KR20130094901A

KR20130094901A - 항암치료 효과 증강용 조성물

Info

Publication number: KR20130094901A
Application number: KR1020120016155A
Authority: KR
Inventors: 신현철; 황혜정; 김성호
Original assignee: 주식회사 보타메디
Priority date: 2012-02-17
Filing date: 2012-02-17
Publication date: 2013-08-27
Also published as: KR101945783B1; US20130217760A1

Abstract

본 발명은, 항암 요법의 항암치료 효과 증강용 조성물에 있어서, 하나 이상의 디벤조-p-디옥신(dibenzo-p-dioxine) 유도체를 유효성분으로 포함하는 항암치료 효과 증강용 조성물에 대한 것으로, 항암 요법의 암 치료 효과를 극대화 할 뿐 아니라, 항암 요법의 부작용을 최소화하는 작용, 효과가 있다.

Description

항암치료 효과 증강용 조성물{Composition for enhancing anti-cancer treatments effect}

본 발명은 항암 요법과 병용하여 처리할 경우, 항암치료의 부작용을 줄이고 치료효과를 극대화시키는, 화학식 1 내지 10의 화합물을 포함하는 항암치료 효과 증강용 조성물에 관한 것이다.

최근 우리나라에서도 식생활의 서구화 및 사회의 고령화등으로 인하여 각종 여러가지 암의 발생율이 급격히 증가하고 있다. 그러나 많은 연구 및 투자에도 불구하고 아직까지 예방과 치료에 많은 성과를 내지 못하고 있다. 또한 기존의 항암제의 사용은 많은 부작용으로 인해 충분한 양을 적용함에 많은 한계가 있으며 이러한 암을 제거하는 수술 및 방사선 치료는 초기암 혹은 국소적인 형태에만 적용되는 한계를 가지고 있다. 또한 항암요법을 계속하는 경우 이에 대한 저항성이 증가하여 재발 또는 악성화되는 경향을 가진다. 그리고 치료 후 암의 전이 혹은 재발에 대한 효과적인 제어법이 없다는 문제가 있으며, 이는 암의 낮은 생존율과 밀접한 관계를 가진다. 또한 항암화학요법(Chemotherapy)은 심각한 부작용을 초래하는데 1차적 주요 부작용으로 빈혈, 소화기능 저하, 만성피로, 탈모, 감염, 구토, 인지기능 저하등이 있으며, 심장, 신장, 방광, 폐, 혹은 신경계등의 주용 장기에 영구적인 손상을 입히기도 한다. 이러한 부작용을 일으키는 원인은, 항암제가 암세포 뿐 아니라 혈액세포, 소화기세포, 면역세포, 생식세포, 모근세포등 세포 분열을 매우 빨리 하는 정상세포를 공격하는 데 있다.

따라서 기존 항암제와 병용 투여하여, 항암제의 부작용을 개선하며 저항성을 줄여주며 효과를 극대화할 수 있는 항암치료 효과 증강제의 개발이 시급하다고 할 수 있다.

한편, 대한민국 특허출원 제2006-0009315호와 제10-2005-0040864호 등에는 디벤조-р-디옥신 유도체를 포함하는 조성물의 안지오텐신 전환 효소의 억제 활성이나, 활성단백질-1(activatorprotein-1, AP-1)의 활성을 억제하는 특성 등이 기재되어 있으나, 상기 디벤조-р-디옥신 유도체의 항암치료 효과 증강제로써의 효과는 연구된 바 없다.

이에, 본 발명자는 항암 요법시 디벤조-р-디옥신 유도체를 병용투여하면, 암 세포사멸효과가 증대될 뿐 아니라 항암 요법의 부작용을 감소시킴을 확인하여, 본 발명을 완성하였다.

KR 10-2006-0009315 KR 10-2005-0040864

본 발명은 항암치료의 효과를 극대화할 수 있는 항암치료 효과 증강용 조성물을 제공하는 데 목적이 있다.

본 발명은, 항암 요법과 병용 투여되는 항암치료 효과 증강용 조성물에 있어서, 하기 화학식 1 내지 화학식 10으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 디벤조-p-디옥신(dibenzo-p-dioxine) 유도체를 유효성분으로 포함하는 항암치료 효과 증강용 조성물을 제공한다:

[화학식 1]

[화학식 2]

[화학식 3]

[화학식 4]

[화학식 5]

[화학식 6]

[화학식 7]

[화학식 8]

[화학식 9]

[화학식 10]

상기 화학식1 내지 10에서, R은 각각 독립적으로 수소, C1~C5의 알킬, C2~C5의 알케닐, 페닐, C7~C12의 페닐알킬, C2~C20의 알카노일, C3~C20의 알케노일, 히드록시페닐, 디히드록시페닐 또는 트리하이드록시페닐이다.

본 발명의 일예에 따르면, 상기 R은 수소일 수 있다.

본 발명의 다른 예에 따르면, 상기 조성물은 화학식3, 화학식 5, 화학식 6 및 화학식 8의 화합물을 포함하거나; 화학식 5, 화학식 6, 화학식 7 및 화학식 8의 화합물을 포함하거나; 화학식 3, 화학식 5, 화학식 6, 화학식 8 및 화학식 10의 화합물을 포함하거나; 화학식1, 화학식 2, 화학식 3, 화학식 4, 화학식 5, 화학식 6, 화학식 7, 화학식 8, 화학식 9 및 화학식 10의 화합물을 포함하거나; 또는 화학식 1, 화학식 2, 화학식 3 및 화학식 10의 화합물을 포함할 수 있다.

본 발명의 또 다른 예에 따르면, 상기 조성물은 유방암, 난소암, 폐암, 간암, 위암, 전립선암, 갑상선암, 대장암 또는 자궁경부암의 치료시 사용될 수 있다.

본 발명의 또 다른 예에 따르면, 상기 항암 요법은 독소루비신, 시스플라틴 또는 파크리탁셀 중 하나 이상의 항암제를 투여하는 것일 수 있다.

본 발명의 또 다른 예에 따르면, 상기 항암 요법은 방사능 요법일 수 있다.

본 발명의 또 다른 예에 따르면, 상기 조성물은 상기 항암 요법의 암세포 사멸 효과를 증대시키는 작용을 통해 항암치료 효과를 증강시키는 것일 수 있다.

본 발명의 또 다른 예에 따르면, 상기 조성물은 상기 항암 요법에 의한 심근비대독성을 억제하는 작용을 통해 항암치료효과를 증강시키는 것일 수 있다.

본 발명의 또 다른 예에 따르면, 상기 조성물은 상기 항암 요법에 의한 식욕부진 효과를 개선시키는 작용을 통해 항암치료효과를 증강시키는 것일 수 있다.

본 발명의 또 다른 예에 따르면, 상기 조성물은 상기 항암 요법의 독성에 대하여 신장 또는 간을 보호하는 작용을 통해 항암치료효과를 증강시키는 것일 수 있다.

본 발명의 조성물은, 항암 요법시 병행하여 처리 됨으로, 항암 요법의 효과를 극대화 하시고 부작용을 줄이는 효과가 있다.

본 발명은 기존 항암 요법의 암치료의 효과를 극대화할 수 있는 항암치료 효과 증강용 조성물에 대한 것이다.

본 발명자들은 기존 항암치료의 문제점을 극복하고 암세포에 대한 선택성을 높이며 절대적 안정성과 강력한 정상세포 보호효과를 가지는 조성을 찾는 것을 목표로 하여 연구를 진행하였다. 또한 항암치료의 독성 및 부작용을 획기적으로 경감하고 센시타이징 효과를 통한 항암치료의 효과를 상승시키며 치료후 재발 혹은 다른 암으로의 전이를 예방 할 수 있는 조성물을 찾는 것을 목표로 하였다.

이러한 목표를 달성하기 위하여, 본 발명자들은 자극성/독성이 없는 천연물 유래의 구조를 갖는 성분으로서 항산화, 항염작용이 뛰어나며 항암치료의 부작용을 보다 효과적으로 줄여줄 수 있는 성분을 찾기 위하여 노력한 바, 천연물에서 추출한 디벤조-р-디옥신 유도체들이 이러한 조건들을 매우 잘 만족시킨다는 것을 발견하여 본 발명을 완성하였다

본 발명은 암세포의 세포사멸을 선택적으로 유도함으로써 정상세포의 손상은 최소화 하면서 항암치료가 가능하도록 한다. 이에 따라 기존 항암요법의 부작용을 70-90% 이상 경감시키며 더불어 기존 항암 요법의 효과를 3배이상 증가시킬 수 있다.

구체적으로, 본 발명은 항암 요법과 병용 투여되는 항암치료 효과 증강용 조성물에 대한 것으로, 하나 이상의 디벤조-p-디옥신(dibenzo-p-dioxine) 유도체를 유효성분으로 포함하는 항암치료 효과 증강용 조성물에 대한 것이다. 상기 디벤조-p-디옥신(dibenzo-p-dioxine) 유도체는 하기 화학식 1 내지 화학식 10 중 하나 이상일 수 있다:

[화학식 1]

[화학식 2]

[화학식 3]

[화학식 4]

[화학식 5]

[화학식 6]

[화학식 7]

[화학식 8]

[화학식 9]

[화학식 10]

상기 화학식 1 내지 10에서, R은 각각 독립적으로 수소, C1~C5의 알킬, C2~C5의 알케닐, 페닐, C7~C12의 페닐알킬, C2~C20의 알카노일, C3~C20의 알케노일, 히드록시페닐, 디히드록시페닐 또는 트리하이드록시페닐일 수 있다.

또한, R은 각각 독립적으로 수소; 메틸; 에테닐; 벤질; 아세틸 또는 올레오일(oleoyl); 4-히드록시페닐; 2,4-히드록시페닐; 또는 2,4,6-트리히드록시페닐인 것이 바람직하다. 더욱 바람직하게는 수소이다.

본 발명의 항암치료 효과 증강용 조성물은, 상기 화학식 1 내지 10의 화합물 중, 화학식3, 화학식 5, 화학식 6 및 화학식 8로 이루어진 군으로부터 선택되는 2종 이상의 화합물을 포함하는 것 일 수 있으며, 이때, 상기 화학식3, 화학식 5, 화학식 6 및 화학식 8의 R은 수소이다. 또한, 본 발명의 항암치료 효과 증강용 조성물에 화학식3, 화학식 5, 화학식 6 및 화학식 8의 화합물이 포함될 경우, 화학식3의 화합물 10~60 중량%, 화학식5의 화합물 15~60 중량%, 화학식6의 화합물 10~40 중량% 및 화학식8의 화합물 5~30 중량%가 포함되어 구성될 수 있다.

본 발명의 항암치료 효과 증강용 조성물은, 상기 화학식 1 내지 10의 화합물 중, 화학식 5, 화학식 6, 화학식 7 및 화학식 8로 이루어진 군으로부터 선택되는 2종 이상의 화합물을 포함하는 것 일 수 있으며, 이때, 상기 화학식 5, 화학식 6, 화학식 7 및 화학식 8의 R은 수소이다. 또한, 본 발명의 항암치료 효과 증강용 조성물에 화학식 5, 화학식 6, 화학식 7 및 화학식 8의 화합물이 포함될 경우, 화학식 5의 화합물 10~60 중량%, 화학식6의 화합물 15~60 중량%, 화학식7의 화합물 10~40 중량% 및 화학식8의 화합물 10~40 중량%가 포함되어 구성될 수 있다.

본 발명의 항암치료 효과 증강용 조성물은, 상기 화학식 1 내지 10의 화합물 중, 화학식3, 화학식 5, 화학식 6, 화학식 8 및 화학식 10로 이루어진 군으로부터 선택되는 2종 이상의 화합물을 포함하는 것 일 수 있으며, 이때, 상기 화학식3, 화학식 5, 화학식 6, 화학식 8 및 화학식 10의 R은 수소이다. 또한, 본 발명의 항암치료 효과 증강용 조성물에 화학식3, 화학식 5, 화학식 6, 화학식 8 및 화학식 10의 화합물이 포함될 경우, 화학식3의 화합물 10~60 중량%, 화학식5의 화합물 5~30 중량%, 화학식6의 화합물 1~40 중량%, 화학식8의 화합물 1~40 중량% 및 화학식 10의 화합물 10~40 중량%가 포함되어 구성될 수 있다.

본 발명의 항암치료 효과 증강용 조성물은, 상기 화학식 1 내지 10의 화합물 중, 화학식1, 화학식 2, 화학식 3, 화학식 4, 화학식 5, 화학식 6, 화학식 7, 화학식 8, 화학식 9 및 화학식 10로 이루어진 군으로부터 선택되는 2종 이상의 화합물을 포함하는 것 일 수 있으며, 이때, 상기 화학식1, 화학식 2, 화학식 3, 화학식 4, 화학식 5, 화학식 6, 화학식 7, 화학식 8, 화학식 9 및 화학식 10의 R은 수소이다. 또한, 본 발명의 항암치료 효과 증강용 조성물에 화학식1, 화학식 2, 화학식 3, 화학식 4, 화학식 5, 화학식 6, 화학식 7, 화학식 8, 화학식 9 및 화학식 10의 화합물이 포함될 경우, 총 조성물 중량 대비 상기 화학식 1의 화합물 0.1-6중량%, 상기 화학식 2의 화합물 0.1-6중량%, 화학식 3의 화합물 1-30중량%, 상기 화학식 4의 화합물 0.5-20중량%, 상기 화학식 5의 화합물 20-40중량%, 상기 화학식 6의 화합물 1-30중량%, 상기 화학식 7의 화합물 0.5-20중량%, 화학식 8의 화합물 1-30중량%, 상기 화학식 9의 화합물 0.1-10중량% 또는 상기 화학식 10의 화합물 0.1-12중량%가 포함될 수 있다.

또한, 본 발명의 항암치료 효과 증강용 조성물은, 상기 화학식 1 내지 10의 화합물 중, 화학식1, 화학식 2, 화학식 3, 화학식 10로 이루어진 군으로부터 선택되는 2종 이상의 화합물을 포함하는 것 일 수 있으며, 이때, 상기 화학식 1, 화학식 2, 화학식 3, 화학식 10의 R은 수소이다. 본 발명의 항암치료 효과 증강용 조성물에 화학식 1, 화학식 2, 화학식 3, 화학식 10의 화합물이 포함될 경우, 화학식 1의 화합물 5~30 중량%, 화학식 2의 화합물 1~30 중량%, 화학식 3의 화합물 50~70 중량% 및 화학식 10의 화합물 5~30 중량%가 포함되어 구성될 수 있다.

본 발명의 조성물은 유방암, 난소암, 폐암, 간암, 위암, 전립선암, 갑상선암, 대장암 또는 자궁경부암의 치료시 사용될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

또한, 본 발명의 조성물의 투여와 병용 가능한 항암 요법은 항암화학요법(Chemotherapy)일 수 있으며, 상기 항암화학요법(Chemotherapy)은 독소루비신, 시스플라틴 또는 파크리탁셀 중 하나 이상의 항암제를 투여하는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 본 발명의 조성물의 투여와 병용 가능한 항암 요법은 방사능 요법일 수 있다.

본 발명의 조성물은 상기 항암 요법의 암세포 사멸 효과를 증대시키는 작용, 항암 요법에 의한 심근비대독성을 억제하는 작용, 항암 요법에 의한 식욕부진 효과를 개선시키는 작용 또는 항암 요법의 독성에 대하여 신장 또는 간을 보호하는 작용을 통해 암치료 효과를 극대화 하는 효과가 있다.

본 발명의 조성물의 하루 사용량은 10-5000mg 정도가 바람직하다. 그러나 사용량이 상기의 범위에 한정되는 것은 아니며, 상기 하루 사용량의 범위 내에서, 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설율 및 질환의 중증도 등에 따라 조절될 수 있다.

본 발명의 조성물의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여 투여될 수 있다. 경구 투여, 복강내 투여, 정맥내 투여, 근육내 투여, 피하 투여, 내피 투여, 비내 투여, 폐내투여, 직장내 투여, 강내 투여, 복강내 투여, 경막내 투여될 수 있다.

본 발명에 따른 조성물은 일일 1회 또는 일정한 시간 간격을 두고 일일 2회 이상 투여될 수 있으며, 항암 요법과 함께 투여 되는 것이 바람직하다.

본 발명의 항암 치료의 효과를 높이는 방법에 사용되는 화합물 및 조성물은 통상적인 모든 방법에 의해 얻을 수 있고, 시판되는 시약을 사용하여 합성 할 수도 있으며, 천연물 특히, 해조류로부터 추출 및 분리하여 얻을 수도 있다.

이하에서, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명한다. 그러나, 하기의 실시예는 본 발명을 더욱 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 하기의 실시예에 의하여 한정되는 것은 아니다. 하기의 실시예는 본 발명의 범위 내에서 당업자에 의해 적절히 수정, 변경될 수 있다.

실시예 1: 갈조류로부터 화합물 1 내지 10의 분리 및 정제

1-1: 갈조류로 부터 폴리페놀 혼합물의 추출

대황(Eisenia bicyclis, 1kg)를 신선한 상태로 착즙기를 이용하여 섬유질을 제거한 후, 95% 에틸알코올(4L)을 추가하여 상온에서 30분간 교반하여 용액만을 걸러낸 후, 건조하여 58g의 갈색분말을 었었다. 얻어진 건조 분말을 20배량의 증류수(50℃)에 용해시킨 후, PVPP(Polyvinylpyrrolidone) 수지(상기 건조분말 중량의 10배)와 혼합하여 교반한 후(50℃, 1hr), 용액을 걸러내어 제거하고, 충분한 량의 증류수(중량비로 PVPP 수지의 5배 이상)로 세척하였다. 세척된 PVPP 수지에 95% 에탄올(중량비로 PVPP 수지의 3배량)을 더하여 상온에서 30분간 교반한 후, 걸러내고, 용액을 취하여 건조하여 8g의 흑갈색 분말을 얻었다. 폴린 시약을 사용하여 총 폴리페놀 함량을 측정한 결과 96.7%로 나타났다.

1-2: 정제된 폴리페놀 혼합물로부터 상기 화합물 1 내지 10의 분리

상기 실시예 1-1에서 얻은 폴리페놀 혼합물을 0.2㎛ 막여과지로 여과하여 고속 액체 크로마토그래피에 로딩(loading)하였다. 고속 액체 크로마토그래피에서, 컬럼은 HP ODS Hypersil 컬럼을, 용매로는 증류수와 메탄올을 사용하였으며, 용매의 공급은 1.0㎖/분의 유속으로 메탄올 15%에서 70%까지 30분간에 걸쳐 선형구배(linear gradient)를 걸어 10개의 활성물질을 분리하였다. 각 화합물은 화학식 1 내지 10의 임을 확인하였다.

[화학식 1]

[화학식 2]

[화학식 3]

[화학식 4]

[화학식 5]

[화학식 6]

[화학식 7]

[화학식 8]

[화학식 9]

[화학식 10]

상기 화학식1 내지 10에서, R은 수소이다.

실시예 2: 화합물 1 내지 10의 화합물을 포함하는 항암치료 효과 증강용 조성물의 제조

하기 표 1에 기재된 조성에 따라, 본 발명의 항암치료 효과 증강용 조성물 1 내지 5를 제조하였다.

시료	시료의 조성 (화학식1내지 10에서 R=H이고, 하기 비율은 중량비임)
조성물 1	화학식3: 화학식5 : 화학식6: 화학식8 = 25:35:20:20
조성물 2	화학식5: 화학식6: 화학식7: 화학식8 = 43:22:12:23
조성물 3	화학식3: 화학식5: 화학식6: 화학식8: 화학식10 = 50:15:10:10:15
조성물 4	화학식1: 화학식2: 화학식3: 화학식4: 화학식5: 화학식6: 화학식7: 화학식8: 화학식9: 화학식10 = 5:5:20:3:25:15:8:12:2:5
조성물 5	화학식1: 화학식2: 화학식3: 화학식10 = 16:8:60:16

참조예 1: 본 발명의 화합물 및 항암치료 효과 증강용 조성물의 암세포 성장 저해 효과

본 발명물의 암세포 성장 저해 효과를 측정하기 위하여 난소암의 항암치료제로 알려져 있는 시스플라틴(Cisplatin)과 상기 화합물 1 내지 10 그리고 상기 조성물 1-5을 사용하였다.

난소 상피암 세포주 (SKOV3, A2780) 를 96-well plate 에 10% FBS, 100units/ml antibiotic antimycotic, 그리고 2.2g/L 탄산수소나트륨(sodium bicarbonate)을 함유한 최소필수배양배지 (Minimun Essential Medium[MEM])를 이용하여 37° C에서 24시간 배양하였다. 난소 상피암 세포주를 1x10⁴ 세포/well 의 농도로 96-well 플레이트(96-well plate)에 분주 하고 24시간 배양하여 세포를 플레이트 바닥에 부착 시킨 다음, 여러 농도의 시스플라틴(Cisplatin)과 상기 화합물 1-10, 조성물 1-5 을 디메틸설폭사이드(DMSO)를 용매로 하여 80ug/ml (A2780) 내지 120ug/ml(SKOV3)의 농도로 세포에 처리 하였다. 이 때 DMSO의 최종농도는 0.1%였으며 이 농도에서는 본 세포주의 세포 성장이나 사멸에 영향을 미치지 못하였다. 24시간 배양한 후 시스플라틴(Cisplatin) 및 상기 화합물 및 조성물에 의한 암세포 성장 저해 효과를 MTT assay를 이용하여 측정하였다. 즉 5mL의 MTT (1mg/ml) 시약을 넣고 4시간 동안 어두운 곳에서 배양한 후 상등액을 제거하고 형성된 MTT fromazan을 DMSO 100ml를 첨가하여 녹인 후 540nm에서 흡광도를 측정하였다. 각 화합물 및 조성물, 그리고 시스플라틴(Cisplatin)의 세포성장을 50% 억제하는 농도를 IC₅₀이라 부르고 이를 하기 표 2에 정리 하였다.

시료	IC₅₀
	SKOV3	A2780
시스플라틴(Cisplatin)	12.30	6.01
화합물 1	120.40	80.05
화합물 2	115.04	76.04
화합물 3	116.08	77.06
화합물 4	115.03	81.02
화합물 5	114.03	79.04
화합물 6	124.02	77.40
화합물 7	120.01	76.34
화합물 8	119.04	75.03
화합물 9	110.90	72.09
화합물 10	112.08	73.98
조성물 1	120.05	80.03
조성물 2	124.05	81.06
조성물 3	125.03	82.04
조성물 4	118.04	79.09
조성물 5	116.07	79.99

그 결과 상기 표 2 에 나타낸 바와 같이 상기 화합물 및 조성물은 항암제인 시스플라틴(Cisplatin)에 비해 매우 높은 IC₅₀값을 보이고 있는데, 이는 매우 높은 세포성장 억제 활성을 보임을 알 수 있다. 즉 상기 화합물과 조성물의 경우 단독처리 만으로도 유의적인 세포 성장 억제 활성을 가지고 있다. 그러나 다소 높은 농도(80-120ug/ml)를 사용해야 한다. 따라서 상기 화합물의 고농도 단독투여 보다는 상기 화합물의 저농도 와 시스플라틴(Cisplatin, cis-Diammineplatinum(II) dichloride; 제조사: Sigma-Aldrich, Co, LLC; 구입처: St. Louis, MO, USA)의 병용 투여가 세포 성장 억제에 효과적일 것으로 생각되어진다.

실험예 1: 본 발명의 항암치료 효과 증강용 조성물의 시스플라틴(Cisplatin)과 병용처리에 의한, 세포사멸 효과

본 발명의 조성물이 세포 주기 및 세포사멸에 미치는 영향을 측정하기 위하여 난소암의 항암치료제로 알려져 있는 시스플라틴(Cisplatin)과 상기 실시예 2에서 제조한 조성물 5를 사용하였다.

세포사멸 효과를 측정 할 수 있는 실험법으로 PI staining을 이용하였는데, PI straining은 프로피디움 요오드화물(Propidium Iodide; PI)를 이용하여 죽어있는 세포의 내 핵을 염색하여 세포 주기 및 세포사를 측정하는 방법이다. 세포주로는 난소 상피암 세포주 (SKOV3) 를 이용하였으며 96-웰 플레이트(96-well plate)에 10% FBS, 100units/ml antibiotic antimycotic, 그리고 2.2g/L 탄산수소나트륨(sodium bicarbonate)을 함유한 최소필수배양배지 (Minimun Essential Medium[MEM])를 이용하여 37° C에서 24시간 배양하였다. 난소 상피암 세포주를 1x10⁴ 세포/well 의 농도로 96-well 플레이트(96-well plate)에 분주 하고 24시간 배양하여 세포를 플레이트 바닥에 부착 시킨 다음, 시스플라틴(Cisplatin) (3uM or 5uM) 혹은 조성물 5(50ug/ml, or 100ug/ml)f,f 단독 혹은 ciplatin +조성물과 병용(저농도 및 고농도) 으로 세포에 세포에 처리 하였다. 48시간 배양 후, 세포를 PBS로 세척한 뒤 Trypsin-EDTA를 사용하여 부착된 세포를 부유시켜 상등액을 1,000rpm에서 10분 동안 원심분리하여 70% 에탄올로 4℃ 에서 24시간 고정 시켰다. 에탄올을 제거한 뒤, PBS로 수차례 세포를 세척한 하고 RNaseA를 첨가한 PBS에 세포를 부유 시킨뒤 PI염색 시약을 넣어 10분 동안 상온의 암소에서 반응시킴. 염색한 시료는 Fluorescence Activated Cell Sorter (FACS)를 이용하여 세포사멸을 측정하였으며 그 결과를 표 3에 정리하였다.

	처리한 물질	세포사멸(%)
단독처리군	시스플라틴(Cisplatin), 3uM	3.0
	시스플라틴(Cisplatin), 5uM	3.5
	조성물 5, 50ug/ml	3.3
	조성물 5, 100ug/ml	23.4
병용 처리군	병용 처리군 (시스플라틴(Cisplatin) 3uM + 조성물 5 50ug/ml)	16.2
	병용 처리군 (시스플라틴(Cisplatin) 5uM + 조성물 5 50ug/ml)	21.8
	병용 처리군 (시스플라틴(Cisplatin) 3uM + 조성물 5 100ug/ml)	37.8
	병용 처리군 (시스플라틴(Cisplatin) 5uM + 조성물 5 1000ug/ml)	51.2

표 3에 나타난 바와 같이 시스플라틴(Cisplatin)을 단독으로 처리한 경우 매우 낮은 암세포사멸 효과를 나타냄을 알 수 있다. 그러나 시스플라틴(Cisplatin)과 상기 조성물 5를 병용투여한 경우 암세포사멸 효과가 매우 커짐을 알 수 있으며 시스플라틴(Cisplatin) 및 조성물의 효과가 커짐에 따라 그 효과도 커짐을 알 수 있다. 즉 병용처리시 단독처리에 의한 암세포 사멸 효과를 더한 값보다 증가하는 것을 알 수 있는데 이는 상가작용(additive effect)에 의한 상승작용(synergistic effect)으로 보인다. 즉 시스플라틴(Cisplatin) 또는 상기 조성물의 단독처리 만으로 유의적인 암세포사멸효과를 보이지 않으나 병용처리하는 경우 유의적인 암세포사멸 효과를 일으키는 것을 확인하였다.

실험예 2: 본 발명의 항암치료 효과 증강용 조성물의 아드레아마이신(Adriamycin)과 병용처리에 의한, 심근비대독성 (Cardiomyopathy) 억제효과

아드레아마이신(독소루비신, Doxorubicin)은 1960년대 이후 가장 흔히 사용되는 항암제 중의 하나로 여러 암종에 효과를 보임으로 광범위하게 사용되어 왔으나, 이 약제의 치명적인 심장 독성으로 인하여 충분한 양의 사용이 제한을 받고 있다. 이에, 본 발명에 의한 조성물의 아드레아마이신에 의한 심근비대 독성을 억제하는 효과를 측정하였다.

총 25마리의 수컷 생쥐 (33±5g, 4주)를 대상으로 네 그룹으로 나누어 실험하였다. 아드레아마이신 군 7마리는 매주 1회씩 1.25mg/kg의 아드레아마이신(제품명: Doxorubicin Hydrochloride; 제조사: Sigma-Aldrich, Co, LLC; 구입처: St. Louis, MO, USA)을 증류수에 혼합하여 총 6주간 복강 내로 주입하였다. 아드레아마이신 및 실시예 2에서 제조한 조성물 4 병합투여군은 저용향 및 고용량의 2그룹으로 하여 각각 7마리에 아드레아마이신을 투여하기 1주전 부터 상기 조성물 4를 매일 32mg/kg 혹은 64mg/kg씩 경구 투여 하였다. 병용투여군의 경우 아드레아마이신군과 마찬가지로 매주 1회씩1.25mg/kg의 아드레아마이신을 증류수에 혼합하여 총 6주간 복강내로 주입하였다. 대조군 4마리는 생리식염수를 매주 1회 총 6주간 주입하고 투여도중 물과 먹이는 충분히 공급하였다.

아드레아마이신을 투여하기 전과 실험후 6주 후에 생쥐를 전신마취시키고 15MHz의 고주파 탐촉자를 이용하여 이면성 및 심초음파를 실시하여 좌심실의 수축기 및 이완기의 벽두께(LVEDD, LVESD)와 수축기 및 이완기말 좌심실 내경(PW)를 측정하였다. 또한 이들에 의해 상대적인 심실벽두께 (RWT), 내경 분획률(FS) 및 좌심실 분획률(LVEF)을 측정하였다. 이러한 심초음파에 의한 평가는 5회 이상 반복하여 평균값을 사용하였다. 각 그룹의 데이터를 하기 표 4에 나타내었다.

	LVEDD(mm)	LVESD(mm)	PW(mm)	RWT (mm)	FS (%)	LVEF(%)
아드레아마이신 투여군
실험전(Baseline)	5.7±0.2	2.4±0.3	1.6±0.2	0.5±0.2	59.0v4.7	85.5v3.3
실험후 (6 week)	6.8v0.3	3.8±0.3	1.4±0.3	0.4±0.1	44.2±3.2	70.3±0.3
Δ(6-0)	1.1±0.1	1.4±0.0	0.2±0.1	0.1±0.1	14.4±1.5	15.2±3.0
저용량 병용투여군 ( 아드레아마이신 +조성물 4)
실험전(Baseline)	5.8±0.2	2.1±0.2	1.6±0.1	0.6±0.0	63.6±3.1	88.7±1.8
실험후 (6 week)	7.1±0.7	3.4±0.6	1.6±0.1	0.4±0.1	52.7±6.3	78.8±5.8
Δ(6-0)	1.3±0.5	1.3±0.4	0.0±0.0	0.2±0.2	10.7±3.2	9.9±1.5
고용량 병용투여군 ( 아드레아마이신 +조성물 4)
실험전(Baseline)	5.8±0.5	2.4±0.8	1.5±0.1	0.5±0.1	58.7±10.2	84.8±7.3
실험후 (6 week)	6.3±0.4	2.8±0.5	1.5±0.1	0.5±0.1	56.4±5.2	82.6±5.2
Δ(6-0)	0.5±0.1	0.4±0.3	0.0±0.0	0.0±0.0	2.3±5.0	2.2±2.1

LVEDD, left ventricular end diastolic dimension(좌심실 수축기 벽두께); LVESD, left ventricular end diastolic dimension(좌심실 이완기 벽두께); PW, posterior wall thickness(좌심실 내경두께); RWT, relative wall thickness(상대적인 심식벽두께); FS, fractional shortening(내경 분획률); LVEF, left ventricular ejection fraction(좌심실분획률).

상기 표 4에서 알 수 있는 바와 같이, 심초음파 결과 아드레아마이신 단독투여군에서는 약물 투여전에 비해 수축기 좌심실 내경이 유의하게 증가되었으며 분획수축률은 유의하게 감소하였고 심장 비대증을 나타내었다. 그러나 본 발명에 의한 조성물4를 병용투여한 군의 경우 저용량군 개선효과를 보였으며 고용량군의 경우 약물 투여 전 후에 심기능 및 심장의 형태학적 변화가 없는 것으로 나타났다. 따라서 본 발명의 조성물은 아드레아마이신에 의한 심비대증에 대해 탁월한 보호효과를 가진 것을 알 수 있었다.

실험예 3: 본 발명의 항암치료 효과 증강용 조성물의 시스플라틴(Cisplatin)과 병용처리에 의한, 난소암 종양성장 억제 활성 및 식욕부진 개선효과

난소암은 전세계적으로 여성에게 다섯번째로 흔하게 발생하는 암이며 가장 사망율이 높은 부인 질환이다. 세계적으로 매년 20만명에 가까운 새로운 난소암 환자가 보고되고 있다. 우리나라에서도 난소암의 발병율이 급격히 증가하고 있으며 많은 연구에도 불구하고 아직까지 예방과 치료에 큰성과를 내고 있지 못하다. 난소암은 특이적인 증상이 없고 확실한 초기 진단 방법이 없어서 대부분 말기가 되어야 진단되며 진단후 5년 생존율은 15% 내외로 매우 낮다. 진행된 난소암의 경우 외과적 수술을 통한 종양제거 및 플라티넘/탁신계의 항암제를 기초로 사용되고 있다. 이러한 일차적인 항암치료는 80%의 높은 화학적 감수성을 보이나 많은 경우 항암제 저항성으로 인해 재발하고 이는 결국 난소암 환자의 낮은 생존율에 원인이 된다. 따라서 항암제와 병용 투여하였을 때 항암제 부작용을 개선하면서 항암제의 저항성을 줄여주는 항암제 감각제의 개발이 시급한 실정이다. 이와 같은 목적에서 상기 실시예 2에서 제조된 본 발명의 항암치료 효과 증강용 조성물을, 난소암 치료에 많이 사용되는 시스플라틴(Cisplatin)과 함께 병용투여 하여 난소암 종양 억제 및 난소암으로 인한 식욕부진 개선 효과를 측정하였다.

난소 상피암 세포주 인 SKOV3를 trypsin-EDTA 용액을 이용하여 배양접시 바닥에서 떼어낸 다음, 10% FBS가 포함되어 있는 RPMI (배양액)에 1×10 cells/150 가 되도록 희석하여 Balb/c nu/nu mice 의 우측 허리에 주사기를 이용하여 피하 주사한다. Caliper를 이용하여 주 2회 암의 크기를 측정한 다음, 크기가 100~150 mm³ 정도 되었을 때 군마다 암의 크기가 일정하도록 하여 4~5마리씩 나누고 대조군 (Control), 시스플라틴(Cisplatin) 단독 처리군 (3 mg/kg), 조성물 3 단독 처리군 (150mg/kg), 조성물 3 저농도 (75 mg/kg)+Cisplatin (3 mg/kg)군, 조성물 3 고농도 (150 mg/kg)+ 시스플라틴 (3 mg/kg)군의 5개의 군으로 나누었다. 4주 간 조성물 3은 경구투여를 , 시스플라틴(Cisplatin)은 복강으로 투여하고 주 3회 암의 크기와 마우스의 무게, 식이량을 측정을 하였다. 4주간의 식이 변화량을 표 5에 나타내었으며 4주간의 암의 부피 변화를 표 6에 나타내었다.

4주 후, 동물을 희생하여 혈액을 채취하여 혈청을 분리하고, 종양을 떼어내고 대조군과 약물 처리군 에서의 종양을 크기, 무게를 측정하였으며 그 결과를 표 6에 나타내었다.

식이량(그램)	0주	1주	2주	3주	4주
대조군	5.0	5.3	5.1	4.9	4.9
시스플라틴(Cisplatin) 단독투여군	4.8	4.6	4.0	3.7	4.1
조성물 3 단독처리군	4.2	4.8	5.1	5.8	5.6
시스플라틴(Cisplatin) + 저용량 조성물	4.7	5.0	5.2	5.1	4.9
시스플라틴(Cisplatin) + 고용량 조성물	4.3	5.1	5.3	5.2	5.1

	종양의 부피 변화 (mm3)				4주 후 종양의 무게(그램)
	1주	2주	3주	4주	4주 후 종양의 무게(그램)
대조군	100	140	160	180	2.2
시스플라틴(Cisplatin) 단독투여군	100	134	144	162	1.7
조성물 3 단독처리군	100	126	142	160	1.3
시스플라틴(Cisplatin) + 저용량 조성물	100	124	140	150	1.1
시스플라틴(Cisplatin) + 고용량 조성물	100	120	126	124	0.8

표 5에 나타난 바와 같이 시스플라틴(Cisplatin) 단독투여군의 경우 대조군에 비하여 투여기간이 길어질수록 식이가 감소함을 알 수 있다. 그러나 상기 조성물 3의 단독투여군의 경우 대조군에 비해 식이 증가를 보였으며 시스플라틴(Cisplatin)과 저용량 조성물 병용투여군의 경우 대조군에 비해 식이 감소를 보이지 않았으며 시스플라틴(Cisplatin) 과 상기조성물의 고용량 투여군의 경우 식이 감소 현상이 타나나지 않은 것을 확인 하였다. 따라서 시스플라틴(Cisplatin)과 본 발명의 조성물을 병용투여 하는 경우 항암제에 의한 식이 감소를 억제할 수 있음을 알 수 있다.

또한 표 6에 나타난 바와 같이 시스플라틴(Cisplatin) 단독 투여군의 경우 대조군에 비하여 약간의 종양크기가 감소한 반면 병용투여군의 경우 대조군에 비해 유의적으로 종양이 감소함을 알 수 있다. 또한 고용량 투여군의 경우 보다 많은 양의 종양 감소효과를 보이고 있음으로 이는 조성물의 농도에 따라 유의적인 종양크기가 감소됨을 알 수 있다. 따라서 시스플라틴(Cisplatin)과 본 발명의 조성물의 병용 투여시 시스플라틴(Cisplatin) 혹은 상기조성물의 단독 투여 보다 난소 상피암의 종양성장을 유의적으로 억제함을 확인하였다. 4주 후의 종양의 무게를 측정한 결과 시스플라틴(Cisplatin)의 단독 투여 보다 상기조성물의 병용투여군의 경우 현저한 종양억제 함을 알 수 있다. 즉 본 발명의 조성물은 난소암 치료에 있어서 항암제와 병용처리시 효과적인 항암 치료 증강제로서 사용될 수 있음을 확인하였다.

실험예 4: 본 발명의 항암치료 효과 증강용 조성물의 시스플라틴(Cisplatin)과 병용처리에 의한, 항암제에 의한 독성으로 신장 및 간 보호 효과

혈액내 AST (GOT)와 ALT (GPT) 수치는 간독성을 확인 할 수 있는 중요한 지표로써 이 효소들은 간세포의 세포질에 존재 하며 독성 물질에 의해 간세포의 세포막이 손상을 받는 경우 혈중으로 유리되는데 따라서 혈중 이들의 농도와 상대적 비율에 따라 간독성 여부를 알 수 있다. 상기 실험예 3에서 채취한 혈액 샘플로 부터 AST (GOT)와 ALT (GPT)를 측정하여 그 값을 표 7에 나타내었다.

또한 생체내로 들어온 각종 화학물질은 일련의 대사효소에 의해 대사되어 신장으로 배설 된다. 따라서 신장은 각종 독성 물질이나 그 대사체가 주로 체내를 빠져 나가는 중요한 장기의 하나로서, 이를 나타내는데 있어서 혈중 Creatinine 과 BUN이 중요한 지표가 된다. 이에, 상기 실험예 3에서 채취한 혈액샘플로 부터 Creatine BUN을 측정하여 그 값을 표 7에 나타내었다.

	AST (U/L)	ALT (U/L)	Creatine(mg/L)	BUN(mg/L)
대조군	86	40	0.6	24
시스플라틴(Cisplatin) 단독투여군	92	42	1.2	37
조성물 3 단독처리군	86	41	0.4	26
시스플라틴(Cisplatin) + 저용량 조성물	88	43	0.9	31
시스플라틴(Cisplatin) + 고용량 조성물	90	45	0.7	29

표 7에서 알 수 있는 바와 같이, 시스플라틴(Cisplatin) 혹은 본 발명의 조성물 3의 단독 투여 시, 대조군 에 비해 AST (GOT)와 ALT (GPT) 모두 유의적인 수치 변화 없음을 알 수 있다. 또한 시스플라틴(Cisplatin) 과 조성물의 병용투여군의 경우 대조군과 비교하여 AST (GOT)와 ALT (GPT) 모두 유의적인 변화가 없음을 알 수 있다. 따라서 본 조성물은 간독성을 일으키지 않음을 알 수 있다.

또한 시스플라틴(Cisplatin)을 단독 투여하는 경우 대조군(Control) 에 비해 Creatinine과 BUN 이 모두 유의적으로 증가하여 시스플라틴(Cisplatin)이 신장 독성이 있음을 알 수 있다. 그러나 시스플라틴(Cisplatin)과 상기 조성물을 병용투여한 경우 Creatine 및 BUN의 값이 대조군에 비해 유의적인 변화를 보이지 않음을 알 수 있다. 따라서 상기조성물은 시스플라틴(Cisplatin)의 투여에 의한 신장독성으로 부터 신장을 보호하는 효과를 가짐을 알 수 있다.

Claims

항암 요법의 항암치료 효과 증강용 조성물에 있어서,
하기 화학식 1 내지 화학식 10으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 디벤조-p-디옥신(dibenzo-p-dioxine) 유도체를 유효성분으로 포함하는 항암치료 효과 증강용 조성물:
[화학식 1]

[화학식 2]

[화학식 3]

[화학식 4]

[화학식 5]

[화학식 6]

[화학식 7]

[화학식 8]

[화학식 9]

[화학식 10]

상기 화학식1 내지 10에서, R은 각각 독립적으로 수소, C1~C5의 알킬, C2~C5의 알케닐, 페닐, C7~C12의 페닐알킬, C2~C20의 알카노일, C3~C20의 알케노일, 히드록시페닐, 디히드록시페닐 또는 트리하이드록시페닐이다.
청구항 1에 있어서,
상기 R은 수소인 것을 특징으로 하는, 항암치료 효과 증강용 조성물.
청구항 1에 있어서,
화학식3, 화학식 5, 화학식 6 및 화학식 8의 화합물을 포함하거나;
화학식 5, 화학식 6, 화학식 7 및 화학식 8의 화합물을 포함하거나;
화학식3, 화학식 5, 화학식 6, 화학식 8 및 화학식 10의 화합물을 포함하거나;
화학식1, 화학식 2, 화학식 3, 화학식 4, 화학식 5, 화학식 6, 화학식 7, 화학식 8, 화학식 9 및 화학식 10의 화합물을 포함하거나; 또는
화학식 1, 화학식 2, 화학식 3 및 화학식 10의 화합물을 포함하는, 항암치료 효과 증강용 조성물.
청구항 1 내지 3 중 어느 한 항에 있어서,
상기 조성물은 유방암, 난소암, 폐암, 간암, 위암, 전립선암, 갑상선암, 대장암 또는 자궁경부암의 치료를 위해 사용되는 것인, 항암치료 효과 증강용 조성물.
청구항 1 내지 3 중 어느 한 항에 있어서,
상기 항암 요법은 독소루비신, 시스플라틴 또는 파크리탁셀 중 하나 이상의 항암제를 투여하는 것인, 항암치료 효과 증강용 조성물.
청구항 1 내지 3 중 어느 한 항에 있어서,
상기 항암 요법은 방사능 요법인, 항암치료 효과 증강용 조성물.
청구항 1 내지 3 중 어느 한 항에 있어서,
상기 조성물은 상기 항암 요법의 암세포 사멸 효과를 증대시키는 작용을 통해 항암치료 효과를 증강시키는 것인, 항암치료 효과 증강용 조성물.
청구항 1 내지 3 중 어느 한 항에 있어서,
상기 조성물은 상기 항암 요법에 의한 심근비대독성을 억제하는 작용을 통해 항암치료 효과를 증강시키는 것인, 항암치료 효과 증강용 조성물.
청구항 1 내지 3 중 어느 한 항에 있어서,
상기 조성물은 상기 항암 요법에 의한 식욕부진 효과를 개선시키는 작용을 통해 항암치료 효과를 증강시키는 것인, 항암치료 효과 증강용 조성물.
청구항 1 내지 3 중 어느 한 항에 있어서,
상기 조성물은 상기 항암 요법의 독성에 대하여 신장 또는 간을 보호하는 작용을 통해 항암치료 효과를 증강시키는 것인, 항암치료 효과 증강용 조성물.