KR20130098550A - 냉수용해성 천마 추출물의 제조 방법 및 상기 추출물을 함유하는 항암용 약학 조성물 - Google Patents
냉수용해성 천마 추출물의 제조 방법 및 상기 추출물을 함유하는 항암용 약학 조성물 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 천마를 고온 및 고압조건(120 ~ 180℃, 20~100 bar)에서 세포조직을 붕괴 및 용융을 유도하는 압출성형공법에 의하여 처리함으로써 유용성분을 냉수에서 용해할 수 있는 기술이다.
현행 산업적인 천마 추출방법은 고에너지 소비, 장시간의 추출시간, 과다한 노동력 소요 및 천마가공제품의 낮은 기호성 등의 단점이 개선사항으로 대두되고 있다. 따라서 본 발명의 기술로 천마가공제품을 생산할 경우 생산비용 감축, 공정 단순화 및 고품질 천마제품을 생산할 수 있다.
현행 산업적인 천마 추출방법은 고에너지 소비, 장시간의 추출시간, 과다한 노동력 소요 및 천마가공제품의 낮은 기호성 등의 단점이 개선사항으로 대두되고 있다. 따라서 본 발명의 기술로 천마가공제품을 생산할 경우 생산비용 감축, 공정 단순화 및 고품질 천마제품을 생산할 수 있다.
Description
본 발명은 천마를 압출성형공정 기술을 통하여 생물고분자의 수율을 증대시키고, 고온, 고압의 처리 과정 중 천마 자체의 향미를 개선하며, 기존의 에너지, 노동 집약적인 추출방법의 개선에 관한 것이다.
천마(天麻, Gastrodia elata Blume)는 한국, 중국, 일본 등지에 자생하는 난초과(Orchidaceae)에 속하는 다년생 초본식물의 괴경을 지칭하는 것으로서 신농본초경(神農本草)에는 천마가 중품(中品)으로 분류되어 있으며 약성(藥性)이 평무독(平無毒)한 약재로 알려져 있다. 천마의 임상적 효능은 본초강목, 동의보감 등 여러 본초문헌들에서 찾아 볼 수 있는데 주로 고혈압, 중풍, 두통, 마비, 신경성 질환, 당뇨, 간질, 빈혈 등에 효능이 있다고 보고되어있다. 우리나라에서의 민간에서도 일찍이 천마를 두통과 빈혈, 수족마비, 중풍 등을 치료하는데 이용되어 왔다.
이와 같은 효능을 가진 천마를 이용함에 있어 기존의 열수 추출방식은 공정상 많은 에너지를 투입해야 함은 물론 여러 공정이 요구되어 효율성이 떨어지기 때문에 이를 대체할 물리적 공정으로써 고온/고압 공정을 이용한 천마의 생물고분자 증대기술 및 공정의 개발이 요구된다.
고온 및 고압의 압출성형공정으로 세포벽의 수용화를 유발시켜 산성다당체 및 생물고분자의 추출율을 크게 증가시킬 수 있으며, 아울러 전분 분자를 저분자화 시켜, 추출물의 농축/냉각/저장 시 침전발생을 억제할 수 있으며, 고온 및 고압 조건의 체류시간의 조절로 원료의 새로운 약리효능 물질 생성도 기대할 수 있고, 세포벽 수용화 붕괴로 인한 polysaccharide의 용해도를 증가시켜 새로운 생리기능이 부여된 추출물의 제조도 보고되어 있다.
현재 천마를 이용한 가공방법 중 큰 비중을 차지하고 있는 열수추출의 공정은 원료를 추출탱크 안에서 24시간 침지하고, 24 ~ 48시간 95℃ 이상의 고온으로 추출한 후 침전 등의 공정을 거치는데 천마의 특성으로 인해 추출 후의 잔사와 추출물의 분리가 용이하지 못하고, 추출 과정에서 전분질이 함께 용출되어, 냉각/농축 시 노화되어 침전물을 발생시킴으로 제품의 품질을 저해하며, 공정에 과도한 에너지와 인력이 투입되고 있는 실정이다.
이에 발명자는, 오래전부터 민간요법으로 이용해 오던 천연물인 천마의 단순가열추출 제조 공정을 개선하여 원료의 단시간 고온처리, 고압 및 물리적 전단력에 의한 혼합, 절단, 파쇄 성형, 팽화, 살균 등과 같은 과정을 동시에 수행할 수 있는 장점을 지닌 압출 공정을 적용하여 산성다당체의 추출 수율을 증가시키고, 냉수 추출을 통해 추출되는 고형분 함량 중 제품의 품질을 저해하는 전분의 용출을 저감시키는 추출 방법을 개발하게 되었다.
한국공개특허 제2009-0032753호에는 천마를 볶음 처리하는 단계와, 볶음 처리된 천마를 열수로 추출하는 단계와, 추출액을 농축하여 천마추출물의 농축물을 얻는 단계를 포함하는 기호도가 향상된 천마 추출물의 제조방법이 개시되어 있으며, 한국등록특허 제0710707호에는 천마를 최적의 증자조건, 건조조건, 추출조건에서 천마가 가지고 있는 유효성분을 대량 추출할 수 있는 천마의 유효성분추출 증대방법이 개시되어 있으며, 한국등록특허 제0526329호에는 천마를 볶음 처리한 후 열수 추출물을 제조함으로써 천마의 부정적인 맛과 향을 감소시킬 수 있는 천마 추출물 제조방법이 개시되어 있으나, 본 발명과 같이 천마를 압출성형한 후 냉수 추출하는 공정을 포함하는 천마 추출물의 제조 방법은 개시된 바가 전혀 없다.
본 발명은 상기한 바와 같은 문제점을 해결하기 위하여 개선된 것으로서, 기존의 열수 추출공정으로 생산된 추출물과 압출성형 전처리를 거친 원료를 냉수 추출공정으로 생산한 추출물을 비교 분석하여 천마의 지표물질 및 산성다당체의 추출 수율을 높일 수 있도록 압출성형온도 및 압력 등의 압출성형 공정변수에 따른 천마 압출물 생산조건을 구명함에 있다. 또한, 압출성형공정을 통하여 천마 특유의 향미물질의 제거와 갈색화 반응에 의한 새로운 향기물질의 형성을 통해 향미를 개선시키며, 생리활성물질인 산성다당체의 최적 추출조건을 확립하여 천마로부터 유용성분 추출물 제조를 저에너지의 경제적인 공정으로 수행할 수 있는 기술을 개발하고자 한다.
상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 압출성형 공정을 이용해 원료를 전처리하여 단시간 냉수 추출로도 열수 추출에 비해 산성다당체 등 생물고분자 물질의 비슷한 추출 수율 혹은 그 이상의 추출 수율을 나타내는 냉수용해성 천마 추출물의 제조 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 방법에 의해 제조된 열수 추출에 비해 우론산 함량이 증가하고, 추출 잔사량이 감소한 냉수용해성 천마 추출물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 냉수용해성 천마 추출물을 유효성분으로 함유하는 암 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
본 발명에 따르면, 새로운 원료 전처리 기법을 확립하여 전처리 공정 중 고온, 고압의 환경에서 천마의 향미가 개선되는 효과가 있으며 장시간의 가열 추출이 아닌 단시간의 실온 추출 공정으로도 고형분, 산성다당체와 같은 생리활성물질인 생물고분자의 수율을 증대하여 기존 열수 추출 공정의 단점인 에너지, 인력, 시간 집약적 생산 및 탄소의 발생을 저감할 수 있다.
도 1은 압출 공정을 이용하여 원료를 전처리하여 추출하는 공정을 도시한 공정 흐름도이다.
도 2는 본 발명의 천마 압출성형물의 성상을 나타낸 사진이다.
도 3은 전처리를 하지 않은 천마와 압출 공정으로 전처리한 원료에 중량 15~20배의 물을 가하고 6시간 동안 상온에서 교반하여 추출한 시료의 추출 후 잔사와 추출액 중의 고형물의 비중을 비교한 그래프이다.
도 4는 전처리를 하지 않은 천마와 압출 공정으로 전처리한 원료에 중량 15~20배의 물을 가하고 6시간 동안 90℃로 가열 교반하여 추출한 시료의 추출 후 잔사와 추출액 중의 고형물의 비중을 비교한 그래프이다.
도 5는 전처리를 하지 않은 천마와 압출 공정으로 전처리한 원료에 중량 15~20배의 물을 가하고 각 6시간 동안 90℃로 가열 교반하여 추출한 시료와 같은 시간동안 상온에서 교반하여 추출한 시료의 추출물에 함유된 다당체 함량을 비교한 그래프이다.
도 6은 전처리를 하지 않은 천마와 압출 공정으로 전처리한 원료에 중량 15~20배의 물을 가하고 각 6시간 동안 90℃로 가열 교반하여 추출한 시료와 같은 시간동안 상온에서 교반하여 추출한 시료의 추출물에 함유된 총 탄수화물 함량을 비교한 그래프이다.
도 7은 전처리를 하지 않은 천마와 압출 공정으로 전처리한 원료에 중량 15~20배의 물을 가하고 각 6시간 동안 90℃로 가열 교반하여 추출한 시료와 같은 시간동안 상온에서 교반하여 추출한 시료의 추출물에 함유된 우론산 함량을 비교한 그래프이다.
도 8은 천마원료와 압출성형 전처리 후 원료의 추출시간에 따른 고형분 함량을 비교한 그래프이다.
도 9는 천마원료와 압출성형 전처리 후 원료의 추출시간에 따른 총 탄수화물 함량을 비교한 그래프이다.
도 10은 천마원료와 압출성형 전처리 후 원료의 추출시간에 따른 우론산 함량을 비교한 그래프이다.
도 11은 압출성형 천마의 향기성분의 크로마토그램을 나타낸 것이다.
도 12는 천마 및 압출성형 천마로부터 조세포벽 추출물을 제조하는 공정을 나타낸 것이다.
도 13은 본 발명의 천마 추출물의 비장 림프구에 대한 증식 유도활성을 측정한 것이다. 배양 중인 비장세포에 2가지 농도(20, 100ug/ml 또는 1, 2.5ug/ml)로 각각 GEAP(1~10) 및 Concanavalin A (ConA)를 처리한 후에, 48시간 동안 37℃, 5% CO2 조건에서 배양하였다. 비장세포 증식을 EZ-Cytox 세포 생존능 분석 키트로 측정하였다. 데이타는 3반복으로 수행된 실험의 평균±표준편차이다. 대조군와 비교하여 *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001.
도 14는 본 발명의 천마 추출물의 대장암 세포주에 대한 암세포 살해능을 측정한 것이다. HT-29(1×105 세포/웰) 세포를 3가지 농도의 GEAP 또는 5-플루오로우라실(5-FU)로 처리하고 24시간(A) 또는 48시간(B) 배양 후, MTT 분석으로 검출하였다.(#: p<0.05, &: p<0.01, $: p<0.001 vs 대조군)
도 15는 본 발명의 천마 추출물의 대장암 세포주에 대한 암세포 아폽토시스 유도 여부를 관찰한 결과이다. 패널은 최종농도 100ug/ml 또는 100uM 을 이용하여 GEAP-4(C), GEAP-5(D), GEAP-6(E), GEAP-8(F), GEAP-9(G), GEAP-10(H) 및 5-FU(B)로 24시간 처리 후에 HT-29 세포의 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) 염색을 보여준다. 대조군(A)와 비교하여, 적색 화살표는 아폽토시스 세포의 전형적인 응축된 크로마틴을 갖는 apoptotic bodies 를 나타낸다.
도 2는 본 발명의 천마 압출성형물의 성상을 나타낸 사진이다.
도 3은 전처리를 하지 않은 천마와 압출 공정으로 전처리한 원료에 중량 15~20배의 물을 가하고 6시간 동안 상온에서 교반하여 추출한 시료의 추출 후 잔사와 추출액 중의 고형물의 비중을 비교한 그래프이다.
도 4는 전처리를 하지 않은 천마와 압출 공정으로 전처리한 원료에 중량 15~20배의 물을 가하고 6시간 동안 90℃로 가열 교반하여 추출한 시료의 추출 후 잔사와 추출액 중의 고형물의 비중을 비교한 그래프이다.
도 5는 전처리를 하지 않은 천마와 압출 공정으로 전처리한 원료에 중량 15~20배의 물을 가하고 각 6시간 동안 90℃로 가열 교반하여 추출한 시료와 같은 시간동안 상온에서 교반하여 추출한 시료의 추출물에 함유된 다당체 함량을 비교한 그래프이다.
도 6은 전처리를 하지 않은 천마와 압출 공정으로 전처리한 원료에 중량 15~20배의 물을 가하고 각 6시간 동안 90℃로 가열 교반하여 추출한 시료와 같은 시간동안 상온에서 교반하여 추출한 시료의 추출물에 함유된 총 탄수화물 함량을 비교한 그래프이다.
도 7은 전처리를 하지 않은 천마와 압출 공정으로 전처리한 원료에 중량 15~20배의 물을 가하고 각 6시간 동안 90℃로 가열 교반하여 추출한 시료와 같은 시간동안 상온에서 교반하여 추출한 시료의 추출물에 함유된 우론산 함량을 비교한 그래프이다.
도 8은 천마원료와 압출성형 전처리 후 원료의 추출시간에 따른 고형분 함량을 비교한 그래프이다.
도 9는 천마원료와 압출성형 전처리 후 원료의 추출시간에 따른 총 탄수화물 함량을 비교한 그래프이다.
도 10은 천마원료와 압출성형 전처리 후 원료의 추출시간에 따른 우론산 함량을 비교한 그래프이다.
도 11은 압출성형 천마의 향기성분의 크로마토그램을 나타낸 것이다.
도 12는 천마 및 압출성형 천마로부터 조세포벽 추출물을 제조하는 공정을 나타낸 것이다.
도 13은 본 발명의 천마 추출물의 비장 림프구에 대한 증식 유도활성을 측정한 것이다. 배양 중인 비장세포에 2가지 농도(20, 100ug/ml 또는 1, 2.5ug/ml)로 각각 GEAP(1~10) 및 Concanavalin A (ConA)를 처리한 후에, 48시간 동안 37℃, 5% CO2 조건에서 배양하였다. 비장세포 증식을 EZ-Cytox 세포 생존능 분석 키트로 측정하였다. 데이타는 3반복으로 수행된 실험의 평균±표준편차이다. 대조군와 비교하여 *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001.
도 14는 본 발명의 천마 추출물의 대장암 세포주에 대한 암세포 살해능을 측정한 것이다. HT-29(1×105 세포/웰) 세포를 3가지 농도의 GEAP 또는 5-플루오로우라실(5-FU)로 처리하고 24시간(A) 또는 48시간(B) 배양 후, MTT 분석으로 검출하였다.(#: p<0.05, &: p<0.01, $: p<0.001 vs 대조군)
도 15는 본 발명의 천마 추출물의 대장암 세포주에 대한 암세포 아폽토시스 유도 여부를 관찰한 결과이다. 패널은 최종농도 100ug/ml 또는 100uM 을 이용하여 GEAP-4(C), GEAP-5(D), GEAP-6(E), GEAP-8(F), GEAP-9(G), GEAP-10(H) 및 5-FU(B)로 24시간 처리 후에 HT-29 세포의 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) 염색을 보여준다. 대조군(A)와 비교하여, 적색 화살표는 아폽토시스 세포의 전형적인 응축된 크로마틴을 갖는 apoptotic bodies 를 나타낸다.
본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은
천마 분말을 120~180℃의 온도 및 20~100 bar의 압력에서 압출성형하는 단계; 및
상기 압출성형한 천마를 상기 압출성형한 천마 중량 대비 15~20배의 물을 가하여 실온에서 3~7시간 동안 교반하여 추출하는 단계를 포함하는 냉수용해성 천마 추출물의 제조 방법을 제공한다.
본 발명의 냉수용해성 천마 추출물의 제조 방법은 천마 분말 압출성형 공정(제1공정) 및 가수추출공정(제2공정)으로 이루어질 수 있다.
제1공정은 천마 분말을 압출성형기를 이용하여 압출성형하는 공정으로서, 구체적으로 천마 분말을 120~180℃의 온도 및 20~100 bar의 압력에서 압출성형하는 공정이다.
압출성형기는 여러 가지 기능과 제품제조가 가능한데 가장 중요한 것은 바렐 내에서 스크류가 회전함으로써 가소성 물질을 앞으로 밀어내고 이 밀어내는 힘이 사출구 안쪽에 높은 회전력을 형성하여 출구로 물질을 밀어내는 동방향 이축압출 성형기이다. 압출성형기에서 수행될 수 있는 단위공정을 열거하면 열처리, 혼합, 분리, 압착, 배열, 팽화 및 성형 등을 들 수 있고 이러한 공정을 통해 식품 재료에 일어날 수 있는 물리 화학적 변화는 첫째, 전분의 수화, 팽윤, 호화, 분해, 둘째, 단백질의 변성, 분자 간 결합 및 조직화, 셋째, 효소의 불활성화, 넷째, 미생물의 사멸 및 살균, 다섯째, 독물질의 파괴, 여섯째, 냄새의 제거, 일곱째, 조직팽창 및 밀도조절, 여덟째, 갈색화 반응, 아홉째, 세포벽 파괴 등을 들 수 있다.
이러한 압출성형기를 이용하여 가공할 수 있는 원료는 거의 모든 식량재료가 가능하며 예를 들면, 곡물, 두류, 착유 박, 육류, 생선 등에 적용하여 새로운 형태의 제품을 개발할 수 있으며, 대표적인 것이 수용성 호화전분, 즉석곡물제품, 과자, 빵, 조직화 단백질, 식물성 단백질 원료, 국이나 죽 재료, 가축사료 등의 제품이 있다.
이와 같이 단일 공정 내에서 일어나는 여러 가지 반응을 적절히 조절, 통제하면 커다란 경제적 이득을 얻을 수 있어 현재 식품산업에서 소비자들의 다양한 욕구를 충족시킬 수 있는 제품을 개발하고 기존의 제품생산 공정을 단축 또는 대체하는데 많이 이용되고 있는 중요한 공정 중의 하나로 꼽히고 있다.
또한, 압출공정을 적용한 추출방법을 이용함으로 인체에 생리활성을 가지는 가식용 고분자 물질인 생물고분자의 추출 수율을 개선함은 물론 제품의 기호도를 높이고 기존 열수추출 방법에 소요되던 에너지의 절감, 공정의 단순화로 인력 절감 등의 효과를 얻을 수 있고 장시간의 가열 추출 공정을 배제함으로 탄소배출을 줄일 수 있다. 본 발명은 이러한 압출공정을 활용한 원료의 전처리 기술로 산성다당체의 추출을 증대하고, 공정을 개선하였다.
제2공정은 가수추출공정으로서, 전처리된 천마 원료를 추출 탱크에 넣고 원료 중량의 약 15~20배의 물을 가하여 3~7시간 동안 실온에서 교반 추출하는 공정이다. 상기 교반 추출 시간은 3~7시간, 바람직하게는 4~6시간, 가장 바람직하게는 4시간일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 실온은 18~25℃, 바람직하게는 20℃일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명은 또한, 상기 방법에 의해 제조된 냉수용해성 천마 추출물을 제공한다. 본 발명의 천마 추출물에서 특히 산성다당체 함량을 추측할 수 있는 우론산 함량의 경우 최소 6.32%에서 최고 7.54% 로서 천마분을 열수로 추출했을 경우 5.20% 보다 높은 수치를 나타내었으며, 추출 잔사량은 압출성형 전처리를 하지 않고 열수추출한 천마분은 19.36%를 나타내지만, 압출처리 후 냉수로 추출할 경우 잔사량이 최소 17.15%에서 최고 15.32% 로 열수추출보다 낮은 수준으로 나타났다.
또한, 본 발명의 천마 추출물은 천마 특유의 불쾌취 개선 공정 개발로 천마를 이용해 다양한 식품소재로서의 응용이 가능하다. 압출성형 정도를 파악할 수 있는 기계적 에너지소모율이 증가할수록 trichloromethane, toluene, cyclopentasiloxane 및 d-limonene의 함량은 원료 천마와 비교할 때 크게 감소하는 경향을 나타냈다. 즉, 압출성형후 향기성분의 기호성이 개선된 관능특성을 보인 것은 기호성에 악영향을 줄 것으로 예상되는 trichloromethane, toluene, cyclopentasiloxane, cyclohexanol 및 초산 등의 성분이 감소하고, 기호성에 부합할 수 있는 furan, furfural 및 기타 다른 성분의 방출로 나타났다.
본 발명은 또한, 본 발명의 냉수용해성 천마 추출물을 유효성분으로 함유하는 암 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다. 본 발명의 공정에 따라 천마를 전처리하고 냉수 추출한 천마 추출액의 암세포 저해 효능평가를 진행하여 효능을 확인하였으며, 또한 천마에 함유된 지용성 물질과 수용성 물질의 암세포 저해 효능 평가를 비교해 본 결과, 수용성 물질 즉 천마에 함유된 다당체가 지용성 물질에 비해 효능이 높을 것으로 나타났다. 본 발명의 약학 조성물에서, 상기 암은 대장암, 위암, 유방암, 폐암, 간암, 신장암, 갑상선암 등일 수 있으며, 바람직하게는 대장암일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 천마 추출물을 포함하는 약학조성물은 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다.
본 발명의 추출물의 약학적 투여 형태는 이들의 약학적 허용 가능한 염의 형태로도 사용될 수 있고, 또한 단독으로 또는 타 약학적 활성 화합물과 결합뿐만 아니라 적당한 집합으로 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 추출물을 포함하는 약학조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 추출물을 포함하는 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유 등을 포함한 다양한 화합물 혹은 혼합물을 들 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 추출물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌 글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈 (tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 추출물의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 그러나, 바람직한 효과를 위해서, 본 발명의 추출물은 1일 0.0001 내지 100 mg/kg으로, 바람직하게는 0.001 내지 100 mg/kg으로 투여하는 것이 좋다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
본 발명의 추출물은 쥐, 생쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁 내 경막 또는 뇌혈관 내(intracerebroventricular) 주사에 의해 투여될 수 있다.
본 발명은 또한, 본 발명의 천마 추출물을 유효성분으로 함유하는 암 예방 또는 개선용 건강식품을 제공한다.
상기 추출물을 첨가할 수 있는 식품으로는, 예를 들어, 각종 식품류, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 건강 기능성 식품류 등이 있다.
식품 또는 음료 중의 상기 추출물의 양은 전체 식품 중량의 0.01 내지 15 중량%로 가할 수 있으며, 건강 음료 조성물은 100 ㎖를 기준으로 0.02 내지 5 g, 바람직하게는 0.3 내지 1 g의 비율로 가할 수 있다.
본 발명의 건강 기능성 음료 조성물은 지시된 비율로 필수 성분으로서 상기 추출물을 함유하는 외에는 다른 성분에는 특별한 제한이 없으며 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당, 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 상술한 것 이외의 향미제로서 천연 향미제(타우마틴, 스테비아 추출물, 예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 100 ㎖당 일반적으로 약 1 내지 20 g, 바람직하게는 약 5 내지 12 g이다.
상기 외에 본 발명의 추출물은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그 밖에 본 발명의 추출물들은 천연 과일 쥬스 및 과일 쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있으며, 이러한 첨가제의 비율은 그렇게 중요하진 않지만 본 발명의 추출물 100 중량부 당 0 내지 약 20 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.
이하, 본 발명을 구체적으로 설명하기 위해 예를 들어 설명하기로 한다. 그러나 본 발명에 따른 실험 예 등은 여러 가지 다른 형태로 변형될 수 있으며, 본 발명의 범위가 아래에서 상술하는 예들에 한정되어지는 것으로 해석되어지지 않아야 한다. 본 발명에 따른 실시 예 등은 본 출원시점에 있어 이들을 대체할 수 있는 다양한 변형 예들이 있을 수 있다.
도 1에 도시한 바와 같이, 본 발명은 필수적으로 천마 분말 압출성형 공정(제1공정)과 가수추출공정(제2공정)으로 이루어지며, 부가적으로 생리활성 평가공정(제3공정)으로 이루어진다.
| 시료 | 원료공급량 (kg/h) |
가수량 (kg/h) |
스크류회전속도(rpm) | 압출압력 (bar) |
압출온도 (℃) |
SME (KJ/kg) |
| Ext-1 | 15 | 3.8 | 270 | 87 | 170 | 816 |
| Ext-2 | 15 | 3.2 | 270 | 75 | 163 | 1008 |
| Ext-3 | 15 | 3.5 | 270 | 60 | 151 | 1183 |
| Ext-4 | 15 | 3.5 | 270 | 40 | 141 | 1325 |
| Ext-5 | 15 | 3.5 | 270 | 20 | 135 | 1455 |
상기의 제조공정을 상세하게 설명하면 다음과 같다.
1. 천마 분말 압출성형 공정(제1공정)
천마분을 전처리하는 과정에 있어 쌍축압출성형장치를 이용하여 지름이 2mm인 원형사출구를 열어 압출처리를 하였고, 이때 강한 층밀림을 유도하기 위하여 3개의 역방향 스크류를 조합하여 천마 분말을 일정한 속도(15kg/h)로 투입하고 가수량을 변화시켜 압출성형하였다.
천마분말을 이용하여 압출성형기에 투입하여 다양한 압출 조건에 따라 압출천마분을 제조하였으며, 성상은 도 2와 같다.
2. 가수추출공정(제2공정)
전처리된 천마 원료를 추출 탱크에 넣고 원료 중량의 15~20배의 물을 가하여 3~7시간 동안 실온에서 교반 추출하였다.
실시예
1: 천마원료와 압출성형 전처리 후 원료의
열수
및 냉수추출 비교
전처리를 하지 않은 천마와 압출 공정으로 전처리한 원료에 중량 15~20배의 물을 가하고 각 6시간 동안 90℃로 가열 교반하여 추출한 시료와 같은 시간 동안 상온에서 교반하여 추출한 시료의 추출 후 잔사와 추출액 중의 고형물의 비중을 비교한 값은 도 3 및 도 4와 같고, 추출물에 함유된 다당체 함량은 도 5에, 총 탄수화물과 우론산의 함량은 도 6과 도 7에 각각 나타내었다.
도 3은 전처리를 거치지 않은 원료 raw는 실온 냉수 추출을 했을 경우 여과 후 잔사로 남는 ppt는 약 68%, 추출액 중 고형분은 약 30%인 반면, 전처리를 거친 ex1 ~ ex5의 원료는 잔사 약 19 ~ 25%, 추출물의 고형분은 약 71 ~ 79%로 나타났다. 압출성형기의 기계적 에너지 소모율이 증가할수록 잔사의 함량이 줄어드는 경향을 나타내었다.
도 4는 전처리를 거치지 않은 원료를 가열 추출한 raw의 잔사는 약 19%, 추출액 중 고형분은 약 80%를 나타냈고 전처리를 거친 ex1 ~ ex5은 잔사 약 15% ~ 17%, 추출물의 고형분은 80% ~ 85%로 추출액 중에 추출되는 성분의 양이 더 많은 결과를 보인다. 도 3과 비교하면 raw의 경우 열수추출과 실온 냉수추출은 추출물의 고형분 함량에서 큰 차이를 보이지만 압출성형을 거친 원료에서는 같은 시간 냉수추출을 하여도 가열 추출한 추출물의 고형분의 차이가 크지 않음을 볼 수 있다.
도 5는 추출물 중 조다당체 함량을 나타내는 것으로, 실온 냉수추출의 경우 전처리를 거치지 않은 원료 raw 추출물의 다당체는 약 9%, 전처리를 거친 ex1 ~ ex5은 약 53% ~ 62%가 함유되어 있었고, 가열 추출한 추출물의 다당체는 raw 58%, 전처리를 거친 ex1 ~ ex5은 약 62% ~ 64%로 압출성형을 거친 원료는 냉수추출물의 다당체와 가열 추출한 추출물의 다당체의 차이가 크지 않음을 알 수 있다.
도 6은 추출물 중 총 탄수화물 함량을 나타내는 것으로 전처리를 거치지 않은 원료 raw를 실온 냉수 추출한 추출물의 총 탄수화물은 약 8%, 압출 성형을 거친 원료 ex1 ~ ex5은 약 49% ~ 59%가 함유되어 있으며, 가열 추출의 경우 raw는 약 45%로 냉수 추출과 큰 차이를 보이지만 ex1 ~ ex5은 약 50 ~ 60%로 비슷한 결과를 보인다.
도 7은 추출물 중 우론산(Uronic acid) 함량을 나타내는 것으로 전처리를 거치지 않은 원료 raw를 실온 냉수 추출한 추출물 중 우론산의 함량은 약 1%, 압출 성형을 거친 원료 ex1 ~ ex5은 약 5% ~ 7%가 함유되어 있으며, 가열 추출의 경우 raw는 약 5%, ex1 ~ ex5은 약 6 ~ 7%의 우론산 함량을 나타낸다.
위 실험의 결과들로 가열 추출 공정을 거친 추출물의 비교 시 전처리를 거치지 않은 원료와 압출 성형을 거친 원료의 각 성분 함량이 비슷하거나 압출 성형 원료가 조금 많은 성향을 보이고, 냉수 추출 공정을 거친 추출물은 전처리를 거치지 않은 원료에 비해 각 성분이 월등히 높은 함량을 보이며 가열 추출물과의 비교에도 큰 차이를 보이지 않는다.
실시예
2: 천마원료와 압출성형 전처리 후 원료의 추출시간에 따른
추출율
추출 최적 시간의 산정을 위한 실험으로 각각의 원료(raw)를 1시간 ~ 6시간동안 추출하여 추출 성분을 비교하였다. 가열추출(B.T)과 실온추출(R.T)을 비교하기 위해 가열을 전처리를 거치지 않은 시료(raw)를 3시간 ~ 6시간, 실온추출 비교군은 전처리를 거치지 않은 시료와 압출성형을 거친 ex1, ex3, ex5를 선정해 1시간 ~ 6시간 동안 추출하였다. 추출시간별 추출고형분, 총 탄수화물 및 우론산의 결과는 도 8, 9, 10과 같다.
전처리를 거치지 않은 원료 raw, 압출성형으로 전처리한 ex1, ex3, ex5를 각각 1 ~ 6시간 동안 실온 추출한 추출물의 고형분 함량은 가열 추출과 비교하여 비슷한 함량을 보이고 있으며 추출 4시간 이후부터는 증가세가 감소하는 것을 볼 수 있다(도 8).
각 원료를 1시간 ~ 6시간 동안 추출하여 시간별로 추출물 중 총 탄수화물의 함량 결과는 도 9와 같다. 추출 1시간 이후부터 증가하여 4시간 이후부터는 증가량의 변화가 많지 않다.
산성다당체의 추출 시간별 함량 변화는 도 10과 같다. 추출 1시간 이후부터 점차 증가하여 4시간 이후부터는 증가량의 변화는 크지 않다. 이상과 같은 결과를 바탕으로 원료를 압출성형 전처리를 통해 실온 추출할 경우에도 추출시간이 증가함에 따라 추출량도 증가하지만, 추출 4시간이 경과하면 투입시간과 에너지에 비해 추출량 증가는 큰 변화가 없어 최적 추출시간은 4시간으로 산출할 수 있다.
실시예
3: 압출 처리에 따른 천마
불쾌취
저감화
SPME(solid phase microextraction) 방법을 사용하여 다음과 같이 실시하였다. 시료 10mL을 60℃에서 20분간 평형시킨 후 100㎛ Polydimethylsiloxane이 코딩된 fiber를 이용하여 60분간 향을 포집하여 Stabilwax - DA column (30 m x 0.25 mm I.d x 0.25 ㎛ film thickness : Restek Corp., Bellefonte, USA)이 장착된 Hewlett-Packard 7890A GC/HP-5973 mass selective detector (MSD) (Hewlett-Packard Co., Palo Alto, CA, USA)를 이용하여 분석하였다. 사용된 GC의 oven 온도는 80℃에서 5분간 유지 후 200℃까지 3℃/min의 속도로 상승시켰으며 injector 온도는 250℃, carrier gas helium을 사용하여 분석하였다. 분석한 향기성분과 크로마토그램을 표 2 내지 3과 도 11에 나타내었다. 표 2 내지 3은 천마 원료 및 압출성형 천마의 향기성분을 나타낸다.
체류시간이 짧은 휘발성 성분인 trichloromethane, toluene, cyclopentasiloxane 및 d-limonene의 함량은 원료 천마와 비교할 때 크게 감소하였다. 한편, 원료 천마에서는 나타나지 않았던 향기성분인 furan과 furfural 성분이 압출성형 천마에서 발견되었는데, 이는 압출성형의 가열과정에서 가열산화물 등에 의한 갈색화 반응에 이은 캬라멜화에 의한 것으로 예측된다. 또한, 원료 천마에는 존재하지 않았던 nonanal과 benzene 성분도 압출성형 후 검출되었다. benzaldehyde 성분은 원료 천마보다 압출성형 후 증가하였으며, 초산성분은 압출성형 후 발견되지 않았다.
cyclohexanol, estragole, naphthalene, 2-Cyclohexen-1-one 성분은 원료 천마보다 압출성형 후 크게 감소하였다. propanoic acid, benzyl alcohol, 및 benzoic acid 성분도 원료 천마에 비하여 압출성형 후 감소하였다. 한편, 원료 천마에는 나타나지 않았던 alpha-calacorene, benzeneacetaldehyde 및 benzothiazole 성분이 압출성형 후 존재하였다.
따라서, 천마의 압출성형 후 향기성분의 기호성이 개선된 관능특성을 보인 것은 기호성에 악영향을 줄 것으로 예상되는 trichloromethane, toluene, cyclopentasiloxane, cyclohexanol 및 초산 등의 성분이 감소하고, 기호성에 부합할 수 있는 furan, furfural 및 기타 다른 성분의 방출에 따른 것으로 예측할 수 있다.
실시예
4: 압출성형 천마 추출물의 생리활성 평가
천마에 함유된 지용성 성분과 수용성 생물고분자의 암세포 면역활성 효능에 대하여 비교하였다. 도 12는 천마 및 압출성형 천마로부터 조세포벽 추출물을 제조하는 공정을 나타내었다.
1. 비장 림프구에 대한 증식 유도활성 측정
1) 실험방법
경추탈골로 희생시킨 BALB/C 마우스에서 비장을 적출하여 단일 세포로 분리한 후, 2,000 rpm에서 10분간 원심분리하여 세포를 얻은 다음, 5 mL의 RBC lysis buffer를 첨가하여 세포를 잘 현탁시킨 후, 상온에서 5-10분간 방치하여 적혈구의 용혈을 유도하였다. 이 세포부유액을 원심분리 튜브에 미리 넣은 Histopaque-1077(Sigma Chemical Co., USA)의 위에 조심스럽게 중층하고 2000 rpm에서 20분간 원심분리 하였다. 원심분리가 끝나면, 상층을 제거한 다음, 경계면의 세포를 회수하여 10% FBS가 함유된 RPMI 1640 배지로 현탁과 원심분리를 2-3회 반복하여 세포를 잘 세척하였다. 역시 동일 배지를 사용하여 세포를 2x105 세포/웰의 밀도로 96-웰 플레이트에 100 ㎕씩 분주하였다. 여기에 측정하는 시료를 1, 10, 100 ㎍/㎕ 또는 Concanavalin A(Sigma Chemical Co., USA)를 1, 2.5 ug/㎖ 가 되게 첨가하였다. 그 다음 37℃, 5% CO2가 함유된 incubator에서 48시간 배양한 다음 EZ-Cytox reagent (Itsbio Co., South Korea)를 10ul씩 넣어 4시간 동안 보존하였다. 그 후 생성된 수용성 포르마잔의 양을 ELISA reader를 이용하여 480 nm에서 흡광도를 측정하였다.
2) 실험결과
적응면역의 주역인 림프구의 증식을 유도하는지 여부를 관찰하기 위하여 비장 림프구에 대한 시료의 증식유도 활성을 측정한 결과, GEAP(1~10) 중 GEAP-5, GEAP-6 샘플이 각각 대조군 대비 고농도인 100ug/ml에서 2.78, 1.89배 정도의 증식율을 보여주었고 특히 GEAP-5는 대조군인 Concanavalin A(ConA) 의 2.5ug/ml 고농도에서의 2.14배의 증식율 보다 더 좋은 효과를 확인할 수 있었다 (도 13).
2. 시료의 암세포 살해능 측정
1) 실험방법
시료 GEAP(1~10)의 암세포 살해능을 측정하기 위하여 대장암세포주인 HT-29 세포에서의 항암 효능을 관찰하였다. HT-29 세포를 1x105 세포/웰 되게 24-웰 플레이트에 500㎕ 분주하여 18~24 시간 37℃, 5% CO2조건인 incubator에 배양한 다음 시료를 각각 4, 20, 100 ug/ml 되게 처리하여 또 24시간과 48시간으로 나눠 배양하였다. 24시간 후 혹은 48시간 후 각 웰에 0.05%(W/V) MTT 용액(Sigma Chemical Co., USA)을 10% (v/v) 되게 넣어 4시간 동안 보존하였다. 그 후 상층액을 제거하고, 형성된 포르마잔을 DMSO(500 ㎕)로 녹여서 ELISA reader를 이용하여 540nm에서 흡광도를 측정하였다. 대조군으로 5-Fluorouracil (5-FU)를 각각 4, 20, 100uM의 농도로 사용하였다.
2) 실험결과
대장암세포주에 대한 살해능 측정결과
대장암세포주 HT-29 세포에 대한 시료 GEAP의 살해능을 시료 처리 24시간 혹은 48시간 후 MTT assay로 측정한 결과 모두 5-Fluorouracil (5-FU)에서처럼 나타난 현저한 살해능 (100uM에서 시료처리 24시간과 48시간 배양 후 측정결과 각각63.84%, 85.78%의 살해능을 보임)에는 미치지 못했지만 GEAP-4, 5, 6, 9, 10은 각각 4, 20, 100ug/ml에서 약 20~40% 좌우의 살해능을 농도의존성 있게 나타난 것으로 확인되었다. 특히 GEAP-5, 6, 9, 10에선 고농도인 100ug/ml에선 항시 30~35% 이상의 살해능을 보여주었다(도 14).
3. 시료 GEAP의 암세포 아폽토시스(apoptosis) 유도
1) 실험방법
시료 GEAP가 대장암상피세포주인 HT-29에서의 아폽토시스 유도 여부를 관찰하기 위하여 DAPI 염색 실험을 진행하였다. HT-29 세포를 0.5x105 세포/웰 되게 circle glass가 덮여 있는 24-웰 플레이트에 분주하여 18~24시간 37℃, 5% CO2가 함유된 incubator에서 배양 후 GEAP(1~10)를 각각 100ug/ml 되게 대조군인 5-Fluorouracil(5-FU)를 100uM 되게 처리하여 24시간 인큐베이션 하였다. 24시간 인큐베이션 후 상층액을 제거하여 4% Paraformaldehyde (PFA) 를 300ul/웰 씩 상온에서 15min 처리하였다. PBS 로 washing 3번 정도 한 다음 0.2% triton X-100/PBS 를 300ul/웰 씩 상온에서 또 15min간 처리하였다. PBS로 또 washing 과정을 3번 반복한 다음 4',6-Diamidino-2-phenlindole dihydrochloride (DAPI, Sigma Chemical Co., USA) 1ug/ml 농도로 된 2% FBS 함유된 RPMI1640 배지에 섞어서 각 웰에 300ul씩 차광, 상온상태에서 30min 처리하였다. PBS 3번 반복 washing 과정을 거친 후 circle glass를 mounting 용액이 묻혀 있는 slide glass에 cover하여 Fluorescence Microscope (BH2-RFCA, Olympus, Japan)를 통하여 관찰하였다.
2) 실험결과
Program cell death 라고도 불리는 아폽토시스를 시료에 대한 대장암상피세포주 HT-29 세포에서의 유도 여부를 관찰한 결과, 대조군에 비해 GEAP 4, 5, 6, 8, 9과 10에서 모두 아폽토시스 전형적인 chromatin condensing 현상이 나타났고 세포 밀도에서도 대조군에 비해 많이 낮아진 것으로 관찰되었다. GEAP의 다른 시료들은 대조군에 비해 거의 차이가 없게 관찰되므로(데이타 미제시) 아폽토시스 효과가 없다고 사료된다(도 15).
Claims (5)
- 천마 분말을 120~180℃의 온도 및 20~100 bar의 압력에서 압출성형하는 단계; 및
상기 압출성형한 천마를 상기 압출성형한 천마 중량 대비 15~20배의 물을 가하여 실온에서 3~7시간 동안 교반하여 추출하는 단계를 포함하는 냉수용해성 천마 추출물의 제조 방법. - 제1항의 방법에 의해 제조된 냉수용해성 천마 추출물.
- 제2항에 있어서, 추출물 내의 우론산(uronic acid) 함량이 6.32~7.54%(w/v)이고, 추출 잔사량이 15.32~17.15%(w/v)이며, 천마 원료와 비교하여 트리클로로메탄(trichloromethane), 톨루엔(toluene), 시클로펜타실록산(cyclopentasiloxane) 및 d-리모넨(d-limonene) 성분의 함량이 감소하고, 푸란(furan) 및 푸르푸랄(furfural) 성분이 생성되는 것을 특징으로 하는 냉수용해성 천마 추출물.
- 제2항 또는 제3항의 냉수용해성 천마 추출물을 유효성분으로 함유하는 암 예방 또는 치료용 약학 조성물.
- 제4항에 있어서, 상기 암은 대장암인 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
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