마토그래피 컬럼을 이용하여 단백질을 분리하는 경우 같은 분획에서 확인되는 것을 확인할 수 있다.
도 2 는 Sox2 단백질-SKP 단백질의 결합을 SAXS modeling 방법으로 확인한 결과를 나타내는 도면이다. Sox2의 transactivation domain이 SKP 단백질에 의해 둘러싸여 있는 것을 확인할 수 있다.
도 3 은 SKP 단백질의 전사 억제능을 확인한 결과를 나타내는 도면이다. NLS-SKP 단백질을 발현시킨 경우, FBX promotor와 연결된 reporter의 활성이 저해되고 있음을 확인할 수 있다.
도 4 는 세포내에서 SKP 단백질과 Sox2 단백질 및/또는 Nanog 단백질과의 물리적 결합을 western blotting으로 확인한 결과를 나타내는 도면이다.
도 5 는 in vitro에서 SKP 단백질과 Sox2 단백질과의 물리적 결합을 western blotting으로 확인한 결과를 나타내는 도면이다. Sox2 단백질과 SKP 단백질이 같은 분획에서 분리되는 것을 확인할 수 있다.
도 6 은 6His-tag을 가지는 NLS-SKP DNA 단편을 포함하는 재조합 벡터를 간략히 나타낸 모식도이다.
도 7 은 세포투과성을 가지는 SKP 융합 단백질을 분리한 결과를 나타내는 도면이다.
도 8 은 세포투과성을 가지는 SKP 융합 단백질의 세포투과성을 공초점 현미경을 이용하여 확인한 결과를 나타내는 도면이다.
도 9 는 세포투과성을 가지는 SKP 융합 단백질의 세포투과성을 웨스턴 블로팅으로 확인한 결과를 나타내는 도면이다.
도 10 은 SKP 융합 단백질을 transduction시킨 세포를 FACS로 관찰한 결과를 나타내는 도면이다.
도 11 은 SKP 융합 단백질의 세포 분화 촉진능을 RT-PCR로 확인한 결과를 나타내는 도면이다.
도 13 은 FITC이 결합된 SKP 융합단백질을 분리한 결과를 나타내는 도면이다.
도 14 는 P19 세포에 SKP 융합단백질이 도입된 세포와, SKP 융합단백질이 도입되지 않은 세포를 비교한 결과를 나타내는 도면이다.
도 15 는 P19 세포에 SKP 융합단백질이 도입된 것을 확인한 결과를 나타내는 도면이다.
도 16 은 TAT-NLS-SKP 융합단백질이 줄기성 유지 인자들의 발현을 억제한 결과를 나타내는 도면이다.
도 17 은 TAT-NLS-SKP 융합단백질 농도의 증가에 따른 Oct DNA와 Sox DNA의 발현을 확인한 결과를 나타내는 도면이다.
도 18 은 TAT-NLS-SKP 융합단백질의 세포 분화 촉진능을 RT-PCR로 확인한 결과를 나타내는 도면이다.
도 19 는 TAT-NLS-SKP 융합단백질의 신경, 심근 세포로의 분화 촉진능을 RT-PCR로 확인한 결과를 나타내는 도면이다.
도 20 은 TAT-NLS-SKP 융합단백질의 신경 세포(Tuj1) 및 심근 세포(Desmin)로의 분화 촉진능을 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
도 21 은 TAT-NLS-SKP 융합단백질의 림프(αMHC) 및 심근 세포(Nkx2.5, Desmin), 및 근섬유(MF20)로의 분화 촉진능을 확인한 결과를 나타낸 도면이다.

본 발명자들은 줄기세포(stem cell)를 다양한 세포로 분화시킬 수 있는 용이한 분화 유도 방법의 개발하기 위하여 연구한 결과 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명은 17Kd 단백질(Seventeen kilodaltone protein, SKP)을 유효성분을 포함하는 줄기세포 분화 유도용 조성물을 제공한다.

Oct4 단백질, Sox2 단백질, Nanog 단백질 등은 핵심 전사 조절자(core transcriptional regulator)로서 수천개의 유전자를 조절하여 줄기세포(stem cell)의 줄기성(stemness)을 유지하는데 중요한 역할을 담당하고 있는 것으로 알려져 있다. 상기 핵심 전사 조절자들은 DNA 결합 부위(DNA binding domain)를 가지고 있으며, 비정형화된 구조를 가지는 전사활성부위(transactivation domain)를 가지고 있다. 한편, 17Kd 단백질(Seventeen kilodaltone protein, 이하, SKP라 지칭함) 또는 OmpH 단백질로 알려져 있는 단백질은 대장균(Escherichia coli)을 포함한 다양한 박테리아(bacteria) 유래의 분자적 샤페론(molecular chaperone)으로 단백질 접합을 돕는 역할을 하거나 다른 단백질에 결합하여 단백질을 안정화시키는 역할을 하고 있는 것으로 알려져 있다.

본 발명자들은 상기 박테리아 유래의 SKP 단백질이 Oct4 단백질, Sox2 단백질, Nanog 단백질 등의 전사활성부위(transactivation domain)에 결합한다는 것을 실험을 통해 확인하고, SKP 단백질을 유효성분으로 포함하는 줄기세포 분화 유도용 조성물을 개발하였다. 상기 SKP 단백질은 박테리아 유래의 분자적 샤페론 17Kd 단백질이라면 제한이 없으나, 바람직하게는 서열번호 17의 아미노산 서열을 포함하는 SKP 단백질이다. 상기 박테리아의 종류에는 제한이 없으나, 바람직하게는 대장균이다.

본 발명의 일 실시예에서는 SKP 단백질이 줄기세포의 줄기성(stemness)에 중요한 역할을 하는 Sox2 단백질 및 Nanog 단백질과 물리적으로 결합하여 하위 유전자의 발현을 억제하는 것을 확인하였으며(실시예 2 및 3 참조), 또한 세포투과성을 가지는 SKP 융합 단백질을 P19 세포에 단백질도입(transduction)시키면, 기존에 알려진 분화 촉진제 없이 세포의 분화(differentiation)가 촉진되어 다양한 세포(내배엽(endodermal), 중배엽(mesodermal), 외배엽(ectoderm), 신경(neuronal), 심근(cardiac) 세포, 림프 세포, 근섬유 세포 등)로 분화되는 것을 확인하였다(실시예 6 및 9 참조).

상기 결과로부터, 본 발명의 SKP 단백질은 추가적인 다른 분화 유도제를 사용하지 않고도 줄기세포의 줄기성에 중요한 역할을 하는 단백질들의 활성을 억제하여, 다양한 세포로의 줄기세포 분화를 유도할 수 있다는 것을 확인하였으며, 상기 SKP 단백질을 유효성분으로 포함하는 조성물을 이용하여 줄기세포의 분화를 유도할 수 있다는 것을 확인하였다. 이에 본 발명은 SKP 단백질을 유효성분으로 포함하는 줄기세포 분화 유도용 조성물에 줄기세포를 배양하는 단계를 포함하는 줄기세포 분화 유도 방법을 제공한다. 상기 방법은 줄기세포 분화 유도용 조성물을 이용하는 방법이라면 제한이 없으나, 바람직하게는 a) 줄기세포(Stem cell)를 준비하는 단계; b) 단백질 도입(transduction)이 가능한 SKP(Seventeen kilodaltone protein) 단백질을 준비하는 단계; c) 상기 SKP(Seventeen kilodaltone protein) 단백질을 줄기세포에 단백질 도입(transduction)시키는 단계; 및 d) 상기 단백질 도입(transduction)된 줄기세포를 배양하는 단계를 포함하는, 줄기세포 분화 유도 방법이다. 상기 SKP 단백질을 도입시키는 단계는 SKP 단백질 및 스트렙토라이신 O(Streptolysin O, SLO) 50ng/nL 내지 300ng/mL을 처리하는 단계를 더 포함하여 단백질 도입 효율을 높일 수 있다.

본 발명의 SKP 단백질은 기존에 알려져 있는 거대분자 세포내 전달도메인(macromolecule transduction domain)과 결합시켜, 세포 투과성을 높일 수 있다. 상기 거대분자 세포내 전달도메인의 종류에는 제한이 없으나, 바람직하게는 Transportan GWTLNSAGYLLGKINLKALAALAKKIL chimera, MAP(KLALKLALKLALALKLA), SBP (MGLGLHLLVLAAALQGAWSQPKKKRKV), FBP(GALFLGWLGAAGSTMGAWSQPKKKRKV), MPG(ac-GALFLGFLGAAGSTMGAWSQPKKKRKV-cya), MPG(ΔNLS)(ac-GALFLGFLGAAGSTMGAWSQPKSKRKV-cya), Pep-1(ac-KETWWETWWTEWSQPKKKRKV-cya), Pep-2(ac-KETWFETWFTEWSQPKKKRKV-cya), Polyarginines RxN (4<N<17) chimera, Polylysines KxN (4<N<17) chimera, (RAca)6R, (RAbu)6R, (RG)6R, (RM)6R, (RT)6R, (RS)6R, R10, (RA)6R, R7 등이다. 더욱 바람직하게는 TAT 펩타이드(YGRKKRRQRRR, 서열번호 8), Drosophila Antenapedia PTD(RQIKWFQNRRMKWKK, 서열번호 18), Isl-1 PTD(RVIRVWFQNKRCKDKK, 서열번호 19), PTD-4(YARAAARQARA, 서열번호 20), L-R9(RRRRRRRRR, 서열번호 21)이다.

상기 줄기세포의 종류는 SKP 단백질이 결합하는 핵심 전사 조절자(Nanog 단백질, Oct4 단백질, Sox2 단백질 등)를 가지고 있는 줄기세포라면 제한이 없으나, 바람직하게는 배아줄기세포(embryonic stem cell), 성체줄기세포(adult stem cell), 암줄기세포(cancer stem cell), 역분화줄기세포(induced Pluripotent Stem Cell) 등이다.

상기 d) 단계에서 줄기세포를 배양하는 단계는 배아체를 형성시키는 단계를 포함할 수 있으며, 상기 배아체를 형성시키는 단계는 세포가 부착(adhesion)될 수 있는 작용기가 없는 박테리아 배양용 배양접시를 사용할 수 있으나, 배아체를 형성시킬 수 있는 배양 접시라면 이에 제한되지 않는다. 또한 상기 줄기세포 분화 유도 방법은 분화된 세포를 개별적으로 분리하는 단계를 더 포함할 수 있으며, 상기 분리하는 단계는 당업계에 공지된 통상의 방법에 따라 실시될 수 있다. 예를 들어, 기계적인 방법 및 효소적 방법으로 실시될 수 있으며, 트립신과 같은 효소를 이용하는 효소적 분리 방법을 이용할 수 있다. 그러나 이에 제한되지는 않는다.

또한 본 발명의 SKP 단백질을 유효성분으로 함유하는 조성물을 이용하여, 반복적인 실험을 통하여 줄기세포에 따른 다양한 배양조건(배지, 온도 등)을 확립한다면 추가적인 분화 촉진제를 사용하지 않고도 줄기세포를 다양한 세포로 분화시킬 수 있기 때문에, 배양 조건에는 제한이 없으나, 배지는 줄기세포의 배양에 통상적으로 이용되는 배지를 사용할 수 있으며, 예를 들어, 혈청, 완충액, 항산화제, 항생제 등을 포함하는 alphaMEM 배지 등을 사용할 수 있다. 또한 상기 줄기세포를 배양하는 시간은 분화세포가 형성될 수 있는 시간이라면 제한이 없으나, 바람직하게는 2일 내지 15일이다.

본 발명의 줄기세포 분화 유도용 조성물은 본 발명의 SKP 단백질을 전체 조성물 총 중량에 대하여 0.0001 내지 10 중량%, 바람직하게는 0.001 내지 1 중량%의 양으로 존재할 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 또한 본 발명의 줄기세포 분화 유도용 조성물은 약제학적으로 허용 가능한 담체를 포함할 수 있다. 상기 약제학적으로 허용 가능한 담체는 생리식염수, 폴리에틸렌글리콜, 에탄올, 식물성 오일, 및 이소프로필미리스테이트 등을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 또한 줄기세포 배양용 배지, 기존에 알려진 분화 유도제 등을 더 포함할 수 있다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.

[ 실시예 ]

실시예 1. SKP 단백질- Sox2 단백질의 결합 확인

SKP 단백질과 Sox2 단백질이 결합하여 복합체를 형성하는지 확인하기 위하여, SKP 단백질을 코딩하는 skp 유전자(서열번호 1)가 삽입된 pACYCDuet 플라스미드 및 Sox2 단백질을 코딩하는 sox2 유전자(서열번호 2)가 삽입된 pET21 플라스미드를 대장균(Escherichia coli) BL21 (DE3) Star 균주에 형질전환시켰다. 그리고 상기 형질전환된 대장균을 암피실린(ampicillin) 100ug/mL 및 클로람페니콜(chloramphenicol) 34ug/mL이 첨가된 LB 배지에 접종하여 37℃에서 12시간 진탕배양하고, 다시 새로운 LB 배지에 1/100 희석하여 OD600nm = 1.0이 될 때까지 진탕배양하였다. 이후 상기 배양액에 0.5mM의 IPTG(isopropyl-b-D-thiogalactopyranoside)를 첨가하고 6시간 추가 배양한 후에, 4℃에서 5,000rpm으로 원심분리하여 세포를 수득하였다. 상기 수득된 세포는 Buffer A(20 mM HepesNaOH, pH 7.5, 200 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM DTT, 1 mM PMSF)에 혼탁시킨 후에 초음파분쇄기(sonicator)를 이용하여 세포를 파쇄하고, 4℃에서 30,000g로 90분 동안 원심분리하여 세포 용해물이 제거된 상층액만을 수득하였다. 상기 상층액으로부터 단백질을 분리하기 위하여, 상층액을 Buffer B(20 mM HepesNaOH, pH 7.5, 200 mM NaCl, 0.5 mM DTT)로 채워진 Hitrap-SP 컬럼(column)에 주입하고, Buffer B로 컬럼을 세척하여 결합되지 않은 단백질을 컬럼으로부터 제거하였다. 그리고 컬럼에 채워진 용액 용량(volume)의 40배 용량으로 NaCl(sodium chloride) 용액을 200mM부터 1M의 농도로 점차 증가시키며 흘려주어 단백질을 추출하고, 추출된 단백질은 SDS-page를 이용하여 확인하였다. 그 결과는 도 1에 나타내었다.

도 1에 나타난 바와 같이, 대장균 내에서 발현된 Sox2 단백질과 SKP 단백질이 결합되어 복합체를 형성하여, 두 개의 단백질이 동시에 분리되었다는 것을 확인할 수 있었다.

또한 싱크로트론 SAXS(Synchrotron Small-Angle X-ray Scattering) 방법을 이용하여 단백질간 결합을 확인하기 위하여, 상기 추출된 단백질의 농도를 1 내지 5mg/mL로 다양하게 희석한 후에 25℃에서 X33 beamline을 이용하여 SAXS 값을 측정하고, PRIMUS를 이용하여 분석하였다. 삼량체 SKP 단백질에 의해 Sox2 단백질의 c-말단(c-terminal) 전사활성부위(transactivation domain)에 결합한다는 정보를 기초로 하여, 삼량체 SKP 단백질(1U2M)과 Sox2 단백질(1GTO)의 핵산결합 도메인인 HMG(High Mobility Group) 도메인을 이용하여 이론 모델(theoretical model)을 수립하였다(도 2A). 상기 모델은 도 2B에서 확인되는 것처럼, 결합 PDB 모델로부터 얻어진 산란강도 표에 의해서 검증될수 있다(chi=3.23). 비록, 도 2B의 실험적 SAXS 커브가 도 2A에 잘 부합하기는 하지만, 화살표가 가르키는 부분과 같이 모델에서 벗어나는 부분도 있다. 따라서, 마지막 모델은 BUNCH를 이용한 보다 엄격한 모델링 방법을 사용하여, 가장 작은 chi 값인 1.252을 가진 모델을 선택하여(도 2D 참조), 새로운 모델로 도 2C를 선택하였다.

상기 결과를 통하여, SKP 단백질은 삼량체를 형성하면 컵 유사 형태(cup like structure)를 형성하고, 이를 통해 기질 단백질(substrate protein)을 보유할 수 있는 공간이 확보되며, Sox2 단백질은 삼량체의 SKP 단백질과 결합하여도 HMG 도메인은 노출되어 있어 DNA와 결합할 수 있다는 것을 예측할 수 있었다. 또한 동일한 결합부위를 가지는 Nanog 단백질과 결합하여, SKP 단백질-Nanog 단백질 복합체를 형성할 수 있다는 것을 예상할 수 있었다.

실시예 2. 하위 유전자의 발현 억제 효과 확인

줄기세포에 SKP 단백질을 주입하면, 줄기세포 내에서 Sox2 단백질 및/또는 Nanog 단백질의 전사활성부위(transactivation domain)에 결합하여 Sox2혹은 Nanog가 전사복합체(transcription complex)를 형성하는 것을 저해하게 되어 이들 전사인자의 전사 작용을 억제시킬 수 있을 것으로 예상하고 이를 확인하기 위하여, 발광효소 실험법(luciferase reporter assay)으로 Sox2 단백질 및 Oct4 단백질의 하위 유전자(downstream gene) 발현을 확인하였다. 발광효소 실험을 실시하기 위하여, skp 유전자에 핵위치신호(nuclear localization signal, NLS) 서열이 결합된 유전자 단편(서열번호 3)을 pcDNA 3.1 vector(Invitrogen)에 삽입하여 재조합 벡터를 제조하였다. 또한, Renilla luciferase(Rluc) control reporter vector pRL-TK(Promega)에 Oct4 단백질과 Sox2 단백질이 결합하는 서열을 가진 Fbx15 프로모터 서열(서열번호 4)을 삽입하여 재조합 벡터를 제조하였다. 이후 0.8 X 10⁴/well의 농도로 인간기형암종(human teratocarcinoma cell line, NCCIT)을 96 웰 플레이트(96 well plate)에 접종한 후, 37℃, 5% CO₂ 조건에서 12시간 동안 세포를 배양하고, 상기 제조된 두 개의 재조합 벡터를 ExGen500(Fermentas)을 이용하여 세포 내로 주입(transfection)하였다. 벡터를 주입시킨 후, 세포를 24시간 동안 추가 배양한 후에 세포를 파쇄하여 세포 용해물(lysate)을 수득하고, Dual-Luciferase Reporter Assay System(Promega)를 이용하여 발광도를 측정하였다. 그 결과는 도 3에 나타내었다.

도 3에 나타난 바와 같이, SKP 단백질을 주입시킨 세포(2)의 경우에는 SKP 단백질을 주입시키지 않은 대조군 세포(1)에 비하여 Fbx15 프로모터에 의한 발광효소의 발현이 5배 이상 감소된 것을 확인할 수 있었다. 상기 결과를 통하여, 세포 내에서 발현된 SKP 단백질은 Sox2와 결합하여 전사복합체의 형성을 저해시키고, 최종적으로는 하위 유전자의 발현을 억제시킬 수 있다는 것을 확인하였다.

실시예 3. SKP 단백질과 다른 단백질과의 물리적 결합 확인

3-1. 인간기형암종에서의 물리적 결합 확인

SKP 단백질이 물리적으로 다른 단백질들과 결합하는지 확인하기 위하여, 인간기형암종(human teratocarcinoma cell line, NCCIT)을 10⁶의 농도로 35mm 배양접시(culture dish)에 접종하고, 실시예 2와 동일한 방법으로 제조한 NLS-SKP 유전자가 삽입된 pcDNA 3.1 vector(Invitrogen)를 ExGen500(Fermentas)을 이용하여 세포 내로 주입(transfection)하였다. 그리고 상기 세포를 24시간 동안 37℃, 5% CO₂ 조건에서 배양한 후에, 용해완충용액(lysis buffer: 20 mM Tris HCl pH 8, 137 mM NaCl, 5% glycerol, 1% Nonidet P-40 (NP-40), 2 mM EDTA, 1mM PMSF)을 이용하여 세포를 용해시켰다. 그리고 anti-Flag M2 항체 F1804(Sigma-Aldrich)가 결합되어 있는 A-Sepharose(GE Healthcare)를 이용하여 SKP 단백질을 침전시키고, 상기 침전된 SKP 단백질을 SDS-page를 이용하여 웨스턴 블로팅(western blotting)으로 확인하였다. 웨스턴 블로팅용 항체는 rabbit anti Sox2 primary antibody(Epitomics), rabbit anti Nanog primary antibody(Epitomics), goat anti rabbit IgG secondary antibody(Santacruz California)를 사용하였다. 그 결과는 도 4에 나타내었다.

도 4에 나타난 바와 같이, 침전된 SKP 단백질은 Sox2 단백질과 Nanog 단백질이 결합되어 있는 것을 확인할 수 있었다. 상기 결과를 통하여, SKP 단백질은 Sox2 단백질 및/또는 Nanog 단백질과 물리적으로 결합하여, Sox2 단백질과 Nanog 단백질의 전사활성부위의 기능을 억제한다는 것을 예측할 수 있었다.

3-2. in vitro 에서의 결합 확인

SKP 단백질이 다른 단백질들과 결합하는지 재확인하기 위하여, SKP 단백질의 N 말단으로부터 21번 ~ 161번째 아미노산 서열(residue 21-161)과 상기 염기서열의 N 말단에 NLS(nuclear localization signal) 서열이 연결되도록 프라이머(서열번호 5 및 6)를 이용하여 overhang PCR(polymerase chain reaction)을 수행하여 서열번호 3의 염기서열을 가지는 NLS-SKP DNA 단편을 수득하였다. SKP 단백질의 1번~20번째 아미노산 서열(residue)는 signal sequnce로서 제거해도, 다른 단백질과의 결합에 영향을 주지 않는다. 상기 수득된 DNA 단편은 6His-tag을 가지고 있는 pVFT1S 벡터에 삽입하여 재조합 벡터를 제조하였다. 상기 제조된 재조합 벡터를 대장균(Escherichia coli) BL21(DE3) 균주(Promega)에 형질전환시킨 후에 카나마이신(kanamycin)이 50ug/mL 농도로 첨가된 LB 배지에 접종하여 37℃에서 12시간 진탕배양하고, 다시 새로운 LB 배지에 1/100 희석하여 OD600nm = 1.0이 될 때까지 진탕배양하였다. 이후 상기 배양액에 1.0mM의 IPTG(isopropyl-b-D-thiogalactopyranoside)를 첨가하고 7시간 추가 배양한 후에, 4℃에서 5,000rpm으로 15분간 원심분리하여 세포를 수득하였다. 상기 수득된 세포는 Buffer E(25 mM Tris-Cl, pH 7.5, 300 mM NaC, 20 mM Immidazole, 1 mM PMSF)에 혼탁시킨 후에 초음파분쇄기(sonicator)를 이용하여 세포를 파쇄하고, 4℃에서 30,000g로 90분 동안 원심분리하여 세포 용해물이 제거된 상층액만을 수득하였다. 상기 상층액으로부터 단백질을 분리하기 위하여, 상층액을 Buffer A로 채워진 Ni-NTA 컬럼(column)에 주입하고, Buffer A로 컬럼을 세척하여 결합되지 않은 단백질을 컬럼으로부터 제거하였다. 그리고 Buffer A의 이미다졸(imidazole) 농도를 20mM부터 1M의 농도로 점차 증가시키며 90분간 흘려주어 단백질을 추출하고, 추출된 단백질은 다시 Buffer F(20mM TrisHCl, pH 7.5, 300mM NaCl)로 채워진 PD10 컬럼을 이용하여 완충용액(buffer)을 변경하였다. 이후 다시 니켈에 의해 전하를 띠는 NTA 컬럼을 Buffer F로 채우고, 상기 분리된 단백질을 흘려주어 단백질을 컬럼에 결합시켰다. 그리고 P19 세포(embryonic carcinoma cell, EC) 10⁷을 Buffer G(20 mM Tris HCl pH 8, 137 mM NaCl, 5% glycerol, 1% Nonidet P-40, 2 mM EDTA , 1mM PMSF)로 용해시킨 후, 원심분리를 통하여 상층액을 수득하고, 상기 단백질이 결합되어 있는 NTA 컬럼에 흘려주었다. 그리고 Buffer G로 컬럼을 세척하고, 최종적으로 1M의 NaCl 용액으로 세척하였다. 상기 세척된 컬럼에 1M의 이미다졸(immidazole)이 포함된 Buffer H(20mM Tris-HCl, pH 8, 300mM NaCl)을 주입하여, 단백질을 컬럼으로부터 분리하였다. 각각의 단계 시료는 mouse anti-his primary antibody(Sigma-Aldrich), rabbit monoclonal anti Sox2 primary antibody(Epitomics), goat anti mouse secondary antibody(Santacruz), mouse anti beta actin primary antibody(Santacruz), 및 goat anti rabbit secondary antibody(Santacruz)를 이용하여 웨스턴 블로팅을 수행하였다. 그 결과는 도 5에 나타내었다.

도 5에 나타난 바와 같이, 6X His tag가 결합된 NLS-SKP 단백질을 컬럼에 주입하였을 때 일부 단백질이 컬럼에 결합되지 않아 검출이 되었으며(lane 1), 이후 P19 세포의 용해물을 컬럼에 주입하였을 때 역시 일부 단백질이 컬럼에 결합되지 않아 검출이 되는 것을 확인할 수 있었다(lane 2). 그리고 beta-actin의 경우에는 세척을 통하여 완전히 제거된 것을 확인할 수 있었으며, 최종적으로 1M의 이미다졸 용액을 이용하여 단백질을 불리하였을 때, NLS-SKP 단백질과 상기 단백질에 결합된 Sox2 단백질을 확인할 수 있었다. 상기 결과를 통하여, SKP 단백질은 in vitro 상에서도 Sox2 단백질과 물리적으로 결합하는 것을 확인할 수 있었다.

실시예 4. 세포투과성을 가지는 SKP 융합 단백질의 제조

세포 투과성을 가지는 SKP 융합 단백질을 제조하기 위하여, 실시예 3-2의 방법으로 제조한 pVFT1S 재조합 벡터를 제한효소로 처리하여 6His-tag을 가지는 NLS-SKP DNA 단편을 수득하여 pTAT 벡터에 삽입하여 NLS-SKP 단백질의 N 말단에 TAT 펩타이드(서열번호 8)가 결합된, 세포 투과성을 가지는 SKP 재조합 단백질(서열번호 7)을 제조하였다. 상기의 방법으로 제조된 재조합 벡터 맵은 도 6에 간략히 나타내었다. 그리고 SKP 융합 단백질을 생산하기 위하여, 상기 제조된 재조합 벡터를 대장균(Escherichia coli) BL21(DE3) pLysS 균주(Promega)에 형질전환시킨 후에 암피실린(ampicillin)이 100ug/mL 농도로 첨가된 LB 배지에 접종하여 37℃에서 12시간 진탕배양하고, 다시 새로운 LB 배지에 1/100 희석하여 OD600nm = 1.0이 될 때까지 진탕배양하였다. 이후 상기 배양액에 1.0mM의 IPTG(isopropyl-b-D-thiogalactopyranoside)를 첨가하고 7시간 추가 배양한 후에, 4℃에서 5,000rpm으로 15분간 원심분리하여 세포를 수득하였다. 상기 수득된 세포는 Buffer D(25mM Tris-Cl, pH 7.5, 500mM NaC, 20mM immidazole, 1 mM PMSF)에 혼탁시킨 후에 초음파분쇄기(sonicator)를 이용하여 세포를 파쇄하고, 4℃에서 30,000g로 90분 동안 원심분리하여 세포 용해물이 제거된 상층액만을 수득하였다. 상기 상층액으로부터 단백질을 분리하기 위하여, 상층액을 Buffer A로 채워진 Ni-NTA 컬럼(column)에 주입하고, Buffer A로 컬럼을 세척하여 결합되지 않은 단백질을 컬럼으로부터 제거하였다. 그리고 Buffer A의 이미다졸(imidazole) 농도를 20mM부터 1M의 농도로 점차 증가시키며 90분간 흘려주어 단백질을 추출하고, 추출된 단백질은 SDS-page를 이용하여 확인하였다. 그 결과는 도 7A에 나타내었다. 상기 SKP 재조합 단백질을 형광으로 표지하기 위하여, SKP 재조합 단백질을 Buffer F(100 mM NaHCO3 pH 9.0, 500mM NaCl, 10FITC(fluorescein iso-thiocyanate))에 50ug/mL의 농도로 희석시킨 후에 3시간 동안 배양하여 FITC와 SKP 재조합 단백질을 접합(conjugation)시켰다. 그리고 CaCl₂, MgCl₂, 및 MgSO₄를 포함하지 않은 1X Hanks' balanced salt solution에 300mM의 NaCl을 첨가하여 PD-10 컬럼에 채우고, 상기 PD-10 컬럼을 이용하여 결합되지 않은 FITC를 제거하고, SDS-page를 이용하여 확인하였다. 그 결과는 도 7B에 나타내었다.

실시예 5. 세포투과성을 가지는 SKP 융합 단백질의 단백질 도입( transduction )

상기 실시예 4에서 제조된 세포투과성을 가지는 SKP 융합 단백질을 세포 내 도입시키기 위하여, P19 세포(embryonic carcinoma cell, EC) 10⁶을 35mm 배양접시에서 37℃, 5% CO₂ 조건에서 12시간 동안 배양하고, 상기 배양된 세포를 10% 우태아혈청(fetal bovine serum, FBS)이 첨가된 alphaMEM 배지 2mL에 혼탁시킨 후에 100ug의 FITC가 결합된 SKP 융합 단백질을 첨가하고 12시간 내지 18시간을 배양하여 단백질 도입(transduction)시켰다.

단백질 도입 효과를 증진시키기 위해서는, 상기 12시간 동안 배양된 세포를 1X HBSS(Hank's Balanced Salt Solution)로 세척한 후에 180ng/mL의 SLO(Streptolysin O) 및 100ug/mL의 SKP 융합 단백질을 처리하고 20분간 배양 후에, 용액을 제거하고 1mM CaCl₂가 첨가된 alphaMEM 배지에서 세포를 배양하여 세포막을 재생성시킨 후에 배지를 제거하고, 다시 35ug/ml의 FITC가 결합된 SKP 융합 단백질을 포함하는 alphaMEM 배지를 첨가하고 12시간 내지 18시간을 배양하여 단백질 도입(transduction)시켰다.

단백질 도입이 되었는지 확인하기 위하여, 상기 세포를 poly-L-lysine이 처리된 챔버 슬라이드(chamber slide)에 챔버 당 10⁴의 세포가 들어가도록 처리한 후에, 4% paraformaldehyde를 이용하여 세포를 고정(fixation)시켰다. 그리고 PBS(phosphate buffered salin)로 세포를 세척하고, DAPI(sigma-aldrich)를 이용하여 핵을 염색하였다. 또한 SKP 단백질이 정상적으로 세포 내에 형질도입되었는지 확인하기 위해서는, 챔버 내의 세포에 4% paraformaldehyde를 20분간 처리하여 세포를 고정시키고, 0.1% Triton X-100을 10분간 처리하여 세포 투과성을 증가시키고, 1% FBS 및 0.05% Tween 20이 첨가된 PBS를 세포에 처리하고 60분간 배양하여 blocking하였다. 그리고 primary mouse anti-His antibody를 세포에 처리하고 4℃에서 16시간 배양하고, Alexa 633이 결합되어 있는 anti-mouse secondary antibody를 실온에서 1시간 동안 처리하고, 최종적으로 DAPI/Antifade 용액을 첨가하고 공초점 현미경(confocal microscope)을 이용하여 세포를 관찰하였다. 그 결과는 도 8에 나타내었다.

도 8A에 나타난 바와 같이, SKP 융합 단백질(녹색 형광)이 정상적으로 세포 내로 형질도입되었다는 것을 확인할 수 있었다. 또한 도 8B에 나타난 바와 같이, Alexa 633이 결합되어 있는 항체를 이용하여 간접 염색한 경우에도 적색 형광이 관찰되었으며, 이를 통하여 FITC가 결합되어 있는 SKP 융합 단백질이 정상적으로 세포 내로 도입되었다는 것을 확인할 수 있었다.

또한, SKP 융합 단백질이 도입된 세포를 이용하여 실시예 3-1과 동일한 방법으로 웨스턴 블로팅을 수행한 결과를 도 9에 나타내었다.

도 9에 나타난 바와 같이, P19 세포 내에 SKP 융합 단백질이 정상적으로 도입되었다는 것을 재확인할 수 있었다.

상기 결과들을 통하여, 본 발명의 SKP 융합 단백질은 다양한 세포 내로 도입될 수 있다는 것을 확인하였다.

실시예 6. SKP 융합 단백질로 형질도입된 세포의 분화능 측정

SKP 융합 단백질이 도입된 세포가 다른 세포로 분화(differentiation)되는지 확인하기 위하여, 우선 세포 투과성을 가지는 SKP 융합 단백질이 도입된 세포를 분리하였다. 세포를 분리하기 위해서는 P19 세포(embryonic carcinoma cell, EC) 10⁶을 35mm 배양접시에서 37℃, 5% CO₂ 조건에서 12시간 동안 배양하고, 상기 배양된 세포를 10% 우태아혈청(fetal bovine serum, FBS)이 첨가된 alphaMEM 배지 2mL에 혼탁시킨 후에 70ug의 FITC가 결합된 SKP 융합 단백질을 첨가하고 12시간 내지 18시간을 추가 배양하여 형질도입(transduction)시켰다. 그리고 Trypsin-EDTA 용액을 처리하여 세포를 수득한 후, 상기 수득된 세포는 10% cFBS가 첨가된 PBS에 혼탁시키고 FACS Aria III(BD Biosciences)를 이용하여 형광을 띠는 세포(R2, R3, R4)를 분리하였다. 대조군으로는 SKP 융합 단백질이 도입되지 않은 P19 세포를 사용하였다. 그 결과는 도 10에 나타내었다.

SKP 융합 단백질이 도입된 EC 세포가 기존에 알려진 분화 촉진제(differentiation inducer) 처리 없이 분화되는지 확인하기 위하여, 상기 분리된 단백질도입된 EC 세포를 레티온산(retionic acid) 처리 없이 10% FBS 및 1X 페니실린(penicillin)/스트렙토마이신(streptomycin)이 첨가된 alphaMEM 배지가 담긴 미생물용 배양 접시(bacterial grade dish)에서 3일간 배양하며 응집(aggregation)시켰다. 그리고 상기 응집된 세포를 다시 세포용 배양접시(tissue-culture grade dish)로 옮기고 10% FBS가 첨가된 alphaMEM 배지에서 6일간 추가 배양하였다. 이후, 배양된 세포가 정상적으로 분화되었는지 확인하기 위하여, easy-BLUE 키트(iNtRON Biotech)를 이용하여 세포로부터 총 RAN를 수득하고, PrimeScrip^TM RT reagent 키트(TaKaRa)와 하기 표 1의 프라이머를 이용하여 RT-PCR(reverse transcription-polymerase chain reaction)을 수행하였다. 그 결과는 도 11에 나타내었다.

[표 1]

도 11에 나타난 바와 같이, 내배엽(endodermal) 및 중배엽(mesodermal) 세포 분화 마커인 GATA4의 경우, 응집 3일째에 R2, R3, 및 R4 세포에서 모두 발현이 촉진된 것을 확인할 수 있었으며, 신경 세포(neuronal cell) 분화 마커인 beta-tubulin III의 경우에도 응집 3일째에 R2, R3, 및 R4 세포에서 모두 발현이 촉진된 것을 확인할 수 있었다. 심근 세포(cardiac cell) 분화 마커인 cardiac troponin T의 경우에는 6일간 추가 배양 후에, R2 및 R3 세포에서 발현이 증가된 것을 확인할 수 있었다. 상기 결과를 통하여, SKP 단백질로 형질도입된 세포는 줄기성(stemness)를 유지하지 못하고, 최종적으로 다양한 세포로 분화된다는 것을 확인할 수 있었으며, 또한 SKP 단백질을 이용한 다양한 배양조건을 확립한다면 추가적인 분화 촉진제를 사용하지 않고, 줄기세포를 다양한 세포로 분화시킬 수 있다는 것을 확인할 수 있었다.

실시예 7. TAT - NLS - SKP 융합 단백질의 제조

7-1. TAT - NLS - SKP 융합 단백질의 설계

본 실시예에서는, P19 세포에 SKP가 보다 잘 전달될 수 있도록, TAT-NLS-SKP를 제조하였다. 일단, 신호 순서가 결여된 E. coli SKP (residues 21-161)를 인코딩하는 유전자를 overhang PCR을 이용하여 N-말단에 NLS(PKKKRKV, nuclear localization signal)를 포함하도록 설계되었다. 증폭된 PCR 산물은 이후 6His-tag가 N-말단에 삽입된 pVFT1S에서 복제시켰다. 세포 내에 보다 쉽게 도입가능한 단백질을 생산하기위한 목적으로, NLS와 함께 SKP의 DNA 조각을 pTAT 벡터에 서브 클로닝하였다. TAT 펩타이드는 N-말단에 쉽게 도입 될 수 있으므로, pTAT-NLS-SKP는 TAT 펩타이드가 N-말단에 결합되어 있는 NLS-SKP 단백질을 생산할 수 있었다(도 12).

7-2. TAT - NLS - SKP 단백질의 발현 및 정제

pTAT-NLS-SKP 벡터는 E. coli strain BL21(DE3) pLysS(Promega, WI, USA)에 형질전환시키고, 암피실린을 100μg/ml 농도로 포함시킨 LB 배지에서 진탕배양했다. 상기 배지는 12시간 후 새로운 LB 배지에 1:100 희석하여 OD600nm=1.0에 될 때까지 진탕배양 해주었다. 이후 상기 배양액에 1.0 mM의 IPTG(isopropyl-b-D-thiogalactopyranoside)를 첨가하고 7시간 추가 배양한 후에, 4℃에서 5,000rpm으로 원심분리하여 세포를 수득하였다.

상기 수득된 세포는 buffer D (25 mM Tris-HCl, pH 7.5, 500 mM NaCl, 20 mM immidazole and 1 mM PMSF)에 재혼탁시킨 후에 초음파분쇄기(sonicator)를 이용하여 세포를 파쇄하고, 4℃에서 30,000g로 90분 동안 원심분리하여 세포 용해물이 제거된 상층액만을 수득하였다.

상기 상층액으로부터 단백질을 분리하기 위하여, 상층액을 Buffer A로 채워진 Ni-NTA 컬럼(GE Healthcare, NJ, USA)에 주입하고, 컬럼용량의 5배인 Buffer A로 컬럼을 세척하여 결합되지 않은 단백질을 컬럼으로부터 제거하였고, 이미다졸 용액을 20mM부터 1M의 농도로 점차 증가시키며 흘려주어 단백질을 추출했다. TAT-NLS-SKP 복합체를 포함하는 추출된 단백질은 Vivaspin 20 (Sartorius Stedim biotech, Goettingen, Germany)를 이용하여 원심분리하여 5ml 이하의 양으로 농축하여 주고, 농축된 용액을 Buffer E(20 mM Tris-HCl, pH 7.5, 500 mM NaCl, 1 mM DTT)로 채워진 Superdex 200 column (GE Healthcare, NJ, USA) 에 주입하였다. 추출된 단백질을 SDS-PAGE를 이용하여 확인한 결과를 도 13A에 나타내었다.

7-3. FITC 결합 TAT - NLS - SKP 단백질의 제조

TAT-NLS-SKP 단백질 50μg/ml를 300ul의 반응 buffer F (100 mM NaHCO₃ pH 9.0, 500mM NaCl, 10μM FITC)에서 희석하여 TAT-NLS-SKP 단백질에 FITC를 결합시켰다. 상기 희석된 단백질을 상온에서 3시간동안 흔들어주며 배양해주었다. 배양 2시간 후, TAT-NLS-SKP에 결합되지 않은 FITC를 CaCl₂, MgCl₂, MgSO₄가 없는 1X Hanks’ balaced salt solution(Gibco Life Technologies, NY, USA) 이 채워진 PD-10 컬럼에 이용하여, 300mM NaCl을 흘려보내주어 제거했다. 이렇게 정제된 FITC 결합 TAT-NLS-SKP을 SDS-PAGE를 이용하여 확인하였다. 그 결과를 도 13B에 나타내었다.

도 13B에 나타난 것과 같이, 정제된 TAT-Skp(Ⅰ)인 도 13A와 같이, 같은 위치에서 발현되어 있다는 것을 확인할 수 있었다.

7-4. P19 cell line 으로 TAT - NLS - SKP 의 형질도입

TAT-NLS-SKP 단백질을 P19 세포 내로 도입시키기 위해서, 10⁶ P19 세포를 35mm 배양접시에서 37℃, 5% CO₂ 조건에서 12시간 동안 배양하고, 상기 배양된 세포를 10% 우태아혈청(fetal bovine serum, FBS)이 첨가된 alphaMEM 배지 2mL에 혼탁시킨 후에 100μg의 FITC가 결합된 TAT-NLS-SKP 융합 단백질을 첨가하고, 12시간 내지 18시간을 배양하여, P19 세포안에 TAT-NLS-SKP 단백질을 도입(transduction)시켰다.

FITC가 결합된 TAT-NLS-SKP 융합 단백질을 도입시킨 P19 세포와 도입시키지 않은 결과를 SDS-PAGE를 이용하여 확인한 결과, 도 14에 나타낸 것과 같이, P19 세포에 TAT-NLS-SKP 융합단백질이 잘 도입된 것을 확인할 수 있었다.

실시예 8. 면역염색을 통한 TAT - NLS - SKP 단백질의 확인

SKP 도입을 확인하기 위해서, P19 세포는 poly-lysine이 코팅된 챔버슬라이드 (10⁴ cell/chamber, Multi Cell) (CTRL Lifesciences, Gyeonggi, Korea)에서 배양했다. 형질 도입 실험 후, 슬라이드를 1X PBS로 2차례 씻어내고, 4% 파라포름알데하이드로 고정시켰다. 상기 슬라이드를 1X PBS를 이용하여 다시 씻어낸 후, DAPI를 1:3000 비율로 이용하여 핵을 염색하고, P19 세포를 공초점 현미경 (LSM 510 Duo Scan, Carl Ziess, Germany)으로 관찰하였다.

또한, 비직접적인 조직화학법을 통해 TAT-NLS-SKP의 localiztion을 관찰하기 위해서는, P19 세포를 특이적인 항체로 염색해야만 한다. 염색을 위해서, 세포는 4% formaldehyde를 이용하여 얼음 위에서 20분 동안 염색되고, 0.1% Triton X 100 (USB Corporation, OH, USA)에서 10분 동안 삼투시켰다. 그리고, 세포를 1% FBS 및 0.05% Tween 20이 첨가된 PBS에서 60분간 배양하여 blocking하였고, 4℃에서 the primary mouse anti-His antibody (Sigma-Aldrich, MI, USA)를 밤새 처리한 후, anti-mouse secondary antibodies (Invitrogen, CA, USA)가 결합된 Alexa 633을 60 분 동안 실온에서 배양하였다. 최종적으로 DAPI/Antifade 용액을 첨가하고, 공초점 현미경을 이용하여 세포를 관찰하였다. 그 결과는 도 15에 나타내었다.

도 15에 나타난 것과 같이, 화살표가 있는 부분을 확인할 때, 적색 부분에서 분명하게 TAT-NLS-SKP가 핵 안에 존재하고 있음을 보여주고 있는 것을 확인할 수 있었다.

실시예 9. TAT - NLS - SKP 단백질의 분화 유도 확인

9-1. 줄기성 유지 인자의 발현 억제 확인

TAT-NLS-SKP 융합 단백질의 도입으로, 줄기세포의 분화를 유도시킬 수 있는지 확인하기 위하여, 우선 10⁶ P19 세포를 35mm 배양 접시에서 12 시간 동안 배양 했다. 다양한 용량의 TAT-Skp를 P19 세포에 넣고, 추가로 48시간 동안 배양하여 각각 50, 20, 15, 10, 5, 0 ug/ml 농도의 TAT-SKP 단백질이 도입된 P19 세포를 얻어냈다. 상기 세포에 rabbit anti Sox2를 1:10000의 농도로, rabbit anti Nanog를 1:6000의 농도로, mouse anti Oct4를 1:10000 농도로, rabbit anti Beta actin(대조군)을 1:5000의 농도로 혼합해주었다. 그 결과, 도 16에 나타낸 것과 같이, TAT-NLS-SKP 세포의 농도가 높을수록 Nanog, Sox2, Oct4의 발현이 낮게 나타났다. 따라서, 세포 내에 TAT-NLS-SKP가 도입되면, 줄기세포의 줄기성(stemness)가 낮아지고, 분화가 일어날 수 있다는걸 확인하였다.

9-2. Reporter Assay

본 실시예에서는, 발광효소 실험법을 이용하여 TAT-NLS-SKP 단백질의 농도 증가에 따른 Oct DNA와 Sox DNA의 발현을 확인하였다. 발광효소 실험을 실시하기 위하여, skp 유전자에 핵위치신호(nuclear localization signal, NLS) 서열이 결합된 유전자 단편(서열번호 3)을 pcDNA 3.1 vector(Invitrogen)에 삽입하여 재조합 벡터를 제조하였다. 또한, Renilla luciferase(Rluc) control reporter vector pRL-TK(Promega)에 Oct4 단백질과 Sox2 단백질이 결합하는 서열을 가진 Fbx15 프로모터 서열(서열번호 4)을 삽입하여 재조합 벡터를 제조하였다. 세포 주입 12시간 후, 상기 세포들은 다양한 농도의 TAT-Skp 안에 도입시켰다. 48시간 배양 후, 세포 용해물을 수득하고, luciferase 활성을 Dual-Luciferase Reporter Assay System (Promega, WI, USA)을 이용하여 발광효소 활성을 산출한 결과를 도 17에 나타내었다. 도 17에서 확인할 수 있는 것과 같이, TAT-NLS-SKP 단백질의 농도가 높아질수록, 발광효소 활성이 낮아진다는 것을 알 수 있다. 상기 결과를 통하여, 세포 내에 도입된 SKP 단백질은 Oct DNA, Sox DNA와 결합하여 전사복합체의 형성을 저해시킨다는 것을 확인할 수 있다.

9-3. Immuno - precipitation with SKP

10⁶ 인간기형암종 세포(human teratocarcinoma cell line, NCCIT)를 35mm 배양접시에서 배양하고, pcDNA3.1-NLS-SKP로 주입시켰다. 배양 24시간 후, trypinization하여 세포를 수득하고, 완충액(20 mM Tris-HCl pH 8.0, 137 mM NaCl, 5% glycerol, 1% Nonidet P-40 (NP-40), 2 mM EDTA 및 1mM PMSF)에 용해시켰다.

Flag-tagged NLS-SKP 단백질을 anti-Flag M2 antibody F1804 (Sigma-Aldrich, MI, USA)가 결합된 A-Sepharose 단백질 (GE Healthcare, NJ, USA)과 함께 침전시키고, 침전된 샘플을 SDS-PAGE를 이용하여 용해시키고, 웨스턴 블롯으로 분석하였다.

SKP가 Sox2 또는 Nanog와 결합하는지 알아보기 위해서, 멤브레인 위에 1:5000 비율로 rabbit anti Sox2 primary antibody를, 1:6000 비율로 rabbit anti-Nanog primary antibody를 블로팅했다. Secondary antibody는 goat anti-rabbit IgG (Santa Cruz Biotech., CA, USA)를 이용했다.

9-4. TAT - NLS - SKP 단백질의 도입에 따른 내배엽, 중배엽, 외배엽 분화 확인

P19 EC 세포 및 R1 마우스 배아줄기세포를 α-minimum essential media에서 10%의 FBS와 stem cell medium 을 공급하여 배양하였다(배양배지; 2mM L-glutamine (Gibco), 15% FBS (Hyclone), 20mM HEPES, 0.1mM Non-essential amino acids (Gibco), 0.1mM β-mercaptoethanol, Gentamycin). TAT-NLS-SKP 단백질의 분화능을 확인하기 위하여, Mouse ES 세포에 TAT-NLS-SKP 단백질을 처리했다. skp 단백질을 처리한 군, 처리하지 않은 군으로 나누어, 심근 및 신경 세포로 유도를 위해 P19 EC 세포를 박테리아 배양 접시 위에 3일 동안 응집시켰다. 3일간 응집배양 시킨 후, 세포를 세포 배양접시에 다시 놓고, 10% FBS가 첨가된 alphaMEM 배지에서 6일간 추가 배양하였다. 이후, 배양된 세포가 정상적으로 분화되었는지 확인하기 위하여, easy-BLUE 키트를 이용하여 세포로부터 총 RAN을 수득하고, PrimeScripTM RT reagent 키트와 하기 표 2의 프라이머를 이용하여, RT-PCR을 수행하여 분화능을 확인했다.

[표 2]

PCR은 β-tubulin III (a pan-neuronal marker), cardiac troponin T, BryT, ISl1, NKx2.5, αSMA (cardiac markers), GATA4 (an endodermal and mesodermal marker), DKK1 (a mesoendodermal marker), Mesp2 (mesodermal), GATA6 and Hnf4 (endodermal markers), Pax6 (ectodermal)의 프라이머들로 수행되었고, 대조군으로 GAPDH를 이용하였다. 그 결과를 도 18에 나타내었는데, SKP를 처리할 경우 3일째에도 뚜렷한 분화능을 나타내어, 내배엽, 중배엽, 외배엽으로 모두 빠르게 분화될 수 있다는 것을 확인하였다.

또한, Tuj1, GATA4, BryT, Isl-1, Nkx2.5, cTNT, αSMA에 추가적으로 실험을 실시한 결과를 도 19에 나타내었다. SKP 처리후 3일째에 뚜렷한 발현을 보여, SKP 처리에 의해 줄기세포가 신경세포, 심근세포, 내배엽, 중배엽, 외배엽으로 다양하게 분화될 수 있다는 것을 확인하였다.

9-5. 면역 형광 실험을 통한 분화 확인

상기 9-5와 같은 조건으로 P19 EC 세포를 R1 mESC를 분화시킨지 6일째에, P19 EC 세포와 R1 mESC를 포름알데하이드 4%를 이용하여 상온에서 15분 동안 고정시켰다. 세포를 0.5%의 Triton X-100을 이용하여 15분 동안 상온에서 삼투시키고, 1% FBS 및 0.05% Tween 20이 첨가된 PBS를 세포에 처리하고 60분간 배양하여 blocking하였다. 그리고 1:200의 blocking 용액으로 희석된 primary antibody를 세포에 처리하고 4℃에서 overnight 배양하고, Alexa 488이 결합되어 있는 anti-mouse secondary antibody 및 Alexa 555가 결합되어 있는 secondary Goat anti rabbit antibody를 실온에서 1시간 동안 처리하고, 최종적으로 DAPI/Antifade 용액을 첨가하고 하여 5분 동안 핵을 염색하였다. 상기 염색 결과를 공초점 현미경(confocal microscope)을 이용하여 관찰하였다. 그 결과를 도 20 및 도 21에 나타내었는데, SKP 처리에 의해서 Tuj1, Desmin, MHC, Nkx2.5, 및 MF20으로 분화가 된다는 것을 확인할 수 있다. 따라서 SKP 처리로 줄기세포를 신경세포, 심근세포, 림프절, 근섬유로 분화시킬 수 있다는 것을 확인하였다.

전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술 분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야 한다.

<110> SUNGKYUNKWAN UNIVERSITY Foundation for Corporate Collaboration <120> Composition comprising SKP protein for inducing the differentiation of stem cell and uses thereof <130> PB13-11442 <150> 10-2012-0080068 <151> 2012-07-23 <160> 39 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 426 <212> DNA <213> Escherichia coli SKP(residue 21-169) gene <400> 1 gctgacaaaa ttgcaatcgt caacatgggc agcctgttcc agcaggtagc gcagaaaacc 60 ggtgtttcta acacgctgga aaatgagttc aaaggccgtg ccagcgaact gcagcgtatg 120 gaaaccgatc tgcaggctaa aatgaaaaag ctgcagtcca tgaaagcggg cagcgatcgc 180 actaagctgg aaaaagacgt gatggctcag cgccagactt ttgctcagaa agcgcaggct 240 tttgagcagg atcgcgcacg tcgttccaac gaagaacgcg gcaaactggt tactcgtatc 300 cagactgctg tgaaatccgt tgccaacagc caggatatcg atctggttgt tgatgcaaac 360 gccgttgctt acaacagcag cgatgtaaaa gacatcactg ccgacgtact gaaacaggtt 420 aaataa 426 <210> 2 <211> 954 <212> DNA <213> Homo sapiens sox2 gene <400> 2 atgtacaaca tgatggagac ggagctgaag ccgccgggcc cgcagcaaac ttcggggggc 60 ggcggcggca actccaccgc ggcggcggcc ggcggcaacc agaaaaacag cccggaccgc 120 gtcaagcggc ccatgaatgc cttcatggtg tggtcccgcg ggcagcggcg caagatggcc 180 caggagaacc ccaagatgca caactcggag atcagcaagc gcctgggcgc cgagtggaaa 240 cttttgtcgg agacggagaa gcggccgttc atcgacgagg ctaagcggct gcgagcgctg 300 cacatgaagg agcacccgga ttataaatac cggccccggc ggaaaaccaa gacgctcatg 360 aagaaggata agtacacgct gcccggcggg ctgctggccc ccggcggcaa tagcatggcg 420 agcggggtcg gggtgggcgc cggcctgggc gcgggcgtga accagcgcat ggacagttac 480 gcgcacatga acggctggag caacggcagc tacagcatga tgcaggacca gctgggctac 540 ccgcagcacc cgggcctcaa tgcgcacggc gcagcgcaga tgcagcccat gcaccgctac 600 gacgtgagcg ccctgcagta caactccatg accagctcgc agacctacat gaacggctcg 660 cccacctaca gcatgtccta ctcgcagcag ggcacccctg gcatggctct tggctccatg 720 ggttcggtgg tcaagtccga ggccagctcc agcccccctg tggttacctc ttcctcccac 780 tccagggcgc cctgccaggc cggggacctc cgggacatga tcagcatgta tctccccggc 840 gccgaggtgc cggaacccgc cgcccccagc agacttcaca tgtcccagca ctaccagagc 900 ggcccggtgc ccggcacggc cattaacggc acactgcccc tctcacacat gtga 954 <210> 3 <211> 447 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NLS-SKP(residue 21-169) gene <400> 3 cctaagaaga agaggaaggt tgctgacaaa attgcaatcg tcaacatggg cagcctgttc 60 cagcaggtag cgcagaaaac cggtgtttct aacacgctgg aaaatgagtt caaaggccgt 120 gccagcgaac tgcagcgtat ggaaaccgat ctgcaggcta aaatgaaaaa gctgcagtcc 180 atgaaagcgg gcagcgatcg cactaagctg gaaaaagacg tgatggctca gcgccagact 240 tttgctcaga aagcgcaggc ttttgagcag gatcgcgcac gtcgttccaa cgaagaacgc 300 ggcaaactgg ttactcgtat ccagactgct gtgaaatccg ttgccaacag ccaggatatc 360 gatctggttg ttgatgcaaa cgccgttgct tacaacagca gcgatgtaaa agacatcact 420 gccgacgtac tgaaacaggt taaataa 447 <210> 4 <211> 187 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Fbx15 promoter <400> 4 gccctttgta cacctttaat ctgggcccta acttcttttg gagactatat aaggacatct 60 tcgcctgctt ccacttactt gcctgtccaa gatctgttgg aatctgcttc tacagaagac 120 cagctgaaac aaatagcttc gtgggactga gcacaactac tagattcttg gacttccgtt 180 cacagct 187 <210> 5 <211> 53 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NLS-SKP 21-169 forward primer <400> 5 aaaaaagaat tccctaagaa gaagaggaag gttgctgaca aaattgcaat cgt 53 <210> 6 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NLS-SKP 21-169 reverse primer <400> 6 aaaaaactcg agttatttaa cctgtttcag tac 33 <210> 7 <211> 666 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TAT-NLS-SKP(residue 21-169) gene <400> 7 catcatcatc atcatcatgg tatggctagc atgactggtg gacagcaaat gggtcgggat 60 ctgtacgacg atgacgataa ggatcgatgg ggatccaagc ttggctacgg ccgcaagaaa 120 cgccgccagc gccgccgcgg tggatccacc atgtccggct atccatatga cgtcccagac 180 tatgctggct ccatggccgg taccggtctc gagcctaaga agaagaggaa ggttgctgac 240 aaaattgcaa tcgtcaacat gggcagcctg ttccagcagg tagcgcagaa aaccggtgtt 300 tctaacacgc tggaaaatga gttcaaaggc cgtgccagcg aactgcagcg tatggaaacc 360 gatctgcagg ctaaaatgaa aaagctgcag tccatgaaag cgggcagcga tcgcactaag 420 ctggaaaaag acgtgatggc tcagcgccag acttttgctc agaaagcgca ggcttttgag 480 caggatcgcg cacgtcgttc caacgaagaa cgcggcaaac tggttactcg tatccagact 540 gctgtgaaat ccgttgccaa cagccaggat atcgatctgg ttgttgatgc aaacgccgtt 600 gcttacaaca gcagcgatgt aaaagacatc actgccgacg tactgaaaca ggttaaataa 660 gaattc 666 <210> 8 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> TAT peptide <400> 8 Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg 1 5 10 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> beta-tubulin III forward <400> 9 caacgtcaag gtagccgtgt 20 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> beta-tubulin III reverse <400> 10 tccgattcct cgtcatcatc 20 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> cardiac troponin T forward <400> 11 ctgagacaga ggaggccaac 20 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> cardiac troponin T reverse <400> 12 ttctcgaagt gagcctcgat 20 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GATA4 forward <400> 13 gcagcagcag tgaagagatg 20 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GATA4 reverse <400> 14 gcgatgtctg agtgacagga 20 <210> 15 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GAPDH forward <400> 15 accacagtcc atgccatcac 20 <210> 16 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GAPDH reverse <400> 16 tccaccaccc tgttgctgta 20 <210> 17 <211> 141 <212> PRT <213> SKP protein 21-169 residue <400> 17 Ala Asp Lys Ile Ala Ile Val Asn Met Gly Ser Leu Phe Gln Gln Val 1 5 10 15 Ala Gln Lys Thr Gly Val Ser Asn Thr Leu Glu Asn Glu Phe Lys Gly 20 25 30 Arg Ala Ser Glu Leu Gln Arg Met Glu Thr Asp Leu Gln Ala Lys Met 35 40 45 Lys Lys Leu Gln Ser Met Lys Ala Gly Ser Asp Arg Thr Lys Leu Glu 50 55 60 Lys Asp Val Met Ala Gln Arg Gln Thr Phe Ala Gln Lys Ala Gln Ala 65 70 75 80 Phe Glu Gln Asp Arg Ala Arg Arg Ser Asn Glu Glu Arg Gly Lys Leu 85 90 95 Val Thr Arg Ile Gln Thr Ala Val Lys Ser Val Ala Asn Ser Gln Asp 100 105 110 Ile Asp Leu Val Val Asp Ala Asn Ala Val Ala Tyr Asn Ser Ser Asp 115 120 125 Val Lys Asp Ile Thr Ala Asp Val Leu Lys Gln Val Lys 130 135 140 <210> 18 <211> 15 <212> PRT <213> Drosophila Antenapedia PTD peptide <400> 18 Arg Gln Ile Lys Trp Phe Gln Asn Arg Arg Met Lys Trp Lys Lys 1 5 10 15 <210> 19 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Isl-1 PTD peptide <400> 19 Arg Val Ile Arg Val Trp Phe Gln Asn Lys Arg Cys Lys Asp Lys Lys 1 5 10 15 <210> 20 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PTD-4 peptide <400> 20 Tyr Ala Arg Ala Ala Ala Arg Gln Ala Arg Ala 1 5 10 <210> 21 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> L-R9 peptide <400> 21 Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg 1 5 <210> 22 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BryT Forward <400> 22 ccggtgctga aggtaaatgt 20 <210> 23 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BryT Reverse <400> 23 tccattgagc ttgttggtga 20 <210> 24 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ISl-1 Forward <400> 24 tcatccgagt gtggtttcaa 20 <210> 25 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ISl-1 Reverse <400> 25 ccatcatgtc tctccggact 20 <210> 26 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NKx2.5 Forward <400> 26 gctacaagtg caagcgacag 20 <210> 27 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NKx2.5 Reverse <400> 27 gggtaggcgt tgtagccata 20 <210> 28 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> alpha SMA Forward <400> 28 ctgacagagg caccactgaa 20 <210> 29 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> alpha SMA Reverse <400> 29 catctccaga gtccagcaca 20 <210> 30 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DKK1 Forward <400> 30 gccagagaca ctaaaccgac ag 22 <210> 31 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DKK1 Reverse <400> 31 gagaaacaag gcaatgtacc ac 22 <210> 32 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Mesp2 Forward <400> 32 cgcctggcca tccgctacat 20 <210> 33 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Mesp2 Reverse <400> 33 cacccccagg acaccccact act 23 <210> 34 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GATA6 Forward <400> 34 atgcttgcgg gctctatatg 20 <210> 35 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GATA6 Reverse <400> 35 tgaggtggtc gcttgtgtag 20 <210> 36 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Hnf4 Forward <400> 36 ctcttctgat tataagctga ggatg 25 <210> 37 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Hnf4 Reverse <400> 37 ccacaggaag gtgcagattg atctg 25 <210> 38 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Pax6 Forward <400> 38 aacaacctgc ctatgcaacc 20 <210> 39 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Pax6 Reverse <400> 39 acttggacgg gaactgacac 20

Claims (11)

17Kd 단백질(Seventeen kilodaltone protein)을 유효성분을 포함하는, 줄기세포 분화 유도용 조성물.

제 1 항에 있어서,
상기 17Kd 단백질은 Nanog(the protein Nanog, named after the mythological Celtic land of the ever young Tir nan Og) 단백질, Sox2(SRY (sex-determinating region Y) -related HMG-box 2) 단백질, 및 Oct4(octamer-binding transcription factor 4) 단백질로 이루어진 군으로부터 선택되는 단백질의 전사활성부위(transactivation domain)와 결합하는 것을 특징으로 하는, 줄기세포 분화 유도용 조성물.

제 1 항에 있어서,
상기 17Kd 단백질은 박테리아(bacteria) 유래인 것을 특징으로 하는, 줄기세포 분화 유도용 조성물.

제 3 항에 있어서,
상기 박테리아(bacteria)는 대장균인 것을 특징으로 하는, 줄기세포 분화 유도용 조성물.

제 1 항에 있어서,
상기 17Kd 단백질은 거대분자 세포내 전달도메인(macromolecule transduction domain)과 결합되어 있는 것을 특징으로 하는, 줄기세포 분화 유도용 조성물.

제 5 항에 있어서,
상기 거대분자 세포내 전달 도메인은 서열번호 8의 아미노산 서열을 포함하는 TAT(transactivator of transcription) 펩타이드, 서열번호 18의 아미노산 서열을 포함하는 PTD(protein transduction domain) 펩타이드, 서열번호 19의 아미노산 서열을 포함하는 Isl-1 PTD(protein transduction domain) 펩타이드, 서열번호 20의 아미노산 서열을 포함하는 PTD-4(protein transduction domain-4) 펩타이드, 및 서열번호 21의 아미노산 서열을 포함하는 L-R9 펩타이드로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 줄기세포 분화 유도용 조성물.

제 1 항에 있어서,
상기 17Kd 단백질은 핵위치신호(nuclear localization signal) 서열과 결합되어 있는 것을 특징으로 하는, 줄기세포 분화 유도용 조성물.

제 1 항에 있어서,
상기 줄기세포는 배아줄기세포(embryonic stem cell), 성체줄기세포(adult stem cell), 역분화줄기세포(induced Pluripotent stem Cell) 및 암줄기세포(cancer stem cell)로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나인 것을 특징으로 하는, 줄기세포 분화 유도용 조성물.

제 1 항에 있어서,
상기 줄기세포는 외배엽 세포(ectodermal cell), 중배엽 세포(mesodermal cell), 및 내배엽 세포(endodermal cell)로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 세포로 분화되는 것을 특징으로 하는, 줄기세포 분화 유도용 조성물.

제 1 항의 줄기세포 분화 유도용 조성물에 줄기세포를 배양하는 단계를 포함하는, 줄기세포 분화 유도 방법.

제 10 항에 있어서,
상기 줄기세포를 배양하는 단계는 SKP 단백질 및 스트렙토라이신 O(Streptolysin O)를 처리하는 전처리 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 줄기세포 분화 유도 방법.

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