KR20130054771A

KR20130054771A - 중합효소연쇄반응을 이용한 생물학적 시료내에서 퀴놀론 내성 캠필로박터균을 검출하는 방법 및 이에 사용되는 키트

Info

Publication number: KR20130054771A
Application number: KR1020110120356A
Authority: KR
Inventors: 구복경; 김영일; 김혜지; 권진욱; 정석찬; 명현군; 공시원
Original assignee: 대한민국(관리부서 : 농림축산식품부 농림축산검역본부); 솔젠트 (주)
Priority date: 2011-11-17
Filing date: 2011-11-17
Publication date: 2013-05-27
Also published as: KR101374045B1

Abstract

본 발명은 생물학적 시료내에서 캠필로박터의 퀴놀론 내성 변이형을 검출하는 방법, 이 방법에 사용되는 중합효소연쇄반응(PCR)용 프라이머 세트 및 키트에 관한 것이다. 본 발명에 의하면, 캠필로박터 제주니(C. jejuni) 및 캠필로박터 콜라이(C. coli)의 퀴놀론 내성 변이형균을 야생형균으로부터 고특이도 및 저비용으로 간편하게 분별 검출할 수 있다.

Description

중합효소연쇄반응을 이용한 생물학적 시료내에서 퀴놀론 내성 캠필로박터균을 검출하는 방법 및 이에 사용되는 키트{Method for Detecting and Identifying Quinolone Resistant Campylobacter From Biological Sample Using Polymerase Chain Reaction and Kit Used for The Same Method}

본 발명은 생물학적 시료내에서 퀴놀론(quinolone) 내성을 갖는 캠필로박터 변이형을 검출하기 위한 중합효소연쇄반응(PCR)용 프라이머 세트, 이 프라이머 세트를 포함하는 중합효소연쇄반응(PCR)용 키트, 및 프라이머 세트를 이용한 퀴놀론 내성 캠필로박터 변이형을 검출하는 방법에 관한 것이다.

캠필로박터(Campylobacter)는 1970년 이후로 전 세계적으로 위장관내 (gastrointestinal) 감염의 주요한 원인균으로 알려져 있으며, 미국에서도 해마다 전체인구의 약 1％가 이 세균들에 감염되는데 오염 식품이 주 감염원인인 것으로 보고되어 있다(1). 사람에게 감염된 캠필로박터(Campylobacter)의 약 95％가 캠필로박터 제주니(Campylobacter jejuni)에 의해 일어나며, 약 5％는 캠필로박터 콜라이(Campylobacter coli)에 의한 감염이다. 대부분의 캠필로박터(Campylobacter) 감염은 항생제 치료가 필요 없을 정도의 가벼운 증상을 보이지만 심한 장염, 패혈증, 소화기 이외의 감염에는 항생제 치료가 필요한데, 이 때 항생제로서 에리트로마이신(erythromycin)이나 플루오로퀴놀론(fluoroquinolone)이 가장 많이 사용된다(2-4). 캠필로박터(Campylobacter)는 원래 인수공통감염증(zoonosis)으로 도축된 생육에서 사람으로 직접 감염되거나 생유(raw milk), 물, 애완동물을 통해서도 감염되며, 야생과 가축동물의 장관으로부터 유래한 세균이 식품으로 처리되는 과정 중에 흔히 오염된다. 캠필로박터 제주니(C. jejuni)는 가금류와 소에, 캠필로박터 콜라이(C. coli)는 돼지에 존재하며 캠필로박터 콜라이(C. coli)의 에리트로마이신(erythromycin) 내성율이 캠필로박터 제주니(C. jejuni) 보다 높다. 높은 에리트로마이신(erythromycin) 내성율은 Marcrolide계 항생제가 광범위하게 사용된 결과로 추정된다. 몇몇 학자들은 내성 캠필로박터 제주니(C. jejuni)와 캠필로박터 콜라이(C. coli)가 임상에서 사용된 항생제에 의하기 보다는 동물에 사용된 항생제에 의하여 유도되었을 것이라고 추측하고 있다. Endtz 등은 1991년 네덜란드에서 분리한 사람의 퀴놀론(quinolone) 내성 캠필로박터 제주니(C. jejuni)와 캠필로박터 콜라이(C. coli)가 가축에 대한 플루오로퀴놀론(fluoroquinolne)의 사용과 연관이 있음을 보고한 바 있다(5).

플루오로퀴놀론(Fluoroquinolone)에 대한 캠필로박터(Campylobacter)의 내성은 지난 십년간 전 세계적으로 급속히 증가해 왔다. 1989년 이전에는 플루오로퀴놀론(fluoroquinolone) 내성이 매우 드물게 나타났으나, 유럽 본토인 네덜란드, 핀란드, 프랑스, 스페인 등에서 수의학 분야에 엔로플록사신(enrofloxacin), 의학 분야에 플루오로퀴놀론(fluoroquinolones)을 도입한 이후 환자에서 퀴놀론(quinolone) 내성 캠필로박터가 급속하게 확산되었다(6). 아시아 지역의 사람 분리 균주에서 내성율을 검사한 결과 이 지역에서도 캠필로박터(Campylobacter) 내성이 증가하였음을 보여준다. 퀴놀론(Quinolone)은 1993년 말 영국에서, 1995년 미국에서 수의학 분야 사용이 허가 되었으며, 현재 이들 지역에서 퀴놀론 내성 현상이 증가하고 있다(7, 8).

캠필로박터 제주니(C. jejuni)의 플루오로퀴놀론(fluoroquinolone) 내성은 대부분 DNA gyrase A 서브유닛(gyrA)에 암호된 유전자의 변이에 의하거나, 드물게는 Topoisomerase IV (parC)의 변이에 의한다. 퀴놀론 내성 캠필로박터 제주니(C. jejuni)에서 분리된 DNA gyrase의 경우 감수성 Gyrase 보다 퀴놀론에 의한 저해도가 1/100로 감소되었다. 캠필로박터 제주니(C. jejuni) gyrA 유전자의 Thr-86, Asp-90, Ala-70 보다 더 높은 내성(ciprofloxacin MIC 125 ㎍/㎖)은 gyrA의 돌연변이 Thr-86 → Ile-86 (C-257 to T transition)과 Topoisomerase IV parC의 Arg-139 두 부위의 변이에 기인한다(9, 10, 11). 캠필로박터(Campylobacter) 내성의 감시는 시프로플록사신(ciprofloxacin)과 같은 플루오로퀴놀론(fluroroquinolones)이 사람 감염 치료제로 사용될 때 우선적으로 중요하다. 장세균에서 항생제 내성을 모니터링 하는 주요 목적은 의사들이 적절한 항생제 처방을 선택하도록 돕기 위함이다. 국제 무역과 국제 여행이 지속적으로 증가하기 때문에 캠필로박터(Campylobacter) 내성에 대한 공중보건 문제가 세계적으로 더 부각되고 있다. 임상검사에서 주로 이용하던 캠필로박터 콜라이(C. coli) 감별 기준에 속하는 날리딕스산(nalidixic acid) 감수성과 세파로신(cephalothin) 내성은 날리딕스산(nalidic acid) 내성 균주의 출현으로 인해 그 이용가치가 적어졌다. GyrA 변이를 검출하기 위한 다양한 방법들로는 Denaturing Gradient Gel Electrophoresis (12), 타겟 유전자에 대한 DNA 서열분석 방법(13), RFLP(Restriction Fragment Length Polymorphism)방법(14), non-radioisotopic single-strand confirmatory polymorphism, florogenic PCR assay (15) 등을 포함한다. 그러나 이 방법들은 긴 시간이 소요되고, 복잡한 과정을 거치기 때문에 정례적인 감식 방법으로 사용하기 어렵다.

대립인자 특이 중합효소연쇄반응(Allele specific PCR, AS-PCR)은 단일염기다형성(SNP, single-nucleotide polymorphisms)을 구별할 수 있기 때문에 여러 가지 진단 분야에서 사용되는 PCR 응용방법이다. AS-PCR 방법에서 3' 말단에 SNP을 포함하는 프라이머를 사용한다. 엄격조건(Stringent condition)하에서 PCR 증폭은 주형과 프라이머 사이의 미스매치(mismatch)가 있을 경우 효율성이 많이 떨어지기 때문에, SNP-특이 프라이머로 성공적으로 증폭이 되면 서열에 특이적인 SNP가 있음을 나타낸다. 대립인자특히 중합효소연쇄반응(AS-PCR)은 특이적으로 디자인된 올리고뉴클레오타이드를 이용하여 DNA의 알려진 단일염기다형성(SNP)을 빠르게 검출하기 위해 일반적으로 응용하는 방법이다. AS-PCR은 다른 대립유전자에 대한 하나의 대립유전자를 선택적으로 증폭할 수 있는 특이적인 올리고뉴클레오타이드를 디자인해야 한다. 특이성은 대립유전자-특이 올리고뉴클레오타이드의 3'-말단 부위에서 원하는 대립유전자와 일치하지만 다른 대립유전자와 일치하지 않는 올리고뉴클레오타이드를 디자인함으로써 주어진다. 주형 DNA와 올리고뉴클레오타이드 사이의 불일치(mismatch)는 원하는 대립유전자를 특이적으로 증폭시키지만, 효소에 의한 3' 말단이 연장(elongation) 되지 않도록 함으로서 원하지 않는 대립유전자를 거의 증폭시키지 않는 결과를 만든다.

본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.

본 발명자들은 생물학적 시료내에 포함되어 있는 퀴놀론 항생제 내성의 변이형 캠필로박터(Campylobacter)를 간단하면서도 정확하게 검출할 수 있는 분자생물학적 방법을 개발하기 위해 연구 노력하였다. 그 결과, 퀴놀론 항생제내성을 부여하는 캠필로박터의 gyr A 유전자의 Thr86 → Ile 변이를 특이적으로 검출할 수 있는 대립유전자특이 중합효소연쇄반응 방법을 개발하였고, 이 방법을 사용하면 퀴놀론 항생제 내성의 변이형 캠필로박터를 높은 감도를 가지면서도 매우 간편하고 신속하게 검출할 수 있음을 실험적으로 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 캠필로박터의 퀴놀론 내성 변이형을 검출하는 방법을 제공하는 것에 있다.

본 발명의 다른 목적은 캠필로박터의 퀴놀론 내성 변이형을 검출하기 위한 용도의 중합효소연쇄반응(PCR)용 프라이머 세트를 제공하는 것에 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 프라이머 세트를 포함하는 캠필로박터의 퀴놀론 내성 변이형을 검출하기 위한 용도의 중합효소연쇄반응(PCR)용 키트를 제공하는 것에 있다.

본 발명의 목적 및 장점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구의 범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 다음의 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 생물학적 시료내에서 캠필로박터 제주니(C. jejuni) 및 캠필로박터 콜라이(C. coli)의 야생형과 퀴놀론(quinolone) 내성을 갖는 변이형을 구분하여 검출하는 방법을 제공한다: (a) 생물학적 시료로부터 DNA를 추출하는 단계; (b) 추출한 DNA를 주형으로 사용하고, 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 5, 및 서열번호 6의 올리고뉴클레오티드를 포함하는 중합효소연쇄반응(PCR)용 프라이머 세트를 사용하여 중합효소연쇄반응(PCR)을 행하는 단계; 및 (c) 상기 중합효소연쇄반응(PCR) 산물을 분석하여 캠필로박터 제주니(C. jejuni) 및 캠필로박터 콜라이(C. coli)의 야생형과 퀴놀론(quinolone) 내성을 갖는 변이형을 구분하는 단계.

본 발명자들은 생물학적 시료내에 포함되어 있는 퀴놀론 항생제 내성의 변이형 캠필로박터(Campylobacter)를 간단하면서도 정확하게 검출할 수 있는 분자생물학적 방법을 개발하기 위해 연구 노력하였다. 그 결과, 퀴놀론 항생제내성을 부여하는 캠필로박터의 gyr A 유전자의 Thr86Ile 변이를 검출할 수 있는 대립유전자특이 중합효소연쇄반응 방법을 개발하였고, 이 방법을 사용하면 퀴놀론 항생제 내성의 변이형 캠필로박터를 높은 감도를 가지면서도 매우 간편하고 신속하게 검출할 수 있음을 실험적으로 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

이하에서 캠필로박터 제주니(C. jejuni) 및 캠필로박터 콜라이(C. coli)의 야생형과 퀴놀론 내성을 갖는 변이형을 구분하여 검출하는 방법을 각 단계별로 나누어 상세히 설명한다.

단계 (a): 생물학적 시료로부터 DNA를 추출하는 단계

본 발명의 방법에서 퀴놀론 내성을 갖는 변이형 캠필로박터 제주니(C. jejuni) 및 캠필로박터 콜라이(C. coli)를 검출하고자 하는 생물학적 시료로부터 DNA를 추출한다.

생물학적 시료로부터 DNA 핵산의 분리는 당업계에 공지된 통상적인 방법을 사용하여 행할 수 있으며, 이에 대한 구체적인 방법은 Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (2001)에 개시되어 있으며, 이 문헌은 본 명세서에 참조로써 삽입된다. 예컨대, 생물학적 시료내에서의 핵산 DNA의 분리 및 정제는 페놀-클로로포름 추출 방법을 사용하여 행할 수 있다(Neumann B, et al., Rapid isolation of genomic DNA from Gram-negative bacteria., Trends Genet. 8:332-333(1992)).

본 발명의 방법에서의 생물학적 시료는 인간 또는 동물의 조직(tissue) 또는 기관(organ)으로부터 얻은 시료로서, 예컨대, 뇌, 눈, 심장, 장, 신장, 간, 허파, 근육, 비장, 또는 정소로부터 얻은 조직, 세포, 혈액, 혈장, 혈청, 뇨액, 타액, 땀, 정액, 또는 점액 등의 체액을 포함하나 이에 한정되지 않는다.

단계 (b): 추출한 DNA를 주형으로 사용하고, 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 5, 및 서열번호 6의 올리고뉴클레오티드를 포함하는 중합효소연쇄반응(PCR)용 프라이머 세트를 사용하여 중합효소연쇄반응(PCR)을 행하는 단계

본 발명의 단계 (b)에서 검출대상 캠필로박터(Campylobacter)의 퀴놀론 내성을 일으키는 gyrA 유전자의 변이, Thr86→Ile(C-257 → T)변이를 특이적으로 검출할 수 있는 중합효소연쇄반응(PCR) 프라이머 세트를 사용하여 중합효소연쇄반응을 실시한다.

본 발명에서 “중합효소연쇄반응(PCR)”특정 DNA 단편을 선별적으로 증폭하는 방법으로서 이에 대한 내용은 Miller, H. I. (WO 89/06700) 및 Davey, C. et al. (EP 329,822))에 개시되어 있으며, 이 문헌은 본 명세서에 참조로써 삽입된다. 중합효소연쇄반응(PCR)은 가장 잘 알려진 핵산 증폭 방법으로, 그의 많은 변형과 응용들이 개발되어 있다. 예를 들어, PCR의 특이성 또는 민감성을 증진시키기 위해 전통적인 PCR 절차를 변형시킨 터치다운(touchdown) PCR, 핫 스타트(hot start) PCR, 네스티드(nested) PCR 및 부스터(booster) PCR이 있다. 또한, 실시간 PCR, 분별 디스플레이 PCR(differential display PCR: DD-PCR), cDNA 말단의 신속 증폭(rapid amplification of cDNA ends: RACE), 멀티플렉스 PCR, 인버스 중합효소 연쇄반응(inverse polymerase chain reaction: IPCR), 벡토레트(vectorette) PCR 및 TAIL-PCR(thermal asymmetric interlaced PCR)이 특정한 응용을 위해 개발되었다. PCR에 대한 자세한 내용은 McPherson, M.J., 및 Moller, S.G. PCR. BIOS Scientific Publishers, Springer-Verlag New York Berlin Heidelberg, N.Y. (2000)에 기재되어 있으며, 그의 교시사항은 본 명세서에 참조로 삽입된다.

본 발명의 명세서에서 용어 "프라이머(primer)"는 핵산 증폭 반응시에 증폭되는 타깃 핵산 부위의 5’말단 서열 또는 3’말단 서열에 각각 상보적이며 적합한 온도에서 적합한 완충액 내에서 적합한 조건(즉, 4종의 다른 뉴클레오사이드 트리포스페이트 및 중합반응 효소)하에서 주형-지시 핵산의 중합효소반응의 개시점으로 작용할 수 있는 단일-가닥의 올리고뉴클레오타이드를 의미한다. 프라이머의 적합한 길이는 다양한 인자, 예컨대, 온도와 프라이머의 용도에 따라 변이가 있지만 전형적으로 15-30 뉴클레오타이드이다. 짧은 프라이머 분자는 주형과 충분히 안정된 혼성화 복합체를 형성하기 위하여 일반적으로 보다 낮은 온도를 요구한다. 본 발명에 이용되는 프라이머는 주형의 한 부위에 혼성화 또는 어닐링되어, 이중쇄 구조를 형성한다. 이러한 이중쇄 구조를 형성하는 데 적합한 핵산 혼성화의 조건은 Joseph Sambrook, 등, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.(2001) 및 Haymes, B.D., 등, Nucleic Acid Hybridization, A Practical Approach, IRL Press, Washington, D.C. (1985)에 개시되어 있다.

본 발명의 프라이머는 캠필로박터의 gyrA 유전자의 대립인자 특이적 프라이머이다. 본 발명에서 사용되는 프라이머는 하기 실시예 표 1에 올리고뉴클레오타이드 서열로 구체적으로 기재되어 있으며, 이의 작용은 다음과 같다.

본 발명의 전방향 프라이머 “GyrA-contF”(서열번호 1)와 역방향 프라이머 “GyrA-contR”(서열번호 2)는 캠필로박터 균주의 gyrA 유전자 내부에서 보존적인 서열 위치에 결합하도록 디자인되었다. 이 프라이머쌍에 의해 중합효소연쇄반응(PCR)이 정상적으로 진행되었을 경우 생성되어 확인되는 증폭산물은 468bp 크기이다. 이 프라이머쌍은 PCR의 정상적 반응을 확인하는 내부 대조군(internal control)으로 사용된다.

본 발명의 다른 전방향 프라이머 “cjGyrA-W-F”(서열번호 3)는 캠필로박터 제주니(C. jejuni)의 야생형 gyrA 유전자 특이적 프라이머이다. 이 프라이머는 상기 역방향 프라이머 “GyrA-contR”(서열번호 2)와 쌍을 이루어 PCR 반응하여 317bp 크기의 증폭 산물을 형성한다. 따라서, 본 발명에 따라 PCR을 수행한 경우 317 bp 크기의 PCR 증폭산물이 생성되어 확인되면, 이는 캠필로박터 제주니(C. jejuni)의 야생형 gyrA 유전자의 존재를 지시한다.

한편, 개체에 따라 프라이머 서열 위치 내부에 변이가 존재하는 경우가 있는데, 이를 보완하기 위하여 전방향 프라이머 “cjGyrA-W-F”(서열번호 3)에 축퇴성(degenerated) 염기서열 “Y”을 삽입하여 디자인하였다.

본 발명의 또 다른 역방향 프라이머 “cjGyrA-M-R”(서열번호 4)는 캠필로박터 제주니(C. jejuni)의 gyrA 유전자 “C-257 → T” 변이형 특이적 프라이머이다. 이 프라이머는 상기 전방향 프라이머 “GyrA-contF”(서열번호 1)와 쌍을 이루어 PCR 반응하여 202 bp 크기의 증폭 산물을 형성한다. 따라서, 본 발명에 따라 PCR을 수행한 경우 202 bp 크기의 PCR 증폭산물이 생성되어 확인되면 이는 캠필로박터 제주니(C. jejuni)의 “C-257 → T” 변이형 gyrA 유전자의 존재를 지시한다.

본 발명의 또 다른 전방향 프라이머 “ccGyrA-W-F”(서열번호 5)는 캠필로박터 콜라이(C. coli)의 야생형 gyrA 유전자 특이적 프라이머이다. 이 프라이머는 상기 역방향 프라이머 “GyrA-contR”(서열번호 2)와 쌍을 이루어 PCR 반응하여 317 bp 크기의 PCR 산물을 형성한다. 따라서, 본 발명에 따라 PCR을 수행한 경우 317 bp 크기의 PCR 증폭산물이 생성되어 확인되면 이는 캠필로박터 콜라이(C. coli)의 야생형 gyrA 유전자의 존재를 지시한다.

본 발명의 또 다른 역방향 프라이머 “ccGyrA-M-R”(서열번호 6)는 캠필로박터 콜라이(C. coli)의 gyrA 유전자 “C-257 → T” 변이형 특이적 프라이머이다. 이 프라이머는 상기 전방향 프라이머 “GyrA-contF”(서열번호 1)와 쌍을 이루어 PCR 반응하여 202 bp 크기의 PCR 산물을 형성한다. 따라서, 본 발명에 따라 PCR을 수행한 경우 202 bp 크기의 PCR 증폭산물이 생성되어 확인되면 이는 캠필로박터 콜라이(C. coli)의 “C-257 → T” 변이형 gyrA 유전자의 존재를 지시한다.

따라서, 본 발명의 서열번호 1 내지 6의 서열을 포함하는 6종의 프라이머를 모두 포함하는 프라이머 세트를 사용하면, 캠필로박터 제주니(C. jejuni) 및 캠필로박터 콜라이(C. coli)균의 gyrA 유전자 “C-257 → T” 변이를 갖는 균주를 특이적 검출할 수 있다.

본 발명의 캠필로박터 제주니 및 캠필로박터 콜라이에서 gyrA 유전자 “C-257 → T” 변이는 퀴놀론 항생제에 대한 내성을 부여한다.

본 발명에서는 다양한 DNA 중합효소가 본 발명의 증폭에 이용될 수 있으며, E. coli DNA 중합효소 I의 “클레나우” 단편, 열안정성 DNA 중합효소 및 박테리오파아지 T7 DNA 중합효소를 포함한다. 바람직하게는, 중합효소는 다양한 박테리아 종으로부터 얻을 수 있는 열안정성 DNA 중합효소이고, 이는 Thermus aquaticus(Taq), Thermus thermophilus(Tth), Thermus filiformis, Thermis flavus, Thermococcus literalis, 및 Pyrococcus furiosus(Pfu)를 포함한다.

중합 반응을 실시할 때, 반응 용기에 반응에 필요한 성분들을 과량으로 제공하는 것이 바람직하다. 증폭 반응에 필요한 성분들의 과량은, 증폭반응이 성분의 농도에 실질적으로 제한되지 않는 정도의 양을 의미한다. Mg² ⁺와 같은 조인자, dATP, dCTP, dGTP 및 dTTP를 소망하는 증폭 정도가 달성될 수 있을 정도로 반응 혼합물에 제공하는 것이 소망된다. 증폭 반응에 이용되는 모든 효소들은 동일한 반응 조건에서 활성 상태일 수 있다. 사실, 완충액은 모든 효소들이 최적의 반응 조건에 근접하도록 한다. 따라서 본 발명의 증폭 과정은 반응물의 첨가와 같은 조건의 변화 없이 단일 반응물에서 실시될 수 있다.

단계 (c) : 상기 중합효소연쇄반응(PCR) 산물을 분석하여 캠필로박터 제주니(C. jejuni) 및 캠필로박터 콜라이(C. coli)의 야생형과 퀴놀론(quinolone) 내성을 갖는 변이형을 구분하는 단계

본 발명의 프라이머 세트를 사용하여 중합효소연쇄반응을 행한 후 증폭된 DNA 핵산 산물은 적합한 방법으로 분석하여 캠필로박터 제주니(C. jejuni) 및 캠필로박터 콜라이(C. coli)의 야생형 및 퀴놀론(quinolone) 내성을 갖는 gyrA 유전자의 변이형(“C-257 → T”)을 구분하여 검출하는 자료로 사용된다. 예를 들어, 상술한 DNA 핵산 증폭 반응의 결과물을 아가로즈 젤 전기영동(agarose gel electrophoresis)을 행하고, 그 결과 형성되는 증폭산물의 밴드를 관찰 및 분석한다.

본 발명의 전방향 프라이머 “cjGyrA-W-F”(서열번호 3) 또는 “ccGyrA-W-F”(서열번호 5)와, 역방향 프라이머인 “GyrA-contR”(서열번호 2)에 의해 생성되는 317 bp 증폭산물이 검출되는 경우, 캠필로박터의 gyrA 유전자 야생형이 존재하는 것으로 판단한다.

또한, 본 발명의 역방향 프라이머 “cjGyrA-M-R” (서열번호 4) 또는 “ccGyrA-M-R” (서열번호 6)와, 전방향 프라이머인 “GyrA-contF” (서열번호 1)에 의해 생성되는 202 bp 증폭산물이 검출되는 경우, 캠필로박터의 gyrA 유전자 변이형(“C-257 → T”)이 존재하는 것으로 판단한다.

본 발명의 전방향 프라이머 “GyrA-contF”(서열번호 1)와 역방향 프라이머 “GyrA-contR“(서열번호 2)에 의해 생성되는 내부대조군(internal control) 468 bp 증폭산물이 검출되지 않는다면 PCR을 다시 수행 하여야 한다.

본 발명의 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 캠필로박터 제주니(C. jejuni) 및 캠필로박터 콜라이(C. coli)의 야생형과 퀴놀론(quinolone) 내성을 갖는 변이형을 구분하여 검출하기 위한 중합효소연쇄반응(PCR)용 프라이머 세트로서, 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 5, 및 서열번호 6의 올리고뉴클레오티드를 포함하는 중합효소연쇄반응(PCR)용 프라이머 세트를 제공한다.

본 발명의 또 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 상기 프라이머 세트를 포함하는 캠필로박터 제주니(C. jejuni) 및 캠필로박터 콜라이(C. coli)의 야생형과 퀴놀론(quinolone) 내성을 갖는 변이형을 구분하여 검출하기 위한 용도의 중합효소연쇄반응(PCR)용 키트를 제공한다.

본 발명은 생물학적 시료내에서 캠필로박터의 퀴놀론 내성 변이형을 검출하는 방법, 이 방법에 사용되는 중합효소연쇄반응(PCR)용 프라이머 세트 및 키트에 관한 것이다. 본 발명에 의하면, 캠필로박터 제주니(C. jejuni) 및 캠필로박터 콜라이(C. coli)의 퀴놀론 내성 변이형균을 야생형균으로부터 고특이도 및 저비용으로 간편하게 분별 검출할 수 있다.

도 1은 캠필로박터의 gyr A 유전자의 Thr86 → Ile 변이 부위를 지노타이핑 (genotyping)하기 위한 PCR 증폭 부위 서열을 보여준다. 서열번호 7 및 서열번호 8 참조.
도 2는 캠필로박터의 gyr A 유전자의 서열에서 본 발명의 프라이머 위치를 보여준다.
도 3은 본 발명의 프라이머들의 조합을 모식도로 보여준다.
도 4는 본 발명의 프라이머를 사용하여 멀티플렉스 PCR 증폭하는 경우 나타나게 되는 증폭 산물을 도시한 것이다. M은 1kb ladder 마커이고, 1번 레인은 캠필로박터 콜라이(C. coli)의 야생형(317 bp 증폭산물로 지시됨), 2번 레인은 캠필로박터 콜라이(C. coli)의 변이형(202 bp 증폭산물로 지시됨), 3번 레인은 캠필로박터 제주니(C. jejuni)의 야생형(317 bp 증폭산물로 지시됨), 4번 레인은 캠필로박터 제주니(C. jejuni)의 변이형(202 bp 증폭산물로 지시됨), 5번 레인은 NTC(No Template Control)이다.
도 5는 본 발명의 멀티플렉스 PCR 키트를 131 개의 양성 검체로 검증 한 결과이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예

실험방법 및 재료

1. 샘플 검사( Sample examination )

닭 도체를 완충된 펩톤수(Buffered peptone water) 400 ml로 린스한 후 그 중 25 ml만 채취하여 225 ml의 프레스톤 항생제 첨가제(preston antibiotic supplement)를 첨가한 프레스톤 브로스(preston broth) 용액(Oxoid CM0983, Basingstoke Hampshire, UK)에 넣어주었다. 이어서, Anoxomat^TM system (Mart Microbiology B.V, Lichtenvoorde, The Nethelands)의 미호기성 조건 (5% O², 5% CO², 85% N²)하에서, 42℃, 48시간 배양하였다. 0.1ml 증균액을 CCDA 선별 첨가물(CCDA selective supplement)(oxoid SR0155E)와 캠필로박터 성장 첨가물(Campylobacter growth supplement)(SR0232E)가 첨가된 캠필로박터 무혈액 선택 아가(Campylobacter blood free selective agar)(oxoid CM0739)에 접종하였다. 선택배지에서 캠필로박터 추정의 분리균(isolate)을 취하고, 그람염색과 카탈라아제 옥시다아제 테스트(catalase, oxidase test), hippurate 테스트와 API Campy system (BioMerieux, Marcy l'etoile, France)을 이용하여 확진하였다. PCR 방법을 이용하여 캠필로박터 제주니(C. jejuni)와 캠필로박터 콜라이(C. coli)를 감별하였다(Nayak R, Stewart TM, Nawaz MS. Mol Cell Probes. 2005 Jun;19(3):187-93, PCR identification of Campylobacter coli and Campylobacter jejuni by partial sequencing of virulence genes). 이 때 캠필로박터 제주니(C. jejuni) ATCC 33560과 캠필로박터 콜라이(C. coli) ATCC 33569를 대조균주로 사용하였다.

2. DNA 추출

지놈(Genomic) DNA는 5％ 양 혈액(sheep blood)이 첨가된 Muller-Hinton agar 배지에서 42℃, 48시간 성장시킨 상태에서 추출하였다. QIAamp DNA Mini kit (Qiagen, France)를 이용하여 제조회사의 지시대로 추출과정을 수행하였다. 배양된 세균을 180㎕ 완충액 ATL과 20 ㎕ 프로티나아제 K(Proteinase K)를 첨가한 후 10분 동안 7,500 rpm으로 원심분리후, 다시 잘 혼합하였다. 세균이 용해될 때까지 55℃에 둔 후 볼텍싱(vortexing)을 실시하였다. 이어서, 200 ㎕ 완충액 AL을 첨가하여 15초 동안 볼텍싱하였다. 이어서, 70℃에서 10분 동안 정치한 후 200 ㎕의 에탄올을 첨가하였다. 그것을 QIAamp spin column (in a 2 ml collection tube)로 옮겨서 1분 동안 8000 rpm에서 원심분리하고 AW1을 첨가하여 회수 튜브(collection tube)에 담았다. 이어서, 이 튜브를 새 튜브로 바꾸고 AW2 500 ㎕ 완충액을 첨가하였다. 3분 동안 멤브레인(membrane)이 마르도록 원심분리한 후 DNeasy spin column을 통해 AE 200 ㎕ 완충액을 첨가해서 1.5ml microcentrifuge 튜브에 담아 1분 동안 상온에서 정치한 후, 8000 rpm에서 1분 동안 원심 분리하였다. DNA 농도는 A260에서 분광광도계로 측정하였다.

3. 프라이머(primer)의 제작

캠필로박터 제주니(C. jejuni)와 캠필로박터 콜라이(C. coli)의 핵산을 멀티플렉스 대립유전자 특이 PCR로 검출하기 위한 프라이머를 디자인하였다. 프라이머의 설계는 GeneBank database(National Center of Biotechnology Information, NCBI)에 등록되어 있는 gyrA 야생형과 변이형의 지놈 염기서열을 참조하였다. 프라이머를 설계하기 위해, 염기서열들을 비교정렬분석을 행하였으며(Bioedit sequence alignment edition software, version 7.0.5.3), 이로부터 정렬된 염기서열 중에서 캠필로박터 제주니(C. jejuni)와 캠필로박터 콜라이(C. coli)의 야생형[gyrA Thr-86 (C-257]과 변이형[gyrA Ile-86 (T-257)]에 대한 프라이머를 디자인하였다. 프라이머는 어닐링 온도 55℃, GC 함량 40-60％, 길이는 20-23 mer가 되도록 설계하였고, 제조한 프라이머의 염기서열은 아래 표 1에 나타내었다.

캠필로박터 또는 내부 대조군	프라이머 명칭	염기서열 (5′-> 3′)
내부 대조군 (internal control)	GyrA-contF	TCTATGAGTGTTATTATAGGTCGTGC (서열번호 1)
내부 대조군 (internal control)	GyrA-contR	TGTCGCCATACCTACAGCTATACC (서열번호 2)
캠필로박터 제주니 (C. jejuni )	cjGyrA-W-F	GYCGTTATCAYCCACATGGAGAGCC (서열번호 3)
캠필로박터 제주니 (C. jejuni )	cjGyrA-M-R	TTCTAACCAAAGCATCATAAACTGCGA (서열번호 4)
캠필로박터 콜라이 (C. coli )	ccGyrA-W-F	GTAAGTATCATCCACATGGCGAGCC (서열번호 5)
캠필로박터 콜라이 (C. coli )	ccGyrA-M-R	TTCTTACTAAGGCATCGTAAACAGACA (서열번호 6)

4. 멀티플렉스 PCR 의 조성 및 조건

멀티플렉스 PCR은 Bioneer, CTC 100, CTC 200 기기를 사용하여 수행하였다. 멀티플렉스 PCR의 조성은 2X 멀티플렉스 믹스(Solgent, Korea) 12.5 ㎕, 프라이머세트 믹스(GyrA-contF 1 pmol/㎕, GyrA-contR 2 pmol/㎕, ccGyrA-W-F 2 pmol/㎕, ccGyrA-M-R 20 pmol/㎕, cjGyr-W-F 20 pmol/㎕, cjGyrA-M-R 20pmol/㎕) 6 ㎕, 5X Band Doctor 5 ㎕ (final concentration 1X), DNA 검체 1 ㎕에 D.W.를 최종 25 ㎕ 부피로 맞추어 사용하였다. 본 실시예에서 사용된 PCR 반응액 조성은 아래 표 2에 나타내었다. PCR 반응은 95℃에서 15분간 전-변성(pre-denaturation), 95℃에서 20초간 변성, 55 ℃에서 40초간 어닐링, 72 ℃에서 1분간 증폭 과정을 35-사이클 반복 수행한 후, 72 ℃에서 3분간 증폭하였다. PCR 반응조건은 아래 표 3에 정리하였다.

Component	Volume
Template	1㎕
Primer contF (1p)	1㎕
Primer contR (2p)	1㎕
Primer ccWF3 (2p)	1㎕
Primer ccMR4 (20p)	1㎕
Primer WF2Y (20p)	1㎕
Primer MR2 (20p)	1㎕
2X multiplex mix	12.5㎕
5X Band Doctor (1X)	5㎕
Total	25㎕

Temperature	Time	Cycle (s)
95 ℃	15 min	1
95 ℃	20 sec	35
55 ℃	40 sec
72 ℃	1 min
72 ℃	3 min	1

5. 검체 테스트

멀티플렉스(multiplex) PCR 검출 키트를 검증하기 위해 양성검체시료 131개를 테스트 하였고, 각 샘플을 염기서열분석(sequencing) 하여 염기서열을 확인함으로서 멀티플렉스 PCR 검출 키트의 정확도를 확인하였다.

실험결과

1. 멀티플렉스( multiplex ) PCR 검출 결과

상기 디자인한 프라이머를 사용하여 멀티플렉스 PCR의 조건을 최적화하였다. 최적화된 멀티플렉스 PCR 키트내 프라이머들은 서로 영향을 주지 않으면서, 캠필로박터 제주니(C. jejuni) 및 캠필로박터 콜라이(C. coli)의 감수성, 내성 타입을 감별하는 것으로 확인되었으며, 특이적으로 PCR 산물이 증폭되는 것을 확인하였다. PCR 수행결과는 도 4에 나타내었다.

2. 검체 테스트

새로 개발한 멀티플렉스 PCR 키트를 검증하기 위해 131개의 양성 검체를 주형으로 하여 멀티플렉스 PCR을 수행하였다. 수행 결과의 일부는 도 5에 나타내었다. 본 발명의 멀티플렉스 PCR의 결과는 서열분석(sequencing)한 결과와 일치하여 야생형과 변이형을 정확하게 감별함을 확인하였다. 도 5의 결과에 나타나는 바와 같이, 본 발명의 키트가 퀴놀론(quinolone) 감수성 및 퀴놀론 내성의 캠필로박터 제주니(C. jejuni)와 캠필로박터 콜라이(C. coli)의 DNA 핵산을 높은 특이도로 감별할 수 있음을 확인하였다.

상기의 실험결과들을 보면 알 수 있는 바와 같이, 본 발명의 멀티플렉스용 PCR 프라이머는 퀴놀론(quinolone) 내성 또는 감수성 캠필로박터 제주니(C. jejuni)와 캠필로박터 콜라이(C. coli)를 높은 특이도를 가지면서 검출이 가능한 것으로 확인하였다. 또한, 다량의 시료를 다중 검출함으로써 신속한 테스트 및 결과를 얻을 수 있는 시간과 비용을 줄일 수 있는 장점이 있다.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

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Claims

다음의 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 생물학적 시료에서 캠필로박터 제주니(C. jejuni) 및 캠필로박터 콜라이(C. coli)의 야생형과 퀴놀론(quinolone) 내성을 갖는 변이형을 구분하여 검출하는 방법:
(a) 생물학적 시료로부터 DNA를 추출하는 단계;
(b) 추출한 DNA를 주형으로 사용하고, 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 5, 및 서열번호 6의 올리고뉴클레오티드를 갖는 중합효소연쇄반응(PCR)용 프라이머 세트를 사용하여 중합효소연쇄반응(PCR)을 행하는 단계; 및
(c) 상기 중합효소연쇄반응(PCR) 산물을 분석하여 캠필로박터 제주니(C. jejuni) 및 캠필로박터 콜라이(C. coli)의 야생형과 퀴놀론(quinolone) 내성을 갖는 변이형을 구분하는 단계.
제 1 항에 있어서, 상기 퀴놀론 내성을 갖는 변이형은 캠필로박터 제주니 또는 캠필로박터 콜라이의 gyrA 유전자의 86번째 아미노산 Thr이 Ile으로 전환된 변이형(C-257 → T)인 것을 특징으로 하는 방법.
캠필로박터 제주니(C. jejuni) 및 캠필로박터 콜라이(C. coli)의 야생형과 퀴놀론(quinolone) 내성을 갖는 변이형을 구분하여 검출하기 위한 중합효소연쇄반응(PCR)용 프라이머 세트로서, 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 5, 및 서열번호 6의 올리고뉴클레오티드를 포함하는 중합효소연쇄반응(PCR)용 프라이머 세트.
제 3 항에 상기 퀴놀론 내성을 갖는 변이형은 캠필로박터 제주니 또는 캠필로박터 콜라이의 gyrA 유전자의 86번째 아미노산 Thr이 Ile으로 전환된 변이형(C-257 → T)인 것을 특징으로 하는 프라이머 세트.
제 1 항의 프라이머 세트를 포함하는 캠필로박터 제주니(C. jejuni) 및 캠필로박터 콜라이(C. coli)의 야생형과 퀴놀론(quinolone) 내성을 갖는 변이형을 구분하여 검출하기 위한 용도의 중합효소연쇄반응(PCR)용 키트.
제 5 항에 상기 퀴놀론 내성을 갖는 변이형은 캠필로박터 제주니 또는 캠필로박터 콜라이의 gyrA 유전자의 86번째 아미노산 Thr이 Ile으로 전환된 변이형(C-257 → T)인 것을 특징으로 하는 중합효소연쇄반응(PCR)용 키트.