KR20130053240A - 신경줄기세포 분화조절제용 신규 피리미딘-2,4-디아민 유도체 및 이의 의학적 용도 - Google Patents

신경줄기세포 분화조절제용 신규 피리미딘-2,4-디아민 유도체 및 이의 의학적 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 신경줄기세포 분화조절제용 신규 피리미딘-2,4-디아민 유도체 및 이의 의학적 용도에 관한 것으로, 상기 피리미딘-2,4-디아민 유도체를 이용하여 신경줄기세포를 신경세포 특히 뉴런으로 분화시킬 수 있으므로, 상기 유도체를 포함한 조성물은 뇌졸중, 알츠하이머병, 파킨슨병 또는 척수 손상 질환 등을 포함하는 신경세포손상 질환의 치료 또는 예방에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

신경줄기세포 분화조절제용 신규 피리미딘-2,4-디아민 유도체 및 이의 의학적 용도 {Novel pyrimidine-2,4-diamine derivatives for differentiation of neural stem cells and medical use thereof}
본 발명은 신경줄기세포 분화조절제용 신규 피리미딘-2,4-디아민 유도체 및 이의 의학적 용도에 관한 것이다.
뇌졸중(stroke), 알츠하이머병, 파킨슨병, 탈수초질환(demyelinating disease), 척추 손상(spinal cord injury) 등은 신경 세포 손상에 의해 신경기능에 이상이 생기는 질환으로, 상기 질환들로 인해 손상된 신경세포는 재생되지 않아 치료가 어렵고 대증요법으로 약물 또는 외과적 수술이 이루어지나 이러한 치료법은 일시적이거나 정상적인 세포에도 손상을 입혀 문제점으로 지적되고 있다.
이에 최근에는 질환에 의해 파괴되거나 손상된 세포를 외부로부터 공급해 주는 세포 치료제가 효과적인 것으로 제시되고 있다. 이러한 세포 치료제로는 신경줄기세포(Neural stem cells: NSCs)가 각광을 받고 있다.
신경줄기세포는 신경계에 존재하는 전구세포(progenitor cell)의　서브타입으로, 성상세포(astrocytes), 희돌기교세포(oligodendrocytes), 뉴런(neurons)으로 분화할 수 있는 능력을 가지고 있다. 중추신경계(CNS)와 말초신경계(PNS)에서 분리하여 다세포성 뉴로스피어(Multicellular neurospheres)를 만들 수 있고 이 세포가 각각의 조건에서 글리아(glia) 계통과 신경 계통으로 분화하게 된다(Sally Temple et al. 2001).
뇌신경계 조직을 다른 조직과는 달리 면역거부반응이 거의 없기 때문에, 신경줄기세포를 이식하였을 때 이식된 세포의 장기간 생존을 기대할 수 있고, 따라서 신경세포 손상에 의해 유발되는 다양한 신경 질환에 대한 세포 치료제로서도 많은 연구가 이루어지고 있다.
그러나, 세포 치료제로서의 신경줄기세포의 유용성을 높이기 위해서는 신경줄기세포를 효율적으로 특정 세포로 분화시키는 기술이 필요하다.
이에, 본 발명자들은 신규한 피리미딘-2,4-디아민 유도체가 신경줄기세포를 특정세포 즉, 뉴런으로 분화시키는 신경줄기세포 분화조절제인 것을 밝혀냄으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 신경줄기세포 분화조절 활성을 갖는 신규 피리미딘-2,4-디아민 유도체 및 이의 제조방법을 제공하는 데에 있다.
또한, 본 발명의 다른 목적은 상기 피리미딘-2,4-디아민 유도체를 포함하는 신경줄기세포의 신경세포로의 분화유도용 조성물을 제공하는 데에 있다.
또한, 본 발명의 또다른 목적은 상기 조성물을 신경줄기세포와 함께 배양하는 단계를 포함하는, 신경줄기세포를 신경세포로 분화시키는 방법을 제공하는 데에 있다.
또한, 본 발명의 또다른 목적은 상기 피리미딘-2,4-디아민 유도체를 포함하는 신경세포손상 질환 치료 또는 예방용 약학조성물을 제공하는 데에 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 피리미딘-2,4-디아민 유도체 또는 그의 염을 제공한다.
[화학식 1]
Figure pat00001
상기 화학식 1에서,
R1 및 R2는 각각 독립적으로
Figure pat00002
또는
Figure pat00003
이며, R1 및 R2중 적어도 어느 하나는
Figure pat00004
이며,
상기 R3, R4 및 R6는 각각 독립적으로 수소, C1 -12 알킬, C1 -12 할로알킬 또는 C1 -12 헤테로알킬이며,
R5는 수소, 히드록시기, 할로겐, C1 -12 알킬, C1 -12 할로알킬, C1 -12 헤테로알킬, C1 -12 알콕시, C1 -16 아릴알킬 또는 C1 -16 헤테로아릴알킬일 수 있다.
또한 본 발명은 화학식 1로 표시되는 피리미딘-2,4-디아민 유도체 또는 그의 염을 포함하는 신경줄기세포의 신경세포로의 분화유도용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 조성물을 신경줄기세포와 함께 배양하는 단계를 포함하는, 신경줄기세포를 신경세포로 분화시키는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 화학식 1로 표시되는 피리미딘-2,4-디아민 유도체 또는 그의 염을 포함하는 신경세포손상 질환 치료 또는 예방용 약학조성물을 제공한다.
본 발명에 따른 피리미딘-2,4-디아민 유도체를 이용하여 신경줄기세포를 신경세포 특히 성상세포로 분화시킬 수 있으므로, 상기 유도체를 포함한 조성물은 뇌졸중, 알츠하이머병, 파킨슨병 또는 척수 손상 질환 등을 포함하는 신경세포손상 질환의 치료 또는 예방에 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 본 발명에 따른 피리미딘-2,4-디아민 유도체에 의한 신경줄기세포의 뉴런으로의 유도를 관찰한 것으로, 뉴런 마커(TuJ1) 및 성상세포 마커(GFAP)에 대한 면역형광 이미지이다.
이하, 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.
본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 피리미딘-2,4-디아민 유도체 또는 그의 염을 제공한다:
[화학식 1]
Figure pat00005
상기 화학식 1에서,
R1 및 R2는 각각 독립적으로
Figure pat00006
또는
Figure pat00007
이며, R1 및 R2중 적어도 어느 하나는
Figure pat00008
이며,
상기 R3, R4 및 R6는 각각 독립적으로 수소, C1 -12 알킬, C1 -12 할로알킬 또는 C1 -12 헤테로알킬이며,
R5는 수소, 히드록시기, 할로겐, C1 -12 알킬, C1 -12 할로알킬, C1 -12 헤테로알킬, C1 -12 알콕시, C1 -16 아릴알킬 또는 C1 -16 헤테로아릴알킬일 수 있다.
본 발명의 한 구체예에서, 상기 R3 및 R4 는 각각 독립적으로 수소, 메틸, 에틸일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니며, R6는 C1 -16 아미노알킬, 보다 구체적으로 2-모르폴리노에톡시, 2-피페리딜에톡시 또는 2-디에틸아미노에톡시일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
보다 구체적으로, 본 발명에 따른 화학식 1의 바람직한 화합물로는 이에 제한되는 것은 아니나, N2-(3,4-디메톡시페닐)-N4-(4-(2-모르폴리노에톡시)페닐)피리미딘-2,4-디아민, N4-(3,4-디메톡시페닐)-N2-(4-(2-모르폴리노에톡시)페닐)피리미딘-2,4-디아민 또는 N2,N4-비스(3,4-디메톡시페닐)피리미딘-2,4-디아민 등이 이에 해당할 수 있다.
본 발명에 따른 피리미딘-2,4-디아민 유도체는 공지의 방법에 의해 상응하는 염으로 제조할 수 있다. 이러한 염은 독성이 없는 수용성의 것이 바람직하다. 바람직한 염으로는 칼륨, 나트륨 등 등과 같은 알칼리 금속의 염; 칼슘, 마그네슘 등과 같은 알칼리토류 금속의 염; 그리고 테트라메틸 암모늄, 트리에틸아민, 메틸아민, 디메틸아민, 시클로펜틸아민, 벤질아민, 페네틸아민, 피페리딘, 모노에탄올아민, 디에탄올아민, 트리스(히드록시메틸)아민, 라이신, 아르기닌, N-메틸-D-글루카민 등과 같은 약학적으로 허용 가능한 아민의 염을 들 수 있다.
본 발명에 사용되는 피리미딘-2,4-디아민 유도체는 공지의 방법에 의해 상응하는 산 부가염으로 제조할 수 있다. 이러한 산 부가염은 독성이 없는 수용성인 것이 바람직하다. 바람직한 산 부가염으로는 염산염, 브롬화수소산염, 요오드화수소산염, 황산염, 인산염 및 질산염과 같은 무기산염, 또는 아세트산염, 젖산염, 주석산염, 옥살산염, 푸마르산염, 말레인산염, 구연산염, 벤조산염, 메탄술폰산염, 에탄술폰산염, 벤젠술폰산염, 톨루엔술폰산염, 이세티온산염, 글루쿠론산염 및 글루콘산염과 같은 유기산염을 들 수 있다.
본 발명의 사용되는 피리미딘-2,4-디아민 유도체 또는 그의 염은 공지의 방법에 의해 수화물로 제조할 수 있다.
이하의 표 1 및 도 1에 도시된 바와 같이, 본 발명에 따른 피리미딘-2,4-디아민 유도체 또는 그의 염을 처리한 실험군은 대조군에 비해 5배 내지 8배 세포 분화 유도 효과가 탁월하며, 특히 DMSO 가 처리된 대조군에 비해 뉴런으로의 분화를 현저히 촉진시킬 수 있다. 따라서, 본 발명에 따른 피리미딘-2,4-디아민 유도체 또는 그의 염은 신경줄기세포를 신경세포, 특히 뉴런으로 분화를 촉진함으로써 신경세포들 간의 균형을 맞추어 신경세포손상 질환의 치료 또는 예방에 유용하게 사용될 수 있다.
또한, 본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 피리미딘-2,4-디아민 유도체 또는 그의 염을 유효성분으로 포함하는, 신경줄기세포의 신경세포로의 분화유도용 조성물을 제공한다:
[화학식 1]
Figure pat00009
상기 화학식 1에서,
R1 및 R2는 각각 독립적으로
Figure pat00010
또는
Figure pat00011
이며, R1 및 R2중 적어도 어느 하나는
Figure pat00012
이며,
상기 R3, R4 및 R6는 각각 독립적으로 수소, C1 -12 알킬, C1 -12 할로알킬 또는 C1 -12 헤테로알킬이며,
R5는 수소, 히드록시기, 할로겐, C1 -12 알킬, C1 -12 할로알킬, C1 -12 헤테로알킬, C1 -12 알콕시, C1 -16 아릴알킬 또는 C1 -16 헤테로아릴알킬일 수 있다.
특히, 본 발명에 따른 조성물은 상기 피리미딘-2,4-디아민 유도체 또는 그의 염을 1 내지 10 μM의 양으로 포함하는 것이 바람직하다.
본 발명에 의해 분화될 수 있는 신경줄기세포는 특정한 신경계 세포를 만들어내는 신경전구세포의 단계를 거쳐서 신경세포로 분화하게 된다. 따라서, 미분화 상태이면서, 무한정 증식 및 신경세포로의 분화기능을 갖는 세포라면 특별히 제한되지는 않는다. 예를 들어, 배아 신경줄기세포, 성체 신경줄기세포, 배아생식 신경줄기세포 및 배아종양 신경줄기세포 등으로부터 선택될 수 있다.
상기 신경줄기세포로부터 분화된 신경세포는 뉴런(neuron), 성상세포(astrocyte), 희돌기교세포(oligodendrocyte) 또는 소교세포(microglia cell)일 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 조성물을 신경줄기세포와 함께 배양하는 단계를 포함하는, 신경줄기세포를 신경세포로 분화시키는 방법을 제공한다.
상기 배양은 DMEM(Dulbecco's modified Eagle's medium, Hyclone)/F12 배지와 같은 세포배양용 배지에서 수행될 수 있으며, 배양배지에는 B27, 섬유아세포성장인자(fibroblast-derived growth factor, FGF), 상피세포 성장인자(epidermal growth factor, EGF) 등과 같은 성장인자 등이 추가로 첨가될 수 있다. 배양기간은 3 내지 10일이 바람직하다.
또한, 본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 피리미딘-2,4-디아민 유도체 또는 그의 염을 유효성분으로 포함하는, 신경세포손상 질환 치료 또는 예방용 약학조성물을 제공한다:
[화학식 1]
Figure pat00013
상기 화학식 1에서,
R1 및 R2는 각각 독립적으로
Figure pat00014
또는
Figure pat00015
이며, R1 및 R2중 적어도 어느 하나는
Figure pat00016
이며,
상기 R3, R4 및 R6는 각각 독립적으로 수소, C1 -12 알킬, C1 -12 할로알킬 또는 C1 -12 헤테로알킬이며,
R5는 수소, 히드록시기, 할로겐, C1 -12 알킬, C1 -12 할로알킬, C1 -12 헤테로알킬, C1 -12 알콕시, C1 -16 아릴알킬 또는 C1 -16 헤테로아릴알킬일 수 있다.
상기 신경세포손상 질환으로는 파킨슨씨병, 알츠하이머, 피크병(Pick's disease), 헌팅톤병(Huntington's disease), 근위축성 측면 경화증(amyotriophic lateral sclerosis), 허혈성 뇌질환(stroke), 탈수초질환(demyelinating disease) 및 척추 손상(spinal cord injury)으로 이루어진 군에서 선택될 수 있다.
보다 상세하게는, 상기 신경세포를 치료학적으로 유효한 양으로 신경세포손상 질환의 치료가 필요한 대상의 손상부위에 투여할 경우, 주변 중추신경계 또는 말초신경계의 신경전구세포 또는 신경줄기세포를 신경세포로 분화시켜 손상된 신경 기능을 회복시키고 신경 손상 질환을 치료할 수 있다. 이때 상기 대상은 인간을 포함하는 포유동물일 수 있다.
본 발명의 약학조성물은 유효 성분 이외에 약학적으로 허용되는 첨가제를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 약학 분야에서 통상의 방법에 따라 환자의 신체 내 투여에 적합한 단위 투여형의 제제로 제형화될 수 있다. 이러한 목적에 적합한 제형으로는 비경구투여 제제로서 주사제 또는 구소 투여용 제제 등이 바람직하다. 이때, 일반적으로 사용되는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 함께 사용할 수 있다.
그리고, 신경세포의 1회 투여량은 1 x 105 세포/kg(체중), 바람직하게는 1회 또는 수회로 나누어 투여할 수 있다. 그러나, 유효 성분의 실제 투여량은 분화 및 증식하고자 하는 신경세포의 양, 투여경로, 환자의 체중, 연령 및 성별 등 여러 관련 인자를 고려하여 결정할 수 있으며, 따라서, 상기 투여량은 어떠한 형태로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 다만 하기의 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 실시예는 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.
< 제조예 1> 2-(4- 니트로페녹시 )에탄올(1) 의 제조
4-니트로페놀 (1.55g, 11.15mmol), 2-브로모에탄올 (1.583mL, 22.3mmol), 탄산칼륨 (7.7g, 55.7mmol)을 DMF (3mL)에 용해시킨 후, 80 ℃에서 반응혼합물을 밤새도록 교반하였다. 이후 에틸 아세테이트로 희석하고 물 및 염수로 세척한 후, 무수황산마그네슘으로 건조하고, 감압 하에서 농축하였다. 농축된 산물은 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피 (EtOAc/헥산 = 1:1)로 정제되었고, 흰색 고체로서 2-(4-니트로페녹시)에탄올(1)을 얻을 수 있었다(1.38g, 7.53mmol, 수득률 67.6%).
1H NMR (CDCl3): δ= 8.24 (dd, J = 9, 2Hz, 2H), 7.01 (dd, J= 9, 2Hz, 2H), 4.21 (m, 2H), 4.04 (m, 2H).
제조예 1의 반응식을 이하에 나타내었다.
[반응식 1]
Figure pat00017

< 제조예 2> 2-(4- 니트로페녹시 ) 에틸메탄설포네이트 (2) 의 제조
상기 2-(4-니트로페녹시)에탄올(1)(400mg, 2.18mmol), 트리에틸아민(3mL, 21.8mmol)을 THF (20mL)에 용해하고, 메탄설포닐클로라이드 (254.6μL, 3.27mmol)를 0℃ 에서 적하하였다. 반응 혼합물은 0℃에서 1시간동안 교반되었다. 그 후 에틸 아세테이트로 희석하였으며, 물 및 염수로 세척한 후, 무수황산마그네슘으로 건조하고, 감압 하에서 농축하였다. 농축된 산물은 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피 (MeCN/CHCl3= 1:20)로 정제되었고, 2-(4-니트로페녹시)에틸메탄설포네이트(2) 을 얻을 수 있었다(566mg, 2.17mmol, 수득률 99 %).
1H NMR (CDCl3): δ= 8.21 (dd, J= 9, 2Hz, 2H), 6.97 (dd, J= 9, 2Hz, 2H), 4.59-4.62 (m, 2H), 4.33-4.36 (m, 2H), 3.10(s, 3H)
제조예 2의 반응식을 이하에 나타내었다.
[반응식 2]
Figure pat00018

< 제조예 3> 2-(3- 니트로페녹시 )에탄올의 제조
3-니트로페놀 (180mg, 1.294mmol), 2-브로모에탄올 (110.24 μL, 1.553mmol), 탄산칼륨 (894mg, 6.47mmol)을 DMF (1mL)에 용해시킨 후, 80 ℃에서 반응혼합물을 밤새도록 교반하였다. 이후 에틸 아세테이트로 희석하고 물 및 염수로 세척한 후, 무수황산마그네슘으로 건조하고, 감압 하에서 농축하였다. 농축된 산물은 톨루엔으로 재결정되었고, 흰색 막대 결정으로서 2-(3-니트로페녹시)에탄올(3)을 얻을 수 있었다(140mg, 0.764mmol, 수득률 59%).
1H NMR (CDCl3): δ= 8.24 (dd, J = 9, 2Hz, 2H), 7.01 (dd, J= 9, 2Hz, 2H), 4.21 (m, 2H), 4.04 (m, 2H).
제조예 3의 반응식을 이하에 나타내었다.
[반응식 3]
Figure pat00019

< 제조예 4> 2-(3- 니트로페녹시 ) 에틸메탄설포네이트 (4) 의 제조
상기 2-(3-니트로페녹시)에탄올(3)(140mg, 0.764mmol), 트리에틸아민(1mL, 7.64mmol)을 THF (20mL)에 용해하고, 메탄설포닐클로라이드 (90μL, 1.147mmol)를 0℃ 에서 적하하였다. 반응 혼합물은 0℃에서 1시간동안 교반되었다. 그 후 에틸 아세테이트로 희석하였으며, 물 및 염수로 세척한 후, 무수황산마그네슘으로 건조하고, 감압 하에서 농축하였다. 농축된 산물은 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피 (MeCN/CHCl3= 1:30)로 정제되었고, 2-(3-니트로페녹시)에틸메탄설포네이트(4) 를 얻을 수 있었다(196mg, 0.75mmol, 수득률 98%).
1H NMR (CDCl3): δ= 8.21 (dd, J= 9, 2Hz, 2H), 6.97 (dd, J= 9, 2Hz, 2H), 4.59-4.62 (m, 2H), 4.33-4.36 (m, 2H), 3.10(s, 3H)
제조예 4의 반응식을 이하에 나타내었다.
[반응식 4]
Figure pat00020
< 제조예 5> 2-(4- 니트로페녹시 ) 에틸메탄설포네이트 (2)의 아미노화 반응
2-(4-니트로페녹시)에틸메탄설포네이트(2)(0.727mmol) 또는 2-(3-니트로페녹시)에틸메탄설포네이트(1) , 탄산칼륨(502.4mg, 3.64mmol), 및 부합하는 2차 아민 (2.18mmol)을 DMF(1mL)에 용해한 후, 70℃에서 24시간 교반하였다. 그 후 반응 혼합물을 에틸 아세테이트로 희석하였으며, 여과하고, 여과물을 감압 하에서 농축하였다. 농축된 산물은 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피 (MeOH/디클로로메탄 = 1:15~1:20)로 정제되었다.
4-(2-(4- 니트로페녹시 )모르폴린 (5a)
1H NMR (CDCl3): δ= 8.17 (dd, J= 9, 2Hz, 2H), 6.97 (dd, J= 9, 2Hz, 2H), 4.17-4.21(m, 2H), 3.71-3.74 (m, 4H), 2.81-2.85 (m, 2H), 2.56-2.59 (m, 4H)
1-(2-(4- 니트로페녹시 )에틸)피페리딘 (5b)
1H NMR (CDCl3): δ= 8.19 (d, J = 9.3Hz, 2H), 6.57 (d, J = 9.3Hz, 2H), 4.19 (t, J = 6.0Hz, 2H), 2.80 (t, J = 6.0Hz, 2H), 2.45-2.55 (m, 4H), 1.57-1.65 (m, 4H), 1.45-1.50 (m, 2H)
N,N- 디에틸 -2-(4- 니트로페녹시 ) 에탄아민 (5c)
1H NMR (CDCl3): δ= 8.19 (d, J = 9.0Hz, 2H), 6.97 (d, J = 9.0Hz, 2H), 4.13 (t, J = 6.0Hz, 2H), 2.90 (t, J = 6.0Hz, 2H), 2.65 (q, J = 7.2Hz, 4H), 1.08 (t, J = 7.2Hz, 6H)
4-(2-(3- 니트로페녹시 )에틸)모르폴린 (5d)
1H NMR (CDCl3): δ= 7.83 (dd, J = 7.8, 1.5Hz, 1H), 7.64 (t, J = 2.1Hz, 1H), 7.43 (t, J = 7.8Hz, 1H), 7.35 (dd, J = 7.8 2.1Hz, 1H), 4.19 (t, J = 5.7Hz, 2H), 3.75 (t, J = 4.5Hz, 4H), 2.85 (t, J = 5.7Hz, 2H), 2.56 (t, J = 4.5Hz, 4H)
제조예 5의 각각의 반응식을 이하에 나타내었다.
[반응식 5]
Figure pat00021
< 제조예 6> 니트로기의 아미노기로의 환원반응
상기 제조예 6의 반응산물(0.22mmol), 포름산 암모늄(과량), Pd/C (10 %)을 THF(4mL)에 용해하고 상온에서 1시간동안 교반하였다. 반응 시간은 Pd/C (10 %) 촉매의 양에 의존적이었고, TLC를 매 10분간 체크하였다. 잔여 포름산 암모늄 및 Pd/C가 여과되었고, 여과액은 감압 하에서 농축되었다. 이렇게 얻어진 비정제 산물을 추가적인 정제없이 다음 단계에서 사용되었다.
4-(2- morpholinoethoxy ) aniline (6a)
4-(2-( piperidin -1- yl ) ethoxy ) aniline (6b)
4-(2-( diethylamino ) ethoxy ) aniline (6c)
3-(2- morpholinoethoxy ) aniline (6d)
제조예 6의 각각의 반응식을 이하에 나타내었다.
[반응식 6]
Figure pat00022
< 제조예 7> 2- 클로로 -N-(4-(2- 모르폴리노에톡시 ) 페닐 )피리미딘-4-아민 (7) 의 제조
4-(2-모르폴리노에톡시)아닐린 (6a) (434mg, 1.35mmol)을 n-BuOH(10mL)에 용해하고, 2,4-디클로로피리미딘(223mg, 1.49mmol) 및 트리에틸아민(1.35mmol)을 한방울씩 적하하였다. 혼합용액은 환류조건에서 24시간동안 가열되었다. 그 후 디클로로메탄으로 희석하고, 물 및 염수로 세척하였으며, 무수황산마그네슘으로 건조하고, 감압 하에서 농축하였다. 농축된 산물은 DCM / 메탄올 (20 : 1)을 사용하는 컬럼에서 정제되었고, 용리액에서 2-클로로-N-(4-(2-모르폴리노에톡시)페닐)피리미딘-4-아민 (7)을 얻었다(수득률 55%).
1H NMR (CDCl3): δ= 8.06 (d, J = 6Hz, 1H), 7.18 (d, J= 9, 2Hz, 2H), 6.93 (d, J= 9, 2Hz, 2H), 6.91(s, 1H), 6.40(d, J = 6 Hz, 1H), 4.11-4.15 (m, 2H), 3.73-3.76 (m, 4H), 2.80-2.84 (m, 2H), 2.58-2.61 (m, 4H)
제조예 7의 반응식을 이하에 나타내었다.
[반응식 7]
Figure pat00023
< 제조예 8> N-(2- 클로로피리미딘 -4-일) 벤조 [d]티아졸-6- 아민(8)의 제조
2,4-디클로로피리미딘 (113mg, 0.76mmol), 6-아미노벤조티아졸 (136mg, 91mmol) 및 트리에틸아민 (0.76mmol) 을 n-BuOH (10ml)에 용해하고, 60℃ 에서 12시간도안 교반하였다. 그 후 반응 혼합물을 디클로로메탄으로 희석하고, 물 및 염수로 세척하였으며, 무수황산마그네슘으로 건조하고, 감압 하에서 농축하였다. 농축된 산물은 EtOAc / 헥산 (1 : 1)을 사용하는 컬럼에서 정제되었고, 용리액에서 N-(2-클로로피리미딘-4-일)벤조[d]티아졸-6-아민(8) 을 얻었다(수득률 29%).
제조예 8의 반응식을 이하에 나타내었다.
[반응식 8]
Figure pat00024
< 제조예 9> 2- 클로로 -N-(3,4- 디메톡시페닐 )피리미딘-4- 아민(9)의 제조
3,4-데미톡시아닐린(100mg, 0.653mmol), 2,4-디클로로피리미딘 (116.7mg, 0.783mmol) 및 소듐 아세테이트 무수물 (80.3mg, 0.979mmol) 을 THF/물 (1:1) 용액에 용해하고 60℃에서 두시간동안 교반하였다. 그 후 반응 혼합물을 에틸 아세테이트로 희석하고 물 및 염수로 세척하였으며, 무수황산마그네슘으로 건조하고, 진공 조건 하에서 농축하였다. 농축된 산물은 MeCN/CHCl3 = 1:10 을 사용하는 실리카 겔 크로마토그래피로 정제되었고, 2-클로로-N-(3,4-디메톡시페닐)피리미딘-4-아민(9)을 얻었다(71.8mg, 0.27mmol, 수득률 41.4%).
제조예 9의 반응식을 이하에 나타내었다.
[반응식 9]
Figure pat00025

< 제조예 10> 1- 메톡시 -4-니트로벤젠 (10)의 제조
4-니트로페놀 (280mg, 2.013mmol), 요오드화메틸 (150μL, 2.4mmol) 및 탄산칼륨(과량)을 아세톤에 용해하고 3시간동안 환류시켰다. 반응 혼합물을 에틸 아세테이트로 희석하고, 여과한 후, 여과액을 진공 조건 하에서 농축하였다. 농축된 산물은 EtOAc/헥산 = 1:5 을 사용하는 실리카 겔 크로마토그래피로 정제되었고, 1-메톡시-4-니트로벤젠 (10)을 얻었다(287.7mg, 1.878mmol, 수득률 94 %).
제조예 10의 반응식을 이하에 나타내었다.
[반응식 10]
Figure pat00026

< 제조예 11> 4- 메톡시아닐릴(11)의 제조
1-메톡시-4-니트로벤젠(10)(287.7mg, 1.878mmol), 활성 탄소 상의 팔라듐 5% (촉매량) 및 포름산 암모늄(과량)의 혼합물이 상온에서 2시간동안 교반되었다. 상기 혼합물에서, 메탄올이 증발되었고, 에틸 아세테이트로 희석되었다. 상기 혼합물이 여과되었고, 여과액은 진공 조건 하에서 농축되었다. 이렇게 얻어진 비정제 산물을 추가적인 정제없이 다음 단계에서 사용되었다.
제조예 11의 반응식을 이하에 나타내었다.
[반응식 11]
Figure pat00027

< 제조예 12> 2- 클로로 -N-(4- 메톡시페닐 )피리미딘-4- 아민(12)의 제조
2,4-디클로로피리미딘(280mg, 1.878mg), 4-메톡시아닐린(11)(1,878mmol), 및 트리에틸아민(785μL, 5.63mmol)을 1-부탄올에 용해하고 40℃에서 10시간동안 교반하였다. 반응 혼합물을 에틸 아세테이트로 희석하고, 포화 NaHCO3( aq ) 로 중화한 후, 유기층을 에틸아세테이트로 추출하였다. 유기층을 염수로 세척하고, 무수황산마그네슘으로 건조하고, 진공 조건 하에서 농축하였다. 디클로로메탄을 가한 후, 부유액을 여과하고, 디클로로메탄으로 세척하여 비정제 산물을 얻었고, 이를 통해 2-클로로-N-(4-메톡시페닐)피리미딘-4-아민(12)을 얻었다(188mg, 0.798mmol, 수득률 42.5%).
제조예 12의 반응식을 이하에 나타내었다.
[반응식 12]
Figure pat00028

< 제조예 13> 2- 클로로 -N-(2,4- 디메톡시페닐 )피리미딘-4-아민 (13)
2,4-디메톡시아닐린 (280.4mg, 1.830mmol), 및 2,4-디클로로피리미딘(300mg, 2.013mmol)을 이소프로판올에 용해시키고, 19시간동안 상온에서 교반하였다. 상기 혼합 용액으로부터 용매를 증발시키고, 에틸 아세테이트로 희석한 후, 물 및 염수로 세척하고 무수 황산마그네슘으로 건조한 후 진공조건 하에서 농축하였다. 비정제 산물은 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피로 정제되었고, 2-클로로-N-(2,4-디메톡시페닐)피리미딘-4-아민 (13)을 얻었다(153.1mg, 0.576mmol, 수득률 31.5%).
제조예 13의 반응식을 이하에 나타내었다.
[반응식 13]
Figure pat00029

< 제조예 14> 2- 클로로 -4-(3,4- 디메톡시페녹시 )피리미딘(14)의 제조
3,4-디메톡시페놀 (100mg, 0.649mmol), 2,4-디클로로피리미딘 (115.97mg, 0.778mmol), 및 탄산칼륨(과량)을 DMF(1mL)에 용해하고, 24시간동안 80℃에서 교반하였다. 반응 혼합물은 에틸 아세테이트로 희석되었으며, 여과 후 여과물은 진공조건 하에서 농축되었다. 비정제 산물은 실리카 겔 크로마토그래피로 정제되었고, 이를 통해 2-클로로-4-(3,4-디메톡시페녹시)피리미딘(14)을 얻었다(166.5mg, 0.624mmol, 수득률 96 %).
제조예 14의 반응식을 이하에 나타내었다.
[반응식 14]
Figure pat00030

< 실시예 1> N 2 -(3,4- 디메톡시페닐 )- N 4 -(4-(2- 모르폴리노에톡시 ) 페닐 )피리미딘-2,4- 디아민 (15a) 의 제조
2-클로로-N-(4-(2-모르폴리노에톡시)페닐)피리미딘-4-아민(7) (63 mg, 0.20 mmol), 및 3,4-디메톡시아닐린(35mg, 0.23mmol)을 n-부탄올(3mL)에 용해시키고 170℃에서 25분간 마이크로웨이브에서 교반하였다. 그 후 반응 혼합액은 디클로로메탄으로 희석되었고, 물 및 염수로 세척되었으며, 무수 황산 마그네슘으로 건조되었다. 감압 조건 하에서 용매의 증발이 이루어졌으며, 비정제 산물을 얻었다. 비정제 산물은 그 후 DCM/메탄올 (20:1) 을 사용하는 컬럼에서 정제되었고, 용리액에서 N2-(3,4-디메톡시페닐)-N4-(4-(2-모르폴리노에톡시)페닐)피리미딘-2,4-디아민 (15a)을 얻을 수 있었다(수득률 20%).
1H NMR (CDCl3, 300 MHz): δ= 7.96 (d, J = 6.0Hz, 1H), 7.22-7.26 (m, 4H), 7.01 (dd, 1H, 2.4Hz, J = 8.4), 6.89 (d, J = 9.0Hz, 2H), 6.81 (d, J = 8.4Hz, 1H), 6.74 (s, 1H), 6.00 (d, J = 6.0Hz, 1H), 4.11 (t, J = 5.7Hz, 2H), 3.86 (s, 3H), 3.82 (s, 3H), 3.75 (t, J = 4.5Hz, 4H), 2.81 (t, J =5.7 Hz, 2H), 2.59 (t, J = 4.5Hz, 4H)
실시예 1의 반응식을 이하에 나타내었다.
[반응식 15]
Figure pat00031
< 비교예 1> N 4 -( 벤조[d]티아졸 -6-일)- N 2 -(4-(2- 모르폴리노에톡시 ) 페닐 )피리미딘-2,4- 디아민 (15b)의 제조
4-(2-모르폴리노에톡시)아닐린 (6a) (45 mg, 0.22mmol), N-(2-클로로피리미딘-4-일)벤조[d]티아졸-6-아민 (8) (57mg, 0.22mmol) 및 염산 (1방울)을 n-부탄올 (3mL)에 용해하였고, 170℃ 에서 한시간동안 마이크로웨이브에서 교반하였다. 그 후 반응 혼합액은 디클로로메탄으로 희석되었고, 물 및 염수로 세척되었으며, 무수 황산 마그네슘으로 건조되었다. 감압 조건 하에서 용매의 증발이 이루어졌으며, 비정제 산물을 얻었다. 비정제 산물은 그 후 DCM/메탄올 (10:1) 을 사용하는 컬럼에서 정제되었고, 용리액에서 N4-(벤조[d]티아졸-6-일)-N2-(4-(2-모르폴리노에톡시)페닐)피리미딘-2,4-디아민 (15b) 을 얻을 수 있었다(수득률 10%).
1H NMR (Acetone d6, 300 MHz): δ= 9.08 (s, 1H), 8.93 (d, J= 2.1Hz, 1H), 8.87 (s, 1H), 8.35 (s, 1H) 8.02 (d, J= 5.7Hz, 1H), 7.95 (d, J= 9Hz, 1H), 7.63 (d, J= 9Hz, 2H), 7.53 (dd, J= 6.6, 2.1Hz, 1H) 6.93 (d, J= 9Hz, 2H), 6.24 (d, J= 6Hz, 1H) 4.15 (t, J= 6Hz, 2H) 3.63 (t, J= 4.5Hz, 4H), 2.76 (t, J=5.7Hz, 2H) 2.55 (t, J= 4.5Hz, 4H)
비교예 1의 반응식을 이하에 나타내었다.
[반응식 16]
Figure pat00032
< 실시예 2, 3> N 4 -(3,4- 디메톡시페닐 )- N 2 -(4-(2-(피페리딘-1-일) 에톡시 ) 페닐 )피리미딘-2,4- 디아민 (15c) 및 N 2 -(4-(2-( 디에틸아미노 ) 에톡시 ) 페닐 )- N 4 -(3,4- 디메톡시페닐 )피리미딘-2,4- 디아민 (15d) 의 제조
2-클로로-N-(3,4-디메톡시페닐)피리미딘-4-아민 (9) (1.2 equiv.), 적합한 아닐린(6b-c, 4-메톡시아닐린/1.0 equiv.) 및 4M HCl 에 존재하는 1,4-다이옥산을 1-부탄올에 용해시키고 170℃에서 한시간동안 마이크로웨이브에서 교반하였다. 그 후 반응 혼합액은 디클로로메탄으로 희석되었고, 물 및 염수로 세척되었으며, 무수 황산 마그네슘으로 건조되고 진공 조건 하에서 농축되었다. 비정제 산물은 그 후 실리카 겔 크로마토그래피(메탄올/DCM=1:15~1:10) 로 정제되었고, 원하는 산물을 획득하였다.
실시예 2: N 4 -(3,4- 디메톡시페닐 )- N 2 -(4-(2-(피페리딘-1-일) 에톡시 ) 페닐 )피리미딘-2,4- 디아민 (15c)
실리카 겔 컬럼 크로마토그래피 (MeOH/DCM = 1:15~1:10), 분리 수율 58.2 %
1H NMR (CDCl3, 300 MHz) δ 7.95 (d, J =6.0Hz, 1H), 7.81 (s, 1H), 7.41 (d, J = 9.3Hz, 2H), 7.36 (s, 1H), 6.77-6.89 (m, 5H), 6.02 (d, J =6.0Hz, 1H), 4.00 (t, J = 6.3Hz, 2H), 3.86 (s, 3H), 3.77 (s, 3H), 2.85 (t, J = 6.3Hz, 2H), 2.63 (q, J = 7.2Hz, 4H), 1.06 (t, J = 7.2Hz, 6H)
실시예 3: N 2 -(4-(2-( 디에틸아미노 ) 에톡시 ) 페닐 )-N 4 -(3,4-디 메 톡시페닐)피리미딘-2,4- 디아민 (15d)
실리카 겔 컬럼 크로마토그래피 (MeOH/DCM = 1:10), 분리 수율 26.4 %
1H NMR (CDCl3, 300 MHz) δ 7.97 (d, J =5.7Hz, 1H), 7.43 (d, J = 9.0Hz, 2H), 7.17 (s, 1H), 6.80-6.89 (m, 6H), 6.03 (d, J =5.7Hz, 1H), 4.09 (t, J = 6.0Hz, 2H), 3.89 (s, 3H), 3.82 (s, 3H), 2.78 (t, J = 6.0Hz, 2H), 2.47-2.51 (m, 4H), 1.58-1.65 (m, 4H), 1.44-1.49 (m, 2H)
실시예 2, 3의 반응식을 이하에 나타내었다.
[반응식 17]
Figure pat00033

< 실시예 4> N 4 -(3,4- 디메톡시페닐 )- N 2 -(4-(2- 모르폴리노에톡시 ) 페닐 )피리미딘-2,4- 디아민 (15e)의 제조
4-(2-모르폴리노에톡시)아닐린(6a) (39mg, 0.18mmol), 2-클로로-N-(3,4-디메톡시페닐)피리미딘-4-아민(9) (52mg, 0.20mmol) 및 HCl (1 방울)을 자일렌(3mL)에 용해시켰고, 180℃ 에서 1시간동안 마이크로웨이브에서 교반하였다. 그 후 반응 혼합액은 디클로로메탄으로 희석되었고, 물 및 염수로 세척되었으며, 무수 황산 마그네슘으로 건조되었다. 그 후 감압 조건 하에서 용매의 증발을 통해 비정제 산물을 얻었다. 비정제 산물은 그 후 DCM / 메탄올 (10 : 1)을 용리액으로 사용하는 컬럼으로 정제되었으며, 이를 통해 N4-(3,4-디메톡시페닐)-N2-(4-(2-모르폴리노에톡시)페닐)피리미딘-2,4-디아민 (15e)을 획득하였다(수득률 18%).
1H NMR (CDCl3): δ= 8.30 (s, 1H), 8.16 (s, 1H), 7.94 (d, J = 6Hz, 1H), 7.65 (dd, J = 9, 2Hz, 2H) 7.23(d, J = 2Hz, 1H), 7.09(d, J = 9Hz, 1H), 6.84-6.90 (m, 3H), 6.13-6.15(d, J = 6Hz, 1H), 4.07 (t, 2H), 3.79 (s, 3H), 3.73 (s, 3H), 3.60(t, 4H), 2.71(t, 2H), 2.51(t, 4H)
실시예 4의 반응식을 이하에 나타내었다.
[반응식 18]
Figure pat00034
< 비교예 2, 3, 4, 5, 6> 15f-j 화합물의 제조
2-클로로피리미딘(9, 12, 13, 14 화합물/1.0 equiv.), 적합한 아닐린(6a, 6d /1.0 equiv), 및 캄포설폰산 (0.2 equiv.) 를 이소프로판올에 용해하고, 120℃에서 1시간동안 마이크로웨이브에서 교반하였다. 혼합액은 디클로로메탄으로 희석되었고, 물 및 염수로 세척되었으며, 황산마그네슘으로 건조된 후 진공조건 하에서 농축되었다. 비정제 산물은 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피 (MeOH/DCM = 1:30~1:15)로 정제되어 원하는 산물을 얻었다.
비교예 2: N 4 -(3,4- 디메톡시페닐 )- N 2 -(3-(2- 모르폴리노에톡시 ) 페닐 )피리미딘-2,4- 디아민 (15f)
실리카 겔 컬럼 크로마토그래피 (MeOH/DCM = 1:20~1:15), 분리 수율 24.8 %
1H NMR (CDCl3, 300 MHz):δ= 8.01 (d, J =6.0Hz, 1H), 7.37 (t, J =2.1Hz, 1H), 7.30 (s, 1H), 7.17 (t, J = 7.8Hz, 1H), 7.07 (d, J = 7.8Hz, 1H), 6.90 (s, 1H), 6.86 (s, 2H), 6.85 (s, 1H), 6.55 (dd, J = 7.8, 2.1Hz, 1H), 6.07 (d, J =6.0Hz, 1H), 4.09 (t, J = 5.7Hz, 2H), 3.90 (s, 3H), 3.83 (s, 3H), 3.73 (t, J = 4.5Hz, 4H), 2.79 (t, J = 5.7Hz, 2H), 2.56 (t, J = 4.5Hz, 4H).
비교예 3: N 4 -(4- 메톡시페닐 )- N 2 -(4-(2- 모르폴리노에톡시 ) 페닐 )피리미딘-2,4- 디아민 (15g)
실리카 겔 컬럼 크로마토그래피 (MeOH/DCM = 1:20~1:15), 분리 수율 39.4 %
1H NMR (CDCl3, 300 MHz): δ=7.95 (d, J =5.7Hz, 1H), 7.43 (d, J = 9.3Hz, 2H), 7.31 (s, 1H), 7.22 (d, J = 9.3Hz, 2H), 6.86-6.92 (m, 5H), 5.99 (d, J =5.7Hz, 1H), 4.09 (t, J = 5.7Hz, 2H), 3.81 (s, 3H), 3.74 (t, J = 4.5Hz, 4H), 2.79 (t, J = 6.0Hz, 2H), 2.57 (t, J = 4.5Hz, 4H)
비교예 4: N 4 -(2,4- 디메톡시페닐 )- N 2 -(4-(2- 모르폴리노에톡시 ) 페닐 )피리미딘-2,4- 디아민 (15h)
실리카 겔 컬럼 크로마토그래피 (MeOH/DCM = 1:30~1:20), 분리 수율 9.4 %
1H NMR (Acetone d6, 300 MHz): δ=8.18 (s, 1H), 7.93 (d, J =6.0Hz, 1H), 7.66-7.97 (m, 3H), 6.85 (d, J = 9.0Hz, 2H), 6.63 (d, J = 2.7Hz, 1H), 6.51 (dd, J = 9.0, 2.7Hz 1H), 6.17 (d, J = 5.7Hz, 1H), 4.09 (t, J = 5.7Hz, 2H), 3.84 (s, 3H), 3.81 (s, 3H), 3.62 (t, J = 4.5Hz, 4H), 2.73 (t, J = 6.0Hz, 2H), 2.52 (t, J = 4.5Hz, 4H)
비교예 5: N 4 -(2,4- 디메톡시페닐 )- N 2 -(3,4- 디메톡시페닐 )피리미딘-2,4- 디아민 (15i)
실리카 겔 컬럼 크로마토그래피 (MeOH/DCM = 1:30), 분리 수율 50.7 %
1H NMR (Acetone d6, 300 MHz): δ= 8.20 (s, 1H), 7.90-7.96 (m, 2H), 7.68 (s, 1H), 7.50 (d, J = 2.4Hz, 1H), 7.28 (dd, J = 8.7, 2.4Hz, 1H), 6.84 (d, J = 9.0Hz, 1H), 6.63 (d, J = 2.7Hz, 1H), 6.49 (dd, J = 9.0, 2.7Hz, 1H), 6.17 (d, J = 6.0Hz, 1H), 3.83 (s, 3H), 3.81 (s, 3H), 3.77 (s, 3H), 3.73 (s, 3H).
비교예 6: 4-(3,4- 디메톡시페녹시 )-N-(3,4- 디메톡시페녹시 )피리미딘-2-아민 (15j)
실리카 겔 컬럼 크로마토그래피 (MeOH/DCM = 1:40), 분리 수율 30.6 %
1H NMR (Acetone d6, 300 MHz): δ= 8.42 (s, 1H), 8.27 (d, J = 5.7 Hz, 1H), 7.17 (dd, J = 8.7, 2.4 Hz, 1H), 7.0 (d, J = 8.7 Hz, 1H), 6.85 (d, J = 2.7 Hz, 1H), 6.70~6.77 (m, 2H), 6.30 (d, J = 5.7 Hz, 1H), 3.86 (s, 3H), 3.80 (s, 3H), 3.74 (s, 3H), 3.63 (s, 3H)
비교예 2, 3, 4, 5, 6의 반응식을 이하에 나타내었다.
[반응식 19]
Figure pat00035
< 실시예 5> N 2 , N 4 - 비스(3,4-디메톡시페닐)피리미딘 -2,4- 디아민 (15k)의 제조
2,4-디클로로피리미딘(51mg, 0.34mmol) 3,4-디메톡시아닐린 (128mg, 0.84mmol) 및 트리에틸아민 (0.70mmol)을 자일렌(3mL)에 용해시키고 19시간동안 환류시키며 교반하였다. 그 후 반응 혼합물은 디클로로메탄으로 희석되었고, 물 및 염수로 세척되었으며, 무수 황산마그네슘으로 건조되었다. . 그 후 감압 조건 하에서 용매의 증발을 통해 비정제 산물을 얻었다. 비정제 산물은 그 후 DCM / 메탄올 (20 : 1)을 용리액으로 사용하는 컬럼으로 정제되었으며, 이를 통해 N2,N4-비스(3,4-디메톡시페닐)피리미딘-2,4-디아민 (15k) 을 획득하였다(수득률 7%).
1H NMR (CDCl3): δ= 8.29 (s, 1H), 8.13 (s, 1H), 7.95 (d, J = 6Hz, 1H), 7.48 (d, J = 2Hz, 1H) 7.22-7.29 (m, 2H), 7.09-7.14 (m, 1H), 6.87(d, J = 9Hz, 1H), 6.82(d, J = 9Hz, 1H) 6.14(d, J = 6Hz, 1H), 3.71-3.81(m, 9H)
실시예 5의 반응식을 이하에 나타내었다.
[반응식 20]
Figure pat00036

< 시험예 1> 면역세포화학 분석
면역세포화학 분석을 위하여, 세포 배양물을 4% 파라포름알데히드에서 30분 동안 고정시키고 인산 완충액(PBS)으로 세정하였다. 고정된 세포를 5% 정상 염소 혈청 및 PBS에 용해된 0.2% 트리톤 X-100으로 브로킹하였으며, β-튜블린 III (TuJ1)(모노클로날; 1:1,000; Sigma-Aldrich, MO), 신경교섬유질산성단백질(glial fibrillary acidic protein, GFAP) (폴리클로날; 1:1,000; Dako, Carpinteria, CA)에 대한 제1항체와 배양하였다. PBS로 세정한 후, Cy3 (1:1000, Molecular Probes, CA)에 접합된 제2항체와 30분 동안 배양하였다. 핵 염색으로 제2항체 배양 완료 후, 4,6-디아미디노-2-페닐인돌(DAPI) (1:10,000 in PBS)을 5분 동안 첨가하였다. 역상 형광현미경(DMIL; Leica, Wetzlar)을 이용하여 이미지를 얻었다.
편향된 결과를 방지하기 위해, 이미지를 무작위로 촬영하였으며, GFAP 또는 TuJ1 양성 세포는 3-6 의존적 결과로부터 계수되었다. 총 세포 수를 계산하기 위해, DAPI 염색된 핵이 사용되었다. GFAP-양성 세포 또는 TuJ1 양성 세포의 수는 DAPI 양성 세포에 의해 백분율을 구하기 위해 나누어졌다. 각각의 화합물이 처리된 군의 백분율 값은 증가 배수로 표현되기 위해 컨트롤의 값에 의해 나누어졌다.
결과를 표 1 및 도 1에 나타내었다.
compound No . fold increase
실시예 1 (15a) (KHN01) 5.2
비교예 1 (15b) 2.6
실시예 2 (15c) 2.0
실시예 3 (15d) 1.7
실시예 4 (15e) (KHN02) 5.5
비교예 2 (15f) 1.5
비교예 3 (15g) 1.4
비교예 4 (15h) 2.0
비교예 5 (15i) 2.2
비교예 6 (15j) 1.6
실시예 5 (15k) (KHN03) 8.0
표 1을 참조하면, 실시예 화합물이 처리된 군, 특히 실시예 1, 4, 5 화합물이 처리된 군은 다른 비교군이 처리된 군에 비해, 뉴런 마커인 TuJ1 양성 세포의 수가 현저히 증가되어 있음을 확인할 수 있었다.
이에 따라 실시예 1, 2 및 3에 대한 면역형광 이미지를 나타낸 도 1을 참조하면, 실시예 1, 2, 및 3의 처리에 따라 뉴런 마커인 TuJ1은 DMSO 처리 대조군에 비해 현저히 증가함을 알 수 있고, 성상세포 마커인 GFAP는 현저히 감소됨을 알 수 있었다. 따라서 본 발명의 화합물은 신경줄기세포를 성상세포가 아닌 뉴런으로 분화시키는 효과가 우수함을 알 수 있다.
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시예일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims (9)

  1. 하기 화학식 1로 표시되는 피리미딘-2,4-디아민 유도체 또는 그의 염:
    [화학식 1]
    Figure pat00037

    상기 화학식 1에서,
    R1 및 R2는 각각 독립적으로
    Figure pat00038
    또는
    Figure pat00039

    이며, R1 및 R2중 적어도 어느 하나는
    Figure pat00040
    이며,
    상기 R3, R4 및 R6는 각각 독립적으로 수소, C1 -12 알킬, C1 -12 할로알킬 또는 C1 -12 헤테로알킬이며,
    R5는 수소, 히드록시기, 할로겐, C1 -12 알킬, C1 -12 할로알킬, C1 -12 헤테로알킬, C1 -12 알콕시, C1 -16 아릴알킬 또는 C1 -16 헤테로아릴알킬임.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 피리미딘-2,4-디아민 유도체가 N2-(3,4-디메톡시페닐)-N4-(4-(2-모르폴리노에톡시)페닐)피리미딘-2,4-디아민, N4-(3,4-디메톡시페닐)-N2-(4-(2-모르폴리노에톡시)페닐)피리미딘-2,4-디아민 또는 N2,N4-비스(3,4-디메톡시페닐)피리미딘-2,4-디아민인 것을 특징으로 하는 피리미딘-2,4-디아민 유도체 또는 그의 염.
  3. 하기 화학식 1로 표시되는 피리미딘-2,4-디아민 유도체 또는 그의 염을 유효성분으로 포함하는, 신경줄기세포의 신경세포로의 분화유도용 조성물:
    [화학식 1]
    Figure pat00041

    상기 화학식 1에서,
    R1 및 R2는 각각 독립적으로
    Figure pat00042
    또는
    Figure pat00043

    이며, R1 및 R2중 적어도 어느 하나는
    Figure pat00044
    이며,
    상기 R3, R4 및 R6는 각각 독립적으로 수소, C1 -12 알킬, C1 -12 할로알킬 또는 C1 -12 헤테로알킬이며,
    R5는 수소, 히드록시기, 할로겐, C1 -12 알킬, C1 -12 할로알킬, C1 -12 헤테로알킬, C1 -12 알콕시, C1 -16 아릴알킬 또는 C1 -16 헤테로아릴알킬임.
  4. 제3항에 있어서,
    상기 피리미딘-2,4-디아민 유도체 또는 그의 염을 1 내지 10 μM의 양으로 포함하는, 신경줄기세포의 신경세포로의 분화유도용 조성물.
  5. 제3항에 있어서,
    상기 신경줄기세포가 배아 신경줄기세포, 성체 신경줄기세포, 배아생식 신경줄기세포 및 배아종양 신경줄기세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 신경줄기세포의 신경세포로의 분화유도용 조성물.
  6. 제3항에 있어서,
    상기 신경세포는 뉴런(neuron), 성상세포(astrocyte), 희돌기교세포(oligodendrocyte) 또는 소교세포(microglia cell)인 것을 특징으로 하는, 신경줄기세포의 신경세포로의 분화유도용 조성물.
  7. 제3항의 조성물을 신경줄기세포와 함께 배양하는 단계를 포함하는, 신경줄기세포를 신경세포로 분화시키는 방법.
  8. 하기 화학식 1로 표시되는 피리미딘-2,4-디아민 유도체 또는 그의 염을 유효성분으로 포함하는, 신경세포손상 질환 치료 또는 예방용 약학조성물:
    [화학식 1]
    Figure pat00045

    상기 화학식 1에서,
    R1 및 R2는 각각 독립적으로
    Figure pat00046
    또는
    Figure pat00047

    이며, R1 및 R2중 적어도 어느 하나는
    Figure pat00048
    이며,
    상기 R3, R4 및 R6는 각각 독립적으로 수소, C1 -12 알킬, C1 -12 할로알킬 또는 C1 -12 헤테로알킬이며,
    R5는 수소, 히드록시기, 할로겐, C1 -12 알킬, C1 -12 할로알킬, C1 -12 헤테로알킬, C1 -12 알콕시, C1 -16 아릴알킬 또는 C1 -16 헤테로아릴알킬임.
  9. 제8항에 있어서,
    상기 신경세포손상 질환은 파킨슨씨병, 알츠하이머, 피크병(Pick's disease), 헌팅톤병(Huntington's disease), 근위축성 측면 경화증(amyotriophic lateral sclerosis), 허혈성 뇌질환(stroke), 탈수초질환(demyelinating disease) 및 척추 손상(spinal cord injury)으로 이루어진 군에서 선택되는 것인 신경세포손상 질환 치료 또는 예방용 약학조성물.
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