KR20130080969A - Pcr primers for detecting viruses occurring on solanaceae and method for detceting solanaceae viruses - Google Patents

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Abstract

PURPOSE: PCR primers for detecting solanaceae viruses is provided to accurately and quickly detect 8 kind virus which causes disease on Solanaceae by performing one polymerase chain reaction (PCR), thereby conveniently detecting infection by the virus. CONSTITUTION: A primer set for detecting 8 kind virus generated in solanaceae comprises; a primer pair represented by sequence number 1 and 2; a primer pair represented by sequence number 3 and 4; a primer pair represented by sequence number 5 and 6; a primer pair represented by sequence number 7 and 8; a primer pair represented by sequence number 9 and 10; a primer pair represented by sequence number 11 and 12; a primer pair represented by sequence number 13 and 14, which are combination of primers capable of concurrently detecting 8 kind virus of PLRV (Potato Leafroll Virus), PVS (Potato Virus S), PVX (Potato Virus X), PVY (Potato Virus Y), TMV (Tobacco Mosaic Virus)-U1, TMV (Tobacco Mosaic Virus)-KOR, TRV (Tobacco Rattle Virus) and PMTV (Potato Mop-Top Virus). The method of concurrently detecting 8 kind virus of PLRV, PVS, PVX, PVY, TMV-U1, TMV-KOR, TRV and PMTV generated in solanaceae includes a step of performing PCR by using the primer set.

Description

가지과 작물 바이러스 검출용 프라이머 및 이를 이용한 가지과 작물 바이러스 검출 방법{PCR Primers For Detecting Viruses Occurring on Solanaceae and Method for Detceting Solanaceae Viruses}Primer for eggplant virus detection and method for detecting eggplant virus using same {PCR Primers For Detecting Viruses Occurring on Solanaceae and Method for Detceting Solanaceae Viruses}

본 발명은 가지과 작물에 병을 일으키는 주요 바이러스, 즉 TMV-U1, TMV-KOR, PLRV, PVX, PMTV, TRV, PVS 및 PVY의 8종 바이러스를 특이적으로 검출할 수 있는 PCR용 프라이머 세트 및 이를 이용한 가지과 작물의 바이러스 감염 여부를 검출하는 방법에 관한 것이다.The present invention provides a primer set for PCR capable of specifically detecting 8 kinds of viruses that cause diseases in eggplant crops, namely TMV-U1, TMV-KOR, PLRV, PVX, PMTV, TRV, PVS and PVY. The present invention relates to a method for detecting viral infection of used eggplant and crops.

식물 바이러스 병은 감염 작물의 수량 및 품질을 급격히 감소시키므로 생산량 감소 등 경제적으로 큰 손실을 가져온다. 최근에도 민간업체에서 보급한 종서에서 걀쭉바이러스의 감염 사실이 뒤늦게 발견되어 종서 수거 및 감염 우려 지역에 5년간의 재배를 제한하는 등 큰 문제를 야기한 바 있다. 그럼에도 우리나라의 한해 수출입 물품의 검역이 3,500 ~ 4,200천 건에 이르고 있고, 또한 바이러스 병은 기주범위가 매우 넓고 접촉, 매개 또는 감염된 종서의 사용 등의 다양한 경로를 통해서 2차 감염이 가능하며, 효과적인 방제법이나 약제가 거의 없기 때문에 진단이나 방제가 어려운 실정이다. 따라서 식물 바이러스 병에 대한 조기진단 및 오염원 제거 시스템을 갖추는 것이 가장 효율적인 방제법이며 그 중요성이 점점 높아지고 있다.Plant viral diseases dramatically reduce the yield and quality of infected crops, resulting in economic losses such as reduced production. In recent years, the late-season infection of eggs has been discovered lately by private companies, which has caused major problems, such as limiting the five-year cultivation in areas where the seed collection and infection are concerned. Nevertheless, the quarantine of Korea's import and export goods ranges from 3,500 to 4,200 thousand a year, and the viral disease has a very wide host range, and is capable of secondary infection through various routes such as contact, mediation or the use of infected species. Since there are few drugs, it is difficult to diagnose or control them. Therefore, having early diagnosis and contaminant removal system for plant virus disease is the most effective control method, and its importance is increasing.

국내의 경우 식물에 감염을 유발하는 바이러스의 분리 및 동정에 대한 연구는 대부분 식물바이러스 유전자 은행(www.virusbank.org)과 고령지 농업시험장을 중심으로 1960년대 이후로 이루어지고 있다. 바이러스 병에 의한 대표적인 피해사례로는 PLAV에 의한 잎말림병, PVX와 PVY에 의한 모자이크병(mild mosaic 과 rugose mosaic 증상)에 의한 피해 등이 있었다. 그리고 1977년에는 걀쭉바이로이드(potato spindle tuber viroid, PSTVd)가 발생하여 종자를 전량 폐기 후 일본에서 수입한 사례도 있었다. 이러한 바이러스에 의한 피해는 바이러스의 종류에 따라 약 20~50%의 생산량 감소를 초래 하였다. 이와 같이 바이러스에 감염되면 생산체계의 이상을 복구하는데 최소 5년의 기간이 소모되므로 바이러스의 조기 진단시스템 구축이 우량종서 생산 및 종자 산업에 절실하다. In Korea, studies on the isolation and identification of viruses that cause plant infections have been conducted since the 1960s, mainly on plant virus gene banks (www.virusbank.org) and old agricultural test sites. Representative damages caused by viral diseases include leaf curling disease by PLAV and mosaic disease (mild mosaic and rugose mosaic) by PVX and PVY. And in 1977, there was a case of potato spindle tuber viroid (PSTVd), which was discarded entirely and imported from Japan. The damage caused by these viruses resulted in about 20-50% reduction in production, depending on the type of virus. As a result of the virus infection, at least five years are required to repair the abnormality of the production system. Therefore, the early diagnosis system of the virus is urgently needed for the production of good seed and the seed industry.

한편, 일반적으로 바이러스에 의하여 발생하는 식물병에 직접 작용하는 약제방제법은 현재까지 개발되어 있지 않은 실정이기 때문에, 바이러스에 의한 식물병을 관리하기 위해서는 먼저 식물체에 바이러스가 발생하였는지 여부와, 어떠한 바이러스가 발생하였는지 여부를 정밀하고 신속하게 진단하여야 한다. 그러나 바이러스는 크기가 1㎛ 보다 작은 병원체로 광학현미경으로도 그 실체를 관찰할 수 없고, 전자현미경을 필요로 하기 때문에, 육안으로 식물체에 발생한 바이러스를 진단하는 것은 곤란하다. 이에 따라 바이러스를 진단하기 위한 다양한 방법들이 개발되어 사용되고 있다. On the other hand, in general, pharmaceutical control methods that directly affect plant diseases caused by viruses have not been developed so far. Therefore, in order to manage plant diseases caused by viruses, whether a virus has occurred in a plant or not, It should be diagnosed precisely and quickly whether it occurred. However, since the virus is a pathogen smaller than 1 µm in size, the reality cannot be observed even under an optical microscope, and an electron microscope is required. Therefore, it is difficult to diagnose the virus occurring in the plant with the naked eye. Accordingly, various methods for diagnosing viruses have been developed and used.

지금까지 바이러스를 진단하기 위하여 ELISA와 같은 혈청학적 진단법이 많이 사용되어왔다. 그러나 혈청학적 진단법은 많은 시료를 일반적인 정밀도에서 진단하는데 사용하는 경우에는 큰 무리가 없었으나, 진단대상 바이러스와 혈청학적 유연관계가 있는 바이러스가 존재할 경우에는 식물체에 발생한 바이러스를 잘못 동정하게 된다거나, 바이러스에 감염된 식물체의 종류에 따라 기주유래 물질이 달라지면서, 이 물질과 비특이적 반응으로 인하여 바이러스를 잘못 진단하게되는 문제가 발생하였다. 또한 2종 이상의 바이러스가 복합 감염된 경우에 이를 진단하기 위해서는 다른 종류의 항체를 사용해서 여러 번 진단해야 한다는 문제점이 있었다. So far, serological diagnostic methods such as ELISA have been used to diagnose viruses. However, the serological diagnostic method was not overwhelming when a large number of samples were used to diagnose at a general precision, but when a virus having a serologically flexible relationship with the virus to be diagnosed existed, a virus generated in a plant was misidentified or a virus was detected. As the host-derived substance is changed according to the type of plant infected with the virus, a nonspecific reaction with the substance causes a problem of incorrectly diagnosing the virus. In addition, when two or more viruses are combined, there is a problem in that multiple diagnosis using different kinds of antibodies is required to diagnose them.

최근에는 식물체에 발생하는 바이러스를 정밀진단하기 위하여 역전사-중합효소연쇄반응(RT-PCR)법이 사용되고 있다. RT-PCR법에서는 사용하는 프라이머가 진단의 특이성과 정밀도를 결정짓는데, RT-PCR법에서 사용하는 프라이머는 일반적으로 바이러스의 유전자 클로닝을 목적으로 설계되기 때문에 종특이적이지 못하다는 문제가 있었다. 따라서 식물 원인 바이러스에 대한 종 특이적인 검출 프라이머가 개발된다면 식물 바이러스의 감염 여부를 매우 간편하고 신속하게 검출할 수 있을 것이다.Recently, reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR) has been used to precisely diagnose viruses occurring in plants. In the RT-PCR method, the primer used determines the specificity and precision of the diagnosis. The primer used in the RT-PCR method is generally not designed to be species specific because it is designed for gene cloning of the virus. Therefore, if species-specific detection primers for plant-causing viruses are developed, it will be possible to detect whether plant viruses are infected very easily and quickly.

한편, 가지과에는 고추속 작물(예를 들면, 파프리카, 고추), 감자, 담배, 토마토, 피튜니아가 있는데, 이러한 가지과 작물은 중요 경제작물들이 많이 포함되어 있고, 음식, 향신료, 의약품의 중요한 요소로 사용되고 있다. 그러나 이러한 가지과 작물 역시 식물 바이러스에 의해 작물 생산성 등에 치명적인 타격이 종종 발생하고 있는데, 특히 감자 바이러스병은 17세기 유럽에서 처음으로 발생이 보고된 이후 현재까지 감자의 수확량 감소 및 품종퇴화를 유발하는 중요한 병으로 인식되고 있으며, 곰팡이에 의한 병 다음으로 경제적 문제를 유발하는 것으로 알려져 있다. On the other hand, the eggplant family includes pepper crops (for example, paprika, peppers), potatoes, tobacco, tomatoes, and petunias, which contain many important economic crops and are used as important elements of food, spices, and medicines. have. However, these eggplant crops are also often hit by plant viruses, which can cause fatal impacts on crop productivity. Especially, potato virus disease is an important disease that causes potato yield reduction and varietal degeneration until the first occurrence in Europe in the 17th century. It is known to cause economic problems after mold-induced disease.

이와 같이 바이러스에 의해 가지과 작물이 감염되면 경제적 및 산업적으로 손실티 크기 때문에 이를 조기 진단할 수 있는 방법의 개발이 필요한 실정인데, 현재까지 개발된 기술로는 대한민국 등록특허 제0781066호에 가지과 작물 세균성 풋마름병의 기주특이성에 관여하는 ｒｓａ1 유전자의 내용이 개시되어 있고 이러한 유전자를 이용하여 풋마름병을 치료할 수 있는 방법이 개시되어 있을 뿐, 식물 바이러스에 의해 가지과 작물이 감염되었는지를 조기에 진단할 수 있는 프라이머의 개발에 대해서는 아직까지 연구가 미비한 실정이다. As such, when the eggplant crops are infected by the virus, the development of a method for early diagnosis is necessary because of the economic and industrial loss loss. However, the technology developed so far is that the eggplant crop bacterial foot is disclosed in Korean Patent Registration No. 0781066. The contents of the rsA1 gene, which is involved in the host specificity of blight disease, are disclosed, and methods for treating foot blight are disclosed using these genes, and primers for early diagnosis of eggplant crops caused by plant viruses. The research on the development of is still insufficient.

따라서 본 발명의 목적은 8종의 가지과 작물 바이러스를 각 종별 특이적으로 한 번의 PCR 방법으로 검출할 수 있는 프라이머 세트를 제공하는 것이다.Accordingly, an object of the present invention is to provide a primer set capable of detecting eight kinds of branched and crop viruses by one PCR method for each species.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 프라이머 세트를 이용하여 가지과 작물의 바이러스병 감염 여부를 진단할 수 있는 방법을 제공하는 것이다.Still another object of the present invention is to provide a method for diagnosing viral infection of eggplant crops using the primer set.

또한, 본 발명의 다른 목적은 상기 프라이머 세트를 포함하는 가지과 작물의 바이러스병 진단용 키트를 제공하는 것이다.In addition, another object of the present invention to provide a kit for diagnosing viral diseases of eggplant crops comprising the primer set.

상기한 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 PLRV(potato leafroll virus), PVS(potato virus S), PVX(potato virus X), PVY(potato virus Y), TMV(tobacco mosaic virus)-U1, TMV(tobacco mosaic virus)-KOR, TRV(tobacco rattle virus) 및 PMTV(potato mop-top virus)의 8종 바이러스를 동시에 진단할 수 있는 프라이머 조합으로서, 서열번호 1 및 2로 이루어진 프라이머 쌍; 서열번호 3 및 4로 이루어진 프라이머 쌍; 서열번호 5 및 6으로 이루어진 프라이머 쌍; 서열번호 7 및 8로 이루어진 프라이머 쌍; 서열번호 9 및 10으로 이루어진 프라이머 쌍; 서열번호 11 및 12로 이루어진 프라이머 쌍; 및 서열번호 13 및 14로 이루어진 프라이머 쌍을 포함하는 가지과 작물에 발생하는 8종 바이러스 검출용 프라이머 세트를 제공한다. In order to achieve the above object, the present invention is a PLRV (potato leafroll virus), PVS (potato virus S), PVX (potato virus X), PVY (potato virus Y), TMV (tobacco mosaic virus) -U1, TMV ( A primer combination capable of simultaneously diagnosing eight viruses of tobacco mosaic virus (KOR), tobacco rattle virus (TRV), and potato mop-top virus (PMTV), comprising: a primer pair consisting of SEQ ID NOs: 1 and 2; Primer pairs consisting of SEQ ID NOs: 3 and 4; Primer pairs consisting of SEQ ID NOs: 5 and 6; Primer pairs consisting of SEQ ID NOs: 7 and 8; Primer pairs consisting of SEQ ID NOs: 9 and 10; Primer pairs consisting of SEQ ID NOs: 11 and 12; And it provides a set of primers for detecting 8 kinds of viruses occurring in the branch and crop comprising a primer pair consisting of SEQ ID NO: 13 and 14.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 서열번호 1 및 2의 프라이머 쌍은 PLRV(potato leafroll virus)를 특이적으로 검출하고, 상기 서열번호 3 및 4의 프라이머 쌍은 PVS(potato virus S)를 특이적으로 검출하고, 상기 서열번호 5 및 6의 프라이머 쌍은 PVX(potato virus X)를 특이적으로 검출하고, 상기 서열번호 7 및 8의 프라이머 쌍은 PVY(potato virus Y)를 특이적으로 검출하고, 상기 서열번호 9 및 10의 프라이머 쌍은 TMV(tobacco mosaic virus)-U1과 TMV(tobacco mosaic virus)-KOR을 특이적으로 검출하고, 상기 서열번호 11 및 12의 프라이머 쌍은 TRV(tobacco rattle virus)를 특이적으로 검출하고, 상기 서열번호 13 및 14의 프라이머 쌍은 PMTV(potato mop-top virus)를 특이적으로 검출할 수 있다. In one embodiment of the present invention, the primer pair of SEQ ID NO: 1 and 2 specifically detects PLRV (potato leafroll virus), the primer pair of SEQ ID NO: 3 and 4 is specific for PVS (potato virus S) Specifically, the primer pairs of SEQ ID NOs: 5 and 6 specifically detect potato virus X (PVX), and the primer pairs of SEQ ID NOs: 7 and 8 specifically detect potato virus Y (PVY) The primer pairs of SEQ ID NOs: 9 and 10 specifically detect tobacco mosaic virus (TMV) -U1 and tobacco mosaic virus (TMV) -KOR, and the primer pairs of SEQ ID NOs: 11 and 12 are TRV (tobacco rattle virus) ) And the primer pairs of SEQ ID NOs: 13 and 14 can specifically detect PMTV (potato mop-top virus).

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 가지과 작물은 파프리카, 고추, 감자, 담배, 토마토 또는 피튜니아일 수 있다. In one embodiment of the present invention, the eggplant crop may be paprika, pepper, potato, tobacco, tomato or petunia.

또한, 본 발명은 상기 본 발명에 따른 프라이머 세트를 포함하는 가지과 작물에 발생하는 8종 바이러스 검출용 키트를 제공한다.The present invention also provides a kit for detecting 8 kinds of viruses occurring in eggplants and crops comprising the primer set according to the present invention.

또한, 본 발명은 본 발명에 따른 상기 프라이머 세트를 이용하여 PCR을 수행하는 단계를 포함하는, 가지과 작물에 발생하는 8종 바이러스인 PLRV(potato leafroll virus), PVS(potato virus S), PVX(potato virus X), PVY(potato virus Y), TMV(tobacco mosaic virus)-U1, TMV(tobacco mosaic virus)-KOR, TRV(tobacco rattle virus) 및 PMTV(potato mop-top virus)를 동시에 검출하는 방법을 제공한다.In addition, the present invention includes the step of performing PCR using the primer set according to the present invention, 8 kinds of viruses that occur in eggplant crops PLRV (potato leafroll virus), PVS (potato virus S), PVX (potato) virus X), potato virus Y (PVY), tobacco mosaic virus (TMV) -U1, tobacco mosaic virus (TMV) -KOR, tobacco rattle virus (TRV), and potato mop-top virus (PMTV) to provide.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 PCR은 미지의 바이러스 게놈을 주형으로 하여, 94℃에서 3~5분간 변성반응 시킨 후, 94℃에서 30초~50초, 55℃에서 30초~50초 및 72℃에서 45초~50초를 한 사이클로 하여 30회~35회 사이클을 반복 실시한 다음, 72℃에서 7분간 연장 반응을 수행하는 한번의 PCR 반응으로 가지과 작물에 발생하는 8종 바이러스인 PLRV(potato leafroll virus), PVS(potato virus S), PVX(potato virus X), PVY(potato virus Y), TMV(tobacco mosaic virus)-U1, TMV(tobacco mosaic virus)-KOR, TRV(tobacco rattle virus) 및 PMTV(potato mop-top virus)를 동시에 검출할 수 있다. In one embodiment of the present invention, the PCR is a denaturation reaction of the unknown viral genome as a template, 3 to 5 minutes at 94 ℃, 30 seconds to 50 seconds at 94 ℃, 30 seconds to 50 seconds at 55 ℃ And PLRV (8 types of viruses that occur in eggplant crops in one PCR reaction, repeating 30 to 35 cycles with one cycle of 45 seconds to 50 seconds at 72 ° C. and then extending the reaction for 7 minutes at 72 ° C. ( potato leafroll virus (PVS), potato virus S (PVS), potato virus X (PVX), potato virus Y (PVY), tobacco mosaic virus (TMV) -U1, tobacco mosaic virus (TMV) -KOR, tobacco rattle virus (TRV) And PMTV (potato mop-top virus) can be detected simultaneously.

본 발명의 프라이머 세트는 한 번의 PCR 반응을 수행하여 가지과 작물에 병을 일으키는 주요 바이러스인 TMV-U1, TMV-KOR, PLRV, PVX, PMTV, TRV, PVS 및 PVY의 8종 바이러스를 특이적으로 신속하고 정확하게 검출할 수 있어, 가지과 작물의 바이러스에 의한 감염 여부를 쉽게 진단할 수 있는 효과가 있다.The primer set of the present invention performs a single PCR reaction to quickly and rapidly target eight viruses of TMV-U1, TMV-KOR, PLRV, PVX, PMTV, TRV, PVS, and PVY, which are the main viruses causing disease in eggplant crops. And it can be detected accurately, there is an effect that can easily diagnose the infection by the virus of eggplant crops.

도 1은 PVX 특이적인 마커를 사용하여 PCR을 수행한 결과를 나타낸 것이고(위), 또한 Blastn 결과(아래)를 나타낸 것이다.
도 2는 PLRV 특이적인 마커를 사용하여 PCR을 수행한 결과를 나타낸 것이고(위), 또한 Blastn 결과(아래)를 나타낸 것이다.
도 3은 PVS 특이적인 마커를 사용하여 PCR을 수행한 결과를 나타낸 것이고(위), 또한 Blastn 결과(아래)를 나타낸 것이다.
도 4는 PMTV 특이적인 마커를 사용하여 PCR을 수행한 결과를 나타낸 것이고(위), 또한 Blastn 결과(아래)를 나타낸 것이다.
도 5는 TRV-M 특이적인 마커를 사용하여 PCR을 수행한 결과를 나타낸 것이고(위), 또한 Blastn 결과(아래)를 나타낸 것이다.
도 6은 PVY-VN 특이적인 마커를 사용하여 PCR을 수행한 결과를 나타낸 것이고(위), 또한 Blastn 결과(아래)를 나타낸 것이다.
도 7은 TMV-U1, TMV-KOR 특이적인 마커를 사용하여 PCR을 수행한 결과를 나타낸 것이고(위), 또한 Blastn 결과(아래)를 나타낸 것이다.
도 8은 가지과 8종에 대한 multiplex PCR 분석결과를 나타낸 것이다.
도 9는 가지과 8종 프라이머에 대한 고추 작물에서의 바이러스 감염 여부 진단결과를 나타낸 것이다.FIG. 1 shows the results of PCR using PVX specific markers (top) and also shows the Blastn results (bottom).
FIG. 2 shows the results of PCR using PLRV specific markers (top) and also shows the Blastn results (bottom).
Figure 3 shows the results of PCR using PVS specific markers (top) and also shows the Blastn results (bottom).
Figure 4 shows the results of PCR using PMTV specific markers (top) and also shows the Blastn results (bottom).
FIG. 5 shows the results of PCR using TRV-M specific markers (top) and also shows Blastn results (bottom).
Figure 6 shows the results of PCR using PVY-VN specific markers (top) and also shows the Blastn results (bottom).
Figure 7 shows the results of PCR using TMV-U1, TMV-KOR specific markers (top), and also shows the Blastn results (bottom).
Figure 8 shows the results of multiplex PCR analysis for 8 kinds of branches.
Figure 9 shows the results of the virus infection in pepper crops for eggplant and eight kinds of primers.

본 발명은 가지과 작물에 병을 일으키는 여러 종의 바이러스를 특이적으로 한 번에 검출할 수 있는 PCR용 프라이머 세트에 관한 것으로서, 보다 구체적으로 가지과 작물 감염원인의 주요 바이러스인 PLRV(potato leafroll virus), PVS(potato virus S), PVX(potato virus X), PVY(potato virus Y), TMV(tobacco mosaic virus)-U1, TMV(tobacco mosaic virus)-KOR, TRV(tobacco rattle virus) 및 PMTV(potato mop-top virus)의 8종 바이러스를 동시에 진단할 수 있는 프라이머 조합으로서, 서열번호 1 및 2로 이루어진 프라이머 쌍; 서열번호 3 및 4로 이루어진 프라이머 쌍; 서열번호 5 및 6으로 이루어진 프라이머 쌍; 서열번호 7 및 8로 이루어진 프라이머 쌍; 서열번호 9 및 10으로 이루어진 프라이머 쌍; 서열번호 11 및 12로 이루어진 프라이머 쌍; 및 서열번호 13 및 14로 이루어진 프라이머 쌍을 포함하는 가지과 작물에 발생하는 8종 바이러스 검출용 프라이머 세트를 제공함에 특징이 있다. The present invention relates to a primer set for PCR that can specifically detect a plurality of viruses causing disease in eggplant crops, and more specifically, PLRV (potato leafroll virus), which is a major virus causing eggplant crop infection, Potato virus S (PVS), potato virus X (PVX), potato virus Y (PVY), tobacco mosaic virus (UTMV) -U1, tobacco mosaic virus (TMV) -KOR, tobacco rattle virus (TRV), and potato mop A primer combination capable of simultaneously diagnosing eight viruses of -top virus, comprising: a primer pair consisting of SEQ ID NOs: 1 and 2; Primer pairs consisting of SEQ ID NOs: 3 and 4; Primer pairs consisting of SEQ ID NOs: 5 and 6; Primer pairs consisting of SEQ ID NOs: 7 and 8; Primer pairs consisting of SEQ ID NOs: 9 and 10; Primer pairs consisting of SEQ ID NOs: 11 and 12; And it is characterized by providing a primer set for detecting 8 kinds of viruses occurring in the branches and crops comprising a primer pair consisting of SEQ ID NO: 13 and 14.

특히 본 발명자들은 본 발명의 일실시예를 통해 가지과 작물에 병을 일으키는 주요 바이러스인 상기 8종에 대한 데이터베이스 상의 서열정보를 바탕으로 이들을 특이적으로 검출할 수 있는 프라이머를 설계하였고, 설계한 프라이머들을 대상으로 8종 바이러스를 특이적으로 검출할 수 있는 후보 프라이머들을 이용하여 바이러스에 감염된 작물을 대상으로 바이러스 검출을 수행한 결과, 서열번호 1~14의 프라이머들을 사용한 경우, 8종의 바이러스 특이 유전자를 서로 다른 크기로 동시에 탐지할 수 있으며, 단 한번의 PCR 반응으로 각 바이러스를 검출할 수 있다는 것을 확인하였다.In particular, the inventors of the present invention designed a primer that can specifically detect them based on the sequence information on the database of the eight kinds of viruses that cause diseases in eggplant and crops through an embodiment of the present invention, the designed primers As a result of performing virus detection on virus-infected crops using candidate primers capable of specifically detecting eight viruses as targets, when the primers of SEQ ID NOs 1 to 14 were used, eight virus-specific genes were detected. It can be detected at the same time in different sizes, it was confirmed that each virus can be detected by a single PCR reaction.

또한, 본 발명에서 제공하는 상기 가지과 작물에 발생하는 8종 바이러스 검출용 프라이머 세트에 포함되는 상기 프라이머 쌍들 중, 서열번호 1 및 2의 프라이머 쌍은 PLRV(potato leafroll virus)를 특이적으로 검출하고, 상기 서열번호 3 및 4의 프라이머 쌍은 PVS(potato virus S)를 특이적으로 검출하고, 상기 서열번호 5 및 6의 프라이머 쌍은 PVX(potato virus X)를 특이적으로 검출하고, 상기 서열번호 7 및 8의 프라이머 쌍은 PVY(potato virus Y)를 특이적으로 검출하고, 상기 서열번호 9 및 10의 프라이머 쌍은 TMV(tobacco mosaic virus)-U1과 TMV(tobacco mosaic virus)-KOR을 특이적으로 검출하고, 상기 서열번호 11 및 12의 프라이머 쌍은 TRV(tobacco rattle virus)를 특이적으로 검출하고, 상기 서열번호 13 및 14의 프라이머 쌍은 PMTV(potato mop-top virus)를 특이적으로 검출할 수 있다.In addition, among the primer pairs included in the primer set for detecting eight kinds of viruses occurring in the branched crop provided by the present invention, the primer pairs of SEQ ID NOs: 1 and 2 specifically detects PLRV (potato leafroll virus), The primer pairs of SEQ ID NOS: 3 and 4 specifically detect potato virus S (PVS), the primer pairs of SEQ ID NOs: 5 and 6 specifically detect potato virus X (PVX), and SEQ ID NO: 7 And primer pairs of 8 specifically detect potato virus Y (PVY), and the primer pairs of SEQ ID NOs: 9 and 10 specifically target tobacco mosaic virus (TMV) -U1 and tobacco mosaic virus (TMV) -KOR. The primer pairs of SEQ ID NOs: 11 and 12 specifically detect tobacco rattle virus (TRV), and the primer pairs of SEQ ID NOs: 13 and 14 specifically detect potato mop-top virus (PMTV). Can be.

그러므로 본 발명에서 제공하는 상기 프라이머 세트는 가지과 작물에 발생하는 상기 8종의 바이러스를 검출하는데 매우 용이하게 사용할 수 있으며, 또한 본 발명은 상기 본 발명의 프라이머 세트를 포함하는 가지과 작물에 발생하는 8종 바이러스 검출용 키트를 제공할 수 있다. Therefore, the primer set provided in the present invention can be used very easily to detect the eight kinds of viruses occurring in eggplant crops, and the present invention also provides eight kinds of eggplant crops comprising the primer set of the present invention. A kit for detecting a virus can be provided.

여기서 상기 본 발명에서 사용한프라이머란 용어는 적합한 온도 및 적합한 완충액 내에서 적합한 조건(즉, 4종의 다른 뉴클레오시드 트리포스페이트 및 중합반응 효소) 하에서 주형-지시 DNA 합성의 개시점으로 작용할 수 있는 단일-가닥 올리고뉴클레오타이드를 의미한다. 프라이머의 적합한 길이는 다양한 요소, 예컨대, 온도와 프라이머의 용도에 따라 변화가 있을 수 있다. 또한, 프라이머의 서열은 주형의 일부 서열과 완전하게 상보적인 서열을 가질 필요는 없으며, 주형과 혼성화되어 프라이머 고유의 작용을 할 수 있는 범위 내에서의 충분한 상보성을 가지면 충분하다. 따라서 본 발명에서의 프라이머는 주형인 유전자의 뉴클레오타이드 서열에 완벽하게 상보적인 서열을 가질 필요는 없으며, 이 유전자 서열에 혼성화되어 프라이머 작용을 할 수 있는 범위 내에서 충분한 상보성을 가지면 충분하다. 또한, 본 발명에 따른 프라이머는 유전자 증폭 반응에 이용될 수 있는 것이 바람직하다.The term primer, as used herein, herein refers to a single that can serve as an initiation point for template-directed DNA synthesis under suitable conditions (ie, four different nucleoside triphosphates and polymerases) in suitable buffers. -Refers to stranded oligonucleotides. The appropriate length of the primer may vary depending on various factors, such as temperature and use of the primer. In addition, the sequence of the primer does not need to have a sequence completely complementary to a partial sequence of the template, and it is sufficient that the primer has sufficient complementarity within a range capable of hybridizing with the template and acting as a primer. Therefore, the primer of the present invention does not need to have a perfectly complementary sequence to the nucleotide sequence of the gene that is the template, and it is sufficient that the primer has sufficient complementarity within the range capable of hybridizing with the gene sequence to perform the primer action. In addition, it is preferable that the primer according to the present invention can be used for gene amplification reaction.

또한, 상기 증폭 반응은 핵산 분자를 증폭하는 반응을 말하며, 이러한 유전자의 증폭 반응들에 대해서는 당업계에 잘 알려져 있고, 예컨대, 중합효소 연쇄반응(PCR), 역전사 중합효소 연쇄반응(RT-PCR), 리가아제 연쇄반응(LCR), 전자 중재 증폭(TMA), 핵산 염기서열 기판 증폭(NASBA) 등이 포함될 수 있다. In addition, the amplification reaction refers to a reaction for amplifying a nucleic acid molecule, and the amplification reactions of such genes are well known in the art, for example, polymerase chain reaction (PCR), reverse transcriptase polymerase chain reaction (RT-PCR). , Ligase chain reaction (LCR), electron mediated amplification (TMA), nucleic acid sequence substrate amplification (NASBA), and the like.

나아가 본 발명에서 제공하는 상기 가지과 작물에 발생하는 8종 바이러스 검출용 키트가 만일 PCR 증폭 과정에 적용되는 경우, 본 발명의 키트는 선택적으로, PCR 증폭에 필요한 시약, 예컨대, 완충액, DNA 중합효소(예컨대, Thermus aquaticus (Taq), Thermus thermophilus (Tth), Thermus filiformis, Thermis flavus, Thermococcus literalis 또는 Pyrococcus furiosus(Pfu)로부터 수득한 열 안정성 DNA 중합효소), DNA 중합 효소 조인자 및 dNTPs를 포함할 수 있으며, 본 발명의 진단용 키트가 면역 분석에 적용되는 경우, 본 발명의 키트는 선택적으로, 이차항체 및 표지의 기질을 포함할 수 있다. Furthermore, if the 8 kinds of virus detection kits generated in the eggplant crop provided by the present invention are applied to the PCR amplification process, the kit of the present invention may optionally include reagents required for PCR amplification, such as buffers and DNA polymerases ( Such as Thermus aquaticus (Taq), Thermus thermophilus (Tth), Thermus filiformis, Thermis flavus, Thermococcus literalis or thermally stable DNA polymerase obtained from Pyrococcus furiosus (Pfu)), DNA polymerase joiners and dNTPs When the diagnostic kit of the present invention is applied to an immunoassay, the kit of the present invention may optionally include a substrate of a secondary antibody and a label.

나아가, 본 발명에 따른 키트는 상기한 시약 성분을 포함하는 다수의 별도 패키징 또는 컴파트먼트로 제작될 수 있으며, 본 발명의 키트는 DNA 칩을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 진단용 키트일 수 있다. DNA 칩 키트는, 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 cDNA가 프로브로 부착되어 있는 기판, 및 형광표식 프로브를 제작하기 위한 시약, 제제, 효소 등을 포함할 수 있다. 또한, 기판은 정량 대조구 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 cDNA를 포함할 수 있다.Furthermore, the kit according to the present invention may be manufactured in a number of separate packaging or compartments containing the reagent components described above, and the kit of the present invention may be a diagnostic kit including essential elements necessary for carrying out a DNA chip. have. The DNA chip kit may include a substrate on which a cDNA corresponding to a gene or a fragment thereof is attached as a probe, and reagents, preparations, enzymes, and the like for producing a fluorescent-labeled probe. In addition, the substrate may contain a cDNA corresponding to a quantitative control gene or a fragment thereof.

이 외에도 본 발명은 상기 본 발명에 따른 프라이머 세트를 이용하여 PCR을 수행하는 단계를 포함하는, 가지과 작물에 발생하는 8종 바이러스인 PLRV(potato leafroll virus), PVS(potato virus S), PVX(potato virus X), PVY(potato virus Y), TMV(tobacco mosaic virus)-U1, TMV(tobacco mosaic virus)-KOR, TRV(tobacco rattle virus) 및 PMTV(potato mop-top virus)를 동시에 검출하는 방법을 제공할 수 있으며, 특히 본 발명에서 제공하는 상기 검출 방법은 미지의 바이러스 게놈을 주형으로 하여, 94℃에서 3~5분간 변성반응 시킨 후, 94℃에서 30초~50초, 55℃에서 30초~50초 및 72℃에서 45초~50초를 한 사이클로 하여 30회~35회 사이클을 반복 실시한 다음, 72℃에서 7분간 연장 반응을 수행하는 한번의 PCR 반응으로 가지과 작물에 발생하는 8종 바이러스를 동시에 검출할 수 있다. In addition to the present invention, including the step of performing PCR using the primer set according to the present invention, eight kinds of viruses that occur in the eggplant crops PLRV (potato leafroll virus), PVS (potato virus S), PVX (potato) virus X), potato virus Y (PVY), tobacco mosaic virus (TMV) -U1, tobacco mosaic virus (TMV) -KOR, tobacco rattle virus (TRV), and potato mop-top virus (PMTV) In particular, the detection method provided by the present invention is a denaturation reaction for 3 to 5 minutes at 94 ℃, with the unknown virus genome as a template, 30 seconds to 50 seconds at 94 ℃, 30 seconds at 55 ℃ Eight types of viruses that occur in eggplant crops with one PCR reaction, repeating 30 to 35 cycles with one cycle of 45 seconds to 50 seconds at ~ 50 seconds and 72 ° C, and then extending the reaction for 7 minutes at 72 ° C. Can be detected simultaneously.

일반적으로 PCR 반응은 사용하는 주형 DNA 및 프라이머의 염기서열 종류와 수에 따라 PCR 반응의 시간 및 온도 조건이 각기 달리 최적화 되어지는데, 본 발명의 경우, 8종 가지과 감염 바이러스에 대해 종 특이적인 프라이머들을 가지고 한 번의 PCR 반응 만으로 감염 여부를 진단할 수 있다. In general, the PCR reaction is optimized according to the time and temperature conditions of the PCR reaction according to the type and number of nucleotide sequences of the template DNA and primers used, in the case of the present invention, species-specific primers for 8 kinds and infectious virus You can diagnose the infection with just one PCR reaction.

또한, 본 발명에서 상기 바이러스들이 감염시킬 수 있는 가지과 작물로는 이에 제한되지는 않으나 파프리카, 고추, 감자, 담배, 토마토 또는 피튜니아일 수 있다.
In addition, eggplant crops that can be infected by the viruses in the present invention may be, but not limited to, paprika, pepper, potato, tobacco, tomato or petunia.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명하기로 한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
Hereinafter, the present invention will be described in detail with reference to examples. However, these examples are intended to illustrate the present invention in more detail, and the scope of the present invention is not limited to these examples.

<< 실시예Example 1> 1>

가지과Eggplant 작물에 바이러스의 접종 및 감염 확인 Virus inoculation and infection identification in crops

가지과 작물에 병을 일으키는 바이러스들을 기주식물체인 감자 및 담배에 각각 접종한 후 감염 여부를 확인하였다. 이때 사용한 바이러스로는 TMV-U1, TMV-KOR, PLRV, PVX, PMTV, TRV, PVS 및 PVY의 8종 균주를 사용하였는데, 이는 식물바이러스유전자은행에서 분양받아 사용하였고, 일부는 ATCC에서 분양받아 사용하였다. Viruses that cause disease in eggplant and crops were inoculated into potato and tobacco, which are host plants, respectively. At this time, 8 strains of TMV-U1, TMV-KOR, PLRV, PVX, PMTV, TRV, PVS and PVY were used, which were used by the plant virus gene bank and some were used by ATCC. It was.

이후 상기 바이러스들을 기주식물체에 각각 접종하기 위해, 막자사발을 이용하여 접종 대상 작물 0.01g을 4㎕의 0.01M K2HPO4(제2인산칼륨)에 섞어 마쇄한 후, 잘 소독된 철사에 묻혀 상기 바이러스들을 기주식물에 접종하였다. 또한, 바이러스 접종에 의한 식물병 발병조건을 위해 상기 바이러스를 기주식물의 본엽 1기에 접종한 후 온도는 22℃, 습도는 80% 이상으로 유지하였고, 본엽 3기 이후에 접종한 잎이 아닌 새잎을 육안으로 확인하고, ELISA 및 항체 여과지 진단키트(기산바이오)를 사용하여 발병 여부를 확인하였다. 또한 진단키트로 검정이 어려운 경우, PCR 산물(product)을 시퀀싱(sequencing)한 후 BLASTN을 실시하여 각 바이러스에 대한 감염 여부의 유의성을 검정하였다.
Then, to inoculate the viruses into host plants, 0.01 g of the crop to be inoculated was mixed with 4 μl of 0.01MK 2 HPO 4 (dibasic potassium phosphate) using a mortar and ground, and then buried in a well-sterilized wire. Viruses were inoculated into host plants. In addition, after inoculation of the virus to the first leaf of the host plant for the development of plant diseases caused by the virus inoculation, the temperature was maintained at 22 ℃, humidity of 80% or more, after the third leaf of the leaves not inoculated Visually confirmed, the onset was confirmed using ELISA and antibody filter paper diagnostic kit (kisan bio). In addition, if the assay kit is difficult to assay, PCR products were sequenced, and then BLASTN was performed to test the significance of each virus.

그 결과, 도 1 내지 도 7에 나타낸 바와 같이, 본 발명에서 사용한 상기 8종의 바이러스(TMV-U1, TMV-KOR, PLRV, PVX, PMTV, TRV, PVS 및 PVY)에 의해 각각 접종되어 식물병이 유발된 작물을 선별할 수 있었으며, 도 1 내지 도 7에서 별(*) 표시된 lane이 각 바이러스에 의해 감염된 작물(감자 및 담배)을 나타낸 것이다.
As a result, as shown in Figs. 1 to 7, each of the eight viruses used in the present invention (TMV-U1, TMV-KOR, PLRV, PVX, PMTV, TRV, PVS and PVY) respectively inoculated with plant diseases This induced crop was able to be selected, and lanes marked with a star (*) in FIGS. 1 to 7 indicate crops (potatoes and tobacco) infected by each virus.

<< 실시예Example 2> 2>

바이러스 검출용 For virus detection 프라이머의Primer 설계 design

<2-1> 바이러스 염기서열의 <2-1> Viral Sequence InIn SilicoSilico 분석 analysis

상기 기주식물에 접종한 바이러스의 염기서열을 확보하기 위해 상기 8종의 가지과 바이러스들에 대해 NCBI 데이터베이스에 등록된 바이러스 시퀀스(sequence)를 탐색하였고, 각 바이러스의 시퀀스 데이터를 각 바이러스의 특징적인 구조에 따라 정렬하였으며, 바이러스 웹사이트(http://tree.bio.ed.ac.uk/rnavirusdb)를 활용하여 바이러스 구조를 확인한 후, CLC Sequence viewer program을 이용하여 정리된 서열을 정렬(alignment)하고, 계통수(phylogenetic tree)를 프로그램을 이용하여 작성하여 서열을 그룹화하였다.
In order to secure the nucleotide sequence of the virus inoculated into the host plant, virus sequences registered in the NCBI database were searched for the 8 kinds of branches and viruses, and the sequence data of each virus was added to the characteristic structure of each virus. After confirming the virus structure using the virus website (http://tree.bio.ed.ac.uk/rnavirusdb), the sequence was arranged using the CLC Sequence viewer program. Phylogenetic trees were created programmatically to group sequences.

<2-2> 특이적 <2-2> specific 프라이머primer 조합 설계 Combination design

각 식물 바이러스에서 그룹화된 서열정보를 바탕으로 프로그램을 이용하여 아래 표 1과 같이 각 바이러스를 특이적으로 탐지할 수 있는 후보 프라이머 조합을 설계하였다.Based on the sequence information grouped in each plant virus, the program was designed using a candidate primer combination that can specifically detect each virus as shown in Table 1 below.

가지과 바이러스에 대한 프라이머쌍 및 생성물 크기Primer Pairs and Product Sizes for Eggplant Virus 바이러스virus 프라이머명Primer name 센스 프라이머Sense primer 안티센스 프라이머Antisense primer 생성물product PLRVPLRV FPPLRV_1 FPPLRV_1 ACAACAACCAAGAAGGCGAA ACAACAACCAAGAAGGCGAA TTGCCTCCTCTTCTGCGTC TTGCCTCCTCTTCTGCGTC 120120 FPPLRV_2 FPPLRV_2 GGCGGAGAAAACAGCAGG GGCGGAGAAAACAGCAGG CTGTTTGTGGGGCTCTCCTT CTGTTTGTGGGGCTCTCCTT 440440 FPPLRV_3 FPPLRV_3 CGCAGAAGCAAGAAAGCG CGCAGAAGCAAGAAAGCG CTGTTTGTGGGGCTCTCCTT CTGTTTGTGGGGCTCTCCTT 367367 FPPLRV_4 FPPLRV_4 GGCGGAGAAAACAGCAGG GGCGGAGAAAACAGCAGG GTTTGTGGGGCTCTCCTTTG GTTTGTGGGGCTCTCCTTTG 360360 FPPLRV_5 FPPLRV_5 GGCGGAGAAAACAGCAGG GGCGGAGAAAACAGCAGG TGTTTGTGGGGCTCTCCTTT TGTTTGTGGGGCTCTCCTTT 540540 FPPLRV_6 FPPLRV_6 AGAAGGCGAAGAAGGCAATC AGAAGGCGAAGAAGGCAATC TGAATGCCGGACAGTCTGAT TGAATGCCGGACAGTCTGAT 300300 FPPLRV_7 FPPLRV_7 GAAGAACTGGAGTTCCCCGA GAAGAACTGGAGTTCCCCGA TGAATGCCGGACAGTCTGAT TGAATGCCGGACAGTCTGAT 140140 FPPLRV_8 FPPLRV_8 AACCAAGAAGGCGAAGAAGG AACCAAGAAGGCGAAGAAGG TGAATGCCGGACAGTCTGAT TGAATGCCGGACAGTCTGAT 180180 FPPLRV_9 FPPLRV_9 AGAAGGCGAAGAAGGCAATC AGAAGGCGAAGAAGGCAATC ATACTTTGCAATGGGGGTCC ATACTTTGCAATGGGGGTCC 380380 FPPLRV_10 FPPLRV_10 GAAGACGCAGAAGAGGAGGC GAAGACGCAGAAGAGGAGGC TGAATGCCGGACAGTCTGAT TGAATGCCGGACAGTCTGAT 180180 PVSPVS FPPVS_1 FPPVS_1 CTGCTGACATCGCTGGACTTCTGCTGACATCGCTGGACTT TGCCATACTCTTGTGGGCATTGCCATACTCTTGTGGGCAT 420420 FPPVS_2 FPPVS_2 CTGCTGACATCGCTGGACTTCTGCTGACATCGCTGGACTT TGCAGCCCCATTAGTCACATTGCAGCCCCATTAGTCACAT 320320 FPPVS_3 FPPVS_3 AACACGTTGCAGGGGTCATAAACACGTTGCAGGGGTCATA TGCCATACTCTTGTGGGCATTGCCATACTCTTGTGGGCAT 380380 FPPVS_4 FPPVS_4 AACACGTTGCAGGGGTCATAAACACGTTGCAGGGGTCATA TGCAGCCCCATTAGTCACATTGCAGCCCCATTAGTCACAT 320320 FPPVS_5 FPPVS_5 GAGACACCACAAGCAATGCCGAGACACCACAAGCAATGCC AAGTCCAGCGATGTCAGCAGAAGTCCAGCGATGTCAGCAG 330330 FPPVS_6 FPPVS_6 AGCATGTTGCAGGGGTCATAAGCATGTTGCAGGGGTCATA AATTCCACACGACTGGAGCAAATTCCACACGACTGGAGCA 210210 FPPVS_7 FPPVS_7 GCATGTTGCAGGGGTCATACGCATGTTGCAGGGGTCATAC AATTCCACACGACTGGAGCAAATTCCACACGACTGGAGCA 200200 FPPVS_8 FPPVS_8 TGGTGATCATGTGTGCAAGCTGGTGATCATGTGTGCAAGC AATTCCACACGACTGGAGCAAATTCCACACGACTGGAGCA 180180 FPPVS_9 FPPVS_9 TGAACTCATGGCCTCGAAAATGAACTCATGGCCTCGAAAA AAGTCCAGCGATGTCAGCAGAAGTCCAGCGATGTCAGCAG 280280 FPPVS_10 FPPVS_10 TTGAACTCATGGCCTCGAAATTGAACTCATGGCCTCGAAA AAGTCCAGCGATGTCAGCAGAAGTCCAGCGATGTCAGCAG 250,850250,850 PVX
PVX
FPPVX_1 FPPVX_1 CACAACTGCAAGAAGCCGAT CACAACTGCAAGAAGCCGAT CGCGTAGTCCTCAAGACCAA CGCGTAGTCCTCAAGACCAA 300,370300,370 FPPVX_2 FPPVX_2 TAAGCCCTGCCAAGTGACTG TAAGCCCTGCCAAGTGACTG TTGGTGCCGTCTCTGTAAGC TTGGTGCCGTCTCTGTAAGC 304304 FPPVX_3 FPPVX_3 TAAGCCCTGCCAAGTGACTG TAAGCCCTGCCAAGTGACTG GCTTTGGTGCCGTCTCTGTA GCTTTGGTGCCGTCTCTGTA 250,300250,300 FPPVX_4 FPPVX_4 TGGCAGATTTGATAGCAGGC TGGCAGATTTGATAGCAGGC GCTTTGGTGCCGTCTCTGTA GCTTTGGTGCCGTCTCTGTA 470470 FPPVX_5 FPPVX_5 TGGCAGATTTGATAGCAGGC TGGCAGATTTGATAGCAGGC TTGGTGCCGTCTCTGTAAGC TTGGTGCCGTCTCTGTAAGC 467467 FPPVX_6 FPPVX_6 CACAGGCTGCTTGGGACTTA CACAGGCTGCTTGGGACTTA CTTGCCAGTTAGCAGGTGGA CTTGCCAGTTAGCAGGTGGA 400400 FPPVX_7 FPPVX_7 TGAAGGTGCCCACAGACACT TGAAGGTGCCCACAGACACT CTTGCCAGTTAGCAGGTGGA CTTGCCAGTTAGCAGGTGGA 243243 FPPVX_8 FPPVX_8 CACTATGGCACAGGCTGCTT CACTATGGCACAGGCTGCTT CTTGCCAGTTAGCAGGTGGA CTTGCCAGTTAGCAGGTGGA 300,700300,700 FPPVX_9 FPPVX_9 GGCCACAGGGTCAACTACCT GGCCACAGGGTCAACTACCT CTTGCCAGTTAGCAGGTGGA CTTGCCAGTTAGCAGGTGGA 422422 FPPVX_10 FPPVX_10 AGGCCACAGGGTCAACTACC AGGCCACAGGGTCAACTACC CTTGCCAGTTAGCAGGTGGA CTTGCCAGTTAGCAGGTGGA 423423 FPPVX_1 FPPVX_1 CACAACTGCAAGAAGCCGAT CACAACTGCAAGAAGCCGAT CGCGTAGTCCTCAAGACCAA CGCGTAGTCCTCAAGACCAA 300,370300,370 FPPVX_2 FPPVX_2 TAAGCCCTGCCAAGTGACTG TAAGCCCTGCCAAGTGACTG TTGGTGCCGTCTCTGTAAGC TTGGTGCCGTCTCTGTAAGC 304304 FPPVX_3 FPPVX_3 TAAGCCCTGCCAAGTGACTG TAAGCCCTGCCAAGTGACTG GCTTTGGTGCCGTCTCTGTA GCTTTGGTGCCGTCTCTGTA 250,300250,300 FPPVX_4 FPPVX_4 TGGCAGATTTGATAGCAGGC TGGCAGATTTGATAGCAGGC GCTTTGGTGCCGTCTCTGTA GCTTTGGTGCCGTCTCTGTA 470470 FPPVX_5 FPPVX_5 TGGCAGATTTGATAGCAGGC TGGCAGATTTGATAGCAGGC TTGGTGCCGTCTCTGTAAGC TTGGTGCCGTCTCTGTAAGC 467467 FPPVX_6 FPPVX_6 CACAGGCTGCTTGGGACTTA CACAGGCTGCTTGGGACTTA CTTGCCAGTTAGCAGGTGGA CTTGCCAGTTAGCAGGTGGA 400400 FPPVX_7 FPPVX_7 TGAAGGTGCCCACAGACACT TGAAGGTGCCCACAGACACT CTTGCCAGTTAGCAGGTGGA CTTGCCAGTTAGCAGGTGGA 243243 FPPVX_8 FPPVX_8 CACTATGGCACAGGCTGCTT CACTATGGCACAGGCTGCTT CTTGCCAGTTAGCAGGTGGA CTTGCCAGTTAGCAGGTGGA 300,700300,700 FPPVX_9 FPPVX_9 GGCCACAGGGTCAACTACCT GGCCACAGGGTCAACTACCT CTTGCCAGTTAGCAGGTGGA CTTGCCAGTTAGCAGGTGGA 422422 FPPVX_10 FPPVX_10 AGGCCACAGGGTCAACTACC AGGCCACAGGGTCAACTACC CTTGCCAGTTAGCAGGTGGA CTTGCCAGTTAGCAGGTGGA 423423 FPPVX_CG_G1_1 FPPVX_CG_G1_1 CACAGGCTGCTTGGGACTTACACAGGCTGCTTGGGACTTA TCAGGCTTGAAACCTTGTGC TCAGGCTTGAAACCTTGTGC 200200 FPPVX_CG_G1_2 FPPVX_CG_G1_2 CCCACTTGCAGTGGCTAAAA CCCACTTGCAGTGGCTAAAA CCTGTCTGGTTGTCCAAACG CCTGTCTGGTTGTCCAAACG 209209 FPPVX_CG_G1_3 FPPVX_CG_G1_3 ATGTGCGTGGAGAATGAGGA ATGTGCGTGGAGAATGAGGA CATCTTTGGCCTGTTGATGG CATCTTTGGCCTGTTGATGG 380380 FPPVX_CG_G1_4 FPPVX_CG_G1_4 CCCACTTGCAGTGGCTAAAA CCCACTTGCAGTGGCTAAAA AGGATGGGCTTCTTGCAGTT AGGATGGGCTTCTTGCAGTT 268268 FPPVX_CG_G1_5 FPPVX_CG_G1_5 CCATCAACAGGCCAAAGATG CCATCAACAGGCCAAAGATG ACTTGCTTTGCACCTCATGC ACTTGCTTTGCACCTCATGC 218218 FPPVX_CG_G2_4 FPPVX_CG_G2_4 AAGTGCCCAACACTGAACCA AAGTGCCCAACACTGAACCA CAAGCATGTTCGCAAGGTCT CAAGCATGTTCGCAAGGTCT 700700 FPPVX_CG_G2_5 FPPVX_CG_G2_5 ACACTGTGCTGATGTGGGCT ACACTGTGCTGATGTGGGCT 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TMV-KORTMV-U1
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TMV-KOR FPTMV_1 FPTMV_1 GGACGTTCGAGACATCATGC GGACGTTCGAGACATCATGC GCTTCCTTTTGGAAGTTGGG GCTTCCTTTTGGAAGTTGGG 110110 FPTMV_2 FPTMV_2 GTCATGCATGGGGTGTTGTT GTCATGCATGGGGTGTTGTT CGCTACTGACATGCGGTTCT CGCTACTGACATGCGGTTCT 200200 FPTMV_3 FPTMV_3 CCAGTCTCCATCATTGCAGG CCAGTCTCCATCATTGCAGG TTGGAACCTTTGAACACCGA TTGGAACCTTTGAACACCGA 220220 FPTMV_4 FPTMV_4 AATGCGGTATTAGACCCGCT AATGCGGTATTAGACCCGCT GCTCTCGAAAGAGCTCCGAT GCTCTCGAAAGAGCTCCGAT 230230 FPTMV_5 FPTMV_5 CCAGTCTCCATCATTGCAGG CCAGTCTCCATCATTGCAGG TGTGTTCCTGCATCGACCTT TGTGTTCCTGCATCGACCTT 190190 FPTMV_6 FPTMV_6 AATGCGGTATTAGACCCGCT AATGCGGTATTAGACCCGCT GCTCTCGAAAGAGCTCCGAT GCTCTCGAAAGAGCTCCGAT 210210 FPTMV_7 FPTMV_7 GTTCTTGTCATCAGCGTGGG GTTCTTGTCATCAGCGTGGG GCTCTCGAAAGAGCTCCGAT GCTCTCGAAAGAGCTCCGAT 450450 FPTMV_8 FPTMV_8 GTTCTTGTCATCAGCGTGGG GTTCTTGTCATCAGCGTGGG ACAGTGCTGTGACTAGCGGG ACAGTGCTGTGACTAGCGGG 210210 FPTMV_9 FPTMV_9 GTTCTTGTCATCAGCGTGGG GTTCTTGTCATCAGCGTGGG CAGTGCTGTGACTAGCGGGT CAGTGCTGTGACTAGCGGGT 210210 FPTMV_10 FPTMV_10 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<< 실시예Example 3> 3>

PCR 반응을 이용한 바이러스 병 진단Virus disease diagnosis using PCR reaction

<3-1> 바이러스 RNA 추출(Trizol method)<3-1> Viral RNA Extraction (Trizol method)

상기 실시예에서 바이러스를 감염시킨 기주식물체의 잎 100㎎에 액체질소를 첨가하고, 비드(bead)를 이용하여 잎을 파쇄한 후, 트리졸(Trizol) 시약 1,000㎕를 첨가하고 볼텍싱(vortexing)한 후, 상온에서 5분간 방치하였고, 다시 200㎕의 클로로포름(chloroform)을 각 튜브에 넣고 15초간 볼텍싱한 다음, 상온에 15분간 방치하였다. 12,000rpm, 4℃에서 10분간 원심분리한 후, 상층액 500㎕를 새로운 튜브로 옮기고, 400㎕의 아이소프로판올(isopropanol)을 첨가하여 인버팅(inverting)하였다. 12,000rpm, 4℃에서 10분간 원심 분리한 다음, 상층액을 버리고 70% 에탄올 1㎖로 세척하였다. 12,000rpm에서 4℃의 온도로 2분간 원심분리한 후, 상층액을 버리고 상온에서 5분간 건조한 다음 DEPC 40㎕를 첨가하고 65℃에서 10분간 배양(incubation)하고 잘 섞은 후 -70℃에 보관하였다.
In the above embodiment, liquid nitrogen was added to 100 mg of the leaves of the host plants infected with the virus, and the leaves were crushed using beads, and then 1,000 μl of Trizol reagent was added and vortexed. After that, the mixture was left at room temperature for 5 minutes, and 200 µl of chloroform was added to each tube and vortexed for 15 seconds, and then left at room temperature for 15 minutes. After centrifugation at 12,000 rpm for 10 minutes at 4 ° C., 500 μl of the supernatant was transferred to a new tube and inverted by adding 400 μl of isopropanol. After centrifugation at 12,000 rpm for 10 minutes at 4 ° C, the supernatant was discarded and washed with 1 ml of 70% ethanol. After centrifugation for 2 minutes at 12,000rpm at a temperature of 4 ℃, discard the supernatant, and dried at room temperature for 5 minutes, 40 μl of DEPC was added, incubated at 65 ℃ for 10 minutes (mixed well) and stored at -70 ℃ .

<3-2> 바이러스 cDNA 합성(SuperScript, invitrogen)<3-2> Virus cDNA Synthesis (SuperScript, invitrogen)

실시예 <3-1>에서 수득한 각 바이러스의 RNA을 대상으로 cDNA의 합성을 위해 RT-PCR을 수행하였는데, 반응 조성물로는 추출한 RNA 10ng, Oligo DT 1㎕, dNTPs 1㎕, DEPC 1㎕을 혼합하고 총 부피(volume)가 11㎕가 되도록 조정한 다음, 65℃에서 5분, 4℃에서 1분간 반응시켰다. 이후, 10X RT 2㎕, 25mM Mgcl2 4㎕, 0.1M DTT 2㎕, RNase Out 1㎕ 혼합하고 총 부피를 20㎕로 조정하고, 42℃에서 2분간 반응시켰다. 이후, SSⅡ 1㎕ 첨가 후, 총 부피 21㎕로 조정하여 42℃에서 50분, 70℃에서 15분 반응시키고 RNase H 1㎕ 넣고 37℃에서 20분간 처리하고 -20℃에서 보관하였다.
RT-PCR was performed on the RNA of each virus obtained in Example <3-1> for the synthesis of cDNA. As a reaction composition, 10 ng of extracted RNA, 1 μl of Oligo DT, 1 μl of dNTPs, and 1 μl of DEPC were used. After mixing and adjusting the total volume to 11 μl, the reaction was carried out at 65 ° C. for 5 minutes and at 4 ° C. for 1 minute. Thereafter, 2 µl of 10X RT, 4 µl of 25mM Mgcl2, 2 µl of 0.1M DTT, and 1 µl of RNase Out were adjusted, and the total volume was adjusted to 20 µl and reacted at 42 ° C. for 2 minutes. Thereafter, after adding 1 μl of SSII, the total volume was adjusted to 21 μl, reacted at 42 ° C. for 50 minutes and at 70 ° C. for 15 minutes. 1 μl of RNase H was added and treated at 37 ° C. for 20 minutes and stored at −20 ° C.

<3-3> 바이러스 cDNA에 대한 본 발명의 프라이머를 사용한 PCR 분석<3-3> PCR analysis using primers of the present invention for viral cDNA

상기 실시예 <3-2>의 실험을 통해 각 바이러스의 cDNA를 수득한 후, 이들 바이러스를 검출할 수 있다고 예상되는 프라이머들로서 상기 표 1에 기재된 프라이머들을 대상으로, 각 8종의 바이러스를 각각 검출할 수 있는 프라이머쌍을 선택하여 각각의 조합을 만든 후, PCR 반응을 수행하여, 8종의 바이러스를 검출할 수 있는 프라이머 조합을 찾아내었는데, 먼저 이를 위한 PCR 반응 조성물로 바이러스 cDNA 10ng, 10× buffer(1.0mM MgCl2포함), dNTPs 200 μM, taq polymerase 0.1 Unit, Primer 0.25uM 를 혼합하여 총 부피가 25 ㎕가 되도록 조절한 후, 94℃에서 5분간 변성, 94℃에서 45초, 55℃에서 45초, 72℃에서 45초를 한 사이클(cycle)로 하여 총 35회 반복 실시한 후, 72℃에서 7분간 반응시켰다.After obtaining the cDNA of each virus through the experiment of Example <3-2>, each of 8 viruses are detected in each of the primers listed in Table 1 as primers expected to detect these viruses. After selecting each primer pair to make each combination, PCR reaction was performed to find a primer combination that can detect eight viruses. First, the PCR reaction composition for the virus cDNA 10ng, 10 × buffer (containing 1.0mM MgCl 2 ), dNTPs 200 μM, taq polymerase 0.1 Unit, Primer 0.25 uM, adjusted to a total volume of 25 μl, and then denatured at 94 ° C. for 5 minutes, 45 seconds at 94 ° C., 55 ° C. After a total of 35 repetitions of 45 seconds at 45 ℃, 45 seconds at one cycle (cycle), the reaction was carried out at 72 ℃ for 7 minutes.

그 결과, 8종의 바이러스를 한 번에 검출할 수 있는 프라이머 조합으로서, 하기 표 2의 프라이머 세트를 사용할 수 있다는 것을 확인할 수 있었다. 또한, 여기서 TMV-UI과 TMV-KOR의 2종 바이러스는 한 쌍의 프라이머로 검출할 수 있다는 것을 알 수 있었다(도 8 참조). As a result, it was confirmed that the primer set shown in Table 2 below can be used as a primer combination capable of detecting eight viruses at once. In addition, it was found that two viruses of TMV-UI and TMV-KOR can be detected by a pair of primers (see FIG. 8).

최적 조건을 구성하는 바이러스별 프라이머 조합Combination of primers for each virus that constitute optimal conditions 바이러스명Virus name 프라이머명Primer name 프라이머서열(5'→3')Primer sequence (5 '→ 3') 산물길이
(bp)Product length
(bp) 서열번호SEQ ID NO: PLRV PLRV FPPLRV_8-FFPPLRV_8-F AACCAAGAAGGCGAAGAAGG AACCAAGAAGGCGAAGAAGG 180180 1One FPPLRV_8-RFPPLRV_8-R TGAATGCCGGACAGTCTGAT TGAATGCCGGACAGTCTGAT 22 PVSPVS FPPVS_3-FFPPVS_3-F AACACGTTGCAGGGGTCATAAACACGTTGCAGGGGTCATA 380380 33 FPPVS_3-RFPPVS_3-R TGCCATACTCTTGTGGGCATTGCCATACTCTTGTGGGCAT 44 PVX PVX FPPVX_CG_G1_1-FFPPVX_CG_G1_1-F CACAGGCTGCTTGGGACTTACACAGGCTGCTTGGGACTTA 200200 55 FPPVX_CG_G1_1-RFPPVX_CG_G1_1-R TCAGGCTTGAAACCTTGTGC TCAGGCTTGAAACCTTGTGC 66 PVY PVY FPPVY_8 -FFPPVY_8 -F ACACAATCGATGCAGGAGGA ACACAATCGATGCAGGAGGA 480480 77 FPPVY_8 -RFPPVY_8 -R GAAATGTGCCATGATTTGCC GAAATGTGCCATGATTTGCC 88 TMV-U1, TMV-KOR TMV-U1, TMV-KOR FPTMV_1 FFPTMV_1 F GGACGTTCGAGACATCATGC GGACGTTCGAGACATCATGC 110110 99 FPTMV_1 RFPTMV_1 R GCTTCCTTTTGGAAGTTGGG GCTTCCTTTTGGAAGTTGGG 1010 TRVTRV FPTRV_2-FFPTRV_2-F TGTTGTGGCCGTAGTCACCT TGTTGTGGCCGTAGTCACCT 320320 1111 FPTRV_2-RFPTRV_2-R ACAAACAAAGTCCGTTCCCC ACAAACAAAGTCCGTTCCCC 1212 PMTVPMTV FPPMTV28-FFPPMTV28-F ATGCCACTAGCGTGTTGAGCATGCCACTAGCGTGTTGAGC 220220 1313 FPPMTV28-RFPPMTV28-R ACCTCTGCGAGTTGATGTGCACCTCTGCGAGTTGATGTGC 1414

<< 실시예Example 4> 4>

본 발명의 프라이머 쌍을 이용한 가지과 바이러스 검출Eggplant Virus Detection Using Primer Pairs of the Invention

나아가 본 발명자들은 상기 실시예 3을 통해 8종의 가지과 바이러스를 검출할 수 있는 바이러스 특이 프라이머 조합을 사용하여 실제 가지과 작물에 감염된 바이러스를 종별 검출가능한지 확인하기 위해, 상기 바이러스들에 감염된 고추 개체 16개를 선별하여 PCR 분석으로 병 발생 여부를 진단하였다. 이를 위해 상기 표 2의 프라이머 조합을 모두 사용하였는데, 상기 프라이머 8개 세트를 Speed Vac. 기기를 사용하여 30분간 농축시킨 다음, 이것을 시중에 판매되고 있는 Premixture와 함께 혼합한 다음, PCR 반응으로서 94℃에서 5분간 변성, 94℃에서 30초, 55℃에서 30초, 72℃에서 50초를 한 사이클로 하여 총 35회 사이클을 반복 실시한 후, 72℃에서 7분간 반응시켜 합성하였다.
Furthermore, the present inventors used 16 virus peppers infected with the viruses in order to check whether the virus infected with the actual eggplant crops could be detected by using a combination of eight virus-specific primers capable of detecting 8 kinds of eggplant viruses through Example 3. Was screened to diagnose the disease by PCR analysis. To this end, all of the primer combinations shown in Table 2 were used. The eight sets of primers were used in Speed Vac. Concentrate using the instrument for 30 minutes, then mix it with commercially available Premixture, and then denature for 5 minutes at 94 ° C, 30 seconds at 94 ° C, 30 seconds at 55 ° C, 50 seconds at 72 ° C as a PCR reaction. After repeating a total of 35 cycles in a cycle, it was synthesized by reacting for 7 minutes at 72 ℃.

그 결과, 도 9에 나타낸 바와 같이, 본 발명에서 규명한 프라이머 조합을 사용하여 단 한번의 PCR 방법을 통해 8종의 가지과 바이러스의 감염 여부를 신속하고 정확하게 검출할 수 있다는 것을 알 수 있었다.As a result, as shown in Figure 9, using the primer combination identified in the present invention it can be seen that it is possible to quickly and accurately detect the infection of eight kinds of branches and viruses through a single PCR method.

이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.So far I looked at the center of the preferred embodiment for the present invention. It will be understood by those skilled in the art that various changes in form and details may be made therein without departing from the spirit and scope of the invention as defined by the appended claims. Therefore, the disclosed embodiments should be considered in an illustrative rather than a restrictive sense. The scope of the present invention is defined by the appended claims rather than by the foregoing description, and all differences within the scope of equivalents thereof should be construed as being included in the present invention.

<110> FNP, inc. <120> PCR Primers For Detecting Viruses Occurring on Solanaceae and Method for Detceting Solanaceae Viruses <130> NP11-1329 <160> 14 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FPPLRV_8-F primer <400> 1 aaccaagaag gcgaagaagg 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FPPLRV_8-R primer <400> 2 tgaatgccgg acagtctgat 20 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FPPVS_3-F primer <400> 3 aacacgttgc aggggtcata 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FPPVS_3-R primer <400> 4 tgccatactc ttgtgggcat 20 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FPPVX_CG_G1_1-F primer <400> 5 cacaggctgc ttgggactta 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FPPVX_CG_G1_1-R primer <400> 6 tcaggcttga aaccttgtgc 20 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FPPVY_8 -F primer <400> 7 acacaatcga tgcaggagga 20 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FPPVY_8 -R primer <400> 8 gaaatgtgcc atgatttgcc 20 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FPTMV_1 F primer <400> 9 ggacgttcga gacatcatgc 20 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FPTMV_1 R primer <400> 10 gcttcctttt ggaagttggg 20 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FPTRV_2-F primer <400> 11 tgttgtggcc gtagtcacct 20 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FPTRV_2-R primer <400> 12 acaaacaaag tccgttcccc 20 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FPPMTV28-F primer <400> 13 atgccactag cgtgttgagc 20 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FPPMTV28-R primer <400> 14 acctctgcga gttgatgtgc 20 <110> FNP, inc. <120> PCR Primers For Detecting Viruses Occurring on Solanaceae and          Method for Detceting Solanaceae Viruses <130> NP11-1329 <160> 14 <170> Kopatentin 2.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FPPLRV_8-F primer <400> 1 aaccaagaag gcgaagaagg 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FPPLRV_8-R primer <400> 2 tgaatgccgg acagtctgat 20 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FPPVS_3-F primer <400> 3 aacacgttgc aggggtcata 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FPPVS_3-R primer <400> 4 tgccatactc ttgtgggcat 20 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FPPVX_CG_G1_1-F primer <400> 5 cacaggctgc ttgggactta 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FPPVX_CG_G1_1-R primer <400> 6 tcaggcttga aaccttgtgc 20 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FPPVY_8 -F primer <400> 7 acacaatcga tgcaggagga 20 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FPPVY_8 -R primer <400> 8 gaaatgtgcc atgatttgcc 20 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FPTMV_1 F primer <400> 9 ggacgttcga gacatcatgc 20 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FPTMV_1 R primer <400> 10 gcttcctttt ggaagttggg 20 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> 223 FPTRV_2-F primer <400> 11 tgttgtggcc gtagtcacct 20 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FPTRV_2-R primer <400> 12 acaaacaaag tccgttcccc 20 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FPPMTV28-F primer <400> 13 atgccactag cgtgttgagc 20 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FPPMTV28-R primer <400> 14 acctctgcga gttgatgtgc 20

Claims (6)

PLRV(potato leafroll virus), PVS(potato virus S), PVX(potato virus X), PVY(potato virus Y), TMV(tobacco mosaic virus)-U1, TMV(tobacco mosaic virus)-KOR, TRV(tobacco rattle virus) 및 PMTV(potato mop-top virus)의 8종 바이러스를 동시에 진단할 수 있는 프라이머 조합으로서, 서열번호 1 및 2로 이루어진 프라이머 쌍; 서열번호 3 및 4로 이루어진 프라이머 쌍; 서열번호 5 및 6으로 이루어진 프라이머 쌍; 서열번호 7 및 8로 이루어진 프라이머 쌍; 서열번호 9 및 10으로 이루어진 프라이머 쌍; 서열번호 11 및 12로 이루어진 프라이머 쌍; 및 서열번호 13 및 14로 이루어진 프라이머 쌍을 포함하는 가지과 작물에 발생하는 8종 바이러스 검출용 프라이머 세트. Potato leafroll virus (PLRV), potato virus S (PVS), potato virus X (PVX), potato virus Y (PVY), tobacco mosaic virus (UTM) -U1, tobacco mosaic virus (KV) -KOR, tobacco rattle (TRV) A primer combination capable of simultaneously diagnosing eight viruses of virus) and PMTV (potato mop-top virus), comprising: a primer pair consisting of SEQ ID NOs: 1 and 2; Primer pairs consisting of SEQ ID NOs: 3 and 4; Primer pairs consisting of SEQ ID NOs: 5 and 6; Primer pairs consisting of SEQ ID NOs: 7 and 8; Primer pairs consisting of SEQ ID NOs: 9 and 10; Primer pairs consisting of SEQ ID NOs: 11 and 12; And primer sets for detecting 8 kinds of viruses occurring in branches and crops comprising primer pairs consisting of SEQ ID NOs: 13 and 14. 제1항에 있어서,
상기 서열번호 1 및 2의 프라이머 쌍은 PLRV(potato leafroll virus)를 특이적으로 검출하고,
상기 서열번호 3 및 4의 프라이머 쌍은 PVS(potato virus S)를 특이적으로 검출하고,
상기 서열번호 5 및 6의 프라이머 쌍은 PVX(potato virus X)를 특이적으로 검출하고,
상기 서열번호 7 및 8의 프라이머 쌍은 PVY(potato virus Y)를 특이적으로 검출하고,
상기 서열번호 9 및 10의 프라이머 쌍은 TMV(tobacco mosaic virus)-U1과 TMV(tobacco mosaic virus)-KOR을 특이적으로 검출하고,
상기 서열번호 11 및 12의 프라이머 쌍은 TRV(tobacco rattle virus)를 특이적으로 검출하고,
상기 서열번호 13 및 14의 프라이머 쌍은 PMTV(potato mop-top virus)를 특이적으로 검출하는 것을 특징으로 하는 가지과 작물에 발생하는 8종 바이러스 검출용 프라이머 세트.The method of claim 1,
The primer pairs of SEQ ID NO: 1 and 2 specifically detects PLRV (potato leafroll virus),
The primer pairs of SEQ ID NO: 3 and 4 specifically detects PVS (potato virus S),
The primer pairs of SEQ ID NO: 5 and 6 specifically detects PVX (potato virus X),
The primer pairs of SEQ ID NO: 7 and 8 specifically detects PVY (potato virus Y),
The primer pairs of SEQ ID NOs: 9 and 10 specifically detect TMAC (tobacco mosaic virus) -U1 and TMV (tobacco mosaic virus) -KOR,
The primer pairs of SEQ ID NOs: 11 and 12 specifically detect TRV (tobacco rattle virus),
The primer pairs of SEQ ID NOs: 13 and 14 are eight sets of primers for detecting viruses that occur in eggplant crops, characterized in that they specifically detect PMTV (potato mop-top virus). 제1항에 있어서,
상기 가지과 작물은 파프리카, 고추, 감자, 담배, 토마토 또는 피튜니아인 것을 특징으로 하는 가지과 작물에 발생하는 8종 바이러스 검출용 프라이머 세트. The method of claim 1,
The eggplant crop is a paprika, pepper, potato, tobacco, tomato or petunia 8 sets of primers for detecting the virus occurring in the eggplant crop, characterized in that. 제1항의 프라이머 세트를 포함하는 가지과 작물에 발생하는 8종 바이러스 검출용 키트.8 kinds of virus detection kits that occur in eggplant crops comprising the primer set of claim 1. 제1항의 프라이머 세트를 이용하여 PCR을 수행하는 단계를 포함하는, 가지과 작물에 발생하는 8종 바이러스인 PLRV(potato leafroll virus), PVS(potato virus S), PVX(potato virus X), PVY(potato virus Y), TMV(tobacco mosaic virus)-U1, TMV(tobacco mosaic virus)-KOR, TRV(tobacco rattle virus) 및 PMTV(potato mop-top virus)를 동시에 검출하는 방법.Eight kinds of viruses that occur in eggplant crops, including the step of performing PCR using the primer set of claim 1, PLRV (potato leafroll virus), PVS (potato virus S), PVX (potato virus X), PVY (potato) virus Y), tobacco mosaic virus (TMV) -U1, tobacco mosaic virus (TMV) -KOR, tobacco rattle virus (TRV) and potato mop-top virus (PMTV). 제5항에 있어서,
상기 PCR은 미지의 바이러스 게놈을 주형으로 하여, 94℃에서 3~5분간 변성반응 시킨 후, 94℃에서 30초~50초, 55℃에서 30초~50초 및 72℃에서 45초~50초를 한 사이클로 하여 30회~35회 사이클을 반복 실시한 다음, 72℃에서 7분간 연장 반응을 수행하는 한번의 PCR 반응으로 가지과 작물에 발생하는 8종 바이러스인 PLRV(potato leafroll virus), PVS(potato virus S), PVX(potato virus X), PVY(potato virus Y), TMV(tobacco mosaic virus)-U1, TMV(tobacco mosaic virus)-KOR, TRV(tobacco rattle virus) 및 PMTV(potato mop-top virus)를 동시에 검출하는 방법. The method of claim 5,
The PCR is based on an unknown viral genome as a template, after denaturation at 94 ° C. for 3 to 5 minutes, 30 seconds to 50 seconds at 94 ° C., 30 seconds to 50 seconds at 55 ° C. and 45 seconds to 50 seconds at 72 ° C. After repeated cycles of 30 to 35 cycles in one cycle, eight PCR viruses, PLRV (potato leafroll virus) and PVS (potato virus), which occur in eggplant crops in a single PCR reaction, which is performed at 72 ° C. for 7 minutes. S), potato virus X (PVX), potato virus Y (PVY), tobacco mosaic virus (TMV) -U1, tobacco mosaic virus (TMV) -KOR, tobacco rattle virus (TRV), and potato mop-top virus (PMTV) To detect them simultaneously.
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