KR20130113718A

KR20130113718A - 인삼의 잎과 줄기로부터 진세노사이드 ｆ1의 분획정제방법

Info

Publication number: KR20130113718A
Application number: KR1020120036128A
Authority: KR
Inventors: 표미경; 유남희; 김종민; 김보람; 성낙술
Original assignee: 재단법인 금산국제인삼약초연구소
Priority date: 2012-04-06
Filing date: 2012-04-06
Publication date: 2013-10-16

Abstract

본 발명은 인삼의 잎 및 줄기로부터 진세노사이드 F₁의 분획제조하는 방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 진세노사이드 F₁의 분획정제과정 중 탈지단계에서 인삼을 수확 후, 폐기되는 인삼의 잎과 줄기에 잔류하는 잔류농약성분 등의 지용성 물질을 완전히 제거된 인삼 잎과 줄기로부터 진세노사이드 F₁을 효과적으로 분획정제하는 방법에 관한 것이 개시된다.

Description

인삼의 잎과 줄기로부터 진세노사이드 Ｆ1의 분획정제방법{Method for isolation and purification of ginsenoside Ｆ1 from leaf and stem of ginseng}

본 발명은 인삼의 잎 및 줄기로부터 진세노사이드 F₁의 분획정제하는 방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 인삼을 수확한 후, 폐기되는 잎과 줄기로부터 진세노사이드 F₁을 효과적으로 분획정제하는 방법에 관한 것이다.

한반도가 원산지인 인삼은 (Panax ginseng C.A. Meyer)은 오가피나무과 (Araliaceae) Panax 속에 속하는 다년생 식물로서 뿌리를 식용 또는 약용으로 이용하고 있다.

인삼의 생리활성물질로 알려진 인삼사포닌은 30여 종이며, 이중 다량으로 존재한다고 알려진 주요사포닌은 ginsenoside Rb₁, Rb₂, Rc, Rd, Re, Rg₁ 등으로, 주요 생리활성을 나타내는 성분은 인삼사포닌인 것으로 알려져 있으며, 항당뇨활성 (Yokozawa et al., 1985), 항암작용 (Mochizuki et al., 1995), 항산화작용 (Jeong et al., 2002), 동맥경화 및 고혈압예방 (Jung and Cho, 1985; Yoon and Joo, 1993), 간기능 촉진 및 숙취제거효과 (Matsuda et al., 1991), 항 피로 및 항 스트레스 작용 (Saito et al., 1974), 항염활성(Matsuda et al., 1990)등이 보고 되었다.

인삼은 뿌리를 식용 또는 약용으로 이용하고 있으나 대개 4 ~ 6년 동안 재배한 후 수확하기 때문에 인삼 또는 인삼가공품의 가격은 상대적으로 다른 식품 또는 약재에 비해 고가이다.

대한민국 식품공전의 인삼홍삼제품의 원료 등의 구비조건에도 수삼은 3년근 이상으로서 춘미삼, 삼피, 인삼박은 사용할 수 없으며, 병든 삼인 경우에는 병든 부분을 제거하고 사용할 수 있다고 명시하고 있다. 따라서 인삼에서 분리된 ginsenoside등의 생리활성 물질은 원료삼 자체가 고가이므로 분리된 단일 성분은 수십 mg 당 수백만원까지 하는 등 고가이므로 다량 확보하기가 쉽지 않은 상황이다.

뿐만아니라 성분이 다량 소요되는 동물실험을 통한 인삼의 효능 및 흡수 대사 관련 실험이 어려워 성분중심의 인삼의 효능을 밝히는 데에도 한계가 있다.

인삼의 조사포닌의 함량은 잎에 24.8%, 줄기에 4.6%, 뿌리에 5.3%로 뿌리나 줄기보다 잎에 훨씬 많은 것으로 알려져 있다 (Cho et al. 2010).

인삼을 수확후 폐기되는 인삼 잎에는 계절적 변동, 지리적 차이, 재배 기간의 길이에 따라 많은 차이가 있으나 ginsenoside Rb₁, Rb₂, Rc, Rd, Re, Rg₁ 등이 전체 진세노사이드의 30-40%를 함유하고 있고, 특히 Re, Rd, Rb₂의 함유량이 높은 것으로 알려져 있다.(Jackson et al., 2003, Xie et al., 2004).

따라서 수확후 폐기되는 인삼 잎이나 줄기에 함유된 생리활성 성분을 선별적으로 분리할 수 있는 기술개발이 절실히 필요한 상황이다. 특히, ginsenoside F₁은 자외선 보호효과와 미백활성이 있어 화장품 소재로 활용가능성이 높으나 인삼의 뿌리에 함유된 성분 함량이 극미량이므로 이를 단일 성분으로 분리하는 것은 쉽지 않을 뿐만 아니라 분리된 성분 또한 고가이므로 경제적으로 매우 불합리하여 활용성이 매우 낮다. 따라서 ginsenoside F₁을 다량 필요로하는 동물실험을 통한 ginsenoside F₁의 효능 및 흡수 대사 관련 실험을 하는 데에는 한계가 있어서 이를 간편한 방법으로 경제적으로 정제하는 기술은 성분별 인삼의 활용도를 높이는데 있어서 매우 중요하다.

1. 대한민국등록특허공보 제10-0418604호 "인삼 사포닌으로부터 화합물 K 및 진세노사이드 F1을 제조하는 방법" 2. 대한민국등록특허공보 제10-0444370호 "나린지나제 효소를 이용한 진세노사이드 에프원의 제조방법" 3. 대한민국등록특허공보 제10-0443411호 "베타글리코시다제를 이용한 진세노사이드 F1의 제조방법" 4. 대한민국등록특허공보 제10-0671291호 "베타갈락토시다제를 이용하여 진세노사이드 F1을 제조하는 방법" 5. 대한민국등록특허공보 제10-0877489호 "진세노사이드의 효소전환"

본 발명에서는 수확후 폐기되는 인삼 잎이나 줄기에서 진세노사이드 F₁을 선별적으로 분리할 수 있는 분획정제방법을 제공하는 것을 그 해결과제로 한다.

또한, 본 발명에서는 진세노사이드 F₁을 선별적으로 분리함에 있어서, 수확 후 폐기되는 인삼 잎과 줄기에 잔존하는 잔류농약을 분획과정 중에서 완전히 제거하는 분획정제방법을 제공하는 것을 다른 해결과제로 한다.

상기한 과제를 해결한 본 발명의 인삼의 잎과 줄기로부터 진세노사이드 F₁의 분획정제방법은 인삼 잎 또는 줄기를 포집하고, 자연건조 또는 동결건조한 다음 분쇄하여 준비하는 원료준비 단계;

상기 준비된 원료를 추출용기에 넣고 상기 원료대비 용매를 중량비로 1:1.5~3.0의 비율이 되도록 상기 용매를 추출용기에 투입하고, 40~70℃의 온도의 수욕 중에서 6~8시간 동안 4회 반복하여 추출하여 탈지하고, 탈지 후 상기 용매를 별도 회수하고, 원료는 흄후드 안에서 용매를 완전히 제거하는 탈지단계;

상기 탈지단계가 완료된 원료에 상기 원료대비 중량비로 50~90% 에탄올을1:1.5~3.0의 비율℃로 첨가하여 환류냉각기로 60~80℃의 온도의 수욕 중에서 8시간씩 3회 반복하여 추출한 후, 농축하여 추출물을 획득하는 추출단계;

상기 추출단계에서 얻어진 추출물을 상기 추출물 대비 중량비로 삼염화메틸(Methyl trichloride; CHCl₃) 또는 디클로로메탄 (CH₂Cl₂)을 1:5 ~ 10의 비율로 혼합한 혼합물에 물을 가하여 추출물에 잔존되어 있을 가능성이 있는 색소, 지질 및 잔류농약 등의 소수성 성분을 제거하고, 삼염화메틸층 또는 디클로로메탈층과 물 층을 분리하는 단계; 및

상기 소수성 물질이 제거된 후 분리된 물층에 에틸아세테이트를 상기 물층의 총량 대비 중량비로 1:1의 비율로 가하여 에틸아세테이트층과 물층으로 분획하여 에틸아세테이트층을 회수한 후 물로 세척 후 농축하는 단계;를 포함하여 이루어진다.

여기서, 상기 소수성 물질을 제거하여 클로로포름과 물층을 제거하는 단계에서 상기 물은 상기 삼염화메틸 또는 디클로로메탄과 중량비로 1:1의 비율이 되도록 투입혼합하는 것을 특징으로 한다.

여기서, 상기 분획단계에서 상기 에틸아세테이트는 상기 분리된 물층의 총량 대비 중량비로 1:1의 비율로 가하여 에틸아세테이트층과 물층으로 분획하는 것을 특징으로 한다.

여기서, 상기 분획 단계 전, 상기 분리된 물층에 수산화나트륨(NaOH)를 적가하여 5% NaOH가 되도록 알칼리화 하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 한다.

본 발명에 따라 제공되는 인삼의 잎과 줄기로부터 진세노사이드 F1의 분획정제방법은 인삼의 뿌리로부터 수득되는 진세노사이드 F1의 수득량 대비 월등히 높은 수득율을 보이며, 종래의 알려진 분획정제방법들에 비해 보다 손쉽고 빠른 시간 안에 인삼 잎과 줄기로부터 극히 미량 함유되어 있는 진세노사이드 F₁을 분획정제할 수 있어, 비교적 고가인 인삼추출물을 보다 안정적으로 확보할 수 있으며, 그에 따른 원료의 가격 경쟁력을 제고할 수 있는 장점이 있다.

도 1 은 본 발명에 사용된 원료의 사진이다.
도 2 는 본 발명의 생리활성물질의 추출 및 분획과정을 예시한 순서도이다.
도 3 은 본 발명이 일실시예에 따른 인삼 잎, 줄기 및 뿌리의 조사포닌 분획 TLC분석 사진이다.
도 4 는 본 발명이 일실시예에 따른 인삼 잎, 줄기 및 뿌리의 조사포닌 분획 HPLC분석 그래프이다.
도 5 는 본 발명의 일실시예에 따른 진세노사이드 F₁의 분리정제 과정과 TLC분석 결과를 도시한 것이다.
도 6 은 본 발명의 일실시예에 따른 pH 및 극성단계 분획과 진세노사이드 F₁의 HPLC분석 그래프이다.
도 7 은 본 발명의 일실시예에 따른 진세노사이드 F₁의 ESI MS spectrum 분석 그래프이다.
도 8 은 진세노사이드 F₁의 화학구조를 도시한 것이다.

이하, 본 발명을 첨부도면을 참조하여 보다 상세히 설명하기로 한다.

인삼의 조사포닌의 함량은 잎에 24.8%, 줄기에 4.6%, 뿌리에 5.3%로 뿌리나 줄기보다 잎에 훨씬 많은 것으로 알려져 있다.

특히, 인삼을 수확후 폐기되는 인삼 잎에는 계절적 변동, 지리적 차이, 재배 기간의 길이에 따라 많은 차이가 있으나 ginsenoside Rb₁, Rb₂, Rc, Rd, Re, Rg₁ 등이 전체 진세노사이드의 30-40%를 함유하고 있고, 특히 Re, Rd, Rb₂의 함유량이 높은 것으로 알려져 있다.(Jackson et al., 2003, Xie et al., 2004).

따라서 수확후 폐기되는 인삼 잎이나 줄기에 함유된 생리활성 성분을 선별적으로 분리할 수 있는 기술개발이 절실히 필요하며, 본 발명에서는 상기 인삼 잎과 줄기로부터 효과적으로 고수율의 생리활성 성분을 선별적으로 분리할 수 있는 분획제조방법을 제공하고자 한다.

또한, 인삼의 생리활성 성분 중, 미량 성분인 진세노사이드 F₁은 자외선 보호효과와 미백활성이 있어 화장품 소재로 활용가능성이 높으나 쉽게 분획제조할 수 없어 상당히 고가의 성분으로 활용성이 매우 낮다.

따라서, 본 발명에서는 인삼의 잎과 줄기로부터 인삼의 미량 성분인 ginsenoside F₁의 손쉬운 분획정제방법을 제공함으로써 진세노사이드 F₁의 수득율을 높인 분획정제방법을 제공하고자 한다.

첨부도면 도 1을 참조하여 본 발명의 진세노사이드 F₁의 수득을 위한 분획정제방법과 유사한 인삼 잎 및 줄기로부터 생리활성물질을 분획정제방법에 대하여 예시하여 보면, 인삼 잎 또는 줄기를 포집하고, 자연건조 또는 동결건조한 다음 분쇄하여 준비하는 원료준비 단계;와 상기 준비된 원료를 추출용기에 넣고 용매와 원료를 1:1.5~3.0의 비율이 되도록 상기 용매를 추출용기에 투입하고, 환류냉각기로 60±5의 온도의 수욕 중에서 8시간씩 3회 반복하여 추출하여 색소 및 잔류농약성분등의 소수성 물질을 제거하고 탈지한 후, 상기 용매를 별도 회수하고, 원료는 흄후드 안에서 용매를 완전히 제거하는 탈지단계;를 거친 원료를 준비한다.

상기 탈지단계가 완료된 원료에 80%-에탄올을 중량비로 80%-에탄올대비 원료를 1:1.5~3.0의 비율로 첨가하여 환류냉각기로 80±5의 온도의 수욕 중에서 6~8시간씩 3회 반복하여 추출한 후, 농축하여 추출물을 획득하는 추출단계; 및

상기 추출단계에서 얻어진 추출물을 중량비로 1:5 ~ 10의 비율로 90%-메탄올(MeOH)를 가하여 용해한 후, 그 용해액을 분액깔때기에 넣고 상기 추출물 대비 중량비로 1:5 ~ 10의 비율로 n-Hexane을 가하여 혼합 후, 층 분리하여 90%-메탄올층을 회수 후 농축한 농축물에 농축물 대비 중량비로 1:5 ~ 10의 비율로 물과 물포화 n-부탄올(n-BuOH)을 각각 첨가하여 상기 물포화 n-부탄올을 회수하여 농축하는 분획단계를 포함하여 이루어진다. 이때, 바람직하게는 상기 분획단계에서 90%-메탄올층을 회수하는 과정과 상기 물포화 n-부탄올을 회수하여 농축하는 과정을 각각 2회 더 반복하는 것이다.

이때, 상기 분획단계에서 90%-메탄올층 분리시 n-Hexane과 메탄올과 물의 투입량은 n-Hexane:메탄올:물을 10:9:1의 비율이 되도록 하는 것이 바람직하며, 상기 메탄올층 분리 후 농축된 농축물에 가하는 물포화 n-부탄올(n-BuOH)과 물은 1:1의 비율이 되도록 투입되는 것이 바람직하다.

상기 탈지단계에서 사용되는 용매는 n-Hexane을 사용한다.

상기 예시하고 있는 본 발명에 따른 생리활성물질의 분획정제방법에 따라 얻어지는 생리활성물질에 함유된 진세노사이드 F₁을 함유하고 있으나, 그 함유량이 미량으로 존재하고 있어, 본 발명자들은 상기 진세노사이드 F₁을 선별적으로 선택하여 대량으로 분획정제할 수 있는 방법을 찾게 되었고, 이하에서 본 발명자들은 진세노사이드 F₁을 선별적으로 선택하여 대량으로 분획정제할 수 있는 방법을 완성하게 되었다.

이하에서 본 발명의 발명자들은 인삼 잎과 줄기로부터 진세노사이드 F₁의 분획정제방법을 제공하게 된다.

본 발명에 따른 인삼 잎과 줄기로부터 진세노사이드 F₁의 분획정제방법은 첨부도면 도 5에 도시된 바와 같이, 인삼 잎 또는 줄기를 포집하고, 자연건조 또는 동결건조한 다음 분쇄하여 준비하는 원료준비 단계;와

상기 준비된 원료를 추출용기에 넣고 상기 원료대비 용매를 중량비로 1:1.5~3.0의 비율이 되도록 상기 용매를 추출용기에 투입하고, 환류냉각기로 40~70℃의 온도의 수욕 중에서 6~8시간씩 3회 반복하여 추출하여 탈지하고, 탈지 후 상기 용매를 별도 회수하고, 원료는 흄후드 안에서 용매를 완전히 제거하는 탈지단계;와

상기 탈지단계가 완료된 원료에 상기 원료대비 중량비로 50~90% 에탄올을 1:1.5~3.0의 비율로 첨가하여 환류냉각기로 60~80℃의 온도의 수욕 중에서 8시간씩 3회 반복하여 추출한 후, 농축하여 추출물을 획득하는 추출단계;와

상기 추출단계에서 얻어진 추출물을 상기 추출물 대비 중량비로 삼염화메틸(Methyl trichloride; CHCl₃) 또는 디클로로메탄 (CH₂Cl₂)을 1:5 ~ 10의 비율로 혼합한 혼합물에 물을 가하여 추출물에 잔존되어 있을 가능성이 있는 색소, 지질 및 잔류농약 등의 소수성 성분을 제거하고, 상기 삼염화메틸층 또는 디클로로메탄층과 물 층을 분리하는 단계; 및

상기 소수성 물질이 제거된 후 분리된 물층에 에틸아세테이트를 상기 물층의 총량 대비 중량비로 1:1의 비율로 가하여 에틸아세테이트층과 물층으로 분획하여 에틸아세테이트층을 회수한 후 물로 세척하여 농축하는 단계를 포함하여 이루어진다.

본 발명에 따르면, 상기 소수성 물질을 제거하여 삼염화메틸층 또는 디클로로메탄층과 물층을 제거하는 단계에서 상기 물은 상기 삼염화메틸 또는 디클로로메탄과 중량비로 1:5 ~ 10의 비율이 되도록 투입혼합하는 것이 바람직하며, 또한, 상기 분획단계에서 상기 에틸아세테이트는 상기 물층의 총량 대비 중량비로 1:1의 비율로 가하여 에틸아세테이트층과 물층으로 분획하는 것이 바람직하다.

본 발명에 따르면, 상기 분획 단계 전, 상기 분리된 물층에 수산화나트륨(NaOH)를 적가하여 5% NaOH가 되도록 알칼리화 하는 단계를 더 포함할 수 있다.(첨부도면 도 5의 A에 도시된 바와 같음) 이때, 알칼리화에 의해 분획할 경우 진세노사이드 F₁의 함량을 약 9% 가량 높일 수 있게 된다.

이상에서, 개시되는 본 발명의 인삼의 잎과 줄기로부터 생리활성물질을 분획제조하는 방법 및 진세노사이드 F₁의 분획정제방법을 바람직한 실험예를 통하여 보다 상세히 설명하기로 한다.

[실험예]

1. 실험재료의 수집

인삼 잎 및 줄기는 금산인삼농협의 협조로 충북 청주시에서 인삼 수확후의 지상부를 수득하였고, wet 상태에서는 인삼잎 60 kg, 줄기 84 kg였으며 음건하에서 건조하였을 때 잎이 11.2 kg, 줄기가 8.0 kg이었다. 인삼뿌리는 금산인삼농협에서 4년근을 구입하여 40℃에서 1주일간 건조하여 백삼으로 만들어 사용하였다. (첨부도면 도 1 참조)

2. 추출(extraction)

-. 조사포닌 최적 수득 선정을 위한 추출: 인삼잎, 줄기의 최적 추출조건 및 조사포닌 최적 수득율 확립을 위해 용매 종류와 온도 조건을 다르게 하여 시료를 추출하였다. 추출용매는 80% 메탄올, 물포화 n-부탄올, 80% 에탄올, 물을 사용하였고, 온도는 상온과 80℃ 수욕상에서 reflux를 장착하여 추출하는 것을 기본으로 하였다. 온욕상의 추출은 시료 10 g을 넣고 추출 용매 100 ㎖로 80℃ 수욕상에서 reflux를 장착하여 6시간씩 3회 추출하였으며, 상온 추출은 시료 10 g을 추출 용매 100 ㎖을 넣어 상온에서 5일간 3회 방치하여 추출하였다.

-. 최적 추출조건 선정 후 대량추출: 분쇄한 인삼 잎 1.5 kg을 준비하여 대형 추출용기에 취한 다음 n-Hexane 10 L를 가하여 환류냉각기를 부착시켜 수욕 중에서 60℃로 8시간씩 3번 반복하여 추출하였다. 용매는 따로 회수하고 탈지가 끝난 인삼 잎은 흄후드 안에서 용매를 완전히 제거하였다. 여기에 80% EtOH 10 L를 가하여 환류냉각기를 부착시켜 수욕상에서 80℃로 8시간씩 3번 반복하여 추출하였다. 인삼 줄기도 같은 방법으로 추출하였다.

3. 분획(fractionation)

추출물을 90% MeOH 100 ㎖에 녹여 분액깔때기에 넣고 n-Hexane 100 ㎖를 넣고 잘 혼합하여 층이 분리되면 90% MeOH 층을 회수하였다. 이 과정을 2회 더 반복하여 회수된 90% MeOH 층을 농축한 후 물 100 ㎖와 물포화 n-BuOH 100 ㎖를 첨가하여 물포화 n-BuOH을 회수하기를 2회 더 반복하여 농축한 것을 조사포닌 함량으로 하였다.(도 2 참조)

4. TCL에 의한 ginsenoside 분석

Ginsenoside 분석을 위한 TLC 전개용매는 CHCl₃:MeOH:Water (13:7:2)과 Ethylacetate:n-butanol:Water (4:5:1)를 사용하였으며, 10% H₂SO₄ 용액을 사용하여 발색하였다.

5. HPLC에 의한 ginsenoside 분석

Ginsenoside 함량은 Waters-PAD (Waters 1525, detector 2998, USA)를 활용하여 물 (A액)과 ACN (B액)의 다음과 같은 gradient 조건으로 flow rate 1.0 ㎖/min으로 HPLC 분석하였다. 진세노사이드 분석을 위한 용매조건은 하기 표 1과 같고, 진세노사이드 분석을 위한 HPLC분석조건은 하기 표 2와 같다.

6. pH gradient에 특정 ginsenoside 함유 분획 제조

예비실험을 위하여 홍삼에서 추출한 조사포닌 층을 시험재료로 사용하였다. 조사포닌층 (GTS-1)을 5% NaOH에 녹이고 물포화부탄올로 분획을 3회 반복 한 후, 회수된 물포화 부탄올층을 물로 씻어 준후 농축하여 PPT계열 물질 (PPT-2)을 얻고, 물층은 10% HCl로 중화한 후 물포화부탄올로 분액을 3회 반복하여 얻은 물포화 부탄올층을 물로 씻어 준후 농축하여 PPD계열 물질 (PPD-2)을 얻었다.

7. pH 및 극성 단계별 분획 제조 및 ginsenoside F₁의 분리

인삼 잎 80% EtOH 추출물을 CHCl₃와 물로 분획하여 클로로필 등의 지용성 물질을 제거하고, 물층에 NaOH가 5% 되게 녹인 후 에틸아세테이트로 분획하기를 3회 반복한 후 물로 씻어준 후 감압 농축하였다. 에틸아세테이트층을 CHCl₃:MeOH:Water=13:7:2 용매조건으로 silica gel column chromatography를 실행하여 ginsenoside F₁을 분리하였다.

<최적 추출 조건 및 조사포닌 최적 수득율 확립>

1. 추출수율 및 조사포닌 수득율 비교

-. 인삼잎: 인삼잎의 추출수율은 80℃ 수욕상에 추출한 것이 상온 추출한 것보다 수율이 훨씬 좋았다[표 3]. 온욕상에서의 추출율은 물추출이 40%로 가장 높았고, 80% 메탄올과 80% 에탄올은 31.0%와 31.5%로 비슷하게 나왔으며, 물포화 부탄올 추출율은 20.0%로 가장 낮았다. 그러나 조사포닌의 수득율은 80% 에탄올 추출에서 16.0%로 가장 높았고, 다음으로 80% 메탄올 추출이 11.0%, 물포화부탄올 추출이 8.9%의 순이었다. 상온 추출에 의한 조사포닌 수득율은 80% 에탄올 추출이 15.7%로 온욕상의 추출에서의 16.0%에 육박하였다.

-. 인삼 줄기: 인삼 줄기 추출 수율은 잎에 비해 대체적으로 40%정도에 그쳐 추출되는 물질이 많지 않았는데, 이것은 줄기가 잎보다 셀룰로오스 등이 많이 함유되어 있기 때문인 것으로 해석된다. 인삼 줄기 또한 잎과 마찬가지로 온욕상에서 추출수율은 물추출로 하는 것이 가장 많았으나 조사포닌 수득율은 가장 낮았다. 온욕상이나 상온에서의 80% 메탄올 추출과 80% 에탄올 추출은 추출물과 조사포닌의 수득율이 비슷하였으나 80% 메탄올에서 더 높게 나오는 경향을 보였다 [표3].

-. 인삼 뿌리 (홍삼): 홍삼의 추출율은 물추출에서 추출수율과 조사포닌 수득율이 52.3%와 8.4%로 80% 메탄올 추출 (추출수율 46.6%, 조사포닌 수득율 6.7%)과 물포화 부탄올 추출(추출수율 18.5%, 조사포닌 수득율 5.4%)에서 보다 높게 나타났다 [표3].

2. 인삼의 잎, 줄기 및 뿌리에 함유된 ginsenoside 함량 분석

Ginsenoside Rg₁, Re, Rf, F₁등의 PPT계열 사포닌과 Rb₁, Rb₂, Rb₃, Rc, Rd, F₂ 등의 PPD계열 사포닌 10종을 분석한 결과 PPT 계열 사포닌과 PPD 계열 사포닌의 비가 뿌리는 1.08로 비슷하게 나타났고, 잎은 1.49, 줄기는 8.76로 PPT계열 사포닌의 비율이 현저하게 높았다. 그러나 ginsenoside 총합으로 본 사포닌의 절대 함량은 잎이 153.72 ㎎/g으로 월등하게 높았고, 다음으로 줄기가 8.76 ㎎/g, 뿌리가 7.23 ㎎/g의 순으로 높았다. 인삼잎은 ginsenoside는 Re, F₁, Rd의 상대적 함량비율이 뿌리에 비하여 높았고, 특히 뿌리의 미량 성분인 ginsenoside F₁의 함량은 뿌리에 비하여 57배나 높게 나타났다 [표 4, 도 3, 도 4 참조].

3. Ginsenoside F₁ 분획 제조 및 분리

인삼의 미량 성분인 ginsenoside F₁은 자외선 보호효과와 미백활성이 있어 화장품소재로 활용가능성이 있으나 쉽게 얻을 수 없으므로 상당히 고가이다. Ginsenoside F₁의 함량이 고농도로 농축된 분획을 얻기 위하여 인삼잎에탄올 추출물을 CHCl₃와 물로 분획하여 CHCl₃로 이행하는 클로로필 등의 소수성 물질을 제거하고 물층은 ginsenoside F₁을 함유하는 분획을 얻기 위하여 에틸아세테이트로 분획 (EtOAC fr. (2))하여 ginsenoside F₁ 분획을 얻었고[도 5의 B], HPLC 분석을 통해 ginsenoside F₁의 함량이 12.6%임을 확인하였다 [표 5]. 보다 높은 ginsenoside F₁함유분획을 얻기 위하여 물층을 5% NaOH가 되게 알카리화한 후 에틸아세테이트로 분획 (EtOAc fr. (3)) 하였더니 ginsenoside F₁의 함량이 21.3%로 증가하여 ginsenoside F₁의 함량을 약 9%가량 높일 수 있었다. [도 5의 A, 표 5]. 인삼잎으로부터의 ginsenoside F₁ 함유분획인 EtOAc fr. (2)의 수율은 0.22%였고, 알카리화한 후의 알카리화 한 후의 ginsenoside F₁ 함유분획인 EtOAC fr. (2)의 수율은 0.24%로 두 분획간의 수율차이는 크지 않았다 [도 5]. 알카리화한 후의 ginsenoside F₁ 함유분획인 EtOAc fr. (3)을 CHCl₃:MeOH:Water=13:7:2의 이동상 조건으로 silica gel chromatography를 실시하여 ginsenoside F₁ (637 ㎎)을 간편하게 다량분리하였다 [도 5의 C, 도 6, 도 7, 도 8, 표 5]. 분리된 ginsenoside F₁은 HPLC에 의한 분석과 ESI-MS spectrum을 통하여 [M-H]⁺의 637.3의 peak를 확인함으로써 ginsenoside F₁임을 확인하였고(도 7), HPLC chromatography 분석을 통하여 순도가 97.5%로 확인되었다.(도 6).

한편, 식품공전 중에 명시된 인삼의 잔류허용기준이 설정된 농약 62종을 인삼 잎과 실시예에 따라 제조한 에틸아세테이트 분획을 분석한 결과 tebuconazole (살균제)이 인삼잎에서는 0.19 mg/kg이 검출된 반면 생리활성 분획인 에틸아세테이트 분획에서는 검출한계 (0.01 mg/kg)에서 검출되지 않음을 확인하여 본 방법에 의해 잔류농약이 제거됨을 확인할 수 있었다 [표 6].

이상에서 설명되는 실험예로 확인할 수 있는 바와 같이, 본 발명에 따라 제공되는 인삼의 잎과 줄기로부터 진세노사이드 F₁의 분획정제방법은 인삼의 뿌리로부터 수득되는 진세노사이드 F₁의 수득량 대비 월등히 높은 수득율을 보이며, 종래의 알려진 분획제조방법들에 비해 보다 손쉽고 빠른 시간 안에 인삼 잎과 줄기로부터 생리활성물질과 극히 미량 함유되어 있는 진세노사이드 F₁을 분획제조할 수 있어, 비교적 고가인 인삼추출물을 보다 안정적으로 확보할 수 있으며, 그에 따른 원료의 가격 경쟁력을 제고할 수 있는 장점이 있게 된다.

이상에서 설명되는 본 발명의 예시인 실험예는 본 발명을 설명하기 위한 것으로, 본 발명이 이에 한정되는 것은 아니며, 본 발명의 범위를 벗어나지 않는 범위 내에서 얼마든지 변형 가능한 것이다.

Claims

인삼 잎 또는 줄기를 포집하고, 자연건조 또는 동결건조한 다음 분쇄하여 준비하는 원료준비 단계;
상기 준비된 원료를 추출용기에 넣고 상기 원료대비 용매를 중량비로 1:1.5~3.0의 비율이 되도록 상기 용매를 추출용기에 투입하고, 40~70℃의 온도의 수욕 중에서 6~8시간씩 4회 반복하여 추출하여 탈지하고, 탈지 후 상기 용매를 별도 회수하고, 원료는 흄후드 안에서 용매를 완전히 제거하는 탈지단계;
상기 탈지단계가 완료된 원료에 상기 원료대비 중량비로 50~90% 에탄올을1:1.5~3.0의 비율로 첨가하여 환류냉각기로 60~80℃의 온도의 수욕 중에서 8시간씩 3회 반복하여 추출한 후, 농축하여 추출물을 획득하는 추출단계;
상기 추출단계에서 얻어진 추출물을 상기 추출물 대비 중량비로 삼염화메틸(Methyl trichloride; CHCl₃) 또는 디클로로메탄 (CH₂Cl₂)을 1:5 ~ 10의 비율로 혼합한 혼합물에 물을 가하여 추출물에 잔존되어 있을 가능성이 있는 색소, 지질 및 잔류농약 등의 소수성 성분을 제거하고, 삼염화메틸층 또는 디클로로메탈층과 물 층을 분리하는 단계; 및
상기 소수성 물질이 제거된 후 분리된 물층에 에틸아세테이트를 상기 물층의 총량 대비 중량비로 1:1의 비율로 가하여 에틸아세테이트층과 물층으로 분획하여 에틸아세테이트층을 회수한 후 물로 세척 후 농축하는 단계;를 포함하여 이루어지는 것을 특징으로 하는 인삼의 잎과 줄기로부터 진세노사이드 F₁의 분획정제방법.
제 1 항에 있어서,
상기 소수성 물질을 제거하여 상기 삼염화메틸층 또는 디클로로메탄층과 물층을 제거하는 단계에서 상기 물은 상기 삼염화메틸 또는 디클로로메탄과 중량비로 1:1의 비율이 되도록 투입혼합하는 것을 특징으로 하는 인삼의 잎과 줄기로부터 진세노사이드 F₁의 분획정제방법.
제 1 항에 있어서,
상기 분획단계에서 상기 에틸아세테이트는 상기 물층의 총량 대비 중량비로 1:1의 비율로 가하여 에틸아세테이트층과 물층으로 분획하는 것을 특징으로 하는 인삼의 잎과 줄기로부터 진세노사이드 F₁의 분획정제방법.
제 1 항에 있어서,
상기 분획 단계 전, 상기 분리된 물층에 수산화나트륨(NaOH)를 적가하여 5% NaOH가 되도록 알칼리화 하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 인삼의 잎과 줄기로부터 진세노사이드 F₁의 분획정제방법.