KR20120094017A - 비-ｄｎａ 염기-함유 폴리뉴클레오타이드 조성물 및 면역 반응을 조절하기 위한 그의 용도 - Google Patents

비-ｄｎａ 염기-함유 폴리뉴클레오타이드 조성물 및 면역 반응을 조절하기 위한 그의 용도 Download PDF

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니젤 씨. 필립스
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바이오니취 라이프 사이언시즈 인코포레이티드
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Abstract

본 발명은 약학적으로 허용가능한 비히클, 특히 하나 이상의 애주번트 비히클 및 하나 이상의 항원과 조합하여 하나 이상의 비-DNA 염기를 포함하는 길이가 3 내지 30개의 염기인 합성의 비-DNA 염기-함유 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 조성물을 제공한다. 본 발명은 생체 내 또는 시험관 내에서 면역 반응을 유도 또는 조절하기 위한, 특히 항원 제시 세포를 활성화시키기 위한 방법에서 상기 조성물의 용도에 관한 것이다.

Description

비-ＤＮＡ 염기-함유 폴리뉴클레오타이드 조성물 및 면역 반응을 조절하기 위한 그의 용도{NON-DNA BASE-CONTAINING POLYNUCLEOTIDE COMPOSITIONS AND THEIR USE FOR THE MODULATION OF IMMUNE RESPONSES}
본 발명은 합성의 비-DNA(non-DNA) 염기-함유 폴리뉴클레오타이드, 약학적으로 허용가능한 비히클 및 선택적으로 하나 이상의 항원을 포함하는 조성물, 및 면역 반응을 조절하기 위한 그들의 용도에 관한 것이다.
미생물 위험 요소 및 세포 스트레스의 적절한 인식은 이들이 특화된 면역 세포의 활성화, 보충 및 국소 방어 메커니즘의 활성화를 유도하므로 숙주 생존 유지에 필수적이다. 따라서, 내재 면역계(innate immune system)의 다른 세포뿐만 아니라 항원 제시 세포(antigen presenting cell: APC)는 소위 "패턴 인식 수용체"(pattern recognition receptors; PRR)라 불리는 것을 사용해서 상기와 같이 하기 위한 다양한 수단을 발달시켰다. 상기 PRR는 큰 집단의 미생물에 의해 공유되지만, 숙주에서 확인되는 것과는 다른 병원체(박테리아, 마이코박테리아, 바이러스)의 핵산 또는 세포 벽 성분과 같은 비-조작 항원(non-processed antigens)에서의 분자 패턴(병원체-관련 분자 패턴 또는 PAMP)을 인식한다. APC는 CD14, 만노스 수용체, DEC 205 및 톨-유사 수용체(TLR)의 군을 포함하는 PRR을 발현시킬 수 있다. APC는, 이하에 열거하는 것들로 반드시 제한되지는 않지만, 전문적인 APC, 예컨대 골수양 및 형질세포양 수지상 세포, 모노사이트, 마크로파지, 랑게르한스 세포, B 림프구, T 림프구, 쿠퍼 세포, 미세아교 세포, 슈반 세포 및 내피 세포; 및 비-전문적인 APC, 예컨대 이제 제한되지는 않지만 상피 세포, 섬유아 세포, 멜라닌 세포, 신경 세포, 평활근 세포, 근육 세포, 간세포, 성상 세포 및 각질 형성 세포를 포함한다. 종래 문헌에서, 미생물 유래가 통상적인 물질, 또는 이의 변형물은 흔히 비특이적 방식으로 면역 반응을 자극하기 위해 사용되었다. 예를 들면 프로인트 애주번트(Freund's adjuvant) 중의 마이코박테리아, LPS, 모노포스포릴 지질 A(LPS의 독성이 적은 유도체) 및 트레할로스 다이마이콜레이트(마이코박테리아로부터의 마이콜산 종)의 결합물, 폴리(I:C), 바이러스 dsRNA의 합성 유사체 및 CpG 다이뉴클레오타이드 모티프를 함유하는 재발성 DNA 서열을 포함한다. 최근 몇몇 문헌에서는 비(非)메틸화 CpG 모티프(CpG)를 함유하는 합성 면역자극 폴리뉴클레오타이드의 용도를 개시하고 있다. 두 개의 합성 이미다조퀴놀린 화합물[레시퀴모드(Resiquimod) 및 이미퀴모드(Imiquimod)]도 또한 면역자극 활성을 갖는다. 톨-유사 수용체(TLR)는 면역 애쥬번트로서 작용할 수 있는 다수의 천연 및 합성 분자와 상호작용하는 것으로 공지되어 있다. 이러한 분자의 예로는 폴리(I:C) 폴리뉴클레오타이드 리포폴리사카라이드 및 CpG-함유 폴리뉴클레오타이드가 있다. 위에서 설명된 바와 같이, 주어진 화합물에 의해 사용되는 특이적 TLR이 동정되어 있다(즉, TLR9는 CpGs를 인식함).
합성 폴리뉴클레오타이드는 다음이온 서열이다. 합성 폴리뉴클레오타이드는 선택적으로 핵산, 특이적 세포 단백질, 특이적 핵 단백질 또는 특이적 세포 표면 수용체와 결합하는 것으로 보고되어 있다. 적어도 하나의 비메틸화 CpG 다이뉴클레오타이드를 함유하는 8 내지 100 염기의 합성 포스포로티오에이트 폴리뉴클레오타이드는 면역계를 자극하는 것으로 확인되었다(미국 특허 제6,239,116호). 특히, CpG 모티프(5'퓨린-퓨린-사이토신-구아닌-피리미딘-피리미딘3')를 함유하는 합성 포스포로티오에이트 폴리뉴클레오타이드는 사이토카인, 예컨대 IL-6, IL-12, IFN-감마, TNF-알파 및 GM-CSF의 합성, 자연 살생 세포의 용균 활성 및 B 림프구의 증식을 자극하는 것으로 확인되었다(Krieg, Annual Rev. Immunol. 2002, 20:709-760). 염기 수가 14 이상인 CpG 모티프를 포함하는 합성 포스포로티오에이트 폴리뉴클레오타이드는 수지상 세포의 성숙 및 활성을 촉발시키고; 세포 크기 및 입도를 증가시키며; IL-12를 합성하고; 내포 작용을 증가시키며; 세포 표면 분자 MHC II, CD40, CD80, CD83 및 CD86을 상향 조절하는 것으로 보고되어 있다(Sparwasser et al. Eur. J. Immunol. 1998, 28:2045-205; Hartman et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1999, 96:9305-9310; Askew et al. J. Immunol. 2000, 165:6889-6895). 염기 수가 30인 CpG 모티프를 포함하는 합성 포스포다이에스터 폴리뉴클레오타이드는 DC 전구물질 상의 CD80 및 CD86의 발현을 상향 조절하고, IFN의 합성을 자극하는 것으로 보고되어 있다(Kadowaski et al. J. Immunol. 2001 166:2291-2295).
본 발명자들은 이전에 (GxTy)n, (TyGx)n, a(GxTy)n, a(TyGx)n, (GxTy)nb, (TyGx)nb, a(GxTy)nb 및 a(TyGx)nb(여기서, x 및 y는 1 내지 7의 정수이며, n은 1 내지 12의 정수이고, a 및 b는 As, Cs, Gs 또는 Ts 중 하나 이상임)로 이루어진 군으로부터 선택된 2 내지 20 염기 3'-OH, 5'-OH 합성 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 조성물을 기재하였으며, 상기 폴리뉴클레오타이드는 2 내지 20 염기이다. 이러한 조성물은 세포 주기 정지의 유도, 증식 억제, 전환효소 활성의 유도, 세포자살의 유도 및 모노사이트 및 말초혈액 단핵구 세포에 의한 사이토카인 합성의 자극으로 이루어진 군으로부터 선택된 반응을 유도한다(PCT 공개 번호 WO 01/44465 참조).
따라서, 부적절한 사이토카인 유도의 부재에 보다 효과적인 면역성 반응을 위한 APC의 성숙을 유도하는 관련 방법 및 화합물이 필요하다. 이러한 화합물은 특히 항원 또는 항원들 공급이 적고 백신의 효험이 효과적이고 보호적인 것 둘 다에 필요한 환경하에 항원에 대항하는 효과적이고 적당한 면역 반응을 끌어내는 능력이 있어야 한다.
특별히 필요한 것은 효과적인 면역 애주번트 반응을 획득하기 위해서 APC를 포함하는 면역 세포의 기능을 조절하기 위해 이러한 조성물을 사용하기 위한 방법 및 신규의 비-DNA 염기-함유 폴리뉴클레오타이드 조성물이다.
본 발명은 하나 이상의 비-DNA 염기를 포함하는 길이가 3 내지 30 염기의 합성의 비-DNA 염기-함유 폴리뉴클레오타이드 및 약학적으로 허용가능한 비히클, 예를 들면 애주번트를 포함하는 조성물을 제공함으로써 이러한 필요성을 충족시킨다. 이러한 폴리뉴클레오타이드를 여기서는 비-DNA 염기-함유 폴리뉴클레오타이드라고 한다. 하나의 실시형태에서, 본 발명은 하나 이상의 비-DNA 염기를 포함하는 길이가 3 내지 20 염기인 합성의 비-DNA 염기-함유 폴리뉴클레오타이드를 제공한다. 또 다른 실시형태에서, 본 발명은 하나 이상의 비-DNA 염기를 포함하는 길이가 3 내지 9 염기인 합성의 비-DNA 염기-함유 폴리뉴클레오타이드를 제공한다. 또한, 본 발명은 하나 이상의 네뷸라린(nebularine) 염기, 하나 이상의 하이포크산틴 염기, 또는 하나 이상의 유라실 염기 또는 네뷸라린, 하이포크산틴 및 유라실 염기의 결합물을 포함하는 길이가 3 내지 30, 3 내지 20 또는 3 내지 9 염기인 합성의 비-DNA 염기-함유 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 조성물을 제공한다. 이러한 폴리뉴클레오타이드는 선택적으로 하나 이상의 구아닌 염기, 또는 하나 이상의 티민 염기, 또는 하나 이상의 아데닌 염기, 또는 하나 이상의 사이토신 염기 또는 이의 결합물을 추가로 포함한다.
본 발명은 선택적으로 하나 이상의 항원과 결합해서 하나 이상의 비-DNA 염기-함유 폴리뉴클레오타이드 및 약학적으로 허용가능한 비히클, 예를 들면 애주번트를 포함하는 신규의 조성물을 제공한다. 이러한 조성물은 생체 내 또는 시험관 내의 면역 반응을 조절하는데 유용하다. 이러한 조절은 면역 반응을 증가 또는 감소시킬 수 있다. 본 발명의 몇몇 조성물은 약학적으로 허용가능한 비히클, 예를 들면 하나 이상의 애주번트와 결합한 하나 이상의 비-DNA 염기-함유 폴리뉴클레오타이드로서 백신 제제에 사용되는 항원의 용량을 낮추며, 하나 이상의 항원은 항원의 용량을 낮추는데 효과적인 면역 반응을 생성한다.
본 발명은 또한 면역 반응을 유도하기 위해 생체 내 또는 시험관 내에서 조성물을 투여함으로써 이러한 조성물을 사용하는 방법을 제공한다. 또한, 본 발명의 조성물은 하나 이상의 치료제와 함께 투여될 수 있다. 본 발명의 조성물의 이러한 투여는 의료 또는 수의학 분야에서 당 업에 통상의 지식을 가진 사람에게 공지되어 있는 하나 이상의 치료제를 투여하기 이전, 투여 중 또는 투여 이후에 이루어질 수 있다. 의료 또는 수의학 분야에서 당 업에 통상의 지식을 가진 사람에게 공지되어 있고, 질병을 치료하기 위해 이용되는 임의의 치료제는 이러한 조성물과 결합해서 사용될 수 있다.
하나의 실시형태에서, 본 발명은 길이가 3 내지 30, 3 내지 20 또는 3 내지 9 염기의 합성 5'-OH, 3'-OH 비-DNA 염기-함유 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 조성물을 제공한다. 추가의 실시형태에서, 이러한 비-DNA 염기-함유 폴리뉴클레오타이드는 포스포다이에스터인 포스페이트 백본 또는 다른 적당한 변형을 포함한다. 본 a명세서 전반에 걸쳐 비-DNA 염기-함유 폴리뉴클레오타이드라는 용어는 5'-OH 또는 3'-OH 폴리뉴클레오타이드를 의미하는 것으로 이해된다.
추가의 실시형태에서, 비-DNA 염기-함유 폴리뉴클레오타이드의 5'-OH 또는 3'-OH 말단은 세포내 또는 세포외 분해로부터 보호하기 위해 변형될 수 있다. 하나의 예로서, 비-DNA 염기-함유 폴리뉴클레오타이드의 5'-OH 또는 3'-OH 말단은 이에 제한되지는 않지만 트라이에틸렌글리콜 (TGE)-콜레스테릴을 포함할 수 있다. 이에 제한되지는 않지만, 하나 또는 둘 다의 말단에 첨가되어 분자의 고유 활성, 즉 이의 면역 애주번트 활성에 실질적으로 영향을 주지 않도록 할 수 있는 아데닌(A), 구아닌(G), 사이토신(C) 또는 티민(T)을 포함하는 염기를 함유하는 추가의 뉴클레오타이드를 사용할 수 있다. 하나 또는 둘 다의 말단에 첨가되어 분자의 고유 활성, 즉 면역 애주번트 활성에 실질적으로 영향을 주지 않도록 할 수 있는 네뷸라린(Neb), 하이포크산틴(I) 및 유라실(U)로부터 선택된 추가의 비-DNA 염기를 함유하는 추가의 뉴클레오타이드를 사용할 수 있다.
하나의 실시형태에서, 폴리뉴클레오타이드의 포스페이트 백본은 포스포다이에스터 백본이다. 또 다른 실시형태에서, 폴리뉴클레오타이드의 포스페이트 백본은 변형된 포스포로티오에이트 백본이다. 다른 실시형태에서, 폴리뉴클레오타이드의 포스페이트 백본은 아미노 백본이거나, 또는 리보스 또는 2'-데옥시리보스 부분의 변형을 포함한다. 바람직하게, 상기 5'-OH, 3'-OH 폴리뉴클레오타이드는 합성되며, 비-DNA 염기, 예컨대 이에 제한되지는 않지만 네뷸라린(Neb), 하이포크산틴(I) 또는 유라실(U)을 포함한다. 상기 하이포크산틴 염기는 뉴클레오타이드에 존재하는 경우에는 이노신(예를 들면, 이노신 모노포스페이트-IMP)으로 나타내며, 여기서는 "I"로 규정한다. 하나의 실시형태에서, 상기 비-DNA 염기-함유 폴리뉴클레오타이드는 NebGGTGNeb(서열 번호: 1), UUGTUU(서열 번호:2), IIGTII(서열 번호: 3), GNebG(서열 번호: 4), GGGTGGNebNebNeb(서열 번호: 5), GIG(서열 번호: 6), GGGTGGIII(서열 번호: 7), GUG(서열 번호: 8) 및 GGGTGGUUU(서열 번호: 9)로 이루어진 군으로부터 선택된다. 상기 비-DNA 염기-함유 폴리뉴클레오타이드는 시험관 내, 또는 인간 또는 동물의 생체 내로 투여되는 경우에 면역 반응을 생성한다. 상기 면역 반응은 전신 또는 국소에 영향을 줄 수 있다. 하나의 실시형태에서, 상기 비-DNA 염기-함유 폴리뉴클레오타이드는 폴리뉴클레오타이드가 투여되는 인간 또는 동물에서 APC를 자극한다. 상기 비-DNA 염기-함유 폴리뉴클레오타이드는 또한 APC의 자극을 위해 시험관 내에서 직접적으로 APC에 투여될 수도 있다. 다음에 자극된 APC는 인간 또는 동물에서 면역 반응의 활성화를 위해 APC가 유래되는 인간 또는 동물에 투여될 수 있다.
APC에 투여되는 경우 본 발명의 비-DNA 염기-함유 폴리뉴클레오타이드는 예를 들면 IL-1β, IL-6, IL-12, MCP-1, RANTES, 및 APC에 의한 기타 사이토카인 및/또는 케모카인 및/또는 조혈 성장 인자의 생성 증가로 이루어진 군으로부터 선택된 반응을 유도함으로써 APC를 자극할 수 있다.
본 발명은 추가로 동물 또는 인간의 면역 반응의 자극, 및 보다 바람직하게는 동물 또는 인간의 하나 이상의 APC의 자극을 유도하기 위한 유효량으로 인간 또는 동물에 비-DNA 염기-함유 폴리뉴클레오타이드 및 약학적으로 허용가능한 비히클을 포함하는 조성물을 투여하는 방법을 제공한다. 하나의 실시형태에서, 바람직한 APC는 수지상 세포와 같은 전문적인 APC이다. 또 다른 실시형태에서, 하나 이상의 항원이 비-DNA 염기-함유 폴리뉴클레오타이드 및 약학적으로 허용가능한 비히클을 포함하는 조성물에 더해서 동물 또는 인간에 투여되어 동물 또는 인간에서 항원 특이적 면역 반응을 수득한다. 바람직한 항원은 암 항원, 박테리아 항원, 곰팡이 항원, 바이러스 항원 또는 자기 항원, 예컨대 이에 제한되지는 않지만 간염 표면 항원, 불활성화 또는 약화된 비리온 형태의 H1N1 항원, 온전한 마이코박테리아 형태로 마이코박테리움 보비스 균주 bacillus Calmette Guerin(BCG) 또는 하나 이상의 항원성 결정인자, 기생충 항원, 식물 항원 또는 자기-항원으로 이루어진 서브유닛 항원이다. 몇몇 실시형태에서, 하나 이상의 APC의 자극으로 동물 또는 인간에서 전신 면역 반응이 수득된다. 다른 실시형태에서, 상기 면역 반응은 국소에 영향을 준다. 본 발명은 또한 동물 또는 인간에서 면역 반응 자극을 유도하는데 효과적인 양으로 동물 또는 인간에 면역자극 제제 또는 양상일 수 있는 비-DNA 염기-함유 폴리뉴클레오타이드 및 약학적으로 허용가능한 비히클을 포함하는 조성물을 투여하는 방법을 포함한다. 본 발명은 또한 선택적으로 하나 이상의 애주번트와 함께, 하나 이상의 비-DNA 염기-함유 폴리뉴클레오타이드 및 약학적으로 허용가능한 비히클의 하나 이상의 항원의 감소된 양을 포함하는 조성물을 투여하여 효과적인 면역 반응을 획득하고 이에 따라 항원의 공급이 적고 제조가 어렵고 비용이 많이 들 수 있는 항원 절약형 전략을 최적화하는 방법을 제공한다.
본 발명은 또한 상기에서 인용한 것과 같이, 하나 이상의 항원을 함유하는, APC 및 바람직하게는 DC에 비-DNA 염기-함유 폴리뉴클레오타이드 및 약학적으로 허용가능한 비히클을 포함하는 조성물을 시험관 내에서 투여하는 단계를 포함하는 방법을 제공하며, 이러한 투여로 APC가 자극된다. 상기 방법은 동물 또는 인간에서 면역 반응을 자극하기 위해 APC가 유래되는 동물 또는 인간에 자극된 APC를 도입시키는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 면역 반응을 자극하기 위해서 선택적으로 하나 이상의 항원을 함유하는, 비-DNA 염기-함유 폴리뉴클레오타이드 및 약학적으로 허용가능한 비히클을 포함하는 이러한 조성물의 예상치 못한 놀라운 능력이 동물 및 인간을 위한 중요한 이점을 제공한다.
여기서 기재하는 방법은 이에 제한되지는 않지만 암과 같은 질병의 치료, 알러지 치료, 다양한 병원체에 대항하여 동물 또는 인간의 백신 접종, 자가면역 질환의 치료 및 이식 거부의 예방을 위해 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명은 이에 제한되지는 않지만 감염성 질환, 암, 자가면역 질환, 및 이에 제한되지는 않지만, 탄저륜, 보툴리눔 식중독, 전염병, 야토병, 두창 및 바이러스성 출혈열을 포함하는, 바이러스, 박테리아 및 독소와 같은, 유기체의 의도적 전파에 의한 생화학 테러를 포함하는 다양한 질환의 예방 및 치료에 유용하다. 몇몇 실시형태에서, 본 발명으로 IL-12 합성을 증가시켜 이식 거부의 예방 및 자가면역 질환의 치료가 획득된다. IL-12가 합성되면 자가면역 질환, 이식 거부 및 이식편대 숙주 질환(GVHD), 및 알러지를 억제할 수 있다[예를 들면, Bagenstose et al ., J. Immunol . 1998; 160: 1612 (Downregulation of autoantibody production in autoimmunity by IL-12); Vogel et al ., Eur . J. Immunol ., 1996;26:219 (Inhibition of Bl lymphocyte, a B lymphocyte subset implicated in the development of autoimmunity, by IL-12); Dey et al ., Blood , 1998;91:3315 (Inhibition of graft-versus-host disease (GVHD) by IL-12); Smits et al , Int . Arch Allergy Immunol ., 2001; 126-102 (Modification of the pathogenic Th2 immune profile toward a Thl profile by IL-12 in the treatment of allergies) 참조]. 다른 실시형태에서, 본 발명으로 백신 접종을 통한 이식 거부의 예방 및 자가면역 질환의 치료가 획득된다[예를 들면 Zhang et al ., J. Mol . Med . 1996;74:653 (Vaccination against autoreactive B or T lymphocytes responsible for autoreactive diseases); Vignes et al ., Eur . J. Immunol ., 2000;30:2460 (Vaccination against alloreactive T lymphocytes responsible for graft rejection); Liu et al ., J. Exp . Med ., 2002;196:1013 (Induction of immune tolerance by delivery of dying cells to activated DC cells in situ) 참조].
따라서, 하나의 실시형태에서, 본 발명은 약학적으로 허용가능한 비히클과 결합해서, 하나 이상의 네뷸라린 염기, 하나 이상의 하이포크산틴 염기 또는 하나 이상의 유라실 염기, 또는 네뷸라린, 하이포크산틴 및 유라실 염기의 결합물을 포함하는, 길이가 3 내지 30, 3 내지 20 또는 3 내지 9 염기인 합성의 비-DNA 염기-함유 폴리뉴클레오타이드를 제공한다. 이러한 서열은 선택적으로 하나 이상의 구아닌 염기, 또는 하나 이상의 티민 염기, 또는 하나 이상의 아데닌 염기, 또는 하나 이상의 사이토신 염기, 또는 이의 결합물을 추가로 포함한다. 바람직하게 기재된 결합물로 상기 네뷸라린, 하이포크산틴, 유라실, 구아닌, 티민, 아데닌 및 사이토신 염기로 구성되는 폴리뉴클레오타이드는 포스포다이에스터 백본을 함유한다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명은 선택적으로 하나 이상의 항원 및 하나 이상의 애주번트와 결합한 약학적으로 허용가능한 비히클 중의 비-DNA 염기-함유 폴리뉴클레오타이드 중 하나 이상을 포함하는 조성물, 및 인간을 포함하는 동물에서 질환을 치료 또는 예방하기에 효과적인 방법에서의 이들의 용도를 제공한다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명은 동물 또는 인간에 백신 접종하기에 효과적인 방법 및 조성물을 제공한다. 이러한 조성물 및 방법의 이점은 소량의 항원을 이용해서 효과적인 면역 반응을 발생시키고, 보호물을 제공할 수 있다는 것이다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명은 종래의 애주번트와 함께 사용되는 경우 차선이 될 수 있다고 생각되는 항원 용량을 사용해서 동물 또는 인간에게 백신 접종을 하기 효과적인 조성물 및 방법을 제공한다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명은 동물 또는 인간의 질환을 치료 또는 예방하기에 효과적인 조성물 및 방법을 제공한다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명은 동물 또는 인간의 면역 반응을 자극하기에 효과적인 조성물 및 방법을 제공한다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명은 동물 또는 인간에서 APC, 및 바람직하게는 DC의 성숙 및/또는 활성화를 유도하는데 효과적인 조성물 및 방법을 제공한다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명은 동물 또는 인간에게 자극된 APC의 자가 조직 투여를 위해 항원을 함유하는 APC의 시험관 내 자극을 유도하기에 효과적인 조성물 및 방법을 제공한다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명은 IL-1β, IL-6, IL-12, MCP-1, RANTES, 및 APC에 의한 기타 사이토카인 및/또는 케모카인 및/또는 조혈 성장 인자의 생성을 증가시키기에 효과적인 조성물 및 방법을 제공한다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명은 기타 치료적 또는 면역조절 제제의 효과를 강력하게 하는 조성물 및 방법을 제공한다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명은 APC 및 바람직하게는 DC 상에 하나 이상의 사이토카인 효과를 강력하게 하는 조성물 및 방법을 제공한다.
본 발명의 이러한 실시형태는 첨부된 청구의 범위 및 개시된 실시형태의 하기 상세한 설명을 검토한 이후에 명백해 질 것이다.
하나의 실시형태에서, 본 발명은 하나 이상의 애주번트일 수 있는, 약학적으로 허용가능한 비히클 및 하나 이상의 비-DNA 염기-함유 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 물질의 신규 조성물을 제공한다. 하나의 실시형태에서, 본 발명은 선택적으로 하나 이상의 항원과 결합하여, 애주번트일 수 있는 약학적으로 허용가능한 비히클에 하나 이상의 비-DNA 염기-함유 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 물질의 신규의 조성물을 제공한다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명은 약물 제조에서 하나 이상의 비-DNA 염기-함유 폴리뉴클레오타이드 및 약학적으로 허용가능한 비히클 또는 부형제를 포함하는 이러한 조성물의 용도를 제공한다. 또 다른 실시형태에서, 본 발명은 약물 제조에서 선택적으로 하나 이상의 항원과 결합해서 하나 이상의 애주번트일 수 있는 약학적으로 허용가능한 비히클에 하나 이상의 비-DNA 염기-함유 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 이러한 조성물의 용도를 제공한다. 상기 약물은 하나 이상의 항원에 대한 면역 반응을 조절하기에 유용하다. 이러한 조절은 면역 반응의 감소 또는 면역 반응의 자극일 수 있다. 또 다른 실시형태에서, 이러한 약물은 하나 이상의 항원에 대한 효과적인 면역 반응을 생성하기 위해 소량의 하나 이상의 항원을 사용하여 이용되는 하나 이상의 항원의 양을 줄인다.
본 발명은 APC 자극 애주번트로서 작용하여 백신 항원에 대한 면역학적 반응을 강화시키는데 유용하다.
본 발명은 APC 상에서 활성화되어 면역학적 반응을 억제 또는 감소시키는데 유용하다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명은 선택적으로 하나 이상의 항원과 결합해서, 하나 이상의 비-DNA 염기-함유 폴리뉴클레오타이드 및 약학적으로 허용가능한 비히클 또는 부형제를 포함하는 조성물을 투여하는 단계를 포함하는 생체 내 또는 시험관 내 면역 반응을 자극하는 방법을 제공한다.
여기서 사용하는 "항원 제시 세포(APC)"라는 용어는 특이적 항원에 반응하기위해 T 세포를 준비시키는데 책임이 있는 신체의 항원-전달 세포로서 규정하며, 상기 T 세포는 추가로 T 헬퍼 세포 또는 세포 독성 T 세포와 같은 기능을 가질 수 있는 "효과인자(effector)" 세포 또는 "기억(memory)" T 세포로 분화된다. APC는 또한 병원체의 즉각적인 비-병원성 특이 사멸을 제공하는, 자연살 세포와 같은 선천적 면역계 세포를 포함하는 기타 면역 세포를 자극하는 것뿐만 아니라 T 세포 기능을 자극 및 유도하는 다양한 사이토카인 및 케모카인을 분비한다. APC는 이에 제한하지는 않지만, 모노사이트, 마크로파지, 상피 세포, 내피 세포, B 세포, 소교 세포, 과립구 세포, 형질세포양 수지상 세포, 및 골수 또는 모노사이트 수지상 세포를 포함한다. "수지상 세포" 및 "DC"라는 용어는 이에 제한되지는 않지만 간질 DC, 랑게르한스 세포-유래 DC, 형질세포양 DC 및 상기에서 기재한 세포의 임의의 전구물질을 포함한다.
본 발명은 합성의 비-DNA 염기-함유 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 조성물 및 이를 사용하는 방법을 제공한다. 길이가 3 내지 9, 3 내지 20 또는 3 내지 30 염기인 이러한 상기 폴리뉴클레오타이드는 하나 이상의 네뷸라린 염기, 하나 이상의 하이포크산틴 염기, 또는 하나 이상의 유라실 염기, 또는 네뷸라린, 하이포크산틴 및 유라실 염기의 결합물을 포함하는 하나 이상의 비-DNA 염기를 포함한다. 바람직한 실시형태에서, 신규의 합성 폴리뉴클레오타이드는 길이가 3 내지 9 염기이다. 이러한 서열은 선택적으로 하나 이상의 아데닌 염기, 사이토신 염기, 구아닌 염기 또는 티민 염기, 또는 이의 결합물 중 하나 이상을 추가로 포함할 수 있다. 바람직하게, 기재된 결합물로 네뷸라린, 하이포크산틴, 유라실, 구아닌, 티민, 아데닌 및 사이토신 염기로 구성되는 폴리뉴클레오타이드는 포스포다이에스터 백본을 함유한다. 이러한 서열 중 하나 이상은 조성물을 형성하기 위해서 허용가능한 비히클, 예컨대 약학적으로 허용가능한 비히클과 결합될 수 있다. 또한, 이러한 조성물은 하나 이상의 항원 및 선택적으로 약학적으로 허용가능한 비히클일 수 있는 하나 이상의 애주번트와 함께 결합될 수 있다. 이러한 조성물은 또한 목적하는 치료 반응을 발생시키는데 유용하도록 당 업에 통상의 지식을 가진 자에게 공지된 하나 이상의 치료 제제와 결합될 수도 있다.
이러한 조성물은 면역 반응을 유도하는데 유용하다. 하나의 실시형태에서, 선택적으로 하나 이상의 항원과 결합해서 약물학적으로 허용가능한 비히클 및 비-DNA 염기-함유 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 조성물은 동물 또는 인간에서 면역 반응을 유도하는데 효과적인 양으로, 동물 또는 인간에 투여된다. 하나의 실시형태에서, 선택적으로 하나 이상의 항원 및 하나 이상의 애주번트와 결합하여 비-DNA 염기-함유 폴리뉴클레오타이드 및 약물학적으로 허용가능한 비히클을 포함하는 조성물은 동물 또는 인간에 면역 반응을 유도하기에 효과적인 양으로 동물 또는 인간에 투여된다.
하기 표기법은 본 발명의 폴리뉴클레오타이드 서열에서 염기 서열을 기재하기 위해 사용한다: A = 아데닌; C = 사이토신; G = 구아닌; I = 하이포크산틴; Neb = 네뷸라린; T = 티민; 및 U = 유라실. 여기서 기재한 것과 같이, 비-DNA 염기-함유 폴리뉴클레오타이드 서열은 염기 I, Neb 또는 U, 또는 이의 결합물 중 적어도 하나를 포함하고, 선택적으로는 염기 A, C, G 또는 T, 또는 이의 결합물 중 적어도 하나를 추가로 포함하는 합성 폴리뉴클레오타이드를 나타낸다. 상기 비-DNA 염기-함유 폴리뉴클레오타이드 서열은 길이가 3 내지 30, 3 내지 30 또는 3 내지 9 염기이다.
여기서 사용하는 단수 용어는 하나 또는 그 이상으로서 규정한다. 여기서 사용하는 "포함하는(including)" 및/또는 "갖는(having)"은 포함하는 것[즉, 열린 언어(open language)]로서 규정한다.
추가의 실시형태에서, 본 발명은 3 내지 9, 3 내지 20 또는 3 내지 30 염기를 포함하는 합성의 비-DNA 염기-함유 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 조성물을 제공하며, 상기 염기 중 적어도 하나는 비-DNA 염기이다. 또 다른 실시형태에서, 상기 비-DNA 염기-함유 폴리뉴클레오타이드는 적어도 두 개의 비-DNA 염기를 함유한다. 본 발명은 또한 동물 또는 인간에서 하나 이상의 항원-전달 세포(APC) 또는 바람직하게는 하나 이상의 DC를 자극하기에 효과적인 양으로 동물 또는 인간에 비-DNA 염기-함유 폴리뉴클레오타이드 및 약물학적으로 허용가능한 비히클을 포함하는 조성물을 투여하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 바람직한 실시형태에서, 비-DNA 염기-함유 폴리뉴클레오타이드는 5'-OH, 3'-OH 폴리뉴클레오타이드이다. 동물 또는 인간에서 하나 이상의 APC의 자극으로 전신 면역 반응 또는 국소 면역 반응이 수득될 수 있다. 본 발명은 또한 APC를 자극하는데 효과적인 양으로 항원을 함유하는 APC에 비-DNA 염기-함유 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 조성물을 시험관 내 투여하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 다음에 이러한 APC는 면역 반응의 자극을 위해 약물학적으로 허용가능한 비히클과 함께 동물 또는 인간에게 자가 조직 방식으로 투여될 수 있다. 바람직한 실시형태에서, 투여되는 비-DNA 염기-함유 폴리뉴클레오타이드는 5'-OH, 3'-OH 폴리뉴클레오타이드이다. APC 자극을 유도하기 위한 비-DNA 염기-함유 합성 포스포다이에스터 및 포스포로티오에이트 폴리뉴클레오타이드의 예상치 못한 놀라운 능력으로 동물 및 인간에게 중요한 이점을 제공한다.
본 명세서 전반에 걸쳐 비-DNA 염기-함유 폴리뉴클레오타이드는 5'-OH, 3'-OH 폴리뉴클레오타이드를 의미하는 것으로 이해된다. 여기서 기재한 것과 같이, "5'-OH, 3'-OH 비-DNA 염기-함유 폴리뉴클레오타이드"라는 용어는 이의 5' 및 3' 말단 둘 다에 히드록실 부분을 가지며, 하나 이상의 비-DNA 염기를 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 나타낸다. 보다 특히, 본 발명의 5'-OH, 3'-OH 비-DNA 염기-함유 폴리뉴클레오타이드는 폴리뉴클레오타이드의 5' 말단의 당의 5' 탄소에 히드록실 부분을 포함하며, 폴리뉴클레오타이드의 3' 말단의 당의 3' 탄소에 히드록실 부분을 포함한다. 다르게 지시하지 않는 한 여기서 기재하는 폴리뉴클레오타이드 서열은 5' 말단에서 3' 말단, 즉 왼쪽에서 오른쪽 배향으로 나타낸다.
그러나, 당 업에 통상의 지식을 가진 사람은 부가물, 예컨대 이에 제한하지는 않지만 TEG-콜레스테릴로 5'-OH 또는 3'-OH 말단 중 하나 또는 둘 다를 변형하여, 상기 말단의 변형이 실질적으로 폴리뉴클레오타이드의 고유의 면역 애주번트 활성에 영향을 주지 않을 수 있다. 하나 이상의 부가적인 A, T, C 또는 G 염기는 말단의 변형이 실질적으로 폴리뉴클레오타이드의 고유의 면역 애주번트 활성에 영향을 주지 않도록 5'-OH 말단 또는 3'-OH 말단에 첨가될 수 있다. 네뷸라린, 하이포크산틴 및 유라실로부터 선택되는 추가적인 비-DNA 염기를 함유하는 하나 이상의 부가적인 뉴클레오타이드를 말단 중 하나 또는 둘 다에 첨가하여 분자의 고유의 활성, 즉 이의 면역 애주번트 활성이 실질적으로 영향을 받지 않도록 할 수 있다.
여기서 기재한 것과 같이, "폴리뉴클레오타이드" 및 "올리고뉴클레오타이드"라는 용어는 상호교환적으로 사용될 수 있다. 본 발명의 하나의 실시형태에서, 비-DNA 염기-함유 폴리뉴클레오타이드는 길이가 3 내지 9 뉴클레오타이드 염기이다. 본 발명의 또 다른 실시형태에서, 비-DNA 염기-함유 폴리뉴클레오타이드는 길이가 3 내지 20 뉴클레오타이드 염기이다. 본 발명의 또 다른 실시형태에서, 비-DNA 염기-함유 폴리뉴클레오타이드는 길이가 3 내지 30 뉴클레오타이드 염기이다. 바람직하게, 5'-OH, 3'-OH 비-DNA 염기-함유 폴리뉴클레오타이드는 뉴클레오타이드 염기를 포함하며, 상기 뉴클레오타이드 염기 중 적어도 하나는 비-DNA 염기, 예컨대 이에 제한되지는 않지만, 유라실(U), 네뷸라린(Neb) 또는 하이포크산틴(I)이다. 몇몇 실시형태에서, 비-DNA 염기-함유 폴리뉴클레오타이드는 특이적으로 NebGGTGNeb(서열 번호: l), UUGTUU(서열 번호: 2) 및 IIGTII(서열 번호: 3)으로 구성되는 군으로부터 선택되는 염기 서열을 포함하거나 또는 염기 서열로 구성될 수 있다.
비-DNA 염기-함유 폴리뉴클레오타이드가 네뷸라린을 포함하는 또 다른 실시형태에서, 상기 폴리뉴클레오타이드 서열은 하기 서열 중 임의의 서열을 포함할 수 있다: NebTNeb(서열 번호: 10), GNebG(서열 번호: 4), NebNebGNebNebNeb(서열 번호: 11), NebNebNebNebNebNeb(서열 번호: 12), NebNebNebTNebNeb(서열 번호: 13), GGGNebGG(서열 번호: 14), GGGTNebG(서열 번호: 15), GGNebNebGG(서열 번호: 16), GGNebTGG(서열 번호: 17), NebGGTGG(서열 번호: 18), NebGGTGNeb(서열 번호: 1), GGGTGGNeb(서열 번호: 19) 및 NebGGGTGG(서열 번호: 20).
비-DNA 염기-함유 폴리뉴클레오타이드가 하이포크산틴을 포함하는 또 다른 실시형태에서, 폴리뉴클레오타이드 서열은 하기 서열 중 임의의 서열을 포함할 수 있다: GGITGG(서열 번호: 21), GGGIGG(서열 번호: 22), IIGTII(서열 번호: 3), IGGGTGG(서열 번호: 23), GGGTGGI(서열 번호: 24), IGGGTGGI(서열 번호: 25), GGGTGGIII(서열 번호: 7) 및 GIG(서열 번호: 6).
비-DNA 염기-함유 폴리뉴클레오타이드가 유라실을 포함하는 또 다른 실시형태에서, 폴리뉴클레오타이드 서열은 하기 서열 중 임의의 서열을 포함할 수 있다: GGUTGG(서열 번호: 26), GGGUGG(서열 번호: 27), UUGTUU(서열 번호: 2),㎍GGTGG(서열 번호: 28), GGGTGGU(서열 번호: 29),㎍GGTGGU(서열 번호: 30), GGGTGGUUU(서열 번호: 9) 및 GUG(서열 번호: 8).
하나의 실시형태에서, 비-DNA 염기-함유 폴리뉴클레오타이드는 APC, DC, 인간 또는 동물에 핵산-계 벡터로 투여한다.
비-DNA 염기-함유 폴리뉴클레오타이드는 포스포다이에스터 백본 또는 다른 적당한 변형물을 함유할 수 있다.
또한 여기서 기재한 것과 같이, "자극하다(stimulate)" 및 "자극하다(stimulates)"라는 용어는 상기 용어의 사용 맥락에 따라서 APC의 활성화 또는 성숙, 면역 반응의 활성화 또는 증가를 나타낸다.
여기서 기재하는 비-DNA 염기-함유 폴리뉴클레오타이드는 DC를 자극할 수 있을뿐만 아니라 또한 전문적인 APC, 예컨대 이에 제한되지는 않지만 모노사이트, 마크로파지, 랑게르한스 세포, B 림프구, T 림프구, 쿠퍼 세포, 미세아교 세포, 슈반 세포 및 내피 세포; 및 비-전문적인 APC, 예컨대 이제 제한되지는 않지만 상피 세포, 섬유아 세포, 멜라닌 세포, 신경 세포, 평활근 세포, 근육 세포, 간세포, 성상 세포 및 각질 형성 세포를 포함하는 기타 APC를 자극할 수도 있다고 알려져 있다. 따라서, 본 발명은 APC의 활성화 방법 및 조성물을 포함한다.
면역 반응을 참조하면, "자극하다(stimulate)"라는 용어는 일반적으로 다르게 지시하지 않는 한 항원 비-특이적 방식으로 면역계 성분의 활성화 또는 면역계의 활성화를 나타낸다. 개체에서 면역 반응의 자극은 이에 제한되지는 않지만, 세포 증식, 클론 확대, 신규의 단백질 합성, 효과인자 세포로의 분화, 기억 세포로의 분화, 항체 타입의 수준 또는 양의 증가, 항체 부류의 스위칭, 항체-생성 B 림프구에서의 체세포성 과변이, 면역 세포 타입 수준 또는 양의 증가, 특정 위치에서의 면역 세포의 보충(운동성 및 이동), 개체에서 사이토카인의 수준 또는 양의 증가, 개체에서 케모카인의 수준 또는 양의 증가, 증가된 항원 제시, 증가된 내포작용, 보조-자극 분자(부수적 분자)의 습득 또는 증가, 부착 분자의 습득 또는 증가, 사이토카인 수용체의 습득 또는 증가, 케모카인 수용체의 습득 또는 증가, 증가된 세포-매개성 세포독성, 형태학적 변화, 면역 세포 기억의 설정, 반응성 산소 중간물질의 수준 또는 양의 증가, 일산화질소의 수준 또는 양의 증가, 신경내분비 분자(예를 들면, 호르몬, 신경전달 물질, 등)의 수준 또는 양의 증가 및 면역 관용 또는 억제의 브레이크에 의해서 입증될 수 있다. 면역 세포는 이에 제한되지는 않지만 CD4+ 및 CD8+ 세포, 및 NK 세포; 단핵 식세포; 과립구, 예컨대 호중구, 호산구 및 호염기구; 여기서 기재하는 것과 같은 수지상 세포; 및 상기에서 언급한 세포의 임의의 전구물질을 포함하는, 림프구, 예컨대 B 세포, T 세포를 포함한다. 항체 타입은 IgG, IgA, IgM, IgD, IgE 및 IgY을 포함한다. IgG 항체는 추가로 상이한 아형으로 나뉠 수 있다. 인간에서는 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4가 있다. 마우스에서는 IgG1, IgG2a, IgG2b 및 IgG3이 있다. 항바이러스성 면역 반응은 특이적 IgG 항체 아형 반응과 관련이 있는 것으로 공지되어 있다. 마우스에서는 당 업에 통상의 지식을 가진 사람에게 IgG2a 및 IgG2b 아형이 공지되어 있다. 당 업에 통상의 지식을 가진 사람들은 바이러스 백신에 의한 상기 분류의 항체를 유도하여 바이러스 백신 효험 및 잠재성을 측정한다.
하나의 실시형태에서, 면역 반응은 전신 면역 반응이다. "전신 면역 반응"이라는 용어는 여기에서 신체의 특정 영역으로 제한되지 않는 면역 반응을 나타낸다. 전신 면역 반응의 예는 개체로의 항원 및 면역 자극 분자의 개체 이후 투여에서의 순환 또는 림프계에서 순환되는 항체의 양의 증가이다. 또 다른 예는 개체에 면역자극 분자의 개체 이후 투여의 순환 또는 림프계에서의 사이토카인 및/또는 케모카인 수준의 증가이다. 또 다른 예는 혈액 또는 림프 순환 또는 면역계 기관, 예컨대 비장, 림프절 또는 간에서의 민감화 항원으로 시험감염(challenge)하는데 반응할 수 있는 민감화 면역 효과인자 세포, 예컨대 T-세포, B-세포 또는 플라즈마 세포의 존재이다. 다른 실시형태에서, 면역 반응은 국소 면역 반응이다. "국소 면역 반응"라는 용어는 신체의 특정 영역으로 우선적으로, 그러나 전체적일 필요는 없게 제한되는 면역 반응을 나타낸다. 국소 면역 반응은 신체의 특정 영역으로의 면역 세포의 보충(운동성 및 이동) 및/또는 국소적 부기 또는 적열 상태로 입증될 수 있다. 예를 들면, 점막 면역 반응은 여기서 기재하는 5'-OH 3'-OH 비-DNA 염기-함유 폴리뉴클레오타이드 서열과 같은 면역 자극 분자 및/또는 항원의 이후 점막 투여를 발생시킬 수 있다. 점막 반응은 이에 제한하지는 않지만, 항체 타입 수준 또는 양의 증가, IgA 항체 수준 또는 양의 증가, 감마/델타-양성 T 림프구의 활성화, 국소 면역 관용의 유도 및 전신 면역 관용의 유도를 포함할 수 있다.
본 발명의 몇몇 실시형태에서, 비-DNA 염기-함유 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 조성물은 질병의 치료 또는 예방을 위해 개체(즉, 동물 또는 인간)에 투여된다. 여기서 기재하는 것과 같은, "질병"라는 용어는 신체 건강이 손상된 상태를 나타내며, 이제 제한되지는 않지만 암; 바이러스, 박테리아 또는 기생충을 포함하는 병원체에 의한 감염; 알러지; 자가면역 질환; 및 이식된 기관에 대한 자가면역 반응을 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 상기 질환은 이에 제한하지는 않지만, 세자리 증후군(순환 DC에서의 엄청난 결함을 갖는 환자)(Wysocka et al , Blood 2002, 100:3287); 다운 증후군(가지 위축이 있는 환자)(Takashima et al , J. Intellect. Disabil . Res . 1994, 38:265); DC의 부적절한 활성화와 관련된 자가면역 질환(예를 들면, DC에 의한 자가 항원의 연장된 제시)(Erikson et al , J. Exp . Med. 2003, 197:323 및 Ludewig et al , Curr . Opin . Immunol . 2001, 13:657); 척수 손상(가지 위축이 있는 환자)(Iversen et al , Blood 2000, 96:2081); 및 그레이브스 병(갑상성 수지상 세포가 질병과 연루됨)(Quadbeck et al , Scand . J. Immunol . 2002, 55:612)을 포함하는 DC 이상과 관련이 있다. "치료(treatment)"라는 용어는 질환 증상의 감소 또는 경감을 의미하며, 질환의 치료일 필요는 없다. 또한 여기서 사용하는 것과 같이, "유효량"이라는 용어는 면역 반응을 유도하는데 효과적인 비-DNA 염기-함유 폴리뉴클레오타이드의 양을 나타낸다. 비-DNA 염기-함유 폴리뉴클레오타이드의 치료 효율성은 이에 제한되지는 않지만 생물학적 환경의 안정성을 증가시키기 위한 염기, 당 또는 포스페이트 백본의 화학적 변형, 면역계 세포와의 상호작용을 강화시키기 위한 올리고뉴클레오타이드의 화학적 보충, 또는 생체 내 서열의 이용성을 증가시키기 위한 적당한 서열을 함유하는 박테리아 플라즈미드를 사용한 서열의 생물공학적 증폭, 세포-타입 유도 리간드 또는 항체에 서열을 커플링 또는 생물학적 또는 화학적 담체에 서열의 착화를 포함하는 방법에 의해 증가될 수 있다. 여기서 사용하는 "유효량"이라는 용어는 2차 면역결핍을 치료하는 당 업에 공지된 것과 같은 고려사항에 의해서 결정되는 양을 의미하며, 이것은 치료 개체에서의 주목할 만한 안심, 예컨대 이에 제한되지는 않지만 개선된 생존율, 더욱 신속한 회복, 증상의 개선 또는 완화, 후 전염 합병증의 감소, 및 감염원에 대항하는 적당한 항체 역가 또는 증가된 역가, 암 덩어리의 감소, 및 당 업에 통상의 지식을 가진 사람에게 공지되어 있는 기타 측정을 제공하는데 효과적이어야 한다.
여기서 사용하는 "항원"이라는 용어는 항체, T-세포 수용체 또는 패턴 인지 수용체(PRRs)에 의해 특이적으로 결합될 수 있어 면역 반응을 유도하는 임의의 물질로 규정된다. 항원의 타입에는 이에 제한하지는 않지만, 바이러스, 박테리아, 암 및 자가-항원을 포함한다. 따라서, 본 발명에 따라 제조된 수지상 세포는 감염성 질환, 암, 자가면역 질환을 포함하며, 이에 제한하지는 않지만 탄저륜, 보툴리눔 식중독, 전염병, 야토병, 두창 및 바이러스성 출혈열을 포함하는, 바이러스, 박테리아 및 독소와 같은, 유기체의 의도적 전파에 의해 발생하는 다양한 질환의 예방 및 치료에 유용하다.
하나 이상의 5'-OH, 3'-OH 비-DNA 염기-함유 폴리뉴클레오타이드, 약학적으로 허용가능한 비히클 및 선택적으로 하나 이상의 항원을 포함하는 조성물은 이에 제한하지는 않지만, 질환의 치료 또는 영상화를 위한 진단 목적과 같은 응용 또는 당 업에 통상의 지식을 가진 사람에게 공지된 다른 응용을 위한 단클론 및 다클론 항체 생성의 제조에 대한 항체 생성을 자극하기 위해서 투여될 수 있다고 이해된다.
하나 이상의 5'-OH, 3'-OH 비-DNA 염기-함유 폴리뉴클레오타이드, 약학적으로 허용가능한 비히클 및 선택적으로 하나 이사의 항원을 포함하는 조성물은 알레르기 항원에 대항하는 항체 반응, 알레르기 항원에 대항하는 탈감각화를 줄이는 수단 또는 이에 제한하지는 않지만 하시모토 병, 전신 홍반성 루푸스 및 반응성 관절염과 같은 질환의 자기항체 반응을 감소시키는 수단으로서 투여될 수 있는 것으로서 이해된다.
하나 이상의 5'-OH, 3'-OH 비-DNA 염기-함유 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 조성물은 면역 반응의 자극을 위해 동물 또는 인간에게 자가조직 방식으로 재주입되도록 도안된 APC의 자극을 유도하는데 효과적인 양으로 암 항원을 포함하는 항원을 함유하는 APC에 영향을 주는 다른 면역조절 제제, 하나 이상의 항원 또는 하나 이상의 애주번트와 결합하거나 또는 단독으로 시험관 내에서 APC에 약학적으로 허용가능한 비히클로 투여될 수 있다고 이해된다. 면역조절 제제는 이에 제한하지는 않지만 하기를 포함한다: 알루미늄 히드록시드; 알루미늄 포스페이트; 칼슘 포스페이트; 폴리머; 코-폴리머, 예컨대 블록 코-폴리머를 포함하는 폴리옥시에틸렌-폴리옥시프로필렌 코폴리머; 폴리머 P1005; 프로인트 완전 애주번트(동물용); 프로인트 불완전 애주번트; 솔비탄 모노올레이트; 스쿠알렌; CRL-8300 애주번트; QS 21; 사포닌; ISCOM; 뮤라밀 다이펩티드; 글루코스아미닐뮤라밀 다이펩티드; 트레할로스; 마이코박테리아 추출물을 포함하는 박테리아 추출물; 마이코박테리아 전체 세포를 포함하는 박테리아 전체 세포; 마이코박테리아 세포 벽-DNA 착체, 마이코박테리아 세포 벽 골격, 해독 내독소; 막 지질; 원핵 세포 유기체로부터 분리된 DNA, CpG 합성 폴리뉴클레오타이드; 변형된 CpG 합성 폴리뉴클레오타이드 또는 비-CpG 함유 폴리뉴클레오타이드(예를 들면, MIMPs), 압타머; 플라즈미드 면역자극 분자; 폴리(I:C) 분자; 사이토카인; 케모카인; 키토산 및 유도체; 히알루론산 및 유도체; 콜레라 독소; 백해일 독소; 및 키홀 림펫 헤모시아닌(keyhole limpet hemocyanin), 또는 이의 결합물. 하나 이상의 5'-OH, 3'-OH 비-DNA 염기-함유 폴리뉴클레오타이드 또는 5'-OH, 3'-OH 비-DNA 염기-함유 폴리뉴클레오타이드 플러스 면역조절 제제를 포함하는 조성물을 선택적으로 여러 농도로 APC의 자극을 위한 적당한 시간에 걸쳐 단일 처리 또는 다중 처리로 APC에 첨가할 수 있다. 하나 이상의 5'-OH, 3'-OH 비-DNA 염기-함유 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 조성물은 면역조절 제제 투여 이전, 투여와 동시에 또는 투여 이후에 투여될 수 있다. 또한, 하나 이상의 5'-OH, 3'-OH 비-DNA 염기-함유 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 조성물은 항원(들) 투여 이전, 투여와 동시에 또는 투여 이후에 첨가될 수 있다.
본 발명은 또한 동물 또는 인간에 백신으로서 직접 비-DNA 염기-함유 폴리뉴클레오타이드 및 약학적으로 허용가능한 비히클 및 항원을 포함하는 조성물을 투여하는 방법을 포함하며, 상기 투여로 동물 또는 인간에서 면역 반응 및 보다 바람직하게는 항원-특이적 면역 반응이 수득된다. 상기 항원은 하나 이상의 비-DNA 염기-함유 폴리뉴클레오타이드 및 약학적으로 허용가능한 비히클을 포함하는 조성물을 투여하기 이전, 투여하는 것과 동시에 또는 투여 이후에 동물 또는 인간에 투여될 수 있다. 바람직한 실시형태에서, 상기 항원은 하나 이상의 5'-OH, 3'-OH 비-DNA 염기-함유 폴리뉴클레오타이드 및 약학적으로 허용가능한 비히클을 포함하는 조성물과 동시에 투여된다.
본 발명은 또한 비-DNA 염기-함유 폴리뉴클레오타이드 및 약학적으로 허용가능한 비히클, 및 APC 내에 함유되지 않은 항원을 포함하는 조성물을 동물 또는 인간에 투여하는 방법을 포함하며, 상기 항원의 양은 현저하게 감소되며, 이러한 투여로 동물 또는 인간에 효과적인 면역 반응, 및 보다 바람직하게는 항원-특이적 면역 반응이 수득된다. 상기 항원은 비-DNA 염기-함유 폴리뉴클레오타이드 및 약학적으로 허용가능한 비히클을 포함하는 조성물을 투여하기 이전, 투여와 동시에 또는 투여 이후에 투여될 수 있다. 바람직한 실시형태에서, 상기 항원은 비-DNA 염기-함유 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 조성물과 동시에 투여된다. 하나의 실시형태에서, 상기 항원은 비-DNA 염기-함유 폴리뉴클레오타이드 및 약학적으로 허용가능한 비히클을 포함하는 조성물과 결합할 수 있으며, 동물 또는 인간에 투여될 수 있다.
여기서 기재하는 항원은 임의의 특정 항원 또는 항원 타입에 제한되지 않는다. 실제로 본 발명의 실시예 및 상세한 설명을 판독한 이후에 당 업에 통상의 지식을 가진 사람은 상세한 설명, 실시예 및 청구의 범위에서 규정하는 것과 같이 본 발명의 정신 및 범주를 벗어나지 않으면서 본 발명에 기재된 것 이외의 항원과 함께 본 발명의 폴리뉴클레오타이드 조성물을 사용하는 것을 생각해 낼 수 있을 것으로 평가된다. 임의의 항원 또는 하나 이상의 항원을 본 발명의 비-DNA 염기-함유 폴리뉴클레오타이드 및 하나 이상의 약학적으로 허용가능한 비히클을 조성물로 결합하기 위해 당 업에 통상의 지식을 가진 사람에 의해서 선별될 수 있다. 이러한 항원은 특정 항원에 대항하여 목적하는 면역 반응 또는 백신에 특이적이다. 하나의 실시형태에서, 상기 항원은 암 항원, 예컨대 분자 생물학 분야에서 통상의 지식을 가진 사람에게 공지된 기술(예컨대 이에 제한되지는 않지만, 시퀀싱, 클로닝, 트랜스펙션, 적당한 진핵 세포 또는 원핵 세포-계 시스템에서의 증폭 및 이후의 분리 및 정제)로부터 또는 암 세포 용해물로부터 유래된 암 항원이다. 또 다른 실시형태에서, 상기 항원은 병원체로부터 유래된 항원, 보다 바람직하게는 병원체의 외부 표면 상에 발현되는 항원이다. 병원체 유래 표면 항원 중 하나의 예는 간염 표면 항원이다. 또 다른 실시형태에서, 항원은 온전한 병원체로 구성된다. 온전한 병원체의 하나의 예는 불활성화 또는 약화된 H1N1 비리온이다. 또 다른 예는 다른 마이코박테리아 감염, 예컨대 이에 제한되지는 않지만 엠. 투버쿨로시스(M. tuberculosis) 또는 마이코박테리움 아비움(Mycobacterium avium) 및 파라투버쿨로시스(paratuberculosis)와 같은 서브-종에 대항해서 항원 보호물을 발현시키기에 적당한 비변형 또는 유전적으로 변형된 온전한 마이코박테리움 보비스 균주 결핵 예방 백신(BCG)이다. 상기 항원이 APC 내에 함유되지 않은 동물 또는 인간에 투여되는 경우 항원은 단백질, 펩티드 또는 폴리펩티드, 또는 투여되는 항원을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드로서 투여될 수 있다. 항원을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드는 동물 또는 인간에서 항원 폴리펩티드의 발현을 허락하는 다른 인자를 포함하는 백터 내에 함유될 수 있다. 하나의 실시형태에서, 항원 및 5'-OH, 3'-OH 비-DNA 염기-함유 폴리뉴클레오타이드는 여러 백터 내에 함유된다. 항원은 이에 제한되지는 않지만 H1N1 항원, 인플루엔자 항원, A형 간염 항원, B형 간염 항원, 결합된 A형 간염 항원 및 B형 간염 항원, 인유두종 항원, 폐렴구균성 항원, 디프테리아 항원, 수막구균성 항원, 파상풍 항원, 하나 이상의 인간 면역결핍성 바이러스 항원, 하나 이상의 고양이 면역결핍성 바이러스 항원, 및 하나 이상의 시미안 면역결핍성 바이러스 항원을 포함한다.
동물 또는 인간에게 비-DNA 염기-함유 폴리뉴클레오타이드, 약학적으로 허용가능한 비히클 및 항원 또는 항원들을 포함하는 조성물을 투여하거나 또는 항원을 함유하는 비-DNA 염기-함유 폴리뉴클레오타이드-자극 APC를 투여하면 동물 또는 인간에서 면역 반응이 자극된다고 이해된다. 바람직한 실시형태에서, 이러한 투여로 동물 또는 인간에서 항원-특이적 면역 반응과 함께 면역계가 자극된다. "항원-특이적 면역 반응"라는 용어는 대부분이 항원 또는 항원들로 바로 유도되는 면역 반응을 나타낸다. 항원-특이적 면역 반응은 이에 제한되지는 않지만 항체의 양(항체 역가)의 증가, 항체 부류에서의 스위칭, 항체-생성 B 림프구에서의 체세포성 과변이, 면역 세포 기억의 설정, 항원이 투여되는 인간 또는 동물에서 항원에 있어서 특이적 B 세포 수용체 또는 T 세포 수용체를 함유하는 세포 양의 증가를 포함하거나 또는 이들로 구성된다. 항체는 항체-항원 착체를 생성하기 위해서 효과적인 친화도 및 결합능으로 항원과 항체가 결합하는 경우 특정 항원"에 있어서 특이적"이다.
선택적으로 하나 이상의 항원과 결합하여 약학적으로 허용가능한 비히클에 하나 이상의 비-DNA 염기-함유 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 본 발명의 조성물은 이에 제한되지는 않지만 투여 수단 또는 방법, 예컨대 주입, 용액, 크림, 겔, 임플란트, 펌프스, 연고, 에멀젼, 현탁액, 마이크로스피어, 입자, 미세입자, 나노입자, 리포좀, 페이스트, 패치, 정제, 경피 운반 장치, 스프레이, 에어로졸, 또는 당 업에 통상의 지식을 가진 자에게 친근한 기타 수단을 포함한다. 본 발명의 약학적인 제제는 잘 공지되어 있으며 용이하게 이용가능한 성분을 사용해서 당 업에 공지된 절차에 따라 제조될 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 조성물은 일반적인 부형제, 희석제 또는 담체로 제제화될 수 있으며, 정제, 캡슐, 현탁액, 분말 등으로 형성될 수 있다. 약학적으로 허용가능한 비히클은 당 업에 통상의 지식을 가진 자에게 공지되어 있으며, 일반적인 부형제, 희석제 또는 담체를 포함한다. 예를 들면, 조성물은 일반적인 부형제, 희석제 또는 담체로 제제화될 수 있으며, 정제, 캡슐, 현탁액, 분말 등으로 형성될 수 있다. 이러한 제제에 적당한 부형제, 희석제 및 담체의 예는 하기를 포함한다: 필러 및 익스텐더(예를 들면, 전분, 당, 만니톨 및 규소 함유 유도체); 결합제(예를 들면, 카르복시메틸 셀룰로스 및 다른 셀룰로스 유도체, 알지네이트, 젤라틴 및 폴리비닐-피롤리돈); 수분제(예를 들면, 글리세롤); 붕해제(예를 들면, 칼슘 카보네이트 및 소듐 바이카보네이트); 완염 용해를 위한 제제(예를 들면, 파라핀); 흡수 촉진제(예를 들면 제4 암모늄 화합물); 표면 활성화제(예를 들면, 세틸 알콜, 글리세롤 모노스테아레이트); 흡착 담체(예를 들면, 카올린 및 벤토나이트); 유화제; 보존제; 향미제; 안정제; 착색제; 향수 제제; 착향로; 윤활제(예를 들면, 탈크, 칼슘 및 마그네슘 스테아레이트); 고체 폴리에틸 글리콜; 및 이의 혼합물. 약학적으로 허용가능한 비히클은 약학적으로 허용가능한 담체를 포함한다. 몇몇 담체는 당 업에 통상의 지식을 가진 사람에게 공지된 면역 애주번트 담체일 수 있다.
조성물은 이들이 가능하면 일정 기간 동안(즉, 서방 제형 제제) 또는 바람직하게는 특정 위치에 활성 성분을 방출하도록 구성될 수 있다. 이러한 결합물은 또한 방출 운동을 제어하기 위한 추가의 메커니즘을 제공한다. 예를 들면 폴리머 물질 또는 왁스로부터 코팅, 포장재료 및 보호성 매트릭스를 구성할 수 있다.
하나 이상의 5'-OH, 3'-OH 비-DNA 염기-함유 폴리뉴클레오타이드 및 약학적으로 허용가능한 비히클을 포함하는 조성물은 하나 이상의 5'-OH, 3'-OH 비-DNA 염기-함유 폴리뉴클레오타이드 및 약학적으로 허용가능한 담체와 균일하게 및 직접적으로 연관되도록 하여 제조된다. 약학적으로 허용가능한 비히클은 액체 비히클, 고체 비히클 또는 둘 다일 수 있다. 액체 비히클은 수성 비히클, 비-수성 비히클 또는 둘 다이다. 약학적으로 허용가능한 비히클은 면역 애주번트 담체를 포함한다. 약학적으로 허용가능한 비히클은 이에 제한되지는 않지만 수성 현탁액, 오일 에멀젼, 유중수 에멀젼, 수중유중수 에멀젼, 부위-특이적 에멀젼, 장기-잔류 에멀젼, 점착성-에멀젼, 미크로에멀젼 및 나노에멀젼을 포함한다. 고체 비히클은 생물학적 비히클, 화학적 비히클 또는 둘 다이며, 이에 제한되지는 않지만, 비-DNA 염기-함유 폴리뉴클레오타이드 조성물의 서방 제형을 가능하게 하는, 바이러스 벡터 시스템, 입자, 마이크로입자, 나노입자, 마이크로스피어, 나노스피어, 미니펌프스, 박테리아 세포 벽 추출물 및 생분해가능한 또는 비-생분해가능한 천연 또는 합성 폴리머를 포함한다. 에멀젼, 미니펌프스 및 폴리머는 운반되어야 하는 부근으로 이식될 수 있다(Brem et al ., 1991 J. Neurosurg . 74: 441). 고체 비히클로의 5'-OH, 3'-OH 비-DNA 염기-함유 폴리뉴클레오타이드 착체화에 사용되는 방법은 이에 제한되지는 않지만, 고체 비히클 표면에 직접 흡착, 연결 부분을 경유하거나 또는 직접적인 고체 비히클 표면에 공유 결합, 및 고체 비히클을 제조하기 위해 사용되는 폴리머와의 공유 결합을 포함한다. 선택적으로 서열(들)은 비-이온성 또는 이온성 폴리머, 예컨대 폴리옥시에틸렌솔비탄 모노올레이트(통상적으로 TWEENs라고 함) 또는 히알루론산 또는 히알루론산 유도체의 첨가에 의해서 안정화될 수 있다.
바람직한 수성 비히클은 이제 제한되지는 않지만, 물, 식염수 및 약학적으로 허용가능한 완충액을 포함한다. 바람직한 비-수성 비히클은 이에 제한되지는 않지만, 다이글리세라이드, 트라이글리세라이드, 포스포리피드, 지질, 오일 및 이의 혼합물을을 포함하는, 이에 제한되지는 않지만 미네랄 오일 또는 천연 오일을 포함하며, 상기 오일은 폴리불포화 및 포화 지방산의 적당한 혼합물을 함유한다. 예를 들면, 이에 제한되지는 않지만, 대두유, 카놀라유, 팜유, 올리브유 및 마이글리올(myglyol)을 포함하며, 지방산은 포화 또는 불포화될 수 있다. 선택적으로 부형제는 세포에 비-DNA 염기-함유 폴리뉴클레오타이드 조성물을 나타내기 위해 사용되는 약학적으로 허용가능한 비히클에 상관없이 포함될 수 있다. 이러한 부형제는 이제 제한되지는 않지만 항산화제, 완충액 및 세균 발육 저지제(bacteriostats)를 포함하며, 현탁 제제 및 농후제(thickening agents)를 포함할 수 있다.
하나 이상의 비-DNA 염기-함유 폴리뉴클레오타이드는 인간 또는 동물에 단독으로, 또는 이에 제한하지는 않지만 하기를 포함하는 기타 면역 애주번트 비히클 또는 담체와 결합해서 투여될 수 있다: 백반(alum), 알루미늄 히드록사이드; 알루미늄 포스페이트; 칼슘 포스페이트; 폴리머; 코-폴리머, 예컨대 블록 코-폴리머를 포함하는 폴리옥시에틸렌-폴리옥시프로필렌 코폴리머; 프로인트 불완전 애주번트; 솔비탄 모노올레이트; 스쿠알렌; 스쿠알란; CRL-8300 애주번트; QS 21; 사포닌; ISCOM; 뮤라밀 다이펩티드; 글루코사미닐뮤라밀 다이펩티드; 트레할로스; 마이코박테리아 추출물을 포함하는 친수성 또는 친유성 박테리아 추출물; 마이코박테리아 전체 세포를 포함하는 박테리아 전체 세포; 마이코박테리아 세포 벽 제제를 포함하는 박테리아 세포 벽 제제; 해독형 내독소; 지질 A 및 이의 합성 유사체; 막 지질; 원핵 세포 유기체로부터 분리된 DNA, CpG 합성 폴리뉴클레오타이드; 비-CpG 합성 폴리뉴클레오타이드; 압타머; 면역조절 분자를 암호화하는 플라즈미드; 폴리(I:C) 분자; 사이토카인; 케모카인; 키토산 및 유도체; 히알루론산 및 유도체; 콜레라 독소; 백일해 독소; 및 키홀 림펫 헤모시아닌 또는 이의 결합물. 면역 애주번트 비히클 또는 담체는 당 업에 통상의 지식을 가진 사람에게 공지되어 있으며, 제한 없이 백반, 오일계 애주번트, 면역자극 착체(ISCOMS), 비로좀, 모노포스포릴 지질 A(MPL) 및/또는 이의 유사체를 포함한다. 본 발명의 바람직한 실시형태에서, 미립자 담체는 백신 애주번트로서 사용되는 알루미늄 포스페이트 또는 알루미늄 히드록사이드로부터 제조되는 백반, 콜로이드 항원 담체이다.
약학적으로 허용가능한 비히클에 하나 이상의 비-DNA 염기-함유 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 조성물은 단독으로, 또는 이에 제한되지는 않지만 화학치료제, 항미생물제 또는 항바이러스제를 포함하는, 당 업에 통상의 지식을 가진 자에게 공지된 기타 치료 방식과 결합해서 투여될 수 있다. 화학치료제는 이에 제한하지는 않지만, 항대사제, DNA 손상 물질, 미세소관 불안정화제, 미세소관 안정화제, 액틴 탈중합제, 성장 저해제, 토포아이소머라아제 저해제, HMG-CoA 저해제, 퓨린 저해제, 피리미딘 저해제, 메탈로프로테인아제 저해제, CDK 저해제, 혈관 성장 저해제 및 분화 강화제를 포함한다. 이러한 다른 치료 방식의 투여 방법 및 투여량은 당 업에 통상의 지식을 가진 자에게 공지되어 있다.
본 발명의 비-DNA 염기-함유 폴리뉴클레오타이드 조성물 및 비-DNA 염기-함유 폴리뉴클레오타이드를 함유하는 약물학적으로 허용가능한 비히클, APC 또는 DC를 포함하는 조성물 또는 비-DNA 염기-함유 폴리뉴클레오타이드, 및 다양한 형태에 특별하게 적당한, 본 발명의 담체와 같은 기타 물질을 포함하는 조성물을 투여하는 방법은 하기의 투여 타입에 제한하지는 않지만 경구(예를 들면, 구강 또는 설하선), 항문, 직장, 좌약으로서, 국소, 장관외, 코, 에어로졸, 흡입, 척추 강내, 복강내, 정맥내, 동맥내, 경피, 피내, 진피, 피하, 근육내, 조직내(예를 들면, 조직 또는 분비 기관), 자궁내, 질, 체강으로, 암 또는 내상의 위치에 수술적으로 투여, 암에 직접, 기관의 루멘 및 실질, 골수, 및 위장계, 생식계, 비뇨계 및 비뇨생식계의 임의의 점막 표면으로의 투여를 포함한다. 본 발명의 5'-OH, 3'-OH 비-DNA 염기-함유 폴리뉴클레오타이드 및 약학적으로 허용가능한 비히클을 포함하는 조성물은 점적(방광), 안구, 구강, 코, 직장 및 질 표면으로 구성된 그룹으로부터 선택되는 점막 표면에 투여될 수도 있다. 상기에서 언급한 다양한 투여 형태에 유용한 기술은 이에 제한되지는 않지만, 국소 적용, 섭취, 수술적 투여, 주입, 스프레이, 경피 운반 장치, 삼투압 펌프스, 목적하는 부위 상에 직접적인 전착, 또는 당 업에 통상의 지식을 가진 자에게 친근한 기타 수단을 포함한다. 적용 부위는 외부, 예컨대 표피 또는 내부, 예를 들면 위궤양, 수술 부위 또는 다른 곳일 수 있다.
본 발명의 조성물은 크림, 젤, 용액, 현탁액, 리포좀, 입자 또는 조성물의 운반 및 제제의 당 업에 통상의 지식을 가진 사람에게 공지된 기타 수단의 형태로 적용될 수 있다. 초미세 입자 크기는 치료의 흡입 운반을 위해 사용될 수 있다. 피하 투여를 위해 적당한 제제의 몇몇 예로는 이에 제한하지는 않지만, 임플란트, 데포(depot), 바늘, 캡슐 및 삼투압 펌프스를 포함한다. 질 투여를 위한 적당한 제제의 몇몇 예는 이에 제한되지는 않지만 크림 및 링을 포함한다. 경구 투여를 위한 적당한 제제의 몇몇 예로는 이에 제한되지는 않지만, 하기를 포함한다: 정제, 액체, 시럽 및 현탁액. 경피 투여를 위한 적당한 제제의 몇몇 예로는 이에 제한되지는 않지만, 젤, 크림, 페이스트, 패치, 스프레이 및 젤을 포함한다. 피하 투여를 위한 적당한 운반 메커니즘의 몇몇 예는 이에 제한되지는 않지만 임플란트, 데포, 바늘, 캡슐 및 삼투압 펌프스를 포함한다. 장관 외 투여에 적당한 제제는 이에 제한되지는 않지만 대상 수령자의 혈액과 등장성의 제제를 부여하는 항산화제, 완충액, 세균 발육 저지제 및 용질을 함유할 수 있는 수성 및 비-수성 멸균 주입 용액 및 현탁제 및 농후제를 포함할 수 있는 수성 및 비-수성 멸균 현탁액을 포함한다. 즉석 주입 용액 및 현탁액은 당 업에 통상의 지식을 가진 사람에 의해 통상적으로 사용되는 멸균 분말, 과립 및 정제로부터 제조될 수 있다.
본 발명의 조성물이 예를 들면 하나 이상의 약학적으로 허용가능한 비히클 또는 부형제와 결합되는 실시형태는 유닛 투여량으로 알맞게 표시될 수 있으며, 종래의 약학적 기술로 제조될 수 있다. 적당한 기술은 활성 성분 및 약학적 비히클(들) 또는 부형제(들)를 함유하는 조성물과 관련이 있도록 하는 단계를 포함한다. 일반적으로, 상기 제제는 액체 비히클과 활성 성분을 균일하고 직접적으로 관련이 있도록 하는 것에 의해서 제조된다. 바람직한 유닛 투여량 제제는 투여된 성분의 투여 또는 유닛 또는 이의 적당한 분획을 함유하는 것이다. 상기에서 특별하게 언급한 성분에 더해서, 본 발명의 조성물을 포함하는 제제는 당 업에 통상의 지식을 가진 사람에 의해 통상적으로 사용되는 다른 제제를 포함할 수 있다고 이해해야 한다.
투여 부피는 투여 경로에 따라서 다양할 것이다. 이러한 부피는 동물 또는 인간에게 투여되는 조성물의 관련 분야에 통상의 지식을 가진 사람에게 공지되어 있다. 투여 경로에 따라서 투여 당 부피는 투여 당 약 0.001㎖ 내지 100㎖가 바람직하며, 보다 바람직하게는 투여 당 약 0.01㎖ 내지 50㎖, 가장 바람직하게는 투여 당 약 0.1㎖ 내지 30㎖이다. 예를 들면, 근육 내 주입은 약 0.1㎖ 내지 1.0㎖ 부피 범위일 수 있다. 단독으로 또는 다른 치료 제제(들)와 함께 투여되는 비-DNA 염기-함유 폴리뉴클레오타이드 조성물은 단일 투여 치료, 다중 투여 치료, 또는 치료하는 질환, 수령자의 건강상태 및 투여 경로에 적당한 일정 시간 및 스케줄에 연속적으로 스미도록 투여될 수 있다. 또한, 기타 치료 제제는 하나 이상의 비-DNA 염기-함유 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 조성물의 투여 이전, 투여와 동시에 또는 투여 이후에 투여될 수 있다.
바람직하게, 투여 당 투여되는 5'-OH, 3'-OH 비-DNA 염기-함유 폴리뉴클레오타이드의 양은 체중 1 kg 당 약 0.0001 mg 내지 100 mg, 보다 바람직하게는 체중 1 kg 당 약 0.001 mg 내지 10 mg, 가장 바람직하게는 체중 1 kg 당 약 0.01 mg 내지 5 mg이다. 투여되는 특정 비-DNA 염기-함유 폴리뉴클레오타이드 및 특정 치료 제제, 투여 당 양, 투여 스케줄 및 투여 경로는 당 업에 통상의 지식을 가진 자에게 공지된 방법을 사용해서 의사가 결정해야 하며, 질병 타입, 질병의 중증도, 질병 위치 및 다른 임상적 인자, 예컨대 수령자의 사이즈, 체중 및 신체적 조건에 따라 달라질 것이다. 또한 시험관 내 분석은 시퀀스 및 시퀀스 플러스 치료 제제 투여에 있어서의 최적의 범위를 규명하는 것에 도움을 주기 위해 선택적으로 이용될 수 있다.
본 발명에 사용하기 위해서, 비-DNA 염기-함유 폴리뉴클레오타이드는 당 업에 잘 공지되어 있는 다수의 절차 중 임의의 것을 사용해서 새로 합성될 수 있다. 예를 들면, β-시아노에틸 포스포라미디트 방법(Beaucage and Caruthers 1981 Tet . Let. 22: 1859) 및 뉴클레오사이드 H-포스포네이트 방법(Garegg et al . 1986 Tet . Let. 27:4051-4054; Froehler et al . 1986 Nucl . Acid . Res . 14:5399-5407; Garegg et al . 1986 Tet . Let . 27:4055-4058, Gaffney et al . 1988 Tet . Let . 29;2619-26220) 또는 지질-상 합성 절차의 사용 방법(Bonora et al . 1993 Nucl . Acids Res . 21 : 1213-1217)을 이용할 수 있다. 이러한 화학 방법은 시장에서 이용가능한 다양한 자동화된 올리고뉴클레오타이드 합성기에 의해서 실행될 수 있다. 대안적으로, 폴리뉴클레오타이드는 공지된 기술, 예컨대 제한 효소, 엑소뉴클레아제 및/또는 엔도뉴클레아제를 이용해서 존재하는 핵산 서열(예를 들면 게놈 또는 cDNA)로부터 제조될 수 있다.
생체 내 이용을 위해서 폴리뉴클레오타이드는 (예를 들면, 엔도- 및 엑소-뉴클레아제를 경유한) 분해에 비교적 저항성이 있는 것이 바람직하다. 폴리뉴클레오타이드 안정화의 하나의 예는 포스페이트 백본 변형 사용을 경유하는 것이다. 하나의 실시형태에서, 안정화된 폴리뉴클레오타이드는 포스포로티오에이트-변형 백본을 갖는다. 폴리뉴클레오타이드의 포스포로티오에이트 백본 변형으로 설치류에서 48 시간의 전신에 영향을 주는 반생이 수득되며, 이러한 약물 동력학으로 이들이 생체 내 응용에 유용할 수 있다는 것을 지시한다(Agrawal et al . 1991 Proc . Natl . Acad . Sci. USA 88:7595). 포스포로티오에이트는 포스포라미데이트 또는 H 포스포네이트 화학 방법을 적용하여 자동화 기술을 사용하여 합성될 수 있다. 아릴- 및 알킬-포스포네이트가 제조될 수 있으며(예를 들면 미국 특허 제4,469,863호에 기재되어 있는 것과 같음); 및 알킬포스포트라이에스터(전하 산소 부분은 미국 특허 제5,023,243호 및 유럽 특허 제092,574호에 기재된 것과 같이 알킬화됨)는 시판되어 이용가능한 시약을 사용해서 자동화 고체 상 합성에 의해 제조될 수 있다. 다른 DNA 백본 변형 및 치환 방법이 개시되어 있다[Uhlmann, E. and Peyman, A. (1990) Chem. Rev . 90:544; Goodchild, J. (1990) Bioconj㎍ate Chem . 1:165].
생체 내 투여에 있어서, 하나 이상의 비-DNA 염기-함유 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 조성물은 목표 세포[예를 들면 B-세포 및 자연 살해(NK) 세포] 표면에 결합되는 친화도를 증가시키거나/증가시키고 목표 세포에 의해 세포 섭취를 증가시키는 분자와 연관될 수 있다. 폴리뉴클레오타이드는 당 업에 잘 공지되어 있는 기술을 사용해서 적당한 분자와 공유적으로 또는 생물공학적으로 연관될 수 있다. 다양한 결합 또는 가교 제제가 사용될 수 있다[예를 들면, 단백질 A, 카르보다이이미드 및 N-숙신이미딜-3-(2-피리디이디티오)프로피오네이트(SPDP)]. 폴리뉴클레오타이드는 대안적으로 잘-공지되어 있는 기술을 사용해서 리포좀 또는 비로좀으로 캡슐화될 수 있다.
하기 실시예는 본 발명을 추가로 설명하기 위한 것이지만, 동시에 이를 제한하는 것이 아니다. 대조적으로, 다양한 다른 실시형태, 변형 및 이와 균등물에 대해서 본 발명의 범주 및 정신으로부터 벗어나지 않는 범위 내에서 당 업에 통상의 지식을 가진 사람에게 여기서의 상세한 설명을 판독한 후에 제안될 수 있다는 것이 명백하게 이해될 것이다.
실시예 1
5'- OH , 3'- OH 비- DNA 염기-함유 폴리뉴클레오타이드의 제조
하기 5'-OH, 3'-OH 비-DNA 염기-함유 폴리뉴클레오타이드 서열은 Sigma-Genosys(캐나다 온타리오주의 오크빌시에 소재) 또는 Midland(Midland, TX, USA)로 제조하였다. 다르게 기재하지 않는 한, 상기 서열은 고압증기살균 탈염수 또는 약학적으로 허용가능한 완충액, 예컨대 이에 제한되지는 않지만 식염수에 사용하기 직전에 분산시켰다.
비-DNA 염기-함유 폴리뉴클레오타이드는 정기적 또는 표준 포스포로아미디티 올리고뉴클레오타이드 기술을 사용하여 제조될 수 있다는 것은 당 업에 통상의 지식을 가진 사람에게 명백할 것이다.
하기 5'-OH, 3'-OH 비-DNA 염기-함유 폴리뉴클레오타이드 서열은 단지 면역 애주번트로서 사용될 수 있는 조성물을 대표하는 것이다. 이러한 분자, 예컨대 이에 제한되지는 않지만 하기에거 기재하는 것들의 변형은 백신 애주번트 제제의 분야에 통상의 지식을 가진 사람이 사용할 수 있다는 것을 예상할 수 있다. 그러나 면역 애주번트로서 활성을 갖기 위해서 Neb, U 또는 I를 함유하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 사용하는 일반적인 원칙이 보존될 것임이 하기 실시예로부터 명백하게 알 수 있다. 유사하게, 당 업에 통상의 지식을 가진 사람에게 공지된 적당한 애주번트 제제의 선택도 또한 면역 애주번트로서 활성을 갖도록 Neb, U 또는 I를 함유하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 사용하는 일반적인 원칙은 보존될 것이다.
추가적으로, 적당한 백본 변형, 또는 세포외 및 세포내 분해에 강하게 저항하는 당업자에게 공지된 기타 화학적 변형으로 폴리뉴클레오타이드 서열을 발생시키는 적당한 합성 방법을 사용할 수 있다. 보호되도록 하기 위해서 ODN의 5'- 또는 3'-말단에서의 변형(예컨대 이에 제한되지는 않지만 TEG-콜레스테릴 첨가 또는 백본 보호, 예컨대 이에 제한되지는 않지만 포스포로티오에이트 연결)도 이용될 수 있다. 염기, 예컨대 이에 제한되지는 않지만 폴리뉴클레오타이드 중 하나 또는 둘 다의 말단에 첨가되는 A, G, C, T, Neb, U 또는 I를 함유하는 추가적인 자연 또는 비-자연 뉴클레오타이드를 사용하여 고유의 면역 애주번트 활성이 실질적으로 영향을 받지 않도록 할 수 있다. 본 발명의 정신 및 범주에서 벗어나지 않으면서 리보스 및/또는 데옥시리보스 당 또는 변형을 사용할 수 있다.
하기 서열은 표준 포스포로아미디티 폴리뉴클레오타이드 기술을 사용해서 포스포다이에스터 백본으로 합성하였다:
(서열 번호: 1) NebGGTGNeb
(서열 번호: 2) UUGTUU
(서열 번호: 3) IIGTII
(서열 번호: 4) GNebG
(서열 번호: 5) GGGTGGNebNebNeb
(서열 번호: 6) GIG
(서열 번호: 7) GGGTGGIII
(서열 번호: 8) GUG
(서열 번호: 9) GGGTGGUUU
이러한 분자는 면역 반응을 최적화하기 위해 도안된 하나 이상의 부가적인 애주번트 및 담체로 제제 또는 복합 혼합물로서, 또는 면역 반응을 목적하는 항원 또는 항원들과의 간단한 혼합물로서 면역 애주번트로 사용될 수 있는 비-DNA 염기-함유 폴리뉴클레오타이드의 일반적인 조성물을 설명하기 위해 제공된다. 이러한 접근법은 일반적으로 담체 분자 또는 물질, 예컨대 백반(알루미늄 포스페이트 또는 하이드록사이드)을 사용하는 것이 일반적이지만, 당 업에 통상의 지식을 가진 사람이 이용가능한 담체 또는 비히클의 선택은 넓으며, 당 업에 통상의 지식을 가진 사람은 하기의 실시예 및 청구의 범위에서 규정하는 것과 같이 본 발명의 범주 및 정신을 벗어나지 않으면서 본 발명의 폴리뉴클레오타이드 서열에 응용가능한 것으로서 이를 인식할 수 있다.
하기 참고 폴리뉴클레오타이드는 또한 포스포로티오에이트 백본으로 합성하였으며, 미들랜드(Midland)(미국 텍사스주의 미들랜드시에 소재)에서 구입하였다:
(서열 번호: 31) 비-CpG 4010 5'-TGCTGCTTTTTGCTGGCTTTTT-3'
(서열 번호: 32) CpG 2006 5'-TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT-3' (A-부류)
(서열 번호: 33) CpG 2336 5'-GGGGACGACGTCGTCGGGGGG-3' (A-부류)
(서열 번호: 34) CpG 7909 5'-TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT-3' (B-부류)
(서열 번호: 35) CpG 2429 5'-TCGTCGTTTTCGGCGGCCGCCG-3' (C-부류)
실시예 2
비- DNA 염기-함유 폴리뉴클레오타이드에 의한 TLR 활성화의 부족
톨-유사 수용체(TLR)는 면역 애주번트로서 기능할 수 있는 다수의 자연 및 합성 분자와 상호작용하는 것으로 공지되어 있다. 이러한 분자의 예로는 폴리(I:C) 폴리뉴클레오타이드, 리포폴리사카라이드 및 CpG-함유 폴리뉴클레오타이드가 있다. TLR과 상호작용하고, 다운스트림 시그널링을 유도하기 위한 비-DNA 염기-함유 폴리뉴클레오타이드(서열 번호: 1 내지 3)의 상호작용은 HEK293 세포 발현 인간 TLR2, 3, 4, 5, 7, 8 및 9에서 NF-κB 활성을 평가하여 시험하였다. TLR 인게이지먼트는 NF-κB에 의해 유도가능한 수용체의 제어 하에 분비된 알칼리 포스파타아제를 측정하여 결정하였다. 적당한 양성 대조군은 각 TLR 용으로 사용하였다. 비-DNA 염기-함유 폴리뉴클레오타이드는 100㎍/㎖ 농도에서 멸균수에 용해하였고, 최종 농도 10㎍/㎖에서 사용하였다. TLR 및 NF-κB 보고 시스템을 함유하는 HEK293 세포(InvivoGen, 미국 캘리포니아주의 샌디에이고시에 소재)를 96 웰 플레이트 웰에 넣고(분비된 알칼리 포스파타아제 발현이 유도된 NF-κB의 검출을 위해 도안된 최종 부피 200 uL 배지 중 25,000-50,000 세포), 16 내지 20시간 동안 비-DNA 염기-함유 폴리뉴클레오타이드 또는 양성 대조군으로 배양하였다. TLR 활성화 능력은 Coulter AD340C 흡광도 검출기를 이용해서 650㎚ 파장에서의 흡광도 측정에 의해 결정되었다. 표시된 결과는 광학 밀도(OD)로 표현되어 있다. 대표적인 분석 결과를 표 1에 나타냈다.
비-DNA 염기-함유 폴리뉴클레오타이드에 의한 TLR 활성화.
HEK293/TLR 세포 주 리간드 없음 서열 번호: 1(Neb) 서열 번호: 2(U) 서열 번호: 3(I) 양성 대조군2
hTLR2 0.0971 0.093 0.095 0.095 3.485
hTLR3 0.055 0.055 0.056 0.057 2.547
hTLR4 0.054 0.050 0.052 0.050 2.144
hTLR5 0.129 0.158 0.143 0.155 2.593
hTLR7 0.082 0.067 0.090 0.093 2.190
hTLR8 0.125 0.118 0.120 0.128 3.137
hTLR9 0.089 0.074 0.090 0.083 1.904
NF-κB 대조군 세포 0.071 0.078 0.076 0.074 2.765
1 650 nm에서의 광학 밀도
2 양성 대조군:
(hTLR2: 108 세포/㎖에서 열 사멸된 리스테리아 모노사이토제네스(Listeria monocytogenes))
hTLR3: 1㎍/㎖에서의 폴리(I:C)
hTLR4: 100 ng/㎖에서의 E. coli K12 LPS
hTLR5: 100 ng/㎖에서 살모넬라 타이피무리움(S. typhimurium) 플라젤린
hTLR7: 1㎍/㎖에서 가디퀴모드(Gardiquimod)
hTLR8: 1㎍/㎖에서 CL075
hTLR9: 100 ng/㎖에서 CpG ODN 2006
NK-κB: 100 ng/㎖에서 대조군 세포: PMA
상기 결과로 비-DNA 염기-함유 폴리뉴클레오타이드는 알칼리 포스페이트 수용체 활성의 부족에 의해 입증되는 것과 같이 TLR-매개 시그널링 경로를 활성화시킬 수 없다는 것을 알 수 있다(표 1). 대조적으로, 각 TLR 수용체는 이의 특이적 리간드에 의해서 활성화되었다(사용된 각각의 양성 대조군 리간드에 있어서 표 1의 각주 참조). 하기 설명을 지지하는 것을 바라지는 않지만, 이러한 결과는 비-DNA 염기-함유 폴리뉴클레오타이드 면역 애주번트 활성이 TLR의 경로를 경유해서 중재되지는 않지만, 하나 이상의 상이한 경로에 의해서는 중재된다는 가설을 지지한다.
또한, 이러한 결과는 비-DNA 염기-함유 폴리뉴클레오타이드가 공지된 핵산 TLR 수용체 3, 7, 8 또는 9를 통해 신호를 발생하지 않는다는 것을 설명한다. 중요하게, 상기 결과는 비-DNA 염기-함유 폴리뉴클레오타이드가 TLR9 시그널링을 자극하기 위해 비-DNA 염기-함유 폴리뉴클레오타이드의 불능에 의해서 입증되는 것과 같이, 합성적으로 및 기계적으로 둘 다 CpG-함유 폴리뉴클레오타이드와는 별개라는 것을 설명한다. 대조적으로 CpG-함유 폴리뉴클레오타이드는 TLR9 시그널링을 자극하고, 이러한 시그널링은 면역 애주번트 활성과 연관성이 있다는 것은 당 업에 통상의 지식을 가진 사람에게 공지되어 있다.
실시예 3
비- DNA 염기-함유 폴리뉴클레오타이드의 면역 애주번트 활성 - 비- DNA 염기-함유 폴리뉴클레오타이드로의 면역화 이후의 항- HBsAg IgG 항체 역가
비-DNA 염기-함유 폴리뉴클레오타이드의 면역 애주번트 활성은 표준 모델(마우스에서 B형 간염 표면 항원에 대항하는 항체 반응)로 측정하였다. 이러한 항원에 대항하는 면역 반응은 이러한 항원에 있어서만 특이적인 것으로서 간주되지 않는다. 대조적으로, 백신 제제화 및 개발에 통상의 지식을 가진 사람에게 공지된 기타 항원 및 기타 백신 애주번트의 사용은 자명하며, 상기 및 백신 접종에서의 다른 일반적으로 공지된 사용 접근법은 비-DNA 염기-함유 폴리뉴클레오타이드로의 애주번트화된 단백질, 펩티드, 카보하이드레이트 및 지질 항원을 함유하는 백신을 개발하는데 사용될 수 있다. 하기 예는 예방 또는 치료적 방법에서 보호성인 것으로 통상적으로 간주되는 면역 반응을 백신 애주번트가 끌어낼 수 있는 동안 비-DNA 염기-함유 폴리뉴클레오타이드를 사용하는 방법을 설명한다.
5 마리 암컷 BALB/c 마우스 군을 재조합 B형 간염 표면 항원(재조합 HBsAg; Cortex Biochemical, San Leandro, CA, USA) 및 알루미늄 히드록사이드 겔의 여러 결합물(백반; SuperFos Biosector, Vedback, Denmark) 및/또는 서열 번호: 1 내지 3(각각 NebGGTGNeb, UUGTUU 및 IIGTII)로 0일, 21일 및 31일에 근육내(I.M.) 투여 경로를 사용하여 면역화하였다. 백반으로의 착화는 면역화 이전에 백반과 항원 및 비-DNA 염기-함유 폴리뉴클레오타이드를 혼합하여 획득하였다. Sera는 41일에 수집하고, HRP(Southern Biotechnologies, Birmingham, Alabama)에 컨쥬게이트된 염소 항-마우스 IgG, IgG1, IgG2a 및 IgG2b 항체 및 HBsAg(1㎍/웰, 96 웰 미량역가 플레이트)를 사용한 ELISA에 의해 항-HBsAg IgG 총 IgG1, IgG2a 및 IgG2b 항체의 존재를 분석하였다. 항체 역가는 종점 역가(end-point titer)로서 측정되었다. 통상적인 면역화 연구 결과를 표 2 내지 표 5에 나타냈다.
백반 및/또는 비-DNA 염기-함유 폴리뉴클레오타이드 결합물로 HBsAg에 의한 면역화 이후에 BALB/c 마우스에서 항-HBsAg IgG(총) 역가.
총 IgG
군 면역화 절차 항-HBsAg 역가*
평균 표준 편차
1 대조군 식염수 16 22
2 HBsAg 1㎍ 80 630 98 421
3 HBsAg 1㎍ + 백반 10㎍ 157 649 107 948
4 HBsAg 1㎍ + 서열 번호: 1 10㎍ 109 647 57 962
5 HBsAg 1㎍ + 서열 번호: 1 10㎍ + 백반 10㎍ 127 545 84 082
6 HBsAg 1㎍ + 서열 번호: 2 10㎍ 69 812 24 792
7 HBsAg 1㎍ + 서열 번호: 2 10㎍ + 백반 10㎍ 438 156 221 991
8 HBsAg 1㎍ + 서열 번호: 3 10㎍ 147 941 152 424
9 HBsAg 1㎍ + 서열 번호: 3 10㎍ + 백반 10㎍ 171 852 90 252
* 군 당 5마리 마우스
백반 및/또는 비-DNA 염기-함유 폴리뉴클레오타이드 결합물로 HBsAg에 의한 면역화 이후에 BALB/c 마우스에서의 항-HBsAg IgG 역가.
IgG1
군 면역화 절차 항-HBsAg 역가*
평균 표준 편차
1 대조군 식염수 0 0
2 HBsAg 1㎍ 52 929 60 268
3 HBsAg 1㎍ + 백반 10㎍ 100 395 66 606
4 HBsAg 1㎍ + 서열 번호: 1 10㎍ 88 491 53 085
5 HBsAg 1㎍ + 서열 번호: 1 10㎍ + 백반 10㎍ 237 930 206 102
6 HBsAg 1㎍ + 서열 번호: 2 10㎍ 60 086 16 198
7 HBsAg 1㎍ + 서열 번호: 2 10㎍ + 백반 10㎍ 257 454 220 364
8 HBsAg 1㎍ + 서열 번호: 3 10㎍ 112 141 107 727
9 HBsAg 1㎍ + 서열 번호: 3 10㎍ + 백반 10㎍ 185 656 172 171
* 군 당 5마리 마우스
백반 및/또는 비-DNA 염기-함유 폴리뉴클레오타이드 결합물로 HBsAg에 의한 면역화 이후에 BALB/c 마우스에서의 항-HBsAg IgG2a 역가.
IgG2a
군 면역화 절차 항-HBsAg 역가*
평균 표준 편차
1 대조군 식염수 4 0
2 HBsAg 1㎍ 349 498
3 HBsAg 1㎍ + 백반 10㎍ 3 276 4 169
4 HBsAg 1㎍ + 서열 번호: 1 10㎍ 1 850 1 504
5 HBsAg 1㎍ + 서열 번호: 1 10㎍ + 백반 10㎍ 26 268 55 568
6 HBsAg 1㎍ + 서열 번호: 2 10㎍ 3 595 5 394
7 HBsAg 1㎍ + 서열 번호: 2 10㎍ + 백반 10㎍ 10 722 12 038
8 HBsAg 1㎍ + 서열 번호: 3 10㎍ 5 217 7 557
9 HBsAg 1㎍ + 서열 번호: 3 10㎍ + 백반 10㎍ 12 533 5 280
* 군 당 5마리 마우스
백반 및/또는 비-DNA 염기-함유 폴리뉴클레오타이드 결합물로 HBsAg에 의한 면역화 이후에 BALB/c 마우스에서의 항-HBsAg IgG2b 역가.
IgG2b
군 면역화 절차 항-HBsAg 역가*
평균 표준 편차
1 대조군 식염수 0 0
2 HBsAg 1㎍ 862 1 422
3 HBsAg 1㎍ + 백반 10㎍ 3 217 3 565
4 HBsAg 1㎍ + 서열 번호: 1 10㎍ 3 430 3 586
5 HBsAg 1㎍ + 서열 번호: 1 10㎍ + 백반 10㎍ 46 602 97 608
6 HBsAg 1㎍ + 서열 번호: 2 10㎍ 2 864 2 735
7 HBsAg 1㎍ + 서열 번호: 2 10㎍ + 백반 10㎍ 13 540 11 945
8 HBsAg 1㎍ + 서열 번호: 3 10㎍ 3 265 2 572
9 HBsAg 1㎍ + 서열 번호: 3 10㎍ + 백반 10㎍ 9 251 3 970
* 군 당 5마리 마우스
상기 결과는 비-DNA 염기-함유 폴리뉴클레오타이드에 있어서의 면역애주번트 활성을 나타낸다. 본 실시예에서, 서열 번호: 1-3은 백반과 착화되는 경우 항-항원 IgG 항체에 의해 측정되는 것과 같이 세 개의 비-DNA 염기-함유 폴리뉴클레오타이드에 있어서의 현저한 면역애주번트 활성을 나타내며, 획득된 항체 역가는 표준 애주번트 백반에 착화된 항원 또는 항원 단독에 있어서 나타난 것보다 더 높다. 가장 의미 있는 입증은 백반의 사용으로 비-DNA 염기-함유 폴리뉴클레오타이드의 면역 애주번트 활성이 강화되었는데도 불구하고, 상기 비-DNA 염기-함유 폴리뉴클레오타이드는 항원-특이적 항체의 더 높은 수준을 이끌어내는 수단으로서 용해성 항원과 결합한 미립자 담체 없이 사용될 수 있다는 것이다. 가장 의미 있는 확인은 애주번트로서 단독으로 또는 백반 담체와 결합해서 비-DNA 염기-함유 폴리뉴클레오타이드의 사용으로 IgG2a 및 IgG2b 아형의 IgG 항체 수준이 증가한다. 이러한 항체는 바이러스 항원에 대항하는 면역 반응을 유도하는 경우 특정 이점으로서 당 업에 통상의 지식을 가진 사람에게 인지되어 있다.
실시예 4
비- DNA 염기-함유 폴리뉴클레오타이드의 면역 애주번트 활성 - 비- DNA 염기-함유 폴리뉴클레오타이드에 의한 면역화 이후 항- H1N1 비리온 IgG 항체 역가
비-DNA 염기-함유 폴리뉴클레오타이드의 면역 애주번트 활성은 표준 모델(마우스에서 H1N1 비리온에 대항하는 항체 반응)에서 측정하였다. 이러한 항원에 대항하는 면역 반응은 이러한 비리온에만 특이적인 것으로 간주되지 않는다. 대조적으로, 백신 제조 및 개발 분야에 통상의 지식을 가진 사람에게 공지되어 있는 다른 비리온 및 다른 백신 애주번트의 사용이 자명하며, 상기 및 기타 일반적으로 공지된 백신 접종에서 사용되는 접근법은 비-DNA 염기-함유 폴리뉴클레오타이드와의 애주번트화되는 단백질, 펩티드, 카보하이드레이트 및 지질 항원을 함유하는 백신의 개발에 사용될 수 있다. 하기 실시예는 예방 또는 치료 방법에서 보호되는 것으로 통상적으로 생각되는 면역 반응을 백신 애주번트가 이끌 수 있는 것과 같이 비-DNA 염기-함유 폴리뉴클레오타이드의 사용 방법을 설명한다.
5 마리의 암컷 C57BL/6 마우스 군은 H1N1 비리온(Genway Biotech, 미국 캘리포니아주의 샌디에이고시에 소재, Influenza type A Beijing H1N1) 및 알루미늄 히드록사이드 겔의 여러 결합물(백반; SuperFos Biosector, Vedback, Denmark) 및/또는 서열 번호: 1 내지 9로 0일, 21일 및 31일에 근육 내(I.M.) 투여 경로를 사용하여 면역화하였다. 백반으로의 착화는 면역화 이전에 백반으로 비-DNA 염기-함유 폴리뉴클레오타이드 및 H1N1 비리온을 혼합하여 획득하였다. Sera는 41일에 수집하고, HRP(Southern Biotechnologies, 앨라바마주 버밍햄에 소재)에 컨쥬게이트된 염소 항-마우스 IgG, IgG1 및 IgG2b 항체 및 H1N1 비리온(1㎍/웰, 96 웰 미량역가 플레이트)를 사용한 표준 ELISA에 의해 항-H1N1 비리온 IgG1 및 IgG2b 항체의 존재를 분석하였다. 항체 역가는 종점 역가로서 측정되었다. 통상적인 면역화 연구 결과를 표 6 내지 표 7에 나타냈다.
백반 및/또는 비-DNA 염기-함유 폴리뉴클레오타이드 결합물로 H1N1 비리온에 의한 면역화 이후에 C57/BL-6 암컷 마우스에서의 항-H1N1 비리온 IgG1 항체 역가.
IgG1
군 면역화 절차 항-H1N1 역가*
평균 표준 편차
1 대조군 식염수 44 98
2 H1N1 1㎍ 9554 7156
3 H1N1 1㎍ + 백반 10㎍ 47422 24890
4 H1N1 1㎍ + 서열 번호: 1 10㎍ 2270 2215
5 H1N1 1㎍ + 백반 10㎍ + 서열 번호: 1 10㎍ 69528 38017
6 H1N1 1㎍ + 서열 번호: 2 10㎍ 3863 1984
7 H1N1 1㎍ + 백반 10㎍ + 서열 번호: 2 10㎍ 26359 14472
8 H1N1 1㎍ + 서열 번호: 3 10㎍ 3508 2069
9 H1N1 1㎍ + 백반 10㎍ + 서열 번호: 3 10㎍ 22238 9392
10 H1N1 1㎍ + 서열 번호: 4 10㎍ 8435 11344
11 H1N1 1㎍ + 백반 10㎍ + 서열 번호: 4 10㎍ 53768 28138
12 H1N1 1㎍ + 서열 번호: 5 10㎍ 6551 4870
13 H1N1 1㎍ + 백반 10㎍ + 서열 번호: 5 10㎍ 30316 24590
14 H1N1 1㎍ + 서열 번호: 6 10㎍ 15566 22080
15 H1N1 1㎍ + 백반 10㎍ + 서열 번호: 6 10㎍ 21634 17778
16 H1N1 1㎍ + 서열 번호: 7 10㎍ 15567 32622
17 H1N1 1㎍ + 백반 10㎍ + 서열 번호: 7 10㎍ 29788 28747
18 H1N1 1㎍ + 서열 번호: 8 10㎍ 2477 3348
19 H1N1 1㎍ + 백반 10㎍ + 서열 번호: 8 10㎍ 28214 18376
20 H1N1 1㎍ + 서열 번호: 9 10㎍ 2249 1619
21 H1N1 1㎍ + 백반 10㎍ + 서열 번호: 9 10㎍ 18956 13527
* 군 당 5마리 마우스
백반 및/또는 비-DNA 염기-함유 폴리뉴클레오타이드 결합물로 H1N1 비리온에 의한 면역화 이후에 C57/BL-6 암컷 마우스에서의 항-H1N1 비리온 IgG2b 항체 역가.
IgG2b
군 면역화 절차 항-H1N1 역가*
평균 표준 편차
1 대조군 식염수 0 0
2 H1N1 1㎍ 8179 2411
3 H1N1 1㎍ + 백반 10㎍ 12152 8921
4 H1N1 1㎍ + 서열 번호: 1 10㎍ 6521 3000
5 H1N1 1㎍ + 백반 10㎍ + 서열 번호: 1 10㎍ 12429 7764
6 H1N1 1㎍ + 서열 번호: 2 10㎍ 22994 18153
7 H1N1 1㎍ + 백반 10㎍ + 서열 번호: 2 10㎍ 25112 18866
8 H1N1 1㎍ + 서열 번호: 3 10㎍ 12456 8189
9 H1N1 1㎍ + 백반 10㎍ + 서열 번호: 3 10㎍ 18016 5225
10 H1N1 1㎍ + 서열 번호: 4 10㎍ 9420 9191
11 H1N1 1㎍ + 백반 10㎍ + 서열 번호: 4 10㎍ 31431 30917
12 H1N1 1㎍ + 서열 번호: 5 10㎍ 19056 31508
13 H1N1 1㎍ + 백반 10㎍ + 서열 번호: 5 10㎍ 19574 24662
14 H1N1 1㎍ + 서열 번호: 6 10㎍ 15967 11635
15 H1N1 1㎍ + 백반 10㎍ + 서열 번호: 6 10㎍ 10552 4563
16 H1N1 1㎍ + 서열 번호: 7 10㎍ 14668 15155
17 H1N1 1㎍ + 백반 10㎍ + 서열 번호: 7 10㎍ 25382 27791
18 H1N1 1㎍ + 서열 번호: 8 10㎍ 5776 2810
19 H1N1 1㎍ + 백반 10㎍ + 서열 번호: 8 10㎍ 10431 2921
20 H1N1 1㎍ + 서열 번호: 9 10㎍ 3634 1990
21 H1N1 1㎍ + 백반 10㎍ + 서열 번호: 9 10㎍ 8683 6266
* 군 당 5마리 마우스
표 6에서 나타낸 결과는 비-DNA 염기-함유 폴리뉴클레오타이드 서열 번호: 1, 2, 3, 5 및 9가 H1N1 비리온 단독을 투여하는 경우 IgG1 항체 역가를 감소시키는 능력을 갖는다는 것을 설명한다. 비-DNA 염기-함유 폴리뉴클레오타이드 서열 번호: 6 및 7은 H1N1 비리온 단독이 투여되는 경우 항-IgG1 항체 수준을 자극하였다. 서열 번호: 8은 H1N1 비리온 단독을 투여한 경우 항-IgG1 항체 역가에 미치는 효과가 없었다. H1N1 비리온이 백반 및 비-DNA 염기-함유 폴리뉴클레오타이드에 착화되는 경우 단지 서열 번호: 2 및 4가 백반 단독에 착화된 H1N1과 비교하는 경우 IgG1 항체 역가가 증가시켰다. 이러한 자료는 적당한 비-DNA 염기-함유 폴리뉴클레오타이드 및 제제(식염수에서의 가용성 제제 또는 담체 백반에 착화된 가용성 제제)를 사용해서 H1N1에 대항하는 IgG1 반응을 강화 또는 약화시킬 수 있다는 것을 설명한다.
표 7에 나타낸 결과는 비-DNA 염기-함유 폴리뉴클레오타이드 서열 번호: 1, 8 및 9가 H1N1 비리온 단독으로 투여되는 경우 IgG2b 항체 역가를 감소시키는 능력을 갖는다는 것을 설명한다. 비-DNA 염기-함유 폴리뉴클레오타이드 서열 번호: 2, 3, 5, 6 및 7은 H1N1 비리온 단독으로 투여되는 경우 항-IgG1 항체 수준을 자극하였다. 서열 번호: 4는 H1N1 비리온 단독으로 투여하는 경우 항-IgG2b 항체 역가에 미치는 효과가 없다. H1N1 비리온이 비-DNA 염기-함유 폴리뉴클레오타이드 및 백반에 착화되는 경우, 서열 번호: 1, 2, 3, 4, 5 및 7은 단독으로 백반에 착화된 H1N1와 비교하는 경우 항체 역가를 증가시킨다. 서열 번호: 6, 8 및 9는 백반에 착화되는 경우 IgG2b 항-H1N1 항체 수준에 미치는 효과가 없다. 이러한 자료는 적당한 비-DNA 염기-함유 폴리뉴클레오타이드 및 제제(식염수 중의 가용성 제제 또는 담체 백반에 착화되는 가용성 제제)를 사용하여 H1N1 비리온에 대항하는 IgG2b 반응을 약화 또는 강화시킬 수 있다는 것을 설명한다.
실시예 5
비- DNA 염기-함유 폴리뉴클레오타이드의 면역 애주번트 활성 - 비- DNA 염기-함유 폴리뉴클레오타이드로 면역화한 이후의 항- H1N1 비리온 IgG 항체 역가 - 항원 절감 효과
항원-절감 효과 애주번트로서 기능하는 비-DNA 염기-함유 폴리뉴클레오타이드의 능력은 마우스에서 H1N1 비리온 모델 시스템을 사용해서 증가시켰다. 간결한 면역화 스케줄 및 감소된 비리온 시험감염 용량을 대유행 인플루엔자 발생 중 부딪칠 수 있는 백신 제한을 나타내도록 의도적으로 선택하였다. 5 마리 암컷 C57BL/6 마우스 군은 면역 용량이 0.1 및 0.01㎍/주입의 H1N1 비리온(Genway Biotech, 미국 캘리포니아주의 샌디에이고시에 소재, Influenza A Beijing H1N1) 및 알루미늄 히드록사이드 겔의 여러 결합물(백반; SuperFos Biosector, 덴마크 베드박에 소재) 및/또는 서열 번호: 1, 3, 4, 5, 6 및 7로 0일 14일에 근육내(I.M.) 투여 경로를 사용해서 면역화하였다. 백반에 대한 착화는 면역화 이전에 백반과 H1N1 비리온 및 비-DNA 염기-함유 폴리뉴클레오타이드를 혼합하여 획득하였다. Sera는 22일에 수집하고, HRP(Southern Biotechnologies, 앨라바마주 버밍햄에 소재)에 컨쥬게이트된 염소 항-마우스 IgG1 IgG2b 항체 및 H1N1 비리온(1㎍/웰, 96 웰 미량역가 플레이트)를 사용한 표준 ELISA에 의해 항-H1N1 비리온 IgG2b 항체의 존재를 분석하였다. 항체 역가는 종점 역가로서 측정되었다. 통상적인 면역화 연구 결과를 표 8 내지 표 11에 나타냈다.
백반 및/또는 비-DNA 염기-함유 폴리뉴클레오타이드 결합물로 0.1㎍ H1N1 비리온에 의한 면역화 이후에 C57/BL-6 암컷 마우스에서의 항-H1N1 비리온 IgG2b 항체 역가.
IgG1
군 면역화 절차 항-H1N1 역가*
평균 표준 편차
1 대조군 식염수 4 80
2 H1N1 0.1㎍ 458 497
3 H1N1 0.1㎍ + 백반 10㎍ 1538 2320
4 H1N1 0.1㎍ + 서열 번호: 1 10㎍ 594 834
5 H1N1 0.1㎍ + 백반 10㎍ + 서열 번호: 1 10㎍ 11054 6882
6 H1N1 0.1㎍ + 서열 번호: 3 10㎍ 168 234
7 H1N1 0.1㎍ + 백반 10㎍ + 서열 번호: 3 10㎍ 2907 3422
8 H1N1 0.1㎍ + 서열 번호: 4 10㎍ 781 567
9 H1N1 0.1㎍ + 백반 10㎍ + 서열 번호: 4 10㎍ 28908 27948
10 H1N1 0.1㎍ + 서열 번호: 5 10㎍ 65 110
11 H1N1 0.1㎍ + 백반 10㎍ + 서열 번호: 5 10㎍ 6519 8183
12 H1N1 0.1㎍ + 서열 번호: 6 10㎍ 866 820
13 H1N1 0.1㎍ + 백반 10㎍ + 서열 번호: 6 10㎍ 9066 5870
14 H1N1 0.1㎍ + 서열 번호: 7 10㎍ 29 60
15 H1N1 0.1㎍ + 백반 10㎍ + 서열 번호: 7 10㎍ 6327 3945
* 군 당 5마리 마우스
백반 및/또는 비-DNA 염기-함유 폴리뉴클레오타이드 결합물로 0.1㎍ H1N1 비리온에 의한 면역화 이후에 C57/BL-6 암컷 마우스에서의 항-H1N1 비리온 IgG2b 항체 역가.
IgG2b
군 면역화 절차 항-H1N1 역가*
평균 표준 편차
1 대조군 식염수 26 59
2 H1N1 0.1㎍ 206 267
3 H1N1 0.1㎍ + 백반 10㎍ 700 1097
4 H1N1 0.1㎍ + 서열 번호: 1 10㎍ 659 506
5 H1N1 0.1㎍ + 백반 10㎍ + 서열 번호: 1 10㎍ 659 506
6 H1N1 0.1㎍ + 서열 번호: 3 10㎍ 65 126
7 H1N1 0.1㎍ + 백반 10㎍ + 서열 번호: 3 10㎍ 971 1282
8 H1N1 0.1㎍ + 서열 번호: 4 10㎍ 355 267
9 H1N1 0.1㎍ + 백반 10㎍ + 서열 번호: 4 10㎍ 2598 1825
10 H1N1 0.1㎍ + 서열 번호: 5 10㎍ 0 0
11 H1N1 0.1㎍ + 백반 10㎍ + 서열 번호: 5 10㎍ 2156 3222
12 H1N1 0.1㎍ + 서열 번호: 6 10㎍ 715 776
13 H1N1 0.1㎍ + 백반 10㎍ + 서열 번호: 6 10㎍ 3893 3112
14 H1N1 0.1㎍ + 서열 번호: 7 10㎍ 10 11
15 H1N1 0.1㎍ + 백반 10㎍ + 서열 번호: 7 10㎍ 951 1056
* 군 당 5마리 마우스
백반 및/또는 비-DNA 염기-함유 폴리뉴클레오타이드 결합물로 0.01㎍ H1N1 비리온에 의한 면역화 이후에 C57/BL-6 암컷 마우스에서의 항-H1N1 비리온 IgG1 항체 역가.
IgG1
군 면역화 절차 항-H1N1 역가*
평균 표준 편차
1 대조군 식염수 04 8
2 H1N1 0.01㎍ 86 183
3 H1N1 0.01㎍ + 백반 10㎍ 7 15
4 H1N1 0.01㎍ + 서열 번호: 1 10㎍ 20 44
5 H1N1 0.01㎍ + 백반 10㎍ + 서열 번호: 1 10㎍ 451 694
6 H1N1 0.01㎍ + 서열 번호: 3 10㎍ 28 38
7 H1N1 0.01㎍ + 백반 10㎍ + 서열 번호: 3 10㎍ 203 242
8 H1N1 0.01㎍ + 서열 번호: 4 10㎍ 337 542
9 H1N1 0.01㎍ + 백반 10㎍ + 서열 번호: 4 10㎍ 0 0
10 H1N1 0.01㎍ + 서열 번호: 5 10㎍ 78 174
11 H1N1 0.01㎍ + 백반 10㎍ + 서열 번호: 5 10㎍ 580 534
12 H1N1 0.01㎍ + 서열 번호: 6 10㎍ 31 67
13 H1N1 0.01㎍ + 백반 10㎍ + 서열 번호: 6 10㎍ 1628 2067
14 H1N1 0.01㎍ + 서열 번호: 7 10㎍ 0 0
15 H1N1 0.01㎍ + 백반 10㎍ + 서열 번호: 7 10㎍ 247 457
* 군 당 5마리 마우스
백반 및/또는 비-DNA 염기-함유 폴리뉴클레오타이드 결합물로 0.01㎍ H1N1 비리온에 의한 면역화 이후에 C57/BL-6 암컷 마우스에서의 항-H1N1 비리온 IgG2b 항체 역가.
IgG2b
군
 면역화 절차
 항-H1N1 역가*
평균 표준 편차
1 대조군 식염수 026 590
2 H1N1 0.01㎍ 13 29
3 H1N1 0.01㎍ + 백반 10㎍ 3 6
4 H1N1 0.01㎍ + 서열 번호: 1 10㎍ 3 8
5 H1N1 0.01㎍ + 백반 10㎍ + 서열 번호: 1 10㎍ 150 208
6 H1N1 0.01㎍ + 서열 번호: 3 10㎍ 80 125
7 H1N1 0.01㎍ + 백반 10㎍ + 서열 번호: 3 10㎍ 302 575
8 H1N1 0.01㎍ + 서열 번호: 4 10㎍ 9 19
9 H1N1 0.01㎍ + 백반 10㎍ + 서열 번호: 4 10㎍ 48 52
10 H1N1 0.01㎍ + 서열 번호: 5 10㎍ 1 2
11 H1N1 0.01㎍ + 백반 10㎍ + 서열 번호: 5 10㎍ 34 75
12 H1N1 0.01㎍ + 서열 번호: 6 10㎍ 0 0
13 H1N1 0.01㎍ + 백반 10㎍ + 서열 번호: 6 10㎍ 1149 1593
14 H1N1 0.01㎍ + 서열 번호: 7 10㎍ 3 6
15 H1N1 0.01㎍ + 백반 10㎍ + 서열 번호: 7 10㎍ 1 2
* 군 당 5마리 마우스
표 8 내지 표 11에 나타낸 결과는 비-DNA 염기-함유 폴리뉴클레오타이드로 0.1㎍ 또는 0.01㎍/주입의 낮은 비리온 시험감염 용량에서 H1N1 비리온을 애주번트화하고, 간략한 면역화 방식을 사용함으로써 H1N1이 단독으로 또는 백반에 착화되어 면역원성이 없는 것으로 미미하게 나타나는 조건하에서 IgG1 및 IgG2b 부류의 항-H1N1 항체를 유도할 수 있다는 것을 보여준다. 최적의 항체 반응은 비-DNA 염기-함유 폴리뉴클레오타이드 및 비리온에 있어서의 담체로서 백반을 사용해서 수득하였다. 따라서 비-DNA 염기-함유 폴리뉴클레오타이드는 최적의 면역화 스케줄보다 적게 사용하는 경우에도 항원-절감 효과 애주번트로서 사용될 수 있다.
실시예 6
비- DNA 염기-함유 폴리뉴클레오타이드의 면역 애주번트 활성 - 비- DNA 염기-함유 폴리뉴클레오타이드로 면역화한 이후의 항-인간 혈청 알부민 IgG 항체 역가
(서브-유닛 항원성 단백질 백신의 대표 모델로서) 단백질 항원을 사용한 비-DNA 염기-함유 폴리뉴클레오타이드의 면역 애주번트 활성을 마우스에서 인간 혈청 알부민을 사용해서 조사하였다. 본 연구는 백반과 같은 백신 담체 애주번트의 부재하에 가용성 펩티드 및 가용성 항원으로 면역화하는 효과를 측정하려는 의도였다. 5 마리 암컷 C57BL/6 마우스(Charles River Laboratories Inc., 캐나다 퀘벡주 세인트 콘스탄트에 소재) 군을 서열 번호: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 및 9와 결합하거나 또는 결합하지 않고 1㎍/주입의 면역화 용량에서 인간 혈청 알부민(HSA, Sigma-Aldrich Canada, 캐나다 온타리오주 오크빌에 소재 #A9731, 28.5 mg/㎖)으로 0 일 및 21일에 근육내(I.M.) 투여 경로를 사용해서 면역화하였다. 폴리뉴클레오타이드는 미립자 담체 시스템은 사용하지 않고, 면역화 이전에 식염수에서 HSA와 간단하게 혼합하였다. Sera는 29-30일에 수집하고, HRP(Southern Biotechnologies, 앨라바마주 버밍햄에 소재)에 컨쥬게이트된 염소 항-마우스 IgG 항체 및 HSA(1㎍/웰, 96 웰 미량역가 플레이트)를 사용한 표준 ELISA에 의해 항-HAS IgG 항체의 존재를 분석하였다. 항체 역가는 종점 역가로서 측정되었다. 통상적인 면역화 연구 결과를 표 12에 나타냈다.
1㎍ HSA 및/또는 비-DNA 염기-함유 폴리뉴클레오타이드로 면역화한 이후에 C57/BL-6 암컷 마우스에서의 항-HSA IgG 항체 역가.
총 IgG
군 면역화 절차 항-H1N1 역가*
평균 표준 편차
1 대조군 식염수 0 0
2 HSA 1㎍ 1888 4004
3 HSA 1㎍ + 서열 번호: 1 10㎍ 88 164
4 HSA 1㎍ + 서열 번호: 2 10㎍ 0 0
5 HSA 1㎍ + 서열 번호: 3 10㎍ 364 586
6 HSA 1㎍ + 서열 번호: 4 10㎍ 5662 9129
7 HSA 1㎍ + 서열 번호: 5 10㎍ 14516 25511
8 HSA 1㎍ + 서열 번호: 6 10㎍ 4003 5651
9 HSA 1㎍ + 서열 번호: 7 10㎍ 168 346
10 HSA 1㎍ + 서열 번호: 8 10㎍ 2 5
11 HSA 1㎍ + 서열 번호: 9 10㎍ 0 0
* 군 당 5마리 마우스
본 연구 결과는 식염수에서 폴리뉴클레오타이드와 HSA를 혼합하면 2 타입의 애주번트 효과가 수득된다고 설명한다. 첫 번째로는 서열 번호: 1, 2, 3, 7, 8 및 9로 HSA 단독으로 한 경우와 비교해서 IgG 항체 역가가 감소하였다. 두 번째로 서열 번호: 4, 5 및 6은 HSA 단독으로 사용한 경우와 비교해서 IgG 항체 역가가 증가하였다. 이러한 자료로부터 비-DNA 염기-함유 폴리뉴클레오타이드는 5'OH, 3'OH 비보호형 포스포다이에스터 비-DNA 염기-함유 폴리뉴클레오타이드로서 이들의 가용성 형태의 항원과 함께 조성물로서 투여되는 경우 면역 애주번트 활성(즉, 항체 반응의 억제 또는 자극)에 대해서 면역 조절자로서 활성이 있는 능력을 갖는다는 것이 명백하게 알 수 있다.
실시예 7
비- DNA 염기-함유 폴리뉴클레오타이드에 의한 인간 PBMC 세포로부터의 사이토카인 유도
다수의 면역 애주번트가 인간 PBMC 세포로부터 사이토카인을 끌어낼 수 있다고 공지되었다. 이러한 애주번트의 예는 백반, 리포폴리사카라이드, 모노포스포릴 지질 A, CpG-함유 폴리뉴클레오타이드 및 비-CpG-함유 ODN뿐만 아니라 마이코박테리아 세포벽-DNA 착체(MCC)이다. 3 명의 건강한 성인 개체로부터 수득된 인간 PBMC로부터 사이토카인을 유도하는 비-DNA 염기-함유 폴리뉴클레오타이드, 특히 서열 번호: 1-3(1-100㎍/㎖)의 능력을 측정하였다. PBMC를 표준 피콜-파퀴(GE Healthcare Life Sciences, Baie d'Urfe, 캐나다 퀘백주에 소재) 그래디언트 원심분리를 사용해서 전 혈액으로부터 분리하고, 106 세포/㎖(총 부피: Wisent, St-Bruno, QC, Canada로부터 둘 다의 10% 열-불활성화 FBS를 함유하는 RPMI 1640 중 1㎖) 농도 및 50㎍/㎖ 젠타마이신 설페이트(Sigma-Aldrich Canada, 캐나다 온타리오주의 오크빌시에 소재)에서 조직 배양 플레이트에 둔다. 서열 번호: 1, 2 또는 3은 최종 농도가 100㎍/㎖가 되도록 첨가하고, 세포는 48 시간 동안 배양하였다. 배양 마지막에 현탁물 중 사이토카인(IL-1β, IL-2, IL-6, IL-10 및 IL-12p40)을 사이토카인 캡처 분석 공정(Biosource, 캘리포니아주 카마릴로시에 소재)을 사용하는 ELISA로 측정하였다. 서열 번호: 32 CpG 2006 ODN(1-100 g/㎖, 5'-TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT-3', A-부류 CpG), MCC (1-100㎍/㎖) 및 LPS(10㎍/㎖)를 양성 대조군으로서 사용하였다. 사이토카인 캡처 분석 결과를 표 13에 나타냈다.
비-DNA 염기-함유 폴리뉴클레오타이드에 의한 인간 PBMC 중의 사이토카인 합성 유도.
처리 반응개체 수1
IL-1β IL-2 IL-6 IL-10 IL-12p40
서열 번호: 1 3/3 0/3 3/3 0/3 3/3
서열 번호: 2 0/3 0/3 1/3 0/3 3/3
서열 번호: 3 0/3 0/3 3/3 0/3 0/3
서열 번호: 0/3 0/3 3/3 2/3 1/3
32 CpG 2006
MCC 3/3 0/3 3/3 3/3 3/3
LPS 3/3 0/3 3/3 3/3 3/3
1 결과는 백그라운드 대조군 처치의 것에 비해 사이토카인 수준이 2배 증가한 것에 반응하는 개체 수로서 나타낸다.
상기 결과는 비-DNA 염기-함유 폴리뉴클레오타이드가 CpG 2006, MCC 또는 LPS의 것과는 별개인 사이토카인 합성 자극 프로파일을 갖는다는 것을 설명한다. 본 발명의 비-DNA 염기-함유 폴리뉴클레오타이드에 의해 유도되는 사이토카인 수준은 또한 MCC 또는 LPS(10배 적음)에 의해 유도되는 것보다 현저하게 낮았으며, 하기를 지지하길 원하지 않지만, 이러한 자료로 사이토카인 유도 능력은 비-DNA 염기-함유 폴리뉴클레오타이드의 면역 애주번트 활성과 직접적으로 관련이 없는 것을 강하게 나타낸다.
실시예 8
포스포로티오에이트 CpG -함유 폴리뉴클레오타이드와 비교해 볼 때 인간 PBMC 로부터의 사이토카인 유도
별개의 연구에서 인간 PBMC 군에서 사이토카인 합성을 유도하는 비-DNA 염기-함유 폴리뉴클레오타이드의 능력을 측정하고, 다수의 CpG-함유 포스포로티오에이트 폴리뉴클레오타이드의 것과 비교하였다. LPS 및 MCC는 실시예 7에서 기재한 것과 같은 양성 대조군으로서 포함하였다. PBMC는 표준 피콜-파퀴 플러스(GE Healthcare Life Sciences, Baie d'Urfe, 캐나다 퀘벡주에 소재) 그래디언트 원심분리를 사용해서 전 혈액으로부터 분리하고, 1×106 세포/㎖[총 부피: 10 % 열-불활성화 FBS(둘 다 Wisent, 케나다 퀘벡주의 생-브휴노시에 소재) 및 50㎍/㎖ 젠타마이신 설페이트(Sigma-Aldrich Canada, 캐나다 온타리오주의 오크빌시에 소재)를 함유하는 RPMI 1640 배지 중 1㎖] 농도에서 조직 배양 플레이트에 둔다. 비-DNA 염기-함유 폴리뉴클레오타이드 서열 번호: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 및 9를 첨가하여 최종 농도를 10㎍/㎖로 만들고, 비-CpG 4010, CpG 2336, CpG 2429 및 CpG 7909 폴리뉴클레오타이드, 서열 번호: 31, 33, 35 및 34를 각각 첨가하여 최종 농도를 10㎍/㎖로 만들었다.
다음에 세포를 48 시간 동안 배양하였다. 배양 현탁액 중 사이토카인(인터루킨 IL-6 및 IL-10, 케모카인 MCP-1 및 RANTES)을 바이오-플렉스 200 시스템(Bio-Rad Laboratories, Hercules, 미국 캘리포니아주에 소재) 상의 Milliplex™ MAP 키트(Millipore Corporation, 미국 매사추세츠주 빌러리카에 소재)를 사용해서 측정하였다. 모노사이트 화학주성 단백질로도 알려진 MCP-1은 내피 및 상피 장벽을 가로질러 트래피킹하고, 효과적인 모노사이트 및 골수 수지상 세포에 필요한 필수 케모카인이며(예를 들어, Henkel et al , 2004 Ann . Neurol . 55:221-235 참조), RANTES(보다 일반적으로는 현재 CCL5로 알려진 분비 및 발현된 정상 T 세포의 활성화 제어)는 기억 표현형 T 세포에 의해서 생성되며, T 세포에 화학 주성이고, T 세포를 활성화시킨다(예를 들면, Swanson et al, 2002 Immunity 17:605- 615 참조). 본 연구 결과를 표 14에 나타냈다.
CpG-함유 폴리뉴클레오타이드와 비교할 때 인간 PBMC에서의 사이토카인 합성의 유도.
처리
 사이토카인(pg/㎖)
IL-6 IL-10 MCP-1 RANTES
(CCL5)
대조군 0 0 32 70
LPS 6337 2 1063 121
MCC 738 14 6556 178
서열 번호: 1 26 0 160 93
서열 번호: 2 6 0 196 66
서열 번호: 3 1 0 57 72
서열 번호: 4 1960 28 7000 211
서열 번호: 5 845 13 3600 202
서열 번호: 6 0 0 48 137
서열 번호: 7 1 0 79 71
서열 번호: 8 0 0 78 78
서열 번호: 9 133 1 914 117
서열 번호: 31 43 0 343 275
서열 번호: 33 9 0 573 105
서열 번호: 34 41 2 1270 187
서열 번호: 35 42 0 906 136
본 연구의 결과로 면역 자극제 LPS 및 MCC와 비교해서, 단지 서열 번호: 4 및 5는 인간 PBMC에 대해서 둘 다 강한 인터루킨(IL-6) 및 케모카인-유도 활성(MCP-1, RANTES)을 나타내는 것으로 알 수 있다. 서열 번호: 9는 단지 강한 MCP-1 유도 활성만 나타낸다. 서열 번호: 1, 2, 3, 6, 7 및 8은 중요하지 않거나 또는 인터루킨이 없으며, 케모카인 유도 활성도 미미하거나 없게 나타난다. CpG 폴리뉴클레오타이드(서열 번호: 33, 34, 35)는 사이토카인을 유도하지 않지만, 모두 강한 MCP-1 유도 활성을 갖는다. 비-CpG 4010 폴리뉴클레오타이드 서열 번호: 31도 또한 케모카인-유도 활성을 갖는다는 것을 알아야 한다. 상기 자료로부터 서열 번호; 1 내지 9가 포스포로티오에이트 백본 CpG 폴리뉴클레오타이드의 것과는 별개인 인터루킨 및 케모카인 유도 프로파일을 가지며, 인터루킨 및 케모카인 유도 능력은 이전 실시예에서 설명하는 것과 같은 면역 애주번트로서 활성을 갖는 능력과 상관관계가 없는 것이 명확해 졌다.
실시예 9
비- DNA 염기-함유 폴리뉴클레오타이드와 백반을 함유하는 백신의 코- 애주번트화
하기 실시예는 항원 담체 및 애주번트로서 사용되는 알루미늄 염(백반) 함유 종래 백신에 대한 면역 반응을 강화시키는데 본 발명의 폴리뉴클레오타이드 서열을 사용하는 것을 설명한다. 백반은 군-계 면역화 절차를 위한 안전한 애주번트로서 간주된다. 상업적으로 이용가능한 백신의 수가 큰 군을 알루미늄 염(예컨대 이에 제한되지는 않지만 알루미늄 하이드록사이드, 알루미늄 포스페이트 또는 알루미늄 설페이트)로 애주번트화한다. 이러한 백신은 본 발명의 비-DNA 염기-함유 폴리뉴클레오타이드를 사용하여 추가로 애주번트화하여 항체 생성 및 보호성 활성의 자극을 획득한다. 사용되는 비-DNA 염기-함유 폴리뉴클레오타이드의 용량(이에 제한되지는 않지만 1~100㎍/백신 용량 내)을 알루미늄 착화 단계 중 또는 전-면역화 즉시에 제조 공정 중 백신에 첨가하고, 개체 면역화는 (종래의 삼각근으로의 근육내) 투여 경로 및 설정된 백신 용량을 사용해서 설정된 백신 접종 절차에 따라 실행한다. 비-DNA 염기-함유 폴리뉴클레오타이드를 함유하는 알루미늄-애주번트화 백신으로의 면역화로 설정된 질환의 제거 또는 감염성 노출에 대한 내성 및 강화된 보호성 항체 역가에 의해 측정되는 것과 같이, 알루미늄-애주번트화 백신으로 백신 접종한 것과 비교하는 경우 최고의 면역 반응이 수득된다. 당 업에 통상의 지식을 가진 사람은 a) 면역화 수가 최적이 아니거나(예를 들면 3 면역화 대신 2) 또는 투여된 항원(들)이 최적 미만인 경우 예를 들면 유행 면역화 중에 강화된 면역 반응으로부터의 이점이 획득되며, 및 b) 백반과의 애주번트화된 백신에서의 항원 절감 효과가 비-DNA 염기-함유 폴리뉴클레오타이드와의 코-애주번트화로부터 획득된다는 것일 인지한다. 비-DNA 염기-함유 폴리뉴클레오타이드로부터 이득을 얻는 백신의 예로는 (이에 제한되지는 않지만) DTaP(디프테리아-파상풍-백일해) 백신, A형 간염 백신, A + B형 간염, Hib(해모필루스 인플루엔자 A) 백신, DTaP-IPV(불활성화 폴리오 바이러스)-B형 간염, 폐렴 구균, DT(디프테리아-파상풍) 백신, Hib-B형 간염 백신, HPV(인간 파필로마 바이러스), H1N1 백신 및 광견병 백신이 있다.
실시예 10
비- DNA 염기-함유 폴리뉴클레오타이드로의 오일계 애주번트 함유 백신의 코-애주번트화
하기 실시예는 애주번트로서 오일 또는 오일계 에멀젼을 함유하는 종래의 백신에 대한 면역 반응을 강화하는데 본 발명의 폴리뉴클레오타이드 서열의 사용을 설명한다. 특히 수의학 실험에 상용되는 것으로서 다 수의 상업적으로 이용가능한 백신을 오일 또는 오일계 에멀젼으로 애주번트화한다. 이러한 오일은 이에 제한되지는 않지만 미네랄 오일, 몬타니드(montanides) 또는 스쿠알렌을 포함한다. 이러한 백신은 본 발명의 비-DNA 염기-함유 폴리뉴클레오타이드를 사용해서 추가로 애주번트화되어 항체 생성 및 보호성 활성 자극을 획득한다. (이에 제한되지는 않지만 1-100㎍/백신 용량 범위 내로) 사용되는 비-DNA 염기-함유 폴리뉴클레오타이드의 용량을 제제화 단계 중 또는 전-면역화 즉시 백신에 첨가하고, 개체 면역화는 (이에 제한되지는 않지만 종래의 근육내 주입) 설정된 투여 경로 및 백신 용량을 사용해서 설정된 백신 접종 절차에 따라 실행한다. 비-DNA 염기-함유 폴리뉴클레오타이드를 함유하는 오일 또는 오일계 에멀젼 애주번트화 백신으로의 개체 면역화로 설정된 질환의 제거 또는 감염성 기관 노출에 대한 내성 즉 강화된 보호성 항체 역가로 측정되는 것과 같이, 단독으로 오일 또는 오일계 에멀젼 애주번트화 백신으로 백신 접종한 경우와 비교하는 경우 최고의 면역 반응이 수득된다. 당 업에 통상의 지식을 가진 사람은 a) 강화된 면역 반응으로부터의 이점이 또한 예를 들면 대유행 면역화 중 투여된 항원(들)의 용량이 최적 미만인 경우 또는 면역화 수가 최적이 아닌 경우(예를 들면 3 또는 그 이상의 면역화 대신 1 또는 2 면역화) 획득되며, b) 백신 오일 또는 오일계 에멀젼 애주번트화 백신에서의 항원 절감 효과로 비-DNA 염기-함유 폴리뉴클레오타이드와의 코-애주번트화로부터 수득된다는 것을 인지하고 있다. 비-DNA 염기-함유 폴리뉴클레오타이드의 첨가로부터 이득을 얻는 오일 또는 오일계 에멀젼으로의 애주번트화된 백신의 예로는 (이에 제한되지는 않지만) E. coli 0157 사이데로포어 단백질 백신, E. coli 0157 타입-3 분비 단백질 백신, 라임병[Borrelia burgdorfen 외부 표면 단백질 A[OspA] 및 단백질 C[OspC] 박트린] 백신, 구제역(FMD 백신, 불활성화 비리온 또는 바이러스 단백질), 출혈성 패혈증(불활성화된 파스튜렐라성 폐렴) 백신, 요네병(불활성화된 마이코박테리움 아비움 아종 파라결핵증 박트린 또는 보호성 면역원성 단백질) 백신, 크론병[불활성화된 마이코박테리움 아비움 아종 파라결핵증[MAP] 박트린, 또는 [MAP]로부터 보호성 면역원성 단백질을 코딩하는 서열을 함유하는 면역원성 단백질 또는 바이러스 벡터] 백신, H1N1 백신 및 광견병 백신이 있다.
실시예 11
비- DNA 염기-함유 폴리뉴클레오타이드로의 ISCOM 계 애주번트 함유 백신의 코-애주번트화
하기 실시예는 애주번트로서 ISCOMS(면역 자극 착체) 함유 종래 백신에 대한 면역 반응을 강화시키는데 본 발명의 폴리뉴클레오타이드 서열의 사용을 설명한다. 다 수의 애주번트는 ISCOMS로 애주번트화된 것으로부터 이점을 얻는 것으로 나타났다. 이러한 백신은 본 발명의 비-DNA 염기-함유 폴리뉴클레오타이드를 사용하여 추가로 애주번트화되어 항체 생성 및 보호성 활성 자극이 획득된다. (이에 제한되지는 않지만 1-100㎍/백신 용량 범위내에서) 사용된 비-DNA 염기-함유 폴리뉴크레오티드 용량을 제제화 단계 중 또는 전-면역화 즉시 제조 공정 중에 백신에 첨가되며, 개체 면역화는 (이에 제한되지는 않지만 근육내 주입과 같은) 설정된 백신 용량 및 투여 경로를 사용하여 설정된 백신 접종 절차에 따라 실행한다. 비-DNA 염기-함유 폴리뉴클레오타이드를 함유하는 ISCOM 애주번트화 백신으로의 개체 면역화로 설정된 질환을 제거 또는 감염성 기관 노출에 저항하여 강화된 보호성 항체 역가에 의해 특정되는 것과 같이, ISCOM 애주번트화 백신 단독으로 백신 접종한 것과 비교하는 경우 최고의 면역 노출이 수득된다. 당 업에 통상의 지식을 가진 사람은 a) 강화된 면역 반응으로부터의 이점이 또한 예를 들면 대유행 면역화 중 투여된 항원(들)의 용량이 최적 미만인 경우 또는 면역화 수가 최적이 아닌 경우(예를 들면 3 또는 그 이상의 면역화 대신 1 또는 2 면역화) 획득되며, b) ISCOMS로 애주번트화된 백신에서의 항원 절감 효과로 비-DNA 염기-함유 폴리뉴클레오타이드와의 코-애주번트화로부터 수득된다는 것을 인지하고 있다. 비-DNA 염기-함유 폴리뉴클레오타이드의 첨가로부터 이득을 얻는 ISCOMS로의 애주번트화된 백신의 예로는 (이에 제한되지는 않지만) 로독코쿠스 에쿠이 백신, 에쿠인 헤르페스 바이러스 타입 2(EHV-2) 백신, 우폐역(CPBB) 백신, 소 바이러스성 설사(BVDV) 백신, 톡소포자충 백신, 조류 인플루엔자 바이러스 백신, 기관염증 인플루엔자 바이러스 백신, 생식샘자극- 방출 인자 백신, 뉴캐슬병 백신, 호흡기 세포융합 바이러스, 헤르페스 백신, 홍역 바이러스 백신, 인간 파필로마 백신이 있다.
실시예 12
비- DNA 염기-함유 폴리뉴클레오타이드로의 비로좀 함유 백신의 코- 애주번트화
하기 실시예는 비로좀 함유 백신에 대한 면역 반응을 강화시키는데 본 발명의 폴리뉴클레오타이드 서열의 사용을 설명한다. 비로좀은 원천 바이러스의 유전적 물질 및 뉴클레오캡시드가 전혀 없는 재구성된 빈 바이러스 외막을 나타낸다. 비로좀은 면역학적 활성 물질의 운반을 위한 시장 승인 담체 및 애주번트 시스템이다. 이러한 우세한 합성 담체는 거의 모든 항원으로 광범위하게 응용가능하다. (이에 제한되지는 않지만 1-100㎍/백신 용량 범위 내에서) 사용된 비-DNA 염기-함유 폴리뉴크레오티드 용량을 제제화 단계 중 또는 전-면역화 즉시 백신에 첨가되며, 개체 면역화는 (이에 제한되지는 않지만 근육내 주입과 같은) 설정된 백신 용량 및 투여 경로를 사용하여 설정된 백신 접종 절차에 따라 실행한다. 비-DNA 염기-함유 폴리뉴클레오타이드를 함유하는 비로좀으로의 개체 면역화로 설정된 질환을 제거 또는 감염성 기관 노출에 저항하여 강화된 보호성 항체 역가에 의해 특정되는 것과 같이, 비로좀 백신으로 백신 접종한 것과 비교하는 경우 최고의 면역 반응이 수득된다. 당 업에 통상의 지식을 가진 사람은 a) 강화된 면역 반응으로부터의 이점이 또한 예를 들면 대유행 면역화 중 투여된 항원(들)의 용량이 최적 미만인 경우 또는 면역화 수가 최적이 아닌 경우(예를 들면 3 면역화 대신 2 면역화) 획득되며, b) 비로좀으로 애주번트화된 백신에서의 항원 절감 효과로 비-DNA 염기-함유 폴리뉴클레오타이드와의 코-애주번트화로부터 수득된다는 것을 인지하고 있다. 비로좀으로의 비-DNA 염기-함유 폴리뉴클레오타이드의 첨가로 이점이 수득되는 백신의 예로는 (이에 제한되지는 않지만) A형 간염 백신, A + B형 간염 백신, HIV/AIDS 백신, 말라리아 백신, 인플루엔자 백신 및 호흡기 세포융합(RSV) 백신이 있다.
실시예 13
비- DNA 염기-함유 폴리뉴클레오타이드로의 모노포스포릴 지질 A를 함유하는 백신의 코- 애주번트화
하기 실시예는 면역계, 즉 모노포스포릴 지질 A(MPL)를 자극하도록 의도되는 면역 자극제를 함유하는 백신에 대한 면역 반응을 강화시키는데 본 발명의 폴리뉴클레오타이드 서열을 사용하는 것을 설명한다. MPL은 항원-특이적 면역을 강화시키는 톨-유사 수용체-4(TLR4) 작용제이다. 돼지풀 백신(Ragweed vaccine), 예컨대 Pollinex Quattro(등록상표)는 면역보호성(IgG) 생성을 자극하도록 의도되며, MPL로 애주번트화된다. (이에 제한되지는 않지만 1-100㎍/백신 용량 범위 내에서) 사용된 비-DNA 염기-함유 폴리뉴크레오티드 용량을 제제화 단계 중 또는 전-면역화 즉시 백신에 첨가되며, 개체 면역화는 (이에 제한되지는 않지만 근육내 주입과 같은) 설정된 백신 용량 및 투여 경로를 사용하여 설정된 백신 접종 절차에 따라 실행한다. 비-DNA 염기-함유 폴리뉴클레오타이드를 함유하는 MPL-함유 백신으로의 면역화로 돼지풀 시즌 중 알러지 에피좀의 감소 및 강화된 보호성 항체 역가에 의해서 측정되는 것과 같이, MPL-함유 백신으로 백신 접종한 것과 비교하는 경우 최고의 면역 반응이 수득된다. 당업자는 a) 강화된 면역 반응으로부터의 이점이 또한 면역 수가 최적이 아닌 경우(예를 들면 4 면역화 대신 2 면역화) 획득된다는 것을 인지하고 있다. MPL-함유 백신으로 비-DNA 염기-함유 폴리뉴클레오타이드를 첨가하면 이득이 수득되는 백신의 예로는 (이에 제한되지는 않지만) 돼지풀 백신, B형 간염 바이러스, 열대열 말라리아 백신, 헤르페스(생식기 헤르페스 포함함) 바이러스 백신, 인플루엔자 백신 및 목초 화분 알러지 백신이 있다.
상기에서 인용하는 모든 특허, 간행물 및 요약문은 이의 전문이 참고로서 여기에 포함된다. 앞서 언급한 것은 단지 본 발명의 바람직한 실시형태에 관한 것이며, 다수의 변형 또는 대안이 다음의 특허청구범위에서 정하는 것과 같이 본 발명의 정신과 범주를 벗어나지 않고 그 안에서 만들어질 수 있다는 것이 이해되어야 한다.
SEQUENCE LISTING <110> Bioniche Life Sciences Inc. Phillips, Nigel C. Filion, Mario C. <120> Non-DNA Base-Containing Polynucleotide Compositions and Their Use for the Modulation of Immune Responses <130> 42368-395739 <140> PCT/IB2010/002561 <141> 2010-10-08 <150> 61/259,812 <151> 2009-11-10 <160> 35 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 6 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> n is nebularine base <220> <221> misc_feature <222> (6)..(6) <223> n is nebularine base <400> 1 nggtgn 6 <210> 2 <211> 6 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> misc_feature <222> (1)..(2) <223> n is uracil base <220> <221> misc_feature <222> (5)..(6) <223> n is uracil base <400> 2 nngtnn 6 <210> 3 <211> 6 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <220> <221> misc_feature <222> (1)..(2) <223> n is hypoxanthine base <220> <221> misc_feature <222> (5)..(6) <223> n is hypoxanthine base <400> 3 nngtnn 6 <210> 4 <211> 3 <212> DNA <213> 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Claims (18)

  1. 길이가 3 내지 30개의 염기인 합성 비-DNA 염기-함유 폴리뉴클레오타이드 서열, 약학적으로 허용가능한 비히클 및 하나 이상의 항원을 포함하는 조성물로서, 상기 비-DNA 염기는 네뷸라린(nebularine), 하이포크산틴(hypoxanthine) 또는 유라실 중 하나 이상인 것인 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 비-DNA 염기-함유 폴리뉴클레오타이드 서열은 길이가 3 내지 20개의 염기인 것인 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 상기 비-DNA 염기-함유 폴리뉴클레오타이드 서열은 길이가 3 내지 9개의 염기인 것인 조성물.
  4. 제1항에 있어서, 상기 약학적으로 허용가능한 비히클은 하나 이상의 애주번트 비히클을 포함하는 것인 조성물.
  5. 제4항에 있어서, 상기 하나 이상의 애주번트 비히클은 백반(alum), 오일계 애주번트, 면역 자극 착체, 비로좀 또는 모노포스포릴 지질 A, 또는 이의 유사체인 것인 조성물.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 면역조절 제제(immunomodulatory agent)를 더 포함하는 것인 조성물.
  7. 길이가 3 내지 30개의 염기인 합성의 비-DNA 염기-함유 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 조성물로서, 상기 비-DNA 염기는 네뷸라린, 하이포크산틴 또는 유라실 중 하나 이상이며, 상기 폴리뉴클레오타이드 서열은 서열 번호: 5인 것인 조성물.
  8. 길이가 3 내지 30개의 염기인 합성의 비-DNA 염기-함유 폴리뉴클레오타이드 서열, 약학적으로 허용가능한 비히클 및 하나 이상의 항원을 포함하는 조성물의 약물 제제로의 용도로서, 상기 비-DNA 염기는 네뷸라린, 하이포크산틴 또는 유라실 중 하나 이상인 것인 용도.
  9. 길이가 3 내지 30개의 염기인 합성의 비-DNA 염기-함유 폴리뉴클레오타이드 서열, 약학적으로 허용가능한 비히클 및 하나 이상의 항원을 포함하는 조성물의 생체 내 또는 시험관 내 면역 반응을 조절하기 위한 약물 제제로의 용도로서, 상기 비-DNA 염기는 네뷸라린, 하이포크산틴 또는 유라실 중 하나 이상인 것인 용도.
  10. 하나 이상의 항원에 대한 면역 반응을 조절하는 방법으로서, 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 조성물을 시험관 내 또는 생체 내에 투여하는 단계를 포함하는 것인 방법.
  11. 제10항에 있어서, 상기 생체 내 투여는 동물 또는 인간에게 투여하는 단계를 포함하 것인 방법.
  12. 제10항에 있어서, 상기 조절된 면역 반응은 항원으로 시험감염(challenge) 후 항체 반응의 변경인 것인 방법.
  13. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 조성물을 체 생체 내 또는 시험관 내에 투여하는 단계를 포함하는 항원 제시 세포(antigen presenting cell)를 자극하는 방법.
  14. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 조성물을 동물 또는 인간에 투여하는 단계를 포함하는 항원에 대해 면역 반응을 강화시키는 방법으로서, 상기 조성물 중의 항원의 양은 면역 반응을 강화시키기 위한 비-DNA 염기-함유 폴리뉴클레오타이드가 없을 때 요구되는 항원의 양 미만인 것인 방법.
  15. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 조성물을 동물 또는 인간에 투여하는 단계를 포함하는 항원에 대한 면역 반응을 감소시키는 방법.
  16. 제15항에 있어서, 상기 조성물 중의 항원의 양은 면역 반응을 감소시키기 위한 비-DNA 염기-함유 폴리뉴클레오타이드가 없을 때 요구되는 항원의 양 미만인 것인 방법.
  17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항의 합성의 비-DNA 염기-함유 폴리뉴클레오타이드 서열로서, 상기 합성의 비-DNA 염기-함유 폴리뉴클레오타이드는 서열 번호: 1 내지 30 중 어느 하나인 것인 합성의 비-DNA 염기-함유 폴리뉴클레오타이드 서열.
  18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 따른 합성의 비-DNA 염기-함유 폴리뉴클레오타이드 서열로서, 상기 합성의 비-DNA 염기-함유 폴리뉴클레오타이드 서열은 TEG-콜레스테릴 부분, 하나 이상의 부가적인 아데닌, 티민, 사이토신 또는 구아닌 염기, 또는 하나 이상의 부가적인 네뷸라린, 하이포크산틴 또는 유라실 염기를 합성의 비-DNA 염기-함유 폴리뉴클레오타이드 서열의 5' 말단 또는 3' 말단 상에 더 포함하는 것인 합성의 비-DNA 염기-함유 폴리뉴클레오타이드 서열.
KR1020127014812A 2009-11-10 2010-10-08 비-ｄｎａ 염기-함유 폴리뉴클레오타이드 조성물 및 면역 반응을 조절하기 위한 그의 용도 KR20120094017A (ko)

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Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4469863A (en) * 1980-11-12 1984-09-04 Ts O Paul O P Nonionic nucleic acid alkyl and aryl phosphonates and processes for manufacture and use thereof
US5023243A (en) * 1981-10-23 1991-06-11 Molecular Biosystems, Inc. Oligonucleotide therapeutic agent and method of making same
US6239116B1 (en) * 1994-07-15 2001-05-29 University Of Iowa Research Foundation Immunostimulatory nucleic acid molecules
ATE292638T1 (de) * 2000-05-01 2005-04-15 Hybridon Inc Modulation von oligonukleotid cpg-vermittelter immunstimulation durch modifikation der nucleoside
EP1350262B8 (en) * 2000-12-08 2008-08-13 Coley Pharmaceuticals GmbH Cpg-like nucleic acids and methods of use thereof
EP1417307B1 (en) * 2001-08-17 2009-04-15 Bioniche Life Sciences Inc. Oligonucleotide compositions and their use to induce apoptosis
NZ535952A (en) * 2002-04-04 2009-01-31 Coley Pharm Gmbh Immunostimulatory G,U-containing oligoribonucleotides

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