CN102348981A - PKN3/RhoC大分子复合体及其使用方法 - Google Patents

PKN3/RhoC大分子复合体及其使用方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了包含新的大分子组件的组合物和所述大分子组件的使用方法，所述大分子组件包含PKN3、PDK1和RhoC(PPRC复合体)。发现PPRC复合体具有激酶活性，并存在于高度恶性的细胞中，例如高度进展性的癌症。在一些方面，本发明提供筛选具有癌症治疗潜能的化合物的方法，诊断进展性癌症的方法，确定癌症患者预后的方法，在临床试验中对患者进行分层或确定特定处理方案的有效性的方法，并提供调节PPRC复合体的形成的多肽以及包含PPRC复合体的一或多种组份的试剂盒。

Description

PKN3/RhoC大分子复合体及其使用方法
背景技术
本发明涉及使用蛋白激酶N3(PKN3)和RhoC来筛选具有抗癌活性的化合物和诊断患有进展性癌症的患者。
开发有效的癌症治疗方法越来越依赖于对疾病的潜在分子机制的认识以及鉴定到这些机制中可用于研发新药的靶分子。一旦获得此类靶分子，便能够针对这些靶分子来测试候选化合物。在许多情况中，此类药物候选物是由合成的或天然的化合物所组成的化合物文库的成员。
十分需要鉴定到与高度进展形式的癌症相关的新的靶分子，以便能够鉴定并验证新的治疗性化合物和方案。
发明内容
在第一方面，本发明提供鉴定可用于治疗癌症的化合物的方法。所述方法的步骤包括：将测试化合物与蛋白激酶N3(PKN3)多肽(或其片段)、RhoC多肽(或其片段)和磷酸肌醇依赖型激酶-1(PDK1)多肽(或其片段)混合，然后确定所形成的含有PKN3和RhoC的复合体(“complex”)的量，这称为所述复合体的“测试水平”。然后将所述测试水平与参照相比较。所述测试水平与参照之间的任何差异代表所述测试化合物可能具有癌症治疗活性。在一些实施方式中，PKN3、RhoC和PDK1多肽(或它们的片段)在与所述测试化合物混合之前先进行一定程度的纯化。
在一些实施方式中，一或多种所述组份(所述组份为PKN3、RhoC和PDK1，或其相应的片段)含有分子标签，所述标签用于鉴定所述组份并有助于分离所述组份以及与之连接的任何其他组份。分子标签通常是本领域已知的。实例包括多组氨酸、GST和FLAG。在一些实施方式中，PKN3多肽包含分子标签，并通过其分子标签捕获(pull down)PKN3多肽而分离所述复合体。
在一些实施方式中，参照是在缺乏所述测试化合物的情况下所形成的复合体的水平。在其他实施方式中，参照是当所述测试化合物与PKN3、RhoC和PDK1(或它们的相应的片段)混合时所形成的复合体的水平，其中所述激酶的任一或两者无激酶活性(kinase-dead)。
在一些实施方式中，所述测试水平低于参照。在一些实施方式中，所述测试化合物是降低癌细胞的侵袭性或降低肿瘤生长速度的化合物。
在第二方面，本发明提供基于细胞的鉴定可用于治疗癌症的化合物的方法。所述方法的步骤包括：将细胞与测试化合物接触，然后确定在存在所述测试化合物的情况下所述细胞中形成的复合体的量(测试水平)。所述细胞含有PKN3多肽(或其片段)、RhoC多肽(或其片段)和磷酸肌醇依赖型激酶-1(PDK1)多肽，而所述复合体也含有每一所述组份。然后将所述测试水平与参照相比较。所述测试水平与所述参照之间的任何差异代表所述测试化合物可能具有癌症治疗活性。
在一些实施方式中，所述细胞是干细胞，例如长期造血干细胞(LT-HSC)。在其他实施方式中，所述细胞是来自肿瘤的培养细胞。在一些实施方式中，所述细胞具有高的转移能力。在一些实施方式中，所述细胞例如是以下细胞中的一种：PC3细胞、HEK293细胞、MDA-MB231细胞、MCF7细胞、MDA361细胞、MCF468细胞、BT549细胞和HeLa细胞。在其他实施方式中，所述细胞含有作为异源重组多肽的所述组份的一种或多种或全部。
在一些实施方式中，一或多种所述组份(所述组份是PKN3、RhoC和PDK1或其片段)对于所述细胞而言是内源的。在一些实施方式中，一或多种所述组份是重组的并含有分子标签，所述标签用于鉴定所述组份并有助于分离所述组份以及与之连接的任何其他组份。分子标签通常是本领域已知的。实例包括多组氨酸、GST和FLAG。在一些实施方式中，PKN3多肽包含分子标签，并通过其分子标签捕获PKN3多肽而分离所述复合体。
在一些实施方式中，参照是在缺乏所述测试化合物的情况下所形成的复合体的水平。在其他实施方式中，参照是当所述测试化合物与PKN3、RhoC和PDK1(或它们的相应的片段)混合时所形成的复合体的水平，其中所述激酶的任一或两者无激酶活性。
在一些实施方式中，所述测试水平低于参照。在一些实施方式中，所述测试化合物是降低癌细胞的侵袭性或降低原发肿瘤生长速度的化合物。
在第三方面，本发明提供通过评估患者的PKN3活性和RhoC活性水平而诊断患者的癌症的方法。根据所述方法，从患者获得样品，然后确定所述样品中PKN3活性和RhoC活性的水平(此为所述测试水平)，然后将所述测试水平与参照相比较。所述测试水平与所述参照之间的差异代表所述患者具有进展性癌症。
在第四方面，本发明提供通过评估患者的PKN3活性和RhoC活性水平而鉴定会对癌症治疗发生反应的患者的方法。根据所述方法，从患者获得样品，然后确定所述样品中PKN3活性和RhoC活性的水平(此为所述测试水平)，然后将所述测试水平与参照相比较。所述测试水平与所述参照之间的差异代表所述患者是否会对所述癌症治疗发生反应的可能性。
在第三和第四方面的一些实施方式中，所述参照是在非癌症组织中确定的PKN3活性和RhoC活性的水平。在一些实施方式中，所述样品是肿瘤活检样品，且通过对肿瘤进行原位测定而确定所述测试水平，例如通过原位杂交、原位PCR或免疫染色。在一些实施方式中，所述参照仅仅是肿瘤样品周围或内部的任何非癌症组织。在一些实施方式中，所述测试水平高于所述参照。
在第五方面，本发明提供通过评估施用处理之前和施用处理之后PKN3和RhoC活性水平的改变而确定癌症治疗性处理方案对患者的有效性的方法。根据所述方法，从患者获得样品，然后确定所述样品中PKN3活性和RhoC活性的水平(此为治疗前水平或第一水平)，然后给所述患者施用处理方案。在施用该处理后一段时间，从患者获得第二样品，并确定所述第二样品中PKN3活性和RhoC活性的水平(此为治疗后水平或第二水平)。将所述第一水平与第二水平相互比较。PKN3活性和RhoC活性的第二水平相对于第一水平均降低代表所述处理方案对所述患者的癌症是有效的。
在第三、第四和第五方面的一些实施方式中，PKN3活性是表达编码PKN3多肽或其片段的RNA。在其他实施方式中，PKN3活性表达PKN3多肽或其片段。在其他实施方式中，PKN3活性PKN3多肽的磷酸化。在另一些实施方式中，PKN3活性是PKN3的下游效应物(例如糖原合酶激酶3(GSK-3)-衍生肽)(另见表1)被磷酸化。
在第三、第四和第五方面的一些实施方式中，RhoC活性是表达编码RhoC多肽或其片段的RNA。在其他实施方式中，RhoC活性是表达RhoC多肽或其片段。在其他实施方式中，RhoC活性是RhoC的下游效应物(例如PKN3或糖原合酶激酶3(GSK-3)-衍生肽)(另见表1)被磷酸化。
在第三、第四和第五方面的一些实施方式中，通过使用特异性结合PKN3的转角基序磷酸化位点T860的抗体或其他多肽来确定PKN3多肽的磷酸化状态。见例如SEQ ID NO.：36。
在第一至第五方面的一些实施方式中，所述癌症是乳腺癌、卵巢癌、胰腺癌、胃癌、肝细胞癌、膀胱癌、结直肠癌、皮肤黑素瘤和前列腺癌(CaP)中的一或多种。
在第六方面，本发明提供组合物，其包含破坏或阻断形成包含PKN3多肽和RhoC多肽的复合体的多肽或肽模拟物。在一些实施方式中，所述多肽或肽模拟物结合PKN3中与RhoC结合的区域。在其他实施方式中，所述多肽或肽模拟物结合RhoC中与PKN3结合的区域。在一些实施方式中，所述多肽或肽模拟物含有一或多个互补决定区(CDR)，所述CDR识别PKN3或RhoC上的表位。在一些实施方式中，所述含CDR的多肽是抗体、单克隆抗体、人源化抗体、单链、单链可变区片段(“ScFv”)、小模块免疫药物(“SMIP”)和纳米抗体(nanobody)(也称为单结构域抗体或VHH抗体)中的任何一种。
在第六方面的一些实施方式中，PKN3中与RhoC结合的区域包含ACC1、ACC2或ACC3氨基酸序列中的任何一或多种。在其他实施方式中，所述多肽或肽模拟物含有相应于PKN3的ACC1、ACC2和ACC3中的一或多种的氨基酸序列。
在第七方面，本发明提供多肽，其含有至少一种识别PKN3转角基序磷酸化位点T860的互补决定区(CDR)。在一些实施方式中，所述多肽是抗体，包括例如，单克隆抗体、人源化抗体、单链、单链可变区片段(“ScFv”)、小模块免疫药物(“SMIP”)和纳米抗体(也称为单结构域抗体或VHH抗体)。
在第八方面，本发明提供试剂盒，其用于筛选调节PKN3和RhoC之间的相互作用的化合物，并可用于治疗癌症。所述试剂盒还可用于确定患者的癌症的进展性或侵袭性。所述试剂盒还可用于评估癌症治疗对患者的有效性。在一些实施方式中，所述试剂盒含有(a)检测PKN3活性的物质，(b)检测RhoC活性的物质，(c)标签和(d)包装。在一些实施方式中，所述试剂盒还含有癌症治疗化合物。癌症治疗化合物是预防或延缓个体的癌细胞的生长或转移的化合物、组合物或处理方案。此类癌症治疗化合物包括，但不限于，化疗药、基因治疗组合物、影响激素的化合物、免疫治疗化合物、抗体和反义寡核苷酸。有用的化疗药的实例包括，但不限于，博来霉素、新制癌菌素(neocarcinostatin)、舒拉明、阿霉素、紫杉醇、丝裂霉素C和顺铂。应该理解，可用于本发明的癌症治疗化合物还包括那些将来研发出的新的化合物或疗法。
附图说明
图1显示了乳腺癌细胞系的蛋白质印迹，细胞的恶性潜能越高，磷酸化的PKN3的水平也随之升高。
图2显示了非小细胞肺癌(NSCLC)细胞系的蛋白质印迹，细胞的抗药性越高，磷酸化的PKN3的水平也随之升高。
图3A显示了来自以Myc标记的Rho和Rac构建体转染的细胞的裂解物的蛋白质印迹，使用抗磷酸化的PKN抗体和抗Myc抗体进行检测。图3B显示了来自以Myc标记的Rho和Rac构建体转染的细胞的抗Myc免疫沉淀物的蛋白质印迹，使用抗磷酸化的PKN抗体和抗Myc抗体进行检测。
图4A显示了来自以Myc标记的Rho构建体和Flag标记的PKN3构建体转染的细胞的裂解物的蛋白质印迹，使用抗Myc抗体和抗Flag抗体进行检测。图4B显示了抗Flag免疫沉淀物的蛋白质印迹，其显示以激酶依赖性方式形成含PKN3、RhoC和PDK1的三元复合体。
图5A显示了来自以Myc标记的Rho构建体和Flag标记的PKN3构建体转染的细胞的裂解物的蛋白质印迹，使用抗Myc、抗PDK1、和抗PKN3抗体检测。图5B显示了抗Flag免疫沉淀物的蛋白质印迹，其显示PKN3的激酶活性受到RhoC/PDK1/PKN3三元复合体的调控。
图6A显示了来自PC-3细胞的裂解物的蛋白质印迹，所述PC-3细胞表达由多西环素(Dox或Doxy)诱导的靶向PKN3或p110β的shRNA。图6B显示了接种于MATRIGEL
Figure BPA00001434085400051
的代表性细胞群体。
图7A和图7B显示了对来自携带移植的PKN3 shRNA PC-3细胞的小鼠的肿瘤体积进行定量的直方图。
图8A显示了来自MDA-MB-231细胞的裂解物的蛋白质印迹，所述MDA-MB-231细胞表达由Dox诱导的靶向PKN3、p110β或CKIε的shRNA。图8B显示了接种于MATRIGEL
Figure BPA00001434085400061
的代表性细胞群体。
图9的散点图显示了携带PKN3 shRNA MDA-MB-231细胞的小鼠的肿瘤体积(经或未经多西环素诱导)。
发明详述
本申请令人惊讶地发现：(a)蛋白激酶N3(PKN3)优先结合RhoC，(b)PKN3以激酶依赖性方式结合RhoC，和(c)PKN3和RhoC的结合有助于形成含有PDK1(PKN3/PDK1/RhoC复合体或PPRC复合体)的三元复合体。PPRC复合体是与高度进展性癌症相关联的可用靶点。本申请还公开了PPRC复合体的形成提高了PKN3的磷酸化并继而提高其激酶活性。
PKN3是长度为889个氨基酸(人直系同源物)的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶。其具有：N端推定的调控区，该调控区含有三个反向平行卷曲螺旋(ACC)结构域ACC1、ACC2和ACC3，分别位于大约第15-77、97-170和184-236位残基；C端催化区，位于第559-882位残基；以及长度为大约100至130个残基的C2样结构域，其位于所述推定的调控结构域和催化结构域之间。哺乳动物中存在至少三种不同的PKN同种型(PKN1/PKNα/PAK-1/PRK-1、PKN2/PRK2/PAK-2/PKNγ和PKN3/PKNβ)，各自具有不同的酶学特性、组织分布和不同的功能。有关PKN的综述见Mukai，H.，J.Biochem.133：17-27，2003。也请参见公开日为2004年6月3日的美国专利申请20040106569，通过引用将其全部内容并入本申请。
本申请还发现，在具有高进展性和抗药性的癌细胞中，PKN3是上调的(分别见图1和图2)。高进展性指的是癌细胞是转移的，发生转移的潜能高，增殖速度快，或是具有抗药性。进展性癌症的实例例如为三阴性乳腺癌(triple-negative breast cancer)(见，例如，Dent等，Clinical CancerResearch 13：4429-4434，Aug.1，2007)。进展性癌症还包括其中涉及PKN3/RhoC途径的那些癌症。
抑制PPRC复合体活性的化合物可用于控制细胞的转移和增殖行为，因此这为治疗肿瘤和癌症，特别是进展性的肿瘤和癌症，提供了方法。受PPRC活性影响的信号途径和其他活性的降低可能是源于转录水平、或翻译水平、或一或多种PPRC复合体组份翻译后修饰的水平或四级结构形成水平(即，形成三元复合体)的降低。
由于进展性癌症中有PPRC复合体和RhoC/PKN3途径的参与，因此该复合体及其组份可用作预后标记物、疾病分期标记物、患者分层标记物或用于诊断细胞的状态或体内具有这样的细胞的患者中所述细胞是否会发生转移或变成进展性的标记物。
PKN3是PI3K诱导的细胞迁移和侵袭的发育调控介导物，其在表达和催化活性水平以Akt非依赖型方式受到PI3K调控。其具有限制性表达模式(内皮、胚胎和肿瘤细胞)，而对于大多数正常细胞功能而言不是必需的。其对于转移性PC-3(PTEN-/-)细胞在同位移植小鼠模型中的生长是必需的。
在正常细胞中，PI3激酶(磷脂酰肌醇-3-激酶)途径的特征在于经生长因子诱导的PI3激酶活性和平行的信号途径。以生长因子刺激细胞引起细胞膜上其同源受体的活化，后者随后与细胞内信号途径分子(例如PI3激酶)结合并使之活化。PI3激酶(由p85调节亚单位和p110催化亚单位组成)的活化导致Akt经由磷酸化而激活，由此支持更下游的细胞应答，例如增殖、存活或迁移。因此，PTEN是肿瘤抑制物，其参与磷脂酰肌醇(PI)3激酶途径，其在调控细胞生长和转化中的作用在过去已经得到了深入的研究(综述请参见，例如，Stein，R.C.and Waterfield，M.D.Mol Med Today6：347-357，2000)。
肿瘤抑制物PTEN的功能是通过逆转PI3激酶催化的反应而作为PI3激酶的负调节物，由此确保该途径的活化以暂时的和可控的方式发生。功能性灭活PTEN引起PI3激酶信号途径持久过度活化。加入小分子抑制剂LY294002阻断PI3激酶活性。可通过例如小分子抑制剂PD98059抑制作为平行途径起作用的信号途径激酶MEK的活性以及下游应答。
因丧失PTEN功能而持久活化的PI3激酶途径是肿瘤发生和转移的主要促成因素，这表明该肿瘤抑制物是受控细胞增殖的一个重要检查点。PTEN敲除细胞显示出与其中PI3激酶途径被活化形式的PI3激酶持久诱导的那些细胞具有类似的特征。磷脂酰肌醇3激酶活化足以造成进入细胞周期和促成癌性转化特有的细胞改变。
涉及PI3激酶途径失调的疾病和状况是已知的。因此，任何这些状况和疾病均可通过本发明的方法以及药物和诊断剂来解决，本文教导了本发明的方法以及药物和诊断剂的设计、筛选或制造。状况和疾病指的是以下示例性而非限制性的情况：子宫内膜癌、结直肠癌、胶质瘤、子宫内膜癌、腺癌、子宫内膜增生、Cowden综合征、遗传性非息肉性结直肠癌、Li-Fraumene综合征、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、Bannayan-Zonana综合征、LDD(Lhermitte-Duklos“综合征)、错构瘤-大头畸形病(hamartoma-macrocephaly diseases)(包括Cow病(CD)和Bannayan-Ruvalcaba Rily综合征(BRR))、皮肤粘膜病变(例如，Trichilemmonmas)、大头畸形、智力低下、胃肠道错构瘤、脂肪瘤，甲状腺腺瘤，乳房纤维囊性疾病，小脑发育不良性神经节细胞瘤和乳腺癌和甲状腺恶性肿瘤。
有鉴于此，PPRC复合体及其各组分是PI3激酶途径的有价值的下游药物靶点，可通过那些可能具有较低不良反应的药物而不是针对PPRC上游靶点的药物来克服PI3激酶途径。因此，本发明提供适合用于设计、筛选、研发和制备具有药物活性的化合物的药物靶点，所述化合物比本领域已知的那些通常靶向PI3激酶的化合物，例如2-(4-吗啉基)8-苯并色酮(“LY294002”)，具有更高的选择性。通过控制这一特殊部分的效应物分子，即RhoC和PKN3以及该途径中涉及的任何更加下游的分子，仅有数量非常有限的其平行分支或该信号级联中更加上游的靶点才可能引起不良反应。因此，与细胞周期、DNA修复、凋亡、葡萄糖转运、翻译有关的PI-3激酶/PTEN途径的其他活性将不受影响。胰岛素信号途径也不会被诱导，这意味着可切实避免与使用LY294002有关的糖尿病反应或其他不良反应。
编码PKN3的完整核酸序列通常可从数据库获得，例如登录号NM_013355.3。PKN3的氨基酸序列也可以登录号NP_037487.2从数据库获得。编码RhoC的完整核酸序列通常可从数据库获得，例如登录号NM_001042678.1、NM_001042679.1和NM_175744.4。RhoC的氨基酸序列也可以登录号NP_001036143.1、NP_001036144.1和NP_786886.1从数据库获得。PKN3和RhoC的衍生物或其截短形式可用于本发明，条件是它们可实现所需的效果，这也属于本发明的范围。本领域人员可通过常规分析确定衍生化和截短的程度。
就本发明而言，编码PKN3和RhoC的核酸序列也包括与上述登录号的核酸序列杂交的核酸或任何可衍生自上述氨基酸序列的核酸序列。此类杂交是本领域人员已知的。此类杂交的细节可参见Sambrook，J.Fritsch，E.F.and Maniatis，T.(1989)Molecular Cloning：A Laboratory Manual，2nd ed.Cold Spring Harbor：Cold Spring Harbor Laboratory。在优选的实施方式中，杂交在严格性条件下进行，例如Sambrook所述的严格性条件。
此外，编码PKN3和RhoC的核酸还包括含有与上述任一核酸序列具有同源性的序列的核酸序列，其中序列同源性的程度为75％、80％、85％、90％或95％。
人PKN3的直系同源物可见于，例如，多种不同进化方向的生物体，例如小家鼠(M.musculus)和褐家鼠(R.norvegicus)、拟南芥(A.thaliana)，秀丽隐杆线虫(C.elegans)，黑腹果蝇(D.melanogaster)和酿酒酵母(S.cerevisiae)。对于PKN3，上述各物种的百分比相同性分别是67％、51％、38％、36％、63％和44％。人RhoC的直系同源物可见于小鼠、大鼠、拟南芥和果蝇，百分比相同性分别为100％、99％、47％和86％。本领域人员可以理解，任何这些或者其他直系同源物和同源物原则上都适用于本发明，条件是使用所述同源物产生的药物或诊断剂仍然可与人PKN3或RhoC或任何其他靶PKN3或RhoC相互作用。
PPRC复合体及其各成员可作为那些可用作药物或候选药物或用作诊断剂的化合物所针对的靶。可以使用不同类别的合适的化合物，例如抗体、肽、Anticalines、适体、镜像适体(Spiegelmers)、核酶、反义寡核苷酸和siRNA、以及小有机分子。通过使用PPRC复合体(所述复合体本身、其各成员或其组合)或与所述PPRC复合体有关的信息来设计、选择、筛选、产生或制备恶心化合物。
在此类化合物的设计、选择、筛选、产生和植被过程中，PPRC也被称为靶，但该靶是在这一过程中使用的，而不是在最终将相应的化合物施用于需要该化合物的患者这一过程中所使用的靶。在提供各类化合物的过程中，可以使用完整的PPRC复合体、其各成员或它们的组合、或编码PPRC的任一或所有蛋白质组份的核酸。术语“PPRC复合体或其组份”在本申请中包括PPRC及其组成成员的任何片段或衍生物，其使得能够设计、选择、筛选、产生或制备可用作药物或诊断剂的所述化合物。
术语“编码PPRC复合体或其组份的核酸”在本申请中包括含有编码PPRC复合体的任何组份或其片段的核酸的任何核酸。对于编码PPRC复合体或其组份的核酸的一部分也是如此看待，条件是其适合用于设计、选择、筛选、产生或制备可用作药物或诊断剂的所述化合物。编码PPRC复合体或其组份的核酸可以是基因组核酸、hnRNA、mRNA、cDNA或它们各自的一部分。
如上所述，除了本文所述的PPRC复合体或其组份或相应的核酸序列以外，本发明还包括可用于产生或抑制由PPRC复合体的内源性活性所引起的效应的手段或化合物。可在筛选方法中确定或选择此类手段。在此类筛选方法中，第一步骤是提供一或多种所谓的候选或测试化合物。在本申请中，候选化合物指的是准备在一测试系统中测试其是否适合用于治疗或减轻本文中所述的癌症或用作癌症的诊断手段或诊断剂的那些化合物。
如果候选化合物在该系统中显示出相应的效应，则该候选化合物是用于治疗所述疾病和疾病状况的合适的手段或治疗剂，且原则上也是该疾病和疾病状况的合适的诊断剂。在第二步骤中，使所述候选化合物接触PPRC表达系统、PPRC基因产物、PPRC活性系统、或PPRC复合体或组份。PPRC活性系统在本文中也称为检测PPRC复合体的活性的系统，例如检测PPRC激酶活性。在一些实施方式中，可通过确定底物的磷酸化来评估PPRC复合体的激酶活性，所述底物例如为诊断用GSK3α衍生片段，其序列为GPGRRGRRRTSSFAEGG(SEQ ID NO：1)。表1给出了可用于实施本发明的一些额外的PPRC激酶底物。
本文中所提到的PPRC筛选方法还可用于将非功能性或无活性化合物排除在进一步考虑之外。因此，可测定获自对象或测试系统的第一样品的PPRC活性，产生处理前水平，随后给所述对象或测试系统施用测试化合物，并在施用所述测试化合物一段时间后测定获自所述对象或测试系统的第二样品的PPRC复合体的活性或其各组份的活性，由此产生测试水平数据。可将处理前水平(第一水平)与所述测试水平(第二水平)相比较，如果数据显示所述测试水平相对于处理前水平无降低，则代表所述测试化合物对所述对象无效，那么可将该测试化合物排除在进一步评价或研究之外。相反，数值的变化可代表所述测试化合物适合用作PPRC抑制剂或用于进一步的究中。
表1：受PKN3调控的含磷蛋白质
PPRC表达系统基本上是这样一种表达系统，其显示或表现出任何一或多种PPRC组份多肽(RhoC、PKN3和PDK1)的表达，其中表达的程度或水平可改变。PPRC活性系统基本上是这样一种表达系统，其中测定所述活性或活性的状态(例如，激酶活性)。
在任一这些系统中，所要确定的是，在候选化合物的影响下，PPRC或编码PPRC的核酸的活性是否不同于没有所述候选化合物时的情况。在本发明的范围内，不管具体的系统是表达系统还是活性系统，活性和表达的升高或降低均可出现并均可被测得到。典型地，表达系统或活性系统是体外反应，例如是细胞提取物或细胞提取物的成分如核酸提取物。本文中的PPRC表达系统还可以是细胞、优选地是本文中所提及的疾病和本文中所提及的疾病状况中所涉及组织或器官的细胞。
可在表达的各个水平确定活性系统或表达系统是否存在升高或降低，例如，通过测定编码PPRC复合体或其组份的核酸(更具体为mRNA)的量的升高或降低，或通过测定在受到候选化合物的影响的情况下所表达的PPRC复合体或其组份的多肽的升高或降低。进行此类测定所需的技术，更具体地为定量测定此类改变(例如mRNA或多肽的改变)所需的技术，是本领域人员所熟知的。本领域人员也知道用于确定PPRC复合体的多肽的量或含量的方法，例如，通过使用合适的抗体进行检测。本领域人员知晓如何产生抗体，例如可参见Harlow，E.，and Lane，D.，″Antibodies：ALaboratory Manual，″Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，N.Y.，(1988)。也可通过其他熟知的方法产生合适的抗体，例如，通过噬菌体展示选择抗体文库。
就PPRC复合体表达系统而言，优选地使用功能性分析确定PPRC复合体活性的升高或降低。
使候选化合物分别接触表达系统和活性系统，这通常是通过将所述候选化合物的水性溶液添加至相应的反应系统而进行的，所述反应系统在本文中通常称为测试系统。除了水性溶液(其可以是缓冲液)，还可以使用候选化合物悬液或候选化合物的有机溶剂溶液或有机溶剂与水性溶剂的混合物的溶液。
在一些实施方式中，进行每一轮表达系统和活性系统分别仅使用单一的候选化合物。不过，本发明也包括使用本领域已知的方法在高通量系统中平行进行多种此类测试。
本发明的方法的另一步骤在于确定，在受到候选化合物影响的情况下，表达系统和活性系统的表达或活性分别相对于PPRC复合体或其编码核酸是否有改变。典型地，这是通过将加入候选(测试)化合物后的系统的反应与未加入所述候选化合物的情况进行比较而进行的。或者，这可以通过将加入候选化合物后的系统的反应与含有非功能性PPRC组份(例如，含有无激酶活性的PKN3)的系统在加入所述候选化合物后的反应进行比较而进行。在一些实施方式中，候选化合物是化合物文库的成员。
通常，任何化合物文库均适合于本发明的目的，而无论化合物是何种类别。合适的化合物文库例如为由小分子、肽、蛋白质、抗体或功能性核酸构成的文库。本领域人员已知如何产生这些化合物。
本领域人员已知如何制备特异于完整的PPRC复合体或其任一组份或组份的组合或其片段的抗体。本发明的抗体包括纳米抗体、多克隆抗体、单克隆抗体、嵌合抗体(例如，人源化抗体)、和抗独特型抗体。多克隆抗体是异质性抗体分子群，来自以抗原免疫的动物的血清。单克隆抗体是结合特异性抗原的基本上均质的抗体群体。通常，制备抗体可采用，例如，常规的杂交瘤技术(Kohler and Milstein(1975)Nature，256：495-499)、重组DNA方法(美国专利4,816,567)、或使用抗体文库的噬菌体展示(Clackson等(1991)Nature，352：624-628；Marks等(1991)J.Mol.Biol.，222：581-597)。对于其他的产生抗体的技术，参见Antibodies：A Laboratory Manual，eds.Harlow and Lane，Cold Spring Harbor Laboratory，1988。本发明对抗体的任何具体来源、产生方法或其他特殊特性没有限制。
术语″抗体″还意味着既包括完整的分子也包括能够结合抗原的片段，例如Fab、单链Fv抗体(ScFv)和小模块免疫药物(SMIP)。Fab片段缺乏完整抗体的Fc片段，从循环中更快地清除，且与完整抗体相比可具有较低的非特异性组织结合(Wahl等，1983，J.Nucl.Med.24：316-325)。嵌合抗体是这样的分子，其不同部分来源于不同的动物种属，例如具有来自鼠的单克隆抗体的可变区(VH、VL)和人免疫球蛋白恒定区(CH1-CH2-CH3，CL)。嵌合抗体及其产生方法是本领域已知的(Cabilly等，1984，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81：3273-3277；Morrison等，1984，Proc.Natl.Acad.Sci.USA81：6851-6855；Boulianne等，1984，Nature 312：643-646；Cabilly等，欧洲专利申请125023(公开日为Nov.14，1984)；Taniguchi等，欧洲专利申请171496(公开日为Feb.19，1985)；Morrison等，欧洲专利申请173494(公开日为Mar.5，1986)；Neuberger等，PCT申请WO 86/01533(公开日为Mar.13，1986)；Kudo等，欧洲专利申请184187(公开日为Jun.11，1986)；Morrison等，欧洲专利申请173494(公开日为Mar.5，1986)；Sahagan等，1986，J.Immunol.137：1066-1074；Robinson等，PCT/US86/02269(公开日为May 7，1987)；Liu等，1987，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84：3439-3443；Sun等，1987，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84：214-218；Better等，1988，Science 240：1041-1043)。SMIP是单链多肽，其包含一个结合结构域、一个铰链结构域和一个效应结构域。SMIP及其使用方法和用途可参见，例如，美国专利申请2003/0118592、2003/0133939、2004/0058445、2005/0136049、2005/0175614、2005/0180970、2005/0186216、2005/0202012、2005/0202023、2005/0202028、2005/0202534和2005/0238646以及有关的同族专利，所有这些均通过引用将其全部内容并入本申请。
可用于本发明的抗体可具有一或多个标记物或标签。当用于诊断用途或治疗用途时，此类标记物或标签可用于检测抗体。优选地，所述标记物或标签选自抗生物素蛋白、抗生蛋白链菌素、生物素、金和荧光素，并可用于例如ELISA方法。这些标记物以及其他标记物以及方法可参见例如上文的Harlow and Lane。
在一个实施方式中，PPRC抗体包含PKN3活化状态特异性抗体，其识别PKN3转角基序第860位的含磷苏氨酸(框内所示)(SEQ ID NO：24：847-YFEGEFTGLPPAL
Figure BPA00001434085400141
PPAPHSLLTARQQA-874)。所述抗体例如可用作探针来检测升高的PKN3表达和活性，并可用作患者分层和治疗应答的生物标记物。
另一类药物，即破坏PPRC的化合物，以及可使用PPRC复合体或其组份和片段或编码所述PPRC复合体或其组份和片段的核酸而产生的诊断剂，是可与之结合的肽。可通过本领域已有的方法例如噬菌体展示来产生此类肽。基本上，产生肽文库并展示于噬菌体表面，使展示的文库与靶接触，在本发明中例如是PPRC复合体或其组份。随后从相应的反应中取出结合靶的那些肽，优选地以与靶分子形成复合体的形式取出。本领域人员已知，结合特性至少在一定程度上取决于具体的实验设计参数例如盐浓度等等。将那些以较高亲和力或者更大的强度结合靶分子的肽与文库中的非结合成员分开，并任选地从靶分子和肽的复合体中去除靶分子，随后对相应的肽进行表征。
在表征步骤之前，任选地可进行扩增步骤，例如通过使编码所述肽的噬菌体增殖。在一些实施方式中，表征包括对结合靶的肽进行测序。基本上，肽的长度没有限制，不过，以相应的方法获得的肽的长度在大约8至20个氨基酸。文库的大小可以是大约102至1018种或108至1015种不同的肽，不过，文库的大小不限于此。
根据本发明，PPRC复合体或其组份，以及编码所述PPRC复合体或其组份的核酸，可作为靶用于筛选方法中，用来制备或研发用于治疗进展性癌症的药物，以及用来制备或研发用于来诊断所述进展性癌症的手段，其中在所述筛选方法中使用小分子或小分子文库。该筛选包括以下步骤：使靶PPRC复合体或其组份(靶)接触单个小分子或同时或依次接触多种(例如文库)小分子，优选地是来自上述文库的小分子，并鉴定那些与所述靶结合并破坏PPRC复合体的功能或完整性的小分子或文库成员，如果它们是与其他相关联的小分子一起筛选的，可将它们与那些不发生结合或不发生相互作用的小分子分开。
具体的实验设计参数可对结合与否造成很大影响。通过改变反应参数的严格性，可以改变结合和不结合的程度，这使得能够对这一筛选过程进行精细调节。在一些实施方式中，在鉴定一或多种与所述靶特异性相互作用的小分子之后，可进一步表征该小分子。这种进一步表征例如可以是鉴定该小分子并确定其分子结构和进一步的物理、化学、生物学或医学特性。在一些实施方式中，天然化合物的分子量为大约100至1000Da。在一些实施方式中，小分子是那些符合里宾斯基五规则(Lipinski’s Rule ofFive)的小分子，里宾斯基五规则是本领域人员已知的(见Lipinski等，Adv.Drug.Del.Rev.，23：3-25，1997)。或者，小分子也可被定义为是来自组合化学的合成小分子，而不是天然产物。不过，要注意的是，这些定义仅仅是本领域对相应术语的理解的补充。与所有的激酶类似，PPRC复合体的PKN3和PDK1组份含有ATP结合位点，因此那些已知可结合此类位点的药物是抑制PPRC功能的合适的候选化合物。合适化合物的实例包括，但不限于，LY-27632、Ro-3 1-8220和HA 1077，所有这些均可从(La Jolla，Calif.)获得。
通过以下实施例来进一步例证本发明，这些实施例无意于限制本发明的范围。
实施例1：构建体和蛋白质
Flag-PKN3蛋白：通过PCR扩增人PKN3全长cDNA(例如，SEQ IDNO：25和SEQ ID NO：26)并克隆入pcDNA3表达载体(SEQ ID NO：27)(Invitrogen，Carlsbad，CA)。5′引物含有ATG密码子，随后是位于所表达的编码区框内的Flag表位(SEQ ID NO：28)。以限制性内切酶EcoRI和XhoI消化该PCR产物并通过相同的酶切位点连接至pcDNA3表达载体，以产生N端Flag表位标记的PKN3。采用相同的策略将无激酶活性形式的PKN3(其含有K588R取代)也克隆入相同的载体中。
Myc-Rho蛋白：将人Rac1(例如，SEQ ID NO：29和30)、RhoA(例如，SEQ ID NO：31和32)、RhoB(例如，SEQ ID NO：32和33)和RhoC(例如，SEQ ID NO：35和36)的全长cDNA克隆入pCG哺乳动物表达载体(见，Tanaka and Herr(1990)Cell，60(3)：375-386)。5′引物含有ATG密码子，随后是位于所扩增的编码区框内的Myc表位(SEQ ID NO：37)。以限制性内切酶NdeI和BamHI消化该PCR产物并通过相同的酶切位点连接至pCG表达载体，以产生N端Myc表位标记的RhoA、RhoB和RhoC。
实施例2：抗体和西部裂解
抗体：p110抗体参见Klippel等，(1994)Mol Cell Biol.，14(4)：2675-85。PKN抗体参见Leenders，2004。PDK1抗体商品化获自Cell SignalingTechnology，Inc.(Beverly，MA)。根据标准程序制备抗含磷PKN3 T860兔单克隆抗体(见Spieker-Polet，1995，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，92：9348-9352)。针对Myc表位的抗体是可商品化获得的9E10 Myc单克隆抗体，也可参见Evan等，Mol.Cell.Biol.，5：3610-6(1985)。
细胞裂解物：细胞以冷磷酸缓冲盐水(PBS)洗涤两次并在4℃的裂解缓冲液中裂解(含20mM Tris(pH 7.5)，137mM NaCl，15％(vol/vol)甘油，1％(vol/vol)Nonidet P-40(NP-40)，2mM苯甲基磺酰氟，10mg的抑肽酶/ml，20mM亮抑酶肽，2mM苄脒，1mM正钒酸钠，25mM β-磷酸甘油酯，50mMNaF，和10mM焦磷酸钠)。在14,000×g离心5min获得澄清裂解物，并分析裂解物等分样品的蛋白质表达和酶活性(见下文)。通过十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离样品并转移至硝酸纤维素滤膜(Schleicher & Schuell)。将滤膜在含有5％(wt/vol)奶粉的TBST缓冲液(10mM Tris-HCl[pH 7.5]，150mM NaCl，0.05％[vol/vol]吐温20，0.5％[wt/vol]叠氮钠)中封闭。将相应的抗体以合适的稀释度加入TBST中。使用置于TBST中的抗小鼠抗体、抗山羊抗体或抗兔抗体缀合的碱性磷酸酶(SantaCruz Biotechnology)检测结合的抗体，洗涤，以四唑氮兰和5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸(Promega)显色。或者是使用了辣根过氧化物酶缀合的二抗并通过增强化学发光法(Amersham)显色。
实施例3：PKN3在癌细胞中的表达谱
已知PKN3或含磷PKN3(“P*-PKN3”)表达升高与肿瘤转移增加相关(见Leenders等，Biochem.Biophys.Res.Comm.，261：808-814)。在恶性潜能和药物抗性模型中测定PKN3和P*-PKN3的表达。
测定进展性逐渐升高的乳腺癌细胞系中PKN3和P*-PKN3的表达，细胞系从进展性最低到进展性最高为MCF-10A、MCF7、MDA361、MCF468、BT549和MDA231。图1显示了来自这些细胞的提取物的蛋白质印迹，测定的是p110αPI3K、总PKN3和含磷PKN3(P*-PKN3 T860)。结果证实PKN3和P*-PKN T860在具有更高恶性潜能的癌细胞中比具有较低恶性潜能的癌细胞中以更高程度表达。
测定对抗癌药吉非替尼(Gefitinib)(也称为易瑞沙(IRESSA)；N-(3-氯-4-氟苯基)-7-甲氧基-6-(3-吗啉丙氧基)喹唑啉-4-胺(4-(3-chloro-4-fluoroanilino)-7-methoxy-6-(3-morpholino-propoxy)-quinazoline))的抗性逐渐升高的非小细胞肺癌(NSCLC)细胞系中PKN3和P*-PKN3的表达，细胞系从抗性最低到抗性最高为H1650、H1975、A549、PC14、H157和H460细胞(见Noro等，(2006)BMC Cancer，6：277-289)。图2显示了来自这些细胞的提取物的蛋白质印迹，测定的是(a)p110αPI3K、(b)总PKN3和(c)P*-PKN3 T718。结果证实PKN3和P*-PKN T860在对抗癌药具有更高抗性的癌细胞中比对抗癌药具有更高敏感性的癌细胞中以更高程度表达。
实施例4：以内源性PKN3形成PPRC复合体
使用转染了Myc标记的小GTP酶Rac1、RhoA、RhoB或RhoC的细胞进行免疫沉淀实验发现，RhoC优先结合磷酸化的PKN3(图3B)。通过FUGENE
Figure BPA00001434085400171
转染试剂(Roche Diagnostics，Indianapolis，IN)以所述质粒单独转染HeLa细胞(5x105个细胞/10-cm组织培养皿)。使用缀合于Protein G琼脂糖的针对Myc的9E10抗体进行免疫沉淀。以裂解缓冲液洗涤免疫复合物3次。使用抗P*-PKN3T860抗体通过蛋白质印迹分析结合的蛋白质。
本实验发现，内源性P*-PKN3优先结合小GTP酶RhoC。
实施例5：以异源性PKN3形成PPRC复合体
使用转染了Flag标记的PKN3和Myc标记的小GTP酶RhoA、RhoB或RhoC的HEK293T细胞进行免疫沉淀实验发现，PKN3结合磷酸肌醇依赖型激酶-1(PDK1)和RhoC。图4B表明具有激酶活性的形式的PKN3优先结合RhoC和PDK1。因此，PKN3、RhoC和PDK1形成三元复合体(“PPRC复合体”)。
为了以Flag进行免疫沉淀(图4B)，通过FUGENE
Figure BPA00001434085400181
转染试剂以所述质粒(Flag-PKN3wt[全长、具有激酶活性]、Flag-PKN3kd[无激酶活性的PKN3]、Myc-RhoA、Myc-RhoB或Myc-RhoC)单独或共转染HEK293T细胞(5x105个细胞/10-cm组织培养皿)。在37℃、5％CO2孵箱中孵育6小时，之后以无血清达尔伯克改良伊格尔培养基(DMEM)洗涤细胞两次，并向细胞中加入新鲜培养基(DMEM，10％胎牛血清)再孵育48小时。以磷酸缓冲盐水(PBS)洗涤细胞并在0.5ml裂解缓冲液(50mM Tris-HCl[pH 7.5]，150mM NaCl，10mM β-磷酸甘油酯，10％甘油，1％Triton X-100，1mMNa3VO4，1mM NaF和蛋白酶抑制剂[Roche Molecular Biochemicals])中冰上裂解30分钟。将所述细胞裂解物14,000rpm离心30分钟，将离心裂解物的上清液与抗Flag M2亲和树脂(Sigma)在4℃温浴过夜。以TBS缓冲液(50mM Tris-HCl[pH 7.5]，150mM NaCl)洗涤珠3次，以每毫升含有10％甘油、1mM DTT和200μg的Flag肽(Sigma)的TBS缓冲液洗脱结合的蛋白质。通过蛋白质印迹分析观察结合的产物(图4)。
实施例6：PPRC复合体激酶活性
通过评估(i)PPRC复合体的PKN3组分的磷酸化状态、和(ii)PPRC对底物(即，具有序列GPGRRGRRRTSSFAEGG(SEQ ID NO：1)的GSK3α-衍生片段)的激酶活性而测定PPRC复合体的酶活性。
使用以Flag标记的PKN3和Myc标记的小GTP酶RhoA、RhoB或RhoC转染的PC3细胞进行免疫沉淀实验发现，PKN3结合磷酸肌醇依赖型激酶-1(PDK1)和RhoC。图5B表明，与单独PKN3相比或与PKN3和RhoC的组合相比，PPRC复合体的激酶活性是最高的。
为了进行Flag-免疫沉淀并随后进行激酶测定，如上所述通过FUGENE
Figure BPA00001434085400182
转染试剂以所述质粒单独转染或共转染PC3细胞(5x105个细胞/10-cm组织培养皿)。以磷酸缓冲盐水(PBS)洗涤细胞并在含0.3％Triton X-100的洗涤缓冲液(20mM Tris-HCl(pH 7.5)，1mM EDTA，1mM EGTA，5mM MgCl2，1μM岗田酸，10mM磷酸甘油酯，25mM氟化钠，5mM焦磷酸钠，0.2mM PMSF，和2mM DTT)中裂解。以抗Flag M2亲和树脂(Sigma)进行免疫沉淀。免疫复合物以含有0.5M NaCl的上述缓冲液洗涤3次然后以含有β-磷酸甘油酯和10mM焦磷酸钠的激酶缓冲液(20mM Tris-HCl(pH7.5)，10mM MgCl2，1mM EDTA，和1mM岗田酸)洗涤2次。最后将复合物悬浮在激酶缓冲液中并与50μM ATP和PKN3底物在室温温育15分钟。在SDS-聚丙烯酰胺凝胶上分离磷酸化的蛋白质，通过蛋白质印迹观察。
实施例7：体内前列腺癌模型
对PC-3(前列腺癌)细胞进行工程化使之表达靶向PKN3和p110β的shRNA。多西环素(Dox)诱导shRNA表达，72小时后导致PKN3和p110β蛋白水平被有效敲低(knockdown)(图6A)。PKN3和p110β均被抑制导致波形蛋白水平降低，已知波形蛋白水平是上皮-间质转变(EMT)的标志物(图6A)。将相应的细胞群体接种在MATRIGEL上，PKN3表达被shRNA敲低的细胞表现出在细胞外基质上的生长受损。由于p110β是PC-3细胞中的优势PI3K亚单位，p110β的抑制也干扰了PC-3细胞在MATRIGEL上的生长，并用作阳性对照(图6B)。
接下来，将稳定的PKN3 shRNA PC-3细胞移植到裸鼠前列腺内。动物被分成两组，一组以Dox处理以诱导shRNA表达，另一组做假处理。49天后处死小鼠，并分析原代肿瘤形成和淋巴结转移。Dox处理组的小鼠显示出对原代肿瘤生长具有强烈影响，且转移的形成也被强烈抑制(图7A)。
还在已建立的前列腺肿瘤上验证了PKN3。在这一实验中，所有动物均维持正常饮食达4周，以便在通过Dox饮食使得PKN3沉默之前形成原代肿瘤。在已建立的肿瘤模型上，4周的正常饮食之后，PKN3的抑制干扰了肿瘤的生长和转移(图7B)。
实施例8：体内乳腺癌模型
对MDA-MB-231(乳腺癌)细胞进行工程化使之表达靶向PKN3、p110β和CKIε的shRNA。Dox诱导shRNA表达，72小时后导致PKN3、p110β和CKIε蛋白水平被有效敲低(图8A)。将相应的细胞群体接种在MATRIGEL上，PKN3表达被shRNA敲低的细胞表现出在细胞外基质上的生长受损，其似乎比p110β的敲低更加强烈。因此，在该实验中，所诱导的CKIε抑制对MDA-MB-231细胞没有影响，将其用作Dox处理和shRNA诱导的对照(图8B)。
使用相同的工程化细胞系产生同位移植乳腺癌模型以便体内验证PKN3在乳腺癌中的作用。将稳定的PKN3 shRNA MDA-MB-231细胞培养在无Dox条件下，并注射至动物的乳腺脂肪垫内。动物被分成两组，一组以Dox处理以诱导shRNA表达，另一组做假处理。每周测量肿瘤的大小直至第55天。如图9所示，Dox处理组的小鼠显示出对如下肿瘤的生长具有强烈的影响。
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Claims (20)

1.鉴定可用于治疗癌症的化合物的方法，所述方法包括：
a.将细胞与测试化合物接触，所述细胞是离体的并包含PKN3多肽或其片段、RhoC多肽或其片段和PDK1多肽或其片段；
b.确定复合体的测试水平，所述复合体是在存在所述测试化合物时形成的，且所述复合体包含PKN3多肽、RhoC多肽和PDK1多肽；和
c.将步骤(b)中确定的测试水平与参照相比较，
其中在步骤(c)中，步骤(b)中确定的测试水平与所述参照之间的差异代表所述测试化合物具有癌症治疗潜能。
2.权利要求1的方法，其中所述细胞选自PC3细胞、HEK293细胞、MDA-MB231细胞和HeLa细胞。
3.权利要求1-2中任一项的方法，其中所述PKN3多肽包含分子标签，所述分子标签选自FLAG标签、GST标签和Myc标签，且通过其分子标签捕获PKN3多肽而分离所述复合体。
4.权利要求1-3中任一项的方法，其中所述参照是(a)在缺乏所述测试化合物的情况下形成的包含PKN3多肽和RhoC多肽的复合体的水平，或(b)在存在所述测试化合物的情况下形成的包含PKN3多肽和RhoC多肽的复合体的水平，其中所述PKN3多肽或PDK1多肽无激酶活性。
5.诊断患者的癌症的方法，包括：
a.从患者获得样品；
b.确定所述样品中PKN3活性的水平和RhoC活性的水平，由此产生测试水平；和
c.将所述测试水平与参照比较，
其中所述测试水平与所述参照之间的差异代表所述癌症是进展性的可能性。
6.鉴定会对癌症治疗有反应的患者的方法，包括：
a.从患者获得样品；
b.确定所述样品中PKN3活性的水平和RhoC活性的水平，由此产生测试水平；和
c.将所述测试水平与参照比较，
其中所述测试水平与所述参照之间的差异代表所述患者将对癌症治疗发生反应的可能性。
7.权利要求5或6的方法，其中所述参照包含在非癌症组织中确定的PKN3活性和RhoC活性的水平。
8.权利要求5-7中任一项的方法，其中所述测试水平高于所述参照。
9.确定患者的癌症治疗性处理方案的效果的方法，包括：
a.从患者获得第一样品；
b.确定所述第一样品中的PKN3活性的水平和RhoC活性的水平，由此产生第一水平；
c.给所述患者施用所述处理方案；
d.在施用所述处理方案后从所述患者获得第二样品；
e.确定所述第二样品中的PKN3活性的水平和RhoC活性的水平，由此产生第二水平；和
f.比较所述第一和第二水平，
其中PKN3活性和RhoC活性的第二水平相对于第一水平均降低代表所述处理方案对所述患者的癌症是有效的。
10.权利要求5-9中任一项的方法，其中所述PKN3活性选自(i)表达编码PKN3多肽或其片段的RNA，(ii)表达PKN3多肽或其片段，(iii)PKN3多肽的磷酸化，和(iv)糖原合酶激酶3(GSK-3)-衍生肽的磷酸化。
11.权利要求5-10中任一项的方法，其中所述RhoC活性选自(i)表达编码RhoC多肽的RNA，(ii)表达RhoC多肽，(iii)PKN3多肽的磷酸化，和(iv)糖原合酶激酶3(GSK-3)的磷酸化。
12.权利要求10或11的方法，其中以抗体检测所述PKN3多肽的磷酸化，所述抗体结合PKN3转角基序磷酸化位点T860。
13.权利要求1-12中任一项的方法，其中所述PNK3多肽包含(a)与SEQ ID NO：26具有至少95％相同性的氨基酸序列，或(b)与SEQ ID NO：36具有至少95％相同性的氨基酸序列。
14.权利要求1-13中任一项的方法，其中所述癌症选自乳腺癌、卵巢癌、胰腺癌、胃癌、肝细胞癌、膀胱癌、结直肠癌、皮肤黑素瘤和前列腺癌(CaP)。
15.多肽，包含结合PKN3转角基序磷酸化位点T860的互补决定区(CDR)。
16.权利要求15的多肽，其中所述多肽是单克隆抗体。
17.试剂盒，包含检测PKN3活性的物质、检测RhoC活性的物质、标签和包装。
18.权利要求17的试剂盒，还包含癌症治疗性化合物。
19.灭活PPRC复合体的多肽，其中
a.所述PPRC复合体包含PKN3多肽、RhoC多肽和PDK1多肽，
b.所述多肽结合(i)RhoC多肽上与PKN3多肽的同源结构域结合的结构域，或(ii)PKN3多肽上与RhoC多肽的同源结构域结合的结构域，和
c.所述多肽(i)抑制PPRC复合体的形成或(ii)抑制与PPRC复合体相关的激酶活性。
20.权利要求19的多肽，其中所述多肽包含选自PKN3的ACC1、ACC2和ACC3中的至少一个ACC结构域，但不包含PKN3的激酶结构域。
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