KR20130043239A

KR20130043239A - 면역글로불린 분획 및 이것의 제조 방법

Info

Publication number: KR20130043239A
Application number: KR1020137007839A
Authority: KR
Inventors: 앤드류 브라운; 피터 합먼; 리차드 페인; 미셸 로니
Original assignee: 머레이 걸번 코-어퍼러티브 컴퍼니 리미티드
Priority date: 2005-05-10
Filing date: 2006-05-10
Publication date: 2013-04-29
Also published as: KR101496432B1; DK1879908T3; US20090214567A1; WO2006119560A1; CN103087188A; JP2008540462A; CA2607082C; CN103087188B; AU2006246299A1; CA2607082A1; EP1879908B1; AU2006246299B2; US8282927B2; KR20080013903A; CN101171261A; EP1879908A1; TW200716664A; EP1879908A4

Abstract

본 발명은 IgA를 함유하는 식품 첨가제용 조성물 제품에 관한 것이다. 특히, IgA 강화 유제품 추출물의 조성물 및 이것의 제조 방법에 관한 것이다.

Description

면역글로불린 분획 및 이것의 제조 방법 {IMMUNOGLOBULIN FRACTION AND PROCESS THEREFOR}

본 발명은 IgA를 함유하는 식품 첨가제용 조성물의 생산에 관한 것이다. 더욱 구체적으로는, 본 발명은 IgA 강화 유제품 추출물의 조성물의 제조 방법 및 그 조성물에 관한 것이다.

본 발명은 관련 기술 분야에서 종래에 행하여진 기술에 비추어 이해될 것이다. 그러나, 이하의 논의는 인용된 어떠한 문헌이 본원의 우선일을 기준으로 호주에서 공개, 또는 사용되었거나 통상의 일반적 지식의 일부이었다는 사실을 인정하는 것은 아니다.

면역글로불린 A (IgA)는 모유를 비롯한 인체 분비물에 우세하게 존재하는 면역글로불린으로서, 병원성 바이러스, 세균, 진균류 및 이들의 독소와 결합함으로써 병원체로부터 신체를 방어한다. IgA는 태아가 전술한 병원체에 대한 본태성 방어 기작을 할 수 있도록 해준다. IgA 항체는 장내 효소에 대한 분해 저항성이 있기 때문에 경구 투여하는 것이 효과적이다. 따라서, 기능성 식품이나 보조 식품으로서 이상적이다. IgA를 프로바이오틱스 (probiotics)와 결합함으로써 병원체로 인한 악영향을 방지하거나 줄일 수 있다. 응용 분야의 예를 들면, IgA는 코, 눈, 귀, 폐, 가슴 및 질 등의 인체 점막 표면의 감염을 유발하는 표적 병원체에 대한 기능성 식품 성분으로 이용하는 것을 포함한다. 또한, IgA 함유 제품은 장 및 구강 건강용 제품으로서 적합하다. 일반적으로 우유에는 IgA가 낮은 수준으로 존재하기 때문에, 면역 접종 요법 (immunisation regimes)에 의하여 우유 내의 존재 수준을 높여서 상업적 규모로 IgA의 수율을 증가시키는 방법이 고안되었다. 일반적으로, 우유에는 IgA 및 IgG가 대략 1:8의 비율로 함유되어 있다.

IgA를 함유하는 식품용 조성물은 현재 기본적으로 동일한 공정 및 사실상 동일한 방법으로 광범위하게 제조되고 있다. 가장 일반적인 제조 방법은 과면역 접종법 (hyperimmunisation)이라 불리는 것으로서, 바이러스 등과 같은 면역 유발성 물질을 다수의 소에 접종하여 과면역 반응을 유도하는 것이다. 과면역 반응의 결과로서, 면역된 소에서 생산되는 우유는 증가된 IgA 함량을 나타내는데, 이를 "과면역유 (hyperimmune milk)"라고도 한다. 생산된 과면역유는 표준 막 기법 (standard membrane technology)을 사용하여 농축시켜 대략 5% w/w의 IgA가 함유된 유제품 추출물로 만드는데, 상기 추출물은 유아용 조제유 등과 같은 보조 식품으로 사용될 수 있다.

과면역유 제조 과정상의 본질적인 문제점은, 소에게 면역 접종 요법에 의하여 과면역 반응을 유도하는데 일반적으로 3 개월이 소요되고, 그 다음에 상업적인 수준의 IgA를 함유하는 유제품 추출물을 생산하기에 충분한 양의 과면역유를 얻는데 다시 1 개월이 소요된다는 점이다. 또한, 이러한 과정은 본 발명에 비하여 비용이 많이 든다.

IgA는 가변성 당화(糖化) 반응 (glycosylation) 때문에 약 4.5~6.5 범위의 산성 등전점 (pI)을 나타내며, 일반적으로는 상업적 가치가 있는 양으로 양이온 교환 수지에 흡착되기 어렵다. 놀랍게도, 본 발명의 방법은 탈지유 등의 유제품으로부터 적하(積荷) (loading) 조건 및 용리(溶離) 조건을 변화시켜가며 양이온 교환 크로마토그래피를 수행함으로써 IgA의 분획 공정이 가능하다. 이러한 공정은 종래에는 상업적 규모로 이루어진 적이 없다.

또한, 본 발명의 방법은 락토페린, 락토과산화 효소 또는 성장 인자 등과 같은 유제품 중의 다른 성분에 대한 종래의 정제 공정의 일부로서 포함될 수도 있다. 이러한 공정의 예로는, 유제품을 양이온 교환 수지에 접촉시켜 우선 IgA 강화 분획을 용리시키고, 이어서 IgA가 고갈된 락토과산화 효소 분획을 용리시킨 다음에, 이온 강도가 증가하는 이동상으로 연속 용리시켜 락토페린 분획을 얻는 것을 들 수 있다.

발명의 요약

본 발명은 소를 과면역 접종할 필요가 없어 이와 관련된 비용과 시간을 절약할 수 있는 IgA 강화 유제품 추출물의 조성물을 제조하는 방법에 관한 것이다.

따라서, 본 발명의 목적은 IgA 강화 유제품 추출물의 조성물 및 이것의 제조 방법을 제공하는 것이고, 이 제조 방법은 상업적 규모로 수행할 수 있으며, 종래 기술의 단점들을 최소 몇 가지 이상 극복할 수 있는 것이다. 'IgA 강화'라는 용어는 용리된 유제품 추출물 중의 IgA:IgG 비율이 분획화 전의 유제품 중 IgA:IgG 비율보다 상대적으로 증가함을 의미하는 것이다. 본 발명의 한 가지 측면은 유제품으로부터 추출한 IgA 및 IgG를 함유하는 IgA 강화 유제품 추출물의 조성물을 제조하는 방법으로서, IgG에 대한 IgA의 상대적인 함량이 상기 유제품 중의 함량보다 증가되어 있다. 상기 방법은,

유제품의 공급원과,

양이온 교환 수지와,

이동상

을 제공하고,

상기 유제품을 양이온 교환 수지와 접촉시켜 그 양이온 교환 수지에 IgA가 IgG에 비하여 우선적으로 흡수될 수 있도록 하고,

상기 양이온 교환 수지를 이동상을 사용하여 용리시키고,

용리된 IgA 강화 분획을 수집 (收集)하는 것

을 포함한다.

유제품이 반드시 소의 전유 (全乳)에만 한정될 필요는 없으며, 다른 유제품들도 IgA 강화 유제품 추출물의 조성물의 제조에 있어서 출발 물질로서 사용될 수 있음은 당업자에게 명백하다.

본 발명의 다른 한 가지 측면으로서, 전유, 탈지유, 유장 (乳漿; whey) 및 초유 (初乳; colostrum)로 된 군으로부터 선택되는 유제품이 사용된 방법도 제공한다.

IgA 강화 유제품 추출물의 조성물이 생산되는 구체적인 조건은 변화될 수 있으며, 여전히 IgA 강화 분획의 결과를 나타낸다.

따라서, 본 발명의 한 가지 측면에 있어서, 좋기로는 0.05~0.4M NaCl (0.29~2.34 % w/v)을 함유하거나 동등한 이온 강도를 나타내는 이동상, 더욱 좋기로는 0.08~0.35M NaCl (0.47~2.05 % w/v), 그보다 더욱 좋기로는 약 0.17M NaCl (1 % w/v)을 함유하거나 동등한 이온 강도를 나타내는 이동상으로 용리가 수행되는 방법을 제공한다. 동등한 이온 강도를 나타내는 기타 적절한 이동상 용액으로 대체하여 사용할 수도 있다.

본 발명의 또 다른 한가지 측면에 있어서, 이동상의 pH는 4.5~9의 범위, 좋기로는 5.5~7.5의 범위, 더욱 좋기로는 약 6.5이다.

본 발명의 또 다른 한가지 측면에 있어서, 접촉 단계 중에 유제품이 양이온 교환 컬럼에 흡수되는 유속은 6~90 ℓ/수지ℓ/시간 (직선 유속 60~900 ㎝/시간)의 범위일 수 있다. 유속은 6~70 ℓ/수지ℓ/시간 (직선 유속 60~700 ㎝/시간)의 범위인 것이 좋고, 6~40 ℓ/수지ℓ/시간 (직선 유속 60~400 ㎝/시간)의 범위인 것이 더욱 좋다. 이러한 유속에서 최적의 IgA 분획화를 위한 양이온 교환 수지와 접촉하는 유제품의 총량은 대략 16~300 컬럼 [베드 (bed)] 부피, 좋기로는 16~200 컬럼 부피, 더욱 좋기로는 16~40 컬럼 부피의 범위임이 밝혀졌다.

본 발명의 또 다른 측면에 있어서, IgA 강화 분획의 용리 전에 양이온 교환 수지를 물 또는 낮은 이온 강도 (< 0.008 M 염 또는 그의 등가량)의 완충 용액으로 세척하여, 컬럼에 잔류하는 유제품을 제거한다. 또한, 다양한 유형의 양이온 교환 수지가 본 발명에 사용될 수 있는데, SP 세파로스 빅 비즈 (SP Sepharose Big Beads)와 같은 세파로스 양이온 교환 수지 비즈를 사용하는 것이 좋다. 더욱 좋은 것은, 입도가 45~300 ㎛의 범위인 수지 비즈다.

본 발명의 또 다른 측면에 있어서, 세파로스 비즈를 함유하는 양이온 교환 수지를 사용한 방법을 제공하는데, 입도가 45~300 ㎛의 범위인 것이 좋다.

본 발명의 방법은 연속식 공정 또는 회분식 공정으로서 사용될 수 있는데, 연속식 공정으로 사용하는 것이 좋다. 용리된 IgA 강화 분획은 이어서 염 함량을 감소시키기 위한 처리를 할 수 있다.

탈지유에는 대략 1~2.5% IgG w/w 및 0.05~0.1% IgA w/w이 함유되며, 우유의 유장 (bovine serum)에는 20% IgG w/w 및 0.4% IgA w/w가 함유된다. 본원의 발명자들은 본 발명의 방법에 의한 유제품 추출물의 농축액 (용리액)은 놀랍게도 일반적인 IgA:IgG 비율이 1:2의 차수로서 기대하던 것보다 낮은 수준의 IgG w/w가 함유되어 있음을 발견하였는데, 이는 IgA가 8배 내지 16배 농축된 것에 상당하는 것이다. ELISA (효소 결합 면역 흡착 검정, enzyme linked immunosorbent assay) 키트를 사용하여 IgA 및 IgG의 정량 분석을 수행하였다. 이러한 IgA:IgG 비율의 증가는 식재료 또는 기능성 식품 중의 IgA 수준 증가를 원하는 당업자들에게는 중요한 의미가 있다. 양이온 교환 크로마토그래피 용리액 중의 IgA의 실재량과 IgA 및 IgG의 상대량 (비율)은 종래에는 알려져 있지 않았다.

따라서, 본 발명의 또 다른 측면은, 함유된 IgA:IgG 비율이 적어도 1:8, 좋기로는 적어도 1:4, 더욱 좋기로는 적어도 1:2인 IgA 강화 유제품 추출물의 조성물을 얻기 위한 방법을 제공하는 것이다.

IgA 강화 유제품 추출물의 조성물은 비IgA계 단백질의 존재량을 감소시키기 위한 추가 처리를 할 수 있다. 상기 추가 처리는 막여과, 컬럼 크로마토그래피, 투석 또는 기타 공지된 방법을 통하여 수행될 수 있다. 이러한 외부 단백질의 제거는 표준화된 식재료 또는 기능성 식품의 제조에 있어서 중요한 관심사일 수 있다.

본 발명의 또 다른 측면은, IgA:IgG 비율이 적어도 1:8, 좋기로는 적어도 1:4, 더욱 좋기로는 적어도 1:2인 IgA 강화 유제품 추출물의 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 본 발명의 방법에 의하여 얻은 IgA 강화 유제품 추출물의 조성물을 제공하는 것이다. 또한, 본 발명의 유제품 추출물은 식재료 또는 기능성 식품으로 사용될 수 있으며, 유아용 식재료 또는 기능성 식품으로도 좋다.

본 발명의 방법의 실시 결과는 특히, 산성의 등전점을 가지므로 양이온 교환 수지상에서 유지되지 못하거나, 또는 IgA가 IgG에 비하여 우선 결합 성향을 나타내는 단백질 부류에 속하는 것으로 여겨지는 면역글로불린을 생산한다는 점에서 놀라운 것이다.

본 발명은 본 명세서에 개시된 특정한 예시에 의하여 제한되지 않는다.

발명의 상세한 설명

본 발명의 IgA 강화 분획의 제조에 대하여 이하에서 상세히 설명한다.

IgA의 적합한 원료로서는 인간, 소, 양, 염소, 돼지 등의 포유 동물로부터 얻은 전유, 탈지유, 유장 또는 초유 등의 유제품이 포함된다. 유제품을 양이온 교환 수지와 접촉시켜 IgA를 흡착하는 경우에 있어서, 비록 본 발명의 유제품은 pH의 조정이 요구되지는 않지만, 유제품의 pH는 약 6.5인 것이 좋다.

유제품과 양이온 교환 수지의 접촉 단계 중에 사용되는 유속은, 6~90 ℓ/수지ℓ/시간 (직선 유속 60~900 ㎝/시간), 좋기로는 6~70 ℓ/수지ℓ/시간 (직선 유속 60~700 ㎝/시간), 더욱 좋기로는 대략 6~40 ℓ/수지ℓ/시간 (직선 유속 60~400 ㎝/시간)과 같이 넓은 범위로 변경할 수 있다. 매우 낮은 유속에서는 공정을 수행하는 비용이 그 결과로 얻는 이득을 초과한다는 사실에 입각하여, 상기 범위의 하한은 산업용 공정의 비용 효율을 고려하여 정하여진다. 수지와 접촉되는 유제품의 총량이 제한되는 경우라면, IgA의 정제에는 높은 유속이 적합하다.

본원의 발명자들은, 호주 특허 번호 제613688호에 개시된 바와 같이, 락토과산화 효소 및 락토페린 등의 다른 유제품의 정제에 있어서는, 유제품의 부피가 수지 부피를 훨씬 초과하는 것이 적절하지만, 본 발명의 방법에 있어서는, 수지 부피에 대한 유제품의 부피가 약 1000 컬럼 부피 (유제품ℓ/수지ℓ)인 것은 IgA의 정제에 적합하지 않다는 사실을 밝혀내었다. 본원의 발명자들은 유제품 부피가 수지 부피에 대하여 약 400 컬럼 부피를 초과하면 IgA가 수지에 거의 결합되지 않고 출발 물질 중의 IgG에 비하여 IgA가 상대적으로 풍부하게 존재하도록 할 수 없다. 본 발명에 있어서, 탈지유의 경우에 상기 범위의 상한은 약 300 컬럼 부피이고, 좋기로는 약 200 컬럼 부피이며, 더욱 좋기로는 약 34 컬럼 부피이다. 수지에 대한 유제품의 비율이 증가하면 결합된 IgA의 양과 용리된 IgA의 순도가 점차 감소한다. 유속의 경우에는, 컬럼과 관련된 인자보다는 경제적 고려에 의하여 하한을 설정한다. 적하된 유제품의 부피가 16 컬럼 부피보다 훨씬 적은 부피로 감소하면, 세척 및 용리 시간이, 충분한 IgA를 정제하여 상기 공정을 경제적으로 실현 가능하도록 할 수 있는 한계를 넘기게 된다.

양이온 교환 컬럼에 유제품을 적하하는 단계를 따라, IgA를 이동상을 사용하여 용리하기 전에 양이온 교환 컬럼 내에 결합되지 않은 유제품을 물 또는 예컨대, 염화나트륨 0.0086M보다 낮은 이온 강도를 나타내는 완충 용액으로 상기 컬럼을 세척함으로써 제거할 수 있다.

흡착된 IgA의 용리에 있어서, 0.086~0.4M의 염화나트륨, 염화칼륨 또는 그 등가물과 같은 낮은 이온 강도를 나타내는 완충 용액으로 이루어지는 이동상을 사용한다. 이동상에 사용되는 염의 종류에는 제한이 없다. 이온 강도가 0.4를 초과하면, 비 IgA계 단백질의 용리가 일어나기 시작하여 IgA가 다른 단백질에 의하여 희석되므로 그 결과 IgA의 순도가 감소한다. 0.35M 염화나트륨과 동등하거나 그보다 낮은 이온 강도를 사용하는 것이 좋다.

이동상의 pH는 넓은 범위를 나타내는데, 예컨대 4.5~9.0, 좋기로는 5.5~7.5, 더욱 좋기로는 약 6.5이다. 단백질의 안정성 및 단백질의 양이온 교환 수지에의 결합능 양자 모두는 상한 및 하한의 영향을 받는다. 5.5~7.5 범위의 pH에서 수율의 감소없이 가장 높은 IgA 순도를 얻는다.

본 발명에 있어서, IgA의 흡착에 적합한 양이온 교환 수지의 종류로서는 세파로스 양이온 교환 수지 비즈와 같은 수지가 포함된다. 예를 들어, 각각 술포프로필기 및 카르복시메틸기가 함유된 SP 세파로스 빅 비즈 및 CM 세파로스 비즈 (GE Healthcare사 상품)가 적합하다. 양이온 교환 수지 비즈의 입도는 45~300 ㎛의 범위인 것이 좋다. SP 세파로스 비즈로는 45~165 ㎛의 범위 및 100~300 ㎛의 범위 양자 모두가 본 발명의 IgA 흡착 및 정제에 적합하다. IgA 강화 유제품 추출물의 조성물에 적용할 수 있는 추가 처리 공정의 하나로서는, 예를 들어, 투석 또는 한외 여과를 통한 탈염법이 있다. IgA 강화 유제품 추출물의 조성물에 적용할 수 있는 또 다른 추가 처리 공정의 하나로서는, 비IgA계 단백질의 제거 공정이 있다. 비IgA계 단백질의 제거는, 예를 들어, 면역 흡착 또는 크기 배제 (size-exclusion)를 통한 추가의 크로마토그래피에 의하여 달성될 수 있다.

본 발명의 IgA 강화 유제품 추출물의 조성물은 식재료나 기능성 식품에 사용될 수 있으며, 유아용 식재료나 기능성 식품용으로 좋다.

본 발명의 방법은 IgA 강화 유제품 추출물의 조성물의 제조만을 위하여 단독으로 사용할 수도 있고, 원하는 기타 다른 유제품 추출물의 분획을 위한 일괄 분획 공정의 일부로서 결합하여 사용할 수도 있다.

IgA 강화 분획 및 IgA 고갈 분획의 제조 방법

본 발명의 방법에 있어서는, 45 ㎛ (이상적으로는 90~300 ㎛)보다 큰 SP (술포프로필) 세파로스를 10 ㎝ 깊이의 컬럼에 충전하는 것이 좋다. 첨가하는 유제품의 부피가 컬럼에 충전된 수지 부피의 134.6배가 될 때까지 컬럼에 유제품 (탈지유가 좋음)을 11 ㎖/분 (직선 유속 331 ㎝/시간 또는 0.55 컬럼 부피 (CV)/분)의 유속으로 첨가하였다. 컬럼 내에 잔류하는 유제품은 물 또는 낮은 이온 강도 (<0.05% (0.0086M) NaCl 또는 그와 등가물)의 완충 용액 2.5 CV를 사용하여 3.5 ㎖/분 (직선 유속 147 ㎝/시간 또는 0.25 CV/분)으로 10분 동안 제거하였다. pH 6.5, 1% (0.171M) NaCl에 상당하는 나트륨 이온을 함유하는 완충 용액 3.5 CV를 사용하고,상기 양이온 용액을 3.5 ㎖/분 (직선 유속 102 ㎝/시간 또는 0.175 CV/분)으로 20분 동안 유동시켜 컬럼으로부터 IgA 강화 분획을 용리하였다. 처음의 3분 분량 (0.5 CV)은 따라버리고, 다음의 20분 분량 (3.5 CV)은 IgA 강화 분획으로서 수집하였다 (상기 다음의 완충 용액의 적용 시간, 즉 파과 (破過) 시간과 중복되는 3분 [0.5 CV]을 포함함). 8.75% (1.5M) NaCl에 상당하는 나트륨 이온을 함유하는 완충 용액 3.5 CV를 사용하고, 양이온 용액을 3.5 ㎖/분 (직선 유속 102 ㎝/시간 또는 0.175 CV/분)으로 20분 동안 유동시켜 컬럼으로부터 IgA 고갈 분획을 용리하였다. 처음의 3분 분량 (0.5 CV)은 따라버리고, 다음의 20분 분량 (3.5 CV)은 IgA 고갈 분획으로서 수집하였다 (상기 다음의 완충 용액의 적용 시간, 즉 파과 시간과 중복되는 3분 [0.5 CV]을 포함함). 회수된 단백질 분획은 한외 여과막 등으로 막여과 (diafilter)하여 염을 제거하였다. 당업자로서는 이러한 IgA 분획 방법은 상업적 사용을 위하여 확대하여 수행될 수 있음을 명백하게 알 수 있을 것이다.

3 종류의 분획 제조 방법 ( IgA 강화 분획, IgA 고갈 락토과산화 효소 및 락토페린)

또한, 본 발명의 방법에 있어서, 45 ㎛ (이상적으로는 90~300 ㎛)보다 큰 SP (술포프로필) 세파로스를 10 ㎝ 깊이의 컬럼에 충전하는 것이 좋다. 첨가하는 유제품의 부피가 컬럼에 충전된 수지 부피의 134.6배가 될 때까지 컬럼에 유제품 (탈지유가 좋음)을 11 ㎖/분 (직선 유속 331 ㎝/시간 또는 0.55 컬럼 부피 (CV)/분)의 유속으로 첨가하였다. 컬럼 내에 잔류된 유제품은 물 또는 낮은 이온 강도 (<0.008M NaCl 또는 그와 등가물)의 완충 용액 2.5 CV를 3.5 ㎖/분 (직선 유속 147 ㎝/시간 또는 0.25 CV/분)으로 10분 동안 제거하였다. pH 6.5, 1% (0.171M) NaCl에 상당하는 나트륨 이온을 함유하는 완충 용액 3.5 CV를 사용하고, 양이온 용액은 3.5 ㎖/분 (직선 유속 102 ㎝/시간 또는 0.175 CV/분)으로 20분 동안 유동시켜 컬럼으로부터 IgA 강화 분획을 용리하였다. 처음의 3분 분량 (0.5 CV)은 따라버리고, 다음의 20분 분량 (3.5 CV)은 IgA 강화 분획으로서 수집하였다 (상기 다음의 완충 용액의 적용 시간, 즉 파과 시간과 중복되는 3분 [0.5 CV]을 포함함). 2.5% w/v (0.43 M) NaCl에 상당하는 나트륨 이온 (다만, 기타 다른 양이온들도 적합함)을 함유하는 완충 용액 3.5 CV를 사용하고, 양이온 용액은 3.5 ㎖/분 (직선 유속 102 ㎝/시간 또는 0.175 CV/분)으로 20분 동안 유동시켜 컬럼으로부터 IgA 고갈 락토과산화 효소 분획을 용리하였다. 처음의 3분 분량 (0.5 CV)은 따라버리고, 다음의 20분 분량 (3.5 CV)은 IgA 고갈 락토과산화 효소 분획으로서 수집하였다 (상기 다음의 완충 용액의 적용 시간, 즉 파과 시간과 중복되는 3분 [0.5 CV]을 포함함). 8.75% (1.5 M) NaCl에 상당하는 나트륨 이온을 함유하는 완충 용액 3.5 CV를 사용하고, 양이온 용액은 3.5 ㎖/분 (직선 유속 102 ㎝/시간 또는 0.175 CV/분)으로 20분 동안 유동시켜 컬럼으로부터 락토페린분획을 용리하였다. 처음의 3분 분량 (0.5 CV)은 따라버리고, 다음의 20분 분량 (3.5 CV)은 IgA 고갈 락토과산화 효소 분획으로서 수집하였다 (상기 다음의 완충 용액의 적용 시간, 즉 파과 시간과 중복되는 3분 [0.5 CV]을 포함함). 회수된 단백질 분획은 한외 여과막 등으로 막여과하여 염을 제거하였다. 당업자로서는 이러한 IgA 분획 방법은 상업적 사용을 위하여 확대하여 수행될 수 있음을 명백하게 알 수 있을 것이다.

도 2a~2c - IgA 용리에 있어서의 염 농도 및 용리 유속의 영향.
도 3a~3e - 양이온 교환 수지와 접촉되는 유제품 부피의 영향.
도 4a~4c - 양이온 교환 수지와 접촉되는 탈지유 제품 부피의 영향.
도 5a~5d - 용리된 IgA의 조성물에 대한 이동상 pH의 영향.
도 6a~6c - 유장 단백질 농축액 (WPC)으로부터의 IgA 정제.
도 7a~7e - IgA 강화 분획, 락토페린 및 락토과산화 효소의 분리 공정; 다양한 분획에서의 IgA에 대한 이동상 이온 강도의 영향.

아래에서는 실시예를 참조하여 본 발명을 설명한다.

실시예 1: 탈지유로부터 IgA 강화 분획의 제조

본 발명의 방법에 있어서, 다중의 SP 세파로스 빅 비즈 양이온 교환 수지 컬럼에서의 연속 공정에는 탈지유가 사용되는 것이 좋으며, 각 베드의 부피 (bed volume)는 29.7 ℓ이고, 유속은 22 ℓ/수지ℓ/시간이며, 총합은 134.6 컬럼 부피이다. 상기 컬럼은 낮은 이온 강도의 완충 용액 (물)으로 세척한 다음에, pH 6.5, 0.3M NaCl로 이루어진 이동상으로 용리시킨다. 용리된 IgA 강화 분획을 모은 다음에 염 함량을 감소시키기 위하여 투석한다. ELISA법으로 용리된 분획의 면역글로불린 함량을 분석하였더니, 4.7% w/w IgA가 함유되고 IgA: IgG 비율은 약 1:2 임이 밝혀졌다 (표 1). 분획된 IgA 강화 유제품 추출물의 조성물은 동결 건조되어 15℃에서 안정 상태로 저장될 수 있다.

ELISA 법으로 분석한 다양한 동물성 제품 중의 IgA : IgG 상대량.

제품	IgG %w/w	IgA %w/w
소의 유장 ¹	20.4	0.4
소의 초유 ²	46.4	5.4
IgG 분획 ³	41	5
유장 분획 ( IgA 분획) ⁴	11	4.7

1) 분획되지 않은 소의 유장 시료.

2) 분획되지 않은 소의 초유 시료.

3) 유장으로부터 음이온 및 양이온 교환 크로마토그래피 공정을 결합 사용하여 얻은 면역글로불린 분획.

4) 유장으로부터 본 발명의 방법을 사용하여 얻은 면역글로불린 분획.

실시예 2: 염 농도 및 용리 유속의 IgA 용리에 대한 영향

IgA 강화 탈지유는 11 ㎖/분의 유속으로 SP 세파로스 빅 비즈 (GE Healthcare) 90~300 ㎛로 충전된 컬럼에 통과시켜 수지에 탈지유의 IgA 함유 분획이 흡착되도록 하였다. 총 134.6 컬럼 부피 (CV)를 컬럼에 통과시켰다. 탈이온수를 컬럼에 5 ㎖/분의 유속으로 통과시켜 상기 수지를 세척한 다음에, 0.5, 1, 1.5, 2, 2.5 또는 8.75% NaCl, pH 6.5 중의 1종을 함유하는 이동상을 2.4 또는 5.0 ㎖/분의 유속으로 칼럼에 통과시켜 IgA 함유 분획을 용리시켰다. 용리된 분획 중의 총 단백질 농도 (도 2a), IgA 농도 (도 2b) 및 IgA% (도 2c)를 측정하였다. 2% w/v NaCl을 초과하는 이온 강도에서, 추가로 IgA를 용리시키지 않고 증가된 양의 비IgA계 단백질을 컬럼으로부터 용리시켰다. 용리 유속을 2.4 ㎖/분 또는 5 ㎖/분으로 변경하여도 용리된 분획 중의 IgA 농도의 차이는 없었다.

실시예 3: 양이온 교환 수지에 접촉하는 유제품의 부피에 대한 영향

탈지유를 11 ㎖/분의 유속으로 SP 세파로스 빅 비즈 (GE Healthcare) 90~300 ㎛로 충전된 컬럼에 통과시켜 수지가 탈지유로부터 단백질이 흡착되도록 하였다. 상기 수지의 양을 유지하며 통과시키는 탈지유의 양을 증가시켰다. 33.6 (676 ㎖), 67.3 (1352 ㎖), 134.6 (2705 ㎖), 183.0 (3678 ㎖)및 231.5 (4652 ㎖) CV의 5 가지 부피의 탈지유를 시험하였다. 탈이온수를 컬럼에 5 ㎖/분의 유속으로 통과시켜 상기 수지를 세척한 다음에, pH 6.5, 8.75% NaCl을 함유하는 이동상을 3.5 ㎖/분의 유속으로 칼럼에 통과시켜 상기 수지에 흡착된 총 단백질을 용리시켰다. 용리된 분획 중의 IgA 및 IgG의 양을 회수된 총 단백질에 대한 상대량으로 측정하였다. IgA로서 용리된 총단백질의 비율은 탈지유의 부피가 증가함에 따라 감소하였다 (도 3a 및 도 3b). 회수된 IgA의 순도는 탈지유의 부피가 증가함에 따라 감소하였다. 비록 IgA:IgG의 비는 1:1.58 내지 1:1.71 사이로 유지되었지만 (도 3e), 총 단백질의 비율로서 회수된 IgG의 양도 역시 탈지유의 부피가 증가함에 따라 감소하였다 (도 3d). 이러한 결과는 수지를 통과시키는 유제품의 양이 증가하면 IgA 양 및 총 단백질의 비율로서의 IgA 양은 감소하지만, IgA 및 IgG 양자 모두의 수율이 비례적으로 감소하므로 여전히 높은 IgA:IgG 비를 나타낸다는 사실을 보여준다.

실시예 4: 양이온 교환 수지와 접촉하는 탈지유 제품의 부피에 대한 영향

탈지유를 11 ㎖/분의 유속으로 SP 세파로스 빅 비즈 (GE Healthcare) 90~300 ㎛로 충전된 컬럼에 통과시켜 수지가 탈지유로부터 단백질이 흡착되도록 하였다. 상기 수지의 양을 유지하며 통과시키는 탈지유의 양을 증가시켰다. 16.8 (338 ㎖), 33.6 (676 ㎖), 67.3 (1352 ㎖) 및 100.9 (2028 ㎖) CV의 5 가지 부피의 탈지유를 시험하였다. 탈이온수를 컬럼에 5 ㎖/분의 유속으로 통과시켜 상기 수지를 세척한 후에, 0.192 M Na⁺ (0.84% 오르토인산수소이나트륨 + 0.89% NaCl (pH 6.5))를 함유하는 이동상을 3.5 ㎖/분의 유속으로 사용하여 IgA 강화 분획을 용리시키고, 그 다음에 pH 6.5, 8.75% NaCl을 함유하는 이동상을 3.5 ㎖/분의 유속으로 칼럼에 통과시켜 상기 수지에 흡착된 잔류 단백질을 용리시켰다. 용리된 분획 중의 IgA 및 IgG의 양을 회수된 총 단백질에 대한 상대량으로 측정하였다. IgA로서 용리된 총 단백질의 비율은 탈지유의 부피가 증가함에 따라 감소하였다 (도 4a 및 도 4b). 컬럼에 첨가하는 탈지유의 부피가 증가할수록 첨가된 IgA의 회수량이 감소되었다. 첨가하는 탈지유의 부피가 증가하여도 IgA:IgG의 비는 약 1:2로 유지되었다 (도 4c).

실시예 5: IgA 가 용리된 조성물에 대한 이동상의 pH 의 영향

탈지유를 11 ㎖/분의 유속으로 SP 세파로스 빅 비즈 (GE Healthcare) 90~300 ㎛로 충전된 컬럼에 통과시켜 수지가 탈지유의 IgA 함유 분획이 흡착되도록 하였다. 컬럼에 통과시킨 상기 탈지유의 부피는 33.6 CV이었다. 탈이온수를 컬럼에 5 ㎖/분의 유속으로 통과시켜 상기 수지를 세척한 다음에, pH 5.5, 6.5, 7.5, 8.5 또는 9.5에서의 이온 강도가 1.125% (0.19 M) NaCl에 상당하는 이동상을 3.5 ㎖/분의 유속으로 칼럼에 통과시켜 IgA 함유 분획을 용리시킨 다음에, pH 6.5, 8.75% (1.5 M) NaCl을 함유하는 이동상을 3.5 ㎖/분의 유속으로 칼럼에 통과시켜 수지에 흡착된 잔류 단백질을 용리시켰다. 용리된 분획 중의 총 단백질 농도 (도 5a), IgA 농도 (도 5b), IgA% (도 5c) 및 출발 유제품에 대한 IgA 순도 증가량 (도 5d)을 측정하였다. pH가 6.5를 초과하여 증가함에 따라, 증가된 비IgA계 단백질을 추가로 IgA를 용리시키지 않고 컬럼으로부터 용리시켰다. 또한, 용리된 분획 중의 IgA%는 pH가 증가함에 따라 pH 6.5에서 18%이었다가 pH 9.5에서 약 10%로 감소하였고, IgA 분획의 순도도 역시 pH가 6.5를 초과하면 감소하였다. IgA:IgG 비는 pH 5.5, 6.5, 7.5, 8.5 및 9.5에서 각각 >1:1.5, >1:1.4, >1:1.5, >1:1.4 및 >1:1.4이었다.

실시예 6: 유장 단백질 농축액 ( WPC )으로부터의 IgA 정제

유장 단백질 농축액 (WPC)을 11 ㎖/분의 유속으로 SP 세파로스 빅 비즈 (GE Healthcare) 90~300 ㎛로 충전된 컬럼에 통과시켜 수지에 WPC로부터 단백질이 흡착되도록 하였다. 상기 수지의 양을 유지하며 컬럼에 통과시키는 상기 WPC의 양을 증가시켰다. 25 (500 ㎖), 50 (1000 ㎖), 75 (1500 ㎖) 및 100 (2000 ㎖) CV의 4 가지 부피의 WPC를 컬럼에 통과시켰다. 탈이온수를 컬럼에 5 ㎖/분의 유속으로 통과시켜 상기 수지를 세척한 후에, pH 7.5에서의 이온 강도가 1.125% (0.19 M) NaCl 상당량인 이동상을 3.5 ㎖/분의 유속으로 칼럼에 통과시켜 IgA 함유 분획을 용리시키고, 그 다음에 8.75% (1.5 M) NaCl을 함유하며 완충되지 않은 이동상을 3.5 ㎖/분의 유속으로 칼럼에 통과시켜 수지에 흡착된 잔류 단백질을 용리시켰다. 용리된 분획 중의 IgA 및 IgG의 양을 회수된 총 단백질에 대한 상대량으로 측정하였다. IgA로서 용리된 총 단백질의 비율은 WPC의 부피가 증가함에 따라 감소하였다 (도 6a). 첨가하는 WPC의 양을 증가시킬수록 IgA (%단백질)는 감소하였지만 (도 6b), IgA의 총량은 증가하였다 (도 6c). WPC 부피가 25, 50, 75 및 100 CV일 때 IgA:IgG 비는 각각 1:2.59, 1:2.76, 1:2.471 및 1:2.61이었다.

실시예 7: IgA 강화 분획, 락토페린 및 락토과산화 효소의 분리 공정; IgA 의 다양한 분획들에 대한 이동상 이온 강도의 영향

탈지유 (134.6 CV)를 11 ㎖/분의 유속으로 SP 세파로스 빅 비즈 (GE Healthcare) 90~300 ㎛로 충전된 컬럼에 통과시켜 수지에 탈지유로부터 단백질이 흡착되도록 하였다. 컬럼에 잔류된 탈지유를 5 ㎖/분 (직선 유속 147 ㎝/시간 또는 0.25 CV/분)으로 10분 동안 2.5 CV의 탈이온수를 사용하여 제거하였다. 3.5 ㎖/분 (직선 유속 102 ㎝/시간 또는 0.175 CV/분)의 유속으로 20분 동안 이동상을 유동시킴으로써, 1% w/v (0.171M) NaCl 또는 1.125% (0.193M) w/v NaCl에 상당하는 나트륨 이온을 제공하는 NaCl 및 0.04 M 오르토인산수소이나트륨을 함유하는 pH 6.5의 완충 용액 3.5 CV를 사용하여 컬럼으로부터 IgA 강화 분획을 용리시켰다. 처음의 3분 분량 (0.5 CV)은 따라버리고, 다음의 20분 분량 (3.5 CV)은 IgA 강화 분획으로서 수집하였다 (상기 다음의 완충 용액의 적용 시간, 즉 파과 시간과 중복되는 3분 [0.5 CV]을 포함함). 3.5 ㎖/분 (직선 유속 102 ㎝/시간 또는 0.175 CV/분)의 유속으로 20분 동안 양이온 용액을 유동시킴으로써, 두 번째 분획인 IgA 고갈 락토과산화 효소를 pH 6.5, 2.5% w/v (0.43 M) NaCl 상당량의 나트륨 이온을 함유하는 완충 용액 3.5 CV를 사용하여 컬럼으로부터 용리시켰다. 처음의 3분 분량 (0.5 CV)은 따라버리고, 다음의 20분 분량 (3.5 CV)은 IgA 고갈 락토과산화 효소 분획으로서 수집하였다 (상기 다음의 완충 용액의 적용 시간, 즉 파과 시간과 중복되는 3분 [0.5 CV]을 포함함). 3.5 ㎖/분 (직선 유속 102 ㎝/시간 또는 0.175 CV/분)의 유속으로 20분 동안 양이온 용액을 유동시킴으로써, 락토페린 분획을 pH 6.5, 8.75% w/v (1.5 M) NaCl에 상당하는 나트륨 이온을 함유하는 완충 용액 3.5 CV를 사용하여 컬럼으로부터 용리시켰다. 처음의 3분 분량 (0.5 CV)은 따라버리고, 다음의 20분 분량 (3.5 CV)은 락토페린 분획으로서 수집하였다 (상기 다음의 완충 용액의 적용 시간, 즉 파과 시간과 중복되는 3분 [0.5 CV]을 포함함). 회수된 단백질 분획은 IgA, IgG 및 성장 인자 IGF1 함량을 분석하였다.

1.125% w/v NaCl로 용리시켰더니 1% w/v NaCl로 용리시킨 경우에 비하여, IgA 강화 분획 중의 IgA 함량이 증가하고 이후의 분획 (락토과산화 효소 및 락토페린) 중에 존재하는 IgA 함량이 크게 감소하였다 (도 7a, 7b). 또한, 1.125% w/v NaCl로 용리시켰더니, IgA 강화 분획 중의 IgG 함량이 50%만큼 감소하였다 (도 7c). 더 높은 NaCl 농도에서 용리시키면 IgA:IgG비도 역시 크게 증가하였다 (도 7d). 0.172M NaCl 및 0.193M NaCl을 사용하여 IgA를 용리시켜 IgA:IgG비가 각각 1:2.01 및 1:0.92인 분획을 얻었다.

흥미롭게도 IgA 강화 분획 중에는 IGF1가 존재하지 않았다 (도 7e). IgA 강화 분획 (0.172M 및 0.193M NaCl 양자 모두에서 <0.005 %w/v) 및 락토페린 분획 (0.172M 및 0.193M NaCl 양자 모두에서 <0.005 %w/v) 중에서는 락토과산화 효소가 거의 발견되지 않았지만, 락토과산화 효소 분획 (0.172M NaCl에서 0.074 %w/v이고 0.193M NaCl에서 0.073 %w/v) 중에서는 다량으로 발견되었다. IgA 강화 분획 (0.172M NaCl에서 0.02 mg/㎖이고 0.193M NaCl에서 0.06 mg/㎖) 및 락토과산화 효소 분획 (0.172M NaCl에서 0.01 mg/㎖이고 0.193M NaCl에서 0.03 mg/㎖) 중에서는 락토페린이 거의 발견되지 않았지만, 락토페린 분획 (0.172M NaCl 및 0.193M NaCl 양자 모두에서 3.0 %w/v) 중에서는 다량으로 발견되었다.

Claims

IgG에 대한 IgA의 상대적인 함량이 유제품에서의 함량에 비하여 증가되어 있는, 유제품으로부터 추출된 IgA 및 IgG를 함유하는 IgA 강화 유제품 추출물의 조성물의 제조 방법으로서, 상기 제조 방법은
유제품의 공급원; 양이온 교환 수지; 및 이동상을 제공하고,
상기 유제품을 양이온 교환 수지와 접촉시켜 그 양이온 교환 수지에 IgA가 IgG에 비하여 우선적으로 흡수될 수 있도록 하고,
이동상을 사용하여 상기 양이온 교환 수지로부터 IgA 강화 분획을 용리시키고,
용리된 IgA 강화 분획을 수집 (收集)하는 것을 포함하는 것인 방법.