KR20130111788A - Primer set for detecting viruses in sweet potato and method for detecting simultaneously said viruses using the same - Google Patents

Primer set for detecting viruses in sweet potato and method for detecting simultaneously said viruses using the same Download PDF

Info

Publication number
KR20130111788A
KR20130111788A KR1020120033948A KR20120033948A KR20130111788A KR 20130111788 A KR20130111788 A KR 20130111788A KR 1020120033948 A KR1020120033948 A KR 1020120033948A KR 20120033948 A KR20120033948 A KR 20120033948A KR 20130111788 A KR20130111788 A KR 20130111788A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
virus
sweet potato
spfmv
primer
spgv
Prior art date
Application number
KR1020120033948A
Other languages
Korean (ko)
Other versions
KR101459616B1 (en
Inventor
최홍수
김미경
이수헌
김정수
이준성
정미남
곽해련
Original Assignee
대한민국(농촌진흥청장)
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 대한민국(농촌진흥청장) filed Critical 대한민국(농촌진흥청장)
Priority to KR1020120033948A priority Critical patent/KR101459616B1/en
Publication of KR20130111788A publication Critical patent/KR20130111788A/en
Application granted granted Critical
Publication of KR101459616B1 publication Critical patent/KR101459616B1/en

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
    • C12Q1/04—Determining presence or kind of microorganism; Use of selective media for testing antibiotics or bacteriocides; Compositions containing a chemical indicator therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2537/00—Reactions characterised by the reaction format or use of a specific feature
    • C12Q2537/10—Reactions characterised by the reaction format or use of a specific feature the purpose or use of
    • C12Q2537/143—Multiplexing, i.e. use of multiple primers or probes in a single reaction, usually for simultaneously analyse of multiple analysis

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

PURPOSE: A primer pair for diagnosing sweet potato virus and a diagnosis method using the same are provided to detect each virus and to specifically diagnose complex infection by four kinds of viruses through one-time RT-PCR. CONSTITUTION: A primer pair for diagnosing virus is selected among a primer pair with base sequences of sequence numbers 1 and 2; a primer pair with base sequences of sequence numbers 3 and 4; a primer pair with base sequences of sequence numbers 5 and 6; and a primer pair with base sequences of sequence numbers 7 and 8. The virus is selected among sweet potato leaf curl virus (SPLCV), sweet potato feathery mottle virus (SPFMV), sweet potato G virus (SPGV), and sweet potato latent virus (SwPLV). A method for diagnosing virus comprises the steps of: isolating RNA from a sample; performing RT-PCR of the RNA using the primer pair; and analyzing the RT-PCR product by each size.

Description

고구마 바이러스 진단용 프라이머 쌍 및 이를 이용한 진단방법{Primer set for detecting viruses in sweet potato and method for detecting simultaneously said viruses using the same}TECHNICAL FIELD The present invention relates to a primer pair for detecting a sweet potato virus and a diagnostic method using the primer pair.

본 발명은 고구마 바이러스 진단용 프라이머 쌍 및 이를 이용한 진단방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 고구마 잎말림병 바이러스(Sweet potato leaf curl virus, SPLCV), 고구마 모틀 바이러스(Sweet potato feathery mottle virus, SPFMV), 고구마 G 바이러스(Sweet potato G virus, SPGV) 및 고구마 잠재 바이러스(Sweet potato latent virus, SwPLV)의 4종 바이러스를 각각 또는 동시에 진단할 수 있는 서열번호 1내지 8로 표시되는 프라이머 세트 및 이를 이용한 진단 방법과 진단용 키트에 관한 것이다.
The invention potato virus diagnostic primer pair, and relates to a diagnostic method using the same, and more particularly, sweet potato leaf curl disease virus (Sweet potato leaf curl virus, SPLCV), Potato Mottle Virus (Sweet potato feathery mottle virus , SPFMV), sweet potato G virus ( Sweet potato G virus , SPGV) and sweet potato latent virus ( Sweet potato latent The present invention relates to a primer set represented by SEQ ID NOs: 1 to 8, which can separately or simultaneously diagnose four viruses of virus , SwPLV), a diagnostic method, and a diagnostic kit using the same.

일반적으로 고구마 바이러스병(Sweet potato virus disease, SPVD)은 Sweet potato feathery mottle virus (SPFMV)과 Sweet potato chlorotic stunt virus (SPCSV)의 중복감염으로 인해 위축, 가는 잎, 기형 등의 병징을 보이게 되며, 이 바이러스병에 의하여 20～80% 수량 감수 및 상품의 질 저하 등의 피해가 큰 것으로 보고되었다(Gao 등, 2000; Gibson 등, 1998; Hahn, 1979; Karyeija 등, 1998; Karyeija 등, 2000; Wisler 등, 1998). 또한, 우량 건전 종자나 종묘로 수시로 갱신하지 않으면 SPFMV 에 의해 수량이 20～78％ 감소하고, 품질이 악화된다는 보고도 있다(Gao 등, 2000). In general, Sweet potato virus disease (SPVD) is a Sweet potato feathery mottle virus (SPFMV) and Sweet potato chlorotic stunt virus (SPCSV) has been shown to cause symptoms such as atrophy, thin leaves, and malformations due to the double infection of the virus (SPCSV). Gibson et al., 1998; Hahn, 1979; Karyeija et al., 1998; Karyeija et al., 2000; Wisler et al., 1998). It is also reported that the yield is reduced by 20-78% and quality is deteriorated by SPFMV if it is not updated frequently with good healthy seeds or seedlings (Gao et al., 2000).

세계적으로 고구마에 발생하는 바이러스는 SPFMV, SwPLV, SPMMV 등 14여종 이상이고(Abad 등, 1992; Brunt 등, 1996; Colinet 등, 1994; Colinet 등, 1996; Fuentes 등, 1996; Moyer and Salazar, 1989), 이중에서 고구마에 문제가 되고 있으며, 명확하게 구명된 바이러스는 표 1과 같이 정리를 하였다. The viruses that occur in sweet potatoes worldwide are more than 14 species including SPFMV, SwPLV and SPMMV (Abad et al., 1992; Brunt et al., 1996; Colinet et al., 1994; Colinet et al., 1996; Fuentes et al., 1996; Moyer and Salazar, 1989) , Which is a problem for sweet potatoes, and the viruses that have been clearly identified are listed in Table 1.

고구마에 발생하는 주요 바이러스Major Viruses in Sweet Potatoes 바이러스명Virus name 약어Abbreviation 그룹group 전염infection SweetSweet potatopotato featheryfeathery mottlemottle virusvirus SPFMVSPFMV Potyviridae
(Potyvirus) Potyviridae
( Potyvirus ) 진딧물
(비영속)aphid
(Non-persistent) Sweet potato G virus Sweet potato G virus SPGVSPGV Potyviridae
(Potyvirus) Potyviridae
( Potyvirus ) 진딧물
(비영속)aphid
(Non-persistent) SweetSweet potatopotato mildmild specklinspecklin virusvirus SPMSVSPMSV Potyviridae
(Potyvirus) Potyviridae
( Potyvirus ) 진딧물
(비영속)aphid
(Non-persistent) SweetSweet potatopotato latentlatent virusvirus SwPLVSwPLV Potyviridae
(Potyvirus) Potyviridae
( Potyvirus ) 진딧물
(비영속)aphid
(Non-persistent) SweetSweet potatopotato mildmild mottlemottle virusvirus SPMMVSPMMV Potyviridae
(Ipomovirus) Potyviridae
( Ipomovirus ) 담배가루이
(영속)Tobacco powder
(perpetuity) SweetSweet potatopotato chloroticchlorotic stuntstunt virusvirus SPCSVSPCSV Closteroviridae (Crinivirus) Closteroviridae ( Crinivirus ) 담배가루이
(반영속)Tobacco powder
(Semi-persistent) SweetSweet potatopotato leafleaf curlcurl virusvirus SPLCVSPLCV Geminiviridae
(Begomovirus) Geminiviridae
( Begomovirus ) 담배가루이
(영속)Tobacco powder
(perpetuity)

SPFMV는 Potyviridae과 Potyvirus속에 속하는 바이러스로 크기가 830-850㎚이며, 진딧물에 의하여 비영속 전염을 한다. 이명으로 “Sweet potato chlorotic leaf spot virus”, “Sweet potato internal cork virus”, “Sweet potato russet crack virus” 및 “Sweet potato virus A” (Sheffield, 1953)가 있으며, 현재 공식적으로 “russet crack” 과 “Sweet potato vein-clearing virus” 등 2계통으로 분류가 되어 있다(Brunt 등, 1996). SPFMV is the size of a virus belonging to the genus 830-850㎚ Potyviridae and Potyvirus, and a non-persistent spread by aphids. Alias “ Sweet potato chlorotic leaf spot virus ”,“ Sweet potato internal cork virus ”,“ Sweet potato russet crack virus ”and“ Sweet potato virus A ”(Sheffield, 1953), currently officially“ russet crack ”and“ Sweet potato vein-clearing ” virus ”and two classes (Brunt et al., 1996).

SPGV는 SPFMV와 동일하게 Potyviridae과 Potyvirus속에 속하는 바이러스이지만, coat protein(CP)과 3'-noncoding region의 염기서열 분석 결과 상동성이 80%이하로 나타나서 이종의 바이러스로 분류가 되었다(Colinet 등, 1994). SPGV was the same but with Potyviridae virus belonging to the genus Potyvirus, coat protein (CP) and a 3'-noncoding sequence analysis of homology of this region appear to 80% or less classified as a heterologous virus with SPFMV (Colinet et al., 1994 ).

Alvarez 등(1997)은 동일하게 SPFMV에 속하던 “Sweet Potato Chlorotic Dwarf disease” 계통을 염기서열 분석한 결과, SPFMV와는 63%, Sweet potato latent virus (SwPLV)는 68~70%, SPGV는 57%, 그리고 PVY와는 73%의 상동성을 보였기 때문에 새로이 Sweet potato mild speckling virus(SPMSV)로 명명하였다. Alvarez et al. (1997) analyzed the sequence of the "Sweet Potato Chlorotic Dwarf disease" system, which belonged to SPFMV, as 63%, Sweet potato latent virus (SwPLV) is 68 ~ 70%, SPGV is 57%, and because of PVY than was seen homology of 73% newly Sweet potato mild speckling virus (SPMSV).

Potyviridae과 Potyvirus속에 속하는 또다른 바이러스인 Sweet potato latent virus(SwPLV)는 이명으로 “Sweet potato virus N”이며, 입자 크기는 700-750㎚인 사상형 바이러스이다. SwPLV는 CP와 3'-noncoding region의 염기서열 분석 결과만 보고되어 있을 뿐, 그 외의 바이러스 특성은 아직까지 구명이 되지 않았다(Brunt 등, 1996). Sweet , another virus belonging to the genus Potyviridae and Potyvirus potato latent virus (SwPLV) is known as “ Sweet potato virus N "and a particle size of 700-750 nm. SwPLV has only reported sequencing results of CP and 3'-noncoding regions, and other viral characteristics have not yet been identified (Brunt et al., 1996).

Sweet potato mild mottle virus(SPMMV)는 우간다의 빅토리아 지역에서 크게 문제가 된 바이러스로서 대부분 다른 고구마 바이러스에 비해 넓은 기주범위를 가지고 있다(Moyer 등, 1989). SPMMV는 "Sweet potato T virus" 및 "Sweet potato B virus"라는 이명을 가지고 있으며(Sheffield, 1953), Potyviridae과 Ipomovirus속에 속하는 바이러스로 크기는 800～950㎚로, 담배가루이에 의한 영속전염을 한다(Brunt 등, 1996). Sweet potato mild mottle The virus (SPMMV) is a major problem virus in the Victoria region of Uganda and has a broader host range than most other sweet potato viruses (Moyer et al., 1989). SPMMV has the name "Sweet potato T virus" and "Sweet potato B virus" (Sheffield, 1953), a virus belonging to the genus Potyviridae and Ipomovirus , with a size of 800 to 950 nm, (Brunt et al., 1996).

Sweet potato chlorotic stunt virus(SPCSV)는 Closteroviridae과 Crinivirus속에 속하는 바이러스로 크기는 850㎚이며, 이전까지는 "Sweet potato sunken vein virus(SPSVV)"로 알려져 있었다. SPCSV는 담배가루이에 의해 반영속전염을 하며, 현재까지는 이스라엘과 나이제리아 지역에 한정적으로 분포된 것으로 보고되어 있다(Gibson 등, 1998; Winter 등, 1992). Sweet potato chlorotic stunt virus (SPCSV) is the size of a virus belonging to the genus 850㎚ Closteroviridae and Crinivirus, Previously "Sweet potato sunken vein virus (SPSVV). "SPCSV has been reported to have been transmitted to the cigarette by Louie, and has been reported to be limited in Israel and Nigeria until now (Gibson et al., 1998; Winter et al., 1992).

Sweet potato leaf curl virus(SPLCV)는 미국, 이스라엘, 대만 및 일본 등에 보고되어 있으며(Chung 등, 1985; Osaki와 Inouye, 1991; Cohen 등, 1997; Lotrakul 등, 1998), Geminiviridae과 Begomovirus속에 속하는 바이러스로 담배가루이에 의해 영속전염을 하는 것으로 보고되어 있다(Brunt 등, 1996). 현재, SPLCV는 Ipomoea yellow vein virus(IYVV)와 게놈구조가 유사한 동일한 바이러스로 분류를 하였으나, IYVV가 담배가루이에 의해 전염되지 않는 원인에 관해서는 아직까지 명확히 구명되지 않았다(Banks 등, 1999; Lotrakul 등, 2001). Sweet potato leaf curl virus (SPLCV) has been reported in the United States, Israel, Taiwan, and Japan (Chung et al., 1985; Osaki and Inouye, 1991; Cohen et al., 1997; Lotrakul et al., 1998) and belongs to Geminiviridae and Begomovirus . It is reported to be persistently infected by tobacco flour (Brunt et al., 1996). Currently, SPLCV is classified as the same genome with Ipomoea yellow vein virus (IYVV), but the cause of IYVV transmission by tobacco flour has not been clearly identified (Banks et al., 1999; Lotrakul). Et al., 2001).

국내에서의 고구마 바이러스병은 현재까지 SPFMV, SwPLV, SPGV 및 SPLCV등 4종이 보고되어 있다(Kim 등, 1998; Park 등, 1994; Park 등, 1995; Ryu와 Choi, 2002; Yun 등, 2002; Choi 등, 2006). 2003년에서 2005년에 수집된 고구마 시료 179점과 2011년에 수집된 고구마 시료 126점 및 바이오에너지센터에 보존되고 있는 유전자원 452점에 대해 바이러스 7종에 대해 검정한 결과 [표 2]와 같은 분포를 보여주었다.Four kinds of sweet potato virus disease in Korea have been reported so far: SPFMV, SwPLV, SPGV and SPLCV (Kim et al., 1998; Park et al., 1994; Park et al., 1995; Ryu and Choi, 2002; Yun et al., 2002; Choi; Et al., 2006). As a result of testing for 7 viruses in 179 samples of sweet potatoes collected in 2003-2005, 126 samples of sweet potatoes collected in 2011 and 452 of genetic resources preserved in the bioenergy center, the results were as shown in [Table 2] Distribution.

국내 고구마의 바이러스 발생 상황Virus outbreak situation in domestic sweet potato mixed infectionmixed infection detected virusesdetected viruses genetic resourcesgenetic resources Field SamplesField Samples detecteddetected ratioratio 20112011 2003-20052003-2005 detecteddetected ratioratio detecteddetected ratioratio Quatre
infectionQuatre
infection SPLCV+SPFMV+SPGV+SwPLVSPLCV + SPFMV + SPGV + SwPLV 9191 20.120.1 1010 7.97.9 22 1.11.1 Triple
infectionTriple
infection SPLCV+SPFMV+SPGVSPLCV + SPFMV + SPGV 111111 24.624.6 1212 9.59.5 66 3.43.4 SPLCV+SPFMV+SwPLVSPLCV + SPFMV + SwPLV 1010 2.22.2 1One 0.80.8 00 00 SPLCV+SPGV+SwPLVSPLCV + SPGV + SwPLV 00 00 00 00 00 00 SPFMV+SPGV_SwPLVSPFMV + SPGV_SwPLV 2727 5.95.9 2929 2323 22 1.11.1 Double
infectionDouble
infection SPLCV+SPFMVSPLCV + SPFMV 2525 5.55.5 22 1.61.6 1One 0.60.6 SPLCV+SPGVSPLCV + SPGV 1717 3.83.8 1One 0.80.8 00 00 SPLCV+SwPLVSPLCV + SwPLV 1One 0.20.2 00 00 00 00 SPFMV+SPGVSPFMV + SPGV 4545 1010 3434 2727 1919 10.610.6 SPFMV+SwPLVSPFMV + SwPLV 22 0.40.4 44 3.23.2 1One 0.60.6 SPGV+SwPLVSPGV + SwPLV 33 0.70.7 00 00 00 00 Single
infectionSingle
infection SPLCVSPLCV 1414 3.13.1 22 1.61.6 00 00 SPFMVSPFMV 1212 2.72.7 1414 11.111.1 7171 39.739.7 SPGVSPGV 2020 4.44.4 22 1.61.6 2929 16.216.2 SwPLVSwPLV 1One 0.20.2 00 00 00 00 NO detectionNO detection 7373 16.216.2 1515 11.911.9 4848 26.826.8 계system 452452 126126 179179

바이러스는 크기가 1 ㎛ 보다 작은 병원체로 광학현미경으로도 그 실체를 관찰할 수 없으며, 육안으로 보기 위해서는 전자현미경을 필요로 한다. 그리고 아직까지도 바이러스에 직접 작용하는 약제방제법은 개발되어 있지 않은 실정이다. 이러한 이유에서 정밀하고 신속한 진단은 바이러스병의 관리를 위한 선결요건이다.Viruses are pathogens smaller than 1 μm in size and cannot be seen by optical microscopy, and require an electron microscope to see them with the naked eye. And yet, the pharmaceutical control method that acts directly on the virus has not been developed yet. For this reason, precise and rapid diagnosis is a prerequisite for the management of viral diseases.

한편 식물 바이러스에서 정밀진단용으로 흔히 사용되고 있는 역전사-중합효소연쇄반응(RT-PCR)법은 사용하는 프라이머가 진단의 특이성과 정밀도를 결정짓는다. 일반적으로 사용하는 프라이머의 경우는 바이러스의 유전자 클로닝을 목적으로 설계되어 종 특이적이지 못한 경우가 많다. 그리고 식물체 또는 다른 바이러스에 의한 비특이적 산물을 생산하는 경우가 있기 때문에 진단용으로 사용하기에는 부적합한 경우가 많이 있다. 또한 같은 시료에서 여러 종의 바이러스를 진단하기 위해서는 여러 종류의 프라이머를 사용하여 각각 역전사-중합효소연쇄반응을 함으로써 많은 진단비용과 노동력이 소요되는 문제점을 가지고 있다.The reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR) method, which is commonly used for precise diagnosis in plant viruses, determines the specificity and precision of the diagnosis. In general, primers used in general are designed for the purpose of gene cloning of the virus and are not species specific. In addition, the production of non-specific products by plants or other viruses is often unsuitable for use in diagnostics. In addition, in order to diagnose several kinds of viruses in the same sample, the reverse transcription-polymerase chain reaction using various kinds of primers has a problem that requires a lot of diagnostic cost and labor.

이에 본 발명자들은 4종 바이러스 내에서 지금까지 알려진 염기서열을 수집하여 종의 모든 계통과 분리주가 가지고 있는 공통 염기서열을 탐색한 후 이 공통 염기서열 중에서 유연관계가 있는 다른 바이러스가 가지고 있는 염기서열을 프라이머 설계 대상에서 제외시킴으로써 종 특이적 서열을 선발한 다음 이러한 종 특이적 염기서열로부터 프라이머로 최적의 조건을 가지는 서열을 종 특이적 프라이머로 설계하고 이 프라이머들을 조합별로 실제적인 역전사-중합효소연쇄반응(RT-PCR)을 거쳐 대상 바이러스 이외의 핵산과는 비특이적 반응이 없고, 대상 바이러스에 대해서는 민감도가 우수한 조합을 최종 선발하여 본 발명을 완성하게 되었다.Accordingly, the present inventors have collected common nucleotide sequences in the four species of viruses, and have searched for common nucleotide sequences of all strains and isolates of the species, and found nucleotide sequences of other mutually related viruses in this common nucleotide sequence Specific primers were selected by excluding them from the primer design, and the sequences having the optimal conditions as the primers from the species-specific base sequences were designed as species-specific primers, and these primers were subjected to real reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR), no nonspecific reaction with the nucleic acid other than the target virus, and a combination with a high sensitivity for the target virus were finally selected to complete the present invention.

따라서 본 발명의 목적은 서열번호 1 및 2의 염기서열로 표시되는 프라이머 쌍, 서열번호 3 및 4의 염기서열로 표시되는 프라이머 쌍, 서열번호 5 및 6의 염기서열로 표시되는 프라이머 쌍, 서열번호 7 및 8의 염기서열로 표시되는 프라이머 쌍으로 이루어진 군에서 선택되는 고구마 잎말림병 바이러스(Sweet potato leaf curl virus, SPLCV), 고구마 모틀 바이러스(Sweet potato feathery mottle virus, SPFMV), 고구마 G 바이러스(Sweet potato G virus, SPGV) 및 고구마 잠재 바이러스(Sweet potato latent virus, SwPLV) 로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 바이러스 진단용 프라이머 쌍을 제공하는 것이다.Therefore, an object of the present invention is a primer pair represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 and 2, a primer pair represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3 and 4, primer pair represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 5 and 6, SEQ ID NO: Sweet potato leaf virus selected from the group consisting of primer pairs represented by nucleotide sequences of 7 and 8 curl virus , SPLCV), sweet potato mottle virus ( Sweet potato feathery mottle virus , SPFMV), sweet potato G virus ( Sweet potato G virus , SPGV) and sweet potato latent virus ( Sweet potato latent virus , SwPLV).

본 발명의 다른 목적은 상기 프라이머 쌍을 포함하는 고구마 잎말림병 바이러스, 고구마 모틀 바이러스, 고구마 G 바이러스(Sweet potato G virus, SPGV) 및 고구마 잠재 바이러스로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 바이러스 진단용 키트를 제공하는 것이다.It is another object of the present invention provides a potato leaf curl disease virus, sweet potato Mottle virus, sweet potato G virus (Sweet potato G virus, SPGV) and sweet potatoes more than one virus diagnostic kit is selected from the group consisting of latent virus comprising the primer pair It is.

본 발명의 다른 목적은 (a) 시료의 RNA를 분리하는 단계; (b) 상기 (a)단계의 RNA를 상기 프라이머 쌍을 이용하여 RT-PCR을 수행하는 단계; 및 (c) 상기 (b)단계의 RT-PCR 산물을 크기별로 분리하여 분석하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 고구마 잎말림병 바이러스, 고구마 모틀 바이러스, 고구마 G 바이러스 및 고구마 잠재 바이러스로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 바이러스 진단 방법을 제공하는 것이다.Another object of the invention is (a) separating the RNA of the sample; (b) performing RT-PCR using the primer pair in the RNA of step (a); And (c) isolating and analyzing the RT-PCR products of step (b) by size. The method according to any one of claims 1 to 3, wherein the virus is selected from the group consisting of sweet potato mottle virus, sweet potato G virus, And to provide one or more virus diagnostic methods to be selected.

본 발명의 다른 목적은 서열번호 1 내지 8의 염기서열로 표시되는 프라이머를 포함하는 고구마 잎말림병 바이러스(SPLCV), 고구마 모틀 바이러스(SPFMV), 고구마 G 바이러스(SPGV) 및 고구마 잠재 바이러스(SwPLV) 동시 진단용 조성물 및 이를 포함하는 키트를 제공하는 것이다.
Another object of the present invention is sweet potato leaf blight virus (SPLCV), sweet potato mottle virus (SPFMV), sweet potato G virus (SPGV) and sweet potato latent virus (SwPLV) comprising a primer represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NOS: 1-8 It is to provide a simultaneous diagnostic composition and a kit comprising the same.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1 및 2의 염기서열로 표시되는 프라이머 쌍, 서열번호 3 및 4의 염기서열로 표시되는 프라이머 쌍, 서열번호 5 및 6의 염기서열로 표시되는 프라이머 쌍, 서열번호 7 및 8의 염기서열로 표시되는 프라이머 쌍으로 이루어진 군에서 선택되는 고구마 잎말림병 바이러스(Sweet potato leaf curl virus, SPLCV), 고구마 모틀 바이러스(Sweet potato feathery mottle virus, SPFMV), 고구마 G 바이러스(Sweet potato G virus, SPGV) 및 고구마 잠재 바이러스(Sweet potato latent virus, SwPLV) 로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 바이러스 진단용 프라이머 쌍을 제공한다.In order to achieve the above object, the present invention is a primer pair represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 and 2, primer pair represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3 and 4, primer represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 5 and 6 Sweet potato leaf curling virus selected from the group consisting of a pair, a primer pair represented by the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 7 and 8 (Sweet potato leaf curl virus, SPLCV), sweet potato mottle virus (Sweet potato feathery mottle virus, SPFMV), sweet potato G virus (Sweet potato Gvirus, SPGV) and sweet potato latent viruses (Sweet potato latent virus, SwPLV) provides one or more pairs of virus diagnostic primers selected from the group consisting of.

본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 프라이머 쌍을 포함하는 고구마 잎말림병 바이러스(SPLCV), 고구마 모틀 바이러스(SPFMV), 고구마 G 바이러스(SPGV) 및 고구마 잠재 바이러스(SwPLV) 로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 바이러스 진단용 키트를 제공한다.In order to achieve the other object of the present invention, the present invention comprises a sweet potato leaf blight virus (SPLCV), sweet potato mottle virus (SPFMV), sweet potato G virus (SPGV) and sweet potato latent virus (SwPLV) comprising the primer pair At least one virus diagnostic kit selected from the group is provided.

본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 (a) 시료의 RNA를 분리하는 단계;(b) 상기 (a)단계의 RNA를 상기 프라이머 쌍을 이용하여 RT-PCR을 수행하는 단계; 및 (c)상기 (b)단계의 RT-PCR 산물을 크기별로 분리하여 분석하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 고구마 잎말림병 바이러스(SPLCV), 고구마 모틀 바이러스(SPFMV), 고구마 G 바이러스(SPGV) 및 고구마 잠재 바이러스(SwPLV) 로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 바이러스 진단 방법을 제공한다.In order to achieve another object of the present invention, the present invention comprises the steps of (a) separating the RNA of the sample; (b) performing the RT-PCR using the primer pair of the RNA of step (a); And (c) isolating and analyzing the RT-PCR products of step (b) by size to analyze SPLCV, SPFMV, Sweet Potato G virus, SPGV, ) And sweet potato potential virus (SwPLV).

본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 서열번호 1 내지 8의 염기서열로 표시되는 프라이머를 포함하는 고구마 잎말림병 바이러스(SPLCV), 고구마 모틀 바이러스(SPFMV), 고구마 G 바이러스(SPGV) 및 고구마 잠재 바이러스(SwPLV) 동시 진단용 조성물 및 이를 포함하는 키트를 제공한다.
In order to achieve another object of the present invention, the present invention provides a sweet potato leaf blight virus (SPLCV), sweet potato mottle virus (SPFMV), sweet potato G virus (SPGV) and a primer comprising a nucleotide sequence represented by SEQ. Provided are a composition for diagnosing sweet potato latent virus (SwPLV) and a kit comprising the same.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
Hereinafter, the present invention will be described in detail.

본 발명의 프라이머는 상기 바이러스에 대해서 종 특이적으로 RT-PCR 산물이 합성되도록 하기 위하여 개발되었다. 본 발명에서 종 특이적이라는 의미는 해당 프라이머가 진단대상이 되는 바이러스의 유전체 서열로부터 특이적인 RT-PCR 산물을 합성할 수 있음을 의미하며, 진단대상이 되는 바이러스 종 내의 모든 계통에 대해서 공통적으로 작용해야 하고, 다른 유사 종 또는 식물체 유래의 핵산과의 비특이적 반응은 일어나지 않아야 한다. 일반적으로 사용하는 프라이머의 경우는 바이러스의 특정 유전자를 증폭하기 위하여 설계되어 종 특이적이지 못한 경우가 많으며, 식물체 또는 다른 바이러스의 핵산에 의한 비특이적 산물을 생산하는 경우가 있기 때문에 진단용으로 사용하기에는 부적합하다.Primers of the invention were developed to allow species-specific RT-PCR products to be synthesized against the virus. Species specific in the present invention means that the primer can synthesize a specific RT-PCR product from the genome sequence of the virus to be diagnosed, and works in common for all strains in the virus species to be diagnosed. And nonspecific reactions with nucleic acids from other similar species or plants should not occur. In general, primers used in general are designed to amplify specific genes of a virus and are not species specific, and are not suitable for diagnostic use because they may produce nonspecific products by nucleic acids of plants or other viruses. .

구체적으로 본 발명의 프라이머는 다음과 같은 방법으로 디자인 되었다. (a) 대상 바이러스의 유전자 중 대상이 되는 게놈을 선정;(b) 현재까지 알려진 대상 바이러스의 계통 및 분리주의 게놈서열에서 공통 염기서열을 탐색;(C) 유사 바이러스의 게놈과 동일 또는 유사한 서열을 배제;(d) 프라이머로 기능이 가능한 염기서열만을 선정하는 방법에 의해 프라이머를 디자인 했다. 디자인된 프라이머 중 RT-PCR에 의해 종 특이적인 증폭이 수행될 수 있으며, 비특이적 반응이 일어나지 않는 프라이머 쌍을 선정하였다.Specifically, the primer of the present invention was designed by the following method. (a) selecting a target genome from among genes of the target virus; (b) searching for common sequences in the genome sequences of strains and isolates of the target virus known to date; (C) identifying sequences identical or similar to those of similar viruses. (D) The primers were designed by selecting only those sequences capable of functioning as primers. Among the designed primers, primer-specific amplification can be performed by RT-PCR, and primer pairs are selected in which no non-specific reaction occurs.

본 발명의 프라이머는 PCR용 프라이머 쌍을 말하며, 보다 구체적으로는 이에 한정하지는 않으나 바이러스의 RNA 게놈에 대한 RT-PCR용 프라이머 쌍을 말한다. 본 발명의 프라이머 쌍은 정방향 프라이머와 역방향 프라이머를 포함하며, 고구마 잎말림병 바이러스(Sweet potato leaf curl virus, SPLCV), 고구마 모틀 바이러스(Sweet potato feathery mottle virus, SPFMV), 고구마 G 바이러스(Sweet potato G virus, SPGV) 및 고구마 잠재 바이러스(Sweet potato latent virus, SwPLV)를 진단할 수 있는 서열번호 1과 2로 표시되는 프라이머 쌍, 서열번호 3과 4로 표시되는 프라이머 쌍, 서열번호 5와 6으로 표시되는 프라이머 쌍, 서열번호 7과 8로 표시되는 프라이머 쌍을 포함하는 프라이머일 수 있다.The primer of the present invention refers to a primer pair for PCR, and more particularly, refers to a primer pair for RT-PCR for the RNA genome of a virus. The primer pair of the present invention includes a forward primer and a reverse primer, and the sweet potato leafroll virus virus ( Sweet potato leaf curl virus , SPLCV), sweet potato mottle virus ( Sweet potato feathery mottle virus , SPFMV), sweet potato G virus ( Sweet potato G virus , SPGV) and sweet potato latent virus ( Sweet potato latent viruses , SwPLV), primer pairs shown in SEQ ID NOS: 3 and 4, primer pairs shown in SEQ ID NOS: 5 and 6, and primer pairs shown in SEQ ID NOS: 7 and 8, May be a primer comprising a primer pair.

고구마 모틀 바이러스(SPFMV)를 검출하는 프라이머 쌍으로, 총 5개의 프라이머 쌍([표 3])을 선발하였다(실시예 <1-1>). 그러나 상기 프라이머 쌍 중에서 서열번호 13과 14로 표시되는 프라이머 쌍은 고구마 G 바이러스(SPGV)도 검출하여, 비특이적이었다(실시예 <1-2>).A total of five primer pairs (Table 3) were selected as primer pairs for detecting sweet potato mottle virus (SPFMV) (Example <1-1>). However, the primer pairs shown in SEQ ID NOS: 13 and 14 among the primer pairs detected sweet potato G virus (SPGV) and were nonspecific (Example <1-2>).

고구마 G 바이러스(SPGV)를 검출하는 프라이머 쌍으로, 총 5개의 프라이머 쌍([표 4])을 설계하였고, 모두 다 SPGV와 반응을 하였다(실시예 <1-2>).As a primer pair for detecting sweet potato G virus (SPGV), a total of five primer pairs (Table 4) were designed and all reacted with SPGV (Example <1-2>).

또한 고구마 잠재 바이러스(SwPLV)를 검출하는 프라이머 쌍으로, 총 4개의 프라이머 쌍([표 5])을 설계하였고, 그 중에서 서열번호 7과 8로 표시되는 프라이머 쌍과 서열번호 25와 26으로 표시되는 프라이머 쌍만 고구마 잠재 바이러스에 대해서 특이적이었다(실시예 <1-3>).In addition, a total of four primer pairs ([Table 5]) were designed as primer pairs for detecting sweet potato latent virus (SwPLV), among which primer pairs represented by SEQ ID NOs: 7 and 8 and SEQ ID NOs: 25 and 26. Only primer pairs were specific for sweet potato latent virus (Examples <1-3>).

고구마 잎말림병 바이러스(SPLCV)를 검출하는 프라이머 쌍으로 12개의 프라이머 쌍을 설계하였고, 그 중에서 9개 프라이머 쌍만 SPVCV에 반응하였다. SPLCV는 IYVV와 동일한 바이러스로서, 세계적으로 오직 3종의 계통에서만 전 염기서열이 분석되어 있으므로, 기존에 보고된 바이러스 전 영역의 염기서열 분석 및 특이 프라이머를 구축할 목적으로 프라이머를 설계하고자 했기에, 상기 9개 프라이머 쌍 중 이에 적합한 프라이머 쌍 6개를 선발하였다. 이는 [표 6]에 기재하였다(실시예 <1-4>).Twelve primer pairs were designed with primer pairs to detect sweet potato leaf curl virus (SPLCV), of which only nine primer pairs responded to SPVCV. SPLCV is the same virus as IYVV, and since all the nucleotide sequences are analyzed in only three strains worldwide, the primers were designed for the purpose of constructing the sequencing and specific primers of the entire reported virus region. Six primer pairs were selected out of nine primer pairs. This is shown in Table 6 (Examples <1-4>).

상기 4개의 바이러스를 RT-PCR 전기영동 결과로 구별하기 위해서는 크기 구별이 또렷해야 하므로, 증폭되는 산물의 크기를 고려하여, 각 바이러스를 검출하는 프라이머 쌍을 선발하였다. 고구마 모틀 바이러스(SPFMV) 검출용으로는 서열번호 3과 4로 표시되는 프라이머 쌍(355bp), 고구마 G 바이러스(SPGV) 검출용으로는 서열번호 5와 6으로 표시되는 프라이머 쌍(285bp), 고구마 잠재 바이러스(SwPLV) 검출용으로는 서열번호 7과 8로 표시되는 프라이머 쌍(183bp), 고구마 잎말림병 바이러스(SPLCV) 검출용으로는 서열번호 1과 2로 표시되는 프라이머 쌍(506 bp)을 이용하였다([표 7]). In order to distinguish the four viruses by RT-PCR electrophoresis results, size distinction should be clear, and in consideration of the size of the amplified product, primer pairs for detecting each virus were selected. For detection of Sweet Potato Mottle virus (SPFMV), a primer pair (355 bp) shown in SEQ ID NO: 3 and 4, a primer pair (285 bp) shown in SEQ ID NO: 5 and 6 for detection of sweet potato G virus (SPGV) For detection of virus (SwPLV), primer pair (183 bp) shown in SEQ ID NO: 7 and 8, and primer pair (506 bp) shown in SEQ ID NO: 1 and 2 for detection of sweet potato leafroll virus (Table 7).

상기 선발한 프라이머 쌍들로 SPFMV, SPGV, SPGV, SwPLV 로 단독감염, 2종 복합감염, 3종 복합감염, 4종 복합감염 시킨 시료를 RT-PCR 실행하여, 그 산물을 전기영동 한 결과 ([도 5]), 상기 4가지 바이러스들을 크기별로 뚜렷하게 구별할 수 있었다. 그러므로 상기 프라이머 쌍을 고구마 잎말림병 바이러스(SPLCV), 고구마 모틀 바이러스(SPFMV), 고구마 G 바이러스(SPGV) 및 고구마 잠재 바이러스(SwPLV)들을 동시에 또는 각각 진단하는데 유용하게 쓸 수 있음을 알 수 있다.RT-PCR was performed on samples selected from SPFMV, SPGV, SPGV, and SwPLV as single infections, two types of compound infections, three types of compound infections, and four types of compound infected with the selected primer pairs and the products were subjected to electrophoresis 5]), the four viruses could be distinguished by size. Therefore, it can be seen that the primer pair can be useful for diagnosing sweet potato leaf blight virus (SPLCV), sweet potato mottle virus (SPFMV), sweet potato G virus (SPGV) and sweet potato latent virus (SwPLV) simultaneously or separately.

따라서 본 발명은 상기 프라이머 쌍을 포함하는 고구마 잎말림병 바이러스(SPLCV), 고구마 모틀 바이러스(SPFMV), 고구마 G 바이러스(SPGV) 및 고구마 잠재 바이러스(SwPLV) 로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 바이러스 진단용 키트를 제공한다.Therefore, the present invention is one or more virus diagnostic kit selected from the group consisting of sweet potato leaf blight virus (SPLCV), sweet potato mottle virus (SPFMV), sweet potato G virus (SPGV) and sweet potato latent virus (SwPLV) comprising the primer pair To provide.

또한 본 발명은 상기 프라이머 쌍을 포함하는 고구마 잎말림병 바이러스(SPLCV), 고구마 모틀 바이러스(SPFMV), 고구마 G 바이러스(SPGV) 및 고구마 잠재 바이러스(SwPLV) 동시 진단용 조성물 및 이를 포함하는 키트를 제공한다.The present invention also provides a composition for simultaneous diagnosis of sweet potato leafroll virus (SPLCV), sweet potato mottle virus (SPFMV), sweet potato G virus (SPGV) and sweet potato virus (SwPLV) comprising the above primer pair, and a kit comprising the same .

상기 조성물은 RT-PCR 증폭 반응을 수행하기에 필요한 시약, 열 안정성 DNA 폴리머라아제, dNTP 및 2가 금속 양이온을 함유하는 용액을 의미한다.The composition refers to a solution containing the reagents, thermally stable DNA polymerase, dNTP, and divalent metal cations necessary for carrying out the RT-PCR amplification reaction.

상기 키트는 RT-PCR 용 키트로서, 서열번호 1과 2로 표시되는 프라이머 쌍, 서열번호 3과 4로 표시되는 프라이머 쌍, 서열번호 5와 6으로 표시되는 프라이머 쌍, 서열번호 7과 8로 표시되는 프라이머 쌍으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 프라이머 쌍 및 역전사 반응과 증폭 반응을 수행하기 위한 시약을 포함한다. 상기 키트에서 증폭반응을 수행하기 위한 시약은 역전사효소, DNA 폴리머라제, dNTPs, 버퍼 등을 포함할 수 있다. 또한 RT-PCR 산물의 증폭 여부를 확인할 수 있는 전기영동 수행에 필요한 구성성분들이 본 발명의 키트에 추가로 포함될 수 있다. The kit is a kit for RT-PCR, a primer pair represented by SEQ ID NO: 1 and 2, a primer pair represented by SEQ ID NO: 3 and 4, a primer pair represented by SEQ ID NO: 5 and 6, represented by SEQ ID NO: 7 and 8 One or more primer pairs selected from the group consisting of primer pairs and reagents for conducting reverse transcription and amplification reactions. Reagents for performing the amplification reaction in the kit may include reverse transcriptase, DNA polymerase, dNTPs, buffers, and the like. In addition, the components necessary for performing electrophoresis capable of amplifying the RT-PCR product may be additionally included in the kit of the present invention.

본 발명은 (a) 시료의 RNA를 분리하는 단계;(b) 상기 (a)단계의 RNA를 상기 프라이머 쌍을 이용하여 RT-PCR을 수행하는 단계; 및 (c)상기 (b)단계의 RT-PCR 산물을 크기별로 분리하여 분석하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 고구마 잎말림병 바이러스(SPLCV), 고구마 모틀 바이러스(SPFMV), 고구마 G 바이러스(SPGV) 및 고구마 잠재 바이러스(SwPLV) 로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 바이러스 진단 방법을 제공한다.The present invention comprises the steps of: (a) separating the RNA of the sample; (b) performing the RT-PCR using the primer pair of the RNA of step (a); And (c) isolating and analyzing the RT-PCR products of step (b) by size to analyze SPLCV, SPFMV, Sweet Potato G virus, SPGV, ) And sweet potato potential virus (SwPLV).

상기 (a) 단계에서 RNA 추출은 당업계에서 통상적으로 사용되는 방법에 따라 수행될 수 있으며, 상업적으로 판매되는 RNA 추출용 키트를 이용하여 수행할 수 있다.RNA extraction in step (a) may be performed according to a method commonly used in the art, it may be performed using a commercially available kit for RNA extraction.

또한 상기 (b) 단계에서 RT-PCR에서 분리된 RNA를 주형으로 하고, 본 발명의 프라이머 쌍 중 역방향 프라이머를 프라이머로 하여, 역전사 효소를 이용한 역전사 반응을 통해 cDNA 가닥을 합성한 다음, PCR 반응 혼합액을 이용하여 수행할 수 있다. PCR 반응은 PCR 반응에 필요한 당업계에 공지된 여러 가지 성분을 포함하는 PCR 반응 혼합액을 이용하여 수행될 수 있다. 상기 PCR 반응 혼합액에는 역전사 반응에 의해 합성된 cDNA와 본 발명에서 제공되는 프라이머 쌍 이외에 적당량의 DNA 중합효소, dNTP, PCR 완충용액 및 물을 포함한다. 상기 PCR 완충용액은 Tris-HCl, MgCl2, KCl 등을 포함한다. 이 때 MgCl2 농도는 증폭의 특이성과 수량에 크게 영향을 주며, 일반적으로 Mg2 +가 과량인 경우는 비특이적인 PCR 증폭산물이 증가하고, Mg2+가 부족한 경우 PCR 산물의 산출율이 감소한다. 상기 PCR 완충용액에는 적당량의 트리톤 X-100(Triton X-100)이 추가로 포함될 수도 있다. 또한 PCR은 94-95℃에서 주형 DNA를 전변성시킨 후, 변성(denaturation); 결합(annealing); 및 증폭(extension)의 사이클을 거친 후, 최종적으로 72℃에서 연장(elongation)시키는 일반적인 PCR 반응 조건에서 수행될 수 있다. 상기에서 변성 및 증폭은 94-95℃ 및 72℃에서 각각 수행될 수 있으며, 결합시의 온도는 프라이머의 종류에 따라 달라질 수 있으나, 바람직하게는 50-57℃이며, 보다 바람직하게는 50℃이다. 각 단계의 시간과 싸이클 수는 당업계에 일반적으로 행해지는 조건에 따라 정해질 수 있다.In addition, the RNA isolated from the RT-PCR in step (b) as a template, using the reverse primer of the primer pair of the present invention as a primer, synthesized cDNA strand through reverse transcription using a reverse transcriptase, PCR reaction mixture It can be performed using. The PCR reaction may be carried out using a PCR reaction mixture containing various components known in the art required for the PCR reaction. The PCR reaction mixture includes an appropriate amount of DNA polymerase, dNTP, PCR buffer solution and water in addition to the cDNA synthesized by reverse transcription and the primer pair provided in the present invention. The PCR buffer solution includes Tris-HCl, MgCl 2 , KCl, and the like. In this case MgCl 2 concentration is significantly affects, in general, Mg 2 + is an increase in non-specific PCR amplification products if the excess and, Mg 2+ is the yield of a PCR product decreases if lacking in specificity and yield of the amplification . The PCR buffer solution may further contain an appropriate amount of Triton X-100 (Triton X-100). Also, PCR was performed by denaturing the template DNA at 94-95 ° C, followed by denaturation; Annealing; Followed by a cycle of amplification and extension followed by final elongation at 72 ° C. The denaturation and amplification may be performed at 94-95 ° C and 72 ° C, respectively. The temperature at the time of binding may vary depending on the type of the primer, but is preferably 50-57 ° C, more preferably 50 ° C . The time and number of cycles in each step can be determined according to the conditions commonly practiced in the art.

상기 (c) 단계에서는 당업계에서 널리 공지된 방법에 따라 PCR 산물의 DNA를 크기별로 분리할 수 있다. 바람직하게는 아가로스 겔(agarose gel) 또는 폴리아크릴아미드 겔(polyacrylamide gel) 전기영동 또는 형광분석장치(ABI prism 3100 genetic analyzer-electropherogram)에 의해 확인할 수 있다. 이 때, 형광분석장치를 이용하기 위해서는 당업계에 공지된 형광 다이(dye)를 붙인 프라이머쌍을 이용하여 상기 (b)단계에서 PCR을 수행한다. PCR 증폭 결과는 바람직하게는 아가로스 겔 전기영동에 의해 확인할 수 있다. 전기영동 후 에디듐 브로마이드(ethidium bromide) 염색으로 전기영동 결과를 분석할 수 있다. 일반적인 역전사 반응, PCR 수행 및 그 결과 분석 방법에 대해서는 당업계에 잘 알려져 있다.
In step (c), DNAs of PCR products may be separated according to sizes according to methods well known in the art. Preferably it can be confirmed by an agarose gel (agarose gel) or polyacrylamide gel electrophoresis or fluorescence analysis (ABI prism 3100 genetic analyzer-electropherogram). At this time, in order to use the fluorescence analyzer PCR is performed in the step (b) using a primer pair attached to a fluorescent die known in the art. PCR amplification results can be preferably confirmed by agarose gel electrophoresis. After electrophoresis, electrophoresis results can be analyzed by ethidium bromide staining. Methods for performing general reverse transcription, PCR and analysis of the results are well known in the art.

본 발명은 고구마 잎말림병 바이러스(Sweet potato leaf curl virus, SPLCV), 고구마 모틀 바이러스(Sweet potato feathery mottle virus, SPFMV), 고구마 G 바이러스(Sweet potato G virus, SPGV) 및 고구마 잠재 바이러스(Sweet potato latent virus, SwPLV)의 4종 바이러스를 각각 또는 동시에 진단할 수 있는 서열번호 1 내지 8로 표시되는 프라이머 세트 및 이를 이용한 진단 방법과 진단용 키트에 관한 것으로서, 국내 고구마에 발생하는 4종 바이러스(SPLCV, SPFMV, SPGV, SwPLV)를 한번의 RT-PCR 반응으로 바이러스 각각에 대한 진단뿐만 아니라 4종 바이러스에 대한 모든 조합의 복합감염의 경우에도 특이적으로 진단이 가능하다. 이 동시진단법의 사용으로 비용과 시간을 줄이는 경제성이 있으며, 고구마 바이러스 무병주 생산 개발에 효과적으로 사용할 수 있다.The present invention sweet potato leaf blight virus ( Sweet potato leaf curl virus , SPLCV), sweet potato mottle virus ( Sweet potato feathery mottle virus , SPFMV), sweet potato G virus ( Sweet potato G virus , SPGV) and sweet potato latent virus ( Sweet potato latent 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, , SPGV, and SwPLV) can be diagnosed specifically in the case of multiple infections of all combinations of four viruses as well as diagnosis of each virus by one RT-PCR reaction. This simultaneous diagnosis method is economical to reduce cost and time, and can be effectively used for development of disease-free production of sweet potato virus.

도 1은 SPFMV 진단용 프라이머 선별 결과에 관한 것이다. (각 lane 별 샘플과 프라이머 쌍은 하기 표와 같다.)

Figure pat00001

도 2는 SPGV 단독 감염 시료를 SPGV 진단용 프라이머 쌍와 SPFMV 진단용 프라이머 쌍으로 RT-PCR을 시행한 결과이다.(각 lane 별 프라이머 쌍은 하기 표와 같다.)
Figure pat00002

도 3은 SwPLV 진단용 프라이머 선별 결과에 관한 것이다.(각 Lane별 샘플과 프라이머 쌍은 하기 표와 같다.)
Figure pat00003

도 4는 SPLCV 진단용 프라이머 선별 결과에 관한 것이다.(각 lane 별 프라이머 쌍을 하기 표에 기재하였다. lane 3, 7, 10 의 프라이머 쌍은 SPLCV 및 IYVV에 대해 특이성이 없어서 제외시켰다.)
Figure pat00004

도 5는 고구마 바이러스 Multiplex RT-PCR 결과 전기영동 사진에 관한 것이다. (M : 100bp ladder, 1 : SwPLV, 2 : SPGV, 3 : SPFMV, 4 : SPLCV, 5 : SwPLV+SPGV, 6 : SwPLV+ SPFMV, 7 : SwPLV+SPLCV, 8 : SPGV+ SPFMV, 9 : SPGV+SPLCV, 10 : SPFMV+SPLCV, 11 : SwPLV+SPGV+ SPFMV, 12 : SwPLV+SPGV+SPLCV, 13 : SwPLV+SPFMV+SPLCV, 14 : SPGV+SPFMV+SPLCV, 15 : SPLCV+SPFMV+SPGV+SPLV)Figure 1 relates to the results of screening primers for SPFMV diagnostics. (Sample and primer pairs for each lane are shown in the table below.)
Figure pat00001

Figure 2 shows the results of RT-PCR of SPGV single-infected samples with SPGV diagnostic primer pairs and SPFMV diagnostic primer pairs (primer pairs for each lane are shown in the table below).
Figure pat00002

Figure 3 shows the results of screening for SwPLV diagnostic primers (sample and primer pairs for each lane are shown in the following table).
Figure pat00003

Figure 4 relates to the results of SPLCV diagnostic primer selection (primary pairs for each lane are shown in the table below. Primer pairs lanes 3, 7, 10 were excluded because they were not specific for SPLCV and IYVV).
Figure pat00004

5 relates to the electrophoretic photograph of sweet potato virus Multiplex RT-PCR results. ( M: 100bp ladder, 1: SwPLV, 2 : SPGV, 3 : SPFMV, 4 : SPLCV, 5 : SwPLV + SPGV, 6 : SwPLV + SPFMV, 7 : SwPLV + SPLCV, 8: SPGV + SPFMV, 9 : SPGV + SPLCV, 10 : SPFMV + SPLCV, 11 : SwPLV + SPGV + SPFMV, 12 : SwPLV + SPGV + SPLCV, 13 : SwPLV + SPFMV + SPLCV, 14 : SPGV + SPFMV + SPLCV, 15 : SPLCV + SPFMV + SPGV + SPLV)

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.Hereinafter, the present invention will be described in detail.

단, 하기 실시 예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시 예에 한정되는 것은 아니다.
However, the following examples are illustrative of the present invention, and the present invention is not limited to the following examples.

<< 실시예Example 1> 1>

고구마 바이러스 진단 체계 확립Establishment of Sweet Potato Virus Diagnosis System

<1-1><1-1> SPFMVSPFMV 진단용  For diagnostic purposes 프라이머primer 선별 Selection

SPFMV(고구마모틀바이러스) 진단용 프라이머는 외피단백질(coat protein, CP) 및 RNA의 3’말단 지역을 대상으로 크기가 225~355bp인 5쌍을 설계하였다. 설계한 프라이머는 하기 [표 3]에 기재하였다.SPFMV (Sweet Potato Mottle Virus) diagnostic primer designed five pairs of size 225-355 bp for the 3 'terminal region of coat protein (CP) and RNA. The designed primers are listed in Table 3 below.

SPFMV 진단용 프라이머SPFMV Diagnostic Primer Primer namePrimer name locuslocus sequencesequence expected sizeexpected size 서열번호SEQ ID NO: SPFMV 1-FSPFMV 1-F 9073-90929073-9092 5' TACACACTGCTAAAACTAGG 3' (20-mer)5 'TACACACTGCTAAAACTAGG 3' (20-mer) 355bp355 bp 33 SPFMV 1-RSPFMV 1-R 9428-94099428-9409 5' AGTTCATCATAACCCCATGA 3' (20-mer)5 'AGTTCATCATAACCCCATGA 3' (20-mer) 44 SPFMV 2-FSPFMV 2-F 9465-94839465-9483 5' GGACCAAGCCCCATACAAT 3' (19-mer)5 'GGACCAAGCCCCATACAAT 3' (19-mer) 347bp347bp 99 SPFMV 2-RSPFMV 2-R 9812-97959812-9795 5' GGAATGGTTGCGGGTTGC 3' (18-mer)5 'GGAATGGTTGCGGGTTGC 3' (18-mer) 1010 SPFMV 3-FSPFMV 3-F 9788-98079788-9807 5' GAGCTAAGCAACCCGCAACC 3' (20-mer)5 'GAGCTAAGCAACCCGCAACC 3' (20-mer) 225bp225bp 1111 SPFMV 3-RSPFMV 3-R 10013-999410013-9994 5' TCATATGTTGACAAGAGTTG 3' (20-mer)5 'TCATATGTTGACAAGAGTTG 3' (20-mer) 1212 SPFMV 4-FSPFMV 4-F 10127-1014810127-10148 5' TGAATGGATTAATGGTTTGGTG 3' (22-mer)5 'TGAATGGATTAATGGTTTGGTG 3' (22-mer) 261bp261 bp 1313 SPFMV 4-RSPFMV 4-R 10388-1037010388-10370 5' GCATATCGCGCAAGACTCA 3' (19-mer)5 'GCATATCGCGCAAGACTCA 3' (19-mer) 1414 SPFMV 5-FSPFMV 5-F 10381-1040210381-10402 5' CGATATGCATTTGATTTCTACG 3' (22-mer)5 'CGATATGCATTTGATTTCTACG 3' (22-mer) 270bp270 bp 1515 SPFMV 5-RSPFMV 5-R 10651-1063110651-10631 5' TTAAAGGCATACTAAAGATAA 3' (21-mer)5 'TTAAAGGCATACTAAAGATAA 3' (21-mer) 1616

설계한 상기 프라이머들을 SPFMV에 감염된 두 샘플 583-1, 552-2를 대상으로 RT-PCR 검정해 본 결과, 5쌍 SPFMV를 모두 검출하였다. 결과는 [도 1]에서 확인할 수 있다.RT-PCR analysis of the primers designed for two samples 583-1 and 552-2 infected with SPFMV resulted in detection of all 5 pairs of SPFMV. The results can be seen in [FIG. 1].

아래 실시예에서 확인할 수 있듯이, SPFMV 4-F와 SPFMV 4-R로 이루어진 프라이머 쌍은 SPGV도 검출하므로 SPFMV 단독 검출용으로는 적합하지 않다.
As can be seen in the examples below, the primer pair consisting of SPFMV 4-F and SPFMV 4-R is also not suitable for SPFMV detection alone because it also detects SPGV.

<1-2><1-2> SPGVSPGV 진단용  For diagnostic purposes 프라이머primer 선별  Selection

SPGV 진단용 프라이머는 CP 및 RNA의 3’말단 지역을 대상으로 크기가 203~365bp인 5쌍을 설계하였다. 디자인한 프라이머 쌍은 하기 [표 4]에 기재하였다. SPGV diagnostic primers designed 5 pairs of 203 ~ 365bp in size for the 3 ′ end region of CP and RNA. The designed primer pairs are listed in Table 4 below.

SPGV 진단용 프라이머 설계SPGV diagnostic primer design PrimerPrimer namename locuslocus sequencesequence expectedexpected sizeyou 서열번호SEQ ID NO: SPGV 1-FSPGV 1-F 467-484467-484 5' TGGCGCATCAAGGAAAAG 3' (18-mer)5 'TGGCGCATCAAGGAAAAG 3' (18-mer) 313bp313 bp 1717 SPGV 1-RSPGV 1-R 780-763780-763 5' ACCTGGTGGTAATGGTCC 3' (18-mer)5 'ACCTGGTGGTAATGGTCC 3' (18-mer) 1818 SPGV 2-FSPGV 2-F 808-829808-829 5' GAAATTCCGCAGCCAGAGTCAC 3' (22-mer)5 'GAAATTCCGCAGCCAGAGTCAC 3' (22-mer) 203bp203bp 1919 SPGV 2-RSPGV 2-R 1011-9901011-990 5' TCCAACCGTACCAGCATTCACA 3' (22-mer)5 'TCCAACCGTACCAGCATTCACA 3' (22-mer) 2020 SPGV 3-FSPGV 3-F 1061-10811061-1081 5' CAATGCCAAATGGAAGAATAG 3' (22-mer)5 'CAATGCCAAATGGAAGAATAG 3' (22-mer) 285bp285bp 55 SPGV 3-R SPGV 3-R 1346-13251346-1325 5' GCATGATCCAATAGAGGTTTTA 3' (22-mer)5 'GCATGATCCAATAGAGGTTTTA 3' (22-mer) 66 SPGV 4-FSPGV 4-F 1410-14311410-1431 5' GCGCAATAGGATCAAGGCATAC 3' (22-mer)5 'GCGCAATAGGATCAAGGCATAC 3' (22-mer) 334bp334 bp 2121 SPGV 4-RSPGV 4-R 1744-17231744-1723 5' ACACTGAAGGCGAAACTGAAAT 3' (22-mer)5 'ACACTGAAGGCGAAACTGAAAT 3' (22-mer) 2222 SPGV 5-FSPGV 5-F 1546-15651546-1565 5' CAAATGAAAGCAGCAGCACT 3' (20-mer)5 'CAAATGAAAGCAGCAGCACT 3' (20-mer) 365bp365bp 2323 SPGV 5-RSPGV 5-R 1911-18921911-1892 5' ATCACGAACCAAAAAGGCTT 3'(20-mer)5 'ATCACGAACCAAAAAGGCTT 3' (20-mer) 2424

SPGV에 단독 감염된 샘플을 대상으로 상기 [표 4]의 SPGV 진단용 프라이머와 [표 3]의 SPFMV 진단용 프라이머로 RT-PCR을 실시하였다. 그 결과, [표 4]의 프라이머 모두 SPGV를 검출하였는데, [표 3]의 SPFMV 검출용 SPFMV 4-F(서열번호 13)와 SPFMV 4-R(서열번호 14) 프라이머 세트 역시 SPGV를 검출하였다. 이는 [도 2]에서 확인할 수 있다.
RT-PCR was performed on SPGV single-infected samples with the SPGV diagnostic primer shown in Table 4 and the SPFMV diagnostic primer shown in [Table 3]. As a result, SPGV was detected in all of the primers of Table 4. SPGV was also detected in the SPFMV 4-F (SEQ ID NO: 13) and SPFMV 4-R (SEQ ID NO: 14) primer sets for SPFMV detection in Table 3. This can be confirmed in [Fig. 2].

<1-3> <1-3> SwPLVSwPLV 진단용  For diagnostic purposes 프라이머primer 선별 Selection

SwPLV는 세계적으로 염기서열 분석 결과가 많지 않았으며, 기존에 보고된 바이러스도 CP 및 RNA 3’말단 지역만을 염기서열 분석하였기 때문에, SPFMV 및 SPGV와 동일하게 CP 및 RNA 3’말단 지역을 대상으로 크기가 183~520bp인 4쌍을 설계하였다. 설계 프라이머는 하기 [표 5]에 기재하였다.SwPLV did not have many sequencing results worldwide, and since the previously reported virus sequenced only the CP and RNA 3 'end regions, the size of the SwPLV was the same as that of SPFMV and SPGV. We designed 4 pairs with 183 ~ 520bp. Design primers are listed in Table 5 below.

SwPLV 진단용 프라이머 설계 SwPLV diagnostic primer design PrimerPrimer namename locuslocus sequencesequence expectedexpected sizeyou 서열번호SEQ ID NO: SwPLV 1-FSwPLV 1-F 335-356335-356 5' GGAGTCAGTTCAATCAATGGTA 3' (22-mer)5 'GGAGTCAGTTCAATCAATGGTA 3' (22-mer) 183bp183bp 77 SwPLV 1-RSwPLV 1-R 518-498518-498 5' AGTGGCTTTATTGGGTATGAT 3' (21-mer)5 'AGTGGCTTTATTGGGTATGAT 3' (21-mer) 88 SwPLV 2-FSwPLV 2-F 470-490470-490 5' GGGTGATGATGGACGGAGACA 3' (21-mer)5 'GGGTGATGATGGACGGAGACA 3' (21-mer) 298bp298bp 2525 SwPLV 2-RSwPLV 2-R 768-747768-747 5' CCGATGATGTGTATTTGTGAGC 3' (22-mer)5 'CCGATGATGTGTATTTGTGAGC 3' (22-mer) 2626 SwPLV 3-FSwPLV 3-F 757-777757-777 5' ACACATCATCGGCTGTTCGGT 3' (21-mer)5 'ACACATCATCGGCTGTTCGGT 3' (21-mer) 319bp319 bp 2727 SwPLV 3-RSwPLV 3-R 1076-10561076-1056 5' GTGTGTGGTATAAGACAAAAA 3' (21-mer)5 'GTGTGTGGTATAAGACAAAAA 3' (21-mer) 2828 SwPLV-u1SwPLV-u1 24-4724-47 5' TGGAAAAGTGGAAACGAAGAAGAA 3‘ (24-mer)5 'TGGAAAAGTGGAAACGAAGAAGAA 3' (24-mer) 520bp520bp 2929 SwPLV-d1SwPLV-d1 544-523544-523 5' GAAATGTTGGTGCTGCGAAATC 3'(22-mer)5 'GAAATGTTGGTGCTGCGAAATC 3' (22-mer) 3030

SwPLV와 다른 바이러스가 복합 감염된 시료 2종(607-2, 618-2)을 대상으로 RT-PCR 검정 결과, SwPLV 1-F와 SwPLV 1-R로 이루어진 세트, SwPLV 2-F와 SwPLV 2-R로 이루어진 세트만이 SwPLV와 뚜렷한 반응을 한 반면에, 나머지 2종의 프라이머는 다른 바이러스와 비특이 반응을 보였으며, 반응 결과 다소 차이가 있어 진단용 특이 프라이머로 선발하기엔 적합하지 않았다(도 3).
RT-PCR assay on two SwPLV and other virus-infected samples (607-2, 618-2) revealed that SwPLV 1-F and SwPLV 1-R, SwPLV 2-F and SwPLV 2-R While only the set consisting of SwPLV reacted distinctly, the other two primers showed a nonspecific reaction with other viruses, and the reaction result was slightly different, so it was not suitable for selection as a diagnostic specific primer (FIG. 3).

<1-4><1-4> SPLCVSPLCV 진단용  For diagnostic purposes 프라이머primer 선별 Selection

SPLCV는 IYVV와 동일한 바이러스 보고되어 있으며, 세계적으로 SPLCV와 IYVV 모두 오직 3종의 계통에서만 전 염기서열이 분석되어 있기 때문에, 기존에 보고된 바이러스의 전 영역의 염기서열 분석 및 특이 프라이머를 구축할 목적으로 프라이머를 설계하였다. 각각 SPLCV와 IYVV에 보고된 전 염기서열을 대상으로 모두 12종으로 프라이머를 설계하였다. 설계한 12쌍 프라이머로 SPLCV 및 IYVV 에 감염된 샘플을 RT-PCR 검정한 결과, [도 4]에서 확인할 수 잇듯이, lane 3, 7, 10에 적용한 3개의 프라이머 쌍은 SPLCV 및 IYVV에 대해 특이성이 없었다. 나머지 9개의 프라이머 쌍 중에서 전 염기서열 분석 및 특이 진단용 프라이머 쌍은 모두 6개를 선발하였는데, 이 6종의 프라이머 쌍을 하기 [표 6]에 기재하였다.SPLCV has been reported in the same virus as IYVV. Since SPLCV and IYVV have been analyzed in all three species only, the sequence analysis of the whole region of the previously reported virus and the construction of specific primers Primers were designed. A total of 12 primers were designed for the base sequences reported in SPLCV and IYVV, respectively. As a result of RT-PCR analysis of SPLCV and IYVV-infected samples with the designed 12-pair primers, three primer pairs applied to lanes 3, 7, and 10 were specific for SPLCV and IYVV. There was no. Of the remaining nine primer pairs, all six sequencing and specific diagnostic primer pairs were selected, and these six primer pairs are described in Table 6 below.

SPLCV 진단용 프라이머 설계Primer Design for SPLCV Diagnostics PrimerPrimer namename locuslocus sequencesequence expectedexpected sizeyou 서열번호SEQ ID NO: SPLCV 2-FSPLCV 2-F 1970-19871970-1987 5' TGTGAGGGCCCAAAGACC 3'(18-mer)5 'TGTGAGGGCCCAAAGACC 3' (18-mer) 401bp401 bp 3131 SPLCV 2-RSPLCV 2-R 2371-23522371-2352 5' TCGATAAGGACGGGGATACC 3'(20-mer)5 'TCGATAAGGACGGGGATACC 3' (20-mer) 3232 SPLCV 3-FSPLCV 3-F 1496-15131496-1513 5' TCCCCTGTGCGTGAATCC 3' (18-mer)5 'TCCCCTGTGCGTGAATCC 3' (18-mer) 505bp505 bp 3333 SPLCV 3-RSPLCV 3-R 2001-19812001-1981 5' AACAGTATGGGCCAGGTCTTT 3'(21-mer)5 'AACAGTATGGGCCAGGTCTTT 3' (21-mer) 3434 SPLCV 5-FSPLCV 5-F 631-650631-650 5' ATGGGTATAGATGGGAAGGT 3' (20-mer)5 'ATGGGTATAGATGGGAAGGT 3' (20-mer) 424bp424 bp 3535 SPLCV 5-RSPLCV 5-R 1055-10361055-1036 5' TGCGAATCATAGAAATAAGC 3' (20-mer)5 'TGCGAATCATAGAAATAAGC 3' (20-mer) 3636 SPLCV 6-FSPLCV 6-F 146-168146-168 5' GGACCCTTTGCAGAACCCACTAC 3' (23mer)5 'GGACCCTTTGCAGAACCCACTAC 3' (23mer) 574bp574bp 3737 SPLCV 6-RSPLCV 6-R 720-699720-699 5' TCTGTCACGAATCAACCAATAC 3' (22-mer)5 'TCTGTCACGAATCAACCAATAC 3' (22-mer) 3838 IYVV 1-FIYVV 1-F 2315-23352315-2335 5' TCTGCCGTCGATCTGGAACTC 3'(21-mer)5 'TCTGCCGTCGATCTGGAACTC 3' (21-mer) 506bp506bp 1One IYVV 1-RIYVV 1-R 2821-28032821-2803 5' GTGCCCGCCTTTGGTGGAC 3'(19-mer)5 'GTGCCCGCCTTTGGTGGAC 3' (19-mer) 22 IYVV 4-FIYVV 4-F 1232-12541232-1254 5' TTAAGGCGTTGCAAAATACCAGT 3'(23-mer)5 'TTAAGGCGTTGCAAAATACCAGT 3' (23-mer) 501bp501 bp 3939 IYVV 4-RIYVV 4-R 1733-17161733-1716 5' TAGATAAACCAGAGCAAGGAGCA 3'(23-mer)5 'TAGATAAACCAGAGCAAGGAGCA 3' (23-mer) 4040

<실시예 2><Example 2>

고구마 발생 4종 바이러스에 대한 다중 진단법 개발Development of Multiple Diagnosis Methods for Four Sweet Potato Viruses

RT-PCR 산물의 크기에 따라 바이러스를 분류하여야 하기 때문에 검출 크기를 고려하여 하기 [표 7]과 같이 SPFMV, SPGV, SwPLV, SPLCV 진단용 프라이머를 선발하였다. Since the virus must be classified according to the size of the RT-PCR product, SPFMV, SPGV, SwPLV and SPLCV diagnostic primers were selected as shown in [Table 7].

고구마 바이러스 다중진단용 프라이머Sweet potato virus multiple diagnosis primer VirusVirus PrimerPrimer namename SequenceSequence (5`→3`)(5`➝3`) LociLoci ProductProduct sizeyou 서열번호SEQ ID NO: SPLCVSPLCV IYVV 1-FIYVV 1-F TCTGCCGTCGATCTGGAACTCTCTGCCGTCGATCTGGAACTC 2315-23352315-2335 506bp506bp 1One IYVV 1-RIYVV 1-R GTGCCCGCCTTTGGTGGACGTGCCCGCCTTTGGTGGAC 2821-28032821-2803 22 SPFMVSPFMV SPFMV 1-FSPFMV 1-F TACACACTGCTAAAACTAGGTACACACTGCTAAAACTAGG 9073-90929073-9092 355bp355 bp 33 SPFMV 1-RSPFMV 1-R AGTTCATCATAACCCCATGAAGTTCATCATAACCCCATGA 9428-94099428-9409 44 SPGVSPGV SPGV 3-FSPGV 3-F CAATGCCAAATGGAAGAATAGCAATGCCAAATGGAAGAATAG 1061-10811061-1081 285bp285bp 55 SPGV 3-RSPGV 3-R GCATGATCCAATAGAGGTTTTAGCATGATCCAATAGAGGTTTTA 1346-13251346-1325 66 SwPLVSwPLV SwPLV 1-FSwPLV 1-F GGAGTCAGTTCAATCAATGGTAGGAGTCAGTTCAATCAATGGTA 335-356335-356 183bp183bp 77 SwPLV 1-RSwPLV 1-R AGTGGCTTTATTGGGTATGATAGTGGCTTTATTGGGTATGAT 518-498518-498 88

상기 선발된 프라이머 쌍들을 이용하여 단독감염, 2종 복합감염, 3종 복합감염, 4종 복합감염 이병주에 대해 RT-PCR 진단을 실시하였다.RT-PCR diagnosis was performed for single infection, two complex infections, three complex infections, and four complex infection pathogens using the selected primer pairs.

고구마 시료는 병징이 있는 잎의 잎자루 및 하단 줄기 표피를 액체질소로 마쇄한 뒤, 바이러스 게놈 추출 키트(Intron, Viral gene-spin kit)를 이용하여 전체 게놈을 추출하였다. 역전사(RT)과정으로, 게놈 주형 1 마이크로리터, 3'-프라이머 각각 32 pmol 혼합물 0.5 마이크로리터, 2.5mM dNTPs 0.5 마이크로리터, 10mg/ml BSA 0.1 마이크로리터, 40U/ul RNase inhibitor 0.2 마이크로리터, 5x RT buffer, AMV 역전사 효소를 넣어 최종 5 마이크로리터 반응액으로 42 ℃에서 30분 반응한다. 이 과정에서 만들어진 cDNA를 이용하여, 5'-프라이머 각각 32 pmol 혼합액 0.5 마이크로리터, 10mg/ml BSA 0.1 마이크로리터, 2.5 mM dNTPs 1.5 마이크로리터, 25mM MgCl2 2.5ul, 5X PCR buffer, Taq polymerase를 넣어 최종 25 마이크로리터 반응액을 만들어 PCR를 수행하는데, DNA 초기 변성 과정으로 94 ℃ 3분, [DNA 변성을 위해 94 ℃ 30초, 프라이머 바인딩(annealing)을 위해 50 ℃ 30초, DNA 사슬 신장을 위해 72 ℃ 1분]을 35회 반복한 후, 최종적으로 DNA 사슬 신장을 위해 72 ℃ 10분의 PCR 반응 조건으로 하여 SPFMV, SPGV, SwPLV 및 SPLCV서열을 증폭한 산물을 1% 아가로스겔, 100mV, 1시간 30분 전기영동하여 확인하였다.The sweet potato sample was pulverized with liquid nitrogen on the petiole and the lower stem epidermis of the diseased leaf, and the whole genome was extracted using a viral genome extraction kit (Intron, Viral gene-spin kit). (RT), 0.5 microliters of a mixture of 32 pmol each of the genomic template and 3'-primer, 0.5 microliters of 2.5 mM dNTPs, 0.1 microliter of 10 mg / ml BSA, 0.2 microliters of 40 U / ul RNase inhibitor, 5x RT buffer, AMV reverse transcriptase, and react at 42 ° C for 30 minutes with the final 5 μl reaction mixture. Using the cDNA prepared in this procedure, 0.5 microliters of 32 pmol each of 5'-primer, 0.1 microliter of 10 mg / ml BSA, 1.5 microliter of 2.5 mM dNTPs, 2.5 ul of 25 mM MgCl2, 5X PCR buffer, and Taq polymerase were added PCR was carried out using 25 microliters of reaction solution. The PCR reaction was carried out at 94 ° C for 3 minutes, 94 ° C for 30 seconds for DNA denaturation, 30 seconds for 50 ° C for primer annealing, 72 1 minute] was repeated 35 times. Finally, products amplified with SPFMV, SPGV, SwPLV and SPLCV sequences were subjected to 1% agarose gel, 100 mV, 1 Time 30 minutes.

그 결과는 [도 5]에서 확인할 수 있다. 단독감염 및 복합 감염 모두에서 정확한 반응을 나타냈으며, 증폭 서열의 크기도 뚜렷한 차이를 나타내어서 밴드의 위치만 확인하여도 어떤 종의 바이러스가 감염되어 있는지 쉽게 확인할 수 있었다.The results can be confirmed in [5]. The response was accurate in both single infection and multiple infections, and the size of the amplification sequence also showed a significant difference. Therefore, it was easy to confirm which species of virus was infected only by checking the band position.

상기 RT-PCR산물의 염기서열 분석결과, NCBI에 등록된 염기서열과 98~99%의 상동성을 보였다(표 8).The nucleotide sequence analysis of the RT-PCR product showed 98-99% homology with the nucleotide sequence registered in NCBI (Table 8).

다중 진단용 프라이머를 이용한 증폭산물의 염기서열 분석결과Sequence analysis of amplification products using multiple diagnostic primers 대상
바이러스object
virus 프라이머primer 산물크기Product size 염기서열Base sequence 비교대상
/상동성comparison target
Homology SwPLVSwPLV SwPLV 1-F
&
SPLV 1RSwPLV 1-F
&
SPLV 1R 185bp185 bp GGAGTCAGTTCAAATCAATGGTATGAGGGCGTGAAGAGTGCTTACGAAGTGGATGACCAGCAGATGTCAATCCTAATGAATGGACTTGTTGTATGGTGTATAGAGAATGGGACTTCTCCAAATATCAATGGTGATTGGGTGATGATGGACGGAGACACGCAAGTATCATACCCAATAAAGCCACTGGAGTCAGTTCAAATCAATGGTATGAGGGCGTGAAGAGTGCTTACGAAGTGGATGACCAGCAGATGTCAATCCTAATGAATGGACTTGTTGTATGGTGTATAGAGAATGGGACTTCTCCAAATATCAATGGTGATTGGGTGATGATGGACGGAGACACGCAAGTATCATACCCAATAAAGCCACT HQ844144
/ 98%HQ844144
/ 98% SPGVSPGV SPGV 3-F
&
SPGV 3-R
SPGV 3-F
&
SPGV 3-R
286bp286bp CAATGCCAAATGGAAGAATAGTAGTCAATCTTGACCACTTGACAATCTATGACCCTGAACAAACAAGTCTTTCAAATACTCGAGCAACACAGGAACAATTTAATGCTTGGTACGAGGGTGTCAGGGAAGATTATGGAGTGAATGATGAGCAAATGGGGATATTGCTCAATGGGTTAATGGTTTGGTGTATCGAGAATGGAACATCCCCGAATATTAATGGAATGTGGGTCATGATGGATGGTGATGAACAAGTTACATATCCAATAAAACCTCTATTGGATCATGCCAATGCCAAATGGAAGAATAGTAGTCAATCTTGACCACTTGACAATCTATGACCCTGAACAAACAAGTCTTTCAAATACTCGAGCAACACAGGAACAATTTAATGCTTGGTACGAGGGTGTCAGGGAAGATTATGGAGTGAATGATGAGCAAATGGGGATATTGCTCAATGGGTTAATGGTTTGGTGTATCGAGAATGGAACATCCCCGAATATTAATGGAATGTGGGTCATGATGGATGGTGATGAACAAGTTACATATCCAATAAAACCTCTATTGGATCATGC JQ073704
/ 99%JQ073704
/ 99% SPFMVSPFMV SPFMV 1-F
&
SPFMV 1-RSPFMV 1-F
&
SPFMV 1-R 356bp356 bp TACACACTGCTAAAACTAGGTATTCAGGAGAGCGAGTTTGATGAATGCTGTGTCTTCTTCGCGAATGGAGATGATCTATTACTGGCAATGAGGCCAGACACAGCTCATTTACTGGATAAGTTTAGTGAGTGCTTTTCAGAGTTAGGACTCAATTATGATTTTTCATCGCGAACCAGTAATAAAGAAGAGCTATGGTTTATGTCACACTGCGGAGTGAAACGTGATGGAATATTCATACCGAAGCTGGAGCCTGAGAGAATTGTTTCCATTCTTGAATGGGATCGCTCACACGAACCTATCCATCGATTGGAAGCAATATGTGCTGCGATGGTAGAATCATGGGGTTATGATGAACTTACACACTGCTAAAACTAGGTATTCAGGAGAGCGAGTTTGATGAATGCTGTGTCTTCTTCGCGAATGGAGATGATCTATTACTGGCAATGAGGCCAGACACAGCTCATTTACTGGATAAGTTTAGTGAGTGCTTTTCAGAGTTAGGACTCAATTATGATTTTTCATCGCGAACCAGTAATAAAGAAGAGCTATGGTTTATGTCACACTGCGGAGTGAAACGTGATGGAATATTCATACCGAAGCTGGAGCCTGAGAGAATTGTTTCCATTCTTGAATGGGATCGCTCACACGAACCTATCCATCGATTGGAAGCAATATGTGCTGCGATGGTAGAATCATGGGGTTATGATGAACT D86371
/ 98%D86371
/ 98% SPLCVSPLCV IYVV 1-F
&
IYVV 1-R
IYVV 1-F
&
IYVV 1-R
503bp503bp TCTGCCGTCGATCTGGAACTCACCCCAGGTGATGGTATCCCCGTCCTTGTCAACGTAGGACTTGACATCGGACGAGGATTTAGCTCCCTGGATGTTGGGGTGAAAGTGATTCGATCTGTTCGGTGAGACCAGATCGAAGAATCTGCTATTTGTGCAGACGAATTTGCCTTCGAACTGCACCAGCACATGGAGGTGAGGTTCCCCATCCTCGTGCAGTTCTCTTGCTACGTGTATGTATTTTTTGTTGGTGGGTGTTTGGATATTTAGGAGTTGGGCTAGGCAGTCCTCTTTTGAGAGAGAACAGCGTGGATAAGTAATAAAATAATTTTTGGCCTGAATTTTAAAACGTTTTGGAGGAGCCATTTGGAGACACGCATAAGTTCAAATGAATTGGAGACTGGAGACAATATATAGTATGTCTCCAAATGGCATTCTGGTAATTTAGAAGATCCTTTTAGCTTTAATTCAAATTCCGACAACTCTGGGTCCACCAAAGGCGGGCATCTGCCGTCGATCTGGAACTCACCCCAGGTGATGGTATCCCCGTCCTTGTCAACGTAGGACTTGACATCGGACGAGGATTTAGCTCCCTGGATGTTGGGGTGAAAGTGATTCGATCTGTTCGGTGAGACCAGATCGAAGAATCTGCTATTTGTGCAGACGAATTTGCCTTCGAACTGCACCAGCACATGGAGGTGAGGTTCCCCATCCTCGTGCAGTTCTCTTGCTACGTGTATGTATTTTTTGTTGGTGGGTGTTTGGATATTTAGGAGTTGGGCTAGGCAGTCCTCTTTTGAGAGAGAACAGCGTGGATAAGTAATAAAATAATTTTTGGCCTGAATTTTAAAACGTTTTGGAGGAGCCATTTGGAGACACGCATAAGTTCAAATGAATTGGAGACTGGAGACAATATATAGTATGTCTCCAAATGGCATTCTGGTAATTTAGAAGATCCTTTTAGCTTTAATTCAAATTCCGACAACTCTGGGTCCACCAAAGGCGGGCA FJ969837
/ 99%FJ969837
/ 99%

이상 살펴본 바와 같이, 본 발명은 고구마 잎말림병 바이러스(Sweet potato leaf curl virus, SPLCV), 고구마 모틀 바이러스(Sweet potato feathery mottle virus, SPFMV), 고구마 G 바이러스(Sweet potato G virus, SPGV) 및 고구마 잠재 바이러스(Sweet potato latent virus, SwPLV)의 4종 바이러스를 각각 또는 동시에 진단할 수 있는 서열번호 1 내지 8로 표시되는 프라이머 세트 및 이를 이용한 진단 방법과 진단용 키트에 관한 것으로서, 국내 고구마에 발생하는 4종 바이러스(SPLCV, SPFMV, SPGV, SwPLV)를 한번의 RT-PCR 반응으로 바이러스 각각에 대한 진단뿐만 아니라 4종 바이러스에 대한 모든 조합의 복합감염의 경우에도 특이적으로 진단이 가능하다. 이 동시진단법의 사용으로 비용과 시간을 줄이는 경제성이 있으며, 고구마 바이러스 무병주 생산 개발에 효과적이어서 산업상 이용가능성이 크다.As seen from the foregoing, the present invention is potato leaf curl disease virus (Sweet potato leaf curl virus, SPLCV), sweet potato Mottle Virus (Sweet potato feathery mottle virus, SPFMV), sweet potato G virus (Sweet potato G virus, SPGV) and sweet potato potential 1 to 8 capable of simultaneously or simultaneously diagnosing four viruses of Sweet potato latent virus (SwPLV), and a diagnostic method and a diagnostic kit using the primer set, A single RT-PCR reaction of viruses (SPLCV, SPFMV, SPGV, SwPLV) can be used to diagnose not only the virus but also any combination of all four viruses. The use of this diagnostic method is economical to reduce costs and time, and is effective in the development of sweet potato virus-free bottles.

<110> REPUBLIC OF KOREA(MANAGEMENT : RURAL DEVELOPMENT ADMINISTRATION) <120> Primer set for detecting viruses in sweet potato and method for detecting simultaneously said viruses using the same <130> NP12-0003 <160> 40 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IYVV 1-F, Forward primer for SPLCV <400> 1 tctgccgtcg atctggaact c 21 <210> 2 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IYVV 1-R, Reverse primer for SPLCV <400> 2 gtgcccgcct ttggtggac 19 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SPFMV1-F, Forward primer for SPFMV <400> 3 tacacactgc taaaactagg 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SPFMV 1-R, Reverseprimer for SPFMV <400> 4 agttcatcat aaccccatga 20 <210> 5 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SPGV 3-F, Forward primer for SPGV <400> 5 caatgccaaa tggaagaata g 21 <210> 6 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SPGV 3-R, Reverse primer for SPGV <400> 6 gcatgatcca atagaggttt ta 22 <210> 7 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SwPLV 1-F, Forward primer for SwPLV <400> 7 ggagtcagtt caatcaatgg ta 22 <210> 8 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SwPLV 1-R, Reverse primer for SwPLV <400> 8 agtggcttta ttgggtatga t 21 <210> 9 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SPFMV 2-F, Forward primer for SPFMV <400> 9 ggaccaagcc ccatacaat 19 <210> 10 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SPFMV 2-R, Reverse primer for SPFMV <400> 10 ggaatggttg cgggttgc 18 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SPFMV 3-F, Forward primer for SPFMV <400> 11 gagctaagca acccgcaacc 20 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SPFMV 3-R, Reverse primer for SPFMV <400> 12 tcatatgttg acaagagttg 20 <210> 13 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SPFMV 4-F, Forward primer for SPFMV <400> 13 tgaatggatt aatggtttgg tg 22 <210> 14 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SPFMV 4-R, Reverse primer for SPFMV <400> 14 gcatatcgcg caagactca 19 <210> 15 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SPFMV 5-F, Forward primer for SPFMV <400> 15 cgatatgcat ttgatttcta cg 22 <210> 16 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SPFMV 5-R, Reverse primer for SPFMV <400> 16 ttaaaggcat actaaagata a 21 <210> 17 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SPGV 1-F, Forward primer for SPGV <400> 17 tggcgcatca aggaaaag 18 <210> 18 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SPGV 1-R, Reverse primer for SPGV <400> 18 acctggtggt aatggtcc 18 <210> 19 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SPGV 2-F, Forward primer for SPGV <400> 19 gaaattccgc agccagagtc ac 22 <210> 20 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SPGV 2-R, Reverse primer for SPGV <400> 20 tccaaccgta ccagcattca ca 22 <210> 21 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SPGV 4-F, Forward primer for SPGV <400> 21 gcgcaatagg atcaaggcat ac 22 <210> 22 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SPGV 4-R, Reverse primer for SPGV <400> 22 acactgaagg cgaaactgaa at 22 <210> 23 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SPGV 5-F, Forward primer for SPGV <400> 23 caaatgaaag cagcagcact 20 <210> 24 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SPGV 5-R, Reverse primer for SPGV <400> 24 atcacgaacc aaaaaggctt 20 <210> 25 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SwPLV 2-F, Forward primer for SwPLV <400> 25 gggtgatgat ggacggagac a 21 <210> 26 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SwPLV 2-R, Reverse primer for SwPLV <400> 26 ccgatgatgt gtatttgtga gc 22 <210> 27 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SwPLV 3-F, Forward primer for SwPLV <400> 27 acacatcatc ggctgttcgg t 21 <210> 28 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SwPLV 3-R, Reverse primer for SwPLV <400> 28 gtgtgtggta taagacaaaa a 21 <210> 29 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SwPLV-u1, Forward primer for SwPLV <400> 29 tggaaaagtg gaaacgaaga agaa 24 <210> 30 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SwPLV-d1, Reverse primer for SwPLV <400> 30 gaaatgttgg tgctgcgaaa tc 22 <210> 31 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SPLCV 2-F, Forward primer for SPLCV <400> 31 tgtgagggcc caaagacc 18 <210> 32 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SPLCV 2-R, Reverse primer for SPLCV <400> 32 tcgataagga cggggatacc 20 <210> 33 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SPLCV 3-F, Forward primer for SPLCV <400> 33 tcccctgtgc gtgaatcc 18 <210> 34 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SPLCV 3-R, Reverse primer for SPLCV <400> 34 aacagtatgg gccaggtctt t 21 <210> 35 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SPLCV 5-F, Forward primer for SPLCV <400> 35 atgggtatag atgggaaggt 20 <210> 36 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SPLCV 5-R, Reverse primer for SPLCV <400> 36 tgcgaatcat agaaataagc 20 <210> 37 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SPLCV 6-F, Forward primer for SPLCV <400> 37 ggaccctttg cagaacccac tac 23 <210> 38 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SPLCV 6-R, Reverse primer for SPLCV <400> 38 tctgtcacga atcaaccaat ac 22 <210> 39 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IYVV 4-F, Forward primer for SPLCV <400> 39 ttaaggcgtt gcaaaatacc agt 23 <210> 40 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IYVV 4-R, Reverse primer for SPLCV <400> 40 tagataaacc agagcaagga gca 23 <110> REPUBLIC OF KOREA (MANAGEMENT: RURAL DEVELOPMENT ADMINISTRATION) <120> Primer set for detecting viruses in sweet potato and method for          Detecting said viruses using the same <130> NP12-0003 <160> 40 <170> Kopatentin 2.0 <210> 1 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IYVV 1-F, Forward primer for SPLCV <400> 1 tctgccgtcg atctggaact c 21 <210> 2 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IYVV 1-R, reverse primer for SPLCV <400> 2 gtgcccgcct ttggtggac 19 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SPFMV1-F, Forward primer for SPFMV <400> 3 tacacactgc taaaactagg 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SPFMV 1-R, Reverseprimer for SPFMV <400> 4 agttcatcat aaccccatga 20 <210> 5 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SPGV 3-F, Forward primer for SPGV <400> 5 caatgccaaa tggaagaata g 21 <210> 6 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SPGV 3-R, Reverse primer for SPGV <400> 6 gcatgatcca atagaggttt ta 22 <210> 7 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SwPLV 1-F, Forward primer for SwPLV <400> 7 ggagtcagtt caatcaatgg ta 22 <210> 8 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SwPLV 1-R, Reverse primer for SwPLV <400> 8 agtggcttta ttgggtatga t 21 <210> 9 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SPFMV 2-F, Forward primer for SPFMV <400> 9 ggaccaagcc ccatacaat 19 <210> 10 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SPFMV 2-R, Reverse primer for SPFMV <400> 10 ggaatggttg cgggttgc 18 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SPFMV 3-F, Forward primer for SPFMV <400> 11 gagctaagca acccgcaacc 20 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SPFMV 3-R, Reverse primer for SPFMV <400> 12 tcatatgttg acaagagttg 20 <210> 13 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SPFMV 4-F, Forward primer for SPFMV <400> 13 tgaatggatt aatggtttgg tg 22 <210> 14 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SPFMV 4-R, Reverse primer for SPFMV <400> 14 gcatatcgcg caagactca 19 <210> 15 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SPFMV 5-F, Forward primer for SPFMV <400> 15 cgatatgcat ttgatttcta cg 22 <210> 16 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SPFMV 5-R, Reverse primer for SPFMV <400> 16 ttaaaggcat actaaagata a 21 <210> 17 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SPGV 1-F, Forward primer for SPGV <400> 17 tggcgcatca aggaaaag 18 <210> 18 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SPGV 1-R, Reverse primer for SPGV <400> 18 acctggtggt aatggtcc 18 <210> 19 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SPGV 2-F, Forward primer for SPGV <400> 19 gaaattccgc agccagagtc ac 22 <210> 20 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SPGV 2-R, Reverse primer for SPGV <400> 20 tccaaccgta ccagcattca ca 22 <210> 21 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SPGV 4-F, Forward primer for SPGV <400> 21 gcgcaatagg atcaaggcat ac 22 <210> 22 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SPGV 4-R, Reverse primer for SPGV <400> 22 acactgaagg cgaaactgaa at 22 <210> 23 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SPGV 5-F, Forward primer for SPGV <400> 23 caaatgaaag cagcagcact 20 <210> 24 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SPGV 5-R, Reverse primer for SPGV <400> 24 atcacgaacc aaaaaggctt 20 <210> 25 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SwPLV 2-F, Forward primer for SwPLV <400> 25 gggtgatgat ggacggagac a 21 <210> 26 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SwPLV 2-R, Reverse primer for SwPLV <400> 26 ccgatgatgt gtatttgtga gc 22 <210> 27 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SwPLV 3-F, Forward primer for SwPLV <400> 27 acacatcatc ggctgttcgg t 21 <210> 28 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SwPLV 3-R, Reverse primer for SwPLV <400> 28 gtgtgtggta taagacaaaa a 21 <210> 29 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SwPLV-u1, Forward primer for SwPLV <400> 29 tggaaaagtg gaaacgaaga agaa 24 <210> 30 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SwPLV-d1, Reverse primer for SwPLV <400> 30 gaaatgttgg tgctgcgaaa tc 22 <210> 31 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SPLCV 2-F, Forward primer for SPLCV <400> 31 tgtgagggcc caaagacc 18 <210> 32 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SPLCV 2-R, Reverse primer for SPLCV <400> 32 tcgataagga cggggatacc 20 <210> 33 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SPLCV 3-F, Forward primer for SPLCV <400> 33 tcccctgtgc gtgaatcc 18 <210> 34 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SPLCV 3-R, Reverse primer for SPLCV <400> 34 aacagtatgg gccaggtctt t 21 <210> 35 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> &Lt; 223 > SPLCV 5-F, Forward primer for SPLCV <400> 35 atgggtatag atgggaaggt 20 <210> 36 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SPLCV 5-R, Reverse primer for SPLCV <400> 36 tgcgaatcat agaaataagc 20 <210> 37 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> &Lt; 223 > SPLCV 6-F, Forward primer for SPLCV <400> 37 ggaccctttg cagaacccac tac 23 <210> 38 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SPLCV 6-R, reverse primer for SPLCV <400> 38 tctgtcacga atcaaccaat ac 22 <210> 39 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IYVV 4-F, Forward primer for SPLCV <400> 39 ttaaggcgtt gcaaaatacc agt 23 <210> 40 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IYVV 4-R, Reverse primer for SPLCV <400> 40 tagataaacc agagcaagga gca 23

Claims (5)

서열번호 1 및 2의 염기서열로 표시되는 프라이머 쌍, 서열번호 3 및 4의 염기서열로 표시되는 프라이머 쌍, 서열번호 5 및 6의 염기서열로 표시되는 프라이머 쌍, 서열번호 7 및 8의 염기서열로 표시되는 프라이머 쌍으로 이루어진 군에서 선택되는 고구마 잎말림병 바이러스(Sweet potato leaf curl virus, SPLCV), 고구마 모틀 바이러스(Sweet potato feathery mottle virus, SPFMV), 고구마 G 바이러스(Sweet potato G virus, SPGV) 및 고구마 잠재 바이러스(Sweet potato latent virus, SwPLV) 로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 바이러스 진단용 프라이머 쌍.Primer pair represented by nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 1 and 2, primer pair represented by nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 3 and 4, primer pair represented by nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 5 and 6, and nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 7 and 8 Sweet potato leaf curl virus (SPLCV), sweet potato feathery mottle virus (SPFMV), sweet potato G virus ( Sweet potato G virus , SPGV) selected from the group consisting of primer pairs And sweet potato latent virus (SwPLV) at least one virus diagnostic primer pair selected from the group consisting of. 제1항의 프라이머 쌍을 포함하는 고구마 잎말림병 바이러스(SPLCV), 고구마 모틀 바이러스(SPFMV), 고구마 G 바이러스(SPGV) 및 고구마 잠재 바이러스(SwPLV) 로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 바이러스 진단용 키트.At least one virus diagnostic kit selected from the group consisting of sweet potato leaf blight virus (SPLCV), sweet potato mottle virus (SPFMV), sweet potato G virus (SPGV) and sweet potato latent virus (SwPLV) comprising a primer pair of claim 1. (a) 시료의 RNA를 분리하는 단계;
(b) 상기 (a)단계의 RNA를 제1항의 프라이머 쌍을 이용하여 RT-PCR을 수행하는 단계; 및
(c) 상기 (b)단계의 RT-PCR 산물을 크기별로 분리하여 분석하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 고구마 잎말림병 바이러스(SPLCV), 고구마 모틀 바이러스(SPFMV), 고구마 G 바이러스(SPGV) 및 고구마 잠재 바이러스(SwPLV) 로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 바이러스 진단 방법.(a) isolating RNA of the sample;
(b) performing RT-PCR on the RNA of step (a) using the primer pair of claim 1; And
(c) sweet potato leaf disease (SPLCV), sweet potato mottle virus (SPFMV), sweet potato G virus (SPGV) comprising the step of separating and analyzing the RT-PCR product of step (b) by size And sweet potato latent virus (SwPLV). 서열번호 1 내지 8의 염기서열로 표시되는 프라이머를 포함하는 고구마 잎말림병 바이러스(SPLCV), 고구마 모틀 바이러스(SPFMV), 고구마 G 바이러스(SPGV) 및 고구마 잠재 바이러스(SwPLV) 동시 진단용 조성물.Sweet potato leaf blight virus (SPLCV), potato sweet potato virus (SPFMV), sweet potato G virus (SPGV) and sweet potato latent virus (SwPLV) at the same time comprising a primer represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NOS: 1-8. 제4항의 조성물을 포함하는 키트.Kit comprising the composition of claim 4.
KR1020120033948A 2012-04-02 2012-04-02 Primer set for detecting viruses in sweet potato and method for detecting simultaneously said viruses using the same KR101459616B1 (en)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020120033948A KR101459616B1 (en) 2012-04-02 2012-04-02 Primer set for detecting viruses in sweet potato and method for detecting simultaneously said viruses using the same

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020120033948A KR101459616B1 (en) 2012-04-02 2012-04-02 Primer set for detecting viruses in sweet potato and method for detecting simultaneously said viruses using the same

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20130111788A true KR20130111788A (en) 2013-10-11
KR101459616B1 KR101459616B1 (en) 2014-11-13

Family

ID=49633022

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020120033948A KR101459616B1 (en) 2012-04-02 2012-04-02 Primer set for detecting viruses in sweet potato and method for detecting simultaneously said viruses using the same

Country Status (1)

Country Link
KR (1) KR101459616B1 (en)

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107475460A (en) * 2017-10-10 2017-12-15 福建省农业科学院作物研究所 The LAMP detection primer group and its visible detection method of a kind of sweet potato curve leaf disease virus
CN111534638A (en) * 2020-04-30 2020-08-14 河南科技学院 Primer, kit, detection method and application for rapidly detecting SPLCV
KR102240776B1 (en) * 2019-12-06 2021-04-15 서울대학교산학협력단 Primer sets for diagnosing of new and variant sweet potato viruses and diagnostic methods using thereof

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108504776A (en) * 2018-04-04 2018-09-07 贾云云 The detection kit and its detection method of Georgia curve leaf disease virus in a kind of sweet potato

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107475460A (en) * 2017-10-10 2017-12-15 福建省农业科学院作物研究所 The LAMP detection primer group and its visible detection method of a kind of sweet potato curve leaf disease virus
KR102240776B1 (en) * 2019-12-06 2021-04-15 서울대학교산학협력단 Primer sets for diagnosing of new and variant sweet potato viruses and diagnostic methods using thereof
CN111534638A (en) * 2020-04-30 2020-08-14 河南科技学院 Primer, kit, detection method and application for rapidly detecting SPLCV
CN111534638B (en) * 2020-04-30 2023-02-24 河南科技学院 Primer, kit, detection method and application for rapidly detecting SPLCV

Also Published As

Publication number Publication date
KR101459616B1 (en) 2014-11-13

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Osman et al. Real-time RT-PCR (TaqMan®) assays for the detection of Grapevine Leafroll associated viruses 1–5 and 9
KR101642771B1 (en) Primer set for multiple detection lily viruses and method for detecting said viruses using the same
Liu et al. Rapid detection of tobacco mosaic virus using the reverse transcription loop-mediated isothermal amplification method
KR101985654B1 (en) Primer set for multiple detection 4 kinds of virus infecting Passiflora edulis and method for detecting said viruses using the same
Hadidi et al. Polymerase chain reaction
WO2008077330A1 (en) Taqman mgb probe for detecting maternal inherited mitochondrial genetic deafness c1494t mutation and its usage
KR101459616B1 (en) Primer set for detecting viruses in sweet potato and method for detecting simultaneously said viruses using the same
US20080090224A1 (en) Nucleic acid detection
KR101546758B1 (en) Primer set for multiple detection tomato viruses that transmitted by whiteflies, and method for detecting said viruses using the same
Rolland et al. A multiple single nucleotide polymorphisms interrogation assay for reliable Potato virus Y group and variant characterization
CN101560515B (en) Specific gene sequence of tilletia controversa kuhn, specific SCAR marker and PCR detection method
JP5315519B2 (en) Koi herpesvirus (KHV) detection method
Ryazantsev et al. An efficient diagnostic method for the identification of potato viral pathogens
KR100625019B1 (en) DETECTING PRIMER SETS FOR TuMV RMV AND CMV INFECTING CRUCIFERAE
KR101557045B1 (en) Primer set for multiple detection SPV2, SPVC, SPSMV-1, and SPCFV and method for detecting said viruses using the same
KR101750837B1 (en) Primer set for multiple detection MNSV, SqMV, WMV, and CABYV and method for detecting said viruses using the same
KR102076343B1 (en) Composition for detecting adenovirus type 55 using Real-time LAMP and uses thereof
KR102147340B1 (en) A composition for detecting Ganoderma microorganism and diagnosing basal stem rot and a method using the same
KR102137500B1 (en) Primer set for Multiplex RT-PCR of Proso millet or Foxtail millet Viruses and use thereof
KR20130080968A (en) Pcr primers for detecting viruses occurring on cucurbitaceae and method for detceting cucurbitaceae viruses
KR20130080969A (en) Pcr primers for detecting viruses occurring on solanaceae and method for detceting solanaceae viruses
KR102147351B1 (en) A composition for detecting Ganoderma microorganism and diagnosing basal stem rot and a method using the same
KR102068306B1 (en) Primers set for diagnosing or detecting Setaria yellow dwarf virus
KR102629167B1 (en) Primer sets for diagnosing five fungi infecting Capsicum annuum and diagnostic methods using thereof
KR102150933B1 (en) Complete marker linked to the pepper ChiVMV-resistant Cvr1 gene and uses thereof

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
E902 Notification of reason for refusal
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant