KR20130108853A - 차나무 뿌리에서 추출한 트리테르페노이드 사포닌을 함유하는 조성물 - Google Patents

차나무 뿌리에서 추출한 트리테르페노이드 사포닌을 함유하는 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 차나무 뿌리에서 추출한 트리테르페노이드 사포닌을 함유하는 조성물에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 차나무 뿌리의 메탄올 추출물에서 분리한 트리테르페노이드 사포닌을 함유함으로써 당뇨, 비만, 고혈압 등의 치료 또는 예방 효과를 제공할 수 있어 식품 및 의약 분야에서 다양하게 활용 가능한 건식 조성물에 관한 것이다.

Description

차나무 뿌리에서 추출한 트리테르페노이드 사포닌을 함유하는 조성물{Composition containing triterpenoid saponin extracted from the root of Camellia sinensis}
본 발명은 차나무 뿌리에서 추출한 트리테르페노이드 사포닌을 함유하는 조성물에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 차나무 뿌리의 메탄올 추출물에서 분리한 트리테르페노이드 사포닌을 함유함으로써 당뇨, 비만, 고혈압 등의 치료 또는 예방 효과를 제공할 수 있는 건식 조성물에 관한 것이다.
녹차는 차나무(Camellia sinensis)의 잎을 사용하는 것으로, 의학적 음료 및 건강 음료로서 소비되고 있으며, 녹차의 의학적인 효과는 주로 녹차의 플라보노이드계 성분에 기인한 것이다. 녹차 잎에서 추출한 다수의 트리테르페노이드 사포닌은 고미질(bitter principle)로서 보고되어 있으며, 트리테르페노이드 사포닌은 녹차의 다른 부분, 즉 씨, 꽃봉오리, 뿌리 등에서도 추출가능하다.
한편, 생활양식의 변화 및 식생활의 서구화로 인하여 비만과 함께 고지혈증, 고혈압, 동맥경화와 같은 체내 지질축적에서 오는 현대인의 성인병 문제는 심각하며, 비만은 주로 고지방, 고단백 식품을 과식해서 오는 경우가 매우 많다. 특히, 체중과다는 절제된 식이요법이 요구되나, 이를 실생활에서 실천하는 데는 많은 어려움이 있는 것도 사실이다. 또한, 약간의 체중감량이 되었더라도 요요현상 등으로 인해 다시 체중이 증가할 위험성이 높다. 따라서, 체중의 유지 내지 감량을 위해서는 오랜 시간에 걸쳐 꾸준한 노력과 주의가 필요하다.
체중조절을 위해서는, 적당한 약물치료와 건신운동(建身運動)을 통하여 살을 빼고 병을 치료하는 감비 요법이 필요하다. 감비는 비대한 사람이나 몸매를 늘씬하게 가꾸고 싶은 여성들의 미용을 위한 체중감량 또는 체중감량을 위한 식이요법이나 식사조절을 말한다. 하지만, 많은 사람들이 단시간에 체중감량 효과를 보기 위하여, 신체 특정부위의 지방을 흡입하는 외과적 치료를 받거나 한약 또는 양약 복용으로 인해 부작용이 일어나는 경우도 자주 볼 수 있다.
비만환자의 대부분은 원인 발생 후 치료를 위주로 하기 때문에, 이미 비만증에 의한 합병증이 유발된 이후인 경우가 많다. 또한, 증세에 따른 치료효과도 남녀노소 또는 개개인에 따라 차이가 있기 때문에, 오늘날 현대인에게는 예방과 치료를 겸한 감비제의 개발이 더욱 절실하다.
이에 본 발명자들은 차나무 뿌리의 메탄올 추출물에서 분리한 트리테르페노이드 사포닌이 신체의 전반적인 건강상태를 향상시킬 수 있는 다양한 효능이 있음을 발견하고 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서, 본 발명은 당뇨, 비만, 고혈압 등의 치료 또는 예방 효과를 제공할 수 있는 건식 조성물에 관한 것이다.
상기한 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 차나무 뿌리의 메탄올 추출물에서 분리한 트리테르페노이드 사포닌을 유효성분으로 함유하는 당뇨의 예방 및 개선용, 심혈관계 질환의 예방 및 개선용, 동맥경화의 예방 및 개선용, 고혈압의 예방 및 개선용, 비만의 예방 및 개선용 조성물을 제공한다.
본 발명의 조성물은 차나무 뿌리의 메탄올 추출물에서 분리한 트리테르페노이드 사포닌을 유효성분으로 함유함으로써 당뇨, 비만, 고혈압 등의 치료 및 예방 효과를 제공할 수 있으며, 이를 식품 및 의약 분야에서 다양하게 활용할 수 있다.
도 1은 녹차포닌 R1 내지 R10의 지방분해 효능을 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 2는 녹차포닌 R1 내지 R10의 투여에 따른 체중 변화를 나타낸 그래프이다.
도 3은 녹차포닌 R1 내지 R10의 투여에 따른 지방분해 촉진 효과를 나타낸 그래프이다.
도 4는 은 녹차포닌 R1 내지 R10의 투여에 따른 간조직 내 CPT-1 발현 증가 효과를 나타낸 그래프이다.
본 발명에 의한 조성물은 차나무(Camellia sinensis) 뿌리의 메탄올 추출물에서 분리한 트리테르페노이드 사포닌을 유효성분으로 함유한다.
본 발명에서 사용되는 트리테르페노이드 사포닌은 차나무 뿌리의 메탄올 추출물에서 분리한 10종류의 사포닌이며, 본 발명에서는 이를 각각 ‘녹차포닌(rogchaponin) R1 내지 R10’으로 지칭한다. 이들 녹차포닌 R1 내지 R10은 하기 화학식 1 내지 10의 구조를 가진다.
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본 발명의 조성물은 상기 녹차포닌(rogchaponin) R1 내지 R10에 해당하는 트리테르페노이드 사포닌을 조성물 총 중량에 대하여 0.01~20중량%의 양으로 함유하는 것이 바람직하다. 이는 상기 유효성분의 함량이 0.01중량% 미만이 경우에는 유효한 효능을 기대하기 어려우며, 20중량%를 초과할 경우에는 제형화 및 섭취 편의성에 문제가 있다.
본 발명의 조성물은 체중조절, 혈당 강하 및 혈중 콜레스테롤 강하 효능이 있어 고혈압, 동맥경화, 뇌졸증, 뇌출혈, 협심증, 심근경색 등의 심혈관계 질환, 당뇨, 비만, 고지혈증 등의 질환의 예방 및 증상의 완화 또는 치료에 효과가 있으며, 또한 면역력을 증진시키는데에도 효과적이다.
또한, 본 발명의 조성물은 혈소판 응집을 억제하여 혈전생성 방지, 혈관수축 억제 및/또는 콜레스테롤 억제 효능이 있어 혈관 질환의 예방, 증강의 경감 또는 치료에 효과적이다. 구체적으로 본 발명의 조성물은 항혈전 효능에 기인하는 혈액 순환 개선용일 수 있으며, 비만, 당뇨 및 고지혈증 등을 포함하는 혈관 질환의 예방, 증상의 완화 또는 치료에 효과적이다. 상기 혈관 질환은 예를 들어 비만, 당뇨, 뇌졸증, 뇌출혈, 동맥경화, 협심증, 심근경색, 고혈압, 빈혈, 편두통 또는 고지혈증 등을 포함한다.
또한 본 발명의 조성물은 면역력을 높이는데 효과가 있다.
또한 본 발명의 조성물은 피로 회복에 도움을 줄 수 있으며, 정신적 피로 회복 또는 육체적 피로 회복에 뛰어난 효과가 있다.
또한 본 발명의 조성물은 기억력, 집중력 또는 인지능력을 향상시켜 학습 능력을 증진시키는데 도움을 줄 수 있다.
본 발명에 의한 조성물은 그 제형이 특별히 제한되지 않으나, 예를 들어 약학 조성물 또는 건강식품 조성물일 수 있다.
본 발명에 따른 약학 조성물은 경구, 비경구, 직장, 국소, 경피, 정맥 내, 근육 내, 복강 내, 피하 등으로 투여될 수 있으며, 녹차포닌 R1 내지 R10의 트리테르페노이드 사포닌을 유효성분으로 하여 사용되는 무기 또는 유기의 담체를 가하여 고체, 반고체 또는 액상의 형태로 경구 투여제 혹은 비경구 투여제로 제형화할 수 있다.
본 발명에 의한 약학 조성물이 경구 투여될 경우에는 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 환제, 캡슐제, 세립제, 분제, 펠렛제, 현탁액, 에멀젼, 시럽 등의 경구형 제형 등의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 또한 본 발명의 조성물이 비경구로 투여될 경우에는 주사제, 점적제, 연고, 로션, 스프레이, 현탁제, 유제, 좌제 등의 형태로 제형화할 수 있다. 본 발명의 유효성분은 통상적인 방법에 따라서 용이하게 제형화할 수 있으며, 계면활성제, 부형제, 착색료, 향신료, 보존료, 안정제, 완충제, 현탁제, 기타 사용하는 보조제를 적당히 사용할 수 있다.
또한, 상기 조성물은 필요에 따라서 하기의 첨가제의 1종 또는 2종 이상을 첨가 배합할 수 있다. 첨가제로는, 예를 들어 그레이프프루트, 사과, 오렌지, 레몬, 파인애플, 바나나, 배 등의 가종 과즙(농축 과즙, 분말 과즙 등이어도 좋다); 비타민류(팔미트산 레티놀, 리보플라빈, 피리독신, 시아노코발아민(cyanocobalamine), 아스코르빈산 나트륨, 니코틴산 아미드, 판토텐산 칼슘, 엽산, 비오틴, 콜레칼시페롤(cholecalciferol), 중주석산 콜린, 토코페롤 또는 β-카로틴 등의 수용성 및 지용성 비타민류); 향미료(레몬플레이버, 오렌지플레이버, 딸기플레이버, 그레이프프루트플레이버 또는 바닐라 에센스 등); 아미노산, 핵산 및 그들의 염류(글루탐산, 글루탐산나트륨, 글리신, 알라닌, 아스파라긴산, 아스파라긴산 나트륨, 이노신산 등); 식물 섬유(폴리덱스트로오스, 펙틴, 크산탄 고무, 글루코만난 또는 알긴산 등); 또는 미네랄류(염화나트륨, 초산나트륨, 황산마그네슘, 염화칼륨, 염화마그네슘, 탄산마그네슘, 염화칼슘, 인산 2칼륨, 인산 1나트륨, 글리세로인산칼슘, 구연산제1철나트륨, 구연산철암모늄, 구연산철, 황산망간, 황산구리, 요오드화나트륨, 솔빈산칼륨, 아연, 망간, 구리, 요오드 또는 코발트 등) 등이 포함될 수 있다.
상기 조성물에는 방부제, 안정화제, 수화제 또는 유화 촉진제, 삼투압 조절을 위한 염 및/또는 완충제 등의 약제학적 보조제 및 기타 치료적으로 유용한 물질을 추가로 함유할 수 있으며, 통상적인 방법에 따라 다양한 경구 형태로 제형화할 수 있다.
경구 투여용 제형으로는, 예를 들면 정제, 환제, 경질 및 연질 캅셀제, 액제, 현탁제, 유화제, 시럽제, 과립제 등이 있는데, 이들 제형은 유효성분 이외에 희서제(예: 락토오스, 덱스트로오스, 수크로오스, 만니톨, 솔비톨, 셀룰로오스 및 글리신), 활택제(예: 실리카, 탈크, 스테아르산 및 그의 마그네슘 또는 칼슘염 및 폴리에틸렌 글리콜)를 함유하고 있다. 정제는 마그네슘 알루미늄 실리케이트, 전분페이스트, 젤라틴, 트라가칸스, 메틸셀룰로오스, 나트륨 카복시메틸셀룰로오스 및 폴리비닐피롤리딘과 같은 결합제를 더 함유할 수 있으며, 경우에 따라 전분, 한천, 알긴산 또는 그의 나트륨 염과 같은 붕해제, 흡수제, 착색제, 향미제, 및 감미제 등의 약제학적 첨가제를 함유할 수 있다. 정제는 통상적인 혼합, 과립화 또는 코팅 방법에 의해 제조될 수 있다.
또한 본 발명에 의한 조성물이 건강식품 조성물인 경우에는, 예를 들어 각종 식품류, 음료, 껌, 차 비타민 복합제, 건강 기능성 식품류 및 다양한 식품 첨가제의 형태 등으로 제형화될 수 있다. 본 발명에서 사용하는 녹차포닌 R1 내지 R10의 트리테르페노이드 사포닌은 독성 및 부작용이 거의 없으므로 예방 목적으로 장기간 복용시에도 안심하고 사용할 수 있다.
본 발명의 건강식품 조성물은 지시된 비율로 필수 성분으로서 녹차포닌 R1 내지 R10의 트리테르페노이드 사포닌을 함유하는 외에는 다른 성분에 특별한 제한이 없으며, 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토오스, 수크로오스 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당, 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 상술한 것 이외의 향미제로서 천연 향미제(타우마틴, 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등)) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 이에 한정되는 것은 아니지만, 본 발명의 조성물 100ml 당 일반적으로 약 1~20g, 바람직하게는 약 5~12g이다.
또한, 본 발명의 건강식품 조성물은 본 발명이 목적으로 하는 주 효과를 손상시키지 않는 범위 내에서 주 효과에 상승 효과를 줄 수 있는 다른 성분 등을 함유할 수 있다. 예를 들어, 물성 개선을 위하여 향료, 색소, 살균제, 산화방지제, 방부제, 보습제, 점증제, 무기염류, 유화제 및 합성 고분자 물질 등의 첨가제를 더 포함할 수 있다. 그 외에도, 수용성 비타민, 유용성 비타민, 고분자 펩티드, 고분자 다당 및 해초 엑기스 등의 보조 성분을 더 포함할 수도 있다. 상기 성분들은 제형 또는 사용 목적에 따라서 당업자가 어려움 없이 적의 선정하여 배합할 수 있으며, 그 첨가량은 본 발명의 목적 및 효과를 손상시키지 않는 범위 내에서 선택될 수 있다. 예를 들어, 상기 성분들의 첨가량은 조성물 총 중량에 대하여 0.01~5중량%, 보다 구체적으로는 0.01~3중량%의 범위일 수 있다.
상기 외에 본 발명의 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 알코올 또는 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그 밖에 본 발명의 조성물은 천연 과일 주스 및 과일 주스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 그렇게 중요하진 않지만 본 발명의 조성물 총 중량에 대하여 0~20중량%의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.
이하, 하기 실시예에 의하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하고자 한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐 본 발명의 범위가 이들만으로 한정되는 것은 아니다
[참고예 1] 녹차포닌의 분리
차나무의 뿌리는 2005년 11월에 제주도 서귀포시 남원읍 한남리에서 수집하였으며, 차나무는 야부기다(Yabukita) 품종으로 20년 된 것을 선택하였다.
신선한 차나무 뿌리 10kg을 작은 조각으로 자르고 80%의 수성 MeOH 8L에 담그어 2일 동안 실온에 두었고, 이러한 추출 방법을 2번 반복하였다. 추출물을 합하고, 진공 하에서 농축시켜 고무질의 갈색 잔여물 540g을 수득하였다. 잔여물 100g을 C18 실리카겔 플래시 컬럼(flash column)에서 용리액으로 H2O(각각 4L) 내의 MeOH를 0 내지 100%로 10%씩 증가시킨 것을 사용하여 크로마노크래피로 분리하고 11개의 분획물(A 내지 K)을 얻었다. 이 중 활성인 분획물 G(4g) 및 H(10g)를 합하고, 실리카겔 컬러에서 다시 크로마토그래피를 실시하여 8개의 분획물(GH1 내지 GH8)을 얻었다.
분획물 중 효소 억제 사포닌 분획물인 GH5(1.02g)를 C18 HPLC(용리액; 50~60% 수성 MeCN)로 정제하여 9개의 사포닌인 1(108mg, tR 19.9분), 2(92mg, tR 20.9분), 3(37mg, tR 23.3분), 4(60mg, tR 32.7분), 5(161mg, tR 35.7분), 6(113mg, tR 37.8분), 7(48mg, tR 39.4분), 8(33mg, tR 41.9분), 및 9(56mg, tR 47.9분)를 획득하였다. 또한 C18 HPLC에서 용리액으로 40~49% 수성 MeCN을 사용하여 분석 샘플 1~3을, 용리액 70~80% 수성 MeOH를 사용하여 샘플 4~8을 수득하였다(각각 49mg, 32mg, 12mg, 16mg, 71mg, 20mg, 12mg, 및 9mg). 상기 분획물 9는 HPLC로 용리액 55~60% 수성 MeCN을 사용하여 추가 정제하였고, 분석 샘플 9(26mg, tR 43.3분) 및 10(8mg, tR 62.7분)를 수득하였다.
분리된 10종의 트리테르페노이드 사포닌을 각각 ‘녹차포닌(rogchaponin) R1 내지 R10’으로 지칭하며, 이에 대한 구체적인 분석 결과는 다음과 같다.
녹차포닌 R1: 백색 고체; 녹는점 228 - 229℃; [α]20 D : - 28.83 (c 0.43, MeOH); IR (neat): νmax = 3406, 1738, 1714, 1447, 1249, 1039 cm-1; 1H-NMR (400 MHz, CD3OD): δ = 0.69 (3H, s, H-24) , 0.87 (3H, t, J = 7.2 Hz, 2MB-H-4), 0.89 (3H, s, H-29), 1.00 (5H, 3H,s, H-25 and 2H, m, H-6), 1.01 (3H, s, H-26), 1.02 (1H, m, Ha-1), 1.03 (3H, d, J = 7.2 Hz, 2MB-H-5), 1.05 (3H, s, H-30), 1.07 (1H, m, Ha-7), 1.26 (1H, t, J = 10.4 Hz, H-5), 1.35 (1H, dd, J = 13.2, 5.2 Hz, Ha-19), 1.38 (1H, m, 2MB-Ha-3), 1.48 (1H, m, Hb-7), 1.50 (3H, s, H-27), 1.56 (1H, m, 2MB-Hb-3), 1.64 (2H, m, Hb-1, H-9), 1.74 (1H, m, Ha-2), 1.84 (1H, m, Hb-2), 1.91 (3H, s, Ac), 1.96 (3H, s, Ac), 1.98 (2H, m, H-11), 2.23 (1H, m, 2MB-H-2), 2.25 (3H, s, Ac), 2.47 (1H, t, J = 14.2 Hz, Hb-19), 2.77 (1H, dd, J = 14.0, 4.0 Hz, H-18), 3.10 (1H, d, J = 11.2 Hz, Ha-28), 3.26 (1H, d, J = 11.2 Hz, Ha-23), 3.36 (1H, d, J = 11.2 Hz, Hb-28), 3.42 (1H, t J = 8.0, Hz, GlcA-H-2), 3.54 (2H, m, GlcA-H-3 & Ara-H-3), 3.57 (1H, m, GlcA-H-4), 3.58 (1H, m, Ara-Ha-5), 3.60 (1H, d, J = 11.2 Hz, Hb-23), 3.62 (1H, m, Ara-H-2), 3.63 (1H, m, H-3), 3.80 (1H, m, Ara-H-4), 3.82 (1H, m, GlcA-H-5), 3.90 (1H, m, Ara-Hb-5), 4.51 (2H, d, J = 7.2 Hz, GlcA-H-1, Ara-H-1), 5.16 (1H, d, J = 4.8 Hz, H-15), 5.29 (1H, d, J = 4.8 Hz, H-16), 5.30 (1H, d, J = 10.0 Hz, H-21), 5.52 (1H, d, J = 10.0 Hz, H-22), 5.59 (1H, brs, H-12); HR-TOF-ESI-MS: m/z = 1041.5258 [M + H]+ (calcd. for C52H80O21 + H: 1041.5270).
녹차포닌 R2: 백색 고체; 녹는점 229 - 230℃; [α] 20 D : - 37.61 (c 0.545, MeOH); IR (neat): νmax = 3314,, 1727, 1444, 1248, 1038 cm-1; 1H-NMR (400 MHz, CD3OD): δ = 0.69 (3H, s, H-24), 0.91 (3H, s, H-29), 1.00 (3H, s, H-25), 1.01 (3H, s, H-26), 1.08 (3H, s, H-30), 1.26 (1H, m, Ha-19), 1.50 (3H, s, H-27), 1.71 (3H, s, Ang-H-5), 1.90 (3H, s, Ac), 1.91 (3H, d, J = 7.6 Hz , Ang-H-4), 1.93 (3H, s, Ac), 2.24 (3H, s, Ac), 2.50 (1H, t, J = 14.0, Hb-19), 2.78 (1H, dd, J = 14.4, 4.0 Hz, H-18), 3.14 (1H, d, J = 10.8 Hz, Ha-28), 3.26 (1H, d, J = 10.8 Hz, Ha-23), 3.39 (1H, d, J = 10.0 Hz, Hb-28), 3.60 (1H, d, J = 10.8 Hz, Hb-23), 3.63 (1H, m, H-3), 4.50 (2H, d, J = 7.2 Hz, GlcA-H-1, Ara-H-1), 5.18 (1H, d, J = 4.4 Hz, H-15), 5.28 (1H, d, J = 4.0 Hz, H-16), 5.38 (1H, d, J = 10.8 Hz, H-21), 5.60 (1H, brs, H-12), 5.61 (1H, d, J = 10.8 Hz, H-22), 6.08 (1H, q, J = 7.6 Hz, Ang-H-3); HR-TOF-ESI-MS: m/z = 1039.5142 [M + H]+ (calcd. for C52H78O21 + H: 1039.5114).
녹차포닌 R3: 백색 고체; 녹는점 233 - 234℃; [α] 20 D : - 28.84 (c 0.208, MeOH); IR (neat): νmax = 3415, 1726, 1368, 1249, 1023 cm-1; 1H-NMR (400 MHz, CD3OD): δ = 0.70 (3H, s, H-24), 0.91 (3H, s, H-29), 0.95 (3H, s, H-26), 1.01 (3H, s, H-25), 1.08 (3H, s, H-30), 1.35 (3H, s, H-27), 1.50 (1H, m, Ha-15), 1.74 (3H, s, Ang-H-4), 1.80 (1H, m, Hb-15), 1.90 (3H, s, Ac), 1.93 (3H, d, J = 7.6 Hz , Ang-H-5), 2.20 (3H, s, Ac), 2.66 (1H, dd, J = 14.4, 4.8 Hz, H-18), 3.10 (1H, d, J = 10.8 Hz, Ha-28), 3.27 (1H, d, J = 10.8 Hz, Ha-23), 3.29 (1H, d, J = 10.8 Hz, Hb-28), 3.60 (1H, d, J = 10.8 Hz, Hb-23), 3.64 (1H, m, H-3), 4.51 (2H, d, J = 7.2 Hz, GlcA-H-1, Ara-H-1), 5.10 (1H, brs, H-16), 5.46 (1H, brs, H-12), 5.50 (1H, d, J = 10.4 Hz, H-21), 5.58 (1H, d, J = 10.4 Hz, H-22), 6.08 (1H, q, J = 7.6 Hz, Ang-H-3); HR-TOF-ESI-MS: m/z = 981.5094 [M + H]+ (calcd. for C50H76O19 + H: 981.5059).
녹차포닌 R4: 백색 고체; 녹는점 227 - 228℃; [α] 20 D : - 12.56 (c 0.565, MeOH); IR (neat): νmax = 3421, 1718, 1370, 1257, 1041 cm-1; 1H-NMR (400 MHz, CD3OD): δ = 0.71 (3H, s, H-24), 0.88 (3H, s, H-29), 0.86 (3H, t, J = 8.4 Hz, 2MB-H-4), 0.98 (3H, d, J = 6.8 Hz, 2MB-H-5), 1.00 (3H, s, H-26), 1.02 (3H, s, H-25), 1.07 (3H, s, H-30), 1.38 (3H, s, H-27), 1.40 (1H, m, 2MB-Ha-3), 1.58 (1H, m, 2MB-Hb-3), 1.82 (3H, s, Ang-H-5), 1.96 (3H, d, J = 7.2 Hz, Ang-H-4), 2.22 (1H, m, 2MB-H-2), 2.32 (3H, s, Ac), 2.66 (1H, dd, J = 14.0, 4.0 Hz, H-18), 3.12 (1H, d, J = 10.8 Hz, Ha-28), 3.27 (1H, overlapped with solvent, Ha-23), 3.37 (1H, d, J = 10.8 Hz, Hb-28), 3.60 (1H, d, J = 10.4 Hz, Hb-23), 3.64 (1H, m, H-3), 3.99 (1H, d, J = 4.0 Hz, H-15), 4.51 (2H, d, J = 7.2 Hz, GlcA-H-1, Ara-H-1), 5.29 (1H, d, J = 4.0 Hz, H-16), 5.41 (1H, d, J = 10.4 Hz, H-21), 5.52 (1H, brs, H-12), 5.54 (1H, d, J = 10.4 Hz, H-22), 6.15 (1H, q, J = 6.8 Hz, Ang-H-3); HR-TOF-ESI-MS: m/z = 1039.5471 [M + H]+ (calcd. for C53H82O20 + H: 1039.5478).
녹차포닌 R5: 백색 고체; 녹는점 231 - 232℃; [α] 20 D : + 4.35 (c 0.46, MeOH); IR (neat): νmax = 3395, 1711, 1442, 1256, 1039 cm-1; 1H-NMR (400 MHz, CD3OD): δ = 0.85 (3H, s, H-29), 0.88 (3H, t, J = 7.2 Hz, 2MB-H-4), 1.01 (3H, s, H-25), 1.02 (3H, d, J = 6.0 Hz , 2MB-H-5), 1.04 (3H, s, H-26), 1.07 (3H, s, H-30), 1.13 (3H, s, H-24), 1.42 (1H, m, 2MB-Ha-3), 1.44 (3H, s, H-27), 1.60 (1H, m, 2MB-Hb-3), 1.85 (3H, s, Ang-H-5), 1.98 (3H, d, J = 6.8 Hz, Ang-H-4), 2.32 (1H, m, 2MB-H-2), 2.62 (1H, dd, J = 14.0, 4.0 Hz, H-18), 3.00 (1H, d, J = 10.4 Hz, Ha-28), 3.27 (1H, d, J = 10.8 Hz, Hb-28), 3.71 (1H, d, J = 4.0 Hz, H-15), 3.79 (1H, d, J = 4.8 Hz, H-16), 3.89 (1H, m, H-3), 4.32 (1H, d, J = 7.6 Hz, GlcA-H-1), 4.50 (1H , d, J = 6.4 Hz, Ara-H-1), 5.47 (1H, brs, H-12), 5.55 (1H, d, J = 10.4 Hz, H-22), 5.86 (1H, d, J = 10.4 Hz, H-21), 6.14 (1H, q, J = 7.2 Hz, Ang-H-3), 9.41 (1H, s, H-23); HR-TOF-ESI-MS: m/z = 995.5282 [M + H]+ (calcd. for C51H78O19 + H: 995.5216).
녹차포닌 R6: 백색 고체; 녹는점 229 - 230℃; [α] 20 D : - 9.56 (c 0.23, MeOH); IR (neat): νmax = 3424, 1728, 1538, 1456, 1229, 1070 cm-1; 1H-NMR (400 MHz, CD3OD): δ = 0.86 (3H, t, J = 6.4 Hz, 2MB-H-4), 0.92 (3H, s, H-29), 0.99 (3H, d, J = 7.2 Hz , 2MB-H-5), 1.02 (3H, s, H-25), 1.04 (3H, s, H-26), 1.07 (3H, s, H-30), 1.10 (3H, s, H-24), 1.36 (H, dd, J = 13.6, 4.0 Hz, 2MB-Ha-3), 1.57 (1H, dd, J = 13.6, 7.2 Hz, 2MB-Hb-3), 1.39 (3H, s, H-27), 1.84 (3H, s, Ang-H-5), 1.97 (3H, d, J = 7.2 Hz , Ang-H-4), 2.24 (1H, m, 2MB-H-2), 2.32 (3H, s, Ac), 2.64 (1H, dd, J = 14.4, 4.0 Hz, H-18), 3.12 (1H, d, J = 10.8 Hz, Ha-28), 3.34 (1H, d, J = 10.8 Hz, Hb-28), 3.90 (1H, dd, J = 8.8 & 2.8 Hz, H-3), 3.97 (1H, d, J = 4.8 Hz, H-15), 4.33 (1H, d, J = 7.6 Hz, GlcA-H-1), 4.49 (1H , d, J = 6.8 Hz, Ara-H-1), 5.28 (1H, d, J = 4.4 Hz, H-16), 5.41 (1H, d, J = 10.4 Hz, H-21), 5.54 (1H, d, J = 10.4 Hz, H-22), 5.55 (1H, brs, H-12), 6.16 (1H, q, J = 7.2 Hz, Ang-H-3), 9.40 (1H, s, H-23); HR-TOF-ESI-MS: m/z = 1037.5406 [M + H]+ (calcd. for C53H80O20 + H: 1037.5321).
녹차포닌 R7: 백색 고체; 녹는점 223 - 224℃; [α] 20 D : - 13.01 (c 0.315, MeOH); IR (neat): νmax = 3407, 1714, 1370, 1249, 1039 cm-1; 1H-NMR (400 MHz, CD3OD): δ = 0.86 (3H, t, J = 7.4 Hz, 2MB-H-4), 0.89 (3H, s, H-29), 0.98 (3H, s, H-25), 0.99 (3H, d, J = 7.2 Hz , 2MB-H-5), 1.00 (3H, s, H-26), 1.07 (3H, s, H-30), 1.16 (3H, s, H-24), 1.37 (3H, s, H-27), 1.38 (1H, m, 2MB-Ha-3), 1.56 (1H, m, 2MB-Hb-3), 1.82 (3H, s, Ang-H-5), 1.97 (3H, d, J = 7.2 Hz, Ang-H-4), 2.26 (1H, m, 2MB-H-2), 2.31 (3H, s, Ac), 2.66 (1H, dd, J = 14.8, 4.0 Hz, H-18), 3.12 (1H, d, J = 10.8 Hz, Ha-28), 3.34 (1H, d, J = 10.8 Hz, Hb-28), 3.68 (3H, s, 23-COOCH 3 ), 3.96 (1H, d, J = 4.8 Hz, H-15), 4.03 (1H, dd, J = 11.6, 4.4 Hz, H-3), 4.30 (1H, d, J = 8.0 Hz, GlcA-H-1), 4.50 (1H , d, J = 6.8 Hz, Ara-H-1), 5.28 (1H, d, J = 4.4 Hz, H-16), 5.41 (1H, d, J = 10.4 Hz, H-21), 5.54 (1H, brs, H-12), 5.54 (1H, d, J = 10.8 Hz, H-22), 6.16 (1H, q, J = 7.0 Hz, Ang-H-3); HR-TOF-ESI-MS: m/z = 1067.5492 [M + H]+ (calcd. for C54H82O21 + H: 1067.5427).
녹차포닌 R8: 백색 고체; 녹는점 231 - 232℃; [α] 20 D : - 8.62 (c 0.105, MeOH); IR (neat): νmax = 3411, 1722, 1441, 1242, 1073 cm-1; 1H-NMR (400 MHz, CD3OD): δ = 0.84 (3H, s, H-29), 0.85 (3H, s, H-24), 0.88 (3H, t, J = 7.2 Hz, 2MB-H-4), 0.98 (3H, s, H-25), 1.01 (3H, s, H-26), 1.02 (3H, d, J = 7.2 Hz , 2MB-H-5), 1.05 (3H, s, H-23), 1.07 (3H, s, H-30), 1.41 (3H, s, H-27), 1.42 (1H, m, 2MB-Ha-3), 1.60 (H, m, 2MB-Hb-3), 1.84 (3H, s, Ang-H-5), 1.98 (3H, d, J = 7.2 Hz, Ang-H-5), 2.30 (1H, m, 2MB-H-2), 2.62 (1H, m, H-18), 2.99 (1H, d, J = 10.0 Hz, Ha-28), 3.18 (1H, dd, J = 9.2, 5.2 Hz, H-3), 3.30 (1H, overlapped with solvent, Hb-28), 3.73 (1H, d, J = 4.0 Hz, H-15), 3.80 (1H, d, J = 4.0 Hz, H-16), 4.41 (1H, d, J = 7.2 Hz, GlcA-H-1), 4.53 (1H , d, J = 6.8 Hz, Ara-H-1), 5.47 (1H, brs, H-12), 5.55 (1H, d, J = 10.0 Hz, H-22), 5.86 (1H, d, J = 10.0 Hz, H-21), 6.16 (1H, q, J = 7.2 Hz, Ang-H-3); HR-TOF-ESI-MS: m/z = 981.5435 [M + H]+ (calcd. for C51H80O18 + H: 981.5423).
녹차포닌 R9: 백색 고체; 녹는점 232 - 233℃; [α] 20 D : - 24.15 (c 0.31, MeOH); IR (neat): νmax = 3443, 1724, 1459, 1234, 1072 cm-1; 1H-NMR (400 MHz, CD3OD): δ = 0.71 (3H, s, H-24), 0.84 (3H, t, J = 7.2 Hz, 2MB-H-4), 0.88 (3H, s, H-29), 0.95 (3H, s, H-26), 0.98 (3H, d, J = 6.8 Hz , 2MB-H-5), 1.01 (3H, s, H-25), 1.09 (3H, s, H-30), 1.32 (1H, m, 2MB-Ha-3), 1.37 (3H, s, H-27), 1.44 (1H, m, Ha-15), 1.57 (H, m, 2MB-Hb-3), 1.80 (1H, m, Hb-15), 1.83 (3H, s, Ang-H-5), 1.97 (3H, d, J = 7.2 Hz, Ang-H-4), 2.20 (1H, m, 2MB-H-2), 2.27 (3H, s, Ac), 2.66 (1H, dd, J = 14.0, 3.6 Hz, H-18), 3.08 (1H, d, J = 10.4 Hz, Ha-28), 3.29 (1H, overlapped with solvent, Ha-23), 3.32 (1H, overlapped with solvent, Hb-28), 3.60 (1H, d, J = 10.0 Hz, Hb-23), 3.63 (1H, m, H-3), 4.51 (2H, d, J = 7.2 Hz, GlcA-H-1, Ara-H-1), 5.15 (1H, brs, H-16), 5.45 (1H, brs, H-12), 5.54 (2H, s, H-21 and H-22), 6.16 (1H, q, J = 7.6 Hz, Ang-H-3); HR-TOF-ESI-MS: m/z = 1023.5556 [M + H]+ (calcd. for C53H82O19 + H: 1023.5529).
녹차포닌 R10: 백색 고체; 녹는점 232 - 233℃; [α] 20 D : - 22.06 (c 0.29, MeOH); IR (neat): νmax = 3433, 1720, 1458, 1229, 1072 cm-1; 1H-NMR (400 MHz, CD3OD): δ = 0.70 (3H, s, H-24), 0.85 (3H, t, J = 7.6 Hz, 2MB-H-4), 0.89 (3H, s, H-29), 0.95 (3H, s, H-26), 0.98 (3H, d, J = 6.8 Hz , 2MB-H-5), 1.01 (3H, s, H-25), 1.09 (3H, s, H-30), 1.36 (3H, s, H-27), 1.37 (1H, m, 2MB-Ha-3), 1.43 (1H, m, Ha -15), 1.55 (1H, m, 2MB-Hb-3), 1.81 (1H, m, Hb-15), 1.83 (3H, s, Ang-H-5), 1.96 (3H, d, J = 7.2 Hz, Ang-H-4), 2.22 (1H, m, 2MB-H-2), 2.27 (3H, s, Ac), 2.66 (1H, dd, J = 14.0, 4.0 Hz, H-18), 3.08 (1H, d, J = 10.8 Hz, Ha-28), 3.29 (1H, overlapped with solvent, Ha-23), 3.32 (1H, overlapped with solvent, Hb -28), 3.60 (1H, d, J = 10.8 Hz , Hb -23), 3.62 (1H, m, H-3), 3.77 (3H, s, GlcA -6- OCH3 ), 4.51 (2H, d, J = 7.2 Hz , GlcA -H-1, Ara -H-1), 5.16 (1H, brs, H-16), 5.46 (1H, brs , H-12), 5.54 (2H, s, H-21 and H-22), 6.16 (1H, q, J = 7.0 Hz, Ang-H-3); HR-TOF-ESI-MS: m/z = 1037.5684 [M + H]+ (calcd. for C54H84O19 + H: 1037.5685).
[시험예 1] 독성 실험
<경구투여>
ICR계 마우스와 스프라그 도올리(Sprague Dawley, 대구효창사이언스)를 각각 10마리씩 11군으로 나누어 본 발명의 녹차포닌 R1내지 R10의 트리테르페노이드 사포닌을 각각 200mg/kg의 용량으로 경구투여한 후 2주간 독성여부를 관찰한 결과 11군 모두에서 사망한 예가 한 마리도 없었고 외견상 대조군과 별다른 증상을 찾아볼 수 없었다.
<복강투여>
ICR계 마우스(25±5g)와 스프라그-도올리(Sprague Dawley)(대구효창사이언스)를 각각 10마리씩 11군으로 나누어 본 발명의 녹차포닌 R1 내지 R10의 트리테르페노이드 사포닌을 각각 20mg/kg의 용량으로 복강투여한 후 24시간 동안 독성여부를 관찰한 결과 11군 모두에서 사망한 예가 한 마리도 없었고 외견상 대조군과 별다른 증상을 찾아볼 수 없었다. 이상의 결과에서 본 발명의 추출물은 급성독성이 거의 없음이 확인되었다.
[시험예 2] 분화된 지방세포에 처리시의 중성지방 분해능
1. 지방세포 배양과 분화유도
10% 송아지 혈청(bovine calf serum, Gibco co. USA)을 DMEM(Dulbecco's modified Eagle's Medium, Lonza, 12-604F, USA)에 첨가한 배지에서 쥐의 미분화 지방세포 3T3-L1 지방세포(3T3-L1 adipocyte, ATCC로부터 구매)를 배양하였다. 이틀에 한번씩 배지를 교환하면서, 80% 융합될 때까지 37℃ 5% CO2 배양기에서 배양하였다. 그런 다음, 10% 우태혈청(fetal bovine serum, Gibco co. USA), 0.5mM 3-이소부틸-1-메틸산틴(3-isobutyl-1-methyxanthine, Sigma co. USA), 1μM 덱사메타손(dexamethasone, Sigma co. USA), 및 167nM 인슐린(insulin, Sigma co. USA)을 포함한 배지에서 48시간 배양 후, 그 배지를 10% 우태혈청(fetal bovine serum)과 167nM 인슐린을 포함한 DMEM 배지로 교환하고, 다시 48시간을 배양하였다. 마지막으로, 10% 우태혈청(fetal bovine serum)만을 포함한 배지에서 48시간을 더 배양하여 분화된 지방세포를 얻었다.
2. 분화된 지방세포에 약물처리
완전 분화를 유도한 후, 지방세포에서 배양액을 분리하여 PBS로 세척한 후, 2% 유리지방산 우혈청 알부민(Free Fatty Acid Bovine Serum Albumin, Sigma Co. USA)를 저농도 글루코스 DMEM(With 1000mg/L D-glucose, Without L-glutamine, Without phenol-red, LM001-04, Welgene, Korea)에 첨가한 배지로 교환하고 24시간 10% CO2 배양기에서 배양하였다. 저농도 글루코스 DMEM 배지에, 양성 대조군에는 차카테킨 제품(70%, PFI co. Japan), 음성 대조군에는 일반녹차 열수추출물(BTC, Korea), 실험군에는 녹차포닌 R1 내지 R10의 트리테르페노이드 사포닌을 각각 10㎍/ml로 처리하여 37℃ 5% CO2 배양기에서 배양하였다.
3. 완전분화된 지방세포에 약물처리 후 지방분해능 측정
상기 2단계에서 배양된 세포의 배지를 각각 수거하여 마이크로플레이트(microplate)에 각각 50㎕씩을 분주한 후, 유리지방산 측정 킷(Roche, Cat #. 1-383-175, Germany)의 반응 혼합물 A를 샘플과 같은 양인 50㎕씩을 각 칸에 분주하고, 25℃에서 10분간 반응시킨 후, N-에틸-말레이미드 용액(N-ethyl-maleinimide solution) 5㎕를 각 칸에 분주하고 초기 흡광도를 546nm에서 측정하였다. 반응 혼합물 B를 각 칸에 5㎕씩 분주하고 잘 섞어 주었다. 그런 다음, 25℃에서 15분간 반응시킨 후, 최종 흡광도를 측정하였다. 바탕검정(Blank)의 흡광도를 기준으로 최종값에서 초기값을 뺀 수를, 각 샘플의 차이값에서 제한 수치를 최종 유리산의 농도로 결정하였다. 결과는 도 1에 나타내었다.
도 1을 보면, 본원발명에서 사용되는 녹차포닌 R1 내지 R10은 우수한 지방분해능을 나타냄을 확인할 수 있으며, 중성지방 분해능이 우수한 것으로 알려진 차카테킨과 비교하여서도 더 높은 지방분해능을 보임을 알 수 있다.
[시험예 3] DIO(Diet-Induced Obesity) 모델에서 혈청 화학검사
1. 시료준비
동물실험에 대조군으로 사용된 차카테킨(70%, Pharmafood Inc. Japan) 200 mpk는 매일 경구투여 전 HPLC 등급 H2O(Sigma co. USA)에 녹여서 준비하였으며, 실험군에 사용된 녹차포닌 R1 내지 R10은 20mg/kg의 농도로 경구투여 전 HPLC 등급 H2O에 녹여 준비하였다.
2. 실험군 설정, 체중감량 및 지방분해 효과 검증
본 실험을 진행하기 위하여 7주령의 C57BL/6J 수컷 생쥐를 대상으로 군당 10마리씩 준비하였으며, 1주간의 적응기간을 가진 후, 개별 우리에 분리하여 12시간 간격의 낮(6시~18시)과 밤의 주기에 따라 관리하였다. 군은 1) 일반사료군(일반사료), 2) 고지방식이군(대조군), 3) 고지방식이 및 차카테킨 200 mpk 섭취군(차카테킨), 4) 고지방식이 및 녹차포닌 R1 20mpk 섭취군, 5) 고지방식이 및 녹차포닌 R2 20mpk 섭취군, 6) 고지방식이 및 녹차포닌 R3 20mpk 섭취군, 7) 고지방식이 및 녹차포닌 R4 20mpk 섭취군, 8) 고지방식이 및 녹차포닌 R5 20mpk 섭취군, 9) 고지방식이 및 녹차포닌 R6 20mpk 섭취군, 10) 고지방식이 및 녹차포닌 R720 mpk 섭취군, 11) 고지방식이 및 녹차포닌 R8 20mpk 섭취군, 12) 고지방식이 및 녹차포닌 R9 20mpk 섭취군, 13) 고지방식이 및 녹차포닌 R10 20mpk 섭취군, 총 13개 군으로 나뉘어 1일 1회씩 8주 동안 일정한 시간(오전 10시)에 경구투여하였으며, 대조군인 고지방식이군의 10마리에는 동일량의 물을 투여하였다.
체중은 매주 1회(오전 11시) 측정을 실시하였다. 투여시작 8주 후에 실험군과 대조군의 최종 체중을 측정하여 분석한 결과는 도 2에 나타내었다.
도 2를 보면, 본원발명에서 사용되는 녹차포닌 R1 내지 R10을 투여한 경우에는 고지방식이를 하였음에도 정상식이를 한 경우와 비슷한 수준으로 체중이 감소하였음을 확인할 수 있으며, 체중 감소에 효과가 있는 것으로 알려진 차카테킨과 비교하여서도 체중 감소 효과가 더 우수함을 알 수 있다.
또한, 각 개체군의 부고환 지방의 무게를 8주차에 부검 후 측정하였다. 그 결과 대조군은 2.89±0.58g이었으나, 녹차포닌 20mpk를 섭취한 군의 부고환 무게는 평균 1.51±0.37g으로 확인되었다. 이 결과를 평균 체중 대비 부고환 무게로 환산하여 계산하였다. 계산결과는 하기 표 1에 나타내었다.
녹차포닌 투여에 의한 부고환지방 무게 감소
실험군 부고환지방 무게 (g)
정상식이 1.23±0.32
고지방식이 2.89±0.58
고지방/차카테킨 2.13±0.46
고지방/R1 1.65±0.23
고지방/R2 1.56±0.17
고지방/R3 1.71±0.25
고지방/R4 1.58±0.32
고지방/R5 1.46±0.41
고지방/R6 1.49±0.43
고지방/R7 1.33±0.23
고지방/R8 1.58±0.34
고지방/R9 1.32±0.71
고지방/R10 1.40±0.56
상기 표 1을 보면, 본원발명에서 사용되는 녹차포닌 R1 내지 R10을 투여한 경우에는 고지방식이를 하였음에도 정상식이를 한 경우와 비슷한 수준으로 부고환지방의 무게가 감소하였음을 확인할 수 있으며, 차카테킨을 투여한 경우와 비교하여서도 부고환지방의 무게 감소 효과가 더 우수함을 알 수 있다.
3. 실험군 및 대조군의 혈청 검사
장기 독성 실험은 차카테킨 및 녹차포닌 R1 내지 R10의 트리테르페노이드 사포닌을 다양한 농도로 8주 동안 투여하여 비만예방 및 치료 등의 시험에 이용된 C57BL/6J 생쥐를 대상으로 실험하였다.
동물의 각 장기(조직)에 미치는 영향을 조사하기 위하여 차카테킨 및 녹차포닌 R1 내지 R10의 트리테르페노이드 사포닌을 농도별로 처리한 실험군과 용매만을 투여한 대조군의 동물들로부터 8주 후 혈액을 채취하여 GPT(glutamate-pyruvate transferase) 및 BUN(Blood Urea Nitrogen)의 혈액 내 농도를 설렉트 E(Select E, Vital Scientific NV, Netherland) 기기를 이용하여 측정하였다. 측정결과는 하기 표 2에 나타내었다.
혈중 GPT 및 BUN 농도
실험군 GPT BUN
정상식이 62.13±3.38 19.68±1.05
고지방식이 89.31±7.21 22.48±1.21
고지방/차카테킨 69.21±6.78 20.56±0.91
고지방/R1 63.31±2.58 19.45±0.72
고지방/R2 62.26±3.59 18.67±0.66
고지방/R3 62.58±4.43 20.26±1.01
고지방/R4 64.17±5.32 20.11±0.96
고지방/R5 66.19±4.16 19.68±0.46
고지방/R6 70.12±3.57 18.25±0.56
고지방/R7 63.54±4.91 19.21±1.45
고지방/R8 65.08±6.16 17.67±1.21
고지방/R9 58.12±4.36 18.58±1.16
고지방/R10 56.33±5.15 18.45±0.98
상기 표 2를 보면, 본원발명에서 사용되는 녹차포닌 R1 내지 R10을 투여한 경우에는 고지방식이를 하였음에도 정상식이를 한 경우와 비슷한 수준으로 GPT 및 BUN 농도가 감소하였음을 확인할 수 있으며, 차카테킨을 투여한 경우와 비교하여서도 GPT 및 BUN 농도의 감소 효과가 더 우수함을 알 수 있다.
또한, GPT는 간독성을 확인하는 지표이고, BUN은 신장독성을 확인하는 지표이다. 간독성과 관련된 GPT 및 신장독성과 관련된 BUN은, 대조군과 비교하여 실험군(녹차포닌 R1 내지 R10)은 별다른 차이를 보이지 않았다. 또한, 각 동물로부터 간과 신장을 적출하여 통상적인 조직절편 제작 과정을 거쳐 광학현미경으로 조직학적 관찰을 시행하였으며 특이한 이상이 관찰되지 않았다. 따라서, 본 발명에 따른 녹차포닌 R1 내지 R10은 특별한 독성이 없다고 볼 것이다.
GLUC(glucose; 혈당) 지표는 혈당과 관련된 것으로, 높은 수치는 당뇨병을 나타내기도 한다. 또한, TG(triglyceride; 중성지방)는 콜레스테롤과 함께 동맥경화를 일으키는 혈중 지방성분이다. 또한, CHOL(cholesterol; 콜레스테롤)은 비만, 간질환 및 당뇨병 진단에 도움을 주는 지표이다. 이들 값의 측정 결과는 하기 표 3에 나타내었다.
녹차포닌 투여에 따른 혈중 포도당 및 지질 농도 변화
실험군 GLUC TG CHOL
정상식이 112.41±5.56 78.24±6.42 103.64±6.33
고지방식이 168.32±14.18 121.24±10.21 195.12±21.68
고지방/차카테킨 144.54±5.68 105.46±8.11 156.51±18.12
고지방/R1 125.17±4.32 98.12±6.19 132.18±16.22
고지방/R2 121.31±1.28 83.15±8.12 126.11±10.25
고지방/R3 116.58±3.20 100.12±6.66 108.57±11.57
고지방/R4 107.15±9.12 96.61±7.15 112.14±9.26
고지방/R5 98.56±8.41 88.12±3.59 109.93±10.36
고지방/R6 106.62±4.65 71.95±4.65 129.14±15.14
고지방/R7 109.54±5.68 76.96±5.12 131.26±14.57
고지방/R8 113.46±6.12 86.14±3.19 118.73±16.13
고지방/R9 118.97±5.29 91.26±6.29 114.12±12.11
고지방/R10 120.14±4.21 95.11±7.98 125.21±10.09
표 3에서, GLUC 및 CHOL 모두 녹차포닌 R1 내지 R10을 처리한 경우에 대조군에 비해 낮은 수치를 나타내는 것으로 확인되었다. 따라서, 본 발명에 따른 조성물은, 당뇨병 및 비만의 치료 및 예방에 효과가 있다는 것을 알 수 있다.
또한, TG(triglyceride; 중성지방)는 콜레스테롤과 함께 동맥경화를 일으키는 혈중 지방성분이다. 표 3에서는, 대조군에 비해 녹차포닌 R1 내지 R10을 투여한 실험군에서 TG 수치가 현저히 낮은 것으로 나타났다.
따라서, 본 발명에 따른 조성물은 CHOL 및 TG 수치를 모두 낮추는 효과가 있으며, 이를 통해, 고지혈증, 고혈압, 동맥경화, 협심증 및 심근경색의 치료 및 예방에도 효과가 있는 것으로 확인되었다.
[시험예 4] 수컷 SD쥐의 지방세포내 중성지방 분해 촉진 효능 평가
수컷 SD흰 쥐의 지방세포내 중성지방 분해 촉진 효능을 평가하기 위하여 분리한 부고환 지방세포를 이용하여 실험을 실시하였다.
우선, 부고환 지방조직은 다음의 방법으로 분리하였다. SD계 수컷 흰 쥐의 부고환 지방조직(epididymal adipose tissue)을 분리한 후 가위로 잘게 자르고, 0.1% 콜라게나아제(in DMEM without phenol red)를 가하였다. 그 후 37℃에서 2 시간 동안 배양한 다음 여과하여 지방세포(adipocyte)를 얻었다.
지방세포에 지방산이 없는 0.5% 우혈청 알부민(bovine serum albumin, BAS)을 포함한 무색의 DMEM(Dulbeco's modified eagles medium)을 첨가한 후 취하여 각각 실험에 사용하였다. 글리세롤(glycerol)의 정량은 미국 시그마사(St. Louis, Mo, U.S.A)로부터 구입한 GPO-trinder 키트를 이용한 발색반응법으로 하였으며, ELISA reader를 이용하여 540nm에서 흡광도를 측정하였다.
대조군으로는 시험물질이나 비교물질을 첨가하지 않은 배지만을 사용하였으며, 시험물질로는 녹차포닌 R1 내지 R10을 사용하였고, 양성대조군으로는 카페인을 사용하였고, 이들 물질을 각각 50㎍/ml 씩 첨가하였다. 지방은 가수분해되면 지방산과 글리세롤(glycerol)로 분해되므로, 지방 분해 정도는 지방세포로부터 배양액 중으로 유리된 글리세롤의 농도를 측정함으로써 판단하였으며, 그 결과값은 대조군을 1로 하였을 때 기타 값을 환산하여 구하였다. 그 결과는 도 3에 나타내었다.
도 3에서 보여지는 바와 같이, 녹차포닌을 처리하였을 때에 지방산 분해 효과는 대조군보다 최소 2배, 최대 3배 가량 높게 나타났다.
[시험예 5] 동물의 지질대사에 미치는 효과
본 발명의 조성물이 고지방식으로 유도된 비만 동물의 지질대사에 미치는 영향을 조사하고자 수컷 SD 흰 쥐를 모델로 선정하여 실험하였다.
고지방식이로 유도되는 비만에 대하여 녹차포닌 R1 내지 R10의 트리테르페노이드 사포닌이 어떻게 영향을 미치는지 알아보기 위하여 6주령된 쥐를 일주일간 적응시키고 실험군 당 10마리씩 완전 임의로 배치하였다. 실험군은 정상지방식이군, 고지방식이군, 고지방식이군+녹차포닌 R1 1% 첨가, 고지방식이군+녹차포닌 R2 1% 첨가, 고지방식이군+녹차포닌 R3 1% 첨가, 고지방식이군+녹차포닌 R4 1% 첨가, 고지방식이군+녹차포닌 R5 1% 첨가, 고지방식이군+녹차포닌 R6 1% 첨가, 고지방식이군+녹차포닌 R7 1% 첨가, 고지방식이군+녹차포닌 R8 1% 첨가, 고지방식이군+녹차포닌 R9 1% 첨가, 고지방식이군+녹차포닌 R10 1% 첨가하는 군으로 나누었다.
실험 식이는 8주간 급여하였으며, 실험식이는 하기 표 4의 성분대로 조제하였다. 이 때, 실험식이는 AIN-93G 정제사료를 기본으로 하여 지방이 총 열량의 36%로 조정된 고지방식이(식이 중 18%)로 조제하였으며, 정상지방식은 지방이 총 열량의 17%가 되도록 하였다(식이 중 7%).
각 실험군별 사료 배합비
실험군 정상식이1) 고지방식이 고지방식이 + 녹차포닌
옥수수전분 529.486 419.486 409.486
카제인 200.0 200.0 200.0
수크로오스 100.0 100.0 100.0
콩기름 70.0 180.0 180.0
녹차포닌 R1 내지 R10 - - 10
섬유(fiber) 50.0 50.0 50.0
미네랄 혼합물2 ) 35.0 35.0 35.0
비타민 혼합물3 ) 10.0 10.0 10.0
L-시스틴 3.0 3.0 3.0
콜린 비타르타레이트 2.5 2.5 2.5
Tert-부틸허드로퀴논 0.014 0.014 0.014
에너지합계(Kcal) 3498 4502 4496
1) 정상 식이군(normal diet) : AIN-93G 식이
2) 미네랄 혼합물(mineral mixture) : AIN-93G 미네랄 혼합물(g/kg mix)
3) 비타민 혼합물(vitamin mixture) : AIN-93G 비타민 혼합물(g/kg mix)
실험식이 급여기간 중 주당 1회씩 식이섭취량과 체중을 측정하였고, 실험식이 급여기간 종료 후 최종적으로 체중을 측정하였다. 실험식이에 따른 체중변화의 결과는 하기 표 5 및 6에 나타내었다.
각 군별 체중 차이 및 먹이 섭취량
실험군 식이섭취 실험시작 전 체중(g) 먹이 섭취량(g/day)
1 정상식이군(C) 178.6±10.1 27.2±3.5
2 고지방식이군(HF) 176.9±14.2 26.5±5.4
3 고지방식이군(HF)+
녹차포닌 R1 1.0%
181.5±10.3 25.4±3.6
4 고지방식이군(HF)+
녹차포닌 R2 1.0%
176.8±7.3 25.2±2.7
5 고지방식이군(HF)+
녹차포닌 R3 1.0%
175.9±8.6 25.7±3.2
6 고지방식이군(HF)+
녹차포닌 R4 1.0%
178.6±11.2 24.5±2.4
7 고지방식이군(HF)+
녹차포닌 R5 1.0%
176.4±10.3 23.6±3.1
8 고지방식이군(HF)+
녹차포닌 R6 1.0%
182.0±9.8 22.7±2.5
9 고지방식이군(HF)+
녹차포닌 R7 1.0%
181.4±11.6 23.6±1.6
10 고지방식이군(HF)+
녹차포닌 R8 1.0%
180.0±11.6 25.6±0.9
11 고지방식이군(HF)+
녹차포닌 R9 1.0%
176.8±11.7 26.7±1.4
12 고지방식이군(HF)+
녹차포닌 R10 1.0%
179.4±14.3 26.9±1.2
표 5에 나타난 바와 같이 실험시작 전에는 각 실험군별 체중의 차이는 없었으며 식이섭취량도 군간의 유의적 차이는 없었다. 그러나 하기 표 6에서 나타난 바와 같이 식이 섭취 후 체중 변화량을 확인한 결과 정상식이군의 경우 408.2±20.1이었으며 대조군인 고지방식이군은 557.2±17.5로서 정상식이군보다 체중이 증가하였다. 이에 녹차포닌 R1 내지 R10 식이군 1.0%의 체중은 438.4±15.7 ~ 486.3±19.2g으로서 녹차포닌 R1 내지 R10 식이군에서는 체중증가 가 유의적으로 작게 나타남을 알 수 있었다(P<0.05).
각 군별 실험 후 체중 변화
실험군 식이섭취 실험 후 체중(g) 체중 변화량 (g)
1 정상식이군 408.2±20.1 229.6±15.6
2 고지방식이군 557.2±17.5 380.3±46.3
3 고지방식이군/R1 467.6±14.3 286.1±31.5
4 고지방식이군/R2 476.2±17.1 299.4±15.7
5 고지방식이군/R3 438.4±15.7 262.5±34.6
6 고지방식이군/R4 448.1±8.6 269.5±24.3
7 고지방식이군/R5 486.3±19.2 309.9±41.3
8 고지방식이군/R6 492.0±14.3 310±36.5
9 고지방식이군/R7 466.8±11.3 285.4±26.7
10 고지방식이군/R8 480.1±12.6 300.1±35,7
11 고지방식이군/R9 452.6±19.8 275.8±28.4
12 고지방식이군/R10 469.8±17.21 290.4±22.5
상기 표 6의 결과를 통해 녹차포닌 R1 내지 R10이 체중 증가 방지에 효과적이며, 녹차포닌 R1 내지 R10이 비만 예방 및 개선에 도움을 줄 수 있음을 알 수 있다.
[시험예 6] 부고환지방 무게의 측정
상기 시험예 5의 실험군 1~12에 대해 8주간의 식이가 끝난 후 희생하여 부고환지방을 적출하였다. 적출된 부고환지방은 생리식염수로 씻은 후 여과지상에서 가볍게 수분을 제거하고 무게를 측정하였으며, 결과는 하기 표 7에 나타내었다.
각 군별 부고환지방 무게
실험군 군명 부고환지방 무게(g)
1 정상식이군 18.9±2.6
2 고지방식이군 47.8±6.9
3 고지방식이군/R1 35.2±7.1
4 고지방식이군/R2 31.6±6.4
5 고지방식이군/R3 28.7±4.7
6 고지방식이군/R4 29.5±5.5
7 고지방식이군/R5 22.4±4.6
8 고지방식이군/R6 31.3±3.7
9 고지방식이군/R7 38.2±3.6
10 고지방식이군/R8 36.8±4.3
11 고지방식이군/R9 35.1±5.2
12 고지방식이군/R10 27.7±7.6
상기 표 7의 결과를 통해 녹차포닌 R1 내지 R10이 체지방량 증가 억제효과가 우수함을 알 수 있다.
[시험예 7] CPT-1에 대한 발현 측정
상기 시험예 5의 실험군 1~12에 대해 8주간의 식이가 끝난 후 희생하여 간을 적출하였다. 적출한 간조직을 균질화시킨 후 페놀과 구아니딘 이소티오시아네이트(guanidine isothiocyanate)의 혼합용액으로 된 트리졸(TRIZOL, Life Technologies사, grand Island, NYU, USA)을 사용하여 RNA를 추출하였다. 이렇게 얻어진 총 RNA로부터 CPT-1 mRNA의 발현정도를 Q-PCR로 측정하였고, 이를 정량하여 도 4에 나타내었다.
도 4에서 확인되는 바와 같이, 고지방식이군에 비해 녹차포닌 R1 내지 R10을 섭취한 식이군에서 CPT-1발현이 증가되었음을 알 수 있다.

Claims (9)

  1. 차나무 뿌리의 메탄올 추출물에서 분리한 트리테르페노이드 사포닌을 유효성분으로 함유하는 당뇨의 예방 및 개선용 조성물.
  2. 차나무 뿌리의 메탄올 추출물에서 분리한 트리테르페노이드 사포닌을 유효성분으로 함유하는 심혈관계 질환의 예방 및 개선용 조성물.
  3. 차나무 뿌리의 메탄올 추출물에서 분리한 트리테르페노이드 사포닌을 유효성분으로 함유하는 동맥경화의 예방 및 개선용 조성물.
  4. 차나무 뿌리의 메탄올 추출물에서 분리한 트리테르페노이드 사포닌을 유효성분으로 함유하는 고혈압의 예방 및 개선용 조성물.
  5. 차나무 뿌리의 메탄올 추출물에서 분리한 트리테르페노이드 사포닌을 유효성분으로 함유하는 비만의 예방 및 개선용 조성물.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 트리테르페노이드 사포닌은 하기 화학식 1 내지 10의 것임을 특징으로 하는 조성물.
    [화학식 1]
    Figure pat00011

    [화학식 2]
    Figure pat00012

    [화학식 3]
    Figure pat00013

    [화학식 4]
    Figure pat00014

    [화학식 5]
    Figure pat00015

    [화학식 6]
    Figure pat00016

    [화학식 7]
    Figure pat00017

    [화학식 8]
    Figure pat00018

    [화학식 9]
    Figure pat00019

    [화학식 10]
    Figure pat00020
  7. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 트리테르페노이드 사포닌은 조성물 총 중량에 대하여 0.01~20중량%의 양으로 함유되는 조성물.
  8. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물은 약학 조성물임을 특징으로 하는 조성물.
  9. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물은 건강식품 조성물임을 특징으로 하는 조성물.
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