KR20130072660A - 와송 유래 에틸아세테이트 분획물을 유효성분으로 포함하는 암의 예방 또는 치료용 조성물 - Google Patents

와송 유래 에틸아세테이트 분획물을 유효성분으로 포함하는 암의 예방 또는 치료용 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 와송(Orostachys japonicus) 유래 에틸아세테이트 분획물을 유효성분으로 포함하는 암의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 와송(Orostachys japonicus) 유래 에틸아세테이트 분획물은 세포사멸을 유도 및 세포분열을 억제하는 p53 단백질 발현을 증가시키고, bcl-2 패밀리 단백질의 발현 감소를 통해 세포사멸의 주요 경로중 하나인 미토콘드리아 경로를 제어하며, 세포사멸 최종 실행인자인 활성화형 카스파제-3을 증가시키는 기작을 통하여 암세포의 세포사멸(apoptosis)을 효과적으로 유도할 수 있으므로, 이를 유효성분으로 포함하는 본 발명의 조성물은 암의 예방 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있다. 특히 와송(Orostachys japonicus)은 약용 식물로써, 이러한 와송(Orostachys japonicus) 유래 에틸아세테이트 분획물은 천연물질에 해당하므로, 이를 유효성분으로 포함하는 본 발명의 조성물은 장기적 사용에도 안전한 이점을 가진다.

Description

와송 유래 에틸아세테이트 분획물을 유효성분으로 포함하는 암의 예방 또는 치료용 조성물{Composition for Preventing or Treating Cancer Comprising Ethyl Acetate Fraction from Orostachys japonicus}
본 발명은 암의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것으로서, 보다 구체적으로는 와송(Orostachys japonicus) 유래 에틸아세테이트 분획물을 유효성분으로 포함하는 암의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.
현재 통계청 자료에 따르면, 한국인의 사망원인 중 암으로 인한 사망이 1위를 차지하고 있다. 2009년 암으로 인한 사망률이 1999년인 10년 전과 비교해 볼 때 급격히 증가하고 있는 추세이다. 암에 대한 치료는 대부분 화학요법과 함께 외과적 수술, 방사선 요법, 면역 요법 등이 사용되고 있으나, 현재 임상에서 쓰이고 있는 항암제의 대부분은 화학적으로 합성된 물질들로써 정상세포에도 독성을 일으키는 등 문제점들을 야기시키고 있다. 이런 문제들을 해결하고자 최근에는 천연물에서 유래된 항암작용을 가진 생리활성물질을 개발하려는 연구가 활발히 진행되고 있다.
세포사멸(apoptosis)은 다세포 생명체에서 정상적인 기관의 발달과 조직의 항상성 유지에 필수적인 생명현상의 하나로 세포 내의 유전자에 내재되어 있는 program에 의해 진행 되어지는 자발적인 세포의 죽음을 말하는데, 그 조절에 이상이 생길 경우 암이나 퇴행성 질환 등이 된다고 알려져 있다. 따라서 암세포의 세포사멸 정도가 항암 활성의 중요한 지표로 이해되고 있다. 또한 암이라는 것은 세포에 있어서 정상적인 세포 활동이 유지되지 못하고 성장과 분열이 제어가 되지 않아서 무절제한 방식으로 계속해서 세포가 증식하는 현상을 말하는데, 이러한 세포주기 제어기능의 정도 또한 항암 활성을 이해하는데 중요한 지표로 이용되고 있다.
한편 Orostachys japonicus은 국내에서 와송이라는 이름으로 알려져 있으며, 돌나무과의 다년생 초본식물로서 민간에서 주로 항염증, 해열, 해독, 지혈등에 사용되어 왔다. 지금까지 보고된 와송의 성분으로는 friedelin, epi-friedlanol, grutinone, glutinol, triterpenid, β-sitosterol, campesterol, sterol 계열물질, fatty acid ester류, kaempferol, quercetin, flavonoid, 4-hydroxybenzoic acid, 3,4-dihydroxybenzoic acid, gallic acid 등의 aromatic acid 등이 있다. 그러나 일부 와송에 관한 단일물질들은 보고가 되고 있으나, 그에 따른 생리활성과 분자생물학 수준에서의 기작연구는 전무한 실정이다.
이에 본 발명자들은 생체에 부작용이 없으면서 항암 작용이 우수한 천연물질을 찾고자 모색하던 중, 와송(Orostachys japonicus)에 주목하여 이의 약리학적 효과를 실험한 결과, 와송(Orostachys japonicus) 유래 에틸아세테이트 분획물이 암세포들 중 특히 위암세포의 세포사멸을 효과적으로 유도하여 암의 예방 및 치료에 유용하게 사용될 수 있다는 사실을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
따라서 본 발명의 목적은 생체에 부작용이 없으면서 암세포의 세포사멸을 유도하는 작용이 우수하여 암을 예방 또는 치료할 수 있는 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 본 발명에 따른 상기 조성물에 포함되는 생체에 부작용이 없으면서 암세포의 세포사멸을 유도하는 작용이 우수하여 암을 예방 또는 치료할 수 있는 분획물의 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 생체에 부작용이 없으면서 암세포의 세포사멸을 유도하는 작용이 우수하여 암을 예방 또는 개선할 수 있는 건강기능식품을 제공하는 것이다.
상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위해서, 본 발명은 와송(Orostachys japonicus) 유래 에틸아세테이트 분획물을 유효성분으로 포함하는 암의 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 암은 위암일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 와송 유래 에틸아세테이트 분획물은 20 내지 1000μg/ml의 농도로 상기 조성물에 포함될 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 와송 유래 에틸아세테이트 분획물은 p53 단백질 발현을 증가시키고, bcl-2 패밀리 단백질의 발현 감소를 통해 세포사멸의 주요 경로중 하나인 미토콘드리아 경로를 제어하며, 세포사멸 최종 실행인자인 활성화형 카스파제-3을 증가시키는 기작을 통하여 암세포의 세포사멸(apoptosis)을 유도할 수 있다.
또한 본 발명은 (a) 건조된 와송(Orostachys japonicus) 분말을 에탄올을 이용하여 추출하는 단계; (b) 에탄올 추출물을 건조시켜 분말화하는 단계; (c) 에탄올 추출물 분말에 물을 첨가하여 용해시킨 용액에, 상기 용액과 동량의 헥산을 혼합한 다음 교반시켜 헥산 분획물과 물 분획물로 분리하는 단계; (d) 상기 (c) 단계를 통해 수득한 물 분획물에 대해 동량의 디클로로메탄을 첨가하여 혼합한 다음 교반시켜 디클로로메탄 분획물과 물 분획물로 분리하는 단계; 및 (e) 상기 (d) 단계를 통해 수득한 물 분획물에 대해 동량의 에틸아세테이트를 첨가하여 혼합한 다음 교반시켜 에틸아세테이트 분획물과 물 분획물로 분리하는 단계를 포함하는 와송 유래 에틸아세테이트 분획물 제조방법을 제공한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 (a) 단계는 건조된 와송(Orostachys japonicus) 분말을 95%의 에탄올을 이용하여 3회 추출하는 단계일 수 있다.
또한 본 발명은 와송(Orostachys japonicus) 유래 에틸아세테이트 분획물을 유효성분으로 포함하는 암의 예방 또는 개선용 건강기능식품을 제공한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 식품은 음료류, 육류, 초코렛, 식품류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 사탕류, 아이스크림류, 알코올 음료류, 비타민 복합제 및 건강보조식품류로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
본 발명의 와송(Orostachys japonicus) 유래 에틸아세테이트 분획물은 세포사멸을 유도 및 세포분열을 억제하는 p53 단백질 발현을 증가시키고, bcl-2 패밀리 단백질의 발현 감소를 통해 세포사멸의 주요 경로중 하나인 미토콘드리아 경로를 제어하며, 세포사멸 최종 실행인자인 활성화형 카스파제-3을 증가시키는 기작을 통하여 암세포의 세포사멸(apoptosis)을 효과적으로 유도할 수 있으므로, 이를 유효성분으로 포함하는 본 발명의 조성물은 암의 예방 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있다. 특히 와송(Orostachys japonicus)은 약용 식물로써, 이러한 와송(Orostachys japonicus) 유래 에틸아세테이트 분획물은 천연물질에 해당하므로, 이를 유효성분으로 포함하는 본 발명의 조성물은 장기적 사용에도 안전한 이점을 가진다.
도 1은 와송(Orostachys japonicus)으로부터 계통분획법에 따라 용매 분획하는 과정을 간략하게 나타낸 모식도이다.
도 2는 본 발명의 와송 유래 에틸아세테이트 분획물의 농도별 처리 후 시간경과에 따른 위암세포에서 세포생존율을 측정하여 그래프로 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명의 와송 유래 에틸아세테이트 분획물을 위암세포에 처리(100μg/ml 농도의 와송 유래 에틸아세테이트 분획물을 12시간 처리) 후 아넥신 V 및 PI 염색을 통한 세포사멸 정도를 FACS 분석을 통해 측정한 것이다.
도 4는 위암세포에 와송 유래 용매 분획별 처리 후 FACS 분석을 통해 세포생존율 측정한 데이터를 그래프로 나타낸 것이다(EtOH: 에탄올 추출물, Hexane: 헥산 분획물, DCM: 디클로로메탄 분획물, EtOAc: 에틸아세테이트 분획물, BuOH: 부탄올 분획물, H2O: 물 분획물).
도 5는 위암세포에 와송 유래 용매 분획별 처리 후 FACS 분석을 통해 early apoptosis와 late apoptosis 세포의 비율을 측정한 데이터를 그래프로 나타낸 것이다.
도 6은 본 발명의 와송 유래 에틸아세테이트 분획물을 위암세포에 처리(100μg/ml 농도의 와송 유래 에틸아세테이트 분획물을 12시간 처리) 후 세포주기 분포를 FACS 분석을 통해 측정한 것이다.
도 7은 본 발명의 와송 유래 에틸아세테이트 분획물을 위암세포에 처리 후 시간경과에 따른 p53 단백질 발현 정도를 웨스턴 블랏팅을 이용하여 측정한 것이다.
도 8은 위암세포에 와송 유래 용매 분획별 처리(100μg/ml 농도, 12시간) 후 bcl-2 및 bax 단백질 발현 정도를 웨스턴 블랏팅을 이용하여 측정한 것이다.
도 9는 위암세포에 와송 유래 용매 분획별 처리(100μg/ml 농도, 12시간) 후 procaspase-3, cleaved caspase-3 발현 정도를 웨스턴 블랏팅을 이용하여 측정한 것이다.
본 발명은 와송(Orostachys japonicus) 유래 에틸아세테이트 분획물의 신규 용도에 관한 것으로서, 와송 유래 에틸아세테이트 분획물을 유효성분으로 포함하는 암의 예방 또는 치료용 조성물을 제공함에 그 특징이 있다.
본 발명에서 항암 용도로 사용한 상기‘와송(瓦松, Orostachys japonicus)’은 일명 바위솔로 불리는 쌍떡잎식물 장미목 돌나물과의 다년생 초본식물로, 한방고서에 해열, 지열, 간염, 습진, 화상 등에 특효가 있다고 기록되어 있다. 특히, 당뇨병, 중풍, 관절염, 위장병, 팔 다리 아프고, 손발 저림, 변비, 구토, 각종 성인병 등에 특효가 있다고 알려져 있다.
본 발명은 상기와 같은 특징을 갖는 와송의 에틸아세테이트 분획물이 세포사멸을 유도 및 세포분열을 억제하는 p53 단백질 발현을 증가시키고, bcl-2 패밀리 단백질의 발현 감소를 통해 세포사멸의 주요 경로 중 하나인 미토콘드리아 경로를 제어하며, 세포사멸 최종 실행인자인 활성화형 카스파제-3을 증가시키는 기작을 통하여 암세포의 세포사멸(apoptosis)을 효과적으로 유도할 수 있어, 따라서 이러한 작용기작을 통해 암을 예방 또는 치료할 수 있다는 사실을 최초로 규명하였다.
따라서 본 발명은 와송 유래 에틸아세테이트 분획물을 유효성분으로 포함하여 암 질환을 예방 또는 치료할 수 있는 조성물을 제공할 수 있다.
특히 본 발명의 일실시예에 따르면, 와송 유래 에틸아세테이트 분획물을 가지고 다양한 암세포주(위암, 폐암, 간암, 대장암)를 대상으로 항암활성을 분석한 결과, 특이적으로 위암 세포주에 대해서 높은 암 세포증식 억제 효과를 나타내는 것을 알 수 있었으며, 위암이 아닌 다른 암세포주에 대해서는 항암 활성이 약하게 나타난다는 사실을 알 수 있었다(표 1 참조).
이에 본 발명자들은 본 발명의 와송 추출물, 즉, 와송 유래 에틸아세테이트 분획물이 위암을 치료할 수 있는 효과가 있다는 것을 알 수 있었고, 그러므로 본 발명은 와송 유래 에틸아세테이트 분획물을 유효성분으로 포함하는 암의 예방 또는 치료용 조성물을 제공할 수 있다.
또한, 본 발명의 와송 유래 에틸아세테이트 분획물은 조성물에 20 내지 1000μg/ml의 농도로 포함될 수 있다.
본 발명의 일실시예에 따르면, 본 발명의 와송 유래 에틸아세테이트 분획물을 농도별(20, 40, 60, 80, 100, 200μg/mL) 처리 후 시간 경과에 따른 위암 세포증식 억제효과를 살펴본 결과, 농도 의존적으로 위암 세포증식이 억제되는 것을 확인할 수 있었다(도 2 참조).
본 발명에 따른 와송 유래 에틸아세테이트 분획물은 당업계에 공지된 방법을 통해 천연물을 대상으로 하는 추출 및 분리방법을 사용하여 와송 추출물을 수득할 수 있는데, 당업계에 사용되는 추출방법으로 열수추출법, 냉침추출법, 환류냉각추출법, 용매추출법, 수증기증류법, 초음파추출법, 용출법, 압착법 등의 방법 중 어느 하나를 선택하여 사용할 수 있다.
또한, 목적하는 추출물은 추가로 통상의 분획 공정을 수행할 수도 있으며, 통상의 정제 방법을 이용하여 정제될 수도 있다.
바람직하게 본 발명의 항암 활성을 가지는 와송 추출물은 유기용매로서 에틸아세테이트를 사용하는 추출방법을 사용할 수 있다.
또한, 본 발명의 와송 유래 에틸아세테이트 분획물은 용매추출법으로 추출된 1차 추출물을, 감압 증류 및 동결 건조 또는 분무 건조 등과 같은 추가적인 공정을 수행할 수 있고, 또한 상기 1차 추출물을 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(silica gel column chromatography), 박층 크로마토그래피(thin layer chromatography), 고성능 액체 크로마토그래피(high performance liquid chromatography) 등과 같은 다양한 크로마토그래피를 이용하여 추가로 정제하는 과정을 수행할 수 있다.
따라서 본 발명에 있어서 와송 유래 에틸아세테이트 분획물은 추출, 분획 또는 정제의 각 단계에서 얻어지는 모든 추출액, 분획물 및 정제물, 그들의 희석액, 농축액 또는 건조물을 모두 포함하는 개념이다.
본 발명에 따른 와송 유래 에틸아세테이트 분획물을 제조하는 방법을 구체적으로 살펴보면 다음과 같다.
본 발명의 와송 유래 에틸아세테이트 분획물은 (a) 건조된 와송(Orostachys japonicus) 분말을 에탄올을 이용하여 추출하는 단계; (b) 에탄올 추출물을 건조시켜 분말화하는 단계; (c) 에탄올 추출물 분말에 물을 첨가하여 용해시킨 용액에, 상기 용액과 동량의 헥산을 혼합한 다음 교반시켜 헥산 분획물과 물 분획물로 분리하는 단계; (d) 상기 (c) 단계를 통해 수득한 물 분획물에 대해 동량의 디클로로메탄을 첨가하여 혼합한 다음 교반시켜 디클로로메탄 분획물과 물 분획물로 분리하는 단계; 및 (e) 상기 (d) 단계를 통해 수득한 물 분획물에 대해 동량의 에틸아세테이트를 첨가하여 혼합한 다음 교반시켜 에틸아세테이트 분획물과 물 분획물로 분리하는 단계를 통하여 제조될 수 있다.
한편, 본 발명의 와송 유래 에틸아세테이트 분획물을 유효성분으로 포함하는 본 발명의 조성물은 약제학적 조성물이나 식품 조성물로 사용될 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 상기 유효성분 이외에 약제학적으로 적합하고 생리학적으로 허용되는 보조제를 사용하여 제조될 수 있으며, 상기 보조제로는 부형제, 붕해제, 감미제, 결합제, 피복제, 팽창제, 윤활제, 활택제 또는 향미제 등을 사용할 수 있다.
상기 약제학적 조성물은 투여를 위해서 상기 기재한 유효성분 이외에 추가로 약제학적으로 허용 가능한 담체를 1종 이상 포함하여 약제학적 조성물로 바람직하게 제제화할 수 있다.
상기 약제학적 조성물의 제제 형태는 과립제, 산제, 정제, 피복정, 캡슐제, 좌제, 액제, 시럽, 즙, 현탁제, 유제, 점적제 또는 주사 가능한 액제 등이 될 수 있다. 예를 들어, 정제 또는 캡슐제의 형태로의 제제화를 위해, 유효 성분은 에탄올, 글리세롤, 물 등과 같은 경구, 무독성의 약제학적으로 허용 가능한 불활성 담체와 결합될 수 있다. 또한, 원하거나 필요한 경우, 적합한 결합제, 윤활제, 붕해제 및 발색제 또한 혼합물로 포함될 수 있다. 적합한 결합제는 이에 제한되는 것은 아니나, 녹말, 젤라틴, 글루코스 또는 베타-락토오스와 같은 천연 당, 옥수수 감미제, 아카시아, 트래커캔스 또는 소듐올레이트와 같은 천연 및 합성 검, 소듐 스테아레이트, 마그네슘 스테아레이트, 소듐 벤조에이트, 소듐 아세테이트, 소듐 클로라이드 등을 포함한다. 붕해제는 이에 제한되는 것은 아니나, 녹말, 메틸 셀룰로스, 아가, 벤토니트, 잔탄 검 등을 포함한다. 액상 용액으로 제제화되는 조성물에 있어서 허용 가능한 약제학적 담체로는, 멸균 및 생체에 적합한 것으로서, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 알부민 주사용액, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다. 더 나아가 해당분야의 적절한 방법으로 Remington's Pharmaceutical Science, Mack Publishing Company, Easton PA에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 질환에 따라 또는 성분에 따라 바람직하게 제제화 할 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 본 발명의 와송 유래 에틸아세테이트 분획물은 조성물 총 중량에 대하여 20~1000μg/ml의 농도로 포함될 수 있다.
또한, 본 발명의 조성물이 식품 조성물로 사용될 경우, 이러한 식품 조성물은 유효성분인 와송 유래 에틸아세테이트 분획물을 함유하는 것 외에 통상의 식품 조성물과 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다.
상술한 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당, 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 상술한 향미제는 천연 향미제 (타우마틴), 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등) 및 합성 향미제 (사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다.
본 발명의 식품 조성물은 상기 약제학적 조성물과 동일한 방식으로 제제화되어 기능성 식품으로 이용하거나, 각종 식품에 첨가할 수 있다. 본 발명의 조성물을 첨가할 수 있는 식품으로는 예를 들어, 음료류, 육류, 초코렛, 식품류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 사탕류, 아이스크림류, 알코올 음료류, 비타민 복합제 및 건강보조식품류 등이 있다.
또한 상기 식품 조성물은 유효성분인 와송 유래 에틸아세테이트 분획물 외에 여러 가지 영양제, 비타민, 광물 (전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제 (치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그밖에 본 발명의 식품 조성물은 천연 과일 쥬스 및 과일 쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다.
본 발명의 유효성분인 와송 유래 에틸아세테이트 분획물은 천연물질로서 독성 및 부작용은 거의 없으므로 암의 예방 또는 치료 목적으로 장기간 복용시에도 안심하고 사용할 수 있다.
본 발명은 또한 와송 유래 에틸아세테이트 분획물을 유효성분으로 포함하는 암의 예방 또는 개선용 건강기능식품을 제공한다.
본 발명의 건강기능식품은 암의 예방 또는 개선을 목적으로, 정제, 캅셀, 분말, 과립, 액상, 환 등의 형태로 제조 및 가공할 수 있다.
본 발명에서 “건강기능식품”이라 함은 건강기능식품에 관한 법률 제6727호에 따른 인체에 유용한 기능성을 가진 원료나 성분을 사용하여 제조 및 가공한 식품을 말하며, 인체의 구조 및 기능에 대하여 영양소를 조절하거나 생리학적 작용 등과 같은 보건 용도에 유용한 효과를 얻을 목적으로 섭취하는 것을 의미한다.
본 발명의 건강기능식품은 통상의 식품 첨가물을 포함할 수 있으며, 식품 첨가물로서의 적합 여부는 다른 규정이 없는 한, 식품의약품안전청에 승인된 식품 첨가물 공전의 총칙 및 일반시험법 등에 따라 해당 품목에 관한 규격 및 기준에 의하여 판정한다.
상기 “식품 첨가물 공전”에 수재된 품목으로는 예를 들어, 케톤류, 글리신, 구연산칼슘, 니코틴산, 계피산 등의 화학적 합성물; 감색소, 감초추출물, 결정셀룰로오스, 고량색소, 구아검 등의 천연첨가물; L-글루타민산나트륨제제, 면류첨가알칼리제, 보존료제제, 타르색소제제 등의 혼합제제류 등을 들 수 있다.
예를 들어, 정제 형태의 건강기능식품은 본 발명의 유효성분인 와송 유래 에틸아세테이트 분획물을 부형제, 결합제, 붕해제 및 다른 첨가제와 혼합한 혼합물을 통상의 방법으로 과립화한 다음, 활택제 등을 넣어 압축성형하거나, 상기 혼합물을 직접 압축 성형할 수 있다. 또한 상기 정제 형태의 건강기능식품은 필요에 따라 교미제 등을 함유할 수도 있다.
캅셀 형태의 건강기능식품 중 경질 캅셀제는 통상의 경질 캅셀에 본 발명의 유효성분인 와송 유래 에틸아세테이트 분획물을 부형제 등의 첨가제와 혼합한 혼합물을 충진하여 제조할 수 있으며, 연질 캅셀제는 와송 유래 에틸아세테이트 분획물을 부형제 등의 첨가제와 혼합한 혼합물을 젤라틴과 같은 캅셀기제에 충진하여 제조할 수 있다. 상기 연질 캅셀제는 필요에 따라 글리세린 또는 소르비톨 등의 가소제, 착색제, 보존제 등을 함유할 수 있다.
환 형태의 건강기능식품은 본 발명의 유효성분인 와송 유래 에틸아세테이트 분획물과 부형제, 결합제, 붕해제 등을 혼합한 혼합물을 기존에 공지된 방법으로 성형하여 조제할 수 있으며, 필요에 따라 백당이나 다른 제피제로 제피할 수 있으며, 또는 전분, 탈크와 같은 물질로 표면을 코팅할 수도 있다.
과립 형태의 건강기능식품은 본 발명의 유효성분인 와송 유래 에틸아세테이트 분획물과 부형제, 결합제, 붕해제 등을 혼합한 혼합물을 기존에 공지된 방법으로 입상으로 제조할 수 있으며, 필요에 따라 착향제, 교미제 등을 함유할 수 있다.
본 발명의 와송 유래 에틸아세테이트 분획물을 유효성분으로 포함하는 건강기능식품은 하기 실시예에서도 확인한 바와 같이 암세포의 세포사멸을 유의적으로 증가시킬 수 있기 때문에 암의 예방 또는 개선에 효과적이다.
상기 건강기능식품은 음료류, 육류, 초코렛, 식품류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 사탕류, 아이스크림류, 알코올 음료류, 비타민 복합제 및 건강보조식품류 등일 수 있다.
또한 본 발명은 포유동물에게 와송 유래 에틸아세테이트 분획물을 투여하는 것을 포함하는 암의 예방 또는 치료방법을 제공한다.
여기에서 사용된 용어 "포유동물"은 치료, 관찰 또는 실험의 대상인 포유동물을 말하며, 바람직하게는 인간을 말한다.
여기에서 사용된 용어 "치료상 유효량"은 연구자, 수의사, 의사 또는 기타 임상에 의해 생각되는 조직계, 동물 또는 인간에서 생물학적 또는 의학적 반응을 유도하는 유효 성분 또는 약학적 조성물의 양을 의미하는 것으로, 이는 치료되는 질환 또는 장애의 증상의 완화를 유도하는 양을 포함한다. 본 발명의 유효 성분에 대한 치료상 유효 투여량 및 투여횟수는 원하는 효과에 따라 변화될 것임은 당업자에게 자명하다. 그러므로, 투여될 최적의 투여량은 당업자에 의해 쉽게 결정될 수 있으며, 질환의 종류, 질환의 중증도, 조성물에 함유된 유효성분 및 다른 성분의 함량, 제형의 종류, 및 환자의 연령, 체중, 일반 건강 상태, 성별 및 식이, 투여 시간, 투여 경로 및 조성물의 분비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 비롯한 다양한 인자에 따라 조절될 수 있다. 본 발명의 치료방법에 있어서, 성인의 경우, 본 발명의 와송 유래 에틸아세테이트 분획물을 1일 1회 내지 수회 투여시, 1㎎/kg~250㎎/kg의 용량으로 투여하는 것이 바람직하다.
본 발명의 치료방법에서 본 발명의 와송 유래 에틸아세테이트 분획물을 유효성분으로 포함하는 조성물은 경구, 직장, 정맥내, 동맥내, 복강내, 근육내, 흉골내, 경피, 국소, 안구내 또는 피내 경로를 통해 통상적인 방식으로 투여할 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
< 실시예 >
통계분석
모든 실험 결과는 통계 프로그램 SAS (Statistic analysis system)를 이용하여 평균과 표준편차를 구하였다. 통계 처리는 one-way analysis of variance (ANOVA)에 의해 수행하였고 p<0.05 수준에서 Student t-test에 의해 유의차를 검증하였다.
< 실시예 1>
와송 유래 용매 분획물의 제조
와송(Orostachys japonicus) 유래 용매 분획물을 제조하기 위하여, 건조된 실험재료인 와송을 밀양와송 농장에서 공급받아 분말화한 후 사용하였다.
먼저 와송 분말 200g을 3시간 동안 95%의 에탄올을 이용하여 3회 반복 추출하여 에탄올 추출물을 rotary evaporator를 사용하여 에탄올이 증발된 건조 상태의 파우더를 얻은 후, 계통분획법에 따라 하기에서 설시하는 바와 같이 용매분획을 실시하였다.
상기 준비된 와송 에탄올 추출물 건조 분말을 물에 녹여 용액을 제조한 후, 상기 용액과 동량의 헥산을 혼합하고 격렬히 교반시킨 다음 30분간 정치시켜 헥산 분획과 물 분획으로 분리하였다. 분리된 물 분획에 대해 동량의 디클로로메탄을 다시 첨가하여 혼합한 다음 격렬히 교반시킨 후 30분간 정치시켜 디클로로메탄 분획과 물 분획으로 분리하였으며, 이후 앞선 방법과 동일하게 순차적으로 에틸아세테이트 용매, 부탄올 용매를 가하여 에틸아세테이트 분획, 부탄올 분획 및 최종적인 물 분획을 수득하였다(도 1 참조). 분획이 완료된 각 용매의 모든 와송 유래 추출 분획물들은 rotary evaporator를 이용하여 건조시킨 후 막자사발에 갈아서 파우더 형태로 보관하고 필요에 따라 농도별로 제조하여 하기 실험에 사용하였다. 본 발명의 시료로 사용된 와송 유래 분획물은 아래 표 1에서 나타내었다.
와송 유래 분획물의 종류 수득량
헥산 분획물(Hexane) 2.386g
디클로로메탄 분획물(DCM) 2.814g
에틸아세테이트 분획물(EtOAc) 6.806g
부탄올 분획물(BuOH) 13.358g
물 분획물(H2O) 6.221g
< 실험예 1>
와송 유래 용매 분획물이 암세포주에 미치는 영향 측정
<1-1> 세포배양
먼저 본 실험을 실시하기 위하여 위암세포(AGS, human gastric cancer cells), 폐암세포(A548, human lung cancer cells), 간암세포(HepG2, human liver cancer cells), 대장암세포(HT29, human colon cancer cells)를 한국 세포주 은행으로부터 분양받아 사용하였다. 본 세포들은 10% FBS와 1% 5,000unit/mL penicillin-5,000 ug/mL streptomycin이 포함된 DMEM 배지를 사용하여 배양하였다. 세포는 5% CO2가 공급되고 습도가 유지되는 37℃ 배양기에서 배양하며, 2일 간격으로 배지를 교환해주고 세포수의 증식에 따른 과밀도 현상을 해소하기 위해 일주일에 1~2회 계대 배양을 해주었다.
<1-2> 다양한 암세포에 대한 세포독성 측정
상기 실시예 1에서 제조된 와송 유래 용매 분획물이 암세포주에 어떠한 영향을 미치는지 확인하기 위하여, 대표적으로 와송 유래 에틸아세테이트 분획물을 사용하여 다양한 암세포주에 세포독성을 투여량(농도)에 대한 과반수 활성억제농도(inhibitory concentration 50, IC50)로써 측정하였다.
암세포의 성장 억제 효과는 MTS assay 원리를 이용하여 측정하였다. 세포 배양용 96 웰 플레이트에 암세포를 분주한 후 24시간 동안 안정화시키고 적정 농도의 와송 유래 용매분획물질들을 처리하여 시간별 배양한 후, Cell Titer 96 Aqueous One Solution 용액을 처리하여 흡광도를 측정하였다.
그 결과, 하기 표 2에서 나타낸 바와 같이 AGS 세포의 IC50값은 86 μg/ml, A549 세포는 417 μg/ml, HepG2 세포는 700 μg/ml, HT-29 세포는 870 μg/ml 으로 나타나, 본 발명의 와송 유래 에틸아세테이트 분획물이 위암세포주인 AGS 세포의 증식을 효과적으로 억제할 수 있음을 확인할 수 있었다.
암세포주 IC50(μg/mL)a)
AGS 86
A549 417
HepG2 700
HT-29 870
a)IC50는 와송 아세테이트 분획물이 없이 배양된 대조군과 비교하여 세포수를 50% 감소시킬 수 있는 농도이다. 상기 수치는 3번의 반복실험을 통해 얻은 평균값을 나타낸다.
<1-3> 본 발명의 와송 유래 에틸아세테이트 분획물의 농도별 처리에 따른 위암 세포주 세포증식 억제 측정
상기 실험예<1-2>를 통해 본 발명의 와송 유래 에틸아세테이트 분획물이 다른 암세포주와 비교하여 위암 세포주에 억제효과가 월등함을 알 수 있었다. 따라서 본 실험에서는 이러한 와송 유래 에틸아세테이트 분획물의 농도별(20, 40, 60, 80, 100, 200μg/mL) 처리 후 시간경과에 따른 위암 세포증식 억제효과를 살펴보았다. 암세포의 성장 억제 효과는 MTS assay를 이용하여 측정하였다.
그 결과 도 2에서 나타낸 바와 같이, 농도와 시간에 의존적으로 세포증식이 유의하게 억제되는 것을 확인할 수가 있었다.
본 실험예 1을 통해 와송 용매 분획물이 위암세포주에 대한 세포증식 억제가 가장 뛰어난바 하기의 실험에서는 위암세포주를 이용하여 실험을 실시하였다.
< 실험예 2>
와송 유래 용매 분획별 세포사멸 분석
본 발명자들은 상기 실시예 1을 통해 제조된 와송 유래 용매 분획들이 세포사멸(apoptosis)을 효과적으로 유도할 수 있는지 확인하기 위하여, 아넥신 V(Annexin V) 및 PI(propodium iodide) 염색을 통한 FACS 분석을 수행하였다. 실험에 사용된 세포는 위암세포주인 AGS를 사용하였다.
세포사멸의 초기단계에 세포막은 인지질의 구축에 혼란이 생겨서 포스파티딜세린이 세포막의 외측에 노출이 되게 되며, 아넥신 V는 Ca2 +의존성 인지질 결합 단백질로써 특히 포스파티딜세린에 특이적으로 결합 친화도가 높기 때문에, 현재 사멸세포 표면의 포스파티딜세린을 검출하는데 주로 사용되고 있다. 또한 propididum iodide를 이용해서 손상을 입은 DNA를 염색할 수 있다. 따라서 아넥신 V의 포스파티딜세린에 대한 결합정도와 동시에 PI의 염색을 통해서 확실한 세포사멸의 단계를 검출하고자 하였다.
먼저 세포 배양용 12 웰 플레이트에 위암세포주인 AGS 세포를 분주한 후 24시간 동안 안정화시키고, 상기 실시예 1을 통해 제조된 와송 유래 용매 분획물질들을 처리하여 시간별 배양한 후, 세포사멸 측정은 annexin V-FITC apoptosis detection kit를 이용하여 FACSCaliburTM으로 분석하였다.
그 결과 도 3에서 나타낸 바와 같이, 본 발명의 에틸아세테이트 분획물을 100μg/mL 처리한 세포를 아넥신 V와 PI로 염색한 경우, 전체 세포사멸율(total apoptosis rate)이 20.19%로 나타났다. 이를 통해 본 발명의 와송 유래 에틸아세테이트 분획물이 대조군(6.07%)에 비해 3배가량 현저히 높은 세포사멸 유도능을 나타내는 것을 확인할 수 있었다.
또한 도 4 및 도 5에서는 상기 FACS 데이터를 그래프화하여 나타냈는데, 도 4는 생존하고 있는 세포의 비율을, 도 5는 early apoptosis와 late apoptosis 세포의 비율을 나타낸 것이다. 이를 통해 와송 유래 용매 분획물 중 에틸아세테이트 분획물이 가장 낮은 세포 생존율(도 4 참조)과 가장 높은 세포사멸율(도 5 참조)을 보이는 것을 확인할 수 있었다.
상기와 같은 실험결과를 통해 와송 용매 분획물 중 특히 에틸아세테이트 분획물이 위암세포의 세포사멸을 효과적으로 유도할 수 있음을 확인하였으며, 따라서 와송 유래 에틸아세테이트 분획물이 위암의 치료에 유용하게 사용될 수 있다고 판단되었다.
< 실험예 3>
와송 용매 분획별 세포주기 분석
본 발명자들은 상기 실시예 1을 통해 제조된 와송 용매 분획들이 세포주기 회로에서 어떤 단계에 영향을 미치는지 확인하기 위하여, Propidium Iodide(PI)를 이용 염색을 통한 DNA 함량을 측정하였다. 실험에 사용된 세포는 위암세포주인 AGS를 사용하였다.
AGS 세포를 PI로 염색해서 세포의 DNA 함유량을 유세포분석기(flow cytometry)를 이용하여 측정을 하면, 세포사멸(apoptosis)의 증거인 단편화된 DNA가 세포주기의 G1 peak보다 좌측부분에 나타나게 되는데, 이 Sub G1 peak의 존재를 검출함으로써 세포사멸을 확인하였다.
실험을 위하여 세포 배양용 12 웰 플레이트에 암세포를 분주한 후 24시간 동안 안정화시키고 각각의 와송 유래 용매 분획물들을 100μg/mL 농도로 처리하여 시간별 배양한 후, 세포주기 분석은 cell cycle phase determination kit를 이용하여 FACSCaliburTM으로 분석하였다.
그 결과 하기 표 3 및 도 6에서 나타낸 바와 같이, sub G1 peak의 비율을 와송 유래 용매 분획별로 비교해 보면, 에틸아세테이트 분획물에서 가장 높게 측정이 되는 것을 확인할 수 있었다(대조군에서는 sub G1 peak가 0.80%로 나타나 0에 가깝게 측정이 되지만, 세포사멸이 일어난 와송 에틸아세테이트 분획물에서는 7.31%로 나타나 sub G1 peak가 특징적으로 관찰됨).
또한 흥미로운 결과는 세포사멸의 증거인 sub G1 peak의 증가도 물론 확인이 되지만, 동시에 G2/M peak가 25.33%로 나타나 대조군뿐 아니라 다른 와송 유래 용매 분획물에 비해 유의적으로 현저히 높게 측정이 되었다. DNA 합성의 조절 시기에 따라 진핵세포의 세포주기를 4단계로 나누는데, G1기는 유사분열과 DNA 복제가 시작되는 시기에 해당하며, S기는 합성기로서 실질적인 DNA 복제가 일어난다. DNA 합성후에는 G2기가 이어지는데, 이시기에는 세포가 계속 성장하고 유사분열을 준비하는 단계이며, M기는 유사분열기에 해당한다. 이러한 세포주기에는 각 주기별로 다음주기로 진행될 때 아무 이상 없이 세포분열이 잘 진행이 되고 있는지 전반적인 상태를 확인하는 check-point가 존재한다. G2/M transition은 세포분열을 진행하기 전에 DNA복제가 종결되었는지를 확인하는 지점이다. 따라서 G2/M peak가 증가하였다는 것은 G2/M cell cycle arrest를 의미하는 것으로써, 위암세포의 DNA가 손상되어 세포분열이 더 이상 진행되지 못하고 세포분열이 억제되었다는 것을 보여주는 결과이다.
농도(100μg/ml) Sub G1 G1 S G2/M
대조군 0.80±0.19 76.52±0.61 8.31±0.81 11.98±1.56
에탄올 추출물(EtOH) 1.62±0.52 76.16±3.57 7.93±0.16 12.77±0.85
헥산 분획물(Hexane) 2.66±0.69* 77.25±3.04 10.40±1.16 10.12±1.00
디클로로메탄 분획물(DCM) 4.23±0.77* 72.03±1.52* 8.81±0.39 13.56±1.04
에틸아세테이트 분획물(EtOAc) 7.31±0.66* 60.66±2.38* 11.55±1.09* 25.33±1.78*
부탄올 분획물(BuOH) 3.29±0.38* 69.88±2.61* 7.17±0.75 20.15±2.40*
물 분획물(H2O) 1.06±0.20 73.66±3.25 9.05±0.86 14.46±0.78
상기 결과는 전체 처리된 세포들의 퍼센트로써 나타내었으며, 데이터 수치는 평균±표준편차(n=3)를 의미함 (* p<0.05에서 유의적 차이를 가리킴)
< 실험예 4>
와송 용매 분획별 세포사멸 인자에 미치는 영향 분석
본 발명자들은 상기 실험예 2 및 3을 통하여 와송 용매 분획물들의 세포사멸에 대한 효과를 살펴보았다. 본 실험에서는 이러한 세포사멸 관련 신호전달기작을 좀 더 자세히 알아보고자 분자생물학적 수준에서 세포사멸 관련 단백질들의 발현정도를 웨스턴 블랏팅을 이용하여 분석하였다. 실험에 사용된 세포는 위암세포주인 AGS를 사용하였다.
p53은 최초로 알려진 종양억제유전자이며 전사인자로써, 세포외의 스트레스 신호에 의해서 세포의 DNA가 손상이 되면 세포질 내에서 활성화 되어 핵으로 이동하게 되고, 그 결과 핵 안에서 표적 유전자들을 활성화시키는 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 이렇게 활성화된 p53은 세포사멸 유전자, 세포주기 억제 유전자 등을 활성화시킴으로써 세포사멸을 유도하게 되고 세포분열을 억제시키게 되는 것이다. 또한 세포사멸에 관여하는 주요 단백질의 종류로는 bcl-2와 bax가 대표적이다. Bcl-2는 미토콘드리아의 시토크롬 c의 방출을 억제시킴으로써 세포사멸 신호로부터 세포를 보호하는 역할을 수행하는 단백질이며, 이와는 반대로 bax는 미토콘드리아에 스트레스를 주어 세포사멸을 유도하는 단백질로 알려져 있다. 한편 세포사멸의 최종 실행인자인 카스파제-3(caspase-3)은 대부분의 생존세포에 pro-caspase 3이라는 형태로 존재하면서 활성화되면 cleaved caspase 3이라는 실행효소로 전환되어 세포자살을 일으킨다. 본 실험에서는 이러한 여러 가지 세포사멸 관련 단백질들의 발현정도를 통해 와송 유래 용매 분획물들이 세포사멸 관련 신호전달기작에 어떠한 영향을 미치는지 분자생물학적 수준에서 알아보았다.
먼저 와송 유래 용매 분획물질들의 처리에 따른 단백질 발현 변화의 정도를 관찰하기 위하여 정상 및 와송 유래 용매 분획물들이 처리된 배지에서 자란 암세포주를 모아서 세포 용해 버퍼를 첨가한 뒤, 상등액을 취하여 단백질 샘플로 사용하였다. BCA법으로 측정한 동일 양의 단백질 샘플을 2배의 로딩 버퍼와 혼합한 후 12~15% criterion Tris-HCl precast gel에 loading하여 전기영동하고 semi-dry transfer system을 이용하여 PVDF 멤브레인으로 이동시켰다. 멤브레인을 PBST 버퍼로 상온에서 1시간 블로킹 시킨 후, 1차 항체로 4℃에서 밤새 반응시키고, 2차 항체로 1시간 반응시킨 뒤 ECL kit를 이용하여 분석하였으며, 그 결과는 도 7 내지 도 9에서 나타내었다.
도 7은 와송 유래 용매 분획물 중 에틸아세테이트(EtOAc) 분획물을 100 μg/ml을 처리한 후에, 배양시간에 따른 p53 단백질의 AGS 세포에서의 발현 정도를 측정한 결과로써, 시간이 증가함에 따라 p53의 발현이 증가하는 것을 확인할 수가 있었다.
또한 도 8은 각각의 와송 유래 용매 분획물 100 μg/ml을 처리한 후에, 배양 시간에 따른 Bcl-2 단백질과 Bax 단백질의 AGS 세포에서의 발현 정도를 확인한 결과로써, 에틸아세테이트(EtOAc) 분획물에서 현저한 Bcl-2의 감소가 확인이 되었으며, Bax의 경우 대조군과 비교하여 큰 차이를 보이지 않았다.
또한 도 9는 세포사멸의 최종 실행인자인 카스파제-3 단백질의 발현 정도를 측정한 결과로써, 시간이 경과함에 따라 에틸아세테이트(EtOAc) 분획물 처리군에서 비활성화 상태인 pro-caspase 3 단백질이 감소하는 반면, 활성형인 cleaved caspase 3 단백질이 현저히 증가하는 것을 확인할 수가 있었다.
이러한 결과로 미루어 볼 때, 와송 유래 용매 분획물 중 항암활성이 가장 뛰어난 분획물은 에틸아세테이트(EtOAc) 분획물임을 확인할 수가 있었고, 더 나아가 에틸아세테이트(EtOAc) 분획물은 위암세포에 있어서 종양억제 유전자인 p53 단백질은 활성화시키는 반면, bcl-2 단백질 활성은 저하시키는 것으로 보이며, Bax 단백질에 의한 영향은 거의 없는 것을 확인할 수 있었다.
결론적으로 상기 실시예들을 종합해 보면, 와송(Orostachys japonicus)라는 천연물로부터 얻은 분획물이 다양한 암세포들 중 위암세포에서 항암활성이 가장 높게 나타나는 것으로 나타났으며, 특히 와송 유래 용매 분획물 중 에틸아세테이트 분획물에서 월등히 높은 활성을 보이는 것을 확인할 수 있었다. 또한 분자생물학적 수준에서 세포사멸 관련 단백질들의 발현 정도를 분석하여 항암 기작을 확인한 결과, 본 발명의 와송 유래 에틸아세테이트 분획물이 암세포주에 대해 ① 세포사멸을 유도 및 세포분열을 억제하는 p53 단백질 발현을 증가시키고, ② bcl-2 패밀리 단백질 감소를 통해 세포사멸의 주요 경로중 하나인 미토콘드리아 경로를 제어하며, ③ 세포사멸 최종 실행인자인 활성화형 카스파제-3을 시간 의존적으로 증가시키는 것을 확인할 수 있었다. 이러한 결과들은 본 발명의 와송 유래 에틸아세테이트 분획물의 항암 활성을 입증하는데 확실한 과학적 데이터로 활용이 될 것이며, 향후 수많은 관련 환자들에게 도움을 줄 수 있는 바이오헬스 소재로 개발이 가능할 것이라고 판단되었다.
이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

Claims (8)

  1. 와송(Orostachys japonicus) 유래 에틸아세테이트 분획물을 유효성분으로 포함하는 암의 예방 또는 치료용 조성물.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 암은 위암인 것을 특징으로 하는 암의 예방 또는 치료용 조성물.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 와송 유래 에틸아세테이트 분획물은 20 내지 1000μg/ml의 농도로 상기 조성물에 포함되는 것을 특징으로 하는 암의 예방 또는 치료용 조성물.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 와송 유래 에틸아세테이트 분획물은 p53 단백질 발현을 증가시키고, bcl-2 패밀리 단백질의 발현 감소를 통해 세포사멸의 주요 경로중 하나인 미토콘드리아 경로를 제어하며, 세포사멸 최종 실행인자인 활성화형 카스파제-3을 증가시키는 기작을 통하여 암세포의 세포사멸(apoptosis)을 유도하는 것을 특징으로 하는 암의 예방 또는 치료용 조성물.
  5. (a) 건조된 와송(Orostachys japonicus) 분말을 에탄올을 이용하여 추출하는 단계;
    (b) 에탄올 추출물을 건조시켜 분말화하는 단계;
    (c) 에탄올 추출물 분말에 물을 첨가하여 용해시킨 용액에, 상기 용액과 동량의 헥산을 혼합한 다음 교반시켜 헥산 분획물과 물 분획물로 분리하는 단계;
    (d) 상기 (c) 단계를 통해 수득한 물 분획물에 대해 동량의 디클로로메탄을 첨가하여 혼합한 다음 교반시켜 디클로로메탄 분획물과 물 분획물로 분리하는 단계; 및
    (e) 상기 (d) 단계를 통해 수득한 물 분획물에 대해 동량의 에틸아세테이트를 첨가하여 혼합한 다음 교반시켜 에틸아세테이트 분획물과 물 분획물로 분리하는 단계를 포함하는 와송 유래 에틸아세테이트 분획물 제조방법.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 (a) 단계는 95%의 에탄올을 이용하여 3회 추출하는 것을 특징으로 하는 와송 유래 에틸아세테이트 분획물 제조방법.
  7. 와송(Orostachys japonicus) 유래 에틸아세테이트 분획물을 유효성분으로 포함하는 암의 예방 또는 개선용 건강기능식품.
  8. 제7항에 있어서,
    상기 식품은 음료류, 육류, 초코렛, 식품류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 사탕류, 아이스크림류, 알코올 음료류, 비타민 복합제 및 건강보조식품류로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 건강기능식품.
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