KR20130055663A - 개선된 항-혈청 알부민 결합 변이체 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 항-혈청 알부민 면역글로불린 단일 가변 도메인 DOM7h-14-10의 개선된 변이체, 뿐만 아니라 상기 변이체를 포함하는 리간드 및 약물 컨쥬게이트, 조성물, 핵산, 벡터 및 숙주에 관한 것이다.

Description

개선된 항-혈청 알부민 결합 변이체{IMPROVED ANTI-SERUM ALBUMIN BINDING VARIANTS}
본 발명은 항-혈청 알부민 면역글로불린 단일 가변 도메인 DOM7h-14의 개선된 변이체, 뿐만 아니라 이러한 변이체를 포함하는 리간드 및 약물 컨쥬게이트, 조성물, 핵산, 벡터 및 숙주에 관한 것이다.
발명의 배경
WO04003019호 및 WO2008/096158호에는 치료적으로 유용한 반감기를 갖는 항-SA 면역글로불린 단일 가변 도메인(dAb)과 같은 항-혈청 알부민(SA) 결합 모이어티(moiety)가 개시되어 있다. 이러한 문헌은 단량체 항-SA dAb 뿐만 아니라 상기 dAb를 포함하는 다중특이적 리간드, 예를 들어, 항-SA dAb 및 표적 항원, 예를 들어, TNFR1에 특이적으로 결합하는 dAb를 포함하는 리간드가 개시되어 있다. 하나 이상의 종으로부터의 혈청 알부민에 특이적으로 결합하는 결합 모이어티, 예를 들어, 인간/마우스 교차반응성 항-SA dAb가 개시되어 있다.
WO05118642호 및 WO2006/059106호에는 약물의 반감기를 증가시키기 위해 항-SA 결합 모이어티, 예를 들어, 항-SA 면역글로불린 단일 가변 도메인을 약물에 컨쥬게이션시키거나 회합시키는 개념이 개시되어 있다. 단백질, 펩티드 및 신규 화합물(NCE) 약물이 개시되고 예시되어 있다. WO2006/059106호에는 인슐린자극 작용제, 예를 들어, 인크레틴 호르몬, 예를 들어, 글루카곤-유사 펩티드(GLP)-1의 반감기를 증가시키는 상기 개념의 이용이 개시되어 있다.
문헌[Holt et al, "Anti-Serum albumin domain antibodies for extending the half-lives of short lived drugs", Protein Engineering, Design & Selection, vol 21, no 5, pp283-288, 2008]을 또한 참조하라.
WO2008/096158호에는 우수한 항-SA dAb인 DOM7h-14가 개시되어 있다. 질병의 동물 모델 뿐만 아니라 인간 요법 및/또는 진단에서의 유용성을 제공하는, DOM7h-14의 변이체이고, 혈청 알부민, 바람직하게는 인간 및 비-인간 종으로부터의 알부민에 특이적으로 결합하는 개선된 dAb를 제공하는 것이 바람직할 것이다. 비교적 온건한-친화성 내지 높은-친화성의 항-SA 결합 모이어티(dAb)의 선택을 제공하는 것이 또한 바람직할 것이다. 이러한 모이어티는 약물에 연결될 수 있고, 항-SA 결합 모이어티는 고려되는 최종-적용에 따라 선택된다. 이는 항-SA 결합 모이어티의 선택에 따라 만성 또는 급성 적응증을 치료하고/하거나 예방하기 위해 약물이 보다 낫게 맞춤화되도록 한다. 일부 적용에 대해, 단량체이거나 실질적으로 용액 중에 존재하는 항-SA dAb를 제공하는 것이 바람직할 것이다. 이는 수용체를 길항시키는 목적과 함께 항-SA dAb가 세포-표면 수용체, 예를 들어, TNFR1에 특이적으로 결합하는 결합 모이어티, 예를 들어, dAb에 연결되는 경우에 특히 유리할 것이다. 항-SA dAb의 단량체 상태는 수용체 가교의 기회를 감소시키는데 유용한데, 이는 세포 표면 상의 수용체(예를 들어, TNFR1)에 결합하고 이를 가교시켜, 이에 따라 수용체 효능작용 및 유해한 수용체 신호전달의 가능성을 증가시킬 수 있는 다합체가 형성될 가능성이 더 적기 때문이다.
발명의 개요
개선된 항-SA dAb가 PCT/EP2010/052008호 및 PCT/EP2010/052007호에 기재되어 있다.
일 양태에서, 본 발명은 DOM7h-14-56 (SEQ ID NO:72), DOM7h-14-65 (SEQ ID NO:73), DOM7h-14-74 (SEQ ID NO:74), DOM7h-14-76 (SEQ ID NO:75), DOM7h-14-82 (SEQ ID NO:76), DOM7h-14-100 (SEQ ID NO:77), DOM7h-14-101 (SEQ ID NO:78), DOM7h-14-109 (SEQ ID NO:79), DOM7h-14-115 (SEQ ID NO:80), DOM7h-14-116 (SEQ ID NO:81), DOM7h-14-119 (SEQ ID NO:82), DOM7h-14-120 (SEQ ID NO:83), DOM7h-14-121 (SEQ ID NO:84), DOM7h-14-122 (SEQ ID NO:85) 및 DOM7h-14-123 (SEQ ID NO:86)으로부터 선택된 항-혈청 알부민(SA) 면역글로불린 단일 가변 도메인을 제공한다. 일 구체예에서, 1개, 2개, 3개, 4개 또는 5개의 아미노산 차이를 제외하고는 상기 선택된 도메인과 동일한 변이체 단일 가변 도메인이 제공된다.
본 발명의 임의의 양태의 구체예는 우수한 항-혈청 알부민 친화성의 DOM7h-14 변이체를 제공한다. 변이체의 선택은 요망되는 치료 및/또는 예방 환경에 따른 반감기의 맞춤화(tailoring)를 가능케 할 수 있다. 예를 들어, 일 구체예에서, 혈청 알부민에 대한 변이체의 친화성은 비교적 높아서, 상기 변이체는 만성 또는 지속 질병, 질환, 독성 또는 다른 만성 적응증을 치료하고/하거나 예방하는데 유용한 생성물 내의 포함에 유용할 것이다. 일 구체예에서, 혈청 알부민에 대한 변이체의 친화성은 비교적 작아서, 상기 변이체는 급성 질병, 질환, 독성 또는 다른 급성 적응증을 치료하고/하거나 예방하는데 유용한 생성물 내의 포함에 유용할 것이다. 일 구체예에서, 혈청 알부민에 대한 변이체의 친화성은 중간이어서, 상기 변이체는 급성 또는 만성 질병, 질환, 독성 또는 다른 급성 또는 만성 적응증을 치료하고/하거나 예방하는데 유용한 생성물 내의 포함에 유용할 것이다.
혈청 알부민에 대해 적절히 높은 친화성 및 특이성을 갖는 분자는 요망되는 치료 효과를 갖기에 충분히 길게 순환 내에 머무르는 것이 예상될 수 있다(Tomlinson, Nature Biotechnology 22, 521-522(2004)). 여기서, 높은 친화성의 항-SA 변이체는 종의 혈청 알부민의 높은 친화성과 부합하여 혈청 순환 내에 머무를 것이다(WO2008096158). 순환 후, AlbudAb™ 변이체(AlbudAb는 항-혈청 알부민 dAb 또는 면역글로불린 단일 가변 도메인임)에 융합된 임의의 치료제는 NCE, 펩티드 또는 단백질이 되며, 이는 이후에 이의 표적 상에서 보다 길게 작용할 수 있을 것이며, 보다 길게 지속되는 치료 효과를 나타낸다. 이는 빈번한 투여의 필요 없이 만성 또는 지속 질병을 표적화하는 것을 가능케 할 것이다.
작은 친화성(그러나, SA에 대한 특이성)을 갖는 변이체는 짧은 기간(예를 들어, 몇 시간 또는 몇일) 동안만 혈청 순환에 머물러서, 융합된 치료제에 의한 급성 질병과 관련된 치료 표적의 특이적 표적화를 가능케 할 것이다.
이러한 방식에서, 적절한 알부민 결합 친화성 및/또는 혈청 반감기를 갖는 항-SA 변이체를 선택함으로써 항-SA-함유 생성물을 치료 질병 영역에 맞춤화시키는 것이 가능하다.
도메인 항체의 특성 중 하나는 이들이 단량체 또는 이합체 형태로 존재하고 표적에 결합할 수 있다는 것이다. 본 발명의 임의의 양태의 다른 구체예는 단량체 또는 이합체 또는 다합체인 변이체를 제공한다. 표적 가교를 예방하는데 유리한 경우(예를 들어, 표적이 세포 표면 수용체, 예를 들어, 수용체 티로신 키나제, 예를 들어, TNFR1인 경우) 특정 표적 또는 적응증에 대해 단량체 dAb가 바람직할 수 있다. 일부 예에서, 이합체 또는 다합체로서의 결합은 세포 표면 상의 수용체의 수용체 가교를 야기함으로써, 수용체 효능작용(agonism) 및 유해한 수용체 신호전달 가능성을 증가시킬 수 있다. 대안적으로, 표적 가교를 보장하거나, 예를 들어, 결합력 효과, 안정성 또는 용해도를 통한 개선된 결합을 위해서는 이합체를 형성하는 dAb가 바람직할 수 있다.
다중도메인 작제를 포함하는 특정 표적화 방법에 대해, 예를 들어, 상기 기재된 바와 같이 AlbudAb가 혈청 알부민에 결합하는 dAb-AlbudAb™과 같이 이중 표적화 분자가 생성되는 경우에 단량체 dAb를 사용하는 것이 바람직할 수 있는데, 이는 dAb를 이합체화시키는 것이, 예를 들어, 고분자량의 단백질 응집물의 형성을 초래할 수 있기 때문이다.
본 발명의 양태는 상기 기재된 바와 같은 임의의 항-SA 변이체 및 SA가 아닌 표적 항원에 특이적으로 결합하는 결합 모이어티를 포함하는 다중특이적 리간드를 제공한다.
본 발명의 양태는 상기 기재된 바와 같은 임의의 변이체에 융합되거나 컨쥬게이션(NCE에 대해)된 폴리펩티드, 단백질, 펩티드 또는 NCE 약물을 포함하는 융합 생성물, 예를 들어, 펩티드 또는 NCE(신규 화합물) 약물과의 융합 단백질 또는 융합체를 제공한다. 적합하게는, 융합 생성물에서 유용하게 만드는 파트너에 융합되거나 컨쥬게이션되는 경우에 결합 파트너에 대한 변이체의 친화성에 있어서 단지 작은 감소가 관찰된다. 일 구체예에서, 본 발명은 본 발명에 따른 단일 가변 도메인에 융합된 폴리펩티드 또는 펩티드 약물을 포함하는 융합 단백질을 제공하며, 임의로, 여기서 변이체 또는 모이어티는 DOM7h-14-100 (SEQ ID NO:77)이다. 또 다른 구체예에서, 본 발명은 본 발명의 항-SA 단일 가변 도메인을 제공하며, 여기서 가변 도메인은 약물(임의로, NCE 약물)에 컨쥬게이션되고, 임의로, 가변 도메인 또는 모이어티는 DOM7h-14-100 (SEQ ID NO:77)이다.
본 발명의 양태는 임의의 상기 양태의 변이체, 융합 생성물, 단백질 또는 리간드 및 약학적으로 허용되는 희석제, 담체, 부형제 또는 비히클을 포함하는 조성물을 제공한다.
본 발명의 양태는 본원에 개시된 바와 같은 항-혈청 알부민 dAb 및 인크레틴 또는 인슐린 분비 자극 작용제(insulinotropic agent), 예를 들어, 엑센딘-4, GLP-1 (7-37), GLP-1 (6-36) 또는 WO06/059106호에 개시된 임의의 인크레틴 또는 인슐린 분비 자극 작용제를 포함하는 폴리펩티드 융합체 또는 컨쥬게이트를 제공하며, 상기 작용제는 본 발명 및 하기 청구항에서의 포함을 위해 본원에 기재되는 것과 같이 참조로서 본원에 명백히 포함된다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 상기 추가 양태의 항-SA 단일 가변 도메인 및 SA가 아닌 표적 항원에 특이적으로 결합하는 결합 모이어티를 포함하는 다중특이적 리간드를 제공한다.
본 발명은 본 발명의 임의의 양태에 따라 기재된 바와 같은 단일 가변 도메인, 다중특이적 리간드 또는 융합 단백질을 엔코딩하는 누클레오티드 서열을 포함하는 핵산을 제공한다.
본 발명은 SEQ ID NO:87 내지 101로부터 선택된 누클레오티드 서열 또는 상기 선택된 서열과 적어도 80% 동일한 누클레오티드 서열을 포함하는 핵산을 제공한다. 본 발명은 상기 핵산을 포함하는 벡터 또는 상기 벡터를 포함하는 분리된 숙주 세포를 제공한다.
본 발명의 양태는 본 발명의 임의의 양태 또는 구체예에 따른 변이체, 리간드, 융합 생성물, 단백질 또는 조성물의 적어도 1회 용량을 환자에 투여하는 것을 포함하는, 환자의 질병 또는 장애를 치료하거나 예방하는 방법을 제공한다. 또 다른 양태는 약제로서 사용하기 위한 본 발명에 따른 변이체, 리간드, 다중특이적 리간드, 융합 생성물, 융합 단백질, 단백질 또는 조성물을 제공한다.
도면의 간단한 설명
도 1: PCT/EP2010/052007호에 기재된 DOM7h-14 변이체 dAb에 대한 아미노산 서열 정렬. 특정 위치에서의 "."는 이러한 위치에서 DOM7h-14에서 발견된 것과 동일한 아미노산을 나타낸다. CDR은 밑줄과 굵은 글씨로 표시된다(첫번째 밑줄친 서열은 CDR1이고, 두번째 밑줄친 서열은 CDR2이고, 세번째 밑줄친 서열은 CDR3이다).
도 2: DOM7h-14 변이체의 동역학 파라미터. KD 단위 = nM; Kd 단위 = 초-1; Ka 단위 = M-1초-1. 기호법 A e-B는 A x 10-B를 의미하고, C e D는 C x 10D를 의미한다. 하기 실시예에 의해 뒷받침되는 다양한 종에서의 전체 동역학 범위가 표시된다. 특정 치료 환경(급성 또는 만성 적응증, 질환 또는 질병, 및 만성 및 급성 환경 둘 모두에서 사용하기 위한 "중간")에서 사용하기 위한 임의의 범위가 또한 제공된다. 고 친화성 dAb 및 이를 포함하는 생성물은 만성 환경에 유용하다. 중간 친화성 dAb 및 이를 포함하는 생성물은 중간 환경에서 유용하다. 저 친화성 dAb 및 이를 포함하는 생성물은 급성 환경에 유용하다. 상기와 관련된 친화성은 혈청 알부민에 대한 친화성이다. 다양한 예시적 항-혈청 dAb 및 융합 단백질이 나열되며, 이들은 개시된 범위를 뒷받침한다. 실시예 중 많은 실시예는 인간 및 하나 이상의 비-인간 동물(예를 들어, 인간 및 시노몰구스 원숭이 및/또는 마우스)에서 바람직한 동역학을 갖는다. dAb 및 이를 포함하는 생성물의 선택은 치료적으로 치료되는 환경(예를 들어, 만성 또는 급성)에 따라 본 발명에 따라 맞춤화될 수 있다.
도 3: 본원에 기재된 DOM7h-14-10 변이체 dAb에 대한 아미노산 서열 정렬.
발명의 상세한 설명
본 명세서 내에서, 본 발명은 명세서가 명백하고 간결하게 기재되는 것을 가능케 하는 방식으로 구체예를 참조로 하여 기재된다. 구체예는 본 발명으로부터 벗어남이 없이 다양하게 조합되거나 분리될 수 있으며, 이는 인지되어야 한다.
달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용되는 모든 기술 및 과학 용어는 당 분야(예를 들어, 세포 배양, 분자 유전학, 핵산 화학, 하이브리드화 기술 및 생화학)의 당업자에 의해 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 표준 기술은 분자적, 유전적 및 생화학 방법(일반적으로, 참조로서 본원에 포함되는 문헌[Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2d ed. (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. and Ausubel et al., Short Protocols in Molecular Biology (1999) 4th Ed, John Wiley & Sons, Inc] 참조) 및 화학적 방법에 사용된다.
"환자"는 임의의 동물, 예를 들어, 포유동물, 예를 들어, 비-인간 영장류(예를 들어, 비비, 레수스(rhesus) 원숭이 또는 시노몰구스 원숭이), 마우스, 인간, 토끼, 래트, 개, 고양이 또는 돼지이다. 일 구체예에서, 환자는 인간이다.
본원에서 사용되는 항체는 항체를 자연적으로 생성하는 임의의 종으로부터 유래되거나 재조합 DNA 기술에 의해 생성되거나, 혈청, B-세포, 하이브리도마, 트랜스펙토마(transfectoma), 효모 또는 박테리아로부터 분리되건 간에 IgG, IgM, IgA, IgD 또는 IgE 또는 단편(예를 들어, Fab , Fab', F(ab')2, Fv, 이황화 결합된 Fv, scFv, 폐쇄된 형태의 다중특이적 항체, 이황화 결합된 scFv, 디아바디(diabody))을 의미한다.
본원에서 사용되는 "항체 포맷"은 하나 이상의 항체 가변 도메인이 항원에 대한 결합 특이성을 제공하기 위해 구조 상에 통합될 수 있는 임의의 적합한 폴리펩티드 구조를 의미한다. 다양한 적합한 항체 포맷, 예를 들어, 키메라 항체, 인간화된 항체, 인간 항체, 단쇄 항체, 이중 특이적 항체, 항체 중쇄, 항체 경쇄, 항체 중쇄 및/또는 경쇄의 동종이합체 및 이종이합체, 상기 중 임의의 것의 항원-결합 단편(예를 들어, Fv 단편(예를 들어, 단쇄 Fv (scFv), 이황화 결합된 Fv), Fab 단편, Fab' 단편, F(ab')2 단편), 단일 항체 가변 도메인(예를 들어, dAb, VH, VHH, VL), 및 상기 중 임의의 것의 변형된 형태(예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜 또는 다른 적합한 중합체 또는 인간화된 VHH의 공유 부착에 의해 변형됨)가 당 분야에 공지되어 있다.
구 "면역글로불린 단일 가변 도메인"은 상이한 V 영역 또는 도메인과 독립적으로 항원 또는 에피토프에 특이적으로 결합하는 항체 가변 도메인(VH, VHH, VL)을 의미한다. 면역글로불린 단일 가변 도메인은 다른 가변 영역 또는 가변 도메인을 갖는 포맷(예를 들어, 동종중합체 또는 이종중합체)으로 제공될 수 있으며, 여기서 상기 다른 영역 또는 도메인은 단일 면역글로불린 가변 도메인에 의한 항원 결합에 필요하지 않다(즉, 면역글로불린 단일 가변 도메인은 추가 가변 도메인과는 독립적으로 항원에 결합함). "도메인 항체" 또는 "dAb"는 본원에서 사용되는 용어 "면역글로불린 단일 가변 도메인"과 동일하다. "단일 면역글로불린 가변 도메인"은 본원에서 사용되는 용어 "면역글로불린 단일 가변 도메인"과 동일하다. "단일 항체 가변 도메인" 또는 "항체 단일 가변 도메인"은 본원에서 사용되는 용어 "면역글로불린 단일 가변 도메인"과 동일하다. 면역글로불린 단일 가변 도메인은 일 구체예에서 인간 항체 가변 도메인이나, 이는 또한, 다른 종, 예를 들어, 설치류로부터의 단일 항체 가변 도메인(예를 들어, 전체내용이 참조로서 본원에 포함되는 WO00/29004호에 개시된 바와 같은 단일 항체 가변 도메인), 너스 상어(nurse shark) 및 카멜리드 VHH dAb를 포함한다. 카멜리드 VHH는 경쇄가 자연적으로 결여된 중쇄 항체를 생성하는 낙타, 라마, 알파카, 단봉낙타, 및 과나코를 포함하는 종으로부터 유래되는 면역글로불린 단일 가변 도메인 폴리펩티드이다. VHH는 인간화될 수 있다.
"도메인"은 단백질의 나머지와 독립적인 3차 구조를 갖는 폴딩된 단백질 구조이다. 일반적으로, 도메인은 단백질의 별개의 기능적 특성을 담당하며, 많은 경우에, 단백질 및/또는 도메인의 나머지의 기능의 손실 없이 첨가되거나, 제거되거나, 다른 단백질로 옮겨질 수 있다. "단일 항체 가변 도메인"은 항체 가변 도메인의 서열 특징을 포함하는 폴딩된 폴리펩티드 도메인이다. 따라서, 이는 완전한 항체 가변 도메인, 및, 예를 들어, 하나 이상의 루프가 항체 가변 도메인의 특징이 아닌 서열에 의해 대체된 변형된 가변 도메인, 또는 트렁케이션되거나 N-말단 신장 또는 C-말단 신장을 포함하는 항체 가변 도메인 뿐만 아니라 적어도 완전한 길이의 도메인의 결합 활성 및 특이성을 보유하는 가변 도메인의 폴딩된 단편을 포함한다.
본 출원에서, 용어 "예방" 및 "예방하는"은 질병 또는 질환의 유도 전의 보호 조성물의 투여를 포함한다. "치료" 및 "치료하는"은 질병 또는 질환 증상이 나타난 후의 보호 조성물의 투여를 포함한다. "억제" 또는 "억제하는"은 유도 사건 후이지만 질병 또는 질환의 임상적 출현 전의 조성물의 투여를 의미한다.
본원에서 사용되는 용어 "용량"은 한번에 모두(단위 용량) 또는 규정된 시간 간격에 걸쳐 2회 이상의 투여로 피검체에 투여되는 리간드의 양을 의미한다. 예를 들어, 용량은 1일(24시간)(매일 용량), 2일, 1주, 2주, 3주 또는 1개월 이상의 과정에 걸쳐 피검체에 투여(예를 들어, 단일 투여 또는 2회 이상의 투여에 의함)되는 리간드(예를 들어, 표적 항원에 결합하는 면역글로불린 단일 가변 도메인을 포함하는 리간드)의 양을 의미할 수 있다. 투여 사이의 간격은 임의의 요망되는 시간의 양일 수 있다. 용량에 대해 언급되는 경우 용어 "약학적으로 효과적인"은 요망되는 효과를 제공하는 리간드, 도메인 또는 약학적 활성제의 충분한 양을 의미한다. "효과적인" 양은 개체의 연령 및 전반적 상태, 특정 약물 또는 약학적 활성제 등에 따라 피검체마다 다양할 것이다. 따라서, 모든 환자에게 적용가능한 정확한 "효과적인" 양을 상술하는 것이 항상 가능한 것은 아니다. 그러나, 임의의 개별적 환자에서의 적절한 "효과적인" 용량은 통상적인 실험을 이용하여 당업자에 의해 결정될 수 있다.
약동학 분석 방법 및 리간드(예를 들어, 단일 가변 도메인, 융합 단백질 또는 다중특이적 리간드) 반감기의 결정은 당업자에게 친숙할 것이다. 세부사항은 문헌[Kenneth , A et al: Chemical Stability of Pharmaceuticals: A Handbook for Pharmacists and in Peters et al, Pharmacokinetc analysis: A Practical Approach (1996)]에서 발견될 수 있다. t 알파 및 t 베타 반감기 및 곡선하영역(AUC)과 같은 약동학 파라미터를 기재하는 문헌["Pharmacokinetics", M Gibaldi & D Perron, published by Marcel Dekker, 2nd Rev. ex edition (1982)]가 또한 언급될 수 있다. 임의로, 본원에 인용된 모든 약동학 파라미터 및 값은 인간에서의 값인 것으로 판독되어야 한다. 임의로, 본원에 인용된 모든 약동학 파라미터 및 값은 마우스 또는 래트 또는 시노몰구스 원숭이에서의 값인 것으로 판독되어야 한다.
반감기(t½ 알파 및 t½ 베타) 및 AUC는 시간에 대한 리간드의 혈청 농도의 곡선으로부터 결정될 수 있다. WinNonlin 분석 패키지, 예를 들어, 버전 5.1(Pharsight Corp., Mountain View, CA94040, USA로부터 이용가능함)가, 예를 들어, 곡선을 모델링하기 위해 사용될 수 있다. 2-구획 모델링이 사용되는 경우, 첫번째 단계(알파 단계)에서, 리간드는 약간의 제거와 함께 주로 환자 내의 분포를 겪는다. 두번째 단계(베타 단계)는 리간드가 분포되고, 리간드가 환자로부터 청소됨에 따라 혈청 농도가 감소되는 단계이다. t 알파 반감기는 첫번째 단계의 반감기이고, t 베타 반감기는 두번째 단계의 반감기이다. 따라서, 일 구체예에서, 본 발명의 상황에서, 가변 도메인, 융합 단백질 또는 리간드는 15분(또는 약 15분) 또는 이 초과의 범위의 tα 반감기를 갖는다. 일 구체예에서, 상기 범위의 하한은 30분, 45분, 1시간, 2시간, 3시간, 4시간, 5시간, 6시간, 7시간, 10시간, 11시간 또는 12시간(또는 약 30분, 약 45분, 약 1시간, 약 2시간, 약 3시간, 약 4시간, 약 5시간, 약 6시간, 약 7시간, 약 10시간, 약 11시간 또는 약 12시간)이다. 또한, 또는 대안적으로, 본 발명에 따른 가변 도메인, 융합 단백질 또는 리간드는 12시간(또는 약 12시간) 이하의 범위의 tα 반감기를 가질 것이다. 일 구체예에서, 상기 범위의 상한은 11, 10, 9, 8, 7, 6 또는 5시간(또는 약 11, 약 10, 약 9, 약 8, 약 7, 약 6 또는 약 5시간)이다. 적합한 범위의 예는 1 내지 6시간, 2 내지 5시간 또는 3 내지 4시간(또는 약 1 내지 약 6시간, 약 2 내지 약 5시간 또는 약 3 내지 약 4시간)이다.
일 구체예에서, 본 발명은 2.5시간(또는 약 2.5시간) 또는 그 초과의 범위의 tβ 반감기를 갖는 본 발명에 따른 가변 도메인, 융합 단백질 또는 리간드를 제공한다. 일 구체예에서, 상기 범위의 하한은 3시간, 4시간, 5시간, 6시간, 7시간, 10시간, 11시간, 또는 12시간(또는 약 3시간, 약 4시간, 약 5시간, 약 6시간, 약 7시간, 약 10시간, 약 11시간, 또는 약 12시간)이다. 또한, 또는 대안적으로, tβ 반감기는 21 또는 25일(또는 약 21 또는 약 25일) 이하이다. 일 구체예에서, 상기 범위의 상한은 12시간, 24시간, 2일, 3일, 5일, 10일, 15일, 19일, 20일, 21일 또는 22일(약 12시간, 약 24시간, 약 2일, 약 3일, 약 5일, 약 10일, 약 15일, 약 19일, 약 20일, 약 21일 또는 약 22일)이다. 예를 들어, 본 발명에 따른 가변 도메인, 융합 단백질 또는 리간드는 12 내지 60시간(또는 약 12 내지 약 60시간) 범위의 tβ 반감기를 가질 것이다. 한 추가 구체예에서, 이는 12 내지 48시간(또는 약 12 내지 약 48시간) 범위일 것이다. 한 추가 구체예에서, 이는 12 내지 26시간(또는 약 12 내지 약 26시간) 범위일 것이다.
2-구획 모델링을 이용하는 것에 대한 대안으로서, 당업자는 비-구획 모델링의 사용에 친숙할 것이며, 이는 말기 반감기(이와 관련하여, 본원에서 사용되는 용어 "말기 반감기"는 비-구획 모델링을 이용하여 결정된 말기 반감기를 의미함)를 결정하는데 사용될 수 있다. WinNonlin 분석 패키지, 예를 들어, 버전 5.1(Pharsight Corp., Mountain View, CA94040, USA로부터 이용가능함)이, 예를 들어, 상기 방식으로 곡선을 모델링하는데 이용될 수 있다. 이러한 예에서, 한 구체예에서, 단일 가변 도메인, 융합 단백질 또는 리간드는 적어도 8시간, 10시간, 12시간, 15시간, 28시간, 20시간, 1일, 2일, 3일, 7일, 14일, 15일, 16일, 17일, 18일, 19일, 20일, 21일, 22일, 23일, 24일 또는 25일(또는 적어도 약 8시간, 약 10시간, 약 12시간, 약 15시간, 약 28시간, 약 20시간, 약 1일, 약 2일, 약 3일, 약 7일, 약 14일, 약 15일, 약 16일, 약 17일, 약 18일, 약 19일, 약 20일, 약 21일, 약 22일, 약 23일, 약 24일 또는 약 25일)의 말단 반감기를 갖는다. 일 구체예에서, 상기 범위의 상한은 24시간, 48시간, 60시간 또는 72시간 또는 120시간(또는 약 24시간, 약 48시간, 약 60시간 또는 약 72시간 또는 약 120시간)이다. 예를 들어, 말단 반감기는, 예를 들어, 인간에서 8 시간 내지 60시간, 또는 8시간 내지 48시간 또는 12시간 내지 120시간(또는 약 8 시간 내지 약 60시간, 또는 약 8시간 내지 약 48시간 또는 약 12시간 내지 약 120시간)이다.
상기 기준에 더하여, 또는 상기 기준에 대안적으로, 본 발명에 따른 가변 도메인, 융합 단백질 또는 리간드는 1 mg.분/ml(또는 약 1 mg.분/ml) 또는 그 초과의 범위의 AUC 값(곡선하영역)을 갖는다. 일 구체예에서, 상기 범위의 하한은 5, 10, 15, 20, 30, 100, 200 또는 300 mg.분/ml(또는 약 5, 약 10, 약 15, 약 20, 약 30, 약 100, 약 200 또는 약 300 mg.분/ml)이다. 또한, 또는 대안적으로, 본 발명에 따른 가변 도메인, 융합 단백질 또는 리간드는 600 mg.분/ml(또는 약 600 mg.분/ml) 이하의 범위의 AUC를 갖는다. 일 구체예에서, 상기 범위의 상한은 500, 400, 300, 200, 150, 100, 75 또는 50 mg.분/ml(또는 약 500, 약 400, 약 300, 약 200, 약 150, 약 100, 약 75 또는 약 50 mg.분/ml)이다. 유리하게는, 가변 도메인, 융합 단백질 또는 리간드는 15 내지 150 mg.분/ml, 15 내지 100 mg.분/ml, 15 내지 75 mg.분/ml, 및 15 내지 50mg.분/ml으로 구성되는 군으로부터 선택된 범위(또는 이의 대략의 범위)의 AUC를 가질 것이다.
"표면 플라즈몬 공명": 특정 항원 또는 에피토프, 예를 들어, 인간 혈청 알부민이 본원에 기재된 혈청 알부민 결합 리간드, 예를 들어, 특이적 dAb에 대한 결합에 대해 또 다른 항원 또는 에피토프, 예를 들어, 시노몰구스 혈청 알부민과 경쟁하는지 결정하기 위해 경쟁 검정이 이용될 수 있다. 유사하게, 첫번째 리간드, 예를 들어, dAb가 표적 항원 또는 에피토프에 대한 결합에 대해 두번째 리간드, 예를 들어, dAb와 경쟁하는지 결정하기 위해 경쟁 검정이 이용될 수 있다. 본원에서 사용되는 용어 "경쟁하다"는 2개 이상의 분자 사이의 특이적 결합 상호작용을 어느 정도까지 방해할 수 있는 물질, 예를 들어, 분자, 화합물, 바람직하게는 단백질을 의미한다. 구 "경쟁적으로 억제하지 않는"은 2개 이상의 분자 사이의 특정 결합 상호작용을 임의의 측정가능하거나 유의한 정도까지 방해하지 않는 물질, 예를 들어, 분자, 화합물, 바람직하게는 단백질을 의미한다. 2개 이상의 분자 사이의 특정 결합 상호작용은 바람직하게는 단일 가변 도메인과 이의 인지체 파트너 또는 표적 사이의 특정 결합 상호작용을 포함한다. 방해 또는 경쟁 분자는 또 다른 단일 가변 도메인일 수 있거나, 이는 인지체 파트너 또는 표적과 구조적 및/또는 기능적으로 유사한 분자일 수 있다.
용어 "결합 모이어티"는 상이한 에피토프 또는 항원 결합 도메인과 독립적으로 항원 또는 에피토프에 특이적으로 결합하는 도메인을 의미한다. 결합 모이어티는 도메인 항체(dAb)일 수 있거나, 이는 자연 리간드가 아닌 리간드(본 발명의 경우, 모이어티는 혈청 알부민에 결합됨)에 결합하는 CTLA-4, 리포칼린(lipocalin), SpA, 어피바디(affibody), 아비머(avimer), GroE1, 트랜스페린(transferrin), GroES 및 피브로넥틴(fibronectin)으로 구성된 군으로부터 선택된 스캐폴드와 같은 비-면역글로불린 단백질 스캐폴드의 유도체인 도메인일 수 있다. 단백질 스캐폴드의 예 및 레퍼토리로부터 항원 또는 에피토프-특이적 결합 도메인을 선택하기 위한 방법이 개시된 WO2008/096158호를 참조하라(실시예 17 내지 25 참조). WO2008/096158호의 상기 특정 개시는 본 발명과 함께 사용하기 위해 본원에 명백히 기재되는 것과 같이 참조로서 본원에 명백히 포함되고, 상기 개시의 임의의 부분이 본원의 하나 이상의 청구항에 포함될 수 있는 것이 고려된다.
일 구체예에서, 본 발명의 임의의 양태 또는 구체예에 따른 변이체 또는 결합 모이어티는 하기 동역학 특징 중 하나 이상을 포함한다:
(a) 변이체 또는 모이어티는 표면 플라즈몬 공명에 의해 결정시 0.1(또는 약 0.1) 내지 10000 nM(또는 약 10000 nM), 임의로 1(또는 약 1) 내지 6000 nM(또는 약 6000 nM)의 해리상수(KD)로 인간 SA에 특이적으로 결합하는 결합 부위를 포함하고/하거나;
(b) 변이체 또는 모이어티는 표면 플라즈몬 공명에 의해 결정시 1.5 x 10-4(또는 약 1.5 x 10-4) 내지 0.1 초-1(또는 약 0.1 초-1), 임의로 3 x 10-4(또는 약 3 x 10-4) 내지 0.1 초-1(또는 0.1 초-1)의 분리속도 상수(Kd)로 인간 SA에 특이적으로 결합하는 결합 부위를 포함하고/하거나;
(c) 변이체 또는 모이어티는 표면 플라즈몬 공명에 의해 결정시 2 x 106(또는 약 2 x 106) 내지 1 x 104 M-1초-1(또는 약 1 x 104 M-1초-1), 임의로 1 x 106(또는 약 1 x 106) 내지 2 x 104 M-1초-1(또는 약 2 x 104 M-1초-1)의 결합속도 상수(Ka)로 인간 SA에 특이적으로 결합하는 결합 부위를 포함하고/하거나;
(d) 변이체 또는 모이어티는 표면 플라즈몬 공명에 의해 결정시 0.1(또는 약 0.1) 내지 10000 nM(또는 약 10000 nM), 임의로 1(또는 약 1) 내지 6000 nM(또는 약 6000 nM)의 해리상수(KD)로 시노몰구스 원숭이 SA에 특이적으로 결합하는 결합 부위를 포함하고/하거나;
(e) 변이체 또는 모이어티는 표면 플라즈몬 공명에 의해 결정시 1.5 x 10-4(또는 약 1.5 x 10-4) 내지 0.1 초-1(또는 약 0.1 초-1), 임의로 3 x 10-4(또는 약 3 x 10-4) 내지 0.1 초-1(또는 약 0.1 초-1)의 분리속도 상수(Kd)로 시노몰구스 원숭이 SA에 특이적으로 결합하는 결합 부위를 포함하고/하거나;
(f) 변이체 또는 모이어티는 표면 플라즈몬 공명에 의해 결정시 2 x 106(또는 약 2 x 106) 내지 1 x 104 M-1초-1(또는 약 1 x 104 M-1초-1), 임의로 1 x 106(또는 약 1 x 106) 내지 5 x 103 M-1초-1(또는 약 5 x 103 M-1초-1)의 결합속도 상수(Ka)로 시노몰구스 원숭이 SA에 특이적으로 결합하는 결합 부위를 포함하고/하거나;
(g) 변이체 또는 모이어티는 표면 플라즈몬 공명에 의해 결정시 1(또는 약 1) 내지 10000 nM(또는 약 10000 nM), 임의로 20(또는 약 20) 내지 6000 nM(또는 약 6000 nM)의 해리상수(KD)로 래트 SA에 특이적으로 결합하는 결합 부위를 포함하고/하거나;
(h) 변이체 또는 모이어티는 표면 플라즈몬 공명에 의해 결정시 2 x 10-3(또는 약 2 x 10-3) 내지 0.15 초-1(또는 약 0.15 초-1), 임의로 9 x 10-3(또는 약 9 x 10-3) 내지 0.14 초-1(또는 약 0.14 초-1)의 분리속도 상수(Kd)로 래트 SA에 특이적으로 결합하는 결합 부위를 포함하고/하거나;
(i) 변이체 또는 모이어티는 표면 플라즈몬 공명에 의해 결정시 2 x 106(또는 약 2 x 106) 내지 1 x 104 M-1초-1(또는 약 1 x 104 M-1초-1), 임의로 1 x 106(또는 약 1 x 106) 내지 3 x 104 M-1초-1(또는 약 3 x 104 M-1초-1)의 결합속도 상수(Ka)로 래트 SA에 특이적으로 결합하는 결합 부위를 포함하고/하거나;
(j) 변이체 또는 모이어티는 표면 플라즈몬 공명에 의해 결정시 1(또는 약 1) 내지 10000 nM(또는 약 10000 nM)의 해리상수(KD)로 마우스 SA에 특이적으로 결합하는 결합 부위를 포함하고/하거나;
(k) 변이체 또는 모이어티는 표면 플라즈몬 공명에 의해 결정시 2 x 10-3(또는 약 2 x 10-3) 내지 0.15 초-1(또는 약 0.15 초-1)의 분리속도 상수(Kd)로 마우스 SA에 특이적으로 결합하는 결합 부위를 포함하고/하거나;
(l) 변이체 또는 모이어티는 표면 플라즈몬 공명에 의해 결정시 2 x 106(또는 약 2 x 106) 내지 1 x 104 M-1초-1(또는 약 1 x 104 M-1초-1), 임의로 2 x 106(또는 약 2 x 106) 내지 1.5 x 104 M-1초-1(또는 약 1.5 x 104 M-1초-1)의 결합속도 상수(Ka)로 마우스 SA에 특이적으로 결합하는 결합 부위를 포함한다.
임의로, 변이체 또는 모이어티는 하기를 갖는다:
I: (a) 및 (d)에 따른 KD, (b) 및 (e)에 따른 Kd, 및 (c) 및 (f)에 따른 Ka; 또는
II: (a) 및 (g)에 따른 KD, (b) 및 (h)에 따른 Kd, 및 (c) 및 (i)에 따른 Ka; 또는
III: (a) 및 (j)에 따른 KD, (b) 및 (k)에 따른 Kd, 및 (c) 및 (l)에 따른 Ka; 또는
IV: I 및 II에 따른 동역학; 또는
V: I 및 III에 따른 동역학; 또는
VI: I, II 및 III에 따른 동역학.
본 발명은 또한 본 발명의 상기 임의의 양태 또는 구체예의 변이체 또는 모이어티를 포함하는 리간드를 제공한다. 예를 들어, 리간드는 이중 특이적 리간드(이중 특이적 리간드의 예에 대해 WO04003019호 참조)일 수 있다. 일 양태에서, 본 발명은 본 발명의 상기 임의의 양태 또는 구체예의 항-SA 변이체 또는 모이어티 및 SA가 아닌 표적 항원에 특이적으로 결합하는 추가의 결합 모이어티를 포함하는 다중특이적 리간드를 제공한다. 결합 모이어티 또는 각각의 결합 모이어티는 표적에 특이적으로 결합하는 임의의 결합 모이어티일 수 있으며, 예를 들어, 모이어티는 항체, 항체 단편, scFv, Fab, dAb 또는 비-면역글로불린 단백질 스캐폴드를 포함하는 결합 모이어티이다. 이러한 모이어티는 WO2008/096158호(개시내용이 참조로서 본원에 포함되는 실시예 17 내지 25 참조)에 상세히 개시되어 있다. 비-면역글로불린 스캐폴드의 예는 CTLA-4, 리포칼린, 스태필로코쿠스 단백질 A(spA), 어피바디™, 아비머™, GroEL 및 피브로넥틴이다.
일 구체예에서, 항-표적 결합 모이어티와 항-SA 단일 변이체 또는 모이어티 사이에 링커가 제공되며, 이러한 링커는, 예를 들어, 항-SA 및 항-표적 dAb가 사용되는 경우 아미노산 서열 AST, 임의로 ASTSGPS를 포함한다. 대안적 링커는 WO2007085814호(참조로서 본원에 포함됨) 및 WO2008/096158호(페이지 135의 12행 내지 페이지 140의 14행 참조, 이의 개시내용 및 링커의 모든 서열은 본 발명과 함께 사용하기 위해 본원에 명백히 기재되는 것과 같이 참조로서 본원에 명백히 포함되고, 상기 개시의 임의의 부분이 본원의 하나 이상의 청구항에 포함될 수 있는 것이 고려된다) 및 WO2009/068649호에 기재되어 있다.
다중특이적 리간드의 일 구체예에서, 표적 항원은 자연 발생이거나 합성일 수 있는 폴리펩티드, 단백질 또는 핵산일 수 있거나, 이의 일부일 수 있다. 이와 관련하여, 본 발명의 리간드는 표적 항원에 결합할 수 있고, 길항제 또는 효능제(예를 들어, EPO 수용체 효능제)로 작용한다. 당업자는 선택이 크고 다양한 것을 인지할 것이다. 이는, 예를 들어, 인간 또는 동물 단백질, 사이토카인 또는 성장인자, 사이토카인 또는 성장인자 수용체일 수 있고, 상기 사이토카인 수용체는 사이토카인, 효소, 효소에 대한 보조인자 또는 DNA 결합 단백질에 대한 수용체를 포함한다. 본원에서 사용되는 용어 "종양 괴사 인자 수용체 1(TNFR1)의 길항제" 또는 "항-TNFR1 길항제" 등은 TNFR1에 결합하고 TNFR1의 기능(즉, 하나 이상의 기능)을 억제할 수 있는 작용제(예를 들어, 분자, 화합물)를 의미한다. 예를 들어, TNFR1의 길항제는 TNFR1에 대한 TNF 알파의 결합을 억제할 수 있고/있거나 TNFR1을 통해 매개되는 신호전달을 억제할 수 있다. 따라서, TNFR1-매개 과정 및 세포 반응(예를 들어, 표준 L929 세포독성 검정에서의 TNF 알파-유도되는 세포 사멸)이 TNFR1의 길항제로 억제될 수 있다.
일 구체예에서, 다중특이적 리간드는 본 발명의 항-SA dAb 변이체 또는 모이어티 및 항-TNFR1 결합 모이어티, 예를 들어, 항-TNFR1 dAb를 포함한다. 임의로, 리간드는 수용체 가교 기회를 감소시키기 위해 단지 하나의 항-TNFR1 결합 모이어티(예를 들어, dAb)를 갖는다. 항-TNFR1 dAb는, 예를 들어, WO2006/038027호, WO2007/049017호, WO2008149148호 및 WO2010/081787호에 기재되어 있다(이러한 PCT 출원에 개시된 바와 같은 누클레오티드 서열 및 이의 아미노산 서열은 본 발명과 함께 사용하기 위해 본원에 명백히 기재되는 것과 같이 참조로서 본원에 명백히 포함되고, 상기 개시의 임의의 부분이 본원의 하나 이상의 청구항에 포함될 수 있는 것이 고려된다).
일 구체예에서, 본 발명의 리간드는 하나 이상의 폴리펩티드에 직접적 또는 간접적으로 융합된 본 발명의 변이체 또는 모이어티를 포함하는 융합 단백질이다. 예를 들어, 융합 단백질은 WO2005/118642호(이의 개시내용은 참조로서 본원에 포함됨)에 개시된 바와 같은 "약물 융합체"일 수 있으며, 이는 본 발명의 변이체 또는 모이어티 및 상기 PCT 출원에 정의된 바와 같은 폴리펩티드 약물을 포함한다.
본원에서 사용되는 바와 같은 "약물"은 개체의 생물학적 표적 분자에 대한 결합을 통해 유리하거나, 치료적이거나, 진단적인 효과를 발생시키고/시키거나 개체의 생물학적 표적 분자의 기능을 변경시키기 위해 개체에 투여될 수 있는 임의의 화합물(예를 들어, 작은 유기 분자, 핵산, 폴리펩티드)을 의미한다. 표적 분자는 개체의 유전체에 의해 엔코딩되는 내인성 표적 분자(예를 들어, 개체의 유전체에 의해 엔코딩되는 효소, 수용체, 성장인자, 사이토카인) 또는 병원체의 유전체에 의해 엔코딩되는 외인성 표적 분자(예를 들어, 바이러스, 박테리아, 진균, 선충 또는 다른 병원체의 유전체에 의해 엔코딩되는 효소)일 수 있다. 본 발명의 항-SA dAb 변이체를 포함하는 융합 단백질 및 컨쥬게이트에서 사용하기에 적합한 약물은 WO2005/118642호 및 WO2006/059106호에 개시되어 있다(상기 출원의 전체 개시내용은 참조로서 본원에 포함되고, 이러한 출원의 특정 약물의 전체 목록은 이러한 목록이 본원에 명백히 기재되는 것과 같이 포함되며, 상기 포함이 본원의 청구항 내의 포함을 위해 특정 약물의 개시내용을 제공하는 것이 고려된다). 예를 들어, 약물은 글루카곤-유사 펩티드 1(GLP-1) 또는 변이체, 인터페론 알파 2b 또는 변이체 또는 엑센딘-4(exendin-4) 또는 변이체일 수 있다.
일 구체예에서, 본 발명은 WO2005/118642호 및 WO2006/059106호에 정의되고 개시된 약물 컨쥬게이트를 제공하며, 이러한 컨쥬게이트는 본 발명의 변이체 또는 모이어티를 포함한다. 일 예에서, 약물이 상기 변이체 또는 모이어티에 공유적으로 연결된다(예를 들어, 변이체 또는 모이어티 및 약물은 단일 폴리펩티드의 부분으로 발현된다). 대안적으로, 일 예에서, 약물은 변이체 또는 모이어티에 비공유적으로 결합되거나 회합된다. 약물은 직접 또는 간접적으로 변이체 또는 모이어티에 공유적 또는 비공유적으로 결합(예를 들어, 적합한 링커 및/또는 상보적 결합 파트너(예를 들어, 비오틴 및 아비딘)의 비공유적 결합을 통함)될 수 있다. 상보적 결합 파트너가 이용되는 경우, 결합 파트너 중 하나는 직접적 또는 적합한 링커 모이어티를 통해 약물에 공유적으로 결합될 수 있고, 상보적 결합 파트너는 직접적 또는 적합한 링커 모이어티를 통해 변이체 또는 모이어티에 공유적으로 결합될 수 있다. 약물이 폴리펩티드 또는 펩티드인 경우, 약물 조성물은 융합 단백질일 수 있고, 상기 폴리펩티드 또는 펩티드, 약물 및 폴리펩티드 결합 모이어티는 연속적 폴리펩티드 사슬의 별개의 부분(모이어티)이다. 본원에 기재된 바와 같은 폴리펩티드 결합 모이어티 및 폴리펩티드 약물 모이어티는 펩티드 결합을 통해 서로 직접 결합될 수 있거나, 적합한 아미노산, 또는 펩티드 또는 폴리펩티드 링커를 통해 연결될 수 있다.
혈청 알부민에 특이적으로 결합하는 본 발명의 하나의 단일한 가변 도메인(단량체) 변이체 또는 모이어티 또는 하나 이상의 단일한 가변 도메인 또는 모이어티(본원에 정의된 바와 같은 다합체, 융합 단백질, 컨쥬게이트, 및 이중 특이적 리간드)를 함유하는 리간드는 표지, 태그, 추가 단일 가변 도메인, dAb, 항체, 항체 단편, 마커 및 약물로부터 선택되나 바람직하게는 이에 제한되지는 않는 하나 이상의 존재물(entity)을 추가로 포함할 수 있다. 상기 존재물 중 하나 이상은 단일 가변 도메인 또는 모이어티(면역글로불린 또는 비-면역글로불린 단일 가변 도메인)를 포함하는 리간드의 COOH 말단 또는 N 말단 또는 N 말단과 COOH 말단 둘 모두에 위치될 수 있다. 상기 존재물 중 하나 이상은 하나의 단일 가변 도메인(단량체) 또는 모이어티 또는 하나 이상의 단일 가변 도메인 또는 모이어티(본원에 정의된 바와 같은 다합체, 융합 단백질, 컨쥬게이트, 및 이중 특이적 리간드)를 함유하는 리간드의 혈청 알부민에 특이적으로 결합하는 단일 가변 도메인 또는 모이어티의 COOH 말단, 또는 N 말단, 또는 N 말단과 COOH 말단 둘 모두에 위치될 수 있다. 상기 말단 중 하나 또는 둘 모두에 위치될 수 있는 태그의 비제한적 예는 HA, his 또는 myc 태그를 포함한다. 하나 이상의 태그, 표지 및 약물을 포함하는 존재물은 직접적 또는 상기 기재된 바와 같은 링커를 통해 혈청 알부민에 결합하는 하나의 단일 가변 도메인(단량체) 또는 하나 이상의 단일 가변 도메인 또는 모이어티(본원에 정의된 바와 같은 다합체, 융합 단백질, 컨쥬게이트, 및 이중 특이적 리간드)를 함유하는 리간드에 결합될 수 있다.
본원에 기재된 변이체, 모이어티, 융합 단백질, 컨쥬게이트 또는 리간드, 예를 들어, 혈청 알부민에 특이적으로 결합하거나, 인간 혈청 알부민 및 적어도 하나의 비-인간 혈청 알부민 둘 모두에 특이적으로 결합하는 본 발명의 하나의 단일 가변 도메인(단량체) 변이체 또는 하나 이상의 단일 가변 도메인(예를 들어, 본원에 정의된 바와 같은 다합체, 융합 단백질, 컨쥬게이트, 및 이중 특이적 리간드) 변이체를 함유하는 리간드 또는 이의 기능적으로 활성인 단편 중 임의의 것을 엔코딩하는 분리된 핵산이 본원에 또한 포함된다. 벡터 및/또는 발현 벡터, 벡터를 포함하는 숙주 세포, 예를 들어, 벡터로 형질전환된 식물 또는 동물 세포 및/또는 세포주, 일부 예에서 하나 이상의 변이체, 모이어티, 융합 단백질 또는 리간드 또는 이의 단편이 발현되도록 숙주 세포를 배양하고, 임의로, 숙주 세포 배양 배지로부터 혈청 알부민에 특이적으로 결합하는 하나의 단일 가변 도메인 또는 모이어티(단량체) 또는 하나 이상의 단일 가변 도메인 또는 모이어티(예를 들어, 본원에 정의된 바와 같은 다합체, 융합 단백질, 컨쥬게이트, 및 이중 특이적 리간드)를 함유하는 리간드를 회수하는 것을 포함하는, 혈청 알부민에 특이적으로 결합하는 하나의 단일 가변 도메인(단량체) 변이체 또는 모이어티 또는 하나 이상의 단일 가변 도메인 변이체 또는 모이어티(예를 들어, 본원에 정의된 바와 같은 다합체, 융합 단백질, 컨쥬게이트, 및 이중 특이적 리간드)를 함유하는 상기 벡터에 의해 엔코딩되는 하나 이상의 변이체, 모이어티, 융합 단백질 또는 리간드 또는 이의 단편(들)을 발현시키고/시키거나 생성시키는 방법이 본원에 또한 포함된다. 본원에 기재된 리간드와, 혈청 알부민 및/또는 비-인간 혈청 알부민(들)을 포함하는 혈청 알부민, 및/또는 혈청 알부민이 아닌 하나 이상의 표적을 접촉시키는 방법으로서, 상기 표적이 생물학적으로 활성인 분자, 동물 단백질, 상기 나열된 바와 같은 사이토카인을 포함하고, 접촉이 시험관내에서 이루어질 뿐만 아니라 본원에 기재된 변이체, 모이어티, 융합 단백질 또는 리간드 중 임의의 것을 생체내 및/또는 생체외에서 개별적 숙주 동물 또는 세포에 투여하는 것을 포함하는 방법이 또한 포함된다. 바람직하게는, 혈청 알부민 및/또는 비-인간 혈청 알부민(들)에 특이적인 단일 가변 도메인(면역글로불린 또는 비-면역글로불린), 및 혈청 알부민이 아닌 하나 이상의 표적에 특이적인 하나 이상의 도메인을 포함하는 본원에 기재된 리간드를 투여하는 것은 항-표적 리간드의 T 베타 및/또는 말단 반감기를 포함하는 반감기를 증가시킬 것이다. 변이체, 융합 단백질 또는 단일 도메인 함유 리간드 또는 이의 단편, 예를 들어, 이의 기능성 단편을 엔코딩하는 핵산 분자가 본원에서 고려된다. 발현 벡터를 포함하나, 바람직하게는 이에 제한되지는 않는 핵산 분자를 엔코딩하는 벡터, 및 상기 발현 벡터 중 하나 이상을 함유하는 세포주 또는 유기체로부터의 숙주 세포가 또한 본원에서 고려된다. 상기 언급된 핵산, 벡터 및 숙주 세포 중 임의의 것을 포함하나 바람직하게는 이에 제한되지는 않는 임의의 변이체, 융합 단백질 또는 리간드를 생성시키는 방법이 또한 고려된다.
본 발명의 양태는 본 발명에 따른 변이체 또는 본 발명의 다중특이적 리간드 또는 본 발명의 융합 단백질을 엔코딩하는 누클레오티드 서열 또는 상기 선택된 서열과 적어도 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 또는 99% 동일한 누클레오티드 서열을 포함하는 핵산을 제공한다.
본 발명의 양태는 본 발명의 핵산을 포함하는 벡터를 제공한다. 본 발명의 양태는 상기 벡터를 포함하는 분리된 숙주 세포를 제공한다.
라이브러리 벡터 시스템, 단일 가변 도메인 조합, 이중 특이적 리간드의 특징, 이중 특이적 리간드의 구조, 이중 특이적 리간드를 작제하는데 사용하기 위한 스캐폴드, 항혈청 알부민 dAb 및 다중특이적 리간드 및 반감기 향상 리간드의 용도, 및 항-혈청 알부민 dAb를 포함하는 조성물 및 제형의 세부사항에 대해서는 WO2008/096158호가 참조된다. 이러한 개시는 본 발명의 변이체, 모이어티, 리간드, 융합 단백질, 컨쥬게이트, 핵산, 벡터, 숙주 및 조성물을 포함하는 본 발명과 함께 사용하기 위한 지침을 제공하기 위해 참조로서 본원에 포함된다.
서열들
표 1: DOM7h -14 변이체 dAb 의 아미노산 서열
Figure pct00001
표 2: DOM7h -14 변이체 dAb 의 누클레오티드 서열
Figure pct00002
표 3: 항-혈청 알부민 dAb ( DOM7h ) 융합체
(래트 연구에서 사용됨):-
DOM7h -14/ 엑센딘 -4 융합체 DMS 번호 7138
아미노산 서열(SEQ ID NO:11)
Figure pct00003
누클레오티드 서열(SEQ ID NO:12)
Figure pct00004
DOM7h -14-10/ 엑센딘 -4 융합체 DMS 번호 7139
아미노산 서열(SEQ ID NO:13)
Figure pct00005
누클레오티드 서열(SEQ ID NO:14)
Figure pct00006
DOM7h -14-18/ 엑센딘 -4 융합체 DMS 번호 7140
아미노산 서열(SEQ ID NO:15)
Figure pct00007
누클레오티드 서열(SEQ ID NO:16)
Figure pct00008
DOM7h -14-19/ 엑센딘 -4 융합체 DMS 번호 7141
아미노산 서열(SEQ ID NO:17)
Figure pct00009
누클레오티드 서열(SEQ ID NO:18)
Figure pct00010
DOM7h14 -10/ G4SC - NCE 융합체
DOM7h14-10/G4SC를 엔코딩하는 아미노산 서열(SEQ ID NO:19)
Figure pct00011
C-말단 시스테인은, 예를 들어, 말레이미드 결합을 이용하여 신규 화합물(약학적 화합물, NCE)에 연결될 수 있다.
DOM7h14-10/G4SC를 엔코딩하는 누클레오티드 서열(SEQ ID NO:20)
Figure pct00012
DOM7h14 -10/ TVAAPSC 융합체
아미노산 서열(SEQ ID NO:21)
Figure pct00013
C-말단 시스테인은, 예를 들어, 말레이미드 결합을 이용하여 신규 화합물(약학적 화합물, NCE)에 연결될 수 있다.
누클레오티드 서열(SEQ ID NO:22)
Figure pct00014
myc-태깅된 분자가 상기 표에 표시되는 경우, 이는 실시예의 PK 연구에서 사용된 형태였다. myc-태깅된 서열이 제공되지 않는 경우, 실시예의 PK 연구는 myc-태깅된 물질로 수행되지 않았고, 즉, 연구는 제시된 태깅되지 않은 작제물로 수행되었다.
예시
실험 섹션에서의 모든 넘버링은 케이뱃(Kabat)(Kabat, E.A. National Institutes of Health (US) & Columbia University. Sequences of proteins of immunological interest, edn 5 (US Dept. Of Health and Human Services Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991))에 따른다.
실시예 1: Vk 친화성 성숙
선택:
HSA(인간 혈청 알부민) 및 RSA(래트 혈청 알부민) 항원을 Sigma로부터 구입하였다(본질적으로 지방산 비함유, ~99%(아가로스 겔 전기영동), 각각 동결건조된 분말 Cat. No. A3782 및 A6414).
상기 2개의 항원의 비오티닐화된 생성물을 EZ Link Sulfo-NHS-SS-Biotin(Pierce, Cat. No.21331)을 이용하여 제조하였다. PD10 탈염 컬럼을 통해 샘플을 2회 통과시킨 후 4℃에서 PBS의 1000x 과량 부피에 대한 밤새의 투석에 의해 자유 비오틴 시약을 제거하였다. 생성된 생성물을 질량 분광법으로 시험하고, 분자당 1-2개의 비오틴을 관찰하였다.
친화성 성숙 라이브러리:
오류-유발 및 CDR 라이브러리를 DOM7h-14 모(parental) dAb(DOM7h-14의 서열에 대해 WO2008/096158호 참조)를 이용하여 생성시켰다. CDR 라이브러리를 pDOM4 벡터에서 생성시키고, 오류 유발 라이브러리를 pDOM33 벡터에서 생성시켰다(프로테아제 처리를 이용하거나 이용하지 않은 선택을 가능케 함). 벡터 pDOM4는 유전자 III 신호 펩티드 서열이 효모 당지질 부착된 표면 단백질(GAS) 신호 펩티드로 대체된 Fd 파지 벡터의 유도체이다. 이는 또한 선도 서열과 유전자 III 사이에 c- myc 태그를 함유하며, 이는 유전자 III 뒤에 프레임(frame)으로 놓여있다. 이러한 선도 서열은 파지 디스플레이 벡터 뿐만 아니라 다른 원핵생물 발현 벡터 둘 모두에서 잘 작용하고, 이는 보편적으로 사용될 수 있다. pDOM33은 dAb-파지 융합체가 프로테아제 트립신에 대해 내성이 되도록 하는, c-myc 태그가 제거된 pDOM4 벡터의 변형된 형태이다. 이는 더욱 프로테아제 안정적인 dAb를 선택하기 위한 파지 선택 내에서 트립신의 사용을 가능케 한다(WO2008149143호 참조).
오류-유발 돌연변이 라이브러리에 대해, 성숙되는 dAb를 엔코딩하는 플라스미드 DNA를 GENEMORPH® II RANDOM MUTAGENESIS KIT(무작위의 독특한 돌연변이유발 키트, Stratagene)를 이용한 PCR에 의해 증폭시켰다. 생성물을 SalI 및 NotI으로 절단하고, 절단된 파지 벡터 pDOM33과의 라이게이션 반응에 사용하였다.
CDR 라이브러리에 대해, 친화성 성숙되는 dAb 내의 필요한 위치를 다양화시키기 위해 NNK 또는 NNS 코돈을 함유하는 축퇴성 올리고누클레오티드를 이용하여 PCR 반응을 수행하였다. 이후, 전장의 다양화된 삽입물을 생성시키기 위해 어셈블리 PCR을 사용하였다. 삽입물을 SalI 및 NotI로 절단시키고, 다수의 잔기의 돌연변이유발을 위한 pDOM4 및 단일 잔기의 돌연변이유발을 위한 pDOM5와의 라이게이션 반응에 사용하였다. pDOM5 벡터는 단백질 발현이 LacZ 프로모터에 의해 유도되는 pUC119-기반 발현 벡터이다. GAS1 선도 서열(WO2005/093074호 참조)은 분리된 가용성 dAb의 원형질막 주위공간 및 E. 콜리(E. coli)의 배양 상층액으로의 분비를 보장한다. dAb를 상기 벡터 내에서 SalI/NotI으로 클로닝하였고, 이는 dAb의 C-말단에 myc 태그를 부착시킨다. SalI 및 NotI을 이용하는 상기 프로토콜은 N-말단에 ST 아미노산 서열의 포함을 발생시킨다.
상기 어느 한 방법에 의해 발생된 라이게이션을 이후 전기천공에 의해 E. 콜리 균주 TB1을 형질전환시키는데 이용하였고, 형질전환된 세포를 15 μg/ml 테트라사이클린을 함유하는 2xTY 아가에 플레이팅시켜, >5x107 클론의 라이브러리 크기를 생성시켰다.
오류-유발 라이브러리는 하기 평균 돌연변이 비율 및 크기를 가졌다: DOM7h-14(dAb 당 2.9 돌연변이), 크기:5.4 x 108.
각각의 CDR 라이브러리는 4개의 아미노산 다양성을 갖는다. CDR1 및 3 각각에 대해 2개의 라이브러리를 생성시키고, CDR2에 대해 1개의 라이브러리를 생성시켰다. 각각의 라이브러리 내에서 다양화된 위치는 하기와 같다(VK 더미(dummy) DPK9 서열을 기초로 한 아미노산):
라이브러리 크기
DOM7h-14
1 - Q27, S28, S30, S31 (CDR1) 5.8 x 107
2 - S30, S31, Y32, N34 (CDR1) 4.2 x 108
3 - Y49, A50, A51, S53 (CDR2) 2.4 x 108
4 - Q89, S91, Y92, S93 (CDR3) 2.5 x 108
5 - Y92, Y93, T94, N96 (CDR3) 3.3 x 108
실시예 2: 선택 방법:
Vκ AlbudAb™(항-혈청 알부민 dAb) 친화성 성숙을 위해 3개의 파지 선택 방법을 채택하였다:
1) HSA 단독에 대한 선택:
HSA에 대한 3 라운드의 선택을 수행하였다. 오류 유발 라이브러리 및 각각의 CDR 라이브러리를 모든 라운드에서 개별적 푸울(pool)로 선택하였다. 첫번째 라운드의 선택을 1mg/ml로 면역튜브에 수동적으로 코팅된 HSA에 대해 수행하였다. 라운드 2를 100nM HSA에 대해 수행하고, 라운드 3를 10nM(CDR 선택) 또는 20 또는 100nM(오류 유발 선택) HSA에 대해 수행하였고, 상기 라운드 2 및 라운드 3 둘 모두는 가용성 선택(soluble selection)으로 수행하였으며, 이후 네번째 라운드의 선택을 가용성 선택으로서 1.5nM HSA에 대해 오류 유발 라이브러리로 수행하였다. 오류 유발 라이브러리를 1M Tris pH 8.0을 이용한 중화 전에 0.1M 글리신 pH 2.0로 용리시키고, CDR 라이브러리를 log 단계 TG1 세포로의 감염 전에 1mg/ml 트립신으로 용리시켰다. 세번째 라운드의 각각의 선택을 스크리닝을 위한 pDOM5로 서브클로닝시켰다. 가용성 선택은 비오티닐화된 HSA를 이용하였다.
2) HSA에 대한 트립신 선택:
모 클론에 비해 증가된 프로테아제 내성 및 잠재적으로 개선된 생물리학적 특성을 갖는 dAb를 선택하기 위해, 트립신을 파지 선택에서 사용하였다(WO2008149143호 참조). 4 라운드의 선택을 HSA에 대해 수행하였다. 오류 유발 라이브러리의 첫번째 라운드의 선택을 트립신 없이 1mg/ml로 수동적으로 코팅된 HSA에 대해 수행하였고; 두번째 라운드를 37℃에서 1시간 동안 20μg/ml 트립신과 함께 1mg/ml로 수동적으로 코팅된 HSA에 대해 수행하였고; 세번째 라운드 선택을 37℃에서 1시간 동안 20μg/ml 또는 100μg/ml 트립신과 함께 100nM HSA에 대해 비오티닐화된 HSA를 이용한 가용성 선택에 의해 수행하였다. 최종 라운드의 선택을 37℃에서 밤새 100μg/ml 트립신과 함께 100nM HSA에 대해 비오티닐화된 HSA를 이용한 가용성 선택에 의해 수행하였다.
3) HSA(라운드 1) 및 RSA(라운드 2-4)에 대한 교차 선택:
첫번째 라운드 선택을 1mg/ml의 수동적으로 코팅된 HSA 또는 1μM HSA(가용성 선택)에 대해 수행한 후, 라운드 1에 대해 1μM, 라운드 2에 대해 100nm 및 라운드 3에 대해 20nM, 10nM 또는 1nM의 농도의 비오티닐화된 RSA에 대한 추가 3 라운드의 가용성 선택을 수행하였다.
스크리닝 방법 및 친화성 결정:
각각의 경우에서, 선택 후, 적절한 라운드의 선택으로부터의 파지 DNA의 푸울이 QIAfilter midiprep kit(Qiagen)를 이용하여 제조되며, DNA는 제한 효소 SalI 및 NotI을 이용하여 절단되고, 부화된 V 유전자는 myc 태그와 함께 dAb를 발현하는 가용성 발현 벡터인 pDOM5 내의 해당 부위에 라이게이션된다(PCT/EP2008/067789호 참조). 항생제 카르베니실린을 함유하는 아가 플레이트 상에서 이후에 밤새 성장되는 E. 콜리 HB 2151 세포를 전기 형질전환시키는데 라이게이션된 DNA가 사용된다. 생성된 집락이 항원 결합에 대해 개별적으로 평가된다. 각각의 경우에, 적어도 96개의 클론을 BIAcore™(표면 플라즈몬 공명)에 의해 HSA, CSA(시노몰구스 원숭이 혈청 알부민), MSA(마우스 혈청 알부민) 및 RSA에 대한 결합에 대해 시험하였다. MSA 항원을 Sigma(본질적으로 지방산 비함유, ~99%(아가로스 겔 전기영동), 동결건조된 분말 Cat. No. A3559)로부터 구입하였고, CSA를 프로메틱 블루(prometic blue) 수지(Amersham)를 이용하여 시노몰구스 혈청 알부민으로부터 정제하였다. 가용성 dAb 단편을 96 웰 플레이트에서 37℃에서 밤새 ONEX 배양 배지(Novagen)에서의 박테리아 배양에서 생성시켰다. 가용성 dAb를 함유하는 배양 상층액을 원심분리시키고, 고밀도 HSA, CSA, MSA 및 RSA CM5 칩으로의 결합에 대해 BIAcore에 의해 분석하였다. 클론은 분리속도 스크리닝에 의해 혈청 알부민의 상기 모든 종에 결합하는 것으로 밝혀졌다. 클론을 서열분석하였고, 이는 고유의 dAb 서열을 나타내었다.
선택된 클론의 모(parent)에 대한 최소 동일성(아미노산 수준)은 96.3%(DOM7h-14-10: 96.3%, DOM7h-14-18: 96.3%, DOM7h-14-19: 98.2%, DOM7h-14-28: 99.1%, DOM7h-14-36: 97.2%)였다.
고유의 dAb를 250rpm에서 48시간 동안 30℃에서 2.5L 진탕(shake) 플라스크 내에서 Onex 배지 중의 박테리아 상층액으로 발현시켰다. 단백질 L 아가로스로의 흡수 후 10mM 글리신 pH2.0을 이용한 용리에 의해 배양 배지로부터 dAb를 정제시켰다. BIAcore에 의한 HSA, CSA, MSA 및 RSA로의 결합을 1μM, 500nM 및 50nM의 3 농도의 정제된 단백질을 이용하여 확인하였다. 각각의 혈청 알부민에 대한 AlbudAb의 결합 친화성(KD)을 결정하기 위해, 정제된 dAb를 5000nM 내지 39nM(5000nM, 2500nM, 1250nM, 625nM, 312nM, 156nM, 78nM, 39nM)의 알부민 농도 범위에 걸쳐 BIAcore에 의해 분석하였다.
표 4
Figure pct00015
Figure pct00016
모든 DOM7h-14 유래 변이체는 마우스, 래트, 인간 및 시노몰구스 혈청 알부민에 교차 반응적이다. DOM7h-14-10은 모에 비해 래트, 시노몰구스 및 인간 혈청 알부민에 대해 개선된 친화성을 갖는다. DOM7h-14-28은 RSA에 대해 개선된 친화성을 갖는다. DOM7h-14-36은 RSA, CSA 및 MSA에 대해 개선된 친화성을 갖는다.
실시예 3: 중요 DOM7h -14 계통 클론의 기원 :
DOM7h-14-19: 오류 유발 라이브러리, 100ug/ml 트립신과 함께 라운드 3 결과(100nM, HSA)를 이용하여 HSA에 대해 수행된 친화성 성숙으로부터 기원.
DOM7h-14-10, DOM7h-14-18, DOM7h-14-28, DOM7h-14-36: CDR3 라이브러리(Y92, Y93, T94, N96), 라운드 3 결과를 이용하여 HSA에 대해 수행된 친화성 성숙으로부터 기원.
표 5: CDR 서열( 케이뱃에 따름; 상기 참조)
Figure pct00017
실시예 4 : 발현 및 생물리학적 특성규명:
2.5L 진탕 플라스크 내의 통상적인 박테리아 발현 수준을 250rpm에서 48시간 동안 30℃에서 Onex 배지 중에서의 배양 후에 결정하였다. 생물리학적 특성규명을 SEC MALLS 및 DSC에 의해 결정하였다.
SEC MALLS(다각-레이저-광-분산을 이용한 크기 배제 크로마토그래피)는 용액 내의 거대분자의 특성규명을 위한 비-침입성 기술이다. 간단히, 단백질(완충액 둘베코(Dulbecco) PBS 중 1mg/mL의 농도)이 크기 배제 크로마토그래피(컬럼: TOSOH Biosciences로부터 TSK3000; Pharmacia로부터 S200)에 의해 유체역학 특성에 따라 0.5 ml/분으로 분리된다. 분리 후, 분산광에 대한 단백질의 편향이 다각-레이저-광-분산(MALLS) 검출기를 이용하여 측정된다. 검출기를 통해 단백질이 통과하는 동안의 분산광의 강도가 각의 함수에 따라 측정된다. 굴절 지수(RI) 검출기를 이용하여 결정된 단백질 농도와 함께 상기 측정은 적절한 식(분석 소프트웨어 Astra v.5.3.4.12의 필수 구성 부분)을 이용하여 몰 질량의 계산을 가능케 한다.
DSC(시차주사열용량분석): 간단히, 단백질(PBS 중 1mg/mL)은 180℃/시간의 일정한 속도로 가열되고, 열 변성과 관련된 검출가능한 열 변화가 측정된다. 단백질의 50%가 이의 자연 형태로 존재하고, 나머지 50%가 변성되는 온도로 설명되는 전이 중간점(appTm)이 결정된다. 여기서, 시험된 단백질의 대부분이 완전히 재폴딩되지 않음에 따라, DSC는 겉보기 전이 중간점(appTm)을 결정하였다. Tm이 높을수록, 분자가 더욱 안정적이다. 비-2-상태 식에 의해 언폴딩 곡선을 분석하였다. 사용된 소프트웨어 패키지는 OriginR v7.0383이었다.
표 6
Figure pct00018
표 6의 모든 클론에 대한 발현 수준은 E. 콜리에서 15 내지 119mg/L 범위 내로 관찰되었다.
DOM7h-14 변이체에 대해, 바람직한 생물리학적 파라미터(SEC MALLS에 의해 결정시 용액 중 단량체, 및 DSC에 의해 결정시 >55℃의 appTm) 및 발현 수준이 친화성 성숙 동안 유지되었다. 단량체 상태가 유리한데, 이는 이러한 상태가 이합체화를 피하고, 생성물이 표적, 예를 들어, 세포 표면 수용체를 가교시킬 수 있는 위험을 피하기 때문이다.
실시예 5: 래트 , 마우스 및 시노몰구스 원숭이에서의 혈청 반감기의 결정
AlbudAbs DOM7h-14-10, DOM7h-14-18 및 DOM7h-14-19를 pDOM5 벡터에 클로닝시켰다. 각각의 AlbudAb™에 대해, 20-50mg의 양을 E. 콜리에서 발현시키고, 단백질 L 친화성 수지를 이용하여 박테리아 배양 상층액으로부터 정제시키고, 100mM 글리신 pH2로 용리시켰다. 단백질을 1mg/ml 초과로 농축시키고, PBS로 완충액 교환하고, Q 회전 컬럼(Vivascience)을 이용하여 내독소를 고갈시켰다. 래트 약동학(PK) 분석을 위해, AlbudAb를 화합물 당 3마리의 래트를 이용하여 2.5mg/kg의 단일 정맥내 주사로 투여하였다. 혈청 샘플을 0.16, 1, 4, 12, 24, 48, 72, 120, 168시간에 채취하였다. 혈청 수준의 분석을 하기 기재되는 방법에 따라 항-myc ELISA에 의해 수행하였다.
마우스 PK에 대해, dAb를 3 피검체의 투여 군 당 2.5mg/kg으로 단일한 정맥내 주사로 투여하고, 혈청 샘플을 10분; 1시간; 8시간; 24시간; 48시간; 72시간; 96시간에서 채취하였다. 혈청 수준의 분석을 하기 기재되는 방법에 따라 항-myc ELISA에 의해 수행하였다.
시노몰구스 원숭이 PK에 대해, DOM7h-14-10을 투여 군 당 3마리의 암컷 시노몰구스 원숭이로 2.5mg/kg의 단일 정맥내 주사로 투여하고, 혈청 샘플을 0.083, 0.25, 0.5, 1, 2, 4, 8, 24, 48, 96, 144, 192, 288, 336, 504시간에 채취하였다. 혈청 수준의 분석을 하기 기재되는 방법에 따라 항-myc ELISA에 의해 수행하였다.
항- myc ELISA 방법
혈청에서의 AlbudAb 농도를 항-myc ELISA에 의해 측정하였다. 간단히, 염소 항-myc 폴리클로날 항체(1:500; Abcam, catalogue number ab9132)를 밤새 Nunc 96-웰 Maxisorp 플레이트 상에 코팅시키고, 5% BSA/PBS + 1% tween으로 블로킹시켰다. 혈청 샘플을 공지된 농도의 표준과 함께 일정 범위의 희석액으로 첨가하였다. 이후, 결합된 myc-태깅된 AlbudAb를 토끼 폴리클로날 항-Vk(1:1000; 사내(in-house) 시약, 혈액이 풀링되고, 사용 전에 단백질 A 정제됨), 및 이후 항-토끼 IgG HRP 항체(1:10,000; Sigma, catalogue number A2074)를 이용하여 검출하였다. 플레이트를 3 x PBS+0.1% Tween20, 및 이후 3 x PBS를 이용하여 검정의 각각의 단계 사이에 세척하였다. 마지막 세척 후 TMB(SureBlue TMB1-Component Microwell Peroxidase Substrate, KPL, catalogue number 52-00-00)를 첨가하고, 발달되도록 두었다. 이를 1M HCl을 이용하여 중지시킨 후, 신호를 450nm에서의 흡광도를 이용하여 측정하였다.
미가공 ELISA 데이터로부터, 공지되지 않은 샘플의 농도를 희석 인자를 고려한 표준 곡선에 대한 보간법(interpolation)에 의해 확립하였다. 각각의 시점으로부터의 평균 농도 결과를 복제 값으로부터 결정하고, 이를 WinNonLin 분석 패키지(예를 들어, 버전 5.1)(Pharsight Corp., Mountain View, CA94040, USA로부터 이용가능함)에 입력시켰다. PK 파라미터가 말단 반감기를 제공하는 소프트웨어에 의해 평가되는 비-구획 모델을 이용하여 데이터를 적합화시켰다. 각각의 PK 프로파일의 말단 단계를 반영하는 투여 정보 및 시점을 선택하였다.
표 7: 단일 AlbudAb ™ PK
Figure pct00019
래트, 마우스 및 시노몰구스 원숭이 연구로부터 유도된 약동학 파라미터를 비-구획 모델을 이용하여 적합화시켰다. 기호표: AUC: 무한대로 외삽된 투여 시간으로부터의 곡선하영역; CL: 청소; t1/2: 혈중 농도가 반감되는 기간; Vz: 말단 단계를 기초로 한 분포량.
실시예 6: AlbudAb ™ IFN 융합체
클로닝 및 발현
AlbudAb의 유용한 PK가 융합 단백질로서 유지되었는지의 여부를 결정하기 위해, 단일한 AlbudAb 뿐만 아니라, 친화성 성숙된 Vk AlbudAb를 인터페론 알파 2b(IFNα2b)에 연결시켰다.
인터페론 알파 2b 아미노산 서열:
Figure pct00020
인터페론 알파 2b 누클레오티드 서열:
Figure pct00021
IFNα2b를 TVAAPS 링커 영역을 통해 AlbudAb에 연결시켰다(WO2007085814호 참조). 작제물을 SOE-PCR(문헌[Horton et al. Gene, 77, p61(1989)]의 방법에 따른 단일 중첩 신장)에 의해 클로닝시켰다. AlbudAb 및 IFN 서열의 PCR 증폭을 TVAAPS 링커 영역에서 ~15 염기쌍 중첩을 갖는 프라이머를 이용하여 별개로 수행하였다. 사용된 프라이머는 하기와 같다:
Figure pct00022
단편을 별개로 정제시킨 후, 플랭킹(flanking) 프라이머만을 이용하여 SOE(단일 중첩 신장 PCR 신장) 반응에서 어셈블리시켰다:
Figure pct00023
어셈블리된 PCR 생성물을 제한 효소 BamHI 및 HindIII를 이용하여 절단시키고, 유전자를 세포 배지로의 발현을 촉진시키는 N-말단 V-J2-C 마우스 IgG 분비 선도 서열을 갖는 pTT5 유도체인 포유동물 발현 벡터인 pDOM50 내의 해당 부위에 라이게이션시켰다.
선도 서열(아미노산):
Figure pct00024
선도 서열(누클레오티드):
Figure pct00025
플라스미드 DNA를 QIAfilter megaprep(Qiagen)을 이용하여 제조하였다. 1 μg DNA/ml을 293-Fectin과 함께 HEK293E 세포로 트랜스펙션시키고, 혈청 비함유 배지에서 성장시켰다. 단백질을 5일 동안 배양하에 발현시키고, 단백질 L 친화성 수지를 이용하여 배양 상층액으로부터 정제시키고, 100mM 글리신 pH2로 용리시켰다. 단백질을 1mg/ml 초과로 농축시키고, PBS로 완충액 교환하고, Q 회전 컬럼(Vivascience)을 이용하여 내독소를 고갈시켰다.
표 8: myc - tag 를 갖거나 갖지 않는 인터페론 알파 2b- AlbudAb 서열(아미노산 서열 및 누클레오티드 서열)
인터페론 알파 2b는 하기 융합체에서 AlbudAb에 대해 N-말단이다.
Figure pct00026
Figure pct00027
Figure pct00028
Figure pct00029
Figure pct00030
Figure pct00031
Figure pct00032
Figure pct00033
Figure pct00034
굵은 글씨로 강조된 아미노산 및 누클레오티드 서열은 클로닝 부위 및 MYC 태그를 나타낸다. *는 유전자의 말단에서의 정지 코돈을 나타낸다.
친화성 결정 및 생물리학적 특성규명:
각각의 혈청 알부민에 대한 AlbudAb-IFNα2b 융합 단백질의 결합 친화성(KD)을 결정하기 위해, HBS-EP BIAcore 완충액 중 5000nM 내지 39nM(5000nM, 2500nM, 1250nM, 625nM, 312nM, 156nM, 78nM, 39nM)의 융합 단백질 농도를 이용한 알부민 상에서의 BIAcore(CM5 칩 상으로의 일차-아민 커플링에 의해 고정됨; BIAcore)에 의해 정제된 융합 단백질을 분석하였다.
표 9: SA 에 대한 친화성
Figure pct00035
Figure pct00036
IFNα2b가 AlbudAb 변이체에 연결되는 경우, 모든 경우에, 혈청 알부민에 대한 AlbudAb 결합의 친화성이 감소된다. DOM7h-14-10은 모에 비해 종을 교차하여 혈청 알부민에 대한 개선된 결합 친화성을 보유한다.
표 10: 생물리학적 특성규명
생물리학적 특성규명을 단일 AlbudAb에 대해 상기 기재된 바와 같이 SEC MALLS 및 DSC에 의해 수행하였다.
Figure pct00037
표 10의 모든 클론에 대한 발현은 HEK293 중 17.5 내지 54 mg/L 범위 내로 관찰되었다.
IFNα2b-DOM7h-14 변이체에 대해, 바람직한 생물리학적 파라미터 및 발현 수준이 친화성 성숙 동안 유지되었다.
AlbudAb - IFN α2b 융합체에 대한 PK 결정
AlbudAb IFNα2b 융합체 DMS7321(IFNα2b-DOM7h-14), DMS7322(IFNα2b-DOM7h-14-10), DMS7323(IFNα2b-DOM7h-14-18), DMS7324(IFNα2b-DOM7h-14-19)를 HEK293 세포에서 20-50mg 양으로 myc 태그와 함께 발현시키고, 단백질 L 친화성 수지를 이용하여 배양 상층액으로부터 정제시키고, 100mM 글리신 pH2로 용리시켰다. 단백질을 1mg/ml 초과로 농축시키고, 둘베코 PBS로 완충액 교환하고, Q 회전 컬럼(Vivascience)을 이용하여 내독소를 고갈시켰다.
래트 PK에 대해, IFN-AlbudAb를 화합물 당 3마리의 래트를 이용하여 2.0mg/kg의 단일 정맥내 주사로 투여하였다. 혈청 샘플을 0.16, 1, 4, 8, 24, 48, 72, 120, 168시간에 채취하였다. 혈청 수준의 분석을 제조업체의 설명서(GE Healthcare, catalogue number RPN5960)에 따라 EASY ELISA에 의해 수행하였다.
마우스 PK에 대해, myc 태그를 갖는 DMS7322(IFN2b-DOM7h-14-10)를 3 피검체의 투여군 당 2.0mg/kg의 단일 정맥내 주사로 투여하고, 혈청 샘플을 10분; 1시간; 8시간; 24시간; 48시간; 72시간; 96시간에 채취하였다. 혈청 수준의 분석을 제조업체의 설명서(GE Healthcare, catalogue number RPN5960)에 따라 EASY ELISA에 의해 수행하였다.
표 11 :
Figure pct00038
래트 및 마우스 연구로부터 유도된 약동학 파라미터를 비-구획 모델을 이용하여 적합화시켰다. 기호표: AUC: 무한대로 외삽된 투여 시간으로부터의 곡선하영역; CL: 청소; t1/2: 혈중 농도가 반감되는 기간; Vz: 말단 단계를 기초로 한 분포량.
IFNα2b-AlbudAb를 래트 및 마우스에서 시험하였다. t1/2에서의 개선은 혈청 알부민에 대한 개선된 시험관내 KD와 관련이 있다. IFNα2b-DOM7h-14-10 변이체에 대해, 혈청 알부민에 대한 시험관내 KD에서의 개선은 또한 래트에서의 t1/2의 개선과 관련이 있다.
모든 IFNα2b-AlbudAb 융합 단백질은 단일 AlbudAb에 비해 RSA에 대한 결합에서 5 내지 10배의 감소를 나타낸다.
실시예 7: 단백질, 펩티드 및 NCE 와의 추가 AlbudAb 융합체 .
다른 화학 존재물, 즉, 도메인 항체(dAb), 펩티드 및 NCE에 융합된 다양한 AlbudAb를 시험하였다. 결과는 표 12에 제시된다.
표 12 :
Figure pct00039
기호표: DOM1m-21-23은 항-TNFR1 dAb이고, 엑센딘-4는 39개의 아미노산 길이의 펩티드(GLP-1 효능제)이다. NCE, NCE-GGGGSC 및 NCE-TVAAPSC는 하기 기재된다.
이전에, 생체내에서 항-TNFR1 dAb의 PK 반감기를 연장시키기 위한 알부민-결합 dAb(AlbudAb)와의 유전적 융합체의 사용이 기재되었다(예를 들어, WO04003019호, WO2006038027호, WO2008149148호 참조). 상기 PCR 출원에서의 프로토콜이 참조된다. 상기 표에서, DOM1m-21-23은 항-마우스 TNFR1 dAb이다.
엑센딘-4 또는 혈청 알부민에 결합하는 DOM7h-14(또는 다른 AlbudAb)와의 유전적 융합체를 생성시키기 위해, 엑센딘-4-링커-AlbudAb 서열을 pTT-5 벡터(CNRC, Canada로부터 구입가능함)로 클로닝시켰다. 각각의 경우, 엑센딘-4는 작제물의 5' 말단에 존재하였고, dAb는 3' 말단에 존재하였다. 링커는 (G4S)3 링커였다. 내독소 비함유 DNA를 알칼리성 용해(Qiagen CA로부터 구입가능한 내독소 비함유 플라스미드 Giga 키트를 이용함)를 이용하여 E. 콜리에서 제조하고, HEK293E 세포(CNRC, Canada로부터 구입가능함)를 트랜스펙션시키는데 사용하였다. 플라스크 당 333ul의 293fectin(Invitrogen) 및 250ug의 DNA를 이용하여 250ml/플라스크의 HEK293E 세포로 1.75x106 세포/ml로 트랜스펙션시키고, 5일 동안 30℃에서 발현시켰다. 상층액을 원심분리에 의해 수거하고, 단백질 L 상에서의 친화성 정제에 의해 정제하였다. 단백질을 수지에 배치(batch) 결합시키고, 컬럼 상에 패킹시키고, 10 컬럼 부피의 PBS로 세척하였다. 단백질을 50ml의 0.1M 글리신 pH2로 용리시키고, Tris pH8로 중화시켰다. 예상 크기의 단백질을 SDS-PAGE 겔에서 확인하였다.
NCE Albudab 융합체:
신규 화합물(NCE) AlbudAb 융합체를 시험하였다. NCE, 소분자 ADAMTS-4 억제제를 PEG 링커(PEG 4 링커(즉, 말레이미드 앞의 4 PEG 분자)) 및 AlbudAb로의 컨쥬게이션을 위한 말레이미드기를 이용하여 합성하였다. AlbudAb로의 NCE의 컨쥬게이션은 아미노산 위치 R108C, 또는 AlbudAb의 말단에서 조작된 5개의 아미노산(GGGGSC) 또는 6개의 아미노산(TVAAPSC) 스페이서 뒤의 조작된 시스틴 잔기를 통해 이루어진다. 간단히, AlbudAb를 TCEP(Pierce, Catalogue Number 77720)를 이용하여 환원시키고, PD10 컬럼(GE healthcare)을 이용하여 25mM Bis-Tris, 5mM EDTA, 10%(v/v) 글리세롤 pH6.5로 탈염시켰다. 5배 몰과량의 말레이미드 활성화 NCE를 10%(V/V)의 최종 농도를 초과하지 않게 DMSO에 첨가하였다. 반응물을 실온에서 밤새 인큐베이션시키고, 20mM Tris pH7.4로 광범위하게 투석시켰다.
PEG 링커:
Figure pct00040
서열:
DOM7h-14 R108C:
Figure pct00041
누클레오티드:
Figure pct00042
DOM7h-14-10/TVAAPSC 및 DOM7h-14-10/GGGGSC(즉, DOM7h-14-10/G4SC)의 서열에 대해 표 3을 참조하라.
NCE-AlbudAb DOM7h-14-10 GGGGSC 및 DOM7h14-10 TVAAPSC는 화합물에 융합되는 경우에 BIAcore에 의해 결정시 RSA에 대한 시험관내 친화성(KD)에서 5 내지 10배 감소를 나타낸다. PK 데이터는 상기 분자에 대해 아직 이용가능하지 않다.
엑센딘 4-AlbudAb 융합체: RSA로의 결합 능력에서 펩티드에 AlbudAb를 융합시키는 것의 효과는 결합에서 단지 4배 감소를 나타낸 DOM7h-14-10은 별개로 하고 약 10배이다.
상기 데이터 모두에 대해, 상기 종의 SA에 대한 개선된 친화성과 함께 융합체의 T1/2가 증가하였다.
일반적으로, Albudab-치료는, AlbudAb-약물 융합체가 혈청 알부민 결합에 대해 0.1 nM 내지 10 mM의 친화성 범위(KD)를 나타내는 경우에 치료적으로 수용(질병, 질환 또는 적응증의 치료 및/또는 예방용)될 수 있는 것으로 분류된다.
AlbudAb 및 AlbudAb 융합체(단백질-AlbudAb, 예를 들어, IFNα2b-DOM7h-14-10; 펩티드-AlbudAb, 예를 들어, 엑센딘-4-DOM7h-14-10; dAb-AlbudAb, 예를 들어, DOM1m21-23-DOM7h11-15; NCE-AlbudAb, 예를 들어, ADAMTS-4-DOM7h-14-10)의 치료 범위는 다음과 같이 기재된다: 만성 또는 급성 질환, 질병 또는 적응증의 치료에 유용한 친화성(KD) 범위가 제시된다. "중간"으로 표시된 친화성 범위가 또한 제시된다. 상기 범위에서의 AlbudAb 및 융합체는 만성 또는 급성 질병, 질환 또는 적응증에 대해 유용성을 갖는다. 이러한 방식에서, 혈청 알부민에 대한 AlbudAb 또는 융합체의 친화성은 취급되는 질병, 질환 또는 적응증에 따라 맞춤화되거나 선택될 수 있다. 상기 기재된 바와 같이, 본 발명은 각각의 AlbudAb가 "높은 친화성", "중간 친화성" 또는 "낮은 친화성"으로 분류되는 것을 가능케 하는 친화성을 갖는 AlbudAb를 제공함으로써, 당업자가 직접 치료에 따라 본 발명의 적절한 AlbudAb를 선택하는 것을 가능케 한다. 도 2를 참조하라.
실시예 8: 개선된 단일 가변 도메인
DOM7h-14-10의 친화성 성숙을 수행하고, 다양한 종(인간, 시노몰구스 원숭이, 래트 및 마우스)으로부터의 혈청 알부민에 대한 특이적 결합을 기초로 하여 새로운 변이체를 선택하였다.
선택:
HSA(인간 혈청 알부민) 및 RSA(래트 혈청 알부민) 항원 및 비오티닐화된 생성물을 실시예 1에 기재된 바와 같이 수득하였다.
친화성 성숙 라이브러리:
오류 유발 및 도핑(doping)된 라이브러리 둘 모두를 주형으로서 파지 선택을 위해 트립신의 이용을 가능케 하는 위치 108의 아르기닌이 트립토판으로 돌연변이(DOM7h-14-10 R108W)된 DOM7h-14-10 모 dAb(SEQ ID NO:2 참조)를 이용하여 생성시켰다. 라이브러리를 pDOM33 벡터에서 생성시켰다.
도핑된 CDR 라이브러리에 대해, dAb 내의 필요한 위치를 다양화시키기 위해 편향된 축퇴성 코돈을 함유하는 도핑된 올리고누클레오티드를 이용하여 일차 PCR 반응을 수행하였다. 도핑된 라이브러리의 생성은, 예를 들어, 문헌[Balint and Larrick, Gene, 137, 109-118 (1993)]에 기재되어 있다. 각각의 축퇴성 코돈으로부터 처음 2개의 누클레오티드만 변화시켜, 모 누클레오티드가 케이스(case)의 85%에 존재하고, 케이스의 5%에서 모든 다른 가능한 누클레오티드가 존재하도록 프라이머를 설계하였다. CDR 당 6개의 코돈을, 코돈 내의 누클레오티드 당 15% 가능성으로 모 누클레오티드와 상이하게 존재하도록 동시에 돌연변이되도록 표적화시켰다.
이후, 어셈블리 PCR을 사용하여 전장의 다양화된 삽입물을 생성시켰다. 삽입물을 SalI 및 NotI으로 절단시키고, pDOM33과의 라이게이션 반응에 사용하였다. 이후, 라이브러리의 라이게이션을 전기천공에 의한 E. 콜리 균주 TB1을 형질전환시키는데 사용하였고, 형질전환된 세포를 15μg/ml 테트라사이클린을 함유하는 2xTY 아가에 플레이팅시켰다.
i) 선택 방법 : HSA에 대한 선택 HSA에 대한 2 라운드의 선택을 수행하였다. 각각의 CDR 라이브러리를 모든 라운드에서 개별적 푸울로 선택하였다. 둘 모두의 라운드의 선택을 10nM 농도의 비오티닐화된 HSA에 대해 용액 중에서 수행하였다. 라이브러리를 0.1M 글리신 pH 2.0으로 용리시키고, 1M Tris pH 8.0으로 중화시키고, log 단계 TG1 세포로 감염시켰다. 두번째 라운드의 각각의 선택을 스크리닝을 위해 pDOM5로 서브클로닝시켰다. 교차 선택 용액 중의 비오티닐화된 SA에 대한 2 라운드의 선택을 수행하였다. 2 라운드의 선택을 트립신 처리와 함께 또는 트립신 처리 없이 상이한 순서로 HSA(10nM, 1nM) 및 RSA(25nM, 10nM, 1nM)로 수행하였다. 각각의 CDR 라이브러리를 모든 라운드에서 개별적 푸울로 선택하였다. 라이브러리를 0.1M 글리신 pH 2.0으로 용리시키고, 1M Tris pH 8.0으로 중화시키고, log 단계 TG1 세포로 감염시켰다. 두번째 라운드의 각각의 선택을 스크리닝을 위해 pDOM5로 서브클로닝시켰다.
ii) 스크리닝 방법 및 친화성 결정
각각의 경우, 선택 후, 적절한 라운드의 선택으로부터의 파지 DNA의 푸울을 QIAfilter midiprep kit(Qiagen)를 이용하여 제조하고, DNA를 제한 효소 SalI 및 NotI을 이용하여 절단하고, 부화된 V 유전자를 myc 태그를 갖는 dAb를 발현하는 pDOM5 가용성 발현 벡터 내의 해당 부위로 라이게이션시켰다(PCT/EP2008/067789호 참조). 라이게이션된 DNA는 항생제 카르베니실린을 함유하는 아가 플레이트 상에서 이후 밤새 성장되는 화학 적격 E. 콜리 HB 2151 세포를 형질전환시키는데 사용된다. 생성된 집락이 항원 결합에 대해 개별적으로 평가된다. 각각의 선택 결과에 대해, 93개의 클론을 BIAcore™(표면 플라즈몬 공명)에 의해 HSA, 및 RSA로의 결합에 대해 시험하였다. 가용성 dAb 단편을 96 웰 플레이트에서 37℃에서 밤새 ONEX 배양 배지(Novagen)에서 박테리아 생성물로 생성시켰다. 가용성 dAb를 함유하는 배양 상층액을 원심분리시키고, 고밀도 HSA, 및 RSA CM5 칩으로의 결합에 대해 BIAcore에 의해 분석하였다. 분리속도 스크리닝에 의한 둘 모두의 상기 종의 혈청 알부민에 대해 모 클론과 동등하거나 이보다 낫게 결합하는 것으로 밝혀진 클론을 서열분석하였고, 이는 고유의 dAb 서열을 나타내었다.
모 서열에 대한 서열 상동성이 하기 표 13에 제시된다.
표 13
Figure pct00043
고유의 dAb를 250rpm에서 48시간 동안 30℃에서 0.5L 진탕(shake) 플라스크 내에서 Onex 배지 중의 박테리아 상층액으로 발현시켰다. 단백질 L 스트림라인으로의 흡수 후 100mM 글리신 pH2.0을 이용한 용리에 의해 배양 배지로부터 dAb를 정제시켰다. 인간, 래트, 마우스 및 시노몰구스 혈청 알부민에 대한 AlbudAb의 결합 친화성(KD)을 결정하기 위해, 정제된 dAb를 500nM 내지 3.9nM(500nM, 250nM, 125nM, 31.25nM, 15.625nM, 7.8125nM, 3.90625nM)의 알부민 농도 범위에 걸쳐 BIAcore에 의해 분석하였다.
MSA 항원을 Sigma(본질적으로 지방산 비함유, ~99%(아가로스 겔 전기영동), 동결건조된 분말 Cat. No. A3559)로부터 구입하였고, CSA를 프로메틱 블루(prometic blue) 수지(Amersham)를 이용하여 시노몰구스 혈청 알부민으로부터 정제하였다.
중요 클론의 모든 시험된 혈청 알부민 종에 대한 친화성이 표 14에 제시된다.
iii) 발현 및 생물리학적 특성규명 :
박테리아 발현 및 SECMALLS 및 DSC에 의한 특성규명을 상기 실시예 4에 기재된 바와 같이 수행하였다.
T/D 및 D/M은 SEC-MALLS에 의해 검출시 삼합체와 이합체 또는 이합체와 단량체 사이의 평형을 각각 나타낸다.
표 14: DOM7h -14-10 변이체의 특성규명
Figure pct00044
DOM7h-14-100은 시험된 종 전체에 걸쳐 한자리 수(single-digit)의 nM KD를 갖는다. DOM7h-14-100은 또한 유리하게는 용액 중의 단량체이다.
아미노산 및 누클레오티드 서열이 하기 나열된다. 대부분의 클론은 위치 108의 아르기닌이 트립토판으로 돌연변이되었으며, 이는 필요시 트립신 유도 선택을 가능케 수행되었고(트립신 인지 부위 노킹 아웃(knocking out))- 이러한 돌연변이는 혈청 알부민에 대한 AlbudAb 결합에 중요하지 않았다.
위치 108이 아르기닌으로 역 돌연변이(W108R)되고, 임의로, 위치 106이 이소류신으로 역 돌연변이된 다른 클론(DOM7h-14-119, DOM7h-14-120, DOM7h-14-121, DOM7h-14-122, DOM7h-14-122 참조)이 유도되었다. 상기 클론의 서열은 하기에 나열된다.
서열 정렬은 도 3에 제시된다.
표 15: DOM7h -14-10 변이체의 아미노산 서열
Figure pct00045
Figure pct00046
표 16: DOM7h -14-10 변이체의 누클레오티드 서열
Figure pct00047
Figure pct00048
Figure pct00049
서열들의 표
Figure pct00050
Figure pct00051
Figure pct00052
Figure pct00053
SEQUENCE LISTING <110> DE ANGELIS, Elena ENEVER, Carolyn LIU, Haiqun PUPECKA-SWIDER, Malgorzata SCHON, Oliver <120> IMPROVED ANTI-SERUM ALBUMIN BINDING VARIANTS <130> DB64317 <150> 61/375,328 <151> 2010-08-20 <160> 101 <170> FastSEQ for Windows Version 4.0 <210> 1 <211> 108 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino Acid Sequences of DOM7h-14 Variant dAbs <400> 1 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Trp Ile Gly Ser Gln 20 25 30 Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Met Trp Arg Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Gln Gly Leu Arg His Pro Lys 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 100 105 <210> 2 <211> 108 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino Acid Sequences of DOM7h-14 Variant dAbs <400> 2 Asp 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Leu Arg His Pro Lys 85 90 95 Thr Tyr Gly Lys Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 100 105 <210> 86 <211> 108 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid <400> 86 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Trp Ile Gly Ser Gln 20 25 30 Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Met Trp Arg Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Gln Gly Leu Arg His Pro Lys 85 90 95 Thr Tyr Gly Lys Gly Thr Lys Val Glu Asn Lys Arg 100 105 <210> 87 <211> 324 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleotide <400> 87 gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga ccgtgtcacc 60 atcacttgcc gggcaagtca gtggattggg tctcagttat cttggtacca gcagaaacca 120 gggaaagccc ctatgctcct gatcatgtgg agttcctcgt tgcaaagtgg ggtcccatca 180 cgtttcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag tctgcaacct 240 gaagattttg ctacgtacta ctgtgctcag ggtttgaggc atcctaagac gttcggccaa 300 gggaccaagg tggaaatcaa atgg 324 <210> 88 <211> 324 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleotide <400> 88 gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga ccgtgtcacc 60 atcacttgcc gggcaagtca gtggattggg tctcagttat cttggtacca gcagaaacca 120 gggaaagccc ctaagctcct gatcatgtgg cgttccgcgt tgcaaagtgg ggtcccatca 180 cgtttcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag tctgcaacct 240 gaagattttg ctacgtacta ctgtgctcag ggtttgaggc atcctaagac gttcggccaa 300 gggaccaagg tggaaatcaa atgg 324 <210> 89 <211> 324 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleotide <400> 89 gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga ccgtgtcacc 60 atcacttgcc gggcaagtca gtggattggg tctcagttat cttggtacca gcagaaacca 120 gggaaagccc ctaagctcct gatcatgtgg cgttcctcgt tgcaaagtgg ggtcccatca 180 cgtttcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag tctgcaacct 240 gaagattttg ctacgtacta ctgtgctcag ggtttgaggc atcctaagac gtacggcaaa 300 gggaccaagg tggaaaacaa atgg 324 <210> 90 <211> 324 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleotide <400> 90 gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga ccgtgtcacc 60 atcacttgcc gggcaagtca gtggattggg tctcagttat cttggtacca gcagaaacca 120 gggaaagccc ctaagctcct gatcatgtgg cgttcctcgt tgcaaagtgg ggtcccatca 180 cgtttcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag tctgcaacct 240 gaagattttg ctacgtacta ctgtgctcag ggtttgaagc atcctaagac gtacggccaa 300 gggaccaagg tggaaatcaa atgg 324 <210> 91 <211> 324 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleotide <400> 91 gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga ccgtgtcacc 60 atcacttgcc gggcaagtca gtggattggg tctcagttat cttggtacca gcagaaacca 120 gggaaagccc ctaagctcct gatcatgtgg cgttcctcgt tgcaaagtgg ggtcccatca 180 cgtttcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag tctgcaacct 240 gaagattttg ctacgtacta ctgtgctcag ggtatgaggc atcctaagac gttcggccaa 300 gggaccaagg tggaaatcaa atgg 324 <210> 92 <211> 324 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleotide <400> 92 gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga ccgtgtcacc 60 atcacttgcc gggcaagtca gtggattggg tctcagttat cttggtacca gcagaaacca 120 gggaaagccc ctaagctcct gatcatgtgg cgttcctcgt tgcaaagtgg ggtcccatca 180 cgtttcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag tctgcaacct 240 gaagattttg ctacgtacta ctgtgctcag ggtttgcggc atcctaagac gtacggccaa 300 gggaccaagg tggaaaacaa atgg 324 <210> 93 <211> 324 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleotide <400> 93 gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga ccgtgtcacc 60 atcacttgcc gggcaagtca gtggattggg tctcagttat cttggtacca gcagaaacca 120 gggaaagccc ctaagctcct gatcatgtgg cgttccgcgt tacaaaatgg ggtcccatca 180 cgtttcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag tctgcaacct 240 gaagattttg ctacgtacta ctgtgctcag ggtttgaggc atcctaagac gttcggccaa 300 gggaccaagg tggaaatcaa atgg 324 <210> 94 <211> 324 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleotide <400> 94 gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtttgcat ctgtaggaga ccgtgtcacc 60 atcacttgcc gggcaagtca gtggattggg tctcagttat cttggtacca gcagaaacca 120 gggaaagccc ctaagctcct gatcatgtgg cgttcctcgt tgcaaagtgg ggtcccatca 180 cgtttcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag tctgcaacct 240 gaagattttg ctacgtacta ctgtgctcag ggtttgagga aacctaagac tttcggccaa 300 gggaccaagg tgaaaatcaa atgg 324 <210> 95 <211> 324 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleotide <400> 95 gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga ccgtgtcacc 60 atcacttgcc gggcaagtca gtggattggg tctcagttat cttggtacca gcagaaacca 120 gggaaagccc ctaagctcct gatcatgtgg cgttccgcgt tgcaaagtgg ggtcccatca 180 cgtttcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag tctgcaacct 240 gaagattttg ctacgtacta ctgtgctcag ggtttgaggc atcctaaaac gtacggccaa 300 gggaccaagg tggaaatcaa atgg 324 <210> 96 <211> 324 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleotide <400> 96 gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga ccgtgtcacc 60 atcacttgcc gggcaagtca gtggattggg tctcagttat cttggtacca gcagaaacca 120 gggaaagccc ctaagctcct gatcatgtgg cgttccgcgt tgcaaagtgg ggtcccatca 180 cgtttcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag tctgcaacct 240 gaagattttg ctacgtacta ctgtgctcag ggtttgaggt atcctaagac gttcggccaa 300 gggaccaagg tggaaatcaa atgg 324 <210> 97 <211> 324 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleotide <400> 97 gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga ccgtgtcacc 60 atcacttgcc gggcaagtca gtggattggg tctcagttat cttggtacca gcagaaacca 120 gggaaagccc ctaagctcct gatcatgtgg cgttcctcgt tgcaaagtgg ggtcccatca 180 cgtttcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag tctgcaacct 240 gaagattttg ctacgtacta ctgtgctcag ggtttgcggc atcctaagac gtacggccaa 300 gggaccaagg tggaaatcaa acgg 324 <210> 98 <211> 324 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleotide <400> 98 gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga ccgtgtcacc 60 atcacttgcc gggcaagtca gtggattggg tctcagttat cttggtacca gcagaaacca 120 gggaaagccc ctaagctcct gatcatgtgg cgttcctcgt tgcaaagtgg ggtcccatca 180 cgtttcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag tctgcaacct 240 gaagattttg ctacgtacta ctgtgctcag ggtttgcggc atcctaagac gtacggccaa 300 gggaccaagg tggaaaacaa acgg 324 <210> 99 <211> 324 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleotide <400> 99 gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga ccgtgtcacc 60 atcacttgcc gggcaagtca gtggattggg tctcagttat cttggtacca gcagaaacca 120 gggaaagccc ctaagctcct gatcatgtgg cgttccgcgt tgcaaagtgg ggtcccatca 180 cgtttcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag tctgcaacct 240 gaagattttg ctacgtacta ctgtgctcag ggtttgaggc atcctaagac gttcggccaa 300 gggaccaagg tggaaatcaa acgg 324 <210> 100 <211> 324 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleotide <400> 100 gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga ccgtgtcacc 60 atcacttgcc gggcaagtca gtggattggg tctcagttat cttggtacca gcagaaacca 120 gggaaagccc ctaagctcct gatcatgtgg cgttcctcgt tgcaaagtgg ggtcccatca 180 cgtttcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag tctgcaacct 240 gaagattttg ctacgtacta ctgtgctcag ggtttgaggc atcctaagac gtacggcaaa 300 gggaccaagg tggaaatcaa acgg 324 <210> 101 <211> 324 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleotide <400> 101 gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga ccgtgtcacc 60 atcacttgcc gggcaagtca gtggattggg tctcagttat cttggtacca gcagaaacca 120 gggaaagccc ctaagctcct gatcatgtgg cgttcctcgt tgcaaagtgg ggtcccatca 180 cgtttcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag tctgcaacct 240 gaagattttg ctacgtacta ctgtgctcag ggtttgaggc atcctaagac gtacggcaaa 300 gggaccaagg tggaaaacaa acgg 324

Claims (10)

  1. DOM7h-14-56 (SEQ ID NO:72), DOM7h-14-65 (SEQ ID NO:73), DOM7h-14-74 (SEQ ID NO:74), DOM7h-14-76 (SEQ ID NO:75), DOM7h-14-82 (SEQ ID NO:76), DOM7h-14-100 (SEQ ID NO:77), DOM7h-14-101 (SEQ ID NO:78), DOM7h-14-109 (SEQ ID NO:79), DOM7h-14-115 (SEQ ID NO:80), DOM7h-14-116 (SEQ ID NO:81), DOM7h-14-119 (SEQ ID NO:82), DOM7h-14-120 (SEQ ID NO:83), DOM7h-14-121 (SEQ ID NO:84), DOM7h-14-122 (SEQ ID NO:85) 및 DOM7h-14-123 (SEQ ID NO:86)으로부터 선택된 항-혈청 알부민(SA) 면역글로불린 단일 가변 도메인.
  2. 제 1항의 항-SA 단일 가변 도메인 및 SA가 아닌 표적 항원에 특이적으로 결합하는 결합 모이어티(moiety)를 포함하는 다중특이적 리간드.
  3. 제 1항에 있어서, 가변 도메인이 약물(임의로, 신규 화합물(NCE) 약물)에 컨쥬게이션되고, 임의로, 가변 도메인 또는 모이어티가 DOM7h-14-100 (SEQ ID NO:77)인 항-SA 단일 가변 도메인.
  4. 제 1항에 따른 단일 가변 도메인에 융합된 폴리펩티드 또는 펩티드 약물을 포함하는 융합 단백질로서, 임의로, 변이체 또는 모이어티가 DOM7h-14-100 (SEQ ID NO:77)인 융합 단백질.
  5. 제 1항 내지 제 4항 중 어느 한 항의 가변 도메인, 융합 단백질 또는 리간드, 및 약학적으로 허용되는 희석제, 담체, 부형제 또는 비히클을 포함하는 조성물.
  6. 제 1항에 따른 단일 가변 도메인 또는 제 2항의 다중특이적 리간드 또는 제 4항의 융합 단백질을 엔코딩하는 누클레오티드 서열을 포함하는 핵산.
  7. SEQ ID NO:87 내지 101로부터 선택된 누클레오티드 서열 또는 상기 선택된 서열과 적어도 80% 동일한 누클레오티드 서열을 포함하는 핵산.
  8. 제 6항 또는 제 7항의 핵산을 포함하는 벡터.
  9. 제 8항의 벡터를 포함하는 분리된 숙주 세포.
  10. 제 1항 내지 제 5항 중 어느 한 항에 따른 가변 도메인, 리간드, 융합 단백질 또는 조성물의 적어도 1회 용량을 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 환자의 질병 또는 장애를 치료하거나 예방하는 방법.
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