KR20140000810A - 분변 중 요네균 신속분리를 위한 자석 나노입자를 이용한 검출방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 분변 중 요네균 신속분리를 위한 자석 나노입자를 이용한 검출방법에 관한 것으로, 구체적으로 요네균 특이적 항체가 결합된 자성 나노입자를 이용하여 가축 등의 분변 시료에 존재할 수 있는 요네균을 높은 감도로 분리해 내고, 요네균의 DNA에 특이적으로 결합하는 프라이머를 사용하여 중합효소 연쇄반응을 수행함으로써 요네균의 감염여부를 신속하고 간편하게 확인하기 위한 요네균 검출 방법에 관한 것이다.
본 발명에 따르면 분변 등의 생물학적 시료에 요네균이 매우 작은 수로 존재하더라도 용이하게 요네균을 검출할 수 있으며, 그 방법이 간단하고 매우 신속하게 이루어질 수 있어, 감염된 개체를 우군에서 격리함으로써 다른 개체로의 전염을 막을 수 있다.
본 발명에 따르면 분변 등의 생물학적 시료에 요네균이 매우 작은 수로 존재하더라도 용이하게 요네균을 검출할 수 있으며, 그 방법이 간단하고 매우 신속하게 이루어질 수 있어, 감염된 개체를 우군에서 격리함으로써 다른 개체로의 전염을 막을 수 있다.
Description
본 발명은 분변 중 요네균 신속분리를 위한 자석 나노입자를 이용한 검출방법에 관한 것으로, 구체적으로 요네균 특이적 항체가 결합된 자성 나노입자를 이용하여 가축 등의 분변 시료에 존재할 수 있는 요네균을 높은 감도로 분리해 내고, 요네균의 DNA에 특이적으로 결합하는 프라이머를 사용하여 중합효소 연쇄반응을 수행함으로써 요네균의 감염여부를 신속하고 간편하게 확인하기 위한 요네균 검출 방법에 관한 것이다.
요네균(Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis)은 가축에서 만성 설사와 같은 만성소모성 질병을 유발하여 전세계적으로 막대한 경제적 손실을 유발한다. 요네병에 걸릴 수 있는 반추수는 소, 양, 염소, 사슴, 낙타 등이 있으며, 이외에도 오소리, 여우, 코요테, 라쿤, 쥐, 토끼, 족제비 등의 야생동물에도 감염될 수 있다.
요네병 발생에 의한 가장 큰 피해는 생산성의 저하로 인한 경제적 손실로, 요네병은 주요 선진국에서도 많이 발생하여 미국의 경우 젖소산업에서 연간 약 2억 ~ 2억 5천만 달러의 손실을 유발하고, 캐나다에서도 약 1700억의 경제적 손실을 일으킨다.
요네병의 국내발생상황에 대해 전국적인 조사는 이루어지지 않아 정확한 발생율은 알 수 없으나, 각 시도 가축위생연구소에서 의뢰된 시료에 대해서 조사한 결과에 의하면 2008년 140두(49건), 2009년 277두(111건), 2010년 432두(168건), 2011년 353두(157건)로 해마다 증가하는 경향을 보이고 있어, 국내에서도 요네병 근절에 대한 대책이 필요한 시점이다.
요네균은 동물에서 소화기관에 병변을 유발하며 분변에서 요네균을 배양법을 통해 검출하는 방법이 ‘gold standard'로 사용되어왔다. 그러나 요네병의 전염을 막기 위해서는 감염 여부를 신속하게 확인하고, 감염이 확인된 동물을 무리로부터 신속하게 격리시키는 조치가 매우 중요한데, 기존의 배양법을 사용하여 검출하는 경우 요네균의 배양을 위해 최소 2주에서 4개월이라는 긴 시간이 요구되기 때문에, 신속한 대응이 어렵다.
이를 극복하기 위해 분변에서 직접 유전자를 정제하여 PCR을 수행하는 방법이 시도되었으나, 이 방법에 따르면 기존 배양법과 비교 시 민감도는 높지만, 분변 시료로부터 DNA를 추출하기 위해 고가의 분변 전용 DNA 추출키트를 사용해야 하고, 이 방법 역시 인력과 시간이 많이 소요된다는 단점이 있다.
이에, 본 발명자들은 상기와 같은 기존 요네균 검출방법들의 문제점을 극복하기 위하여 예의 연구 노력한 결과, 요네균 특이 항체를 자성 나노입자의 표면에 결합시킨 항체 결합 나노입자를 이용하여 분변 시료로부터 요네균을 효과적으로 분리해내고, 간단한 가열과정을 통해 DNA를 추출한 다음 요네균 유전자 특이 프라이머를 사용하여 중합효소 연쇄반응을 수행할 경우, 간단한 방법을 사용하여 매우 빠른 시간 내에 높은 민감도로 요네균을 검출할 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서 본 발명의 주된 목적은 가축 등의 분변 시료로부터 간단하고 경제적인 방법을 사용하여 신속하고 효율적으로 요네균을 검출하는 방법을 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 요네균 검출방법을 적용하는데 필요한 재료가 포함되어 있어, 분변 시료로부터 간편하고 신속하게 요네균을 검출할 수 있도록 하는 요네균 검출 키트를 제공하는데 있다.
본 발명의 한 양태에 따르면, 본 발명은 도데실황산나트륨(sodium dodecyl sulfate, SDS)이 포함된 pH 7 내지 8의 완충액에 생물학적 시료를 현탁하고 원심분리하여 침전물을 수득하는 단계; 상기 침전물을 pH 7 내지 8의 완충액에 현탁한 다음, 직경이 30 내지 500㎚이고 표면이 아민(NH2) 작용기(functional group)로 코팅되며 마이코박테리움 아비움 아종 파라튜버큘로시스(Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis, 요네균)에 대한 항체 면역글로불린 Y(immunoglubulin Y, IgY)가 상기 아민 작용기에 공유결합된 자성(magnetic) 나노입자를 첨가하고 혼합하여 항체반응 혼합물을 준비하는 단계; 상기 항체반응 혼합물로부터 자력을 이용하여 자성 나노입자 결합물을 수득하는 단계; 상기 자성 나노입자 결합물에 물 또는 완충액을 첨가하고 95 내지 100℃로 가열한 다음 원심분리하여 상층액을 수득하는 단계; 상기 상층액을 시료로 하여, 서열번호 1로 표시되는 염기서열을 포함하는 프라이머 및 서열번호 2로 표시되는 염기서열을 포함하는 프라이머로 이루어지는 제1프라이머 세트 또는 서열번호 3으로 표시되는 염기서열을 포함하는 프라이머 및 서열번호 4로 표시되는 염기서열을 포함하는 프라이머로 이루어지는 제2프라이머 세트로 중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR)을 수행하는 단계; 상기 중합효소연쇄반응에 의해 증폭된 DNA를 분석하는 단계;를 포함하는 요네균 검출 방법을 제공한다.
본 발명의 요네균 검출 방법에서, 상기 침전물을 수득하는 단계는 여러 가지 물질들이 혼합되어 있는 생물학적 시료로부터 계면활성제를 사용하여 미생물 등을 1차 분리하기 위한 단계라고 할 수 있다. 이때 계면활성제로는 도데실황산나트륨(sodium dodecyl sulfate, SDS)을 사용하는 것이 바람직하며, 완충액에 3 ~ 10%(w/v)의 농도로, 보다 바람직하게는 약 6%(w/v)의 농도로 포함시켜 사용하는 것이 좋다. 이 단계에서 완충액의 역할은 갑작스런 pH 등의 변화로 인해 요네균 세포막이 변형되어 요네균을 선택 분리하기도 전에 DNA가 용출되는 것을 방지하기 위한 것으로, 완충액의 pH는 7 ~ 8인 것이 바람직하며, 보다 바람직하게는 pH 8 정도가 좋다. 완충액으로는 트리스-염화수소(Tris-HCl) 완충액을 사용하는 것이 좋다. 예를 들면, 도데실황산나트륨의 농도가 약 6%(w/v)이고 pH가 약 8 정도인 12mM의 트리스-염화수소(트리스-염화수소) 완충액을 제조하여 여기에 시료를 현탁하는 방법으로 이 단계를 수행할 수 있다.
상기 항체반응 혼합물을 준비하는 단계는 1차 분리단계를 거친 혼합물로부터 요네균만을 선택적으로 분리하는 단계라 할 수 있다. 이를 위해 요네균 특이적인 항체가 결합된 자성 나노입자를 사용하는데, 자성 나노입자로는 직경이 30 ~ 500㎚이고 표면이 아민(NH2) 작용기(functional group)로 코팅된 것을 사용하는 것이 바람직하다. 아민 작용기에 요네균 특이 항체를 공유결합시키면 항체가 안정적으로 결합된 나노입자를 제조할 수 있다.
요네균 특이 항체로는 요네균체 또는 요네균 세포 파쇄물을 항원으로 사용하고 조류 특히 닭의 면역반응을 유도하여 생산되는 면역글로불린 Y(immunoglubulin Y, IgY)를 사용하는 것이 바람직하다.
이 단계에서도 갑작스런 pH 등의 변화로 인해 요네균 세포막이 변형되어 요네균을 선택 분리하기도 전에 DNA가 용출되는 것을 방지하기 위해, pH 7 ~ 8의 완충액을 사용하는 것이 바람직한데, 이때 완충액으로는 인산완충식염수(phosphate buffered saline, PBS)를 사용하는 것이 바람직하다.
요네균 특이 항체가 결합된 자성 나노입자를 1차 분리한 시료와 반응시키면, 시료의 요네균과 항체가 결합하기 때문에, 만약 시료 내에 요내균이 존재한다면 최종적으로 요네균 + 항체 + 자성 나노입자 상태의 결합물이 형성된다.
따라서 혼합물에서 나노입자를 선택적으로 분리하면, 요네균도 함께 분리될 수 있다. 본 발명에서는 자성 나노입자를 사용하므로, 자석 등을 이용한 간단한 방법으로 요네균 + 항체 + 자성 나노입자 결합물을 효과적으로 분리할 수 있다.
이때 항체 결합 자성 나노입자는 항체반응 혼합물의 항체 농도가 0.1 ~ 2㎍/㎖이 되도록 첨가하는 것이 바람직하다.
항체 결합 자성 나노입자로 요네균을 분리한 다음, 물이나 완충액에 현탁하고 가열하는 아주 간단한 방법으로 요네균 DNA를 추출할 수 있다. 가열온도는 95 ~ 100℃인 것이 바람직하며, 10 ~ 15분 정도 가열하면 요네균 세포 밖으로 DNA가 용출된다.
상기 중합효소 연쇄반응을 수행하는 단계는 요네균 특이 프라이머를 이용하여 시료에 존재할 수 있는 요네균 DNA의 일부를 증폭함으로써 시료 내 요네균 존재 여부 확인을 용이하게 하기 위한 단계라고 할 수 있다.
시료 내에 존재할 수 있는 다른 균주와 구분되고, 낮은 농도의 DNA 만으로도 용이한 증폭이 이루어지기 위해서는, 서열번호 1로 표시되는 염기서열을 포함하는 프라이머 및 서열번호 2로 표시되는 염기서열을 포함하는 프라이머로 이루어지는 제1프라이머 세트 또는 서열번호 3으로 표시되는 염기서열을 포함하는 프라이머 및 서열번호 4로 표시되는 염기서열을 포함하는 프라이머로 이루어지는 제2프라이머 세트를 사용하는 것이 바람직하다.
또한, 상기 제1프라이머 세트를 사용하는 경우, 중합효소연쇄반응은 93 ~ 95℃로 3 ~ 7분간 유지하는 단계; 93 ~ 95℃에서 20 ~ 40초, 61 ~ 63℃에서 20 ~ 40초, 71 ~ 73℃에서 20 ~ 40초의 순서로 30 ~ 40회 반복하는 단계; 및 71 ~ 73℃에서 5 ~ 20분간 유지하는 단계;를 포함하여 이루어지며, 상기 제2프라이머 세트를 사용하는 경우, 중합효소연쇄반응은 93 ~ 95℃로 10 ~ 20분간 유지하는 단계; 93 ~ 95℃에서 50 ~ 70초, 61 ~ 63℃에서 50 ~ 70초, 71 ~ 73℃에서 50 ~ 70초의 순서로 25 ~ 40회 반복하는 단계; 및 71 ~ 73℃에서 5 ~ 20분간 유지하는 단계를 포함하여 이루어지는 것이 바람직하다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기와 같은 요네균 검출방법을 용이하게 수행할 수 있도록 구성된 요네균 검출용 키트를 제공한다.
이 키트는 직경이 30 ~ 500㎚이고 표면이 아민(NH2) 작용기로 코팅되며 마이코박테리움 아비움 아종 파라튜버큘로시스(Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis)에 대한 항체 면역글로불린 Y가 상기 아민 작용기에 공유결합되는 자성 나노입자; 및 서열번호 1로 표시되는 염기서열을 포함하는 프라이머 및 서열번호 2로 표시되는 염기서열을 포함하는 프라이머로 이루어지는 제1프라이머 세트 또는 서열번호 3으로 표시되는 염기서열을 포함하는 프라이머 및 서열번호 4로 표시되는 염기서열을 포함하는 프라이머로 이루어지는 제2프라이머 세트;를 포함하는 것이 바람직하다.
이 외에도 본 발명의 요네균 검출방법에 사용되는 완충액, PCR을 위한 중합효소, dNTP 등이 더 포함될 수 있으며, 시료의 채취를 위한 도구나 검출과정에 필요한 용기 등이 포함될 수 있다.
본 발명에 따르면 분변 등의 생물학적 시료에 요네균이 매우 작은 수로 존재하더라도 용이하게 요네균을 검출할 수 있으며, 그 방법이 간단하고 매우 신속하게 이루어질 수 있어, 감염된 개체를 우군에서 격리함으로써 다른 개체로의 전염을 막을 수 있다.
도 1은 항체 결합 자성 나노입자를 이용하여 요네균을 검출한 후 IS900 프라이머를 사용하여 PCR을 수행하고 전기영동한 결과이다. 1 ~ 6번 레인은 PBS 환경, 7 ~ 12번 레인은 분변 용액 환경의 결과이다. 1 ~ 6번 레인과 7 ~ 12번 레인은 그 순서대로 각각 균수 105, 104, 103, 102, 101, 1의 경우이며, P는 양성대조군, N은 음성대조군, M은 분자량 마커이다.
도 2는 항체 결합 자성 나노입자를 이용하여 요네균을 검출한 후 MOSS900 프라이머를 사용하여 PCR을 수행하고 전기영동한 결과이다. 1 ~ 6번 레인은 PBS 환경, 7 ~ 12번 레인은 분변 용액 환경의 결과이다. 1 ~ 6번 레인과 7 ~ 12번 레인은 그 순서대로 각각 균수 105, 104, 103, 102, 101, 1의 경우이며, P는 양성대조군, N은 음성대조군, M은 분자량 마커이다.
도 3은 본 발명의 방법과 기존 열처리 방법을 사용하여 각각 PCR하고 전기영동한 결과이다. 1 ~ 6번 레인은 항체 결합 자성 나노입자를 이용해 요네균을 검출하여 DNA를 추출, PCR을 수행한 것이며, 7 ~ 12번 레인은 기존 열처리 방법을 통해 DNA를 추출, PCR을 수행한 것이다. 1 ~ 6번 레인과 7 ~ 12번 레인은 그 순서대로 각각 균수 105, 104, 103, 102, 101, 1의 경우이다.
도 2는 항체 결합 자성 나노입자를 이용하여 요네균을 검출한 후 MOSS900 프라이머를 사용하여 PCR을 수행하고 전기영동한 결과이다. 1 ~ 6번 레인은 PBS 환경, 7 ~ 12번 레인은 분변 용액 환경의 결과이다. 1 ~ 6번 레인과 7 ~ 12번 레인은 그 순서대로 각각 균수 105, 104, 103, 102, 101, 1의 경우이며, P는 양성대조군, N은 음성대조군, M은 분자량 마커이다.
도 3은 본 발명의 방법과 기존 열처리 방법을 사용하여 각각 PCR하고 전기영동한 결과이다. 1 ~ 6번 레인은 항체 결합 자성 나노입자를 이용해 요네균을 검출하여 DNA를 추출, PCR을 수행한 것이며, 7 ~ 12번 레인은 기존 열처리 방법을 통해 DNA를 추출, PCR을 수행한 것이다. 1 ~ 6번 레인과 7 ~ 12번 레인은 그 순서대로 각각 균수 105, 104, 103, 102, 101, 1의 경우이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이므로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.
실시예 1. 요네균 준비
본 실시예에서는 미국생물자원센터(American Type Culture Collection, ATCC)에서 제공받은 ATCC 19698 균주(Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis, MAP)를 사용하였다.
미들브룩 7H10 배지(Difco, USA)에 0.4% 트윈80과 10% 미들브룩 올레익산-알부민-덱스트로즈-카탈라제(OADC), 0.04% 마이코박틴 J를 포함시켜 만든 사면배지에 상기 균주를 접종하여 37℃에서 8주간 배양하였다.
균주는 인산완충식염수(phosphate buffered saline, PBS)에 현탁하여 5,000rpm으로 10분간 원심분리한 후 침전물을 pH7.4의 PBS에 두 번 세척하였다. 이를 20% 글리세롤(glycerol)이 포함된 배지에 108 cells/㎖의 균체수에 맞추어 현탁한 다음 -80℃에서 보관하였다.
실시예 2. 요네균 항체 준비
24주령 화이트 레그혼(White Leghorn) 품종의 닭을 이용하여 IgY를 생산하였다. 여기에 사용된 닭은 모두 병아리일 때 마렉병(Marek's disease) 바이러스 예방 접종하였다.
항체 생산을 위한 면역 항원으로 4가지 MAP 균주를 열처리하여 죽인 세포를 사용하였다. 면역반응 유도 이전에 각 닭의 혈청을 이용하여 MAP 세포벽 항원에 대한 면역반응성을 테스트하였다(ELISA를 이용). 가장 낮은 ELISA OD값(OD = 0.12)을 나타내는 닭을 선택하였다.
동일 부피의 프로인트 불완전 아쥬반트(Freund's incomplete adjuvant, FIA)가 혼합되고 MAP 세포 농도가 2×107 CFU/㎖인 세포액 500㎕를 산란닭에 경피주사하였다. 이후 일주 간격으로 상기와 동일한 세포액을 동량 1회 날개에 근육주사하여 총 7회에 걸쳐 면역반응을 유도하였다.
2회째 면역반응 이후 면역반응이 유도된 닭의 달걀을 수집하여 4℃에 보관하였다. 난황 3배 부피의 PBS가 첨가된 난황 혼합물에 난황 1배 부피의 40% 폴리에틸렌 글리콜(polyethylene glycol, PEG) 8000(시그마 사) 용액을 첨가하고, 13,000×g로 20분간 원심분리하여 닭의 IgY를 침전시켰다. 정제된 IgY를 10mM PBS(pH 7.2)로 4회 투석하였다. IgY의 순도 및 농도를 SDS-PAGE 및 BCA 단백질 분석 키트(피어스 사)로 결정하였다.
실시예 3. 요네균 항체 결합 자성 나노입자 준비
자성 나노입자로 나노브릭(Nano brick) 사의 SPM-NH2 제품을 사용하였다. 이 제품은 직경이 30 내지 500㎚이고 표면이 아민(NH2) 작용기(functional group)로 코팅된 자성(magnetic) 나노입자이다.
3-1. 자성 나노입자 준비
나노입자 2㎎에 커플링 버퍼(coupling buffer)(0.01M Pyridin, pH6) 1㎖를 첨가하여 현탁하고 자석을 이용하여 나노입자를 수득하는 과정을 3회 반복한 다음, 수득한 나노입자에 5% 글루타알데히드(glutaraldehyde) 용액 1㎖을 첨가하여 현탁하고 30분간 실온에 놓아두어 반응시킨 후 자석을 이용하여 나노입자를 수득하고 커플링 버퍼를 사용하여 위와 동일한 방법으로 3회 세척하였다.
3-2. 항체 결합
상기 실시예 2의 항체를 커플링 버퍼에 90 ~ 100㎍/㎖의 농도로 현탁한 다음 상기 3-1에서 준비된 나노입자 2㎎을 첨가하여 현탁하고, 실온에서 16 ~ 24시간 간헐적으로 섞어 주면서(vortexing) 반응시켰다. 자석을 이용하여 나노입자를 수득한 다음 글리신 퀀칭(glycine quenching) 용액(1M Glycine, pH8) 1㎖을 첨가하여 현탁하고 상온에서 30분간 간헐적으로 섞어 주면서 반응시켰다.
반응이 끝난 후 자석을 이용하여 나노입자를 수득하고 상기 3-1에서와 같은 방법으로 커플링 버퍼로 3회 세척한 다음 세척 버퍼(wash buffer)(0.01M Tris, 0.15M NaCl, 0.1% BSA, pH 7.4) 1㎖에 현탁하여 4℃에서 보관하였다.
BCA 분석 방법을 이용하여 단백질의 농도를 측정하였으며, 최종 단백질 농도를 확인한 후 사용하였다.
실시예
4.
분변중
요네균
검출
4-1. 시료 준비
상기 실시예 1에서 준비한 요네균의 균체수가 105, 104, 103, 102, 101, 1 cells/㎖ 인 시료를 준비하였다.
각 시료는 PBS 또는 분변 용액에 균체를 현탁하는 방법으로 준비하였으며, 분변 용액은 DNA를 추출하고 중합효소연쇄반응을 수행하여 음성결과를 나타낸 검체를 5개 이상 모아 PBS에 1/20으로 희석한 것으로 대신하였다.
4-2. 항체 결합 자성 나노입자를 이용한
요네균
검출 및
DNA
추출
각 시료 1㎖을 7,500rpm에서 5분간 원심분리한 후 상층액을 제거하고 6% 도데실황산나트륨(sodium dodecyl sulfate, SDS)을 포함시킨 12mM Tris-HCl 완충액 1㎖에 현탁한 후 150rpm으로 30분간 회전시켰다. 이를 13,000rpm으로 3분간 원심분리하여 침전물을 수득하고, 이 침전물을 12mM Tris-HCl 완충액(pH8.0)으로 2번 세척하였다. 세척한 침전물을 990㎕의 PBS에 현탁하고 단백질 농도가 100㎍/㎖인 상기 실시예 3의 항체 결합 자성 나노입자 용액 10㎕를 첨가한 후 37℃에서 150rpm으로 1시간 회전시키면서 반응시켜 항체 결합 자정 나노입자가 시료 안의 균체와 결합할 수 있도록 하였다. 이후 자석 위에 30분간 놓아두어 나노입자가 자석 부근에 모이도록 하면서 상층액을 제거하였다. 여기에 0.05% 트윈20이 포함된 PBS를 첨가하여 현탁한 다음 10분간 유지하고 상층액을 제거하는 방법으로 나노입자를 2번 세척하였다. 세척 이후 남아있는 상층액을 깨끗이 제거하고 증류수 100㎕를 첨가한 다음 100℃에서 15분간 열처리하여 DNA가 추출되도록 하였다. 이후 13,000rpm으로 5분간 원심분리하여 상층액을 수득하였다.
4-3.
프라이머
제작
요네균 공통 유전자인 IS900과 MOSS900에 대한 정방향 및 역방향 프라이머를 표 1과 같이 제작하였다.
| 구분 | Forward primer (정방향) | 구분 | Reverse primer (역방향) |
| IS900 F | 5'-CCG CTA GAG AGA TGC GA-3' | IS900 R | 5'-AAT CAA CTC CAG CGC GG-3' |
| MOSS900 F | 5'-GTT CGG GGC CGT CGC TTA GG-3' | MOSS900 R | 5'-GAG GTC GAT CGC CCA CGT GA-3' |
4-4. 중합효소 연쇄반응
상기 4-2에서 마지막으로 수득한 상층액을 주형으로 하고, 상기 4-3의 프라이머를 사용하여 중합효소 연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR)을 실시하였다. PCR은 AccuPower HotStart PCR Premix (Bioneer사, Korea)를 이용하여 수행하였다.
IS900의 PCR은 94℃에서 5분간 변성과정을 거치고 94℃에서 30초, 62℃에서 30초, 72℃에서 30초씩 35사이클, 72℃에서 10분의 조건으로 수행하였다. MOSS900의 PCR은 94℃에서 15분간 변성 후, 94℃에서 1분, 62℃에서 1분, 72℃에서 1분을 30사이클, 72℃에서 7분의 조건으로 수행하였다.
각 PCR의 결과는 도 1 내지 3과 같다.
비교예
1.
기존의 열처리법에 따라, 상기 실시예 4-1의 시료를 100℃에서 15분간 열처리하여 DNA가 추출되도록 하고, 13,000rpm에 5분 동안 원심 분리하여 상층액을 수득한 다음 상기 실시예 4-4와 동일한 방법으로 PCR을 수행하였다.
이의 결과는 도 3과 같다.
<110> REPUBLIC OF KOREA (Management : Ministry for Food, Agriculture, Forestry and Fisheries.Animal, Plant and Fisheries Quarantine and Inspection Agency (QIA) )
<120> Immunomagnetic capture method to rapid detect Mycobacterium avium
subsp. paratuberculosis in fecal sample
<130> PA120518-C01
<160> 4
<170> KopatentIn 2.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Forward primer for IS900
<400> 1
ccgctaattg agagatgcga 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Reverse primer for IS900
<400> 2
aatcaactcc agcagcgcgg 20
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Forward primer for MOSS900
<400> 3
gttcggggcc gtcgcttagg 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Reverse primer for MOSS900
<400> 4
gaggtcgatc gcccacgtga 20
Claims (3)
- 도데실황산나트륨이 포함된 pH 7 내지 8의 완충액에 생물학적 시료를 현탁하고 원심분리하여 침전물을 수득하는 단계;
상기 침전물을 pH 7 내지 8의 완충액에 현탁한 다음, 직경이 30 내지 500㎚이고 표면이 아민(NH2) 작용기로 코팅되며 마이코박테리움 아비움 아종 파라튜버큘로시스(Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis)에 대한 항체 면역글로불린 Y가 상기 아민 작용기에 공유결합된 자성 나노입자를 첨가하고 혼합하여 항체반응 혼합물을 준비하는 단계;
상기 항체반응 혼합물로부터 자력을 이용하여 자성 나노입자 결합물을 수득하는 단계;
상기 자성 나노입자 결합물에 물 또는 완충액을 첨가하고 95 내지 100℃로 가열한 다음 원심분리하여 상층액을 수득하는 단계;
상기 상층액을 시료로 하여, 서열번호 1로 표시되는 염기서열을 포함하는 프라이머 및 서열번호 2로 표시되는 염기서열을 포함하는 프라이머로 이루어지는 제1프라이머 세트 또는 서열번호 3으로 표시되는 염기서열을 포함하는 프라이머 및 서열번호 4로 표시되는 염기서열을 포함하는 프라이머로 이루어지는 제2프라이머 세트로 중합효소연쇄반응을 수행하는 단계; 및
상기 중합효소연쇄반응에 의해 증폭된 DNA를 분석하는 단계;를 포함하는 요네균 검출 방법. - 제 1항에 있어서,
상기 항체반응 혼합물을 준비하는 단계는
상기 자성 나노입자를 상기 항체반응 혼합물의 항체 농도가 0.1 ~ 2㎍/㎖이 되도록 첨가하는 것을 특징으로 하는 요네균 검출 방법. - 직경이 30 내지 500㎚이고 표면이 아민(NH2) 작용기로 코팅되며 마이코박테리움 아비움 아종 파라튜버큘로시스(Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis)에 대한 항체 면역글로불린 Y가 상기 아민 작용기에 공유결합되는 자성 나노입자; 및
서열번호 1로 표시되는 염기서열을 포함하는 프라이머 및 서열번호 2로 표시되는 염기서열을 포함하는 프라이머로 이루어지는 제1프라이머 세트 또는 서열번호 3으로 표시되는 염기서열을 포함하는 프라이머 및 서열번호 4로 표시되는 염기서열을 포함하는 프라이머로 이루어지는 제2프라이머 세트;를 포함하는 요네균 검출용 키트.
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|---|---|---|---|
| KR1020120068128A KR101462986B1 (ko) | 2012-06-25 | 2012-06-25 | 분변 중 요네균 신속분리를 위한 자석 나노입자를 이용한 검출방법 |
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| KR (1) | KR101462986B1 (ko) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2020116955A1 (ko) * | 2018-12-05 | 2020-06-11 | 가톨릭대학교 산학협력단 | 대변 또는 직장 면봉 검체에서 직접 카바페넴아제 생성 유전자의 분석적 진단을 위한 핵산 추출 방법 |
| RU2765829C1 (ru) * | 2021-04-27 | 2022-02-03 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования «Казанская государственная академия ветеринарной медицины имени Н.Э. Баумана» (RU) | Набор высокоспецифичных олигонуклеотидных праймеров и зондов для детекции и дифференциации нетуберкулезных микобактерий |
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| DK1815028T3 (da) | 2004-11-03 | 2012-01-30 | Iris Molecular Diagnostics Inc | Mikrobobler til affinitetsseparation |
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-
2012
- 2012-06-25 KR KR1020120068128A patent/KR101462986B1/ko active IP Right Grant
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