KR20130113758A - 두 가지 항암물질을 동시에 제공하는 대장균 균주 - Google Patents

두 가지 항암물질을 동시에 제공하는 대장균 균주 Download PDF

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Abstract

본 발명은 안정적 구조의 비독성 디아실리포올리고사카라이드 및 면역촉진(immunostimulatory) 활성을 갖는 올리고데옥시뉴클레오타이드를 포함하는 면역 보조 조성물, 백신 조성물, 항암제 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 조성물에 포함된 두 가지 유효성분은 서로 상승작용을 일으켜, 독성은 낮고 면역원성은 우수한 항암제로 사용이 가능하다. 또한 본 발명에 따르면, 저비용으로 BCG 이상의 약효를 보이는 정제 DNA와 박테리아 LPS 유래의 비독성 고분자 물질을 포함하는 안전한 항암제를 하나의 균주를 이용하여 편리하게 생산 할 수 있다.

Description

두 가지 항암물질을 동시에 제공하는 대장균 균주{E. coli strain for Providing Two Anti-tumor Substances }
본 발명은 두 가지 항암물질을 동시에 제공하는 대장균 균주에 관한 것이다.
1960년대부터 발달하게 된 암의 치료법은 수술, 방사선 조사 그리고 화학요법의 3대 방법이며 미국에서 1973년까지 치솟던 암 사망율의 상승패턴이 완만해진 것은 이러한 치료법의 어느 정도 성공을 이야기하고 있다. 그러나 수술과 방사선 요법은 국소 치료법이므로 국한성 암으로 조기에 차단되어야 그 예후가 좋다는 제한점이 있고 화학적 요법은 암세포 전체를 사멸시켜야 성공적이라 할 수 있다. 이러한 치료법에 의하여 암세포 전체를 사멸시키려면 숙주, 즉 환자의 정상조직, 특히 면역계 조직에 상당한 피해를 동시에 주게 되므로 노약자의 생명을 위험하게 하는 결점이 있다.
이러한 단점을 보완하여 개발된 방법이 면역요법이며, 이는 면역감시기구를 보강함으로써 암 발생에 저항하고자 하는 것이 면역요법의 본질이다. 그동안 다양한 면역요법들이 연구되어 왔으나 그중 현재에는 비특이적 면역요법이 가장 주목을 받고 있으며, 거의 모든 종류의 암 종의 치료에 단독 또는 화학요법제와 병행하여 사용되고 있는 실정이다. 비특이적 면역요법이란 표현대로 암의 종류에 구애받지 않는다는 뜻이며 현재까지 그 본질적 작용 기전에 관하여 여러 가지 학설이 제시되는 등 아직 연구 중에 있으며, 다만 비특이적 방법은 망상내피계 세포 특히 임파구의 활동성을 자극하며 소위 면역감시기구의 보기에 그 작용점이 있다고 생각된다. 실제 임상에 사용되는 주요 물질로서 코리네박테리움(Corynebacterium)이 있으며, 피시바닐(Picibanil, OK-432)은 비교적 오래 전부터 한국에 소개되어 여러 환자에게 이미 사용된 물질이다. 이는 주로 일본에서 연구되어 일본 제약회사들이 판매하기 시작한 물질로서 일본과 한국 또는 동남아의 일부에서 시판되고 있다. 이 계통 물질들의 암에 대한 상용의 역사는 상당히 오래 되었으며, 이미 1968년 독일의 부시(Bush Fehleison) 등은 환자에게 발생한 암이 그 진행이 중지되거나 또는 이미 있던 암이 적어진다는 현상을 발견하였고, 1891년 미국 시카고의 외과의사 콜리(Coley)는 소위 콜리의 혼합 톡신(toxin)이라는 것을 만들어 많은 암환자에게 사용한 경험을 발표하였고 상당한 수의 환자에게 효력을 발휘한 것으로 나타났다. 이는 스트렙토코커스(streptococcus)를 배양한 후 그 배지에서 추출한 물질로 알려져 있다.
포유동물과 박테리아 DNA의 특징적인 차이점 중 하나는 포유동물은 상당한 CpG 억제와 CpG 다이뉴크레오타이드의 시토신에 선택적으로 메틸화되어 있다는 사실이다. 최근에 연구자들은 박테리아 DNA에 존재하는 CpG 모티프가 폴리크로날 B 세포를 빠르게 활성화시켜 IgM 분비를 촉진시키며, 항-IgM 항체에 의해 세포주기가 멈추게 되고 에이팝토시스(apoptosis)가 일어나는 B 세포를 박테리아의 CpG 모티프가 c-myc 발현을 저해하고 myn, bcl2, 그리고 bcl-XL mRNA 발현을 증가시켜 에팝토시스로부터 세포를 보호해 준다고 제안하였다. 또 다른 연구에서는 CpG 모티프가 직접 B 세포를 활성화 시켜 짧은 시간 안에 IL-6와 IL-12 분비를 촉진시킨다고 보고하였다. 미국의 CPG사는 이러한 성질을 이용하여 CpG 서열을 포함한 합성 올리고뉴크레오타이드를 이용한 면역보조제 및 천식 치료제에 대한 임상시험을 진행 중이나, 비용이 매우 비싸다는 단점이 있다. 그러나 최근의 연구 결과 CpG 디뉴크레오타이드의 시토신에 대한 메틸화 유무와 항암효과의 관련성이 없다는 보고가 있으며, 박테리아 DNA의 항암효과는 그 구조적 요인 등에 의한다는 보고가 있다. 또한 DNA의 항암제에서 이러한 비메틸화(unmethylated) CpG에 의한 역할은 필수적이지 않다는 연구가 있었으며, 이를 대신 할 수 있는 방법들이 고안 되고 있다.
지질다당류(lipopolysaccharide, LPS)는 대표적인 흉선 비의존적 항원(Thymus Independent Antigen)으로 B세포에 직접 작용해 비특이적인 면역반응을 유발함으로서 염증 등의 부작용을 일으키는 것으로 알려져 있으나 그 독성을 이용하여 암세포를 죽일 수 있으며 특히 지질 A 부분은 다양한 전사인자(transcription factors)의 유도를 통하여 항암효과를 나타내는 것으로 알려져 있다. 그러나 LPS는 대표적인 내독소로 강한 독성을 가지고 있으며, 더구나 일반 LPS와 DNA의 결합은 패혈증(sepsis)과 같은 심각한 결과를 초래할 수 있다.
본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.
본 발명자들은 안전성이 보장되며 면역촉진(immunostimulatory) 기능이 우수한 면역보조(adjuvant) 조성물을 개발하고자 예의 연구 노력하였다. 그 결과, 인간의 장에서 발굴한 대장균 균주 EG0023(기탁번호: KCCM11218P)로부터 수득하여 탈아실화시킨 (ⅰ) 디아실리포올리고사카라이드 및 (ⅱ) 대장균 EG0023의 염색체 DNA의 분쇄에 의해 생성된 올리고데옥시뉴클레오타이드의 혼합 조성물이 타입 1 T 헬퍼 세포(Th1) 및 자연살해세포(Natural killer cell, NK cell)의 면역 기전에 관련된 다양한 사이토카인의 활성 및 분비를 증가시키고, 항암효능이 우수함을 확인하였다. 또한 본 발명자들은 상기 조성물에서 기존의 리포폴리사카라이드(LPS)에서 문제되었던 독성을 제거하고, 올리고데옥시뉴클레오타이드와 최적 농도로 혼합하여 항암효능을 극대화시킴으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서, 본 발명의 목적은 안전성, 면역촉진(immumostimulatory) 기능 및 항암 효능이 우수한 리포올리고사카라이드 및 올리고데옥시뉴클레오타이드를 동시에 제공할 수 있는 대장균 균주를 제공하는데 목적이 있다.
본 발명의 다른 목적은 면역보조(adjuvant) 조성물을 제공하는데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 백신 조성물을 제공하는데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 항암제 또는 항암 보조제 조성물을 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 분자량 2,000-5,000 Da의 리포올리고사카라이드를 생산하고, 상기 리포올리고사카라이드는 다음 화학식 1로 표시되는 당쇄 사슬을 포함하는 것을 특징으로 하는 대장균(Escherichia coli) 균주를 제공한다:
화학식 1
Figure pat00001
상기 화학식에서, Hex는 헥소오스이고, Hep는 헵토오스, Kdo는 2-케토-3-디옥시-옥토네이트이고, HexNAc는 N-아세틸 헥소사민이며, P는 포스페이트이다.
본 발명자들은 안전성이 보장되며 면역촉진(immunostimulatory) 기능이 우수한 면역보조(adjuvant) 조성물을 개발하고자 예의 연구 노력하였다. 그 결과, 인간의 장에서 발굴한 대장균 균주 EG0023(기탁번호: KCCM11218P)로부터 수득하여 탈아실화시킨 (ⅰ) 디아실리포올리고사카라이드 및 (ⅱ) 대장균 EG0023의 염색체 DNA의 분쇄에 의해 생성된 올리고데옥시뉴클레오타이드의 혼합 조성물이 헬퍼 T 세포 1(Th1) 및 자연살해세포(Natural killer cell, NK cell)의 면역 기전에 관련된 다양한 사이토카인의 활성 및 분비를 증가시킨다는 것을 확인하였다. 또한 본 발명자들은 상기 조성물에서 기존의 리포폴리사카라이드에서 문제되었던 독성을 제거하고, 올리고데옥시뉴클레오타이드와 최적 농도로 혼합하여 항암효능을 극대화시킴으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.
일반 리포폴리사카라이드(LPS)는 다양한 전사인자의 유도를 통하여 항암효능을 나타낼 수 있으나, 강한 독성을 가지고 있고, 합성 올리고뉴클레오타이드와 결합한 경우 패혈증과 같은 심각한 부작용을 초래할 수 있으므로 시급한 개선이 요구되어왔다. 이에 본 발명자들은 인간의 장에서 발굴한 대장균 균주 EG0023로부터 리포올리고사카라이드를 수득하였고, 탈아실화 반응을 통하여 세포독성을 제거하였다. 또한, 동일한 대장균으로부터 생성된 올리고데옥시뉴클레오타이드(ODN)과 최적 농도로 혼합시켜, 면역촉진 반응 및 암세포 사멸능력을 가진 조성물을 개발하였다.
본 발명에서 이용한 대장균 균주 EG0023은 인간의 장에서 발굴한 대장균 균주로서, 건강한 성인 남성의 장에서 얻은 대장균의 단일 콜로니를 배양하여 총 50개의 균주를 1차 선별하였다. 이어, 각 균주에서 수득한 리포폴리사카라이드(LPS)를 과립구대식세포콜로니자극인자(Granulocyte-macrophage colony stimulating factor, GM-CSF)로 분화시킨 인간 림프구 세포주에 처리한 후, TNF-a 분비를 측정하여 가장 낮은 값을 보이는 균주를 2차 선택하였고, 2차 선별된 5개의 균주를 재배양하여 위의 방법으로 TNF-a 값을 확인하여 가장 낮은 수치를 보이는 균주를 선택하였다. 이 균주를 2011년 11월 9일자로 대한민국 서대문구 홍제동 361-221 소재 한국미생물보존센터에 기탁번호 KCCM11218P로 기탁하였다.
상기 본 발명의 대장균 균주 EG0023의 가장 큰 특징은 단일 물질만을 생산할 수 있는 기존의 균주와 달리 저비용, 고효율로서 2 가지의 항암물질(디아실리포올리고사카라이드 및 올리고데옥시뉴클레오타이드)을 동시에 생산할 수 있다는데 있으며, 상기 균주에 의해 생산, 수득한 디아실리포올리고사카라이드 및 올리고데옥시뉴클레오타이드는 구조적으로 안정적이고, 비독성이며, 특이적인 면역반응을 유도할 수 있다.
본 명세서에서 용어 “헥소오스(hexose)”는 한 분자 중 6개의 탄소원자를 함유한 단당류(monosaccharide)를 의미하며, 예컨대 케토헥소오스(프시코스, 프럭토스, 소르보스, 타가토스), 알도헥소오스(알로스, 알트로스, 글루코스, 만노스, 굴로스, 이도스, 갈락토스, 탈로스) 및 데옥시당(푸코스, 푸쿨로스, 람노스)이 있으며 이에 한정되는 것은 아니다. 바람직하게는 상기 헥소오스는 케토헥소오스, 알도헥소오스 또는 데옥시당이며, 보다 바람직하게는 케토헥소오스 또는 알도헥소오스이다.
본 명세서에서 용어 “헵토오스(heptose)”는 한 분자 중 7개의 탄소원자를 함유한 단당류(monosaccharide)를 의미하며, 기능기(알데하이드기 및 케톤기)의 위치에 따라 알도헵토오스(포지션 1) 및 케토헵토오스(포지션 2)로 구분할 수 있다. 상기 알토헵토오스는 예컨대, L-글리세로-D-만노-헵토오스가 있으며 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 케토헵토오스는 예컨대, 세도헵툴로스 및 만노헵툴로스가 있으며 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 대장균 균주의 염색체 DNA는 분쇄에 의해 면역촉진(immunostimulatory) 활성을 갖는 올리고데옥시뉴클레오타이드를 생성하며, 상기 분자량 2,000-5,000 Da의 디아실리포올리고사카라이드는 3-히드록시테트라데카노이트 트리메틸실릴 에스테르의 지질을 포함한다.
본 명세서에서 용어“면역촉진(immunostimulatory)”은 초기 면역반응을 유도하거나 항원에 대한 기존의 면역반응을 측정 가능할 정도로 증가시키는 것을 말한다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 대장균 균주는 대장균 EG0023(기탁번호: KCCM11218P)이다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 다음 화학식 1로 표시되는 당쇄 사슬을 포함하고 분자량 2,000-5,000 Da인 디아실리포올리고사카라이드를 유효성분으로 포함하는 면역보조(adjuvant) 조성물을 제공한다:
화학식 1
Figure pat00002
상기 화학식에서, Hex는 헥소오스이고, Hep는 헵토오즈, Kdo는 2-케토-3-디옥시-옥토네이트이고, HexNAc는 N-아세틸 헥소사민이며, P는 포스페이트이다.
본 발명의 면역보조 조성물에서 가장 큰 특징은 면역보조제로서 탈아실화 비독성 LOS(Lipooligosaccharide)를 이용하는 것이다. 본 명세서에서 용어 “LOS(Lipooligosaccharide)”는 LPS(lipopolysaccharide)의 변형체로서 천연(natural occurring) LPS보다 짧은 당쇄를 가지고 있어 분자량이 작은 것을 의미한다. 탈아실화 전 LOS는 바람직하게는 분자량이 2,000-5,000 Da이다. 용어 “탈아실화 LOS"는 이러한 LOS에서 지질 A의 글루코사민에 -C(O)O- 결합으로 결합된 지방산이 제거되어 LPS와 비교하여 독성이 크게 감소된 것을 의미한다. 지질 A의 글루코사민에 지방산은 -C(O)O- 결합 및 -C(O)NH- 결합을 통하여 결합되어 있다. 본 발명의 탈아실화 LOS는 지질 A의 탈아실화에 의해 -C(O)O- 결합으로 결합된 지방산이 제거된 것을 나타낸다.
탈아실화 비독성 LOS는 다양한 방법을 통하여 제조될 수 있으나, 본 발명자들의 선행특허인 대한민국 특허등록 제0456681호; WO 2004/039413; 대한민국 특허등록 제0740237호; 및 WO 2006/121232에 개시된 방법에 따라 제조될 수 있다. 예를 들어, LPS에 강염기(예컨대, 2 N NaOH)을 처리하여 탈아실화 하여 지질 A로부터 일부 지방산을 제거하여 탈독소화 한다.
본 발명의 구체적인 일실시예에 따르면, 본 발명에서 면역보조제로 이용되는 탈아실화 LOS는 LPS에 알카리 처리하여 탈아실화 하여 비독성화 된 것이다. 상기 알카리의 바람직한 예는 NaOH, KOH, Ba(OH)2, CsOH, Sr(OH)2, Ca(OH)2, LiOH, RbOH 를 Mg(OH)2를 포함하며, 보다 바람직하게는 NaOH, KOH, Ba(OH)2, Ca(OH)2, LiOH 및 Mg(OH)2이고, 보다 더 바람직하게는 NaOH, KOH 및 Mg(OH)2이며, 가장 바람직하게는 NaOH이다.
LPS의 독성 정도는 당업계에 공지된 다양한 방법을 통하여 분석할 수 있다. 예를 들어, LPS가 처리된 THP-1(Acute monocytic leukemia)에 분비되는 TNF-α(tumor necrosis factor-α)의 양을 측정하여 독성을 분석할 수 있다. 본 발명의 탈아실화 비독성 LOS는 종래의 LPS와 비교하여 상대적으로 적은 양의 TNF-α 분비를 유도한다.
본 발명에서 이용되는 면역보조제인 비독성 탈아실화 LOS의 또 다른 특징은 분자량이 일반적으로 종래에 이용되는 LPS와 비교하여 작다는 것이다. 바람직하게는, 본 발명에서 이용되는 탈아실화 비독성 LOS는 2,000-5,000 Da, 보다 바람직하게는 2,000-4,000 Da, 보다 더 바람직하게는 2,000-3,500 Da, 보다 더욱 더 바람직하게는 2,000-3,000 Da의 분자량을 갖는 것이다. 이러한 분자량은 당업계의 통상적인 방법 예를 들어 MALDI-MASS를 이용하여 측정할 수 있다.
본 발명에서 이용되는 비독성 탈아실화 LOS는 면역촉진(immunostimulatory) 효능이 종래의 면역보조제와 비교하여 우수할 뿐만 아니라 독성도 훨씬 감소되어 있어, 본 발명의 면역보조 조성물에 매우 적합하다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 면역보조 조성물에 포함되는 탈아실화 LOS는 대장균(Escherichia coli)으로부터 유래된 것이며, 가장 바람직하게는 본 발명자들의 독자적인 균인 E. coli EG0023(KCCM11218P)으로부터 유래된 것이다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 면역보조 조성물의 유효성분인 리포올리고사카라이드는 3-히드록시테트라데카노이트 트리메틸실릴 에스테르의 지질을 포함하며, 본 발명에서 발굴한 상기 대장균 균주의 염색체의 올리고데옥시뉴클레오타이드를 추가적으로 포함할 수 있다.
본 발명에서 이용되는 올리고데옥시뉴클레오타이드는 바람직하게는 50-10,000 bp이며, 보다 바람직하게는 500-7,000 bp, 보다 더 바람직하게는 500-4,000 bp, 보다 더욱 더 바람직하게는 500-2,000 bp, 가장 바람직하게는 500-1,500 bp의 길이를 갖는 것이다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 면역보조 조성물은 디아실리포올리고사카라이드 및 올리고데옥시뉴클레오타이드의 중량비가 1:0.005 내지 1:200이며, 바람직하게는 1:0.05 내지 1:150이고, 보다 바람직하게는 1:0.5 내지 1:150이며, 보다 더 바람직하게는 1:10 내지 1:120이고 가장 바람직하게는 상기 면역보조 조성물은 디아실리포올리고사카라이드 및 올리고데옥시뉴클레오타이드의 중량비는 1:100이다.
본 발명의 면역보조 조성물은 면역세포를 자극하여 항체의 분비를 촉진시키며, 특히 Th1 세포 면역기전과 관련하여, 항원제시세포인 수지상 세포는 면역반응의 시발 세포이자 B 세포와 T 세포를 효과적으로 자극하는 세포로 잘 알려져 있다(Banchereau J et al., Nature, 392:245-53(1998)). 일반적으로 미성숙상태의 수지상 세포는 T 세포 활성화에 필요한 CD40, CD54, CD86 등의 분비가 부족하여 T 세포를 자극할 수 없는데, 그럼에도 불구하고 항원이 체내로 들어오면 항원을 인식하고, 이 인식과정에서 수지상세포를 성숙시키고 활동적으로 유도하게 된다. 또한, 성숙된 수지상세포는 IL-10의 억제효과에 대해 저항을 나타내며 선천 면역과 후천 면역 반응을 모두 자극하는 사이토카인인 IL-12를 합성하게 된다(Koch F et al, J Exp Med, 184:741-7(1996); Cella M et al, J Exp Med, 184:747-52(1996)). 한편 수지상세포는 T세포 수용체와 연결할 수 있는 여러 매개체를 분비하여 세포의 유착과 신호전달을 증진하게 하며 이 과정은 세균 감염이나 여러 체내 스트레스 등에 노출된 당일부터 진행된다. 성숙된 수지상세포와 IL-12의 존재하에 MHC 타입 II와 결합된 CD4 T 헬퍼 세포는 인터페론-γ를 생성하는 Th1세포로 변하게 되는데 분비된 IFN-γ는 IL-12와 함께 대식세포의 항균 활동을 활성화시키게 된다(Reis e Sousa C et al, J Exp Med, 186:1819-29(1997)).
헬퍼 T 세포(Th)는 분비되는 사이토카인에 의해 Th-1 타입(예컨대, IL-2, IL-12, IFN-γ, TNF-α, IL-12p40)과 Th-2 타입(예컨대, IL-4, IL-6, IL-8, TGF-β)으로 나누어진다(Lucey D. R. et al, Clin. Microbiol . Rev ., 9:532(1996)).
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 면역보조 조성물은 NF-κB를 활성화시킴으로써 인터루킨-8 및 인터루킨-12 프로모터의 활성을 증가시킨다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 면역보조 조성물은 헬퍼 T 세포 1의 인터페론-γ 및 인터루킨-12p40의 분비를 증가시킨다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 (a) 항원; 및 (b) 면역촉진(immunostimulatory) 성분으로서 다음 화학식 1로 표시되는 당쇄 사슬을 포함하고 분자량 2,000-5,000 Da인 디아실리포올리고사카라이드를 유효성분으로 포함하는 백신 조성물을 제공한다:
화학식 1
Figure pat00003
상기 화학식에서, Hex는 헥소오스이고, Hep는 헵토오즈, Kdo는 2-케토-3-디옥시-옥토네이트이고, HexNAc는 N-아세틸 헥소사민이며, P는 포스페이트이다.
본 발명의 백신 조성물은 병원체에 대한 면역반응을 크게 유도하여 특정 지환의 예방 효능이 우수할 뿐만 아니라 면역보조제로 이용되는 탈아실화 비독성 LOS는 독성이 거의 없어 안전성 측면에서도 매우 우수하다.
본 발명의 백신 조성물은 상술한 “면역보조 조성물”에 포함된 성분과 동일한 유효성분을 포함하여 그 기재된 내용이 공통되므로, 과도한 중복을 피하기 위해 그 기재를 생략한다.
본 명세서에서 용어“항원(antigen)”은 수용자의 면역반응을 유도하는 물질이다. 본 발명에서 이용될 수 있는 바이러스 병원체 항원의 예는 인플루엔자 바이러스와 같은 Orthomyxoviruses; RSV(respiratory syncytial virus), SIV(simian immunodeficiency virus) 및 HIV와 같은 레트로바이러스; EBV(Epstein-Barr Virus)와 같은 Herpesviruses; CMV(cytomegalovirus) 또는 HSV(herpes simplex virus); Lentiviruses; 광견병(rabies)와 같은 Rhabdoviruses; 폴리오바이러스와 같은 Picomoviruses; 백시니아와 같은 Poxviruses; Rotavirus; 및 Parvoviruses로부터 유래된 항원을 포함한다. 보다 구체적으로, 바이러스 병원체 항원의 예는 HPV 항원의 예는 HPV의 L1, L2, E6 또는 E7 단백질; HIV의 항원의 예는 nef, p24, gp120, gp41, tat, rev, pol, env 및 gp120의 T 세포와 B 세포 에피토프(Palker et al, J. Immunol ., 142:3612-3619(1989))을 포함한다. HBV의 표면 항원의 예는 Wu et al, Proc . Natl . Acad . Sci ., USA, 86:4726-4730(1989)에 개시되어 있다. 로타바이러스의 항원의 예는 VP4(Mackow et al, Proc . Natl . Acad . Sci ., USA, 87:518-522(1990)) 및 VP7(Green et al, J. Virol ., 62:1819-1823(1988)를 포함하며;, 인플루엔자 바이러스 항원은 헤마글루티딘(hemagglutinin: HA) 및 뉴클레오단백질을 포함하고; HSV 항원은 티미딘 키나아제를 포함하며(Whitley et al, In: New Generation Vaccines, pages 825-854); 조류 인플루엔자 바이러스 항원은 헤마글루티딘을 포함하고; 돼지 콜레라 바이러스 항원은 엔벤로프; 구제역 바이러스 항원은 엔벨로프; 그리고 뉴캐슬바이러스 항원은 HN(Hemagglutinin-neuraminidase), F (Fusion protein)을 포함한다.
본 발명에 이용될 수 있는 박테리아 병원체 항원의 예는 Mycobacterium spp., Helicobacter pylori, Salmonella spp., Shigella spp., E. coli , Rickettsia spp., Listeria spp., Legionella pneumoniae, Pseudomonas spp., Vibrio spp. 및 Borellia burgdorferi으로부터 유래된 항원을 포함한다. 구체적으로, 본 발명에 이용될 수 있는 박테리아 병원체 항원의 예는 Shigella sonnei의 form-1 항원(Formal et al, Infect . Immun ., 34:746-750(1981)); V. cholerae의 O-항원(Forrest et al, J. Infect . Dis . 159:145-146(1989); E. coli의 FA/I 섬모항원(fimbrial antigen)(Yamamoto et al, Infect . Immun ., 50:925-928(1985))과 열민감성 독소의 비독성 B-서브유니트(Klipstein et al, Infect. Immun ., 40:888-893 (1983)); Bordetella pertussis의 퍼택틴(pertactin)(Roberts et al, Vacc., 10:43-48(1992)); B. pertussis의 아데닐레이트 사이클라아제-헤모라이신(Guiso et al, Micro. Path ., 11:423431(1991)); 및 Clostridium tetani의 테타너스 독소의 단편 C(Fairweather et al, Infect . Immun ., 58:1323-1326(1990))을 포함한다.
본 발명에 이용될 수 있는 기생충 항원의 예는 Plasmodium spp., Trypanosome spp., Giardia spp., Boophilus spp., Babesia spp., Entamoeba spp., Eimeria spp., Laishmania spp., Schistosome spp., Brugia spp., Fascida spp., Dirofilaria spp., Wuchereria spp., 및 Onchocerea spp.으로부터 유래된 항원을 포함한다. 보다 구체적으로, 본 발명에 이용될 수 있는 기생충 항원의 예는 Plasmodium bergerii의 circumsporozoite 항원 및 P. falciparum의 circumsporozoite 항원과 같은 Plasmodium spp.의 circumsporozoite 항원(Sadoff et al, Sci ., 240:336-337 (1988)); Plasmodium spp.의 merozoite 표면 항원(Spetzler et al, Int . J. Pept . Prot . Res ., 43:351-358 (1994)); Entamoeba histolytica의 갈락토오스 특이 렉틴(Mann et al, Proc . Natl . Acad . Sci ., USA, 88:3248-3252 (1991)); Leishmania spp.의 gp63(Russell et al, J. Immunol ., 140:1274-1278 (1988)); Brugia malayi의 파라마이오신(Li et al, Mol . Biochem . Parasitol ., 49:315-323 (1991)); 및 Schistosoma mansoni의 트리오스-포스페이트 이소머라아제(Shoemaker et al, Proc . Natl. Acad . Sci . USA, 89:1842-1846 (1992))를 포함한다.
본 발명에 이용될 수 있는 암 항원의 예는 전립선 특이 항원(Gattuso et al, Human Pathol ., 26:123-126 (1995)), TAG-72 및 CEA(carcinoembryonic antigen) (Guadagni et al, Int . J. Biol . Markers, 9:53-60 (1994)), MAGE-1 및 티로시나아제(Coulie et al, J. Immunothera ., 14:104-109 (1993)), p53(WO 94/02167), NY-ESO1(cancer-testis antigen), AFP(α-feto protein) 및 암 항원 125(CA-125), EPCA(Early Prostate Cancer Antigen)를 포함한다.
본 발명의 구체적인 일실시예에 따르면, 상기 항원은 HEL (hen egg lysozyme)이다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 백신 조성물에서 상기 리포올리고사카라이드는 3-히드록시테트라데카노이트 트리메틸실릴 에스테르의 지질을 포함하며, 또한 상기 백신 조성물은 본 발명에서 이용한 대장균 균주의 염색체의 올리고데옥시뉴클레오타이드를 추가적으로 포함한다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 백신 조성물이 올리고데옥시뉴클레오타이드를 추가적으로 포함하는 경우, 디아실리포올리고사카라이드 및 올리고데옥시뉴클레오타이드의 중량비가 1:0.005 내지 1:200이며, 바람직하게는 1:0.05 내지 1:150이고, 보다 바람직하게는 1:0.5 내지 1:150이며, 보다 더 바람직하게는 1:10 내지 1:120이고 가장 바람직하게는 1:100이다.
한편, 하기의 실시예에서 입증한 바와 같이, 본 발명의 탈아실화 비독성 LOS는 LPS보다 독성이 훨씬 적다. 또한, 하기 실시예에 나타난 바와 같이, 본 발명의 탈아실화 비독성 LOS를 여러 병원체의 항원과 함께 투여한 경우 면역반응이 크게 증가함을 알 수 있다. 생체 내 면역 반응은 크게 Th1 면역반응 및 Th2 면역반응으로 나눌 수 있다. 본 명세서에서 용어 “Th1 면역반응”은 세포면역반응을 유도하는 반응을 의미한다.
본 발명에서 면역화된 동물에서의 면역반응 측정은 예를 들어, 면역원을 투여한 대상 동물로부터 혈청을 채취하여 항-면역원 항체(총 IgG, IgG1 및 IgG2a)의 역가를 확인하는 방법을 통해 이루어질 수 있다. 항체의 역가를 확인하는 방법은 예를 들어, ELISA(Enzyme-linked immunosorbent assay), 측면이동분석법(Lateral flow test), MIA(Magnetic immunoassay), 면역침강법(Immunoprecipitation) 등을 이용할 수 있으나, 이에 제한되지 않고 당업계에 알려진 다양한 면역분석(immunoassay) 방법에 의해 이루어질 수 있으며, 바람직하게는 ELISA 분석법을 이용한다.
본 발명의 백신 조성물을 투여한 경우, 혈청 내의 전체 IgG 및 IgG2a 양을 증가시키며, 또한 NF-κB를 활성화시킴으로써 인터루킨-8 및 인터루킨-12 프로모터의 활성을 증가시키고, 헬퍼 T 세포 1의 면역기전과 관련된 인터페론-γ 및 인터루킨-12p40의 분비를 증가시킨다.
본 발명의 백신 조성물은 그의 기본적인 조성, 병원체의 항원과 탈아실화 비독성 LOS만으로도 충분한 면역반응을 유도하여 특정 질환에 대한 예방 효능을 발휘할 수 있다. 선택적으로, 본 발명의 백신 조성물은 다른 면역보조제를 추가적으로 포함할 수 있으며, 예를 들어 Mg, Ca, Sr, Ba 및 Ra으로 구성된 군으로부터 선택되는 제2족 원소, Ti, Zr, Hf 및 Rf로 구성된 군으로부터 선택되는 제4족 원소 또는 알루미늄의 염 또는 그의 수화물을 포함할 수 있다. 상기 염은 바람직하게는 옥사이드, 퍼옥사이드, 하이드록사이드, 카보네이트, 포스페이트, 파이로포스페이트, 하이드로겐포스페이트, 다이하이드로겐포스페이트, 설페이트 또는 실리케이트와 함께 형성된다. 예를 들어, 본 발명의 백신 조성물에서 추가적으로 이용될 수 있는 면역보조제는 마그네슘 하이드록사이드, 마그네슘 카보네이트 하이드독사이드 펜타하이드데이트, 티타듐 다이독사이드, 칼슘 카보네이트, 바륨 옥사이드, 바륨 하이이드록사이드, 바륨 퍼옥사이드, 바륨 설페이트, 칼슘 설페이트, 칼슘 파이로포스페이트, 마그네슘 카보네이트, 마그네슘 옥사이드, 알루미늄 하이드록사이드, 알루미늄 포스페이트 및 수화된 알루미늄 포타슘 설페이트(Alum)를 포함한다. 가장 바람직하게는, 본 발명의 백신 조성물에서 추가적으로 이용될 수 있는 면역보조제는 알루미늄 하이드록사이드이다.
본 발명의 백신 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체를 포함할 수 있으며, 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 백신 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.
본 발명의 백신 조성물은 경구 또는 비경구로 투여할 수 있고, 바람직하게는 비경구 투여이고, 비경구 투여인 경우에는 정맥내 주입, 피하 주입, 근육 주입, 복강 주입, 경피 투여 등으로 투여할 수 있다.
본 발명의 백신 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다. 한편, 본 발명의 약제학적 조성물의 경구 투여량은 바람직하게는 1일 당 0.0001-1000 mg/kg(체중)이다.
본 발명의 백신 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 다음 화학식 1로 표시되는 당쇄 사슬을 포함하고 분자량 2,000-5,000 Da인 디아실리포올리고사카라이드를 유효성분으로 포함하는 항암제 또는 항암 보조제 조성물을 제공한다:
화학식 1
Figure pat00004
상기 화학식에서, Hex는 헥소오스이고, Hep는 헵토오즈이며, Kdo는 2-케토-3-디옥시-옥토네이트이고, HexNAc는 N-아세틸 헥소사민이며, P는 포스페이트이다.
본 발명의 조성물은 암 치료 또는 예방 조성물로서, 항암제 또는 항암보조제로서도 사용될 수 있으며, 독립적으로 또는 물리적/화학요법과 병행하여 사용될 수 있다. 본 발명의 발명자들은 항암보조제로 박테리아 LPS 유래 비독성 고분자물질(dLOS)을 고안하였으며, 이를 이용하여 항암제로서 올리고데옥시뉴크레오타이드의 효과적인 이용에 성공하였다. 특히 단독으로는 효과가 없는 올리고데옥시뉴클레오타이드의 경우에도 디아실 리포올리고사카라이드(dLOS)와 함께 사용할 때, 특별한 독성을 나타내지 않으며 암세포에 대해서는 우수한 항암 효과를 나타낸다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 항암제 또는 항암 보조제 조성물에서 상기 디아실리포올리고사카라이드는 3-히드록시테트라데카노이트 트리메틸실릴 에스테르의 지질을 포함한다.
본 발명의 다른 바람직한 구현예에 따르면, 상기 항암제 또는 항암 보조제 조성물은 본 발명의 대장균 균주 염색체의 올리고데옥시뉴클레오타이드를 추가적으로 포함할 수 있다. 상기 항암제 또는 항암 보조제 조성물이 올리고데옥시뉴클레오타이드를 추가적으로 포함하는 경우, 디아실리포올리고사카라이드 및 올리고데옥시뉴클레오타이드의 중량비는 1:0.005 내지 1:200이며, 바람직하게는 1:0.05 내지 1:150이고, 보다 바람직하게는 1:0.5 내지 1:150이며, 보다 더 바람직하게는 1:10 내지 1:120이고 가장 바람직하게는 1:100이다.
본 발명의 항암제 또는 항암 보조제 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체를 포함할 수 있으며, 다양한 제형으로 제조될 수 있고, 다양한 경로를 통해 투여될 수 있다. 이에 대한 내용은 상기 백신 조성물에 대한 내용과 같으므로 중복된 기재로서 생략한다.
본 발명의 조성물은 다양한 종류의 암 치료에 사용될 수 있으며, 섬유육종, 방광암, 뇌하수체선종, 신경교종, 뇌종양, 상인두암, 후두암, 흉선종, 중피종, 유방암, 폐암, 위암, 식도암, 대장암, 간암, 췌장암, 췌내분비종양, 담낭암, 음경암, 요관암, 신세포암, 전립선암, 비호지킨성림프종, 골수이형성증후군, 다발성골수종, 형질세포성종양, 백혈병, 소아암, 피부암, 난소암 및 자궁경부암을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 바람직하게는 상기 암은 섬유육종 또는 방광암이다.
본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:
(a) 본 발명은 안정적 구조의 비독성 디아실리포올리고사카라이드 및 면역촉진(immunostimulatory) 활성을 갖는 올리고데옥시뉴클레오타이드를 포함하는 면역 보조 조성물, 백신 조성물 및 항암제 조성물을 제공한다.
(b) 본 발명의 조성물에 포함된 두 가지 유효성분은 서로 상승작용을 일으켜, 독성은 낮고 면역원성은 우수한 항암제로 사용이 가능하다.
(c) 본 발명에 따르면, 저비용으로 BCG 이상의 약효를 보이는 정제 DNA와 박테리아 LPS 유래의 비독성 고분자 물질을 포함하는 안전한 항암제를 하나의 균주를 이용하여 편리하게 생산 할 수 있다.
도 1은 항암제의 성분인 박테리아 DNA와 dLOS를 동시에 생산할 수 있는 균주의 스크리닝 과정 중 독성이 가장 낮은 LPS를 생산하는 균주를 선택하기 위하여 그의 지표인 TNF-α의 분비량을 측정한 것이다.
도 2는 도 1에서 선택된 균주(D)에서 생산된 LPS를 정제하여 그 크기를 전기영동 및 실버염색을 통하여 확인한 결과이다.
도 3은 선택된 균주에서 DNA를 정제하고 이를 초음파 분쇄기를 이용, 가장 효능이 우수한 크기로 파쇄하여 전기영동 후 확인한 것이다.
도 4는 분리된 LPS를 알칼리 처리하였을 때 지질 A를 분해함으로써 크기가 작아짐을 보여준다. 레인 1은 정제된 LPS이며 레인 2는 비독성 디아실 리포-올리고사카라이드(dLOS)이다.
도 5는 TNF-α분비 측정을 통하여 dLOS가 독성제거 전 LPS보다 약 45배가량 독성이 감소하였음을 보여준다(J5: 대조군, LPS: 독성제거 전 LPS, dLOS: 독성제거 후 탈아실화된 비독성 LPS).
도 6은 하나의 균주에서 생산된 dLOS에 대한 독성 확인 시험 중 이상독성 부정시험에 관한 것이다(C: 대조군, S: 시료투여군).
도 7은 마우스에서 면역효과를 확인하기 위하여 하나의 균주에서 생산된 올리고데옥시뉴클레오타이드와 dLOS의 혼합 비율에 따른 면역증강 효과(a; Total IgG, b; IgG2a)를 보여준다.
도 8은 사람의 전혈을 이용하여 하나의 균주에서 생산된 올리고데옥시뉴클레오타이드와 dLOS의 혼합 비율에 따른 면역관련 싸이토카인의(a; IFN-γ, b; IL-12p40) 분비 효과를 보여준다.
도 9는 하나의 균주에서 생산된 올리고데옥시뉴클레오타이드와 dLOS의 혼합물질을 RAW 세포에 처리한 결과 NF-kB가 활성화되어 IL-8 (9a), IL-12 (9b) 프로모터의 활성을 증가시킴을 보여준다.
도 10은 마우스 모델에 있어서 하나의 균주에서 생산된 올리고데옥시뉴클레오타이드와 dLOS의 혼합물질에 대한 기존의 치료제와의 항암 효과 비교 결과를 보여준다(도 10a: 생존율, 도 10b: 종앙크기).
도 11은 하나의 균주에서 생산된 dLOS의 MLADI-TOF/MS에 대한 결과자료이다.
도 12는 하나의 균주에서 생산된 dLOS에 대하여 MS/MS, MLADI-TOF/MS 분석을 이용, 확인된 당 구조에 대한 자료이다(Hex: 헥소오스, Hep: 헵토오즈, Kdo: 2-케토-3-디옥시-옥토네이트, HexNAc: N-아세틸 헥소사민, P: 포스페이트).
도 13은 하나의 균주에서 생산된 dLOS에 대하여 GC-MS분석을 이용, 확인된 지질 구조에 대한 자료이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
실시예
실시예 1 : 비독성 dLOS 및 올리고데옥시뉴클레오타이드를 동시에 생산할 수 있는 균주 발굴
매우 짧은 리포폴리사카라이드를 가지며, 안정적으로 올리고 뉴클레오타이드를 동시에 생산 할 수 있는 변이 대장균 스크리닝 및 발굴
건강한 사람의 장에 사는 대장균으로부터 리포폴리사카라이드 당 사슬의 길이가 매우 짧은 리포폴리사카라이드를 가짐과 동시에 안정적으로 올리고데옥시뉴클레오타이드를 생산 하는 균주(E.coli EG0023)를 발굴하였으며 스크리닝 방법은 다음과 같다.
건강한 성인 남성의 장에서 얻은 대장균의 단일 콜로니를 액체 배양하여 선별하는 과정을 5회 반복하였고, 이 후 50종의 균주를 1차 선별하였다. 선별된 50종의 균주는 플레이트에서 콜로니 하나를 따서 0.9 ％생리식염수 4 ㎖ 에 충분히 현탁시킨 후, 그 중 1 ㎖을 에펜도르프 튜브에 옮겨서 DNA 분해효소 1(DNase 1)을 2 ㎕ 처리하고 37 ℃ 인큐베이터(incubator)에서 1시간동안 반응시켰다. DNA 분해효소 1 처리 후 반응이 종료된 균액은 10 mg/㎖ RNA 분해효소(RNase)를 50 ㎕ 처리한 후 37 ℃ 인큐베이터에서 1시간 반응시켰다. 이 후 20 mg/㎖ 단백질분해효소(proteinase) K를 100 ㎕ 첨가한 후, 37℃에서 밤새 반응시켰다. 이와 같은 과정을 거쳐 얻은 각 균주의 LPS를 과립구대식세포콜로니자극인자(Granulocyte-macrophage colony stimulating factor, GM-CSF)로 분화시킨 인간 림프구 세포주에 처리한 후, TNF-a 분비 측정하여 가장 낮은 값을 보이는 균주 5개를 2차 선택하였고, 2차 선별된 5개의 균주를 재배양하여 위의 방법으로 TNF-a 값을 확인하여 가장 낮은 수치를 보이는 균주(D)를 선택하였다(도 1). 또한 선택된 균주의 LPS를 전기영동 및 실버염색하여 리포폴리싸카라이드의 분자량을 확인하였다. 이 약독화 균주는 형태학적이나 균 자체의 특성은 전혀 변함이 없고, 단지 5만-10만의 분자량을 갖는 리포폴리싸카라이드 래더(ladder)가 없고 2천-7천 달톤(Da)의 분자량을 갖는 리포폴리사카라이드를 생산함을 확인하였으며(도 2), 균주명을 EG0023으로 명명하였다. 또한 동일한 균주로부터 실시예 2와 같은 방법으로 올리고데옥시뉴클레오타이드를 정제하였다.
실시예 2 :대장균 올리고데옥시뉴클레오타이드의 정제
<2-1> 올리고데옥시뉴클레오타이드 의 정제
대장균(E. coli) EG-0023을 37 ℃ TSB(Triptic soy broth; Difco) 30 g/ℓ 배지에서 10시간 진탕배양 하였다. 10L 배양 후 8,000 G에서 원심분리하여 얻은 세포 150 g을 300 ㎖ TE(10 mM Tris, pH 8.0, 25 mM EDTA) 완충용액에 세척하고 원심분리한 후, 얻은 균체 150 g을 750 ㎖ 분해용액(10 mM Tris (pH 8.0), 25 mM EDTA. 100 g/ ㎖ 라이소자임)에 현탁시켜 37 ℃ 배양기에서 1시간 처리하였다. 1시간 후 단백질분해효소 K (Sigma)를 최종 100 g/㎖ 되게 첨가한 후 50 ℃ 배양기 에 12시간 처리하였다. 페놀/클로로포름/이소아밀알콜(25:24:1)과 1:1로 섞어 물 층을 수집하는 과정을 3회 반복하였다. 이렇게 얻은 대장균 염색체를 에탄올을 이용하여 침전시켜 얻었다. 정제한 대장균 DNA의 농도는 살균 증류수로 희석한 후 UV 분광기의 파장 260 nm 및 280 nm에서 측정하였다. 측정값에 대해서 정제한 대장균의 DNA 농도는 다음과 같이 산출하였다.
계산식 1
이중 가닥 DNA 농도(㎍/㎖) = O.D. 260 nm x 희석배수 x 50
(단, O.D. 260 nm/280 nm의 값이 1.7-1.8인 경우에 사용한다)
<2-2> 염색체의 파쇄
정제된 상기의 염색체를 TE(Tris-HCl, EDTA) 완충용액에 0.5 mg/㎖이 되게 녹여 유리 비커에서 초음파 파쇄하였다. 초음파 파쇄기는 소닉스(Sonics)사 500 와트 소니케이션 VCX500를 사용하였으며 팁은 630-0220(팁 직경:1/2'(13 mm)을 사용하여 한번에 20 ㎖씩 수행하였다. 기존의 결과에 결정된 1kb 크기의 대장균 DNA의 생산을 위한 분쇄 조건은 펄스로 20,000 J에서 7분 이었다. 위의 조건으로 생산된 DNA는 도 3과 같다.
실시예 3 : 파쇄한 대장균 DNA로부터 엔도톡신의 제거 및 순도 확인
<3-1> 엔도톡신(endotoxin)의 제거
파쇄한 DNA를 클로로포름에 4 ℃에서 12시간 처리 한 후, 3배 부피의 에탄올을 첨가하여 침전물을 수득하였다. 수득한 침전물에 트리톤 X-114(Sigma)를 최종 농도의 0.5 %가 되도록 첨가한 후, 4 ℃에서 4시간 처리하였고, 이 후 37 ℃ 에서 5분 동안 워밍한 후, 페놀/클로로포름/이소아밀알콜(25:24:1)과 1:1로 섞어 물 층을 수집하였다.
얻은 대장균 DNA를 에탄올을 이용하여 침전시킨 후 대장균 DNA를 파이로젠(pyrogen)이 없는 물에 녹였다. 엔도톡신을 제거한 DNA는 생물학적내독소시험(Limulus Amebocyte Lysate, LAL) 분석(BioWhittaker QCL-1000)을 실시하여 잔존 엔도톡신을 확인하였다.
<3-2> 순도확인
잔류 유기 용매량은 GC/MSD (gas chromatography/mass selected detector)를 이용하여 측정하였다. 사용한 기기는 HP-5890A/HP-5870B로 컬럼은 50 m.ultra-1, SIM (Selected Ion Monitoring)으로 에탄올, 아세톤, 클로로포름 및 페놀을 측정하였다. 또한 Brad-Ford 방법을 이용하여 대장균 DNA mg 당 단백질 혼입을 확인하여, 순도 99% 이상 수준을 유지하였다.
실시예 4 : 변이 대장균으로부터 리포폴리사카라이드의 정제
대장균(E. coli) EG-0023을 37 ℃ TSB(Triptic soy broth; Difco) 30 g/ℓ 배지에서 20시간 정치배양 한 후, 원심분리기를 이용하여 세포를 회수 하였다. 준비된 균체에 두 배 부피의 에탄올을 잘 섞은 후 4,000 g에서 원심분리하여 침전물을 수득하였다. 이 후, 수득한 침전물에 1.5배 부피의 아세톤을 첨가해 충분히 섞은 후 4,000 g에서 원심분리하였다.
수득한 침전물에 동량의 에틸에테르를 가해 잘 섞은 후, 4,000 g에서 원심 분리하였다. 원심분리하여 얻은 세포 침전물을 알루미늄 호일을 덮고 구멍을 낸 뒤 말린 다음, 균체 중량을 측정한 후 건조 중량 1 g 당 7.5 ㎖씩 추출혼합액(90 % 페놀:클로로포름:정유(Petroleum)에테르= 2:5:8)을 첨가하였다.
상기 대장균 및 추출혼합액의 혼합물을 유리 원심관에 분주하고, 25 ℃, 3000 rpm (1,200 g)로 20분간 원심분리하여 얻은 상층액을 후드에 12시간 방치하여 가라앉힌 후, 유리 원심관에 분주하였다. 상기 유리 원심관을 25 ℃, 3000 rpm (1,200 g)로 20분간 원심분리하여 얻은 리포폴리사카라이드를 에틸에테르에 녹인 다음, 리포폴리사카라이드를 에펜도르프 튜브로 옮긴 후 후드에서 건조시키고, 케미컬 밸런스를 이용하여 건조중량을 측정한 후 에탄올을 첨가하여 사용직전까지 보관하였다.
에탄올에 보관된 정제 대장균 리포폴리사카라이드는 완전히 에탄올을 제거한 후 리포폴리사카라이드 스탠다드(List Biological Lab.)를 이용하여 리포폴리사카라이드 내에 KDO(2-케토-3-디옥시옥토네이트)의 양을 측정하고, 농도를 측정한 후 SDS-PAGE로 크기에 따라 분리하여 실버 염색으로 확인하였다. 리포폴리사카라이드의 크기는 약 2천에서 6천 사이의 크기로 일반 대장균 리포폴리사카라이드에 비해 매우 작은 크기임을 확인하였다(도 4, 레인 A).
실시예 5: 변이 대장균으로부터 정제한 리포폴리사카라이드의 독성 제거
<5-1> 리포폴리사카라이드의 리피드 A 분해에 의한 독성 제거
정제한 대장균 리포폴리사카라이드(LPS)를 3 mg/㎖ 농도로 맞춘 후 0.2 N NaOH를 1:1 볼륨으로 섞은 후, 60 ℃에서 10분마다 한 번씩 흔들어주며 140분간 탈아실화시켰다. 이후 초기 0.2 N NaOH 양의 약 1/5정도의 1 N 아세트산을 첨가하여 pH 7.0으로 적정하였다. pH 적정 후 에탄올 침전법을 이용하여 비독성 리포폴리사카라이드(또는 비독성 리포올리고사카라이드)를 수득하였다. 비독성 리포폴리사카라이드는 KDO 방법으로 농도를 측정한 후 SDS-PAGE로 처리 전 리포폴리사카라이드와 비교하여 크기의 변화를 실버 염색으로 확인하였다. 실버 염색 결과 알카리 처리에 의해 리포폴리사카라이드의 지질 A가 분해되어 알카리 처리 전 리포폴리사카라이드에 비해 크기가 작아졌음을 확인하였다(도 4, 레인 B).
<5-2> 비독성 리포폴리사카라이드의 독성 제거 확인
비독성 리포폴리사카라이드의 안전성 시험을 위해 염증성 단백질 분비실험, 이상독성실험 및 발열성실험을 수행하였다.
<5-2-1> 염증성 단백질 분비시험
인간급성단핵백혈병세포(Human acute monocytic leukemia cell)인 THP-1세포에 EG0023으로부터 생산된 dLOS(디아실 리포올리고사카라이드)를 처리한 후 분비되는 TNF-α의 양을 측정하였다. 시판중인 LPS(J5)를 대조군으로 사용하였다. 대조군인 LPS가 리포폴리사카라이드 1 ㎍ 당 1 ng 의 TNF-α를 분비하는 반면, dLOS는 비독성 리포폴리사카라이드 1 ㎍당 22 pg TNF-α를 분비하여 독성에 의한 염증반응이 45배 가량 감소하였음을 보여주고 있다(도 5).
<5-2-2> 이상독성부정시험
생산된 dLOS 시료의 독성을 확인하기 위하여 식약청 이상독성 부정시험 규정에 따라 설치류에 시료를 고용량으로 투여한 후 체중 변화를 관찰하였다. 생후 약 5 주의 ICR계 마우스를 사용하였으며, 시료 투여 전 5일 이상 관찰하였을 때 이상이 없는 개체를 각 군당 3 마리씩 선정하여 0.5 ㎖의 양을 1회 복강 내에 주사하고 7일 이상 관찰하였다. 실험 결과, 시료 투여 후 아무런 체중의 이상 변화가 관찰되지 않았다(도 6).
<5-2-3> 발열성시험
토끼는 체중 1.5 kg 이상인 개체를 사용하였으며, 시험에 사용한 토끼를 다시 사용할 경우에는 전 시험 종료 후 3일 이상 경과되어야 한다. 체온 측정은 0.1℃까지 측정할 수 있는 장치를 사용하였다. 주사기와 주사바늘은 미리 250℃에서 30분 이상 가열 멸균한 것을 사용하였다. 동물은 사용 16 시간 전부터 시험이 끝날 때까지 물 이외의 사료는 주지 않았으며, 동물을 고정할 때는 가능한 한 구속의 도가 지나치지 않게 하였다.
생산된 dLOS 시료의 독성을 확인하기위하여 3 마리의 토끼에 dLOS를 주사한 후 직장 체온의 변화를 관찰하였다. 토끼의 귀 정맥에 토끼 체중 1 kg 당 약물 농도를 0.2 ㎍/㎖로 하여 주입한 후, 직장 내로 체온계를 삽입하여 비정상적인 체온의 변화를 측정하였다. 체온 측정은 측온 부분을 60-90 mm의 범위 내에서 일정한 깊이로 직장에 삽입하고 일정시간 후 관찰하였다. 주사 전에 동물의 체온을 측정하여 이를 대조 체온으로 하였다. 대조 체온 측정 후 약 15분 이내에 미리 약 37℃로 가온한 시료를 귀 정맥 내에 주사하였다. 주사 후 3 시간, 적어도 1 시간마다 체온을 측정하였다. 이 측정치와 대조 체온과의 차를 구하고 이를 차(差)체온이라 하였으며, 차체온의 최대치를 이 시험동물의 발열 반응으로 하였다. 검체 3마리의 동물을 사용하여 시험하였으며, 3마리의 반응의 합계가 1.3℃ 이하일 때 발열성물질시험 음성, 또는 2.5℃ 이상일 때는 발열성물질시험 양성으로 하 였다. 시험은 3 회 실시하였으며, 발열성물질시험이 음성일 때 이 시험에 적합한 것으로 하였다. 시험 결과 생산된 dLOS 샘플은 독성이 없음을 확인하였다. 자세한 결과는 다음 표 1과 같다.
횟수 토끼
번호		 투여전 측정횟수별 체온
(단위 : ℃)		 투여후 시간대별 체온
(단위 : ℃)		 최대상승체온 상승체온 누적합계 기준 결과
1회 2회 3회 0.5h 1h 1.5h 2h 2.5h 3h
1회 1 39.2 39.2 39.1 39.3 39.4 39.3 39.3 39.2 39.3 0.2 0.7℃ 1.3℃
이하		 통과
2 39.1 39.2 39.1 39.2 39.3 39.4 39.3 39.1 39.2 0.3
3 39.2 39.3 39.3 39.3 39.5 39.5 39.5 39.2 39.1 0.2
2회 1 39.1 39.3 39.0 39.2 39.3 39.4 39.2 39.3 39.2 0.3 1.8℃ 3.0℃
이하		 통과
2 39.1 39.0 39.2 39.4 39.5 39.4 39.3 39.3 39.2 0.4
3 39.2 39.1 39.4 39.3 39.6 39.5 39.5 39.3 39.3 0.4
3회 1 39.3 39.1 39.1 39.5 39.4 39.5 39.3 39.2 39.3 0.4 2.9℃ 5.0℃
이하		 통과
2 39.2 39.3 39.3 39.6 39.6 39.4 39.2 39.3 39.4 0.3
3 39.1 39.3 39.2 39.4 39.6 39.6 39.5 39.4 39.3 0.4
* 소수 둘째자리에서 반올림
실시예 6: 올리고데옥시뉴클레오타이드 , 비독성 리포폴리사카라이드(dLOS)의 혼합 및 역가 확인
<6-1> 올리고데옥시뉴클레오타이드 및 비독성 리포폴리사카라이드의 혼합
각각 기준에 맞추어 생산한 두 가지 물질(올리고데옥시뉴클레오타이드, 비독성 리포올리고사카라이드(dLOS))의 최적 혼합 농도를 확인하기 위하여 100:1, 50:1의 비율로 진탕 혼합하였다.
<6-2> 역가확인
마우스에서의 면역보조제로써의 효능을 확인하기 위해 HEL (Sigma) 50 ㎍을 항원으로 하여 ICR 마우스(수컷, 4주령, 20 g) 복강 내에 0.1 ㎖씩 일주일 간격으로 2회 투여하였다. 최종 투여 7일 후 전혈을 채취하여 혈청을 분리하였고 혈청 내 전체 항체가와 IgG 서브타입인 IgG2a를 HEL를 항원으로 ELISA법으로 확인하였다(도 7a, 7b).
시판중인 LPS (J5) 1 ㎍을 대조군으로 하고, 실험군은 항원과 dLOS 1 ㎍ + DNA 50 ㎍, dLOS 0.5 ㎍ + DNA 50 ㎍을 두 가지 군으로 나누어 진탕혼합한 후 수행하였다. 그 결과, 전체 IgG 뿐만 아니라 면역글로빈 서브클래스 중 세포면역에 관련되어 항암치료에 효과적으로 알려진 IgG2a 수치가 dLOS 0.5 ㎍ 과 DNA 50 ㎍일 때 가장 높은 농도를 보임을 확인하였다(도 7b).
<6-3> 전혈(whole blood)분석을 이용한 역가 확인시험
건강한 성인 남자로부터 항응고제로 헤파린이 들어있는 진공 튜브에 정맥혈을 무균적으로 채취하였다. 채취한 전혈은 RPMI 1640배지(2 mM L-글루타민, 1 mM 쇼듐 피루베이트, 80 ㎍/㎖의 젠타마이신)과 1:1로 혼합하였다. 배지와 섞은 전혈 1 ㎖에 DNA 50 ㎍ + dLOS 1 ㎍ 또는 DNA 50 ㎍ + dLOS 0.5 ㎍를 총 20 ㎕이 되도록 PBS로 보정하여 처리하고 37 ℃, 5 % CO2 배양기에서 24시간동안 배양하였다. 이 후 배양 상층액을 모아 분비된 IFN-γ, IL-12p40의 양을 상품화되어 나온 ELISA 키트(IFN-γ(R&D, DY485), IL-12p40(R&D, DY2398))를 사용하여 측정하였으며 그 결과는 도 8a 및 8b와 같다.
분석 결과 dLOS 단독으로 투여하였을 때 보다 올리고데옥시뉴클레오타이드 혼합 투여하였을 때 시너지한 면역 증강 효과를 나타내었으며, 용량은 DNA 50 ㎍, dLOS 0.5 ㎍ 일 때 가장 우세한 결과를 보였다.
<6-4> 루시퍼레이즈 어세이
먼저 Raw 264.7(마우스 백혈구-유사 세포주) 세포를 12웰 플레이트에 웰 당 5 x 104로 분주하고(1 ㎖ DMEM / 10% FBS), 24시간동안 37℃, CO2 인큐베이터에서 배양하였다. IL-12 루시퍼레이즈 리포터 플라스미드(0.2 mg/웰), PRL-null 플라스미드(20 ng/ 웰)를 혼합하고, 무혈청 DMEM (50 ㎖/웰)과 트랜스펙션 시약인 퓨진6(1.5 ㎖/웰, Roche Cat. No. 1814443)의 혼합용액에 상기 혼합한 플라스미드를 첨가한 후 5-10분간 방치하였다. 상기 혼합물을 Raw 264.7세포에 52 ㎖/웰로 첨가한 후, 37 ℃, CO2 인큐베이터에서 24시간 배양하였다. 배양 후 웰 당 올리고데옥시뉴클레오타이드 20 ㎍ + dLOS 200 ng를 Raw 264.7 세포에 처리하여 12시간동안 37 ℃, CO2 인큐베이터에서 배양하였다. 루시퍼레이즈 어세이 키트(Promega Cat.no. E1500)를 사용하여 루시퍼레이즈 반응을 시킨 후 루미노미터를 이용하여 루시퍼레이즈 활성을 측정하였다.
올리고데옥시뉴클레오타이드 및 dLOS가 IL-8 및 IL-12 프로모터 활성에 미치는 효과를 루시퍼레이즈 활성으로 측정한 결과, IL-8 및 IL-12 프로모터에는 NF-κB 결합부위가 공통으로 존재하며, RAW264.7 세포주에서 DNA와 dLOS에 의해 NF-kB가 활성화되어 프로모터의 활성을 증가시킴을 볼 수 있었다(도 9a 및 9b).
<6-5> 올리고데옥시뉴클레오타이드 + dLOS 조합의 세포용해능을 이용한 항암 치료 효과 측정
올리고데옥시뉴클레오타이드 + dLOS의 암세포살해능은 51Cr-방출시험법으로 측정하였다. 5-8주령, 수컷, C3H/HeN 마우스의 발바닥에 항원 단독 또는 항원과 올리고데옥시뉴클레오타이드+dLOS를 피하 투여하였다.
세포주 배양을 위한 기본배지로는 RPMI-1640(10 mM의 HEPES, 100 유닛/㎖ 페니실린, 100 ㎍/㎖ 스트렙토마이신, 300 ㎍/㎖ 글루타민; Gibco Laboratories, Grand Island, NY)를 사용하였고, 상기 기본 배지에 56℃에서 30분 가열하여 비활성화 시킨 10% 소태아혈청(Gibco Laboratories, Grand Island, NY)을 첨가하여 사용하였다. 림포카인활성살해세포(lymphokine activated killer cell, LAK) 및 암세포 매개성 살해능의 활성도를 측정하기 위하여 Sarcoma 180과 생쥐 방광암 세포주인 MBT-2를 표적세포로 사용하였다.
각 실험군의 생쥐를 경추탈골로 도살한 후 비장을 무균적으로 적출하고 구경 100 마이크론(micron)의 스테인 리스 스틸 철망 위에서 가위로 혼합 미세절편을 만든 후, PBS(phosphate buffered saline)을 가하면서 유리막대로 가볍게 분쇄 여과하면서 철망을 통과시켜 조직 찌꺼기를 제거하였다. 현미경하에서 단세포 부유액임을 확인한 후 세포를 상기 RPMI-1640 기본 배지로 1회 세척한 다음 37 ℃에서 0.84% 염화암모늄 용액에 5분간 부유시켜 적혈구를 용해시켰다. 세포를 기본배지로 2회 더 세척한 후 완전배지에 부유시켜 배양 플라스크에 분주하고, 37℃, 5% CO2 항온항습기에서 1시간 동안 배양하였다. 배양 후, 플라스크에 부착되지 않는 세포를 채취하여 트립판블루 색소배제법으로 생존세포를 계수한 후, 완전배지로 5 x 106 세포/㎖ 밀도의 세포부유액을 만들었다.
표적 세포주(Sarcoma 180 및 MBT-2)를 배양한 후, 세포수를 계산하고 1 x 106 세포를 취하여 300 g로 3분간 원심분리하였다. 원심분리 후 침전된 세포가 손상되지 않도록 주의하여 파스테르 피펫으로 상층액을 0.2-0.3 ㎖만 남기고 제거하였다. 상기 침전된 세포에 100 ci Na2 51CrO4 (1 ㎖ Ci/㎖, NEZ 030S, NEN, USA)을 첨가하여 37 ℃ 진탕항온조에서 1시간 동안 표지화시킨 후, 기본배지로 3회 세척하였다. 이후, 트립판블루 색소배제법으로 생존세포를 계수한 후 표지화된 표적세포를 5×104 세포/㎖ 되게 완전배지에 재부유시켰다.
바닥이 둥근 96웰 미세적정판의 각 웰당 상기 표지화된 표적세포 5×103개가 들어가도록 0.1 ㎖씩 분주하고, 비장세포를 반응세포:표적세포의 비율이 100:1이 되게 반응세포를 0.1 ㎖씩 첨가한 후, 37℃, 5% CO2 항온항습기에서 4시간 배양하였다. 각 실험당 최고 3개 이상의 웰을 만들고 4시간 배양이 끝난 후 500 g로 15분간 원심분리한 후, 각 웰에서 상층액 0.1 ㎖을 취하여 감마카운터(Packard, USA)로 방사능을 측정하였다. 이때 최대 방출을 유발하기 위하여 대조웰에 5% 트리톤 X-100(Sigma, USA)을 0.1 ㎖ 가하였고, 자연방출량을 측정하기 위하여 표지화된 세포만을 같은 용량의 완전배지에서 배양시켰다. 세포독성능은 다음 공식에 의하여 산출하였다.
계산식 2
세포독성[Cytotoxicity](%) = (ER-SR / MR-SR) X 100
ER : 실험군의 평균 카운트(cpm)
SR : 배지만 배양한 타겟세포의 평균 카운트(cpm)
MR : 5% 트리톤 X-100으로 처리한 타겟세포의 평균 카운트(cpm)
그 결과, Sarcoma 180 세포주의 경우 비 면역세포에 비해 7.2배 증가된 세포용해능을 보였으며 BCG (Bacillus Calmette-Gu) 투여군 보다는 약 1.3배 우세한 결과를 보여주었다. 또한, MBT-2 세포주에서는 비 면역세포에 비해 5.2배 증가된 세포용해능을 보였으며 BCG 투여군에 비하여는 약 1.3배 우세한 결과를 나타냈다(표 2). 이는 각종 부작용이 보고되고 있는 BCG의 대용 항암치료제로서 올리고데옥시뉴클레오타이드 + dLOS 조합의 가능성을 나타낸다고 할 수 있다.
사코마 180
투여일 0 3 7 15
대조군 100 100 100 100
BCG 96 ± 4 108 ± 3 561 ± 16 121 ± 8
DNA+dLOS 95 ± 7 139 ± 3 721 ± 15 118 ± 7
MBT-2
대조군 100 100 100 100
BCG 101 ± 2 107 ± 6 398 ± 14 105 ± 6
DNA+dLOS 103 ± 4 118 ± 7 521 ± 16 114 ± 3
<6-5> 방광암 마우스 모델을 이용한 올리고데옥시뉴클레오타이드 + dLOS 조합의 항암 치료 효과 측정
MBT-2 세포주를 이용하여 방광암을 야기시킨 C3H/HeJ 마우스(자성, 4주령, 19-21 g)를 이용하여 dLOS와 DNA 조합의 방광암에 대한 치료효과를 확인하였다. dLOS+DNA, BCG 및 PBS의 투여는 종양 세포주 이식 다음날부터 시작하였으며, 첫 1주일 동안은 매일, 다음 2주일 동안은 2일 간격으로, 총 13회에 걸쳐 투여하였다. 투여부위는 우측 옆구리(right flank)이며, 투여경로는 피하주사방법을 이용하였다. 방광암에 대한 치료효과는 암병변의 수직 직경(perpendicular diameter)측정, 실험군별 폐사율을 비교함으로서 확인하였다.
세부 실험방법은 마우스 입식 후 1주일 동안 환경적응기를 거친 후, 0일(Day 0)에 MBT-2 방광암 세포주를 5 x 105세포/100 ㎕농도로 마우스의 오른쪽 옆구리에 피하이식 하였다. 암세포 이식 후 1일째부터 1주일간 dLOS+DNA, BCG 또는 PBS를 종양세포주 투여부와 동소에 매일 피하주사하고, 이후 2주일간 2일 간격으로 주사하였다. 10일째부터 40일째까지 2일 간격으로 병변의 수직직경을 측정함과 동시에 페사율을 확인하였다(도 10a 및 10b). 도 10a 및 10b에서 알 수 있는 바와 같이, dLOS와 DNA의 혼합이 BCG보다 강한 항암효과를 보이는 것을 확인할 수 있었다.
실시예 7 : 변이대장균으로부터 정제한 dLOS 구조의 안정성
변이대장균으로부터 유기용매를 이용하여 생산된 dLOS는 작은 사이즈와 명확한 구조를 가진 규정된 형태로 생산되며, 대량생산 시스템을 이용한 대량생산 또한 가능하다.
<7-1> MALDI - TOF
1) 샘플 전처리
DHB (2,5-디하이드록시벤조산) 매트릭스는 10 ㎎/㎖ (50 % 메탄올 및 0.1 % 트리플루오로아세트산)의 농도로 준비한 후 샘플/매트릭스를 1/10-1/100 비율로 섞어 타겟 플레이트에 점적한다. 양성모드 분석을 위한 시료는 DHB 에 0.01 M NaCl을 첨가하였다.
2) MALDI-MS 분석
기기는 오토플렉스(Bruker Daltonics사) MALDI-TOF를 사용하였다. 시료 분석 시, 선형모드(Linear mode)와 대칭모드(Reflect mode)를 사용할 수 있는데 선형모드의 경우, 분해능은 떨어지나 감도(sensitivity)가 좋아 큰 분자량의 시료분석에 유리하고, 대칭모드의 경우, 감도는 낮지만 분해능이 월등하여 작은 분자량의 시료분석에 유리하다. 분석 전, 각 분석 질량 범위에 맞게 Bruker Daltonics사에서 제공하는 펩타이드와 단백질 표준물질을 선택하여 질량 값을 보정(calibration)하였다. 각 데이터의 레이저 샷(laser shot)은 3000으로 하여 얻어졌다. 얻어진 데이터는 FlexAnalysis (Bruker Daltonics)로 분석하였다.
당쇄를 포함하고 있는 dLOS 시료의 특성을 고려하여 고 에너지 조건의 이온화법인 MALDI-TOF/MS를 시행하여 전체적인 구조를 이루는 당 성분을 포함한 전체 구조를 이루는 분자들의 단편화(fragmentation) 패턴을 분석하였다.
MALDI-TOF/MS 분석을 실시한 결과, dLOS는 m/z 2824에 뚜렷한 분자이온의 피크가 검출되었다. 한편 m/z 1233과 1455에서 검출된 다른 프래그먼트 이온(fragment ion)은 베이스 이온(base ion)에 비하여 매우 낮은 강도(intensity)를 나타내었다. 이러한 피크들의 정보로부터 dLOS를 구성하는 당과 지질 성분에 대한 추가적인 정보를 알아내었으며 이러한 피크들은 이온화 과정에서 해리되는 당과 지질 성분들로 추정하였다.
일반적으로 지질이 포함된 구조의 물질 분석에서는 지질에 존재하는 COOH 혹은 포스페이트(phosphate)에 Na가 결합하여 발생될 수 있는 폴리머 패턴을 확인 할 수 있다. 분석된 피크를 확대해서 확인하면 폴리머 패턴이 처음 시작되는 m/z 값은 m/z 2804 이고 이로부터 22 씩 분자량이 증가하는 패턴을 확인 할 수 있으며, 그 결과로 미루어 보아 dLOS의 총 분자량은 m/z 2804로 결정되었다(도 11).
<7-2> 과메틸화 ( permethylation ) 에 의한 MS / MS
정제한 dLOS 1 mg/㎖의 시료에 2 % 아세트산을 첨가하여 1 ㎖의 시료를 만들어 100℃에서 1시간 동안 가열한 후 상온으로 냉각하였다. C18 역상컬럼을 이용하여 시료를 적재하고 5 % 아세트산으로 용리하여 시료를 얻은 후 회전 증발기로 건조하였다. 건조된 시료를 아이오도메탄(iodomethane)을 이용하여 과메틸화 시키고 이를 건조한 다음 0.1 mM NaOH에 용해시켜 질량분석기로 시료를 도입하였다.
도입된 시료의 질량스펙트럼에서 질량분석기의 전체 이온 맵핑(total ion mapping) 기능을 이용하여 질량스펙트럼에 대한 탠덤(tandem) MS의 데이터를 얻어 MS/MS스펙트럼을 분석하였다. 이후 m/z 1046에서 여러 프래그먼트 이온을 얻어 시료의 가능한 구조적 분석을 시도하였다. 일반적인 LPS의 코어(core)구조에서 프래그먼트 이온의 분리 패턴을 활용하여 직선형의 분자구조를 분석하였으며, 추가로 당쇄의 구조를 결정하기 위하여 MALDI-TOF/MS를 수행하였다. 선형모드 분석의 m/z 1842에서 베이스 피크가 검출되었다. 검출된 베이스 피크에 대한 구조분석을 위해 대칭모드 분석에서 얻어진 베이스 피크의 정보로부터 dLOS의 아실기를 동정하였다. 위의 결과들로부터 dLOS는 도 12에서 제시하는 당과 지질의 골격 구조를 갖는 것으로 동정되었으며, 몇 가지 가능한 당쇄 사슬의 구조로 하나의 당쇄 구조가 확인되었다(도 12).
<7-3> GC - MS
시료를 메탄올 하의 HCl에 넣고 80℃에서 18시간동안 반응시켜 가수분해 및 에스테르화 시켰다. 상기 반응물에 증류수를 첨가한 후, 헥산으로 유도체화된 산(derivatized acid)를 추출하여 분리된 층의 유기용매를 제거하였다. 추출된 잔기들을 드라이 피리딘(1 ㎖)에 다시 녹이고, BSTFA-TMCS [N,O-비스(트리메틸실릴)트리플루오로아세트아미드]-트리메틸클로로실레인](Supelco, 200 ㎕)을 첨가한 후 75℃에서 1시간동안 반응시켜 반응샘플을 GC-MS (Agilent)로 분석하였다.
dLOS시료에서 지질만 특이적으로 분리 후 GC-MS를 이용해서 해당 지질의 구조를 분석하였으며, 지질 데이터베이스(http://lipidlibrary.aocs.org/ms/arch_me/index.htm #hydroxy)를 이용해서 dLOS 시료에서 특이적으로 분리한 지질 분석 결과를 비교분석한 결과 도 13과 같은 구조(3-히드록시테트라데카노이트 트리메틸실릴 에스테르)가 확인되었다.
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
한국미생물보존센터(국외) KCCM11218P 20111109

Claims (22)

  1. 분자량 2,000-5,000 Da의 리포올리고사카라이드를 생산하고, 상기 리포올리고사카라이드는 다음 화학식 1로 표시되는 당쇄 사슬을 포함하는 것을 특징으로 하는 대장균(Escherichia coli) 균주:
    화학식 1
    Figure pat00005

    상기 화학식에서, Hex는 헥소오스이고, Hep는 헵토오즈이며, Kdo는 2-케토-3-디옥시-옥토네이트이고, HexNAc는 N-아세틸 헥소사민이며, P는 포스페이트이다.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 대장균 균주의 염색체 DNA는 분쇄에 의해 면역촉진(immunostimulatory) 활성을 갖는 올리고데옥시뉴클레오타이드를 생성하는 것을 특징으로 하는 대장균 균주.
  3. 제 1 항에 있어서, 상기 리포올리고사카라이드는 3-히드록시테트라데카노이트 트리메틸실릴 에스테르의 지질을 포함하는 것을 특징으로 하는 대장균 균주.
  4. 제 1 항에 있어서, 상기 대장균 균주는 대장균 EG0023(KCCM11218P)인 것을 특징으로 하는 대장균 균주.
  5. 다음 화학식 1로 표시되는 당쇄 사슬을 포함하고 분자량 2,000-5,000 Da인 디아실리포올리고사카라이드를 유효성분으로 포함하는 면역보조(adjuvant) 조성물:
    화학식 1
    Figure pat00006

    상기 화학식에서, Hex는 헥소오스이고, Hep는 헵토오즈이며, Kdo는 2-케토-3-디옥시-옥토네이트이고, HexNAc는 N-아세틸 헥소사민이며, P는 포스페이트이다.
  6. 제 5 항에 있어서, 상기 디아실리포올리고사카라이드는 3-히드록시테트라데카노이트 트리메틸실릴 에스테르의 지질을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  7. 제 5 항에 있어서, 상기 면역보조 조성물은 상기 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항의 대장균 균주의 염색체의 올리고데옥시뉴클레오타이드를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  8. 제 7 항에 있어서, 상기 면역보조 조성물은 디아실리포올리고사카라이드 및 올리고데옥시뉴클레오타이드의 중량비가 1:0.005 내지 1:200인 것을 특징으로 하는 조성물.
  9. 제 7 항에 있어서, 상기 면역보조 조성물은 NF-κB를 활성화시킴으로써 인터루킨-8 및 인터루킨-12 프로모터의 활성을 증가시키는 것을 특징으로 하는 조성물.
  10. 제 7 항에 있어서, 상기 조성물은 헬퍼 T 세포 1의 인터페론-γ 및 인터루킨-12p40의 분비를 증가시키는 것을 특징으로 하는 면역 보조 또는 증강용 조성물.
  11. (a) 항원; 및 (b) 면역촉진(immunostimulatory) 성분으로서 다음 화학식 1로 표시되는 당쇄 사슬을 포함하고 분자량 2,000-5,000 Da인 디아실리포올리고사카라이드를 유효성분으로 포함하는 백신 조성물:
    화학식 1
    Figure pat00007

    상기 화학식에서, Hex는 헥소오스이고, Hep는 헵토오즈이며, Kdo는 2-케토-3-디옥시-옥토네이트이고, HexNAc는 N-아세틸 헥소사민이며, P는 포스페이트이다.
  12. 제 11 항에 있어서, 상기 디아실리포올리고사카라이드는 3-히드록시테트라데카노이트 트리메틸실릴 에스테르의 지질을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  13. 제 11 항에 있어서, 상기 백신 조성물은 상기 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항의 대장균 균주의 염색체의 올리고데옥시뉴클레오타이드를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  14. 제 13 항에 있어서, 상기 백신 조성물은 디아실리포올리고사카라이드 및 올리고데옥시뉴클레오타이드의 중량비가 1:0.005 내지 1:200인 것을 특징으로 하는 조성물.
  15. 제 13 항에 있어서, 상기 백신 조성물은 혈청 내의 전체 IgG 및 IgG2a 양을 증가시키는 것을 특징으로 하는 조성물.
  16. 제 13 항에 있어서, 상기 백신 조성물은 NF-κB를 활성화시킴으로써 인터루킨-8 및 인터루킨-12 프로모터의 활성을 증가시키는 것을 특징으로 하는 조성물.
  17. 제 13 항에 있어서, 상기 백신 조성물은 헬퍼 T 세포 1의 인터페론-γ 및 인터루킨-12p40의 분비를 증가시키는 것을 특징으로 하는 조성물.
  18. 다음 화학식 1로 표시되는 당쇄 사슬을 포함하고 분자량 2,000-5,000 Da인 디아실리포올리고사카라이드를 유효성분으로 포함하는 항암제 또는 항암 보조제 조성물:
    화학식 1

    상기 화학식에서, Hex는 헥소오스이고, Hep는 헵토오즈이며, Kdo는 2-케토-3-디옥시-옥토네이트이고, HexNAc는 N-아세틸 헥소사민이며, P는 포스페이트이다.
  19. 제 18 항에 있어서, 상기 디아실리포올리고사카라이드는 3-히드록시테트라데카노이트 트리메틸실릴 에스테르의 지질을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  20. 제 18 항에 있어서, 상기 항암제 또는 항암 보조제 조성물은 상기 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항의 대장균 균주의 염색체의 올리고데옥시뉴클레오타이드를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  21. 제 20 항에 있어서, 상기 항암제 또는 항암 보조제 조성물은 디아실리포올리고사카라이드 및 올리고데옥시뉴클레오타이드의 중량비가 1:0.005 내지 1:200인 것을 특징으로 하는 조성물.
  22. 제 18 항에 있어서, 상기 암은 섬유육종, 방광암, 뇌하수체선종, 신경교종, 뇌종양, 상인두암, 후두암, 흉선종, 중피종, 유방암, 폐암, 위암, 식도암, 대장암, 간암, 췌장암, 췌내분비종양, 담낭암, 음경암, 요관암, 신세포암, 전립선암, 비호지킨성림프종, 골수이형성증후군, 다발성골수종, 형질세포성종양, 백혈병, 소아암, 피부암, 난소암 또는 자궁경부암인 것을 특징으로 하는 조성물.
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