KR20130128571A

KR20130128571A - 광역학 진단 또는 치료에 유용하게 사용하기 위한 친수성 광감작제와 생체 적합성 고분자의 복합체 및 이의 제조방법

Info

Publication number: KR20130128571A
Application number: KR1020120052379A
Authority: KR
Inventors: 나건; 백송이
Original assignee: 가톨릭대학교 산학협력단; (주)파낙스이엠
Priority date: 2012-05-17
Filing date: 2012-05-17
Publication date: 2013-11-27
Also published as: KR101375349B1; WO2013172686A1

Abstract

본 발명은 광역학 진단 또는 치료에 유용하게 사용하기 위한 친수성 광감작제와 생체 적합성 고분자의 복합체 및 이의 제조방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 생체 적합성 고분자와 친수성 광감작제가 이온 결합으로 결합되되, 상기 친수성 광감작제의 둘레를 상기 생체 적합성 고분자가 둘러싸도록 구성된 광역학 진단 또는 치료용 복합체 및 이의 제조방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 복합체는 수계에서 이온화되어 전하를 갖는 생체 적합성 고분자를 이용해 친수성 광감작제의 전하(고분자가 지니고 있는 전하와 상반되는 전하)와 결합시킴으로써 표면에 가지고 있는 전하로 인하여 암세포로의 내재화가 어려웠던 친수성 광감작제의 축적성을 우수하게 하여, 근적외선 조사시 암세포를 사멸하는 효과가 더욱 증가할 뿐만 아니라 혈액순환 과정에서 복합체가 안정적으로 유지됨으로써 정상 세포에 세포 독성을 나타내지 않아 체내 안정성에도 우수한 효과가 있으므로 광역학을 이용한 질병의 진단 또는 치료에 유용하게 사용할 수 있다.

Description

광역학 진단 또는 치료에 유용하게 사용하기 위한 친수성 광감작제와 생체 적합성 고분자의 복합체 및 이의 제조방법{Complex of hydrophilic photosensitizer and biocompatible polymer for useful photodynamic diagnosis or therapy and process of preparation thereof}

본 발명은 광역학 진단 또는 치료를 위한 친수성 광감작제와 생체 적합성 고분자의 복합체 및 이의 제조방법에 관한 것으로서, 보다 구체적으로는 강한 친수성 성질로 인해 암세포 안으로의 내재화가 어려운 친수성 광감작에 생체 적합성 고분자를 도입함으로서 암세포에 대한 내재화율을 높여주는 복합체 및 이의 제조방법에 관한 것이다.

현재까지 암 치료에 주로 사용되는 치료법은 크게 세 가지로 수술적 절제, 방사선조사, 그리고 화학요법이 실행되어 왔다. 그러나 최근 항암치료의 보조요법으로 광역학 치료법(Photo dynamic therapy: PDT)이 주목을 받고 있다. 광역학 치료법(PDT)은 최소 침습적 방식을 이용하여 암 세포를 선택적으로 파괴하는 치료법으로, 체내의 산소와 빛에 민감한 반응을 보이는 물질인 광민감성 물질(photo-sensitizer)이 빛에 의하여 화학적인 반응을 일으키며 단일항산소(singlet oxygen) 또는 자유 라디칼(free radical)을 발생시켜 암 세포의 괴사를 유도한다. 이러한 광역학 치료법은 치료 중 출혈이 생기지 않고, 통증이 없어 마취를 필요로 하지 않으며, 수술이나 방사선 혹은 항암 화학요법에 비해 정상조직에 대한 손상이 적다는 장점을 가질 뿐만 아니라 방사선 치료나 수술과 달리 같은 부위에 수차례 반복적으로도 치료가 가능하다.

현재 광역학 치료에 사용되고, 일반적으로 가장 많이 알려져 있는 광민감성 물질은 포르피린(porphyrin)계 화합물들로, 포르피린계 화합물은 암세포에 선택적으로 축적될 뿐만 아니라 화합물의 특징상 형광이나 인광을 나타내므로 종양의 조기진단으로도 활용될 수 있다는 특성을 가진다. 또한, 포르피린 내부에 금속이 결합되어 있는 메탈로포르피린(metalloporphyrin)의 경우에는 결합된 금속의 종류에 따라 여러 가지 특성을 나타낼 수 있어서 MRI(magnetic resonance imaging) 조영제(contrasting agent)를 이용한 종양세포의 조기 진단에 응용되어지기도 한다.

그러나 광역학 치료는 빛이 투과할 수 있는 범위가 제한되어 있으므로 치료 범위에 한계가 있고, 치료를 위해 투여된 광감제의 인체 내 대사 속도가 느려 광독성(phototoxicity)의 부작용을 나타낸다는 문제점이 있다. 뿐만 아니라 종양내 광감작제의 축적정도가 낮아 효율적인 치료 효과를 보기 어려우며, 장기간의 체내 잔류로 인하여 각종 체내 부작용을 유발하기도 한다. 또한, 광역학 치료용으로 사용되고 있는 광민감성 물질들은 친수성화 된 제품이 대부분으로 소수성의 피부 침투가 어렵기 때문에 장기간에 걸쳐 여러 차례 치료해야 한다는 문제점이 있다.

따라서 친수성 광민감성 물질의 종양 축적률은 높이고, 부작용은 감소시킴으로써 광역학 치료 효과를 더욱 증대시킬 수 있는 복합체의 개발이 요구되고 있다.

상기 광역학 치료용 복합체에 대한 종래 기술로는 대한민국 특허등록 제1116570호에 광감각제-금속나노입자 복합물 및 이를 함유하는 광역학 치료 또는 진단을 위한 조성물이 개시되어 있으며, 대한민국 특허등록 제1035269호에 고분자 유도체와 소수성 광감작제를 아마이드 본드(amide bond)를 이용해 결합하여 자기조립형 자기응집된 형태의 나노입자로 제조하는 방법이 개시되어 있다.

그러나, 이러한 나노입자는 소수성 광감작제에 관한 것으로, 친수성 광감작제의 경우에는 종양 축적률을 높이는 방법에 대한 연구가 많이 이루어지지 않은 실정이다.

따라서 본 발명의 목적은 친수성 광감작제의 종양세포로의 축적을 높임과 동시에 암세포에 내재화 되었을 때 적절한 파장의 빛을 매개로 하여 특이적으로 세포독성을 나타내는 효과가 있는 광역학 진단 또는 치료용 복합체를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 본 발명에 따른 광역학 진단 또는 치료용 복합체의 제조방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 수계에서 이온화가능한 생체 적합성 고분자와 친수성 광감작제가 이온 결합(ionic interaction)으로 연결되어 있는 광역학 진단 또는 치료용 복합체를 제공한다.

또한, 본 발명은,

생체 적합성 고분자를 수용성 용매에 용해시키는 단계(제1단계);

친수성 광감작제를 수용성 용매에 용해시키는 단계(제2단계); 및

상기 생체 적합성 고분자가 용해된 용액에 친수성 광감작제 용액을 첨가하여 고분자와 광감작제를 이온 결합을 통해 복합체화 시키는 단계(제3단계)를 포함하는 광역학 진단 또는 치료용 복합체를 제조하는 방법을 제공한다.

본 발명에 따른 복합체는 수계에서 이온화되어 전하를 갖는 생체 적합성 고분자를 이용해 친수성 광감작제의 전하(고분자가 지니고 있는 전하와 상반되는 전하)와 결합시킴으로써 표면에 가지고 있는 전하로 인하여 암세포로의 내재화가 어려웠던 친수성 광감작제의 축적성을 우수하게 하여, 근적외선 조사시 암세포를 사멸하는 효과가 더욱 증가할 뿐만 아니라 혈액순환 과정에서 복합체가 안정적으로 유지됨으로써 정상 세포에 세포 독성을 나타내지 않아 체내 안정성에도 우수한 효과가 있으므로 광역학을 이용한 질병의 진단 또는 치료에 유용하게 사용할 수 있다.

도 1은 본 발명의 일실시예에 따른 광역학 진단 또는 치료에 유용하게 사용하기 위한 PEI/ClAlPcS₄ 복합체를 나타내는 주사 전자현미경 사진이다.
도 2는 본 발명의 일실시예에 따른 PEI/ClAlPcS₄ 복합체와 복합체를 형성하지 않은 광감작제(ClAlPcS₄)의 형광세기를 비교한 그래프이다.
도 3은 본 발명의 일실시예에 따른 PEI/ClAlPcS₄ 복합체의 레이저 조사에 따른 단일항산소 생성능을 나타낸 그래프이다.
도 4는 본 발명의 일실시예에 따른 PEI/ClAlPcS₄ 복합체의 염에 대한 안정성을 나타내는 그래프이다. (● = Free ClAlPcS₄, ▽ = PEI 0.06/ClAlPcS₄ complex)
도 5a는 복합체를 형성하지 않은 광감작제(ClAlPcS₄)의 암세포에 대한 세포 독성을 나타낸 그래프이다.
도 5b는 본 발명의 일실시예에 따른 PEI/ClAlPcS₄ 복합체의 암세포에 대한 세포 독성을 나타낸 그래프이다.
도 6은 본 발명의 일실시예에 따른 PEI/ClAlPcS₄ 복합체의 암세포에 내재화시 광감각제의 축적정도를 나타내는 형광이미지이다.
도 7은 본 발명의 일실시예에 따른 PEI/ClAlPcS₄ 복합체의 암세포에 내재화시 광감각제의 축적정도를 나타내는 공초점현미경 사진이다.

이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.

본 발명은 암조직 또는 암세포로의 내재화 효율을 증가시켜 축적률을 높이고, 암조직 또는 암세포 이외의 환경에서는 형광간섭으로 인하여 광감작제가 갖는 광독성을 월등히 감소시킬 수 있는 새로운 광감작제 복합체에 관한 것으로, 생체 적합성 고분자의 전하와 친수성 광감작제의 전하가 이온결합(ionic interaction)을 통해 결합되어 구성된 광역학 진단 또는 치료용 복합체를 제공함에 그 특징이 있다.

일반적으로 광역학 치료에 사용되는 광감작제를 고분자 물질에 결합시키는 경우, 대부분 아미노기와 카르복실기가 결합하여 형성되는 아마이드 본드(amide bond)나 하이드록실기와 카르복실기가 결합하여 형성되는 에스터 본드(ester bond)를 이용하여 결합시킨다. 그러나 본 발명에서는 생체적합성 고분자의 전하와 친수성 광감작제의 전하간에 생성되는 정전기적 인력(electrostatic interaction)을 통해 이온 결합으로 복합체를 생성한다는 특징이 있다.

따라서, 본 발명에 따른 상기 광역학 진단 또는 치료용 복합체는 수계에서 이온화 형태의 생체 적합성 고분자와 친수성 광감작제의 균형적인 혼합에 의해 수계에서 안정하게 나노 크기의 복합체를 형성할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 생체 적합성 고분자는 수계에서 이온화되어 전하를 갖는 고분자를 사용할 수 있으며, 바람직하게는 폴리에틸렌이민(polyethylenimine, PEI)을 사용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명에 있어서, 상기 광감작제는 포피린류(phophyrins), 클로린류(chlorins), 박테리오클로린류(bacteriochlorins),포피센류(porphycenes) 및 프탈로사이아닌류(phthalocyanine)로 이루어진 군 중에서 친수성을 갖고 수계에서 전하를 갖는 것으로 선택될 수 있다. 또한, 상기 광감작제는 근적외선에서 형광을 띄며, 친수성이고, 술폰산기를 갖는 것일 수 있다. 이러한 광감작제의 예로는 알루미늄 프탈로시아닌 염화 테트라 술폰산(Al(Ⅲ) phthalocyanine chloride tetrasulfonic aicd, ClAlPcS₄)이 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명에 있어서, 상기 복합체는 혈액순환시 정상조직에 대해서는 세포독성을 나타내지 않고, 암조직 또는 암세포에 내재화되어 축적 및 분해되었을 때 근적외선 파장의 빛을 조사하면 단일항산소 또는 자유 라디칼을 생성하여 세포독성을 나타냄으로써 광역학 치료에 사용될 수 있다. 또한, 상기 복합체는 암조직 또는 암세포에 내재화되어 축적되면 프로톤 스폰지 효과(proton sponge effect)에 의해 광감작제와 고분자 사이에 생성되어있던 이온 결합이 풀어지며 형광 간섭이 사라지게 되어 형광을 나타냄으로써 광역학 진단에 사용될 수 있다.

또한, 본 발명은,

이하에서는 본 발명에 따른 광역학 진단 또는 치료용 복합체의 제조방법을 단계별로 보다 상세히 기술한다.

제1단계: 생체 적합성 고분자를 수용성 용매에 용해시키는 단계

본 발명의 광역학 진단 또는 치료용 복합체의 제조를 위해 먼저 생체 적합성 고분자를 수용성 용매에 용해시킨다.

상기 고분자는 생체 적합성의 특성을 가져야하며, 생체 내에서 안정성이 우수해야 한다.

본 발명에서 사용할 수 있는 상기 고분자로는 생체 내에서 생체적합성을 갖고, 사용하려는 친수성 광감작제의 전하와 상반된 전하를 나타내는 고분자 또는 고분자 유도체라면 모두 사용 가능하다.

본 발명의 일실시예에서는 하기 구조식의 폴리에틸렌이민을 사용하였는데, 이것은 유전자 전달체로 많이 이용되며 많은 아민그룹(amine group)을 가지므로 수용성 용매에 매우 잘 녹는 특성을 지니기 때문이다. 상기 폴리에틸렌이민은 당업계에 통상적으로 알려진 제조방법을 이용하여 제조하거나, 시판되는 것을 이용할 수 있다.

상기 고분자가 용매 상에서 충분히 용해될 수 있도록 적당량의 용매를 사용하는 것이 바람직하며, 이때 용매의 사용량이 너무 적을 경우, 고분자의 점성으로 인해 서로 엉겨붙는 현상이 일어날 수 있다.

본 발명에서 사용할 수 있는 상기 수용성 용매로는 포스페이트 버퍼(phosphate buffered saline: PBS) 및 증류수 일 수 있으며, 바람직하게는 포스페이트 버퍼일 수 있다.

제2단계: 친수성 광감작제를 수용성 용매에 용해시키는 단계

제1단계에서 생체 적합성 고분자를 수용성 용매에 용해시키는 과정이 완료되면, 친수성 광감작제를 제1단계에서 고분자를 용해시키는데 사용했던 것과 같은 용매를 사용해 용해시킨다.

본 발명에서 상기 광감작제는 근적외선 영역대 파장에서 형광을 띄며, 친수성이고, 수계에서 전하를 갖는 것을 사용할 수 있으며, 그 종류로는 포피린류(phophyrins), 클로린류(chlorins), 박테리오클로린류(bacteriochlorins), 포피센류(porphycenes) 및 프탈로사이아닌류(phthalocyanine)로 이루어진 군 중에서 선택될 수 있다. 상기 광감작제로서 바람직하게는 알루미늄 프탈로사이아닌 염화 테트라 술폰산(ClAlPcS₄)을 사용할 수 있다. 상기 ClAlPcS₄는 벤젠링에 결합되어 있는 4개의 술폰산에 의해 전하를 띄고, 수용성 용매에 대한 용해도가 매우 우수하며 근적외선 영역대 파장을 흡수하여 형광을 나타내므로 광감작제로서 바람직하게 사용될 수 있다.

제3단계: 생체 적합성 고분자와 친수성 광감작제를 이온결합을 통해 결합시키는 단계

제1단계와 2단계를 통해 생체 적합성 고분자와 친수성 광감작제가 수용성 용매에 완전히 용해되면, 생체 적합성 고분자가 용해된 용액에 광감작제가 용해된 용액을 첨가해 준다. 이렇게 두 물질을 섞어 준 다음 빛을 차단한 상태로 상온에서 약 24시간 정도 두어 두 물질이 이온결합을 통해 복합체를 형성하도록 한다.

상기 기술된 방법에 의해 제조된 복합체는 수계에서 형성되어 평균 100~200nm 정도의 나노 크기 복합체를 형성할 수 있으며, 고분자의 농도가 높아질수록 광감작제의 전하를 효과적으로 제거하며 감싸게 되므로(shielding) 상대적으로 소수성 성질이 증가하며 광감작제들 간의 거리가 가까워져 응집력이 높아지므로 복합체의 크기가 감소한다(표 1 참조).

이렇게 제조된 복합체는 광역학 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

종래 친수성 광감작제의 경우, 소수성 광감작제의 용해도를 높이기 위해 모핵에 다양한 수용성 관능기를 결합시켜 제조되며, 이러한 수용성 관능기의 도입으로 인해 소수성 성질이 약해 암세포로의 내재화가 어려웠을 뿐만 아니라, 음전하를 가질 경우 세포막의 전하와 일치하여 정전기적 반발(charge repulsion)에 의해 암세포내 축적률이 매우 낮게 나타났다. 또한 형광간섭을 일으키지 못하기 때문에 빛을 조사하게 되면 체내에서 정상세포에도 세포독성을 나타내어 여러 가지 부작용을 초래하는 문제점이 있었다.

그러나, 본 발명에 따른 복합체는 수계에서 이온화되어 전하를 갖는 생체 적합성 고분자를 이용해 친수성 광감작제의 전하(고분자가 지니고 있는 전하와 상반되는 전하)와 결합시킴으로써 표면에 가지고 있는 전하로 인하여 암세포로의 내재화가 어려웠던 친수성 광감작제의 축적성이 우수한 특징이 있다. 특히, 본 발명에 따른 복합체는 정상 세포에는 세포 독성을 나타내지 않고, 선택적으로 암 세포에만 내재화되어 광감작제를 축적시키는 특징이 있다.

구체적으로, 본 발명의 일실시예에 따르면, 복합체를 형성하지 않은 친수성 광감작제는 단일항산소의 생성이 잘 일어나는 반면, 본 발명에서 제조한 복합체는 형광간섭에 의해 단일항산소의 생성이 억제되는 것을 확인하였다(도 3). 이는 복합체가 유지되고 있을 때는 효과적으로 단일항산소의 생성을 억제하여 정상세포에 독성을 나타내지 않게 되지만, 암조직이나 암세포에 내재화되어 복합체가 분해되면 단일항산소의 생성율이 원래되로 회복됨을 나타낸다.

또한, 세포 독성 실험에서 정상세포에는 근적외선 파장의 빛을 조사한 결과 복합체는 형광을 거의 나타내지 않는 것을 확인하였다(도 2). 반면, 암세포로 축적된 경우에는 세포독성을 나타내어 암세포의 세포사멸이 증가하는 것으로 나타났다(도 5).

나아가, 수계 상에서 만들어진 광역학 진단 또는 치료용 복합체가 체내에서 안정적으로 유지될 수 있는지 확인하기 위하여 염(salt)에 대한 안정성 실험(salt stability test)을 진행한 결과, 체내 염 농도와 비슷한 150mM 에서도 복합체가 거의 분해되지 않고 유지되는 것을 확인하였다(도 4).

이러한 결과를 통해 본 발명의 복합체는 암세포로 내재화 되어 축적되지 못할 경우, 빛을 조사하여도 반응성이 나타나지 않으므로 세포독성을 나타내지 않기 때문에 체내에서 안정하며, 암세포로 축적되어 복합체가 분해되는 경우에만 세포독성을 나타내어 치료 효과를 나타낸다는 사실을 알 수 있다.

본 발명에서 상기 '치료'란, 달리 언급되지 않는 한, 질환의 증상을 역전시키거나, 완화시키거나, 그 진행을 억제하거나, 또는 예방하는 것을 의미한다

본 발명에 따른 광역학 진단 또는 치료용 복합체의 치료적으로 유효한 양은 질환증상의 정도, 환자의 연령, 체중, 건강상태, 성별, 투여 경로 및 치료기간 등에 따라 적절히 변화될 수 있다.

또한 본 발명에 따른 광역학 치료용 복합체는 경구, 경피, 피하, 정맥 또는 근육을 포함한 여러 경로 등을 통해 투여될 수 있으며, 활성 성분의 투여량은 투여 경로, 환자의 연령, 성별, 체중 및 환자의 중증도 등의 여러 인자에 따라 적절히 선택될 수 있다.

또한, 본 발명의 복합체는 광역학 진단에 유용하게 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 복합체는 암조직이나 암세포에 내재화될 경우, 엔도좀(endosome)에서 나타나는 프로톤 스폰지 효과에 의해 형광간섭이 풀리고, 레이저 조사에 의해 암세포에서만 광감작제가 형광발색을 나타낼 수 있기 때문에 이러한 형광 유무를 통해 암을 진단할 수 있다.

뿐만 아니라, 본 발명에 따른 복합체를 이용하여 질병을 치료 또는 진단할 경우 사용할 수 있는 광원으로는 비제한적으로, 초음파 조사 방출기, 광방출 다이오드, 레이저 다이오드, 염료 레이저, 할로겐화 금속 램프, 플래쉬 램프, 기계적으로 필터링된 형광 광원, 기계적으로 필터링된 백열 및 필라멘트 광원으로 이루어진 군 중에서 선택된 생체 외 광조사를 위한 광원 및 광역학 치료용 레이저 파이버 등의 생체내 광조사를 위한 광원으로 이루어진 군 중에서 선택된 한 가지 이상의 것을 사용할 수 있으며, 본 발명에서 상기 광감작제는 600nm 내지 700nm 범위의 근적외선 광선에서 활성을 나타낼 수 있다.

이하 본 발명을 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

< 실시예 1-3> 광역학 진단 또는 치료용 복합체의 제조

생체적합성 고분자 물질인 폴리에틸렌이민을 포스페이트 버퍼에 1 mg/ml 농도가 되도록 용해시키고, 0.04, 0.06, 0.08 mg/ml 농도가 되도록 포스페이트 버퍼를 이용해 희석하였다. 다음으로, 친수성 광감작제로서 알루미늄 프탈로사이아닌 염화 테트라 술폰산(ClAlPcS₄)을 포스페이트 버퍼를 이용해 1 mg/ml 농도가 되도록 용해시키고, 최종 농도가 0.1 mg/ml이 되도록 희석하였다. 이후, 폴리에틸렌이민이 0.04, 0.06, 0.08 mg/ml 농도로 녹아있는 용액에 0.1 mg/ml 농도인 광감작제 용액을 각각 넣어 혼합시켰다. 그런 뒤, 파이펫을 이용해 여러 번 섞어주고 빛이 닿지 않는 곳에 24시간 동안 보관하였다. 상기와 같은 방법을 통해 만들어진 생체적합성 고분자와 친수성 광감작제 복합체의 형성 유무를 형광세기의 감소를 통해 확인하였다.

<분석>

(1) 복합체의 크기 및 형태 측정

상기 실시예 1-3에서 생체적합성 고분자의 농도별로 제조한 나노크기의 복합체 샘플 3개를 각각 광감작제의 농도가 5μg/ml 농도가 되도록 희석한 후, 동적 광산란 장치를 사용하여 각각의 크기를 측정하였고, 주사 전자현미경을 이용하여 형태를 확인하였다. 이때, 광감작제의 농도를 5μg/ml로 조정한 것은 광감작제가 용액 속에 녹아있을 때 색을 띄는데, 동적 광산란 장치로 크기 측정시 광감작제가 갖는 색에 의해 크기측정에 오차가 심해질 수 있기 때문이다. 두 장치를 이용해 얻은 결과를 표 1 및 도 1에 나타내었다.

형성된 복합체 입자 크기 측정 결과

실시예	폴리에틸렌이민(mg/ml)	ClAlPcS₄(mg/ml)	형성된 복합체 입자 크기(nm)
1	0.04	0.1	329.7 ± 16.7 (PdI:0.525)
2	0.06	0.1	177.9 ± 4.9 (PdI:0.325)
3	0.08	0.1	147.8 ± 7.9 (PdI:0.288)

측정 결과, 표 1에 나타낸 바와 같이, 형성된 복합체는 생체적합성 고분자의 농도가 0.04 mg/ml인 복합체의 경우 약 300 nm 정도의 크기를 나타내는 반면, 고분자 농도가 0.06, 0.08 mg/ml인 복합체의 경우에는 200 nm 이하의 크기를 갖는 것으로 나타났다. 또한 복합체의 형태는 도 1에 나타낸 바와 같이 구형 혹은 타원형의 형태를 나타났다. 이러한 측정 결과로부터, 고분자의 농도가 높아질수록 광감작제의 전하를 더 효과적으로 제거하고, 또한 광감작제들을 고분자가 완벽하게 감싸게 됨으로써 복합체 중앙에 위치하게 될 광감작제들간의 응집력이 강해져 복합체의 크기가 감소함을 알 수 있다.

(2) 형광간섭의 유무 확인

상기 실시예 1-3에서 만든 복합체와 복합체를 형성하지 않은 광감작제를 포스페이트 버퍼를 이용해 광감작제의 농도가 5 μg/ml이 되도록 희석하고, 형광 스펙트로포토미터(Spectrofluorephotometer)기기를 670 nm의 파장으로 고정시킨 뒤, 550~800 nm의 파장 범위에서 형광 측정을 수행하였다.

측적 결과를 도 2에 나타내었다.

도 2에 나타낸 바와 같이 복합체를 형성하지 않은 광감작제의 경우에는 수계에서 아주 강한 형광광도를 나타내는 반면, 본 발명에 따른 복합체는 형광간섭을 일으켜 근적외선 파장대에서 형광이 나타나지 않는 것으로 나타났다. 이러한 결과를 통해, 본 발명에 따른 복합체는 일반적으로 수계에서 암세포에 축적되지 않은 경우 세포독성을 띄지 않으므로 체내에서 안정함을 알 수 있다.

< 실험예 1> 단일항산소 생성능 평가

본 발명의 광역학 진단 또는 치료용 복합체가 암조직이나 암세포내 축적되지 않고 체내에 머무르고 있을 때, 레이저 조사에 의해 단일항산소를 생성해 정상조직이나 세포에 독성을 나타내는지 알아보기 위하여 수계에서 레이저 조사에 따른 복합체의 단일항산소 생성능을 측정하였다.

구체적으로, 상기 실시예 1-3에서 제조된 생체적합성 고분자/광감작제 복합체와 복합체를 형성하지 않은 광감작제를 포스페이트 버퍼를 사용하여 광감작제 농도가 5μg/ml이 되도록 희석하고, 단일항산소를 검출할 수 있는 싱글렛 옥시즌 센서그린(singlet oxygen sensor green, SOSG) 시약을 포스페이트 버퍼를 이용해 2μM 농도가 되도록 만들어 준 뒤, 준비해 놓은 샘플과 1:1 부피비로 혼합하였다. 이후 본 발명에 사용된 광감작제(ClAlPcS₄)가 단일항산소를 생성할 수 있는 것으로 알려진 670nm 파장의 레이저를 사용하여 40초 간격으로 레이저를 조사한 후, 형광 스펙트로포토미터(Spectrofluorephotometer)를 이용하여 Ex 504nm, Em 525nm에서 형광을 측정하였다.

측정 결과를 도 3에 나타내었다.

도 3에 나타낸 바와 같이, 복합체를 형성하지 않은 광감작제의 경우에는 수계에서 아주 강한 형광광도를 나타내는 반면, 본 발명에 따른 복합체는 형광광도가 낮으므로 단일항산소를 거의 생성하지 않는 것으로 나타났다. 이러한 결과를 통해, 본 발명에 따른 복합체는 일반적으로 수계에서 암세포에 축적되지 않은 경우 레이저 조사에 의한 단일항산소를 거의 생성하지 않아 정상조직이나 세포에 세포독성을 띄지 않으므로 체내에서 안정함을 알 수 있다.

< 실험예 2> 염에 대한 안정성 평가

본 발명에 따른 복합체에 대해 생체 내에서 안정하게 유지될 수 있는지를 평가하기 위하여 염화나트륨(NaCl)을 이용해 염에 대한 안정성 평가를 실시하였다.

구체적으로 염화나트륨을 증류수를 이용해 75, 150, 300, 600, 1200 mM 농도로 용해시킨 뒤, 복합체 용액에 1:1 부피 비율로 첨가하였다. 이때 복합체 속에 포함되어 있는 광감작제의 최종 농도는 5μg/ml이 되도록 했다. 12시간 후, 이미지스테이션(Image station)을 이용하여 형광광도 값을 측정하고, 그 결과를 도 4에 나타내었다.

도 4에 나타낸 바와 같이 복합체를 형성하지 않은 광감작제의 형광세기는 염의 농도에 관계없이 지속적으로 높게 유지되는 반면, 복합체를 형성했을 경우엔 염 농도가 높아질수록 점점 복합체가 분해되며 형광세기를 회복하는 것을 확인하였다. 이때, 체내의 염 농도가 약 150mM 정도 된다는 것을 감안하였을 때, 본 발명에 따른 복합체는 체내에서도 안정적으로 유지될 수 있음을 알 수 있다.

< 실험예 3> 본 발명에 따른 복합체의 암세포에 대한 세포 독성 평가

본 발명에 따른 복합체에 대해 세포독성 시험을 수행하였다. 세포 독성 시험을 위해 사용한 세포주는 자궁 경부암 세포주인 HeLa 세포이고, 10% FBS와 1%의 페니실린이 포함되어 있는 RPMI1640 배양액에서 5% CO₂ 및 37℃의 온도조건에서 배양하였다. 세포 독성 실험은 배양된 HeLa 세포를 96 웰 플레이트에 5×10⁴ 세포수로 분주하여 24시간 동안 배양시킨 후, 다음날 본 발명에 따른 복합체를 농도별로 희석하여 100μl씩 각 웰에 첨가하였다. 이후, 복합체가 세포에 작용할 수 있도록 6시간 동안 배양기에서 배양시켜 준 다음, 근적외선 파장대의 빛(670nm)을 23J/cm²의 양으로 조사하였다. 그 후, 다시 배양기에서 약 24시간 동안 배양시켰다. 약 24시간이 지나면 세포에 MTT (3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide) 시약을 희석하여 100μl씩 첨가하고 3 혹은 4시간 동안 다시 배양시켰다. 이후 MTT 시약을 모두 제거한 뒤 DMSO(dimethyl sulfoxide)를 첨가하여 생성된 포르마잔(formazan)을 녹여 투명한 96 웰에 옮긴 뒤 ELISA 분석기를 이용해 세포의 생존률을 분석하였다. 이때 파장은 570nm에서 흡광도를 측정하여 세포의 생존률을 분석하고, 그 결과를 도 5에 나타내었다.

도 5에 나타난 바와 같이, 복합체화 시키지 않은 광감작제(ClAlPcS₄)를 세포에 각각 첨가하여 배양한 경우에는 근적외선 파장대의 레이저를 조사한 경우나 조사하지 않은 경우에 관계없이 세포사멸이 일어나지 않은 반면(도 5a), 본 발명에 따른 복합체는 근적외선 파장대의 레이저 조사시 특정 농도 이상에서 세포사멸이 발생하여 세포 생존률이 감소하는 것을 확인하였다(도 5b). 따라서, 본 발명에 따른 복합체는 암세포에 특이적으로 세포독성을 나타냄을 알 수 있다.

< 실험예 4> 본 발명에 따른 복합체의 암세포로 내재화시 프로톤 스폰지 효과에 의한 형광간섭 풀림측정

상기 실험예 3과 같이 5×10⁴의 세포수로 96 웰 플레이트에 HeLa 세포를 분주하여 배양한 후, 상기 세포들에 본 발명의 복합체와 복합체화 시키지 않은 광감작제(ClAlPcS₄)를 시간별로 광감작제 농도 5μg/ml로 맞추어 처리해 주었다. 그리고 KODAK 이미지 스테이션 기기를 이용하여 형광현상을 관찰하고, 그 결과를 도 6에 나타내었다.

도 6에 나타난 바와 같이, 복합체화 시키지 않은 광감작제가 처리된 웰에서는 암세포내로 광감작제가 축적되지 못해 형광을 띄지 못하는 반면, 복합체화 시킨 것은 암세포내로 내재화 된 후 복합체가 풀리며 형광을 띄는 것을 확인할 수 있다.

이러한 결과를 통해, 본 발명에서 제조한 복합체가 복합체화 시키지 않은 광감작제보다 훨씬 내재화 효율이 우수하며, 암세포내로 축적되었을시 프로톤 스폰지 효과에 의해 형광간섭이 풀리고, 이후 근적외선 파장의 빛 조사시 광감작에 의해 암세포를 사멸시키는 과정이 이루어져 암을 치료할 수 있음을 알 수 있다.

< 실험예 5> 본 발명에 따른 복합체의 세포내 내재화 및 위치 확인

본 발명에 따른 생체적합성 고분자와 친수성 광감작제를 이용해 제조한 복합체의 내재화 효율 및 축적되는 위치를 측정하기 위해, 다음과 같은 실험을 수행하였다. 구체적으로, 12 웰 플레이트에 1×10⁵ 세포수로 HeLa 세포를 분주하여 배양한 뒤 광감작제(ClAlPcS₄)의 농도가 5μg/ml이 되도록 하여 처리한 후, 시간에 따른 세포내 위치를 공초점현미경을 통해 관찰하였다. 관찰 결과를 도 7에 나타내었다.

도 7에 나타낸 바와 같이, 본 발명에 따른 나노크기의 복합체는 암세포내로 내재화가 잘 일어나 형광광도가 높게 나타난 것에 비해, 복합체를 형성하지 않은 광감작제는 세포내로 잘 들어가지 못해 형광세기가 거의 나타나지 않는 것으로 나타났다. 따라서, 본 발명에 따른 복합체는 수계에서 이온화되어 전하를 갖는 생체 적합성 고분자를 이용해 친수성 광감작제의 전하(고분자가 지니고 있는 전하와 상반되는 전하)와 결합시킴으로써 표면에 가지고 있는 전하로 인하여 암세포로의 내재화가 어려웠던 친수성 광감작제의 축적성을 우수하게 하여, 근적외선 조사시 암세포를 사멸하는 효과를 더욱 증가시키므로 광역학을 이용한 질병의 치료에 유용하게 사용할 수 있다.

이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에 대한 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

Claims

생체 적합성 고분자와 친수성 광감작제가 이온 결합으로 결합되고, 상기 친수성 광감작제의 둘레를 상기 생체 적합성 고분자가 둘러싸도록 구성된 광역학 진단 또는 치료용 복합체.
제1항에 있어서,
상기 생체 적합성 고분자는 폴리에틸렌이민(polyethylenimine)인 것을 특징으로 하는 광역학 진단 또는 치료용 복합체.
제1항에 있어서,
상기 광감작제는 포피린류(phophyrins), 클로린류(chlorins), 박테리오클로린류(bacteriochlorins), 포피센류(porphycenes) 및 프탈로사이아닌류(phthalocyanine)로 이루어진 군 중에서 선택되는 친수성을 가지며, 수계에서 이온으로 존재하는 것을 특징으로 하는 광역학 진단 또는 치료용 복합체.
제1항에 있어서,
상기 광감작제는 알루미늄 프탈로사이아닌 염화 테트라 술폰산(ClAlPcS₄)인 것을 특징으로 하는 광역학 진단 또는 치료용 복합체.
폴리에틸렌이민 및 알루미늄 프탈로사이아닌 염화 테트라 술폰산(ClAlPcS₄)이 이온 결합으로 결합되고, 상기 알루미늄 프탈로사이아닌 염화 테트라 술폰산의 둘레를 상기 폴리에틸렌이민이 둘러싸도록 구성된 광역학 진단 또는 치료용 복합체.
생체 적합성 고분자를 수용성 용매에 용해시키는 단계(제1단계);
친수성 광감작제를 수용성 용매에 용해시키는 단계(제2단계); 및
제1단계에서 상기 생체 적합성 고분자가 용해된 용액에 제2단계에서 친수성 광감작제 용액을 첨가하여 고분자와 광감작제를 이온 결합을 통해 복합체화 시키는 단계(제3단계)를 포함하는, 제1항의 광역학 진단 또는 치료용 복합체를 제조하는 방법.
제6항에 있어서,
상기 생체 적합성 고분자는 폴리에틸렌이민(polyethylenimine)인 것을 특징으로 하는 방법.
제6항에 있어서,
상기 광감작제는 포피린류(phophyrins), 클로린류(chlorins), 박테리오클로린류(bacteriochlorins), 포피센류(porphycenes) 및 프탈로사이아닌류(phthalocyanine)로 이루어진 군 중에서 선택되는 친수성을 가지며 수계에서 이온으로 존재하는 것을 특징으로 하는 방법.
제6항에 있어서,
상기 광감작제는 알루미늄 프탈로사이아닌 염화 테트라 술폰산(ClAlPcS₄)인 것을 특징으로 하는 방법.
폴리에틸렌이민을 포스페이트 버퍼에 용해시키는 단계(제1단계);
알루미늄 프탈로사이아닌 염화 테트라 술폰산(ClAlPcS₄)을 포스페이트 버퍼에 용해시키는 단계(제2단계); 및
제1단계에서 상기 폴리에틸렌이민이 용해된 용액에 제2단계에서 알루미늄 프탈로사이아닌 염화 테트라 술폰산이 용해된 용액을 첨가하여 폴리에틸렌이민 및 알루미늄 프탈로사이아닌 염화 테트라 술폰산을 이온 결합을 통해 복합체와 시켜 복합체를 제조하는 단계(제3단계)를 포함하는 제5항의 광역학 진단 또는 치료용 복합체를 제조하는 방법.