KR20130020827A

KR20130020827A - Ｐｋｎ３／ｒｈｏｃ 거대분자 복합체 및 그의 사용 방법

Info

Publication number: KR20130020827A
Application number: KR1020137000484A
Authority: KR
Inventors: 케지반 운살-칵마즈; 안케 클리펠-기세
Original assignee: 와이어쓰 엘엘씨
Priority date: 2009-03-12
Filing date: 2010-03-12
Publication date: 2013-02-28
Also published as: KR20110125246A; RU2011136885A; CA2753883A1; WO2010105128A2; BRPI1009253A2; KR20130020826A; EP2406627A2; JP2010213694A; MX2011009576A; CN102348981A; WO2010105128A3; IL214881A0; US20120100561A1; AU2010224062A1

Abstract

본 발명은 PKN3, PDK1 및 RhoC를 포함하는 신규한 거대분자 조립체 (PPRC 복합체)를 포함하는 조성물 및 그의 사용 방법을 개시한다. PPRC 복합체는 키나제 활성을 갖는 것으로 나타났고, 높은 악성종양 잠재성의 세포, 예컨대 특히 공격성인 암의 세포에서 발견되었다. 일부 측면에서, 본 발명은 암 치료 잠재성을 갖는 화합물을 스크리닝하는 방법, 공격성 암을 진단하는 방법, 암에 걸린 환자의 예후를 결정하는 방법, 임상 실험에서 환자를 등급별 분류하거나 특정 치료 요법의 유효성을 결정하는 방법, PPRC 복합체의 형성을 조절하는 폴리펩티드, 및 PPRC 복합체의 하나 이상의 성분을 포함하는 키트를 제공한다.

Description

ＰＫＮ３／ＲＨＯＣ 거대분자 복합체 및 그의 사용 방법 {A PKN3/RHOC MACROMOLECULAR COMPLEX AND METHODS OF USE THEREFOR}

본 발명은 화합물을 항암 활성에 대해 스크리닝하고 공격성 암을 갖는 환자를 진단하기 위한 단백질 키나제 N 3 (PKN3) 및 RhoC의 용도에 관한 것이다.

효과적인 암 치료법의 개발은 질환의 근원이 되는 분자 메카니즘의 해명 및 새로운 약물의 개발에 유용할 수 있는 분자 메카니즘 내 표적 분자의 확인에 점점더 의존한다. 상기 표적 분자가 이용가능해지면, 약물 후보 화합물을 그 표적에 대해 시험할 수 있다. 다수의 경우에서, 상기 약물 후보는 합성 또는 천연 화합물로 이루어질 수 있는 화합물 라이브러리의 구성원이다.

새로운 치료 화합물 및 요법제가 확인 및 승인될 수 있도록 특히 공격성 형태의 암과 관련된 새로운 분자 표적을 확인하는 것이 매우 필요하다.

제1 측면에서, 본 발명은 암 치료에 유용한 화합물을 확인하는 방법을 제공한다. 이 방법의 단계는, 시험 화합물을 단백질 키나제 N 3 (PKN3) 폴리펩티드 (또는 그의 단편), RhoC 폴리펩티드 (또는 그의 단편) 및 포스포이노시티드-의존성 키나제-1 (PDK1) 폴리펩티드 (또는 그의 단편)와 조합하는 단계, 및 이어서 형성된 PKN3 및 RhoC 함유 복합체 ("복합체")의 양을 결정하는 단계를 포함한다. 이는 복합체의 "시험 수준"이라 칭해진다. 이어서, 시험 수준을 참조와 비교한다. 시험 수준과 참조와의 임의의 차이는 시험 화합물이 잠재적으로 암 치료 활성을 가짐을 나타낸다. 일부 실시양태에서, PKN3, RhoC 및 PDK1 폴리펩티드 (또는 그의 단편)은 시험 화합물과 조합되기 전에 어느 정도 정제된다.

일부 실시양태에서, 하나 이상의 성분 (성분은 PKN3, RhoC 및 PDK1, 또는 이들의 각 단편임)은, 성분을 확인하고 성분과 그에 부착된 임의의 다른 성분의 단리에 도움을 주는데 사용되는 분자 태그를 함유한다. 분자 태그는 일반적으로 당업계에 공지되어 있다. 예로는 폴리히스티딘, GST 및 플래그(FLAG)가 포함된다. 일부 실시양태에서, PKN3 폴리펩티드는 분자 태그를 포함하고, 복합체는 PKN3 폴리펩티드를 그의 분자 태그로 끌어내림(pulling down)으로써 단리된다.

일부 실시양태에서, 참조는 시험 화합물의 부재하에 형성된 복합체의 수준이다. 다른 실시양태에서, 참조는 시험 화합물이 PKN3, RhoC 및 PDK1 (또는 이들의 각 단편) (여기서 키나제 중 임의의 하나 또는 모두는 사멸 키나제(kinase-dead)임)과 조합되는 경우에 형성된 복합체의 수준이다.

일부 실시양태에서, 시험 수준은 참조보다 낮다. 일부 실시양태에서, 시험 화합물은 암 세포의 침습성을 감소시키거나 종양의 성장률을 감소시키는 화합물이다.

제2 측면에서, 본 발명은 암 치료에 유용한 화합물을 확인하는 세포-기반 방법을 제공한다. 이 방법의 단계는, 세포를 시험 화합물과 접촉시키는 단계, 및 이어서 시험 화합물의 존재하에 세포내 형성된 복합체의 양을 결정하는 단계 (시험 수준)를 포함한다. 세포는 PKN3 폴리펩티드 (또는 그의 단편), RhoC 폴리펩티드 (또는 그의 단편) 및 포스포이노시티드-의존성 키나제-1 (PDK1) 폴리펩티드를 함유하고, 복합체도 또한 상기 성분 각각을 함유한다. 이어서, 시험 수준을 참조와 비교한다. 시험 수준과 참조 사이의 임의의 차이는 시험 화합물이 잠재적으로 암 치료 활성을 가짐을 나타낸다.

일부 실시양태에서, 세포는 예를 들어 장기간 조혈 줄기 세포 (LT-HSC)와 같은 줄기 세포이다. 다른 실시양태에서, 세포는 종양으로부터 배양된 세포이다. 일부 실시양태에서, 세포는 전이에 대한 높은 잠재성을 갖는다. 일부 실시양태에서, 세포는 예를 들어 PC3 세포, HEK293 세포, MDA-MB231 세포, MCF7 세포, MDA361 세포, MCF468 세포, BT549 세포 및 헬라(HeLa) 세포 중 하나이다. 다른 실시양태에서, 세포는 이종 재조합 폴리펩티드로서 하나 이상의 성분 또는 모든 성분을 함유한다.

일부 실시양태에서, 하나 이상의 성분 (성분은 PKN3, RhoC 및 PDK1 또는 이들의 단편임)은 세포에 내인성이다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 성분은 재조합형이며, 성분을 확인하고 성분과 그에 부착된 임의의 다른 성분의 단리에 도움을 주는데 사용되는 분자 태그를 함유한다. 분자 태그는 일반적으로 당업계에 공지되어 있다. 예로는 폴리히스티딘, GST 및 플래그가 포함된다. 일부 실시양태에서, PKN3 폴리펩티드는 분자 태그를 포함하고, 복합체는 PKN3 폴리펩티드를 그의 분자 태그에 의해 끌어내림으로써 단리된다.

일부 실시양태에서, 참조는 시험 화합물의 부재하에 형성된 복합체의 수준이다. 다른 실시양태에서, 참조는 시험 화합물이 PKN3, RhoC 및 PDK1 (또는 이들의 단편) (여기서 키나제 중 임의의 하나 또는 모두는 사멸 키나제임)와 조합되는 경우에 형성된 복합체의 수준이다.

일부 실시양태에서, 시험 수준은 참조보다 낮다. 일부 실시양태에서, 시험 화합물은 암 세포의 침습성을 감소시키거나 1차 종양의 성장률을 감소시키는 화합물이다.

제3 측면에서, 본 발명은 환자에서 PKN3 활성 및 RhoC 활성의 수준을 평가함으로써 환자에서 암을 진단하는 방법을 제공한다. 상기 방법에 따르면, 샘플을 환자로부터 얻은 다음, 샘플에서 PKN3 활성 및 RhoC 활성의 수준을 결정하고 (이것이 시험 수준임), 이어서 시험 수준을 참조와 비교한다. 시험 수준과 참조 사이의 차이는 환자가 공격성인 암을 가짐을 나타낸다.

제4 측면에서, 본 발명은 환자에서 PKN3 활성 및 RhoC 활성의 수준을 평가함으로써 암 치료법에 반응할 수 있는 환자를 확인하는 방법을 제공한다. 상기 방법에 따르면, 샘플을 환자로부터 얻은 다음, 샘플에서 PKN3 활성 및 RhoC 활성의 수준을 결정하고 (이것이 시험 수준임), 이어서 시험 수준을 참조와 비교한다. 시험 수준과 참조 사이의 차이는 환자가 암 치료법에 반응할 것인지의 가능성을 나타낸다.

제3 측면 및 제4 측면 둘 다의 일부 실시양태에서, 참조는 비-암 조직에서 결정된 PKN3 활성 및 RhoC 활성의 수준이다. 일부 실시양태에서, 샘플은 종양 생검이고, 시험 수준은 종양에서의 계내(in situ) 검정, 예컨대 계내 혼성화, 계내 PCR 또는 면역염색에 의해 결정된다. 일부 실시양태에서, 참조는 단순히 종양 샘플 주위 또는 종양 샘플 내의 임의의 비-암 조직이다. 일부 실시양태에서, 시험 수준은 참조보다 높다.

제5 측면에서, 본 발명은 치료제의 투여 전 및 치료제의 투여 후 PKN3 및 RhoC 활성 수준의 변화를 평가함으로써 대상체에서 암 치료용의 치료 요법제의 효능을 결정하는 방법을 제공한다. 상기 방법에 따르면, 샘플을 환자로부터 얻은 다음, 샘플에서 PKN3 활성 및 RhoC 활성의 수준을 결정하고 (이는 치료전 또는 제1 수준임), 이어서 치료 요법제를 환자에게 투여한다. 치료제가 투여되는 시간에, 제2 샘플을 환자로부터 얻고, 제2 샘플에서 PKN3 활성 및 RhoC 활성의 수준을 결정한다 (이는 치료후 또는 제2 수준임). 제1 수준 및 제2 수준을 서로 비교한다. 제1 수준에 비해 제2 수준에서 PKN3 활성 및 RhoC 활성 둘 다의 감소는 치료 요법제가 환자에서의 암에 대해 유효함을 나타낸다.

제3, 제4 및 제5 측면의 일부 실시양태에서, PKN3 활성은 PKN3 폴리펩티드 또는 그의 단편을 코딩하는 RNA의 발현이다. 다른 실시양태에서, PKN3 활성은 PKN3 폴리펩티드 또는 그의 단편의 발현이다. 다른 실시양태에서, PKN3 활성은 PKN3 폴리펩티드의 인산화이다. 또다른 실시양태에서, PKN3 활성은 PKN3의 하류 효과기(effector), 예컨대 글리코겐 신타제 키나제 3 (GSK-3)-유래 펩티드의 인산화이다 (또한 표 1 참조).

제3, 제4 및 제5 측면의 일부 실시양태에서, RhoC 활성은 RhoC 폴리펩티드 또는 그의 단편을 코딩하는 RNA의 발현이다. 다른 실시양태에서, RhoC 활성은 RhoC 폴리펩티드 또는 그의 단편의 발현이다. 다른 실시양태에서, RhoC 활성은 RhoC의 하류 효과기, 예컨대 PKN3 또는 글리코겐 신타제 키나제 3 (GSK-3)-유래 펩티드의 인산화이다 (또한 표 1 참조).

제3, 제4 및 제5 측면의 일부 실시양태에서, PKN3 폴리펩티드의 인산화 상태는 PKN3의 T860에서 턴 모티프(turn motif) 인산화 부위에 특이적으로 결합하는 항체 또는 다른 폴리펩티드를 사용하여 결정된다. 예를 들어, 서열 36을 참조한다.

제1 내지 제5 측면의 일부 실시양태에서, 암은 유방암, 난소암, 췌장암, 위암, 간세포암종, 방광암, 결장직장암, 피부흑색종 및 전립선암종 (CaP) 중 임의의 하나 이상이다.

제6 측면에서, 본 발명은 PKN3 폴리펩티드 및 RhoC 폴리펩티드를 포함하는 복합체의 형성을 방해 또는 차단하는 폴리펩티드 또는 펩티드모방체를 포함하는 조성물을 제공한다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드 또는 펩티드모방체는 RhoC에 결합하는 PKN3의 영역에 결합한다. 다른 실시양태에서, 폴리펩티드 또는 펩티드모방체는 PKN3에 결합하는 RhoC의 영역에 결합한다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드 또는 펩티드모방체는 PKN3 또는 RhoC 상의 에피토프를 인식하는 하나 이상의 상보성 결정 영역 (CDR)을 함유한다. 일부 실시양태에서, CDR-함유 폴리펩티드는 항체, 모노클로날 항체, 인간화 항체, 단일쇄의 단일쇄 가변 단편 ("ScFv"), 소단위 면역약제 ("SMIP") 및 나노바디 (a.k.a. 단일 도메인 항체 또는 VHH 항체) 중 임의의 하나이다.

제6 측면의 일부 실시양태에서, RhoC에 결합하는 PKN3의 영역은 임의의 하나 이상의 ACC1, ACC2 또는 ACC3 아미노산 서열을 포함한다. 다른 실시양태에서, 폴리펩티드 또는 펩티드모방체는 PKN3의 임의의 하나 이상의 ACC1, ACC2 및 ACC3에 상응하는 아미노산 서열을 함유한다.

제7 측면에서, 본 발명은 T860에서의 PKN3 턴 모티프 인산화 부위를 인식하는 하나 이상의 상보성 결정 영역 (CDR)을 함유하는 폴리펩티드를 제공한다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는, 예를 들어 모노클로날 항체, 인간화 항체, 단일쇄의 단일쇄 가변 단편 ("ScFv"), 소단위 면역약제 ("SMIP") 및 나노바디 (a.k.a. 단일 도메인 항체 또는 VHH 항체)를 포함하는 항체이다.

제8 측면에서, 본 발명은 PKN3과 RhoC 사이의 상호작용을 조절하는 화합물을 스크리닝하는데 사용되며 암을 치료하는데 사용될 수 있는 키트를 제공한다. 키트는 또한 환자에서 암의 공격성 또는 침습성을 결정하는데 사용될 수 있다. 키트는 또한 환자에서 암 치료법의 유효성을 평가하는데 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 키트는 (a) PKN3 활성을 검출하는 작용제, (b) RhoC 활성을 검출하는 작용제, (c) 라벨 및 (d) 패키지를 함유한다. 일부 실시양태에서, 키트는 또한 암 치료용 화합물을 함유한다. 암 치료용 화합물은 대상체에서 암 세포의 성장 또는 전이를 예방 또는 지연시키는 화합물, 조성물 또는 치료 요법제이다. 이러한 암 치료용 화합물로는, 화학요법 약물, 유전자 요법 조성물, 호르몬에 영향을 주는 화합물, 면역요법 화합물, 항체 및 안티센스 올리고뉴클레오티드가 포함되나, 이에 제한되지 않는다. 유용한 화학요법 약물의 예로는, 블레오마이신, 네오카르시노스타틴, 수라민, 독소루비신, 탁솔, 미토마이신 C 및 시스플라틴이 포함되나, 이에 제한되지 않는다. 본 발명에 사용하기 위한 암 치료용 화합물은 또한 향후 개발되는 신규 화합물 또는 치료제를 포함하는 것으로 이해될 것이다.

본 발명의 PPRC 복합체를 이용하여 암 치료 잠재성을 갖는 화합물을 스크리닝할 수 있고 공격성 암을 갖는 환자를 진단할 수 있다.

도 1은 부수적으로 증가하는 인산화 PKN3 수준을 보여주는 증가하는 악성 잠재성을 갖는 유방암 세포주의 웨스턴 블롯을 도시한다.
도 2는 부수적으로 증가하는 인산화 PKN3 수준을 보여주는 증가하는 약물 내성을 갖는 비소세포 폐암종 (NSCLC) 세포주의 웨스턴 블롯을 도시한다.
도 3, 패널 A는 항-인산화 PKN 및 항-Myc 항체로 탐침되는 Myc-태그 Rho 및 Rac 구조체로 형질감염된 세포로부터의 용해물의 웨스턴 블롯을 도시한다. 패널 B는 항-인산화 PKN 및 항-Myc 항체로 탐침되는 Myc-태그 Rho 및 Rac 구조체로 형질감염된 세포로부터의 항-Myc 면역침전물의 웨스턴 블롯을 도시한다.
도 4, 패널 A는 항-Myc 및 항-플래그 항체로 탐침되는 Myc-태그 Rho 구조체 및 플래그-태그 PKN3 구조체로 형질감염된 세포로부터의 용해물의 웨스턴 블롯을 도시한다. 패널 B는 PKN3, RhoC 및 PDK1을 함유하는 삼원 복합체의 키나제-의존성 형성을 나타내는 항-플래그 면역침전의 웨스턴 블롯을 도시한다.
도 5, 패널 A는 항-Myc, 항-PDK1 및 항-PKN3 항체로 탐침되는 Myc-태그 Rho 구조체 및 플래그-태그 PKN3 구조체로 형질감염된 세포로부터의 용해물의 웨스턴 블롯을 도시한다. 패널 B는 RhoC/PDK1/PKN3 삼원 복합체에 의해 조절되는 PKN3의 키나제 활성을 나타내는 항-플래그 면역침전의 웨스턴 블롯을 도시한다.
도 6, 패널 A는 PKN3 또는 p110β를 표적으로 하는 독시사이클린 (독스(Dox) 또는 독시(Doxy))-유도된 shRNA를 발현하는 PC-3 세포로부터의 용해물의 웨스턴 블롯을 도시한다. 패널 B는 마트리겔(MATRIGEL)? 상에 시딩된 대표적인 세포 집단을 도시한다.
도 7, 패널 A 및 B는 이식된 PKN3 shRNA PC-3 세포를 갖는 마우스로부터의 종양 부피를 정량화하는 막대그래프를 도시한다.
도 8, 패널 A는 PKN3, p110β 또는 CKIε을 표적으로 하는 독스-유도된 shRNA를 발현하는 MDA-MB-231 세포로부터의 용해물의 웨스턴 블롯을 도시한다. 패널 B는 마트리겔? 상에 시딩된 대표적인 세포 집단을 도시한다.
도 9는 독시사이클린 유도의 존재 및 부재 하에 PKN3 shRNA MDA-MB-231 세포를 갖는 마우스에서의 종양 부피를 나타내는 산점도를 도시한다.

본원에는, (a) 단백질 키나제 N3 (PKN3)이 RhoC와 우선적으로 결합하고, (b) PKN3이 RhoC에 키나제-의존성 방식으로 결합하며, (c) PKN3과 RhoC와의 결합이 PDK1을 함유하는 삼원 복합체 (PKN3/PDK1/RhoC 복합체 또는 PPRC 복합체)의 형성을 촉진한다는 놀라운 발견이 개시되어 있다. PPRC 복합체는 특히 공격성인 암과 관련하여 가치있는 표적이다. 또한, PPRC 복합체가 증가된 PKN3 인산화 및 이후의 키나제 활성을 초래한다는 것이 추가로 개시되어 있다.

PKN3은 길이 889개의 아미노산 잔기의 세린/트레오닌 단백질 키나제이다 (인간 상동체(orthologue)). PKN3은 각각 잔기 15-77, 97-170 및 184-236 주위에 위치하는 3개의 역평행 코일드-코일(antiparallel coiled-coil, ACC) 도메인 ACC1, ACC2 및 ACC3을 함유하는 N-말단의 추정적 조절 영역; 잔기 559-882에 위치하는 C-말단 촉매 영역; 및 추정적 조절 도메인과 촉매 도메인 사이에 위치하는 길이 약 100 내지 130개의 잔기의 C2-유사 도메인을 갖는다. 포유동물에는 3개 이상의 상이한 이소형의 PKN (PKN1/PKNα/PAK-1/PRK-1, PKN2/PRK2/PAK-2/PKNγ, 및 PKN3/PKNβ)이 존재하며, 이들 각각은 상이한 효소학적 성질, 조직 분포 및 변화된 기능을 나타낸다. PKN의 검토를 위해, 문헌 [Mukai, H., J. Biochem. 133:17-27, 2003]을 참조한다. 또한, 2004년 6월 3일자로 공개된 미국특허출원 제20040106569호 (이의 전문이 본원에 참고로 포함됨)를 참조한다.

또한 본원에는, PKN3이 증가된 공격성 및 약물 내성을 갖는 암 세포에서 상향조절된다는 것이 개시되어 있다 (각각 도 1 및 도 2 참조). 증가된 공격성은, 암 세포가 전이성이거나, 전이하기 위한 높은 잠재성을 갖거나, 증가된 증식률을 갖거나, 약물 내성임을 의미한다. 공격성 암은 예를 들어 삼중-음성 유방암에 의해 예시된다 (예를 들어, 문헌 [Dent et al., Clinical Cancer Research 13: 4429-4434, Aug. 1, 2007] 참조). 공격성 암은 또한 PKN3/RhoC 경로가 관여하는 암을 포함한다.

PPRC 복합체의 활성을 억제하는 화합물은 세포의 전이 및 증식 거동을 제어하는데 사용될 수 있으며, 따라서 종양 및 암, 보다 구체적으로는 공격성인 종양 및 암을 치료하는 방법을 제공한다. PPRC 활성에 의해 작동되는 신호전달 및 다른 활성의 감소는, PPRC 복합체 성분 중 하나 이상의 전사 수준, 번역 수준 또는 번역-후 변형 수준이나 사차 구조의 형성 (즉, 삼원 복합체의 형성) 수준의 감소에서 유래될 수 있다.

공격성 암에 PPRC 복합체 및 RhoC/PKN3 경로가 관련되어 있기 때문에, 복합체 및 그의 성분은 예후 마커, 질환 병기 마커, 환자-층별화 마커, 또는 세포가 전이를 겪거나 공격성이 될 지에 관하여 세포의 상태를 진단하거나 체내에 상기 종류의 세포를 갖는 환자를 진단하기 위한 마커로서 사용될 수 있다.

PKN3은 세포의 PI3K-유도된 이동 및 침습의 발달상 조절되는 매개자이다. 그는 PI3K에 의해 발현 및 촉매 활성의 수준에서 Akt-의존성 방식으로 조절된다. 그는 한정된 발현 패턴 (내피, 배아 및 종양 세포)을 가지며, 대부분의 정상 세포 기능에 필수적인 것은 아니다. 그는 정위형(orthotopic) 마우스 모델에서 전이성 PC-3 (PTEN-/-) 세포 성장에 필요하다.

정상 세포에서, PI3-키나제 (포스파티딜-이노시톨-3-키나제) 경로는 성장 인자 유도 및 평행 신호전달 경로에 대한 PI3-키나제 활성에 의해 특성화된다. 세포의 성장 인자 자극은 세포막에서 그의 동족(cognate) 수용체의 활성화를 유도하여 PI3-키나제와 같은 세포내 신호전달 분자와 결합하여 그를 활성화시킨다. PI3-키나제 (조절적 p85 서브유닛 및 촉매적 p110 서브유닛으로 이루어짐)의 활성화는 인산화에 의한 Akt의 활성화를 초래함으로써 증식, 생존 또는 추가 하류로의 이동과 같은 세포 반응을 지지한다. 따라서, PTEN은, 포스파티딜이노시톨 (PI) 3-키나제 경로에 관여하며 과거에 세포 성장 및 형질전환을 조절하는 역할에 대해 광범위하게 연구되었던 종양 억제제이다 (검토를 위해, 예를 들어 문헌 [Stein, R. C. and Waterfield, M. D. Mol Med Today 6:347-357, 2000] 참조).

종양 억제제 PTEN은 PI3-키나제-촉매된 반응을 역전시킴으로써 PI3-키나제의 음성 조절자로서 기능하며, 이에 따라 경로의 불활성화가 일시적이며 제어된 방식으로 일어난다는 것을 보장한다. PI3-키나제 신호전달의 만성 과활성화는 PTEN의 기능적 불활성화에 의해 유발된다. PI3-키나제 활성은 소분자 억제제 LY294002의 첨가에 의해 차단될 수 있다. 예를 들어, 평행 경로로 작동하는 신호전달 키나제 MEK의 활성 및 하류 반응은 소분자 억제제 PD98059에 의해 억제될 수 있다.

PTEN 기능의 상실을 통한 PI3-키나제 경로의 만성 활성화는 종양생성 및 전이의 주요 기여자이며, 이는 상기 종양 억제제가 제어된 세포 증식에 대한 중요한 검사점을 나타냄을 의미한다. PTEN 넉-아웃(knock-out) 세포는, PI3-키나제 경로가 활성화된 형태의 PI3-키나제를 통해 만성적으로 유도되는 세포와 유사한 특징을 보여준다. 포스파티딜이노시톨 3-키나제의 활성화는 세포 주기 진입에 충분하며, 발암유전자 형질전환의 세포 변화 특성을 촉진한다.

PI3-키나제 경로의 조절장애와 관련된 질환 및 상태는 잘 알려져 있다. 따라서, 임의의 상기 상태 및 질환은 본 발명의 방법에 의해 해결될 수 있고, 약물 및 진단제, 그의 디자인, 스크리닝 또는 제조가 본원에 교시되어 있다. 예를 들어 상태 및 질환은 하기를 지칭한다 (이에 제한되지 않음): 자궁내막암, 결장직장 암종, 신경아교종, 자궁내막암, 선암종, 자궁내막 증식증, 코우덴(Cowden) 증후군, 유전성 비폴립성 결장직장 암종, 리-프라우메네(Li-Fraumene) 증후군, 유방암, 난소암, 전립선암, 바나얀-조나나(Bannayan-Zonana) 증후군, LDD (레미트-두클로스(Lhermitte-Duklos) 증후군), 과오종-대두증 질환, 예컨대 광우병 (CD) 및 바나얀-루발카바-릴리(Bannayan-Ruvalcaba-Rily) 증후군 (BRR), 점막피부 병변 (예를 들어, 모종), 대두증, 정신지체, 위장 과오종, 지방종, 갑상선 선종, 유방 섬유낭병, 소뇌 형성장애성 신경절세포종 및 유방 및 갑상선 악성종양.

상기에 비추어, PPRC 복합체 및 그의 개별 성분은, PPRC의 상류 표적에 지시되는 다른 약물보다 부작용이 적을 약물에 의해 해결될 수 있는 PI3-키나제 경로의 가치있는 하류 약물 표적이다. 따라서, 본 발명은 일반적으로 PI3-키나제를 표적으로 하는, 당업계에 공지된 제약상 활성 화합물 (예를 들어, 2-(4-모르폴리닐)8-페닐크롬 ("LY 294002"))보다 더 선택적인 제약상 활성 화합물의 디자인, 스크리닝, 개발 및 제조에 적합한 약물 표적을 제공한다. 효과기 분자, 즉 RhoC 및 PKN3 및 상기 경로에 관여하는 임의의 또다른 하류 분자의 특정 부분을 제어함으로써, 신호전달 캐스케이드에서 매우 제한된 수의 평행 분지 또는 추가의 상류 표적만이 원치않는 효과를 일으키는 것처럼 보인다. 따라서, 세포 주기, DNA 복구, 아팝토시스, 포도당 수송, 번역과 관련된 PI-3 키나제/PTEN 경로의 다른 활성은 영향받지 않을 것이다. 또한, 인슐린 신호전달은 유도되지 않으며, 이는 당뇨병 반응 또는 LY294002 사용과 관련하여 발견된 다른 부작용이 실제로 방지됨을 의미한다.

PKN3을 코딩하는 핵산의 완전한 서열은 일반적으로 데이타뱅크(databank)에서, 예를 들어 등록번호 NM_013355.3로 입수가능하다. 또한, PKN3의 아미노산 서열은 데이타뱅크에서 등록번호 NP_037487.2로 입수가능하다. RhoC를 코딩하는 핵산의 완전한 서열은 일반적으로 데이타뱅크에서, 예를 들어 등록번호 NM_001042678.1, NM_001042679.1 및 NM_175744.4로 입수가능하다. 또한, RhoC의 아미노산 서열은 데이타뱅크에서 등록번호 NP_001036143.1, NP_001036144.1 및 NP_786886.1로 입수가능하다. 본 발명에서, PKN3 및 RhoC 유도체 또는 이의 절단된 형태는 원하는 효과가 달성될 수 있는 한 본 발명에 따라 사용될 수 있다. 따라서, 유도체화 및 절단의 정도는 당업자가 통상적인 분석으로 결정할 수 있다.

본 발명의 문맥에서, PKN3 및 RhoC를 코딩하는 핵산 서열이란 용어는 또한 전술한 등록번호에 의해 특정된 핵산 서열 또는 전술한 아미노산 서열로부터 유래될 수 있는 임의의 핵산 서열에 혼성화되는 핵산을 포함한다. 이러한 혼성화는 당업자에게 알려져 있다. 이러한 혼성화의 특정설명은 문헌 [Sambrook, J. Fritsch, E. F. and Maniatis, T. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed. Cold Spring Harbor: Cold Spring Harbor Laboratory]로부터 얻을 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 혼성화는 엄격한 조건하, 예를 들어 상기 Sambrook 문헌에 설명된 엄격한 조건하의 혼성화이다.

또한, PKN3 및 RhoC를 코딩하는 핵산은 전술한 임의의 핵산 서열에 상동성인 서열 (서열 상동성 정도는 75, 80, 85, 90 또는 95％임)을 함유하는 핵산 서열이다.

인간 PKN3에 대한 상동체는 특히 엠. 무스쿨루스(M. musculus) 및 알. 노르베기쿠스(R. norvegicus), 에이. 탈리아나(A. thaliana), 씨. 엘레강스(C. elegans), 디. 멜라노가스터(D. melanogaster) 및 에스. 세레비시애(S. cerevisiae)와 같은 진화적으로 다양한 유기체에서 발견될 수 있다. PKN3의 경우, 동일성(％)은 상기 언급한 다양한 종에 대해 각각 67％, 51％, 38％, 36％, 63％ 및 44％이다. 인간 RhoC에 대한 상동체는 마우스, 래트, 애기장대(arabidopsis) 및 초파리(drosophila)에서 각각 100％, 99％, 47％ 및 86％의 동일성(％)으로 발견되었다. 당업자는 이들 또는 다른 상동체(orthologue/homologue)가 원칙적으로 본 발명의 실시에 적합할 것이며, 상기 상동체를 사용하여 생성된 약물 또는 진단제가 인간 PKN3 또는 RhoC 또는 임의의 다른 의도된 PKN3 또는 RhoC와 여전히 상호작용할 수 있음을 이해할 것이다.

PPRC 복합체 및 그의 개별 구성원은 약물 또는 약물 후보물 또는 진단제로서 사용될 수 있는 화학 화합물이 지시되는 표적으로서 사용될 수 있다. 상이한 부류의 화합물에 속하는 적합한 화학 화합물, 예컨대 항체, 펩티드, 안티칼린(anticalin), 압타머(aptamer), 스피겔머(spiegelmer), 리보자임, 안티센스 올리고뉴클레오티드 및 siRNA 뿐만 아니라 작은 유기 분자가 사용될 수 있다. 화합물은 PPRC 복합체 (복합체 자제, 그의 개별 구성원 또는 그의 조합물) 또는 PPRC 복합체와 관련된 정보를 사용하여 디자인되거나, 선택되거나, 스크리닝되거나, 생성되거나 또는 제조될 수 있다.

상기 부류의 화합물을 디자인, 선택, 스크리닝, 생성 또는 제조하는 방법에서, PPRC는 또한 그를 필요로 하는 환자에게 각각의 화합물을 최종 적용하는데 사용되기 보다는 상기 방법에 사용되는 표적으로서 언급될 것이다. 다양한 부류의 화합물을 제공하는 방법에서, 전체 PPRC 복합체, 그의 개별 구성원 또는 다양한 조합물, 또는 PPRC의 단백질 구성성분 중 임의 및 모든 구성성분을 코딩하는 핵산이 사용될 수 있다. 본원에 사용된 용어 "PPRC 복합체 또는 그의 성분"은 PPRC의 임의의 단편 또는 유도체 및 그를 구성하는 구성원을 포함하며, 이로써 약제 또는 진단제로서 사용될 수 있는 상기 화합물의 디자인, 선택, 스크리닝, 생성 또는 제조가 가능해진다.

본원에 사용된 용어 "PPRC 복합체 또는 그의 성분을 코딩하는 핵산"은 PPRC 복합체 또는 그의 단편의 임의의 성분을 코딩하는 핵산을 함유하는 임의의 핵산을 포함할 것이다. PPRC 복합체 또는 그의 성분을 코딩하는 핵산의 일부는, 그것이 약제 또는 진단제로서 사용될 수 있는 상기 화합물의 디자인, 선택, 스크리닝, 생성 또는 제조에 적합한 한 그 자체로 여겨진다. PPRC 복합체 또는 그의 성분을 코딩하는 핵산은 게놈 핵산, hnRNA, mRNA, cDNA 또는 이들 각각의 일부일 수 있다.

상기 약술한 바와 같이, 본원에 기재된 PPRC 복합체 또는 그의 성분 또는 그에 대한 핵산 서열 이외에, 다른 수단 또는 화합물이 PPRC 복합체의 내인성 활성으로부터 발생하는 효과를 생성하거나 억제하기 위해 사용될 수 있다는 것은 본 발명에 속한다. 상기 수단은 스크리닝 방법에서 결정되거나 선택될 수 있다. 상기 스크리닝 방법에서, 제1 단계는 1개 또는 여러개의 소위 후보물 또는 시험 화합물을 제공하는 것이다. 본원에 사용된 후보 화합물은 본원에 기재된 암을 치료하거나 완화시키기 위한 시험계에서 시험되거나 암에 대한 진단 수단 또는 진단제로서 사용되기에 적합한 화합물이다.

후보 화합물이 시험계에서 각 효과를 보여주는 경우, 상기 후보 화합물은 상기 질환 및 질환성 상태의 치료에 적합한 수단 또는 치료제이며, 원칙적으로 상기 질환 및 질환성 상태에 적합한 진단제이다. 제2 단계에서, 후보 화합물은 PPRC 발현계, PPRC 유전자 생성물, PPRC 활성계, 또는 PPRC 복합체 또는 성분과 접촉한다. PPRC 활성계는 또한 본원에서, 예를 들어 PPRC 키나제 활성과 같은 PPRC 복합체의 활성을 검출하는 계로서 언급된다. 일부 실시양태에서, PPRC 복합체의 키나제 활성은, 예를 들어 GPGRRGRRRTSSFAEGG (서열 1)의 서열을 갖는 진단용 GSK3α-유래 단편과 같은 기질의 인산화를 결정함으로써 평가될 수 있다. 하기 표 1은 본 발명의 실시에 유용한 추가의 PPRC 키나제 기질을 나타낸다.

또한, 본원에 기재된 PPRC 스크리닝 방법은 추가 고려사항으로부터 비-기능성 또는 불활성 화합물을 제거하는데 유용하다. 따라서, 대상체 또는 시험계로부터 수득한 제1 샘플에서 PPRC 활성을 측정하여 치료전 수준을 생성할 수 있고, 이어서 시험 화합물을 대상체 또는 시험계에 투여하고 시험 화합물의 투여 후 일정 시간에 대상체 또는 시험계로부터 수득한 제2 샘플에서 PPRC 복합체 또는 그의 개별 성분의 활성을 측정하여 시험 수준에 대한 데이타를 생성할 수 있다. 치료전 수준 (제1 수준)을 시험 수준 (제2 수준)과 비교할 수 있으며, 치료전 수준에 비해 시험 수준에서 감소가 나타나지 않았다는 데이타는 시험 화합물이 대상체에 유효하지 않고 시험제는 추가의 평가 또는 연구에서 배제될 수 있음을 나타낸다. 반대로, 값의 변화는 시험 화합물이 PPRC 억제제로서 또는 추가의 연구에 사용되기에 적합함을 나타낸다.

PPRC 발현계는 기본적으로 임의의 하나 이상의 PPRC 성분 폴리펩티드 (RhoC, PKN3 및 PDK1)의 발현을 보여주거나 디스플레이하여 발현의 정도 또는 수준을 변화시킬 수 있는 발현계이다. PPRC 활성계는 본질적으로 활성 또는 활성 상태 (예컨대, 키나제 활성)를 측정하는 발현계이다.

임의의 상기 계에서, 후보 화합물의 영향하에 PPRC의 활성 또는 PPRC를 코딩하는 핵산의 활성이 후보 화합물의 부재하에서의 상황과 다른지 측정한다. 특정 계가 발현계인지 활성계인지에 관계없이, 활성 및 발현 각각의 증가 또는 감소가 일어날 수 있으며 측정될 수 있음은 본 발명의 범위내에 속한다. 전형적으로, 발현계 또는 활성계는 세포 추출물 또는 세포 추출물의 분획물, 예컨대 핵 추출물과 같은 시험관내 반응이다. 또한, 본원에 사용된 PPRC 발현계는 세포, 바람직하게는 본원에 기재된 질환 및 본원에 기재된 질환성 상태에 관여하는 조직 또는 기관의 세포일 수 있다.

활성계 또는 발현계에 증가 또는 감소가 존재하는지 여부는 각 발현 수준에서, 예를 들어 PPRC 복합체 또는 그의 성분을 코딩하는 핵산, 보다 구체적으로는 mRNA의 양의 증가 또는 감소를 측정하거나, 또는 후보 화합물의 영향하에 발현된 PPRC 복합체 또는 그의 성분의 폴리펩티드의 증가 또는 감소를 측정함으로써 결정할 수 있다. 상기 측정, 보다 구체적으로는 상기 종류의 변화, 예컨대 mRNA 또는 폴리펩티드에 대한 정량적 측정에 필요한 기술은 당업자에게 공지되어 있다. 또한, 예를 들어 적절한 항체를 사용하여 검출함으로써 PPRC 복합체의 폴리펩티드의 양 또는 함량을 결정하는 방법은 당업자에게 공지되어 있다. 항체는, 당업자에게 공지되어 있으며 예를 들어 문헌 [Harlow, E., and Lane, D., "Antibodies: A Laboratory Manual," Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y.,(1988)]에 기재된 바와 같이 생성할 수 있다. 또한, 적합한 항체는 다른 널리 공지된 방법, 예를 들어 항체 라이브러리로부터의 파지 디스플레이 선택에 의해 생성할 수 있다.

PPRC 복합체 발현계의 경우에, PPRC 복합체 활성의 증가 또는 감소는 바람직하게는 기능 검정으로 결정할 수 있다.

후보 화합물과 발현계 및 활성계 각각의 접촉은 통상 후보 화합물의 수용액을 각각의 반응계 (본원에서는 일반적으로 시험계로 지칭됨)에 첨가함으로써 수행된다. 수용액 (완충될 수 있음) 이외에, 유기 용매 또는 유기 용매와 수성 용매의 혼합물 중 후보 화합물의 현탁액 또는 용액이 사용될 수 있다,

일부 실시양태에서, 발현계 및 활성계 각각을 사용하는 각 실행에서, 단지 단일의 후보 화합물만이 사용된다. 그러나, 이러한 종류의 시험 여러개를 당업계에 공지된 방법을 사용하여 고처리계에서 평행으로 수행하는 것 또한 본 발명에 속한다.

본 발명에 따른 방법에서 추가의 단계는, PPRC 복합체 또는 그를 코딩하는 핵산과 관련하여 후보 화합물의 영향하에 발현계 및 활성계 각각의 발현 또는 활성이 변화하는지 여부를 결정하는 것에 있다. 전형적으로, 상기 단계는 후보 (시험) 화합물의 첨가시 계의 반응을 후보 화합물의 미첨가시 계의 반응과 비교함으로써 수행된다. 별법으로, 상기 단계는 후보 화합물의 첨가시 계의 반응을 후보 화합물의 첨가시 비-기능성 PPRC 성분 함유 계, 예를 들어 사멸 키나제 PKN3 함유 계와 비교함으로써 수행될 수 있다. 일부 실시양태에서, 후보 화합물은 화합물 라이브러리의 구성원이다.

일반적으로 임의의 화합물 라이브러리는 화합물의 부류에 상관없이 본 발명의 목적에 적합하다. 특히 적합한 화합물 라이브러리는 소분자, 펩티드, 단백질, 항체, 또는 기능성 핵산으로 구성된 라이브러리이다. 후자의 화합물들은 당업자에게 공지된 바와 같이 생성할 수 있다.

전체로서의 PPRC 복합체 또는 그의 임의의 성분 또는 성분의 조합물 또는 그의 단편에 특이적인 항체의 제조는 당업자에게 공지되어 있다. 본 발명의 항체에는 나노바디, 폴리클로날 항체, 모노클로날 항체, 키메릭 항체 (예를 들어, 인간화 항체) 및 항-이디오타입(idiotypic) 항체가 포함된다. 폴리클로날 항체는 항원으로 면역화된 동물의 혈청으로부터 유래된 항체 분자의 이종 집단이다. 모노클로날 항체는 특이적 항원에 결합하는 항체의 실질적 동종 집단이다. 일반적으로, 항체는 예를 들어 전형적인 하이브리도마 기술 (문헌 [Kohler and Milstein (1975) Nature, 256: 495-499]), 재조합 DNA 방법 (미국특허 제4,816,567호), 또는 항체 라이브러리를 사용하는 파지 디스플레이 (문헌 [Clackson et al. (1991) Nature, 352: 624-628]; [Marks et al. (1991) J. Mol. Biol., 222: 581-597])를 사용하여 제조할 수 있다. 추가의 항체 생성 기법에 대해서는, 문헌 [Antibodies: A Laboratory Manual, eds. Harlow and Lane, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988]을 참조한다. 본 발명은 항체의 임의의 특정 공급원, 항체의 제조 방법, 또는 항체의 다른 특별한 특징에 제한되지 않는다.

용어 "항체"는 또한 무손상(intact) 분자 뿐만 아니라 항원에 결합할 수 있는 단편, 예컨대 Fab, 단일쇄 Fv 항체 (ScFv) 및 소단위 면역약제 (SMIP) 모두를 포함함을 의미한다. Fab 단편은 무손상 항체의 Fc 단편이 결핍되어 순환에서 보다 급속히 제거되며, 무손상 항체보다 덜 비-특이적인 조직 결합을 가질 수 있다 (문헌 [Wahl et al., 1983, J. Nucl. Med. 24:316-325]). 키메릭 항체는 상이한 동물 종으로부터 유래되는 상이한 부분인 분자, 예컨대 예를 들어 뮤린 모노클로날 항체로부터 유래된 가변 영역 (VH, VL) 및 인간 면역글로불린 불변 영역 (CH1-CH2-CH3, CL)을 갖는 분자이다. 키메릭 항체 및 그의 제조 방법은 당업계에 공지되어 있다 (문헌 [Cabilly et al., 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:3273-3277]; [Morrison et al., 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851-6855]; [Boulianne et al., 1984, Nature 312:643-646]; [Cabilly et al., 유럽특허출원 제125023호 (1984년 11월 14일자로 공개됨)]; [Taniguchi et al., 유럽특허출원 제171496호 (1985년 2월 19일자로 공개됨)]; [Morrison et al., 유럽특허출원 제173494호 (1986년 3월 5일자로 공개됨)]; [Neuberger et al., PCT 출원 WO 86/01533 (1986년 3월 13일자로 공개됨)]; [Kudo et al., 유럽특허출원 제184187호 (1986년 6월 11일자로 공개됨)]; [Morrison et al., 유럽특허출원 제173494호 (1986년 3월 5일자로 공개됨)]; [Sahagan et al., 1986, J. Immunol. 137:1066-1074]; [Robinson et al., PCT/US86/02269 (1987년 5월 7일자로 공개됨)]; [Liu et al., 1987, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:3439-3443]; [Sun et al., 1987, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:214-218]; [Better et al., 1988, Science 240:1041-1043]). SMIP는 1개의 결합 도메인, 1개의 힌지(hinge) 도메인 및 1개의 효과기 도메인을 포함하는 단일쇄 폴리펩티드이다. SMIP 및 그의 용도 및 적용은 예를 들어 공개된 미국특허출원 제2003/0118592호, 동 제2003/0133939호, 동 제2004/0058445호, 동 제2005/0136049호, 동 제2005/0175614호, 동 제2005/0180970호, 동 제2005/0186216호, 동 제2005/0202012호, 동 제2005/0202023호, 동 제2005/0202028호, 동 제2005/0202534호, 및 동 제2005/0238646호 및 이들의 관련 특허군 (이들 모두는 그 전문이 본원에 참고로 포함됨)에 개시되어 있다.

본 발명에 따라 사용될 수 있는 항체는 1개 또는 여러개의 마커 또는 라벨을 가질 수 있다. 이러한 마커 또는 라벨은 그의 진단 적용 또는 치료 적용에서 항체를 검출하는데 유용할 수 있다. 바람직하게는, 마커 및 라벨은 아비딘, 스트렙타비딘, 비오틴, 금 및 플루오레세인으로 구성된 군에서 선택되며, 예를 들어 ELISA 방법에 사용된다. 이들 및 추가의 마커 뿐만 아니라 방법은 예를 들어 상기 Harlow 및 Lane의 문헌에 기재되어 있다.

한 실시양태에서, PPRC 항체는 PKN3의 턴 모티프 내 위치 860에서 포스포-트레오닌 (박스표시) (서열 24:

)을 인식하는 PKN3 활성화-상태-특이적 항체를 포함한다. 상기 항체는 특히 증가된 PKN3 발현 및 활성에 대한 프로브로서 및 환자 층별화 및 치료 반응에 대한 바이오마커로서 유용하다.

추가 부류의 약제로서, PPRC를 파괴하는 화합물 뿐만 아니라 PPRC 복합체 또는 그의 성분 및 단편, 또는 상기 PPRC 복합체 또는 그의 성분 및 단편을 코딩하는 핵산을 사용하여 생성될 수 있는 진단제는 그에 결합하는 펩티드이다. 이러한 펩티드는 파지 디스플레이 같은 당업계의 상태에 따른 방법을 사용하여 생성될 수 있다. 기본적으로, 펩티드 라이브러리는 파지의 표면상에서 생성 및 디스플레이되고, 디스플레이된 라이브러리는 표적과, 본 경우에서는 예를 들어 PPRC 복합체 또는 그의 성분과 접촉한다. 상기 표적에 결합한 펩티드는 이후, 바람직하게는 표적 분자와의 복합체로서 각각의 반응으로부터 제거된다. 결합 특성이 최소한 어느 정도까지는 염 농도 등과 같은 특정 실험 설정에 좌우된다는 것은 당업자에게 알려져 있다. 표적 분자에 결합한 상기 펩티드를 보다 높은 친화성 또는 보다 큰 힘으로 라이브러리의 비-결합 구성원으로부터 분리한 후에, 그리고 임의로는 또한 표적 분자를 표적 분자와 펩티드의 복합체로부터 제거한 후에, 이어서 각각의 펩티드(들)을 특성화할 수 있다.

특성화 단계 전에, 예를 들어 펩티드 코딩 파지를 증식시키는 것과 같은 증폭 단계를 임의로 수행할 수 있다. 일부 실시양태에서, 특성화는 표적 결합 펩티드의 서열분석을 포함한다. 기본적으로, 펩티드는 그의 길이가 제한되지 않지만, 일반적으로 약 8 내지 20개 아미노산 길이인 펩티드가 각각의 방법에서 수득된다. 라이브러리의 크기는 약 10² 내지 10¹⁸개 또는 10⁸ 내지 10¹⁵개의 상이한 펩티드일 수 있지만, 라이브러리의 크기는 이에 제한되지 않는다.

본 발명에 따라, PPRC 복합체 또는 그의 성분, 뿐만 아니라 상기 PPRC 복합체 또는 그의 성분을 코딩하는 핵산은 공격성 암의 치료를 위한 약제의 제조 또는 개발 뿐만 아니라 스크리닝 방법에서 상기 공격성 암의 진단을 위한 수단의 제조 또는 개발을 위한 표적으로서 사용될 수 있으며, 이로써 스크리닝 방법에서 소분자 또는 소분자 라이브러리가 사용된다. 이러한 스크리닝은 표적 PPRC 복합체 또는 그의 성분 (표적)을 단일의 소분자 또는 다수의 (예컨대 라이브러리의) 소분자, 바람직하게는 상기 명시한 바와 같은 라이브러리로부터의 소분자와 동시에 또는 순차적으로 접촉시키는 단계, 및 표적에 결합하여 PPRC 복합체의 기능 또는 본상태를 파괴하는 상기 소분자 또는 라이브러리의 구성원 (다른 소분자와 관련하여 스크리닝되는 경우 비-결합 또는 비-상호작용 소분자로부터 분리될 수 있음)을 확인하는 단계를 포함한다.

결합 및 비-결합은 특정 실험 설정에 의해 강하게 영향받을 수 있다. 반응 파라미터의 엄격성을 변형시키는데 있어서, 결합 및 비-결합의 정도를 변화시켜 상기 스크리닝 방법을 미세하게 조율하는 것이 가능하다. 일부 실시양태에서, 표적과 특이적으로 상호작용하는 1개 또는 여러개의 소분자를 확인한 후에, 이러한 소분자를 추가로 특성화할 수 있다. 이러한 추가의 특성화는, 예를 들어 소분자의 확인, 및 그의 분자 구조 및 추가의 물리적, 화학적, 생물학적 또는 의학적 특성의 결정에 있을 수 있다. 일부 실시양태에서, 천연 화합물의 분자량은 약 100 내지 1000 Da이다. 일부 실시양태에서, 소분자는 당업자에게 공지된 레핀스키의 5개 규칙(Lepinski's Rule of Five) (문헌 [Lipinski et al., Adv. Drug. Del. Rev., 23: 3-25, 1997] 참조)에 따르는 것이다. 별법으로, 소분자는 또한 천연 생성물과 반대로, 조합 화학으로부터 발생한 합성-소분자이도록 정의될 수 있다. 그러나, 이러한 정의는 단지 당업계에서 각 용어의 일반적인 이해에 부수적인 것임을 주목해야 한다. 모든 키나제와 마찬가지로, PPRC 복합체의 PKN3 및 PDK1 성분은 ATP-결합 부위를 함유하고, 따라서 이러한 부위에 결합하는 것으로 공지된 약물은 PPRC 기능을 억제하는데 적합한 후보 화합물이다. 적합한 화합물의 예로는 LY-27632, Ro-3 1-8220 및 HA 1077 (이들 모두는 칼바이오켐(Calbiochem) (미국 캘리포니아주 라 졸라 소재)으로부터 입수가능함)이 포함되지만, 이에 제한되지 않는다.

본 발명은 하기 실시예에 의해 추가로 예시되나, 본 발명의 범위가 이로 제한되지는 않는다.

실시예 1: 구조체 및 단백질

플래그- PKN3 단백질: 인간 PKN3의 전장 cDNA (예를 들어, 서열 25 및 서열 26)를 PCR에 의해 증폭시키고, pcDNA3 발현 벡터 (서열 27) (인비트로겐(Invitrogen), 미국 캘리포니아주 칼스배드 소재) 내로 클로닝하였다. 5' 프라이머는 증폭되는 코딩 영역과 함께 프레임 내에 ATG 코돈, 이어서 플래그 에피토프 (서열 28)를 함유하였다. 이 PCR 생성물을 EcoRI 및 XhoI 제한 효소로 소화시키고, 동일한 효소 부위를 통해 pcDNA3 발현 벡터 내로 라이게이션하여 N-말단 플래그 에피토프-태그된 PKN3을 생성하였다. 또한, K588R 치환을 포함하는 사멸 키나제 버젼의 PKN3을 동일한 전략을 사용하여 동일한 벡터 내로 클로닝하였다.

Myc - Rho 단백질: 인간 Rac1 (예를 들어, 서열 29 및 서열 30), RhoA (예를 들어, 서열 31 및 서열 32), RhoB (예를 들어, 서열 32 및 서열 33) 및 RhoC (예를 들어, 서열 35 및 서열 36)의 전장 cDNA를 pCG 포유류 발현 벡터 내로 클로닝하였다 (문헌 [Tanaka and Herr (1990) Cell, 60(3): 375-386] 참조). 5' 프라이머는 증폭되는 코딩 영역과 함께 프레임 내에 ATG 코돈, 이어서 Myc 에피토프 (서열 37)를 함유하였다. 이 PCR 생성물을 NdeI 및 BamHI 제한 효소로 소화시키고, 동일한 효소 부위를 통해 pCG 발현 벡터 내로 라이게이션하여 N-말단 Myc 에피토프-태그된 RhoA, RhoB 및 RhoC를 생성하였다.

실시예 2: 항체 및 세포 용해

항체: p110 항체는 문헌 [Klippel et al, (1994) Mol Cell Biol., 14(4):2675-85]에 기재되어 있다. PKN 항체는 문헌 [Leenders, 2004]에 기재되어 있다. PDK1 항체는 셀 시그널링 테크놀로지, 인크.(Cell Signaling Technology, Inc.) (미국 매사추세츠주 베벌리 소재)에서 시판중이다. 항-포스포-PKN3 T860 래빗 모노클로날 항체를 표준 절차에 따라 생산하였다 (문헌 [Spieker-Polet, 1995, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92:9348-9352] 참조). Myc 에피토프에 대한 항체는, 시판중이며 문헌 [Evan et al., Mol. Cell. Biol., 5:3610-6 (1985)]에 기재되어 있는 9E10 Myc 모노클로날 항체였다.

세포 용해물: 세포를 차가운 포스포페이트-완충 염수 (PBS)로 2회 세척하고, 4℃에서 20 mM 트리스(Tris) (pH 7.5), 137 mM NaCl, 15％ (부피/부피) 글리세롤, 1％ (부피/부피) 노니뎃(Nonidet) P-40 (NP-40), 2 mM 페닐메틸술포닐 플루오라이드, 아프로티닌 10 mg/ml, 20 mM 류펩틴, 2 mM 벤즈아미딘, 1 mM 나트륨 바나데이트, 25 mM β-글리세롤포스페이트, 50 mM NaF, 및 10 mM Na-피로포스페이트를 함유하는 용해 완충액에 용해시켰다. 용해물을 14,000 × g에서 5분 동안 원심분리에 의해 제거하고, 용해물의 분취액을 단백질 발현 및 효소 활성에 대해 분석하였다 (하기 참조). 샘플을 나트륨 도데실 술페이트-폴리아크릴아미드 겔 전기영동 (SDS-PAGE)에 의해 분리하고, 니트로셀룰로스 필터 (슐라이처 앤 슈엘(Schleicher ＆ Schuell))에 옮겼다. 필터를 5％ (중량/부피) 분유를 함유하는 TBST 완충액 (10 mM 트리스-HCl [pH 7.5], 150 mM NaCl, 0.05％ [부피/부피] 트윈(Tween) 20, 0.5％ [중량/부피] 나트륨 아지드)에서 차단시켰다. 각각의 항체를 TBST에 적절한 희석도로 첨가하였다. 결합된 항체를 TBST에서 항-마우스-, 항-고트- 또는 항-래빗-접합된 알칼라인 포스파타제 (산타 크루즈 바이오테크놀로지(Santa Cruz Biotechnology))로 검출하고, 세척하고, 니트로블루 테트라졸륨 및 5-브로모-4-클로로-3-인돌릴포스페이트 (프로메가(Promega))로 전개시켰다. 별법으로, 양고추냉이 퍼옥시다제-접합된 2차 항체를 사용하고, 증진된 화학발광 (아머샴(Amersham))으로 전개시켰다.

실시예 3: 암 세포에서 PKN3 의 발현 프로파일

PKN3 또는 포스포-PKN3 ("P^*-PKN3") 발현 증가가 종양 전이 증가와 관련되어 있음은 공지되어 있다 (문헌 [Leenders et al., Biochem. Biophys. Res. Comm., 261:808-814] 참조). PKN3 및 P^*-PKN3의 발현을 악성종양 잠재성 및 약물 내성의 모델에서 조사하였다.

최소 공격성에서 최대 공격성에 이르는 증가하는 공격성의 유방암 세포주 MCF-10A, MCF7, MDA361, MCF468, BT549 및 MDA231을 PKN3 및 P^*-PKN3 발현에 대해 조사하였다. 도 1은 p110αPI3K, 전체 PKN3 및 포스포-PKN3 (P^*-PKN3 T860)에 대해 탐침된 상기 세포로부터의 추출물의 웨스턴 블롯을 도시한다. 상기 결과로부터, PKN3 및 P^*-PKN T860이 적은 악성종양 잠재성을 갖는 암 세포에서보다 큰 악성종양 잠재성을 갖는 암 세포에서 더 큰 정도로 발현됨을 확인하였다.

항암 약물 게피티닙 (a.k.a. IRESSA; 4-(3-클로로-4-플루오로아닐리노)-7-메톡시-6-(3-모르폴리노-프로폭시)-퀴나졸린)에 대한 최소 내성에서 최대 내성에 이르는 증가하는 내성의 비소세포 폐암 (NSCLC) 세포주 H1650, H1975, A549, PC14, H157 및 H460 세포를 PKN3 및 P^*-PKN3 발현에 대해 조사하였다 (문헌 [Noro et al., (2006) BMC Cancer, 6: 277-289] 참조). 도 2는 (a) p110αPI3K, (b) 전체 PKN3 및 (c) P^*-PKN3 T718에 대해 탐침된 상기 세포로부터의 추출물의 웨스턴 블롯을 도시한다. 상기 결과로부터, PKN3 및 P^*-PKN T860이 항암 약물에 대해 큰 감수성을 갖는 암 세포에서보다 항암 약물에 대해 큰 내성을 갖는 암 세포에서 더 큰 정도로 발현됨을 확인하였다.

실시예 4: 내인성 PKN3 과의 PPRC 복합체 형성

Myc-태그된 소형 GTP아제(GTPase) Rac1, RhoA, RhoB 또는 RhoC로 형질감염된 세포를 사용하는 면역침전 실험은 RhoC가 인산화된 PKN3에 우선적으로 결합함을 나타내었다 (도 3, 패널 B). 헬라 세포 (5x10⁵ 세포/10 cm 조직 배양 접시)를 푸젠(FUGENE)? 형질감염 시약 (로슈 다이아그노스틱스(Roche Diagnostics), 미국 인디애나주 인디애나폴리스 소재)에 의해 지시된 플라스미드로 단독 형질감염시켰다. 단백질 G 세파로스와 접합된 Myc에 대한 9E10 항체를 사용하여 면역침전을 수행하였다. 면역복합체를 용해 완충액으로 3회 세척하였다. 결합된 단백질을 항-P^*-PKN3 T860 항체를 사용하여 웨스턴 블롯에 의해 분석하였다.

이 실험은 내인성 P^*-PKN3이 소형 GTP아제 RhoC와 우선적으로 결합함을 나타낸다.

실시예 5: 이종 PKN3 과의 PPRC 복합체 형성

플래그-태그된 PKN3 및 Myc-태그된 소형 GTP아제 RhoA, RhoB 또는 RhoC로 형질감염된 HEK293T 세포를 사용하는 면역침전 실험은 PKN3이 포스포이노시티드-의존성 키나제-1 (PDK1) 및 RhoC에 결합함을 나타냈다. 도 4B는 PKN3의 키나제-활성 형태가 RhoC 및 PDK1에 우선적으로 결합함을 나타낸다. 따라서, PKN3, RhoC 및 PDK1은 삼원 복합체 ("PPRC 복합체")를 형성한다.

플래그를 이용한 면역침전의 경우 (도 4B), HEK293T 세포 (5x10⁵ 세포/10 cm 조직 배양 접시)를 푸젠? 형질감염 시약에 의해 지시된 플라스미드 (플래그-PKN3wt [활성 전장 키나제], 플래그-PKN3kd [사멸 키나제 PKN3], Myc-RhoA, Myc-RhoB 또는 Myc-RhoC)로 단독 형질감염시키거나 공동 형질감염시켰다. 5％ CO₂ 인큐베이터 내 37℃에서 6시간 인큐베이션한 후, 세포를 혈청-무함유 둘베코 개질 이글스 배지(Dulbecco's modified Eagle's medium) (DMEM)에서 2회 세척하고, 추가 48시간의 인큐베이션 동안 신선한 배지 (DMEM, 10％ 태아 소 혈청)를 세포에 첨가하였다. 세포를 포스페이트-완충 염수 (PBS)로 세척하고, 얼음 상에서 30분 동안 0.5 ml의 용해 완충액 (50 mM 트리스-HCl [pH 7.5], 150 mM NaCl, 10 mM ß-글리세롤포스페이트, 10％ 글리세롤, 1％ 트리톤 X-100, 1 mM Na₃VO₄, 1 mM NaF, 및 전립선 억제제 [로슈 몰레큘라 바이오케미칼즈(Roche Molecular Biochemicals)]에 용해시켰다. 세포 용해물을 14,000 rpm에서 30분 동안 원심분리하고, 회전된(spun) 용해물로부터의 상청액을 항-플래그 M2 친화성 수지 (시그마(Sigma))와 함께 4℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 이어서, 비드를 TBS 완충액 (50 mM 트리스-HCl [pH 7.5], 150 mM NaCl)으로 3회 세척하고, 결합된 단백질을 10％ 글리세롤, 1 mM DTT 및 플래그 펩티드 (시그마) 200 μg/ml를 함유하는 TBS 완충액으로 용출시켰다. 결합된 생성물을 웨스턴 블롯 분석으로 가시화하였다 (도 4).

실시예 6: PPRC 복합체 키나제 활성

PPRC 복합체의 효소 활성을 (i) PPRC 복합체의 PKN3 성분의 인산화 상태, 및 (ii) 기질, 즉 서열 GPGRRGRRRTSSFAEGG (서열 1)를 갖는 GSK3α-유래 단편에 대한 PPRC의 키나제 활성을 평가함으로써 조사하였다.

플래그-태그된 PKN3 및 Myc-태그된 소형 GTP아제 RhoA, RhoB 또는 RhoC로 형질감염된 PC3 세포를 사용하는 면역침전 실험은 PKN3이 포스포이노시티드-의존성 키나제-1 (PDK1) 및 RhoC에 결합함을 나타냈다. 도 5B는 키나제 활성이 PKN3 단독 또는 PKN3과 RhoC 조합의 경우보다 PPRC 복합체에 대해 가장 크다는 것을 나타낸다.

플래그-면역침전 후 키나제 검정 동안, PC3 세포 (5x10⁵ 세포/10 cm 조직 배양 접시)를 상기 기재된 바와 같이 푸젠? 형질감염 시약에 의해 지시된 플라스미드로 단독 형질감염시키거나 공동 형질감염시켰다. 세포를 포스페이트-완충 염수 (PBS)로 세척하고, 세척 용액 (20 mM 트리스-HCl (pH 7.5), 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 5 mM MgCl₂, 1 μM 오카다산(okadaic acid), 10 mM 글리세롤포스페이트, 25 mM 나트륨 플루오라이드, 5 mM 나트륨 피로포스페이트, 0.2 mM PMSF, 및 2 mM DTT) 중 0.3％ 트리톤 X-100에 용해시켰다. 항-플래그 M2 친화성 수지 (시그마)로 면역침전을 수행하였다. 면역복합체를 0.5 M NaCl을 함유하는 상기 완충액으로 3회 세척하고, β-글리세롤포스페이트 및 10 mM 나트륨 피로포스페이트를 함유하는 키나제 완충액 (20 mM 트리스-HCl (pH 7.5), 10 mM MgCl₂, 1 mM EDTA, 및 1 mM 오카다산)으로 2회 세척하였다. 마지막으로, 복합체를 키나제 완충액에 현탁시키고, 50 μM ATP 및 PKN3 기질과 함께 실온에서 15분 동안 인큐베이션하였다. 인산화 단백질을 SDS-폴리아크릴아미드 겔 상에서 분리하고, 웨스턴 블롯팅으로 가시화하였다.

실시예 7: 생체내 전립선암 모델

PC-3 (전립선암) 세포를, PKN3 및 p110β를 표적으로 하는 shRNA를 발현하도록 처리하였다. 독시사이클린 (독스)-유도된 shRNA 발현은 72시간 후 PKN3 및 p110β 단백질 수준의 효율적인 넉다운(knockdown)을 초래하였다 (도 6A). PKN3 및 p110β의 억제는 상피-중배엽 전이 (EMT)에 대해 널리 공지된 마커인 비멘틴 단백질 수준의 감소를 초래하였다 (도 6A). 각각의 세포 집단을 마트리겔 상에 시딩하고, shRNA-매개된 PKN3 발현 넉다운을 갖는 세포는 세포외 매트릭스 상에서 손상된 성장을 나타냈다. p110β가 PC-3 세포에서 우세한 PI3K 서브유닛을 나타내기 때문에, p110β의 억제는 또한 PC-3 세포의 마트리겔 성장을 방해하였으며, 양성 대조군으로서의 역할을 하였다 (도 6B).

이어서, 안정한 PKN3 shRNA PC-3 세포를 누드 마우스에 전립선내 이식하였다. 동물을 두 군으로 나누어, 제1 군은 독스로 처리하여 shRNA 발현을 유도하고, 제2 군은 모의 처리하였다. 49일 후, 마우스를 살생시키고, 1차 종양 형성 및 림프절 전이에 대해 분석하였다. 독스-처리한 마우스 군은 1차 종양 성장에 대해 강한 효과를 보여주었으며, 전이 형성 또한 강력하게 억제되었다 (도 7A).

또한, PKN3을 확립된 전립선 종양에서 확인하였다. 이 실험에서, 모든 동물을 4주 동안 정상 식이하에 유지시켜 세포가 1차 종양을 형성하도록 한 후 PKN3을 독스 식이에 의해 침묵시켰다. 정상 식이 4주 후, PKN3의 억제는 확립된 종양 모델에서 종양 성장 및 전이를 방해하였다 (도 7B).

실시예 8: 생체내 유방암 모델

MDA-MB-231 (유방암) 세포를, PKN3, p110β 및 CKIε를 표적으로 하는 shRNA를 발현하도록 처리하였다. 독스-유도된 shRNA 발현은 72시간 후 PKN3, p110β 및 CKIε 단백질 수준의 효율적인 넉다운을 초래하였다 (도 8A). 각각의 세포 집단을 마트리겔에 시딩하고, shRNA-매개된 PKN3 발현 넉다운을 갖는 세포는 세포외 매트릭스에서 손상된 성장을 나타내었으며, 이는 p110β의 넉다운보다 강력한 것처럼 보였다. 따라서, 이 실험에서 CKIε의 유도된 억제는 MDA-MB-231 세포에 아무런 영향을 미치지 않았으며, 독스 처리 및 shRNA 유도에 대한 대조군으로서의 역할을 하였다 (도 8B).

유방암에서 PKN3의 생체내 확인을 수행한 것과 동일하게 처리된 세포주를 사용하여 정위형 유방암 모델을 생성하였다. 안정한 PKN3 shRNA MDA-MB-231 세포를 독스의 부재하에 성장시키고, 동물의 유방 지방 패드내로 주사하였다. 동물을 두 군으로 나누었다: 제1 군은 독스로 처리하여 shRNA 발현을 유도하고, 제2 군은 모의 처리하였다. 종양의 크기를 55일까지 매주 측정하였다. 독스-처리된 마우스 군은 도 9에 도시된 바와 같이 유방 종양 성장에 대한 강한 효과를 나타냈다.

SEQUENCE LISTING <110> Wyeth <120> A PDK3/RhoC Macromolecular Complex and Methods of Use Therefor <130> PC66260A <150> 61/159739 <151> 2009-03-12 <150> 61/226078 <151> 2009-03-12 <160> 37 <170> PatentIn version 3.4 <210> 1 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Gly Pro Gly Arg Arg Gly Arg Arg Arg Thr Ser Ser Phe Ala Glu Gly 1 5 10 15 Gly <210> 2 <211> 30 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Arg Arg Ala Ile Pro Thr Val Asn His Ser Gly Thr Phe Ser Pro Gln 1 5 10 15 Ala Pro Val Pro Thr Thr Val Pro Val Val Asp Val Arg Ile 20 25 30 <210> 3 <211> 33 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 Lys Glu Gly Met Gly Tyr Gly Asp Arg Thr Ser Thr Phe Cys Gly Thr 1 5 10 15 Pro Glu Phe Leu Ala Pro Glu Val Leu Thr Glu Thr Ser Tyr Thr Arg 20 25 30 Ala <210> 4 <211> 13 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Arg Arg Gly Pro Ser Pro Pro Ala Ser Pro Thr Arg Lys 1 5 10 <210> 5 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 5 Lys Gly Cys Pro Arg Thr Pro Thr Thr Leu Arg Glu 1 5 10 <210> 6 <211> 26 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 6 Lys Gly Cys Pro Arg Thr Pro Thr Thr Leu Arg Glu Ala Ser Asp Pro 1 5 10 15 Ala Thr Pro Ser Asn Phe Leu Pro Lys Lys 20 25 <210> 7 <211> 33 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 7 Lys Glu Gly Ile Gly Phe Gly Asp Arg Thr Ser Thr Phe Cys Gly Thr 1 5 10 15 Pro Glu Phe Leu Ala Pro Glu Val Leu Thr Gln Glu Ala Tyr Thr Arg 20 25 30 Ala <210> 8 <211> 31 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 8 Lys Glu Arg Pro Ile Ser Met Ile Asn Glu Ala Ser Asn Tyr Asn Val 1 5 10 15 Thr Ser Asp Tyr Ala Val His Pro Met Ser Pro Val Gly Arg Thr 20 25 30 <210> 9 <211> 18 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 9 Arg Thr Asn Pro Pro Thr Gln Lys Pro Pro Ser Pro Pro Met Ser Gly 1 5 10 15 Arg Gly <210> 10 <211> 27 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 10 Lys Lys Glu Glu Glu Asn Ala Asp Ser Asp Asp Glu Gly Glu Leu Gln 1 5 10 15 Asp Leu Leu Ser Gln Asp Trp Arg Val Lys Gly 20 25 <210> 11 <211> 25 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 11 Arg Thr Ser Ser Pro Arg Ser Pro Pro Ser Ser Ser Glu Ile Phe Thr 1 5 10 15 Pro Ala His Glu Glu Asn Val Arg Phe 20 25 <210> 12 <211> 29 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 12 Lys Phe Ile Val Leu Asn Ser Leu Asn Gln Asn Ala Lys Pro Glu Gly 1 5 10 15 Pro Glu Gln Ala Glu Leu Gly Arg Leu Ser Pro Arg Ala 20 25 <210> 13 <211> 20 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 13 Lys Gly Gly Gly Gly Tyr Thr Cys Gln Ser Gly Ser Gly Trp Asp Glu 1 5 10 15 Phe Thr Lys His 20 <210> 14 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 14 Arg Leu Thr Glu Gly Cys Ser Phe Arg Arg 1 5 10 <210> 15 <211> 27 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 15 Arg Thr Asn Thr Asn Val Asn Cys Pro Ile Glu Cys Phe Met Pro Leu 1 5 10 15 Asp Val Gln Ala Asp Arg Glu Asp Ser Arg Glu 20 25 <210> 16 <211> 20 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 16 Lys Leu Pro Val Gly Ser Gln Cys Ser Val Asp Leu Glu Ser Ala Ser 1 5 10 15 Gly Glu Lys Asp 20 <210> 17 <211> 13 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 17 Lys Ile Glu Asp Ser Glu Glu Asn Gly Val Phe Lys Tyr 1 5 10 <210> 18 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 18 Lys Ala Ala Arg Glu Tyr Glu Asp Pro Pro Ser Glu Glu Glu Asp Lys 1 5 10 15 Ile <210> 19 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 19 Lys Phe Ile Ile Pro Gly Ser Pro Ala Ile Ile Ser Ile Arg Gln 1 5 10 15 <210> 20 <211> 35 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 20 Lys Asp Ser Leu Ser Val Ser Ser Asn Asp Ala Ser Pro Pro Ala Ser 1 5 10 15 Val Ala Ser Leu Gln Pro His Met Ile Gly Ala Gln Ser Ser Pro Gly 20 25 30 Pro Lys Arg 35 <210> 21 <211> 18 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 21 Arg Arg Ser Thr Gln Gly Val Thr Leu Thr Asp Leu Lys Glu Ala Glu 1 5 10 15 Lys Ala <210> 22 <211> 33 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 22 Lys Glu Phe Gly Ser Met Val Leu Glu Leu Asn Ala Ser Asp Asp Arg 1 5 10 15 Gly Ile Asp Ile Ile Arg Gly Pro Ile Leu Ser Phe Ala Ser Thr Arg 20 25 30 Thr <210> 23 <211> 21 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 23 Lys Glu Ser Lys Asp Lys Pro Glu Ile Glu Asp Val Gly Ser Asp Glu 1 5 10 15 Glu Glu Glu Lys Lys 20 <210> 24 <211> 28 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 24 Tyr Phe Glu Gly Glu Phe Thr Gly Leu Pro Pro Ala Leu Thr Pro Pro 1 5 10 15 Ala Pro His Ser Leu Leu Thr Ala Arg Gln Gln Ala 20 25 <210> 25 <211> 3385 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 25 ggctcccgcg ggcgcgcggc ggggaaggcc agaggacctg ggcgcgggcg atgtgcctcc 60 tgagcgtcca aaccgggggt gaggcgcggt cacgcccagc gggaaccgca ggcgccgaag 120 cccgggtact gggcccagaa tcccgcggaa ttttggatcc gagggaggcg ctggggcgcg 180 ggacctcggg cgtggggtcc cgggcgctgg atcggcgcgg acgggaggcg gcgctggtcc 240 cgcgggccag cgggtctcgg gagggggcgc ccgatcccgc gtctccggcg ccgcttcccg 300 ggaagtttca agtttgaaag tcctggcgga gggtctgcgg cttccgggac cggagtggct 360 gagaggaggg ccccaagcgg ccggagcggc gccatggagg agggggcgcc gcggcagcct 420 gggccgagcc agtggccccc agaggatgag aaggaggtga tccgccgggc catccagaaa 480 gagctgaaga tcaaggaggg ggtggagaac ctgcggcgcg tggccacaga ccgccgccac 540 ttgggccatg tgcagcagct gctgcggtcc tccaaccgcc gcctggagca gctgcatggc 600 gagctgcggg agctgcacgc ccgaatcctg ctgcccggcc ctgggcctgg cccagctgag 660 cctgtggcct caggaccccg gccgtgggca gagcagctca gggctcggca cctagaggct 720 ctccggaggc agctgcatgt ggagctgaag gtgaagcagg gggctgagaa catgacccac 780 acgtgcgcca gtggcacccc caaggagagg aagctcctgg cagctgccca gcagatgctg 840 cgggacagcc agctgaaggt ggccctgctg cggatgaaga tcagcagcct ggaggccagt 900 gggtccccgg agccagggcc tgagctgctg gcggaggagc tacagcatcg actgcacgtt 960 gaggcagctg tggctgaggg cgccaagaac gtggtgaaac tgcttagtag ccggagaaca 1020 caggaccgca aggcactggc tgaggcccag gcccagctac aggagtcctc tcagaaactg 1080 gacctcctgc gcctggcctt ggagcagctg ctggagcaac tgcctcctgc ccaccctttg 1140 cgcagcagag tgacccgaga gttgcgggct gcggtgcctg gataccccca gccttcaggg 1200 acacctgtga agcccaccgc cctaacaggg acactgcagg tccgcctcct gggctgtgaa 1260 cagttgctga cagccgtgcc tgggcgctcc ccagcggccg cactggccag cagcccctcc 1320 gagggctggc ttcggaccaa ggccaagcac cagcgtggcc gaggcgagct tgccagcgag 1380 gtgctggctg tgctaaaggt ggacaaccgt gttgtggggc agacgggctg ggggcaggtg 1440 gccgaacagt cctgggacca gacctttgtc atcccactgg agcgagcccg tgagctggag 1500 attggggtac actggcggga ctggcggcag ctatgtggcg tggccttcct gagacttgag 1560 gacttcctgg acaatgcctg tcaccaactg tccctcagcc tggtaccgca gggactgctt 1620 tttgcccagg tgaccttctg cgatcctgtc attgagaggc ggccccggct gcagaggcag 1680 gaacgcatct tctctaaacg cagaggccag gacttcctga gggcttcgca gatgaacctc 1740 ggcatggcgg cctgggggcg cctcgtcatg aacctgctgc ccccctgcag ctccccgagc 1800 acaatcagcc cccctaaagg atgccctcgg accccaacaa cactgcgaga ggcctctgac 1860 cctgccactc ccagtaattt cctgcccaag aagaccccct tgggtgaaga gatgacaccc 1920 ccacccaagc ccccacgcct ctacctcccc caggagccaa catccgagga gactccgcgc 1980 accaaacgtc cccatatgga gcctaggact cgacgtgggc catctccacc agcctccccc 2040 accaggaaac cccctcggct tcaggacttc cgctgcttag ctgtgctggg ccggggacac 2100 tttgggaagg tcctcctggt ccagttcaag gggacaggga aatactacgc catcaaagca 2160 ctgaagaagc aggaggtgct cagccgggac gagatagaga gcctgtactg cgagaagcgg 2220 atcctggagg ctgtgggctg cacagggcac cctttcctgc tctccctcct tgcctgcttc 2280 cagacctcca gccatgcctg ctttgtgact gagtttgtgc ctggtggtga cctcatgatg 2340 cagatccacg aggatgtctt ccccgagccc caggcccgct tctacgtggc ttgtgttgtc 2400 ctggggctgc agttcttaca cgagaagaag 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aaagatacca 3780 ggcgtttccc cctggaagct ccctcgtgcg ctctcctgtt ccgaccctgc cgcttaccgg 3840 atacctgtcc gcctttctcc cttcgggaag cgtggcgctt tctcaatgct cacgctgtag 3900 gtatctcagt tcggtgtagg tcgttcgctc caagctgggc tgtgtgcacg aaccccccgt 3960 tcagcccgac cgctgcgcct tatccggtaa ctatcgtctt gagtccaacc cggtaagaca 4020 cgacttatcg ccactggcag cagccactgg taacaggatt agcagagcga ggtatgtagg 4080 cggtgctaca gagttcttga agtggtggcc taactacggc tacactagaa ggacagtatt 4140 tggtatctgc gctctgctga agccagttac cttcggaaaa agagttggta gctcttgatc 4200 cggcaaacaa accaccgctg gtagcggtgg tttttttgtt tgcaagcagc agattacgcg 4260 cagaaaaaaa ggatctcaag aagatccttt gatcttttct acggggtctg acgctcagtg 4320 gaacgaaaac tcacgttaag ggattttggt catgagatta tcaaaaagga tcttcaccta 4380 gatcctttta aattaaaaat gaagttttaa atcaatctaa agtatatatg agtaaacttg 4440 gtctgacagt taccaatgct taatcagtga ggcacctatc tcagcgatct gtctatttcg 4500 ttcatccata gttgcctgac tccccgtcgt gtagataact acgatacggg agggcttacc 4560 atctggcccc agtgctgcaa tgataccgcg agacccacgc tcaccggctc cagatttatc 4620 agcaataaac cagccagccg gaagggccga gcgcagaagt ggtcctgcaa ctttatccgc 4680 ctccatccag tctattaatt gttgccggga agctagagta agtagttcgc cagttaatag 4740 tttgcgcaac gttgttgcca ttgctacagg catcgtggtg tcacgctcgt cgtttggtat 4800 ggcttcattc agctccggtt cccaacgatc aaggcgagtt acatgatccc ccatgttgtg 4860 caaaaaagcg gttagctcct tcggtcctcc gatcgttgtc agaagtaagt tggccgcagt 4920 gttatcactc atggttatgg cagcactgca taattctctt actgtcatgc catccgtaag 4980 atgcttttct gtgactggtg agtactcaac caagtcattc tgagaatagt gtatgcggcg 5040 accgagttgc tcttgcccgg cgtcaatacg ggataatacc gcgccacata gcagaacttt 5100 aaaagtgctc atcattggaa aacgttcttc ggggcgaaaa ctctcaagga tcttaccgct 5160 gttgagatcc agttcgatgt aacccactcg tgcacccaac tgatcttcag catcttttac 5220 tttcaccagc gtttctgggt gagcaaaaac aggaaggcaa aatgccgcaa aaaagggaat 5280 aagggcgaca cggaaatgtt gaatactcat actcttcctt tttcaatatt attgaagcat 5340 ttatcagggt tattgtctca tgagcggata catatttgaa tgtatttaga aaaataaaca 5400 aataggggtt ccgcgcacat ttccccgaaa agtgccacct gacgtc 5446 <210> 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1560 agatttacac tacattgtac aaggaatgaa agtgtcacgg gtaaaaactc taaaaggtta 1620 atttctgtca aatgcagtag atgatgaaag aaaggttggt attatcagga aatgttttct 1680 taagcttttc ctttctctta cacctgccat gcctccccaa attgggcatt taattcatct 1740 ttaaactggt tgttctgtta gtcgctaact tagtaagtgc ttttcttata gaaccccttc 1800 tgactgagca atatgcctcc ttgtattata aaatctttct gataatgcat tagaaggttt 1860 ttttgtcgat tagtaaaagt gctttccatg ttactttatt cagagctaat aagtgctttc 1920 cttagttttc tagtaactag gtgtaaaaat catgtgttgc agctttatag tttttaaaat 1980 attttagata attcttaaac tatgaacctt cttaacatca ctgtcttgcc agattaccga 2040 cactgtcact tgaccaatac tgaccctctt tacctcgccc acgcggacac acgcctcctg 2100 tagtcgcttt gcctattgat gttcctttgg gtctgtgagg ttctgtaaac tgtgctagtg 2160 ctgacgatgt tctgtacaac ttaactcact ggcgagaata cagcgtggga cccttcagcc 2220 actacaacag aattttttaa attgacagtt gcagaattgt ggagtgtttt tacattgatc 2280 ttttgctaat gcaattagca ttatgttttg catgtatgac ttaataaatc cttgaatcat 2340 a 2341 <210> 30 <211> 192 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 30 Met Gln Ala Ile Lys Cys Val Val Val Gly Asp Gly Ala Val Gly Lys 1 5 10 15 Thr Cys Leu Leu Ile Ser Tyr Thr Thr Asn Ala Phe Pro Gly Glu Tyr 20 25 30 Ile Pro Thr Val Phe Asp Asn Tyr Ser Ala Asn Val Met Val Asp Gly 35 40 45 Lys Pro Val Asn Leu Gly Leu Trp Asp Thr Ala Gly Gln Glu Asp Tyr 50 55 60 Asp Arg Leu Arg Pro Leu Ser Tyr Pro Gln Thr Asp Val Phe Leu Ile 65 70 75 80 Cys Phe Ser Leu Val Ser Pro Ala Ser Phe Glu Asn Val Arg Ala Lys 85 90 95 Trp Tyr Pro Glu Val Arg His His Cys Pro Asn Thr Pro Ile Ile Leu 100 105 110 Val Gly Thr Lys Leu Asp Leu Arg Asp Asp Lys Asp Thr Ile Glu Lys 115 120 125 Leu Lys Glu Lys Lys Leu Thr Pro Ile Thr Tyr Pro Gln Gly Leu Ala 130 135 140 Met Ala Lys Glu Ile Gly Ala Val Lys Tyr Leu Glu Cys Ser Ala Leu 145 150 155 160 Thr Gln Arg Gly Leu Lys Thr Val Phe Asp Glu Ala Ile Arg Ala Val 165 170 175 Leu Cys Pro Pro Pro Val Lys Lys Arg Lys Arg Lys Cys Leu Leu Leu 180 185 190 <210> 31 <211> 1926 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 31 gtggatgagc tgtgagtgcg cgcgcgtgcg cggggccgcg acctgtgccg gctcgagccc 60 gctgggcact cggaggcgcg cacgtcgttc cccgccctcc cgccgccgcc cgccctcgct 120 ctctcgcgct accctcccgc cgcccgcggt cctccgtcgg ttctctcgtt agtccacggt 180 ctggtcttca gctacccgcc ttcgtctccg agtttgcgac tcgcggaccg gcgtccccgg 240 cgcgaagagg ctggactcgg attcgttgcc tgagcaatgg ctgccatccg gaagaaactg 300 gtgattgttg gtgatggagc ctgtggaaag acatgcttgc tcatagtctt cagcaaggac 360 cagttcccag aggtgtatgt gcccacagtg tttgagaact atgtggcaga tatcgaggtg 420 gatggaaagc aggtagagtt ggctttgtgg gacacagctg ggcaggaaga ttatgatcgc 480 ctgaggcccc tctcctaccc agataccgat gttatactga tgtgtttttc catcgacagc 540 cctgatagtt tagaaaacat cccagaaaag tggaccccag aagtcaagca tttctgtccc 600 aacgtgccca tcatcctggt tgggaataag aaggatcttc ggaatgatga gcacacaagg 660 cgggagctag ccaagatgaa gcaggagccg gtgaaacctg aagaaggcag agatatggca 720 aacaggattg gcgcttttgg gtacatggag tgttcagcaa agaccaaaga tggagtgaga 780 gaggtttttg aaatggctac gagagctgct ctgcaagcta gacgtgggaa gaaaaaatct 840 gggtgccttg tcttgtgaaa ccttgctgca agcacagccc ttatgcggtt aattttgaag 900 tgctgtttat taatcttagt gtatgattac tggccttttt catttatcta taatttacct 960 aagattacaa atcagaagtc atcttgctac cagtatttag aagccaacta tgattattaa 1020 cgatgtccaa cccgtctggc ccaccagggt ccttttgaca ctgctctaac agccctcctc 1080 tgcactccca cctgacacac caggcgctaa ttcaaggaat ttcttaactt cttgcttctt 1140 tctagaaaga gaaacagttg gtaacttttg tgaattaggc tgtaactact ttataactaa 1200 catgtcctgc ctattatctg tcagctgcaa ggtactctgg tgagtcacca cttcagggct 1260 ttactccgta acagattttg ttggcatagc tctggggtgg gcagtttttt gaaaatgggc 1320 tcaaccagaa aagcccaagt tcatgcagct gtggcagagt tacagttctg tggtttcatg 1380 ttagttacct tatagttact gtgtaattag tgccacttaa tgtatgttac caaaaataaa 1440 tatatctacc ccagactaga tgtagtattt tttgtataat tggatttcct aatactgtca 1500 tcctcaaaga aagtgtattg gttttttaaa aaagaaagtg tatttggaaa taaagtcaga 1560 tggaaaattc attttttaaa ttcccgtttt gtcacttttt ctgataaaag atggccatat 1620 tacccctttt cggccccatg tatctcagta ccccatggag ctgggctaag taaataggaa 1680 ttggtttcac gcctgaggca attagacact ttggaagatg gcataacctg tctcacctgg 1740 acttaagcat ctggctctaa ttcacagtgc tcttttctcc tcactgtatc caggttccct 1800 cccagaggag ccaccagttc tcatgggtgg cactcagtct ctcttctctc cagctgacta 1860 aacttttttt ctgtaccagt taatttttcc aactactaat agaataaagg cagttttcta 1920 aaaaaa 1926 <210> 32 <211> 193 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 32 Met Ala Ala Ile Arg Lys Lys Leu Val Ile Val Gly Asp Gly Ala Cys 1 5 10 15 Gly Lys Thr Cys Leu Leu Ile Val Phe Ser Lys Asp Gln Phe Pro Glu 20 25 30 Val Tyr Val Pro Thr Val Phe Glu Asn Tyr Val Ala Asp Ile Glu Val 35 40 45 Asp Gly Lys Gln Val Glu Leu Ala Leu Trp Asp Thr Ala Gly Gln Glu 50 55 60 Asp Tyr Asp Arg Leu Arg Pro Leu Ser Tyr Pro Asp Thr Asp Val Ile 65 70 75 80 Leu Met Cys Phe Ser Ile Asp Ser Pro Asp Ser Leu Glu Asn Ile Pro 85 90 95 Glu Lys Trp Thr Pro Glu Val Lys His Phe Cys Pro Asn Val Pro Ile 100 105 110 Ile Leu Val Gly Asn Lys Lys Asp Leu Arg Asn Asp Glu His Thr Arg 115 120 125 Arg Glu Leu Ala Lys Met Lys Gln Glu Pro Val Lys Pro Glu Glu Gly 130 135 140 Arg Asp Met Ala Asn Arg Ile Gly Ala Phe Gly Tyr Met Glu Cys Ser 145 150 155 160 Ala Lys Thr Lys Asp Gly Val Arg Glu Val Phe Glu Met Ala Thr Arg 165 170 175 Ala Ala Leu Gln Ala Arg Arg Gly Lys Lys Lys Ser Gly Cys Leu Val 180 185 190 Leu <210> 33 <211> 2384 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 33 atctgccacc gcagtctggt tggagctgtt gtcttgtatg ctcagcgagg cccggagaga 60 cccgggagag agctaggccg agtccaccgc ccgagtctgc tgcccgagcc cgcgttacgc 120 acaaagccgc cgatccccgg cctggggtga gcagagcgac caccgcccgg gagcagcgcg 180 gcgagacgca cggtgcgccc tatgcccccg cgcccccacc gcccccgccg cggcagccga 240 agcgcagcga gagaacgcgc caccgcgggg cccgggtgca gctagcgacc ctctcgccac 300 ctgcgcgcag cccgaggtga gcagtgagcg gcgagcggga gggcagcgag gcgttcgcgg 360 gccccctcct gctgcccggg cccggcccgc tcatggcggc catccgcaag aagctggtgg 420 tggtgggcga cggcgcgtgt ggcaagacgt gcctgctgat cgtgttcagt aaggacgagt 480 tccccgaggt gtacgtgccc accgtcttcg agaactatgt ggccgacatt gaggtggacg 540 gcaagcaggt ggagctggcg ctgtgggaca cggcgggcca ggaggactac gaccgcctgc 600 ggccgctctc ctacccggac accgacgtca ttctcatgtg cttctcggtg gacagcccgg 660 actcgctgga gaacatcccc gagaagtggg tccccgaggt gaagcacttc tgtcccaatg 720 tgcccatcat cctggtggcc aacaaaaaag acctgcgcag cgacgagcat gtccgcacag 780 agctggcccg catgaagcag gaacccgtgc gcacggatga cggccgcgcc atggccgtgc 840 gcatccaagc ctacgactac ctcgagtgct ctgccaagac caaggaaggc gtgcgcgagg 900 tcttcgagac ggccacgcgc gccgcgctgc agaagcgcta cggctcccag aacggctgca 960 tcaactgctg caaggtgcta tgagggccgc gcccgtcgcg cctgcccctg ccggcacggc 1020 tccccctcct ggaccagtcc cccgcgagcc cggagaaggg gagacccgtg tcccacaagg 1080 accccaccgg cctgcctggc atctgtctgc tgacgcctct ggcttgcgcc aggacttggc 1140 gtgggcaccg ggcgccccca tcccagtgtc tgtgtgcgtc cagctgtgtt gcacaggcct 1200 gggctcccca ctgagtgcca agggtcccct gagcatgctt ttctgaagag ccgggcctca 1260 gagtgtgtgg ctgtgtgtct gttcgactcc cctcgcccca ttttcacccc acccccgcct 1320 ctgatccccg ggggcgagat tggcgcggga gtgtggccgc gccccatcag atgttctccc 1380 ttcaccagcg ggagcttgat atcccttgtc tgtaacatag accccgggta ctgcgggagg 1440 ggagggctgc tggggaggat ggggggatgt tatataaata tagatataat tttattttcg 1500 gagctaagat ggtgttattt aagggtggtg atgggtgagc gctctggccc aggctgggcc 1560 agactcccgc ccaagcatga acaggacttg accatctttc caacccctgg ggaagacatt 1620 tgcaactgac ttggggagga cacagcttca gcacagcctc tcctgcgggc cagcccgctg 1680 cgaaccctcc accagctacc ggagggagga gggaggatgc gctgtggggt tgtttttgcc 1740 ataagcgaac tttgtgcctg tcctagaagt gaaaattgtt cagtccaaga aactgatgtt 1800 atttgattta tttaaaggct aaaatttgtt tttttattct ttgcacaatt gtttcattgt 1860 ttgacactta atgcactcgt catttgcata cgacagtagc attctgacca cacttgtacg 1920 ctgtaacctc atctacttct gatgttttta aaaaatgact tttaacaagg agagggaaaa 1980 gaaacccact aaattttgct ttgtttcctt gaagaatgtg gcaacactgt tttgtgattt 2040 tatttgtgca ggtcatgcac acagttttga taaagggcag taacaagtat tggggcctat 2100 tttttttttt tccacaaggc attctctaaa gctatgtgaa attttctctg cacctctgta 2160 cagagaatac acctgcccct gtatatcctt ttttcccctc ccctccctcc cagtggtact 2220 tctactaaat tgttgtcttg ttttttattt tttaaataaa ctgacaaatg acaaaatggt 2280 gagcttatga tgtttacata aaagttctat aagctgtgta tacagttttt tatgtaaaat 2340 attaaaagac tatgatgatg acatttaaaa aaaaaaaaaa aaaa 2384 <210> 34 <211> 196 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 34 Met Ala Ala Ile Arg Lys Lys Leu Val Val Val Gly Asp Gly Ala Cys 1 5 10 15 Gly Lys Thr Cys Leu Leu Ile Val Phe Ser Lys Asp Glu Phe Pro Glu 20 25 30 Val Tyr Val Pro Thr Val Phe Glu Asn Tyr Val Ala Asp Ile Glu Val 35 40 45 Asp Gly Lys Gln Val Glu Leu Ala Leu Trp Asp Thr Ala Gly Gln Glu 50 55 60 Asp Tyr Asp Arg Leu Arg Pro Leu Ser Tyr Pro Asp Thr Asp Val Ile 65 70 75 80 Leu Met Cys Phe Ser Val Asp Ser Pro Asp Ser Leu Glu Asn Ile Pro 85 90 95 Glu Lys Trp Val Pro Glu Val Lys His Phe Cys Pro Asn Val Pro Ile 100 105 110 Ile Leu Val Ala Asn Lys Lys Asp Leu Arg Ser Asp Glu His Val Arg 115 120 125 Thr Glu Leu Ala Arg Met Lys Gln Glu Pro Val Arg Thr Asp Asp Gly 130 135 140 Arg Ala Met Ala Val Arg Ile Gln Ala Tyr Asp Tyr Leu Glu Cys Ser 145 150 155 160 Ala Lys Thr Lys Glu Gly Val Arg Glu Val Phe Glu Thr Ala Thr Arg 165 170 175 Ala Ala Leu Gln Lys Arg Tyr Gly Ser Gln Asn Gly Cys Ile Asn Cys 180 185 190 Cys Lys Val Leu 195 <210> 35 <211> 1346 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 35 attgaaggct gggcagagtc tgagtccacc cgggtcgtgc tccccccgct cgcccggctc 60 ctccgcagtc caggaatctc cccgtggctc tccccgacct ggaggggtgg acgcccctgg 120 cccccagtcc ccggcctgcg gagggggccg gtggctgcgg ccctgcgcgg ggccggggcg 180 ggccgagcca agggccgccc ccggccgacc ctccccctgc cgggcccgcc ctccccgccg 240 cggcgctgga ggagggcggg gcggggccct ggggtcagtc tgagcctccg gcaccggccg 300 cgcagctgga ggcggcggag cggaagcccc accatggctg caatccgaaa gaagctggtg 360 atcgttgggg atggtgcctg tgggaagacc tgcctcctca tcgtcttcag caaggatcag 420 tttccggagg tctacgtccc tactgtcttt gagaactata ttgcggacat tgaggtggac 480 ggcaagcagg tggagctggc tctgtgggac acagcagggc aggaagacta tgatcgactg 540 cggcctctct cctacccgga cactgatgtc atcctcatgt gcttctccat cgacagccct 600 gacagcctgg aaaacattcc tgagaagtgg accccagagg tgaagcactt ctgccccaac 660 gtgcccatca tcctggtggg gaataagaag gacctgaggc aagacgagca caccaggaga 720 gagctggcca agatgaagca ggagcccgtt cggtctgagg aaggccggga catggcgaac 780 cggatcagtg cctttggcta ccttgagtgc tcagccaaga ccaaggaggg agtgcgggag 840 gtgtttgaga tggccactcg ggctggcctc caggtccgca agaacaagcg tcggaggggc 900 tgtcccattc tctgagatcc ccaaggcctt tcctacatgc cccctccctt cacaggggta 960 cagaaattat ccccctacaa ccccagcctc ctgagggctc catgctgaag gctcccattt 1020 tcagttccct cctgcccagg actgcattgt tttctagccc cgaggtggtg gcacgggccc 1080 tccctcccag cgctctggga gccacgccta tgccctgccc ttcctcaggg cccctgggga 1140 tcttgccccc tttgaccttc cccaaaggat ggtcacacac cagcacttta tacacttctg 1200 gctcacagga aagtgtctgc agtaggggac ccagagtccc aggcccctgg agttgttttc 1260 ggcaggggcc ttgtctctca ctgcatttgg tcaggggggc atgaataaag gctacaggct 1320 ccaacgtgaa aaaaaaaaaa aaaaaa 1346 <210> 36 <211> 193 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 36 Met Ala Ala Ile Arg Lys Lys Leu Val Ile Val Gly Asp Gly Ala Cys 1 5 10 15 Gly Lys Thr Cys Leu Leu Ile Val Phe Ser Lys Asp Gln Phe Pro Glu 20 25 30 Val Tyr Val Pro Thr Val Phe Glu Asn Tyr Ile Ala Asp Ile Glu Val 35 40 45 Asp Gly Lys Gln Val Glu Leu Ala Leu Trp Asp Thr Ala Gly Gln Glu 50 55 60 Asp Tyr Asp Arg Leu Arg Pro Leu Ser Tyr Pro Asp Thr Asp Val Ile 65 70 75 80 Leu Met Cys Phe Ser Ile Asp Ser Pro Asp Ser Leu Glu Asn Ile Pro 85 90 95 Glu Lys Trp Thr Pro Glu Val Lys His Phe Cys Pro Asn Val Pro Ile 100 105 110 Ile Leu Val Gly Asn Lys Lys Asp Leu Arg Gln Asp Glu His Thr Arg 115 120 125 Arg Glu Leu Ala Lys Met Lys Gln Glu Pro Val Arg Ser Glu Glu Gly 130 135 140 Arg Asp Met Ala Asn Arg Ile Ser Ala Phe Gly Tyr Leu Glu Cys Ser 145 150 155 160 Ala Lys Thr Lys Glu Gly Val Arg Glu Val Phe Glu Met Ala Thr Arg 165 170 175 Ala Gly Leu Gln Val Arg Lys Asn Lys Arg Arg Arg Gly Cys Pro Ile 180 185 190 Leu <210> 37 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> synthetic epitope <400> 37 Glu Glu Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu 1 5 10

Claims

(a) PKN3 폴리펩티드 또는 그의 단편, RhoC 폴리펩티드 또는 그의 단편, 및 PDK1 폴리펩티드 또는 그의 단편을 포함하는 생체외 세포를 시험 화합물과 접촉시키는 단계;
(b) 시험 화합물의 존재하에 형성되며 PKN3 폴리펩티드, RhoC 폴리펩티드 및 PDK1 폴리펩티드를 포함하는 복합체의 시험 수준을 결정하는 단계; 및
(c) 단계 (b)에서 결정된 시험 수준을 참조와 비교하는 단계
를 포함하며, 단계 (b)에서 결정된 시험 수준과 단계 (c)에서의 참조와의 차이는 시험 화합물이 암 치료 잠재성을 가짐을 나타내는 것인,
암 치료에 유용한 화합물을 확인하는 방법.
제1항에 있어서, 세포가 PC3 세포, HEK293 세포, MDA-MB231 세포 및 헬라(HeLa) 세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서, PKN3 폴리펩티드가 플래그(FLAG) 태그, GST 태그 및 Myc 태그로 이루어진 군으로부터 선택된 분자 태그를 포함하고, PKN3 폴리펩티드를 그의 분자 태그에 의해 끌어내림으로써(pulling down) 복합체를 단리하는 것인 방법.
제1항에 있어서, 참조가 (a) 시험 화합물의 부재하에 형성된 PKN3 폴리펩티드 및 RhoC 폴리펩티드를 포함하는 복합체의 수준이거나, 또는 (b) 시험 화합물의 존재하에 형성된 PKN3 폴리펩티드 및 RhoC 폴리펩티드를 포함하는 복합체의 수준이며, PKN3 폴리펩티드 또는 PDK1 폴리펩티드는 사멸 키나제(kinase dead)인 방법.
(a) 환자로부터 샘플을 얻는 단계;
(b) 샘플에서 PKN3 활성 수준 및 RhoC 활성 수준을 결정하여 시험 수준을 산출하는 단계; 및
(c) 시험 수준과 참조를 비교하는 단계
를 포함하며, 시험 수준과 참조 사이의 차이는 암이 공격성일 가능성을 나타내는 것인,
환자에서 암을 진단하기 위해 필요한 정보를 제공하는 방법.
(a) 환자로부터 샘플을 얻는 단계;
(b) 샘플에서 PKN3 활성 수준 및 RhoC 활성 수준을 결정하여 시험 수준을 산출하는 단계; 및
(c) 시험 수준과 참조를 비교하는 단계
를 포함하며, 시험 수준과 참조 사이의 차이는 환자가 암 치료법에 반응할 가능성을 나타내는 것인,
암 치료법에 반응할 수 있는 환자를 확인하는 방법.
제5항 또는 제6항에 있어서, 참조가 비-암 조직에서 결정된 PKN3 활성 수준 및 RhoC 활성 수준을 포함하는 것인 방법.
제6항에 있어서, 시험 수준이 참조보다 큰 것인 방법.
(a) 환자로부터 제1 샘플을 얻는 단계;
(b) 제1 샘플에서 PKN3 활성 수준 및 RhoC 활성 수준을 결정하여 제1 수준을 산출하는 단계;
(c) 치료 요법제를 환자에게 투여하는 단계;
(d) 치료 요법제의 투여 후 환자로부터 제2 샘플을 얻는 단계;
(e) 제2 샘플에서 PKN3 활성 수준 및 RhoC 활성 수준을 결정하여 제2 수준을 산출하는 단계; 및
(f) 제1 수준과 제2 수준을 비교하는 단계
를 포함하며, 제1 수준에 비해 제2 수준에서 PKN3 활성 및 RhoC 활성 모두의 감소는 치료 요법제가 환자에서의 암에 대해 유효함을 나타내는 것인,
인간을 제외한 환자에서 암 치료용의 치료 요법제의 효능을 결정하는 방법.
제6항에 있어서, PKN3 활성이 (i) PKN3 폴리펩티드 또는 그의 단편을 코딩하는 RNA의 발현, (ii) PKN3 폴리펩티드 또는 그의 단편의 발현, (iii) PKN3 폴리펩티드의 인산화 및 (iv) 글리코겐 신타제 키나제 3 (GSK-3)-유래 펩티드의 인산화로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
제6항에 있어서, RhoC 활성이 (i) RhoC 폴리펩티드를 코딩하는 RNA의 발현, (ii) RhoC 폴리펩티드의 발현, (iii) PKN3 폴리펩티드의 인산화 및 (iv) 글리코겐 신타제 키나제 3 (GSK-3)의 인산화로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
제10항에 있어서, T860의 PKN3 턴 모티프(turn motif) 인산화 부위에 결합하는 항체로 PKN3 폴리펩티드의 인산화를 검출하는 것인 방법.
제1항에 있어서, PKN3 폴리펩티드가 (a) 서열 26과 95％ 이상 동일한 아미노산 서열 또는 (b) 서열 36과 95％ 이상 동일한 아미노산 서열을 포함하는 것인 방법.
제1항에 있어서, 암이 유방암, 난소암, 췌장암, 위암, 간세포암종, 방광암, 결장직장암, 피부흑색종 및 전립선암종 (CaP)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
PKN3 활성을 검출하는 작용제, RhoC 활성을 검출하는 작용제, 라벨 및 패키지를 포함하는 키트.
제15항에 있어서, 암 치료용 화합물을 더 포함하는 키트.