KR20130024830A - ｍｉｃｒｏＲＮＡ－382의 활성화제를 포함하는 혈관신생촉진용 약학적 조성물 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 혈관신생촉진용 조성물에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 microRNA-382의 활성화제를 포함하는 혈관신생촉진용 약학적 조성물에 관한 것이다. 본 발명자들은 저산소 환경의 위암세포에서 발현이 증가되는 microRNA-382가 혈관신생의 촉진에 영향을 미치는 것을 확인하였다. 따라서, 본 발명은 혈관신생을 촉진함으로써 세포의 증식을 촉진하여 상처 치유, 허혈성 심근경색, 또는 족부허혈의 치료에 유용하게 이용될 수 있는 microRNA-382 활성화제를 포함하는 약학적 조성물을 제공한다.

Description

ｍｉｃｒｏＲＮＡ－382의 활성화제를 포함하는 혈관신생촉진용 약학적 조성물{Pharmaceutical composition comprising microRNA-382 activator for promoting angiogenic activity}
본 발명은 혈관신생촉진용 조성물에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 microRNA-382의 활성화제를 포함하는 혈관신생촉진용 약학적 조성물에 관한 것이다.
혈관신생(angiogenesis)이란 새로운 혈관이 생성되는 과정을 말하며, 정상적인 생체 조건에서는 드물게 일어나지만, 배발생, 황체 형성 또는 상처치료 과정에서는 반드시 수반되는 과정이다. 혈관신생이 일어나는 과정은 일반적으로 혈관신생 촉진인자의 자극에 의하여 프로테아제로 인한 혈관 기저막의 분해, 혈관 내피세포의 이동, 증식 및 혈관 내피세포 분화에 의한 관강의 형성으로 혈관이 재구성되어 새로운 모세혈관이 생성되는 것으로 이루어진다. 혈관생성 과정은 생장인자, 사이토카인, 지질대사물질 및 지혈 단백질의 잠재성 단편 등 여러 종류의 촉진인자와 억제인자에 의해 엄격하게 통제되는 것으로 알려져 있다.
한편, microRNA는 전사 후 조절단계에서 유전자 발현을 억제하는 small non-coding RNAs이다. microRNA는 평균 18 ~ 25개의 뉴클레오타이드로 구성되어 있으며 헤어핀 구조를 형성하고 있다. 타겟 유전자 서열의 3’ UTR 부위에 상보적으로 결합함으로써 mRNA의 분해나 단백질로의 번역을 억제하고 있으며 약 5000개 이상의 인간 유전자가 microRNA의 타겟으로 밝혀져 있다. 결과적으로 어떠한 타겟 유전자를 조절하느냐에 따라 생체 내에서 microRNA의 기능이 세포 분화 및 증식, 발생 단계 및 대사 조절, 혈관신생, 세포 사멸 등으로 다양해지며 microRNA 역할의 중요성은 더욱 강조되고 있어 이에 대한 연구도 활발해지는 추세이다.
따라서 본 발명자들은 혈관신생 매커니즘을 조절하는 인자인 microRNA를 혈관신생의 촉진에 사용하고자 한다.
이에, 본 발명자들은 부작용이 없으면서 저산소 환경에서의 혈관신생에 관여하는 특정 microRNA를 발굴하고 이를 이용한 효과적인 혈관신생촉진용 조성물에 대해 예의 연구 노력한 결과, microRNA-382를 활성화시켰을 때 혈관신생 촉진효과를 확인함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서 본 발명의 목적은 microRNA-382의 활성화를 통한 혈관신생촉진용 약학적 조성물을 제공하는데 있다.
그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
본 발명은 microRNA-382 활성화제를 포함하는 혈관신생촉진용 약학적 조성물을 제공한다. 상기 혈관신생촉진용 약학적 조성물은 상처 치유, 허혈성 심근경색, 또는 족부 허혈의 치료에 사용되는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 약학적 조성물은 microRNA-382를 활성화시킴으로써 혈관신생을 촉진시킬 수 있고, 궁극적으로 상처 치유, 허혈성 심근경색, 또는 족부 허혈의 치료 등에 유용하게 사용될 수 있을 것으로 기대된다.
도 1은 위암세포주인 MKN1 세포를 저산소 조건에서 배양하였을 때 정상산소 조건 대비 변화한 microRNAs의 발현양상을 마이크로어레이 실험을 통해 비교한 결과를 나타낸 것이다. 두 조건에서 다수의 microRNAs의 발현량의 증감에 변화가 있음을 알 수 있었으며 그 중 microRNA-382가 저산소 조건에서 발현이 증가하였다.
도 2는 위암세포주인 MKN1 세포를 저산소 조건에서 시간별로 배양한 후 real-time PCR 실험을 통해 microRNA-382의 발현량을 나타낸 것이다. 정상산소 대비 저산소 조건에서 microRNA-382의 발현이 증가함을 확인하였으며 24시간 배양시 microRNA-382가 가장 많이 발현됨을 알 수 있었다.
도 3은 저산소 조건에서 발현이 증가된 microRNA-382를 억제제를 처리하여 감소시킨 조건배지에 혈관내피세포를 배양하였을 때 세포의 증식능이 억제된 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 저산소 조건에서 발현이 증가된 microRNA-382를 억제제를 처리하여 감소시킨 조건배지에 혈관내피세포를 배양하였을 때 세포의 이동능이 억제된 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 저산소 조건에서 발현이 증가된 microRNA-382를 억제제를 처리하여 감소시킨 조건배지에 혈관내피세포를 배양하였을 때 세포의 혈관 형성능이 억제된 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 정상산소 조건에서 microRNA-382의 발현을 증가시킨 조건배지에 혈관내피세포를 배양하였을 때 세포의 증식능이 향상된 결과를 나타낸 것이다.
도 7은 정상산소 조건에서 microRNA-382의 발현을 증가시킨 조건배지에 혈관내피세포를 배양하였을 때 세포의 이동능이 향상된 결과를 나타낸 것이다.
도 8은 정상산소 조건에서 microRNA-382의 발현을 증가시킨 조건배지에 혈관내피세포를 배양하였을 때 세포의 혈관 형성능이 향상된 결과를 나타낸 것이다.
도 9는 저산소 조건의 암 세포에서 PTEN의 발현량이 감소됨을 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 10은 microRNA-382와 PTEN의 3'UTR의 결합 부위를 나타낸 그림이다.
도 11은 microRNA-382와 PTEN 3'-UTR 결합 유무를 확인하기 위해, PTEN의 3'UTR이 포함된 luciferase 단백질이 융합된 형태의 재조합 벡터를 제작하고, 상기 벡터가 형질도입된 세포주에 microRNA-382를 처리한 후, 세포에서 발현되는 luciferase의 활성을 측정하여 나타낸 그래프이다.
도 12는 miroRNA-382에 의한 PTEN 단백질의 발현량 변화를 확인할 결과이다.
도 13은 microRNA-382의 혈관신생촉진 효과를 확인하기 위한, CAM assay를 수행한 결과이다(scale bar=2 mm).
도 14는 PTEN에 의해 microRNA-382의 혈관신생촉진 효과가 억제되는지 확인하기 위해, tube formation assay를 수행한 결과이다.
도 15는 PTEN에 의해 microRNA-382의 혈관신생촉진 효과가 억제되는지 확인하기 위해, CAM assay를 수행한 결과이다.
본 발명은 microRNA-382 활성화제를 포함하는 혈관신생촉진용 약학적 조성물을 제공한다. 본 발명자들은 세포의 저산소 환경에서 microRNA-382의 혈관신생 및 혈관내피세포의 증식 조절작용을 실험을 통하여 확인하였다. 즉, 본 발명자들은 세포의 정상산소 상태와 저산소 상태에서의 상이한 microRNA 발현을 확인하였고, 특히 microRNA-382의 발현이 저산소 상태에서 증가되는 것으로 확인하였다. 또한, microRNA-382 활성화제를 이용하여 microRNA-382를 활성화시켰을 때 주변의 혈관내피세포들의 증식능, 이동능, 혈관 형성능이 증가함을 실험을 통하여 확인하였다.
이는 체내에서 유전자 발현을 조절하는 microRNA-382에 의해 혈관신생 관련인자들이 조절됨을 시사하며, 이것은 저산소부위, 예를 들면, 상처 치유나 허혈성 심근경색, 족부 허혈 등의 치료에 유용하게 이용될 수 있다.
따라서 본 발명은 microRNA-382를 활성화하여 저산소 부위의 혈관신생 및 혈관내피세포의 증식을 촉진시킴으로써, 상처 치유, 허혈성 심근경색, 또는 족부 허혈 등의 치료에 사용되는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 실시예에서는 위암세포주인 MKN1세포에서 저산소 상태가 되었을 때 상이한 발현량을 보이는 microRNAs를 마이크로어레이 실험을 통해 확인하였으며(도 1 참조), 그 중 microRNA-382가 저산소 조건에서 24시간째 가장 높은 발현을 나타냄을 real-time PCR을 통해 확인하였다(도 2 참조).
또한 본 발명의 다른 실시예에서는 저산소 상태의 위암세포에서 발현이 증가한 microRNA-382를 억제제를 통해 발현을 감소시켰다. 6시간, 12시간, 24시간 후 추출한 조건배지에 혈관내피세포를 배양하였을 때 세포증식능이 감소하는 것을 확인하였으며(도 3 참조), 이 조건배지에서 배양한 혈관내피세포의 이동능 및 혈관 형성능도 감소하는 것을 확인하였다(도 4 및 도 5 참조).
또한, 정상산소 상태의 위암세포에서 microRNA-382를 과발현시킨 후 추출한 조건배지에 혈관내피세포를 배양하였을 때 세포증식능이 향상되는 것을 확인하였으며(도 6 참조), 혈관내피세포의 이동능 및 혈관 형성능도 저산소 상태와 유사한 수치만큼 향상되는 것을 확인하였다(도 7 및 도 8 참조).
이에 더하여, microRNA-382의 표적 유전자가 PTEN이고, microRNA-382가 PTEN의 3'-UTR에 결합함을 확인하였으며(도 9 내지 도 12 참조), CAM assay 및 tube formation assay를 수행하여, in vivo 에서도 microRNA-382에 의해 혈관신생촉진 효과가 나타남을 확인하였다(도 13 내지 15 참조).
상기로부터 본 발명자들은 microRNA-382가 혈관신생 및 혈관내피세포의 증식을 촉진하는 역할을 함을 확인할 수 있었다. 궁극적으로 상기 결과는 microRNA-382를 활성화시킴으로써 혈관내피세포의 증식, 혈관신생을 촉진할 수 있고, 나아가 상처 치유, 허혈성 심근경색, 또는 족부 허혈 등의 치료에 효과적으로 이용할 수 있음을 시사한다.
본 발명의 약학적 조성물은 약제학적으로 허용 가능한 담체를 포함할 수 있다. 상기 약제학적으로 허용 가능한 담체는 생리식염수, 폴리에틸렌글리콜, 에탄올, 식물성 오일, 및 이소프로필미리스테이트 등을 포함할 수 있으며, 이에 한정되지는 않는다.
본 발명의 약학적 조성물은 국소 적용을 위해서 연고나 크림으로 제형화 할 수 있고, 일반적인 식염수, 5% 덱스트로스와 같은 수용성 용매, 또는 식물성 오일, 합성 지방산 글리세라이드, 고급 지방산 에스테르, 또는 프로필렌글리콜과 같은 비수용성 용매에 화합물을 용해시키거나, 현탁시키거나, 또는 유화시켜 주사제로 제형화할 수 있다. 본 발명의 제형은 용해제, 등장화제(isotonic agents), 현탁화제, 유화제, 안정화제, 및 방부제와 같은 종래의 첨가제를 포함할 수 있다.
또한, 본 발명은 microRNA-382 활성화제를 포함하는 혈관신생촉진용 조성물의 약제학적 유효량을 개체에 투여하여 상처, 허혈성 심근경색, 또는 족부 허혈 등을 치료하는 방법을 제공한다. 본 발명에서 "개체"란 질병의 치료를 필요로 하는 대상을 의미하고, 보다 구체적으로는 인간, 또는 비-인간인 영장류, 생쥐(mouse), 쥐(rat), 개, 고양이, 말, 및 소 등의 포유류를 의미한다. 또한, 본 발명에서 "약제학적 유효량"은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설율, 및 질환의 중증도 등에 따라 그 범위가 다양하게 조절될 수 있음은 당업자에게 명백하다.
본 발명의 약학적 조성물의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물 형태, 투여경로, 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 그러나 바람직하게는, 1일 0.001 내지 100 mg/체중kg으로, 보다 바람직하게는 0.01 내지 30 mg/체중kg으로 투여한다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 여러번 나누어 투여할 수 있다. 본 발명의 microRNA-382 활성화제는 전체 조성물 총 중량에 대하여 0.0001 내지 10 중량%, 바람직하게는 0.001 내지 1 중량%의 양으로 존재할 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 쥐, 생쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여방법에는 제한이 없으며, 예를 들면, 경구, 직장, 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁내 경막, 또는 뇌혈관(intra cerbroventricular) 주사에 의해 투여될 수 있다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
[ 실시예 ]
실시예 1. 세포 배양
BAEC 세포(bovine aortic endothelial cell)는 10% 우태아 혈청이 포함된 DMEM 배지에 함께 넣고, 5% 이산화탄소가 있는 37℃ 항온기에서 배양하였다. 인체의 위암세포는 10% 우태아 혈청이 포함된 RPMI-1640 배지에 함께 넣고, 5% 이산화탄소가 있는 37℃ 항온기에서 배양하였다. 세포가 충분히 자라면 RNA(microRNA 포함) 추출과 단백 분리를 위해 10㎠ 의 배양접시에서 배양하였다. 두 개의 배양용기로 분리할 경우, 부착세포의 경우에는 트립신-EDTA를 이용하여 배양용기에서 떼어낸 후 1000 rpm에서 5분 동안 원심분리를 한 뒤 부착세포와 같은 방법으로 새 배양용기로 옮겨주었다. 저산소 상태를 유지할 때에는 1% O2 농도를 유지하는 배양기에 배양하였다.
실시예 2. 저산소 상태에서의 microRNA -382 발현량 비교 실험
암의 주변에는 저산소 상태가 형성이 되며 이러한 환경에서는 세포 증식, 혈관신생 등의 메커니즘을 조절하는 여러 인자들의 발현량에 변화가 일어나게 된다. 그 중, 위암 세포주인 MKN1 세포에서 저산소 조건이 주어졌을 때 발현량의 차이를 보이는 microRNA를 비교해보았다.
구체적으로, MKN1 세포를 1% 산소농도에서 24시간 배양하였다. 24시간 후에 빠르게 배지를 제거하고 RNA 추출액을 처리하여 RNA를 분리하였다. 정상산소 조건에서 배양한 MKN1 세포로부터 분리한 RNA와 비교하여 마이크로어레이 및 real-time PCR을 수행하여 발현량에 변화가 있는 microRNA 중 microRNA-382가 저산소 조건에서 발현이 증가함을 확인하였다(도 1 및 도 2 참조). Real-time PCR 실험 방법은 MKN1 세포의 총 RNA를 TRIzol 시약 및 제조 업체의 프로토콜에 따라 Purelink miRNA kit (Invitrogen)를 사용하여 추출한 후, GenoExplorer™ miRNA First-Strand cDNA Core Kit (Genosensor)를 이용하여 total RNA 500ng을 가지고 Complementary DNA (cDNA)를 생성하였다. Real-time PCR은 SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystems) 과 GenoExplorer™ miRNA qPCR Primer Sets (Genosensor)을 이용하여 Biosystems 7300 Real-Time PCR system으로 수행하였다. U6 RNA (internal control MKN1 cell)에서의 mature microRNA를 계산하였다.
도 1은 위암세포주인 MKN1 세포를 저산소 조건에서 배양하였을 때 정상산소 조건 대비 변화한 microRNAs의 발현양상을 마이크로어레이 실험을 통해 비교한 결과를 나타낸 것이다. 도 1에 나타난 바와 같이, 두 조건에서 다수의 microRNAs의 발현량의 증감에 변화가 있음을 알 수 있었으며 그 중 microRNA-382가 저산소 조건에서 발현이 증가하였다.
도 2는 위암세포주인 MKN1 세포를 저산소 조건에서 시간별로 배양한 후 real-time PCR 실험을 통해 microRNA-382의 발현량을 나타낸 것이다. 도 2에 나타난 바와 같이, microRNA-382는 저산소 상태에서 24시간 째 가장 높은 발현을 나타냄을 real-time PCR을 통해 확인하였다. 즉, 정상산소 대비 저산소 조건에서 microRNA-382의 발현이 증가함을 확인하였으며 24시간 배양시 microRNA-382가 가장 많이 발현됨을 알 수 있었다.
상기 결과는 microRNA-382가 세포의 저산소 상태에서 나타나는 현상을 조절하는 역할을 할 수 있음을 시사한다.
실시예 3. microRNA -382의 발현에 따른 혈관내피세포 증식능 확인
암세포의 무제한 증식 과정에서 조성되는 저산소 미세환경에서는 암세포가 분비하는 여러 생장 인자에 의해 주변의 혈관내피세포가 영향을 받아 증식이 가속화될 수 있다.
따라서 본 발명자들은 저산소 상태의 암세포에서 발현이 증가되는 microRNA-382가 주변의 혈관내피세포에도 영향을 미칠 것이라 생각되어 하기 실험을 수행하였다.
구체적으로, 위암세포주인 MKN1 세포를 항생제가 없는 배지에 하루 배양한 후, PNAsTM microRNA-382 inhibitor(PANAGENE)를 트렌스펙션하였다. 정상 산소상태에서 20시간 배양 후 1% 산소농도로 옮겨 각각 6시간, 12시간, 24시간 동안 배양하였다. 각 시간별로 배양한 배지를 추출하여 농축시킨 후 혈관내피세포에 처리하여 증식능을 관찰하는 실험을 하였다.
혈관내피세포의 증식능을 관찰하기 위해서 혈관내피세포를 48-웰 플레이트에 10% FBS가 함유된 DMEM 배지에 약 24시간 배양한 후, 1% FBS만 함유된 배지로 바꿔 20시간 배양한 다음 조건배지로 바꿔 24시간 더 배양하였다. [³H]-사이미딘을 한 웰당 1uCi씩 4시간 처리한 후 PBS로 3번 세척하였다. 4℃의 메탄올에 5분 동안 고정시킨 후, 증류수로 3번 세척하였다. 5% TCA (trichloroacetic acid)를 10분 처리한 후 증류수로 3번 세척하고 0.3N 수산화나트륨으로 용해시킨 다음, liquid scintillation counter (Perkin Elmer)를 사용해서 방사능을 측정하여 세포의 증식능을 확인하였고, 그 결과를 도 3에 나타내었다.
도 3에 나타난 바와 같이, 저산소 상태의 암세포에서 발현이 증가된 microRNA-382를 억제제를 통해 감소시킨 조건배지를 혈관내피세포에 처리하면 혈관내피세포의 증식능이 감소하는 것이 확인되었다.
상기 결과로부터 microRNA-382가 혈관내피세포의 증식능을 촉진하는 역할을 할 것으로 예상할 수 있었으며, 이를 재확인하기 위해 정상산소 상태에서 microRNA-382를 과발현시켰을 때 혈관내피세포의 증식능에 미치는 영향을 고찰하였다.
구체적으로, pENTRTM /H1/T0 벡터에 클로닝된 mature microRNA-382를 위암세포주인 MKN1 세포에 트렌스펙션하여 과발현을 유도하였다. 24시간 배양 후 배지를 추출하여 농축시킨 후 혈관내피세포에 처리하여 증식능을 관찰하는 실험을 수행하였고, 그 결과를 도 6에 나타내었다.
도 6에 나타난 바와 같이, microRNA-382의 발현 증가가 혈관내피세포의 증식능을 향상시킴을 확인하였다.
실시예 4. microRNA -382의 발현에 따른 혈관내피세포 이동능 확인
실시예 3에 더하여, microRNA-382가 혈관내피세포의 이동능에 미치는 영향을 관찰해 보았다.
구체적으로, 위암세포주인 MKN1 세포를 항생제가 없는 배지에 하루 배양한 후, PNAsTM microRNA-382 inhibitor (PANAGENE) 를 트렌스펙션하였다. 정상 산소상태에서 20시간 배양 후 1% 산소농도로 옮겨 각각 6시간, 12시간, 24시간 동안 배양하였다. 각 시간별로 배양한 배지를 추출하여 농축시킨 후 혈관내피세포에 처리하여 이동능을 관찰하는 실험을 하였다.
혈관내피세포의 이동능을 관찰하기 위해서 8 um porosity polycarbonate filters가 있는 24-웰 트렌스웰에 type 1 collagen을 코팅하여 실온에서 1시간 말린 후 사용하였다. 챔버의 아래에는 추출한 조건배지를 넣고 챔버의 위에는 세럼이 없는 배지와 함께 동일한 수의 세포를 깔아 20시간 배양한 후 막을 통과하는 세포의 수를 세어보았다.
이동한 세포의 구분은 메탄올 고정 후 헤마톡실린 10분 염색, 에오신 1분 염색을 하고 이동하지 않은 막 위의 세포를 면봉으로 제거한 후 현미경으로 염색된 세포를 카운팅하였고, 그 결과를 도 4에 나타내었다.
도 4에 나타난 바와 같이, 저산소 상태의 암세포에서 발현이 증가된 microRNA-382를 억제제를 통해 감소시킨 조건배지를 혈관내피세포에 처리하면 혈관내피세포의 이동능이 감소하는 것이 확인되었다.
상기 결과로부터 microRNA-382가 혈관내피세포의 이동능을 촉진하는 역할을 할 것으로 예상되어졌으며, 이를 재확인하기 위해 정상산소 상태에서 microRNA-382를 과발현시켰을 때 혈관내피세포의 이동능에 미치는 영향을 고찰하였다.
구체적으로, pENTRTM /H1/T0 벡터에 클로닝된 mature microRNA-382를 위암세포주인 MKN1 세포에 트렌스펙션하여 과발현을 유도하였다. 24시간 배양 후 배지를 추출하여 농축시킨 후 혈관내피세포에 처리하여 이동능을 관찰하는 실험을 하였고, 그 결과를 도 7에 나타내었다.
도 7에 나타난 바와 같이, microRNA-382의 발현 증가가 혈관내피세포의 이동능을 향상시킴을 확인하였다.
실시예 5. microRNA -382의 발현에 따른 혈관내피세포 혈관 생성능 확인
본 발명자들은 microRNA-382가 혈관내피세포의 혈관 형성능에 미치는 영향을 관찰해 보았다.
혈관내피세포의 혈관 형성능을 관찰하기 위해서 먼저 48웰 플레이트에 마트리젤을 37℃에서 30분간 코팅을 한 후, 저산소 상태에서 발현이 증가된 microRNA-382를 억제제를 통해 감소시킨 암세포의 배지로부터 추출한 조건배지와 함께 혈관내피세포를 함께 웰에 넣어 배양한 다음 12시간 후 튜브형성을 현미경으로 확인하였고, 그 결과를 도 5에 나타내었다.
도 5에 나타난 바와 같이, 저산소 상태의 암세포에서 발현이 증가된 microRNA-382를 억제제를 통해 감소시킨 조건배지를 혈관내피세포에 처리하면 혈관내피세포의 혈관 형성능이 감소하는 것이 확인되었다.
상기 결과로부터 microRNA-382가 혈관 형성능을 촉진하는 역할을 할 것으로 예상되어졌으며, 이를 재확인하기 위해 정상산소 상태에서 microRNA-382를 과발현시켰을 때 혈관 형성능에 미치는 영향을 고찰하였다.
동일한 방법으로 microRNA-382를 과발현시킨 후 추출한 조건배지와 함께 넣은 세포의 혈관 형성능을 관찰하였을 때 튜브 형성이 더 많이 된 것을 확인하였고, 그 결과를 도 8에 나타내었다.
도 8에 나타난 바와 같이, microRNA-382의 발현 증가가 혈관내피세포의 혈관 형성능을 향상시킴을 확인하였다.
실시예 6. microRNA -382의 in vivo 상에서의 혈관신생촉진효과 확인
6-1. 저산소 조건에서 감소하는 PTEN 의 발현
본 발명자들은 저산소 조건의 암세포에서 발현이 증가되는 microRNA-382의 표적 유전자를 알아보기 위하여, 하기 실험을 수행하였다.
구체적으로, microRNA의 표적 유전자와 결합 부위를 예측할 수 있는 프로그램인 Target Scan, miRanda 및 Sanger miRbase Target을 통해 표적 유전자 중 PTEN을 선정하였으며, 우선적으로, 저산소 조건의 암세포에서의 PTEN의 발현량을 확인하였다.
그 결과, 정상산소 조건일 때 보다 저산소 조건의 암세포에서 PTEN의 발현량이 감소함을 확인하였다(도 9 참조).
6-2. microRNA -382와 PTEN 의 결합 확인
이를 통해, 본 발명자들은 저산소 조건의 암세포에서 발현이 감소하는 PTEN이 microRNA-382의 표적 유전자임을 예측하고, 먼저 miRanda 프로그램을 통해서 miR-130a와 miR-495가 PTEN의 3'-UTR 부분에 결합하는 부위를 찾았다. 그리고 여러 종에서 PTEN mRNA의 3'-UTR에서 microRNA-382와의 결합 부위가 보존되어 있음을 확인하였다(도 10 참조).
상기 예측한 PTEN의 결합 부위에 microRNA-382가 직접적으로 결합하는지 확인하기 위하여, microRNA-382의 결합 부위가 포함된 PTEN의 3'-UTR 부분을 luciferase reporter 벡터에 클로닝하여, pGL3-luciferase-PTEN 3'-UTR-벡터를 제작하였다. 이후, 상기 제작한 벡터를 세포에 형질도입시키고, 벡터가 형질도입된 세포에 microRNA-382를 처리한 다음, 세포에서 나타나는 luciferase 활성을 측정하였다.
그 결과, PTEN의 3'-UTR 부분이 포함된 벡터가 형질도입된 세포에서, microRNA-382 처리에 의해 luciferase 활성이 현저히 감소함을 확인하였다(도 11 참조). 이를 통해, microRNA-382는 표적 유전자 PTEN의 3'UTR에 직접적으로 결합한다는 것을 알 수 있다.
6-3. miR -382에 의한 PTEN 의 발현 감소
본 발명자들은 microRNA-382가 PTEN의 단백질 발현에 미치는 영향을 확인하기 위하여, 위암세포주인 MKN1 세포에 microRNA를 과발현시킬 수 있는 miRNA mimic(MSY0000737) 및 microRNA를 억제할 수 있는 miRNA 억제제(Qiagen miScript miRNAs)를 처리하고, PTEN 단백질의 발현양을 확인하였다.
구체적으로, 정상산소 조건에서 암 세포에 microRNA-382의 mimic을 처리한 경우, 농도 의존적으로 PTEN 단백질의 발현량이 감소되었고, 저산소 조건일 경우에도 암 세포에 microRNA-382 억제제를 처리해 주었을 때 농도 의존적으로, PTEN 단백질의 발현량이 회복되었음을 확인하였다(도 12 참조).
6-4. CAM ( chick chorioallantoic membrane ) assay 를 통한 microRNA -382의 혈관신생촉진효과 확인
본 발명자들은 in vivo에서 microRNA-382의 혈관신생촉진 효과를 확인하기 위하여, CAM(chick chorioallantoic membrane) assay를 수행하였다.
구체적으로, CAM assay는 하기와 같이 수행하였다.
구입한 수정란을 온도 37-38℃, 습도 90% 이상 유지시킨 incubator에서 부화시키고, 수정란의 뾰족한 끝부분에 칼로 흠을 낸 다음 구멍을 봉하고 구멍이 아래로 향하도록 다시 배양시켰다. 이후, 수정란의 air sac이 있는 쪽(주사기 구멍의 반대쪽)으로 직경 2-3㎝ 크기의 원형 window를 내고 수정란으로 확인된 것만 넓은 유리 테잎으로 막고 다시 배양시켜, CAM의 생성을 유도하였다.
이후, microRNA mimic의 처리를 위해서, 정상산소 조건에서 음성 대조군 및 microRNA-382 mimic을 세포에 형질도입하고 24 hr 후에 얻어진 조건배지를 30배 농축하여, matrigel과 1:1비율로 섞어 mixture을 만든 다음, 이를 CAM 위에 처리하였다.
또한, microRNA 억제제의 처리를 위해서, 음성 대조군 및 microRNA-382 억제제를 세포에 형질도입하고 16 hr 후에 저산소 조건을 준 다음, 24 hr 후에 조건배지를 분리/농축하여, matrigel과 1:1비율로 섞어 mixture을 만들었으며, 이를 CAM 위에 처리하였으며, 4일 후에 카메라로 근접 촬영하였다.
그 결과, microRNA-382가 포함된 조건배지 mixture를 처리한 CAM에서는 음성 대조군에 비해 미세혈관(microvessel)의 브랜치(branch) 수가 증가한 반면, 저산소 조건에서 microRNA-382 억제제가 포함된 조건배지 mixture를 처리한 CAM에서는 저산소 상태일 때보다 미세혈관(microvessels)의 branch 수가 감소함을 확인하였다(도 13 참조). 이를 통해, mirroRNA-382가 in vivo 상에서도 혈관신생을 촉진하는 효과가 있음을 알 수 있다.
6-5. PTEN 처리에 의한, microRNA -382의 혈관신생촉진 효과 억제 확인
본 발명자들은 miroRNA-382의 표적 유전자인 PTEN 단백질 처리에 의해 혈관신생촉진 효과가 억제될 수 있는지를 확인하였다.
구체적으로, PTEN 단백질이 과발현되도록, PTEN이 형질도입된 세포로부터 얻어진 조건배지를 이용하여, tube formation assay를 수행하였으며, 그 결과, PTEN 처리에 의해, microRNA-382에 의해 유도된 tube formation이 억제됨을 확인하였다(도 14 참조).
또한, CAM assay를 통해, microRNA-382에 의해 증가된 혈관신생이 PTEN에 의해 감소하고, 저산소 조건에서 microRNA-382 억제제를 처리함으로써 저산소 상태일 때보다 혈관신생이 감소함을 확인하였다(도 15 참조).
따라서, PTEN의 과다발현은 microRNA-382에 의해서 유도되는 혈관신생효과를 억제함을 알 수 있다.
전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 아닌 것으로 이해해야만 한다.

Claims (2)

  1. microRNA-382 활성화제를 포함하는 혈관신생촉진용 약학적 조성물.
  2. 제 1항에 있어서,
    상기 혈관신생촉진용 약학적 조성물은 상처 치유, 허혈성 심근경색, 또는 족부 허혈의 치료에 사용되는 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
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