KR20160083828A - ３차원 콜라겐 겔 환경 내에서 배양된 세포를 이용한 암 세포의 전이성 모니터링 방법 - Google Patents

３차원 콜라겐 겔 환경 내에서 배양된 세포를 이용한 암 세포의 전이성 모니터링 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 3차원적 환경에서 배양된 암 세포의 모양관찰, 인바도포디아(invadopodia) 형성 및 전이에 관련된 단백질의 활성, 발현 및 발현위치 변화, 세포외기질의 분해 측정을 이용한 암 세포의 이동, 침윤 및 전이성 모니터링, 및 암 전이억제제 스크리닝 방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로 3차원 콜라겐 겔 환경 내에서 배양된 세포에서 c-Jun 인산화의 감소가 snail1의 발현 증가 및 코르탁틴(cortactin) 발현 감소를 유발하였고, 이러한 단백질들간의 발현조절 관계는 환자로부터 수득한 유방암 세포조직에서도 동일함을 확인하였다. 또한, 3차원적 콜라겐 겔 환경 내의 유방암 세포에 JNK 억제제를 처리하였을 때, 세포의 모양이 길어지고, 세포 및 세포외 기질의 접촉부분이 밋밋해지고 가늘어지며, 암세포의 이동이 감소하고, 단백질 발현 변화에 있어서는 TGFβ1의 발현증가, smad2 및 smad3의 발현 및 활성 증가, snail1의 발현 증가 및 코르탁틴의 발현 감소 및 이에 따른 인바도포디아의 형성 저하를 확인하였다. 또한, 3차원 콜라겐 겔 환경에서 코르탁틴외에도 MT1-MMP가 다른 인바도포디아 마커로 사용될 수 있고, 이는 JNK 억제가 코르탁틴의 발현을 감소시키고, snail1의 발현을 증가시키면서 동시에 MT1-MMP의 위치 및 역할에 부정적 영항을 미쳐 인바도포디아의 형성을 억제하며, 콜라겐 겔 기질의 분해능을 억제하는 것을 확인함으로써 암 세포의 이동, 침윤, 전이성 및 전이 정도를 모니터링하는 방법 및 암 전이억제제의 스크리닝 방법으로 사용할 수 있고, 이는 약물 개발에 필요한 전임상 실험 시 저비용 고효율의 부가가치를 창출할 수 있는 스크리닝 방법 중의 하나로 유용하게 사용될 것이다.

Description

３차원 콜라겐 겔 환경 내에서 배양된 세포를 이용한 암 세포의 전이성 모니터링 방법{Monitering method for metastasis of cancer using cancer cell cultured in 3-dimensional collagen gels environments}
본 발명은 3차원적 환경에서 배양된 암 세포의 모양관찰, 세포외기질 분해 및 전이에 관련된 단백질의 활성, 발현 및 발현 위치 변화 측정을 이용한 암 세포의 이동, 침윤, 전이성 모니터링 및 암 전이억제제 스크리닝 방법에 관한 것이다.
암 환자가 사망에 이르게 하는 치명적인 요인은 전이(metastasis)이다. 전이는 원발성 종양(primary tumor)에서 암 세포가 떨어져 나오는 과정으로 암 세포가 체 내의 먼 곳으로 퍼져나가는 현상을 나타낸다. 원발성 종양은 숙주의 다양한 유전학적 원인으로 발생할 수 있고, 이것이 각 개인의 치료에 어려움을 일으키고 있다. 그러나, 전이는 모든 종양에서 공통적으로 일어나는 현상이므로 표적의 치료적 개입(therapeutic intervention)에 중요한 과정에 해당된다. 전이 기능을 갖는 암 세포는 원발성 종양을 떠나 기저막을 뚫고 침윤(invasion)하게 된다. 기저막은 세포외 기질(extracellular matrix; ECM) 단백질의 네트워크로 상피(epithelium) 아래에 놓여있는 지지층이다. 일단 암 세포가 종양에서 이탈되어 떨어져 나오게 되면 혈류 내로 들어간다. 전이 기능을 갖는 암 세포는 주변의 세포외 기질을 분해하며 침윤할 수 있는 형태적 구조, 즉 인바도포디아(invadopodia)와 같은 침윤적 돌기(invasive protrusions) 형성에 의해 이러한 기질 막(stromal layer)의 장벽을 뚫고 혈관 또는 림프관으로 들어가게 된다. 인바도포디아는 F-액틴(F-actin)이 축적된 침윤적 돌기로 세포와 기질 사이의 접촉면에 위치하며 기질을 분해하는 능력을 갖는 부분으로 세포 내 신호인자들과 단백질 분해, 세포 부착, 세포 내 골격과, 막-추적 경로(membrane-trafficking pathway)가 물리적으로 모이는 구조물이다.
암을 치료하기 위해 전통적으로 항암제를 이용한 화학요법이나 방사선 치료요법이 널리 이용되고 있다. 이러한 암 치료를 위해 이용되는 항암제를 개발하기 위해서는 많은 노동력과 비용이 듦에도 불구하고 성공률은 매우 낮은 실정이다. 항암제 개발을 위해서는 약물 후보군들의 효과를 확인하는 전임상과정의 실험이 필수적으로 수행된다. 암 재발율 혹은 높은 암 치사율은 암의 수술적 제거를 넘어선 암전이에 의한 현상으로, 암 전이 과정을 분자적으로 이해하고 그 기전을 규명하여 제어할 수 있는 방법 및 단서를 확보하거나 그 분석 시스템을 확보한다면 항암전이제 개발에 있어 획기적인 혁신이 가능할 것이다. 많은 연구자들이 전임상 실험 조건으로 인체의 환경과 가깝거나 환자들의 체내 환경과 유사한 모델 시스템을 찾고 있으며, 그 대표적인 예가 3차원적 세포외 기질 환경 내에서의 세포배양, 조직 모델링 또는 인간화된 동물모델 시스템이다.
생체를 이루는 조직 및 기관은 3차원임에도 불구하고 세포의 형성, 기능 및 병리적 특성을 이해하기 위한 실험 방법은 2차원적인 세포 배양법이나 동물모델에 의존해왔다. 기존의 2차원적 세포 배양법을 통한 많은 연구는 중요한 이론적인 진보를 가져왔으나 세포의 형태, 세포와 세포 또는 세포와 기질사이의 상호작용은 실제 인체와는 다르기 때문에 이를 보완하기 위해 동물모델을 이용한 연구가 실험의 정확성을 보조해 주었다. 그러나 동물모델은 인간과 유전학적으로 다른 시스템을 이용하고 있어, 암 및 약물 치료반응, 자가면역 질환 등에서 인간에서와는 다른 부적절한 결과를 초래할 수 있다. 그리고 무엇보다도 동물모델을 이용한 연구는 모델 구축 및 분석 등의 시간이 오래 걸리고 비용이 많이 들어 재현을 위한 실험들이 한계가 있다. 하지만, 3차원(3D) 세포 배양은 이러한 전통적인 세포 배양의 한계와 동물모델 사이의 틈을 메워주는 역할을 할 수 있다. 3차원 세포 배양법은 특정적인 세포 내 혹은 세포 미세환경 내의 인자를 첨삭함으로써 인위적인 제어 시스템을 구축할 수 있고, 세포 형태와 신호전달이 생체 내 환경과 더욱 가까워 다양한 가설을 확인할 수 있으며, 다량의 실험을 동시에 수행할 수 있다. 또한 실시간으로 특정 환경하의 3차원 세포 형상을 현미경으로 관찰할 수 있는 용이성도 있다.
세포는 기저막(basement membrane)을 이루는 세포외 기질 단백질을 만들고 저장한다. 기저막은 특정 세포외 기질의 얇은 층으로 표피층과 내피층을 지지하고 세포와 기질을 연결시켜주는 라미닌(laminin), 콜라겐(collagen), 파이브로넥틴(fibronectin) 및 엔탁틴(entactin) 등의 단백질들을 갖고 있다. 이러한 단백질들은 세포의 이동, 부착, 손상의 복구, 세포의 퍼짐 등 세포의 행동 조절에 중요한 역할을 한다. 이러한 세포외 기질들을 이용하여 3차원 스캐폴드(scaffold)를 실험실에서 제작할 수 있다. 생체 내에서 3차원 스캐폴드는 일시적인 지지체로 주어진 환경에서 세포를 지지하고 궁극적으로는 조직으로 함입된다. 스캐폴드는 조직공학에서 널리 이용되고 있으며, 3차원 지지체로 스캐폴드는 2차원 세포 단층과는 달리 세포 원래의 기하학적 구조(geometry)를 나타내고 있다. 주로 사용되고 있는 자연적 스캐폴드는 제 1형 콜라겐(type 1 collagen), 제 4형 콜라겐(type Ⅳ collagen), 라미닌(laminin), 파이브로넥틴(fibronectin) 또는 히알루론산(hyaluronic acid)과 같은 천연물질의 하이드로겔(hydrogel)이다. 이러한 하이드로겔은 물리적으로는 약하나, 세포에 생물학적 환경을 제공해준다. 콜라겐 하이드로겔 스캐폴드는 실험실에서 3차원 기관형적(organotypic) 유방암 세포모델을 만드는데 이용되기도 한다. 그러나 콜라겐 하이드로겔은 암세포와 대부분 조직세포 내의 실질적인 경도(stiffness)를 모방하지는 못하고 있다. 3차원 세포 배양 시 세포는 이러한 세포외 기질의 종류와 농도, 경도 등에 따라 다양한 형태를 나타낸다(도 13 참조).
유방암의 형태는 크게 4가지로 분류할 수 있으나, 일부는 매우 드물게 발생한다. 이들 중 일부는 한 종류의 유방암이 여러 종류의 복합적 형태(combination type)를 나타낼 수 있다. 상피 내 유관암종(Ductal carcinoma in situ; DCIS)은 가장 일반적인 비침윤적 유방암(non-invasive breast cancer)의 형태이다. DCIS는 도관(ducts) 내에 암 세포가 존재하지만, 아직 유방조직을 둘러싸고 있는 도관벽을 뚫고 퍼져나가지 않은 형태를 말한다. 유방암 환자의 20% 정도는 DCIS 환자이며, 유관상피내암(DICS)으로 진단받은 경우는 보통 다른 유방 조직으로 퍼질 수 있기 때문에 초기에 치료해야 한다. 상피 내 소엽성 암종(lobular carcinoma in situ)은 소엽(lobular)에서 발생한 암종으로, 이는 실질적인 암에 해당하지는 않는다. 침윤성 유관암(invasive ductal carcinoma; IDC)은 유방암의 가장 흔한 형태이다. 침윤성 유관암은 유방의 유관에서 시작해서 유관을 뚫고 나와 유방의 지방조직에서 자라게 된다. 이때 림프계와 혈관을 따라 체내의 다른 부분으로 전이가 발생할 수 있다. 유방암 환자의 80% 정도는 IDC환자로 분류된다. 침윤성 소엽암(invasive lobular carcinoma; ILC)은 유선(lobules)에서 시작된다. IDC와 마찬가지로 전이가 발생하며, 침윤성 유방암 환자의 10% 정도는 ILC 환자이다. 침윤성 소엽암은 침윤성 유관암보다 진단하기가 더 어렵다.
인바도포디아(Invadopodia)는 액틴(actin)이 강화되어 세포막에 나타나는 돌기로 액틴 코어(core) 구조물의 합성으로 합성되고, 기질 분해 단백질의 축적으로 세포외 기질을 분해한다. 인바도포디아는 전이 기능을 갖고 주변 조직을 침윤하는 암세포(metastatic cancer cells)에서 주로 관찰되며, 조직 방어벽을 통과할 수 있는 대식세포(macrophage), 단핵구(monocytes) 및 조골세포(osteoblast)와 같은 정상 세포에서는 포도좀(podosome)과 매우 유사한 형태를 갖는다. 이러한 인바도포디아[또는, 인바도좀(invadosome)]에는 코르탁틴(cortactin), 타이로신 인산화 단백질, 인테그린(integrin), 및 MT1-MMP 등과 같은 기질 분해효소들이 강화되어 액틴과 공존하고 있다. 2차원과는 달리 3차원 환경에서 세포는 형태와 세포 골격 그리고 세포와 기질 사이 접촉변화를 통해 인바도포디아를 만들 수 있다(도 14 참조).
JNK[c-Jun N-말단 키나아제(N-terminal kinases)]는 MAP(mitogen-activated protein) 키나아제 중의 하나로 여러 단계와 다양한 자극에 의해서 활성화된다. 암 세포에서 JNK는 주로 세포자살을 유도하거나 세포의 생존과 증식을 증진시키기도 함으로써 암화 과정에 양면적인 기능을 하고 있다. 예를 들어, 일부 암종에서 JNK 활성의 억제는 세포의 증식을 멈추거나 세포 자살을 유발하기도 하고, JNK 활성과 c-Jun의 인산화는 암화 단백질인 ras에 의해 발생하는 형질전환에 필요하기도 하다.
snail1은 여러 암종에서 상피-중배엽 세포전이(epithelial mesenchymal transition; EMT) 과정과 관련되어 증가하는 전사인자 중의 하나로, E-카데린(E-cadherin) 유전자의 프로모터 부위의 E-박스 요소(E-box element)에 결합하여 전사를 억제하고 세포-세포간의 부착을 억제함으로써 EMT를 유도한다. snail1은 다양한 세포주에서 TGFβ에 의해 유도되며 EMT관련 단백질들의 발현을 조절하고, 세포자살과 증식을 포함한 다양한 세포작용을 조절한다. snail1의 발현은 PDAC(pancreatic ductal adenocarcinoma) 모델에서 콜라겐에 의해 활성화된 TGFβ 신호에 의하여 증가하고, 세포외 섬유화(extracellular fibrosis) 과정을 조절하기도 하지만, 이 과정 중 생성된 콜라겐이 snail1의 발현을 증가시켜 snail1이 이러한 섬유화 과정을 일으키기도 한다. 또한 snail1 및 twist는 자라는 유방눈(mammary buds)의 앞 가장자리(leading edge)에 축적되어 유방 상피 분기(mammary epithelial branching)에 관여하기도 한다.
이에 본 발명자들은 3차원적 세포외 기질의 세포배양 환경에서 배양된 암 세포의 전이성을 모니터링하기 위한 방법을 개발하기 위해 노력하던 중, 유방암세포인 MDA-MB-231 세포주를 3차원 콜라겐 겔 환경 내에서 배양하거나, 세포외 산성도를 증가시키거나, 또는 세포 환경내 산소농도를 낮추어 저산소환경(hypoxia)을 만들어주면 JNK 활성의 억제에 따른 c-Jun의 인산화 감소, TGFβ1 신호전달에 관련된 smad 단백질들의 활성화 및 snail1의 발현이 증가하고, 또한 코르탁틴(cortactin)의 발현이 감소하는 관계를 확인하고, 이러한 분자들 간의 상호관계는 환자로부터 수득한 유방암 세포조직에서 동일하게 존재함을 확인하였다. 또한, JNK 억제제를 처리하였을 때, 세포의 모양이 길어지고, 세포 및 세포외 기질의 접촉부분이 밋밋해지며, 암세포의 이동이 감소하고, 단백질 발현 변화에 있어서는 snail1의 발현증가 및 코르탁틴의 발현 감소, 및 이에 따른 인바도포디아의 형성 저하를 확인하였다. 이때, c-Jun 인산화의 저해는 TGFβ1, smad2 및 smad3의 발현 및 인산화의 증가를 유도하여 snail1의 프로모터 부위에서 smad2 및 smad4의 결합 및 작용을 통해 snail1의 전사가 증가하여 발현량이 증가됨을 확인하였다. 또한, 3차원 콜라겐 겔 환경에서 MT1-MMP가 다른 인바도포디아 마커로 사용될 수 있고, 이는 JNK 억제가 snail1의 발현을 증가시키고, 상기 snail1에 의해 코르탁틴의 발현이 감소되면서 동시에 MT1-MMP의 위치 및 역할에 부정적 영항을 미쳐 인바도포디아의 형성을 억제하고, 인바도포디아 주변의 콜라겐 기질의 분해를 억제하는 것을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 암 세포의 이동, 침윤, 전이성 및 전이 정도를 모니터링하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 암 전이억제제의 스크리닝 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 하기의 단계를 포함하는 암 세포의 이동, 침윤, 전이성 및 전이 정도를 모니터링하는 방법을 제공한다:
1) 암 세포를 배양용기에서 세포외기질로 둘러싸인 3차원적 배양환경을 이용하여 배양하는 단계; 및
2) 상기 단계 1)의 배양된 암 세포의 모양변화, 인바도포디아(invadopodia) 형성 및 분해, 이동, 침윤 및 전이관련 단백질의 활성, 발현 및 발현 위치의 변화 또는 세포외기질의 분해 정도를 측정하는 단계.
본 발명은 또한 하기의 단계를 포함하는 암 전이억제제의 스크리닝 방법을 제공한다:
1) 암 세포를 배양용기에서 세포외기질로 둘러싸인 3차원적 배양환경을 이용하여 배양하는 단계;
2) 상기 단계 1)의 암 세포에 피검물질을 처리하는 단계;
3) 상기 단계 2)의 암 세포의 인바도포디아 형성 및 분해, 이동, 침윤 및 전이관련 단백질의 활성, 발현 및 발현 위치 변화 또는 세포외기질의 분해 정도를 측정하는 단계;
4) 상기 단계 3)의 암 세포가 무처리 대조군에 비해서 인바도포디아 형성, 인바도포디아 마커 단백질 또는 전이관련 단백질의 활성 및 발현을 억제하거나, 발현 위치 또는 세포외기질 분해에 부정적 영향을 미치는 피검물질을 선별하는 단계.
본 발명은 3차원적 환경에서 세포배양(3-dimensional culture)을 통해 인체 내 환경을 모방하여 세포 외부 미세환경(microenvironment)을 조절함으로써 다양한 세포기능이 주변 미세환경에 어떻게 영향을 받는지 모니터링하고, 3차원 콜라겐 환경 내에서 배양된 암 세포에서 인바도포디아(invadopodia) 형성 유무를 영상화로 확인함으로써, 궁극적으로는 이를 통해 암 세포의 이동, 침윤, 전이성 및 전이 정도를 모니터링하는 방법 및 암 전이억제제의 스크리닝 방법으로 사용할 수 있고, 이는 약물 개발에 필요한 전임상 실험 시 저비용 고효율의 부가가치를 창출할 수 있는 스크리닝 방법 중의 하나로 유용하게 사용될 것이다.
도 1A 내지 1D는 MDA-MB-231 세포주의 3차원 콜라겐 겔 환경 내에서 다양한 미세환경(microenvironment)에서 c-Jun 인산화, snail1 및 코르탁틴(cortactin)의 발현 변화를 나타내는 도이다.
도 1E는 유방암 조직에서 c-Jun 인산화, snail1 및 코르탁틴의 발현 변화를 나타내는 도이다.
도 2A 및 2B는 3차원 콜라겐 겔 환경 내에서 JNK 억제제에 의한 MDA-MB-231 세포주의 모양 변화 및 상기 변형된 세포주의 너비(핵을 관통하는 짧은 거리)에 대한 길이(핵을 관통하는 가장 긴 길이)의 비율을 나타내는 도이다.
Control: 대조군, 및
SP600125: JNK 억제제.
도 2C는 3차원 콜라겐 겔 환경 내에서 JNK 억제제를 시간별로 처리하였을 때 mRNA 및 단백질의 발현 변화를 나타내는 도이다.
P: positve control
SP: JNK 억제제 SP600125.
도 2D는 3차원 콜라겐 겔 환경 내에서 JNK 억제제를 처리하였을 때 단백질의 발현 및 인산화 변화를 나타내는 도이다.
SP: JNK 억제제 SP600125.
도 2E는 GFP 형광단백질 자체 혹은 GFP와 연결된 코르탁틴 단백질을 발현시켜 3차원 콜라겐 겔 환경 내에서 JNK 억제제를 처리하였을 때 코르탁틴 발현 감소가 GFP 발현하는 세포에서는 길어지나, GFP-코르탁틴 발현하는 세포는 길어지지 않는 세포길이의 변화를 나타내는 도이다.
C: 대조군, 및
SP: JNK 억제제 SP600125.
GFP: 녹색형관단백질(green fluorescent protein)
도 2F 및 2G는 3차원 콜라겐 겔 환경 내에서 지속-촬영(time-lapse)을 통해 대조군에 비해 JNK 억제제를 처리하였을 때 세포의 길이 변화나 이동성이 줄어듦을확인한 도이다.
Control(Con): 대조군, 및
SP600125(SP): JNK 억제제.
도 3A는 3차원 매트리젤(matrigel) 환경 내에서 배양된 세포에서 JNK 억제제에 의한 세포주의 모양 변화를 나타내는 도이다.
Control: 대조군, 및
SP600125: JNK 억제제.
도 3B는 3차원 매트리젤, 매트리젤 및 콜라겐 겔의 혼합체, 또는 콜라겐 겔 환경 내에서 배양된 세포에서 JNK 억제제에 의한 snail1의 발현 변화를 나타내는 도이다.
Matri: 매트리젤,
M/C: 마크리겔 및 콜라겐 겔의 혼합체, 및
Col I: 제 1형 콜라겐(type I collagen).
도 3C는 3차원 콜라겐 겔 환경 내에서 JNK 억제제에 의한 c-Jun 인산화 및 단백질의 발현 변화가 JNK 억제제 농도-의존적임을 나타내는 도이다.
SP: JNK 억제제 SP600125.
도 3D는 3차원 콜라겐 겔 환경 내에서 p38 또는 Erk 억제제에 의한 단백질 발현 변화를 나타내는 도이다.
Con: 대조군,
SP: JNK 억제제 SP600125,
SB: p38 억제제 SB203580, 및
U0126: Erk 억제제.
도 4A 내지 4D는 3차원 콜라겐 겔 환경 내에서 많은 세포의 군 또는 적은 세포의 군 내에서 JNK 억제제에 의한 코르탁틴 및 액틴(actin)이 함께 발현되는 위치들의 숫자적 또는 정도적 감소를 나타내는 도이다.
Control: 대조군, 및
SP600125: JNK 억제제.
도 4E 내지 4J는 다양한 유방암 세포주의 3차원 콜라겐 겔 환경 배양시, JNK 억제에 따른 세포 모양 및 인바도포디아 형성 감소 확인을 나타내는 도이다.
Control, Cont: 대조군, 및
SP600125, SP: JNK 억제제.
도 4K는 3차원 콜라겐 겔 환경에서 배양된 유방암 세포주에서 JNK 억제제에 의한 제 1형 콜라겐의 분해를 확인한 도이다.
도 5는 3차원 콜라겐 겔 환경 내에서 JNK 억제제에 의한 코르탁틴의 세포막에서의 발현 감소 및 세포 모양 변화의 비역동성을 나타내는 도이다.
Control: 대조군, 및
SP600125: JNK 억제제.
도 6A는 snail1 유전자의 프로모터 부분에 AP-1 결합 도메인(domains) 및 코르탁틴 유전자의 프로모터 부분에 E-박스 결합 요소를 나타내는 도이다.
도 6B 내지 6D는 3차원 콜라겐 겔 환경 내에서 배양된 전체 세포 파쇄물(cell lysate)(B)에서 항-pS63c-Jun 항체(C) 및 항-snail1 항체를 사용하여 ChIP(chromatin immunoprecipitation) 분석을 수행한 결과를 나타내는 도이다.
WCL: 전체 세포 파쇄물(whole cell lysate),
SP: JNK 억제제 SP600125,
-: SP600125를 처리하지 않은 대조군, 및
+: SP600125을 처리한 처리군.
도 6E 및 6F는 mRNA의 합성을 억제하는 액티노마이신 D(actinomycin; ActD)만 처리하거나, JNK 억제제 및 액티노마이신 D를 함께 시간별로 처리하였을 때 코르탁틴 및 snail1 mRNA의 발현 변화를 나타내는 도이다.
도 6G는 단백질의 합성을 억제하는 사이클로헥사마이드(cyclohexamide; CHX)만 처리하거나, JNK 억제제 및 사이클로헥사마이드를 함께 시간별로 처리하였을 때 코르탁틴 및 snail1 단백질의 발현 변화를 나타내는 도이다.
도 6H는 3차원 콜라겐 겔 환경 내에서 배양된 유방암 세포주에서 JNK 억제제에 의한 snail1 및 코르탁틴 프로모터의 단백질-DNA 복합체 형성을 확인한 도이다.
도 7A는 3차원 콜라겐 겔 환경 내에서 5일 동안 배양한 경우, smad 2 및 3 mRNA의 발현 변화를 나타내는 도이다.
도 7B는 3차원 콜라겐 겔 환경 내에서 5일 동안 배양한 경우, smad 2 및 3 단백질의 발현 변화를 나타내는 도이다.
도 7C 및 7D는 3차원 콜라겐 겔 환경 내에서 JNK 억제제를 처리 또는 세포 외부의 pH 변화에 따른 smad 2 및 3 단백질의 발현 및 인산화 변화를 나타내는 도이다.
Control: 대조군, 및
SP600125: JNK 억제제.
도 7E 3차원 콜라겐 겔 환경 내에서 smad 2, 3 및 4의 shRNA를 처리하였을 때 코르탁틴 및 snail1의 발현 변화를 나타내는 도이다.
도 7F는 3차원 콜라겐 겔 환경 내에서 JNK 억제제를 처리하거나 처리하지 않았을 때, smad 2 및 4에 의한 snail1 단백질의 발현 변화가 전사(translation) 수준에서 일어나는지 확인하기 위해 ChIP 분석을 수행한 결과를 도이다.
도 8A는 3차원 콜라겐 겔 환경 내에서 우성 음성(dominant negative) JNK1에 의한 snail1 및 코르탁틴의 발현 변화를 나타내는 도이다.
도 8B는 3차원 콜라겐 겔 환경 내에서 우성 음성(dominant negative) JNK1에 의한 세포 모양 변화 및 액틴이 많이 염색되는 부위의 감소를 나타내는 도이다.
도 8C는 3차원 콜라겐 겔 환경 내에서 JNK1 siRNA를 처리하였을 때, mRNA 발현 변화를 나타내는 도이다.
도 8D는 3차원 콜라겐 겔 환경 내에서 JNK1 siRNA를 처리하였을 때, 단백질 발현 변화를 나타내는 도이다.
도 8E는 3차원 콜라겐 겔 환경 내에서 JNK1 siRNA를 처리하였을 때, 화살표로 표시되어 JNK1 siRNA가 주입된 세포의 모양 변화 및 액틴이 많이 모여있는 부위의 감소를 나타내는 도이다.
도 9A는 3차원 콜라겐 겔 환경 내에서 snail1 단백질을 과다발현시켰을 때 단백질의 발현 변화를 나타내는 도이다.
도 9B 및 9C는 3차원 콜라겐 겔 환경 내에서 snail1 단백질을 과다발현 시켰을 때 코르탁틴이 위치하는 부위의 감소를 나타내는 도이다.
도 9D 및 9E는 3차원 콜라겐 겔 환경 내에서 snail1 siRNA를 처리하였을 때, JNK 억제제 처리에 따른 코르탁틴 mRNA 및 단백질의 변화를 나타내는 도이다.
siCon: 대조 siRNA, 및
siSnail1: snail1 siRNA.
도 10A는 3차원 콜라겐 겔 환경 내에서 녹색으로 염색된 콜라젠의 분해를 암시하는 공백이 대조군(노란색 화살표로 표시)에 대비하여 JNK 억제제를 처리하였을 때 그 공백이 하얀색화살표로 표시한 곳들에서처럼 생기지 않음을 확인한 도이다.
도 10B는 3차원 콜라겐 겔 환경 내에서 인바도포디아의 다른 마커인 MT1-MMP의 발현을 액틴과 함께 위치하는 것으로 나타내는 도이다.
도 10C 및 10D는 3차원 콜라겐 겔 환경 내에서 JNK 억제제를 처리하였을 때, 세포 가장자리에 위치하는 대조군에 대비하여, MT1-MMP의 발현 및 핵주변으로의 위치 변화를 실시간으로 나타내는 도이다.
Control: 대조군, 및
SP600125: JNK 억제제.
도 11A 및 11B는 3차원 콜라겐 겔 환경 내에서 JNK 억제제를 처리하였을 때, 코르탁틴 및 MT1-MMP의 발현, 발현 위치 변화 및 상기 발현 위치 변화의 역동성이 감소함을 나타내는 도이다.
Control: 대조군, 및
SP600125: JNK 억제제.
도 12A 및 12B는 3차원 콜라겐 겔 환경에서 배양된 유방암 세포주에서 JNK 억제제에 의한 세포내부로 위치에 따라 MT1-MMP 기능 억제 및 제 1형 콜라겐 기질 분해 저해의 확인을 나타내는 도이다.
Control: 대조군, 및
SP600125: JNK 억제제.
도 13은 3차원 세포 배양시 유방암 세포의 콜로니(colony) 형태를 나타내는 도이다.
도 14A 내지 14C는 2차원 세포 배양시 생성가능한 인바도솜(invadosome)의 형태를 나타내는 도이다.
도 14D 및 14E는 3차원 세포 배양시 생성가능한 인바도솜의 형태를 나타내는 도이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 명세서상에 사용된 용어 "인바도포디아(invadopodia)"는 액틴(actin) 및 코르탁틴(cortactin)이 동시에 발현하는 부분을 말하며, 코르탁틴 등의 작용으로 액틴이 중합되어 강화된 세포막 돌기 부위로 기질 분해 단백질(matrix metalloprotease)의 축척에 의해 세포 주변의 세포외 기질(extracellular matrix; ECM)을 분해하는 능력이 있다. 또한, 상기 인바도포디아는 다양한 단백질인 코르탁틴, 겔솔린(gelsolin), 빈쿨린(vinculin), 탈린(talin) 및 팍실린(paxillin) 등의 단백질들이 모여 있어 암 세포가 기질을 분해할 수 있도록 액틴 재구성 등을 위한 다양한 신호전달이 일어나고 있는 부분이다.
본 발명은 하기의 단계를 포함하는 암 세포의 이동, 침윤, 전이성 및 전이 정도를 모니터링하는 방법을 제공한다:
1) 암 세포를 배양용기에서 세포외기질로 둘러싸인 3차원적 배양환경을 이용하여 배양하는 단계; 및
2) 상기 단계 1)의 배양된 암 세포의 모양변화, 인바도포디아(invadopodia) 형성 및 분해, 이동, 침윤 및 전이관련 단백질의 활성, 발현 및 발현 위치의 변화 또는 세포외기질의 분해 정도를 측정하는 단계.
상기 암은 전이성 암 또는 전이성 유발 가능한 암인 것이 바람직하고, 이는 유방암, 간암, 위암, 결장암, 골암, 췌장암, 두부 또는 경부 암, 자궁암, 난소암, 직장암, 식도암, 소장암, 항문부근암, 결장암, 나팔관암종, 자궁내막암종, 자궁경부암종, 질암종, 음문암종, 호지킨병, 전립선암, 방광암, 신장암, 수뇨관암, 신장세포암종, 신장골반암종 및 중추신경계 종양으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것이 더욱 바람직하며, 본 발명의 바람직한 실시예에 의하면 유방암인 것이 가장 바람직하나 이에 한정하지 않는다.
상기 단계 1)의 세포 배양은 세포의 배양 기간 혹은 세포의 숫자(밀도) 변화, 세포외 pH의 조절 또는 세포외부의 산소 농도 조절을 추가적으로 이용하는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
상기 단계 1)의 배양용기는 폴리디메틸실록산(polydimethylsiloxane; PDMS), 폴리메틸메타클릴레이드(polymethylmethacrylate; PMMA), 폴리아크리레이트(polyacrylates), 폴리카보네이트(polycarbonates), 폴리실릭 올레핀(polycyclic olefins), 폴리이미드(polyimides), 폴리우레탄(polyurethanes)으로 이루어진 군으로부터 선택된 것으로 제작한 것이 바람직하고, 본 발명의 바람직한 실시예에 의하면 폴리디메틸실록산인 것이 가장 바람직하나 이에 한정하지 않는다.
상기 단계 1)의 3차원적 배양환경은 당업계의 당업자에게 잘 알려진 콜라겐(collagen), 라미닌(laminin), 파이브로넥틴 (fibronectin) 또는 히알루론산(hyaluronic acid)과 같은 천연물질의 하이드로겔(hydrogel)을 모두 사용할 수 있으며, 구체적으로 콜라겐은 제 1형 콜라겐(type 1 collagen)인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다. 또한, 상기 제 1형 콜라겐의 농도는 1 내지 5 ㎎/㎖인 것이 바람직하고, 2 내지 4 ㎎/㎖인 것이 더욱 바람직하며, 2.5 내지 3 ㎎/㎖인 것이 가장 바람직하다. 또한, 상기 콜라겐은 중성으로 제조되는 것이 바람직하나 이에 한정하지 않는다.
상기 단계 1)의 배양은 상기 천연물질을 포함하는 배양액에 1 x 104 내지 2 x 108 개/㎖의 세포를 넣는 것이 바람직하고, 1 x 105 내지 2 x 107 개/㎖인 것이 더욱 바람직하고, 1 x 106 내지 2 x 106 개/㎖인 것이 가장 바람직하나 이에 한정하지 않는다.
상기 단계 2)의 모양 변화는 세포의 길이가 길어지고, 세포 및 세포외 기질(extracellular matrix; ECM)이 접촉한 부분이 단순하게 밋밋해지는 것이 바람직하고, 인바도포디아의 형성 정도를 확인하는 것이 더욱 바람직하나 이에 한정하지 않는다.
상기 단계 2)의 전이관련 단백질의 발현 위치 변화는 세포막에 발현하는 전이관련 단백질들이 세포질 내 또는 핵주변 부위로 이동하는 것이 가장 바람직하나 이에 한정하지 않으며, 세포막이 아닌 다른 부위로의 위치 변화도 모두 포함한다.
상기 단계 2)의 전이관련 단백질의 활성 변화는 c-Jun 인산화가 증가하는 것이 바람직하고, 발현 변화는 코르탁틴(cortactin)의 감소 및 snail1의 증가인 것이 바람직하나 이에 한정하지 않으며, 상기 단백질의 활성 및 발현 변화는 인바도포디아에 위치하며 인바도포디아의 기능에 중요한 역할을 담당하는 단백질이라면 모두 사용가능하다.
상기 단계 2)의 이동 및 침윤은 콜라겐 겔 기질의 분해 여부를 확인하는 것인 것이 바람직하며, 구체적으로 콜라겐 겔 기질 분해능의 변화를 확인하는 것이 보다 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
또한, 상기 단계 2)의 단백질의 활성 및 발현 변화 측정은 본 발명의 바람직한 실시예에 의하면 웨스턴 블랏, RT-PCR, 실시간 PCR(real time PCR), 면역형광염색(immunofluorescence), CHIP(chromatin immunoprecipitation), EMSA(Electrophoric Mobility Shift Assay) 또는 DQTM-collagen type I을 이용한 ECM 분해능 분석으로 이루어진 군으로부터 선택된 것으로 측정하는 것이 바람직하나 이에 한정하지 않는다.
또한, 본 발명은 하기의 단계를 포함하는 암 전이억제제의 스크리닝 방법을 제공한다:
1) 암 세포를 배양용기에서 세포외기질로 둘러싸인 3차원적 배양환경을 이용하여 배양하는 단계;
2) 상기 단계 1)의 암 세포에 피검물질을 처리하는 단계;
3) 상기 단계 2)의 암 세포의 인바도포디아 형성 및 분해, 이동, 침윤 및 전이관련 단백질의 활성, 발현 및 발현 위치 변화 또는 세포외기질의 분해 정도를 측정하는 단계;
4) 상기 단계 3)의 암 세포가 무처리 대조군에 비해서 인바도포디아 형성, 인바도포디아 마커 단백질 또는 전이관련 단백질의 활성 및 발현을 억제하거나, 발현 위치 또는 세포외기질 분해에 부정적 영향을 미치는 피검물질을 선별하는 단계.
본 발명의 구체적인 실시예에서, 본 발명자들은 3차원 콜라겐 겔 환경에서 배양된 유방암 세포주인 MDA-MB-231 세포주에서 c-Jun의 인산화 감소, 코르탁틴 단백질 발현 감소, 및 snail1 단백질 발현 증가를 확인하였고(도 1A 참조), 이는 세포 주변의 미세환경을 여러 차원 즉 세포의 밀도, 세포외 산성도 또는 저산소화 등으로 변화시켰을 때도 동일하며(도 1B 내지 1D 참조), 반면 인간 유방암 세포조직에서는 c-Jun의 인산화가 감소하고, 코르탁틴의 발현이 증가하며, snail1의 경우 조직 전반적으로 발현되는 것을 확인하였다(도 1E). 따라서, 상기 3차원 콜라겐 겔 환경 내에서 배양된 유방암 세포주에서 상기 단백질들의 활성 및 발현변화는 세포 미세환경의 영향을 받은 것임을 확인하였다.
또한, 본 발명자들은 3차원 콜라겐 겔 환경 내에서 배양된 유방암 세포주에 JNK 억제제를 처리하였을 때, 대조군과 비교하여 세포의 길이가 길어지고, 세포 및 세포외 기질이 접촉한 부분이 밋밋해지는 것을 확인하였다(도 2A 및 2B 참조). 이때, snail1 및 twist 유전자의 mRNA 수준은 증가하였고, 코르탁틴의 mRNA 수준은 감소하였으며, 단백질량에서도 동일한 변화가 확인되었으나, p38 및 ERK의 인산화에는 영향을 미치지 않음을 확인하였다(도 2C 및 2D 참조). 따라서, JNK 억제가 snail1의 발현을 특이적으로 유도하는 것임을 확인하였다.
또한, 본 발명자들은 3차원 콜라겐 겔 환경 내에서 배양된 유방암 세포주에 JNK 억제제를 처리하였을 때 코르탁틴의 발현이 억제됨에 따라 세포의 이동이 감소함을 확인하였다(도 2E 내지 2G 참조).
또한, 본 발명자들은 3차원 매트리젤(matrigel) 환경 내에서 배양된 유방암 세포주에 JNK를 처리하였을 때는 세포 모양 변화 및 snail1 단백질 발현 증가를 확인할 수 없었고(도 3A 및 3B 참조), p38 또는 ERK 억제제에 의한 단백질의 발현 변화를 확인하였으나, JNK 억제제에 의한 단백질의 발현 변화와 같은 양상의 변화는 확인할 수 없었다(도 3D 참조).
또한, 본 발명자들은 3차원 콜라겐 겔 환경 내에서 배양된 유방암 세포주에 JNK 억제제를 처리하였을 때, 코르탁틴의 발현 감소하고(도 3C), 코르탁틴과 액틴의 발현이 함께 이루어지는 부위가 감소됨에 따라, 인바도포디아(invadopodia)의 형성이 감소되는 것을 확인하였다(도 4A 내지 4D 참조).
아울러 세포의 모양이 길어지며, 역동적인 모습이 약화 또는 위축되었으며(도 2 및 4 참조), 세포의 이동이 감소하고, 코르탁틴이 세포막에 위치하지 않고 세포질 내 핵주변에서 많이 위치함을 확인하였다(도 5, 10, 11 및 12 참조).
또한, 본 발명자들은 다양한 유방암 세포주에서 3차원 콜라겐 겔 배양에 따른 JNK 억제제에 의한 인바도포디아 생성을 확인한 결과, 다양한 유방암 세포주에서 JNK 억제에 의한 세포의 모양변화와 snail1의 발현이 증가하고 코르탁틴의 발현이 감소하는 양상이 동일하게 나타나며(도 4E, 4F, 4g 및 4j 참조), 액틴과 코르탁틴이 함께 위치화된 스폿의 수가 감소하는 것을 확인하였고(도 4I 참조), 콜라겐 기질이 분해 능력이 감소하는 것을 확인하였다(도 4K 참조).
또한, 본 발명자들은 3차원 콜라겐 겔 환경 내에서 배양된 유방암 세포주에 JNK 억제제를 처리하였을 때, 코르탁틴의 발현 감소 및 snail1의 발현 증가 매커니즘 확인 결과, JNK 억제에 의해 증가한 snail1이 코르탁틴의 프로모터에 결합하여 코르탁틴의 발현을 억제함을 확인하였다(도 6A 내지 6D 및 도 6H 참조). 또한, JNK 억제제에 의한 코르탁틴의 mRNA 또는 단백질 수준 조절이 전사단계에서 일어남을 확인하였다(도 6E 내지 6G 참조).
또한, 본 발명자들은 3차원 콜라겐 겔 환경 내에서 배양된 유방암 세포주에 JNK 억제제를 처리하였을 때, snail1 mRNA 발현 증가 매커니즘을 확인한 결과, JNK 억제가 TGFβ의 증가를 유도하여 smad2의 양이 증가하고, 동시에 상기 smad2의 인산화도 증가하면서 snail1의 양이 증가하는 것을 확인하였다(도 7A 내지 7E 참조).
또한, 본 발명자들은 3차원 콜라겐 겔 환경 내에서 배양된 유방암 세포주에 JNK 억제제를 처리하였을 때, 발현이 증가 및 활성화된 smad 단백질들이 snail1의 프로모터 부위에 직접적으로 결합하여 snail1의 전사를 증가시킴을 확인하였다(도 7F 참조).
또한, 본 발명자들은 3차원 콜라겐 겔 환경 내에서 배양된 유방암 세포주에 우성음성(dominant negative) JNK1을 과발현시켜 JNK 활성을 억제하였을 때, snail1의 발현이 증가하고, 코르탁틴의 발현이 감소하였으며(도 8A 참조), 세포 끝 부분이 밋밋해지고 가늘어지면서, 액틴이 축적된(enriched) 부위가 감소하는 것을 확인하였다(도 8B 참조). 또한, JNK1 siRNA를 처리하였을 때, 도 8A와 8B에서 보여진 상기 결과와 동일한 결과를 확인하였다(도 8C 내지 8E 참조).
또한, 본 발명자들은 3차원 콜라겐 겔 환경 내에서 배양된 유방암 세포주에 snail1을 과다발현시켰을 때, 코르탁틴의 발현이 감소하고(도 9A 내지 9C), JNK 억제한 후 snail1을 녹다운(knock-down)시켰을 때 JNK 저해제 처리에 따른 snail1의 발현증가가 더 이상 일어나지 않고, 코르탁틴의 발현이 더 이상 감소하지 않는 것을 확인함으로써(도 9D 및 9E), snail1의 발현이 코르탁틴의 발현에 중요하고, 인바도포디아 형성에 부정적 영향을 주는 것을 확인하였다.
또한, 본 발명자들은 녹색형광 염료(dye)가 연결된 콜라젠이 섞인 3차원 콜라겐 겔 환경 내에서 배양된 유방암 세포주에 의해, 대조군 세포에서 콜라젠의 분해(노란 화살표로 표시된 곳)가 일어나지만, JNK 억제제 처리에 의해 그 분해부위가 돋보이지 않는 것을 확인하였고(도 10A), 코르탁틴 외에 MT1-MMP 단백질이 인바도피아의 또 다른 마커로 사용될 수 있음을 확인하였고(도 10B 참조), 상기 MT1-MMP 단백질이 막의 끝 부분에서 발현 및 위치가 세포의 진행방향에 위치하는 세포막 상에서 발현 위치를 역동적으로 바꾸며 변화가 있으며(도 10C 참조), 반면 JNK 억제제에 의해서 전체적인 발현 및 세포의 위치변화에 차이가 없었으며 발현되거나 상실되는 역동성을 보이지 못하고 세포의 위치 변화도 크게 이루어지지 않았으며(도 10D 참조), 이는 JNK 억제제에 의해 MT1-MMP가 세포의 이동 및 침윤 진행에 있어서 세포의 첨단에 존재하며 세포 외 기질분해를 위한 역할을 하지 못함을 나타낸다.
또한, 본 발명자들은 3차원 콜라겐 겔 환경 내에서 배양된 유방암 세포주에서 JNK 억제제를 처리하였을 때, 상기 억제제가 코르탁틴과 MT1-MMP이 공동으로 발현하는 위치에 영향을 미쳐 세포막에 존재하기보다는 세포질 내 핵 부위에 많이 위치하여 세포외기질 분해와 같은 침윤과 관련된 역할을 수행하지 못함을 확인하였다(도 11 참조).
아울러, 본 발명자들은 3차원 콜라겐 겔 환경 내에서 배양된 유방암 세포주에 JNK 억제제를 처리하였을 때, 상기 억제자에 의해 MT1-MMP의 기능이 억제되어 DQ-콜라젠 및 제 1형 콜라겐 기질을 분해하는 능력이 저해되는 것을 확인하였다(도 12 참조).
따라서, 본 발명자들은 3차원 콜라겐 겔 환경 내에서 배양된 MDA-MB-231 세포주에서 JNK 억제가 snail1의 발현을 증가시키고, 이를 통해 코르탁틴의 발현이 감소하며, 동시에 코르탁틴 및 MT1-MMP의 위치 및 역할에 부정적 영향을 미쳐 인바도포디아 형성을 억제할 뿐 아니라, 제 1형 콜라겐 기질의 분해를 억제하는 것을 확인하였다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명이 하기 실시예에 의해서 한정되는 것은 아니다.
< 실시예 1> 3차원 콜라겐 겔(collagen gel) 환경에서 배양된 유방암 세포주에서 주변환경 변화에 따른 세포 내 단백질의 변화 확인
<1-1> 3차원 세포 배양을 위한 폴리디메틸실록산 ( polydimethylsiloxane ; PDMS) 배양용기 제작
3차원 환경에서 자라는 세포를 공초점 현미경으로 관찰하기 위하여 한쪽 면에 커버 글라스(cover glass)가 부착된 PDMS 배양용기를 제작하였다.
구체적으로, 액체상태의 PDMS 원액과 경화제를 10:1의 비율로 섞어서 100℃에서 1시간 정도 경화시킨 후, 몰드에서 PDMS를 떼어내고 직경 8 mm의 펀치(punch)를 이용하여 PDMS에 구멍을 만들었다. 상기 PDMS 구멍에 산소 플라즈마(oxygen plasma)를 45초 처리하여 커버 글라스(24 x 60 mm, Marienfeld)를 붙인 다음 소수성(hydrophobicity)을 회복하기 위해 60℃ 오븐에서 24시간 건조한 후, UV를 처리하여 사용하였다.
<1-2> 3차원 콜라겐 또는 매트리젤 겔 환경에서 유방암 세포주의 배양
다양한 유방암 세포주를 제 1형 콜라겐(type 1 collagen)의 3차원 환경 내에서 배양하였다.
구체적으로, MDA-MB-231, MDA-MB-436, MDA-MB-468, T47D, BT549, Hs578T 및 MCF7(ATCC, 미국) 세포주를 PureCol 제 1형 콜라겐인 소 콜라겐 I(bovine collagen I; PureCol Type1 collagen, Advanced BioMatrix, 미국) 또는 매트리젤(matrigel; BD Bioscience, 미국)을 이용하여 배양하였다. 이때, 사용한 콜라겐의 최종 농도는 2.5 내지 3 ㎎/㎖이고, 매트리젤은 4 내지 10 ㎎/㎖이 되도록 하였다. 콜라겐의 경우, 세포에 어떠한 영향도 주지 않도록 하기 위해 10x 재형성 용액(reconstitution buffer)[260 mM 탄산수소나트륨(sodium bicarbonate), 250 mM HEPES], 2 N NaOH, 및 무혈청의 10x RPMI(Sigma, 미국)]을 이용하여 강산성의 콜라겐(pH 2) 용액을 중성(pH 7)이 되도록 제조하였다. 상기 제조된 콜라겐 용액은 콜라겐 섬유(fiber)가 충분히 형성될 수 있도록 4℃에서 10분 동안 보관하고, 세포가 바닥에 완전히 붙지 않도록 바닥 부분을 콜라겐 또는 매트리젤로 덮어주기 위하여 직경 8 mm의 PDMS 용기에 10 ㎕ 첨가하여 37℃의 세포 배양기에 30분간 두었다. 상기 바닥 부분의 콜라겐 또는 매트리젤이 굳는 동안 10% FBS 및 페니실린/스트렙토마이신(Invitrogen, 미국)이 포함된 RPMI-1640 또는 DMEM(JBI, 대한민국)에서 배양하던 MDA-MB-231 세포주를 PBS로 2번 세척하고 트립신을 이용하여 떼어내었다. 상기 떼어낸 세포주는 원심분리기로 가라앉힌 후 혈구계산기(hematocytometer)로 그 수를 측정하였고, 상기 제조된 콜라겐 용액에 1 내지 2 x 106 개/㎖의 세포가 들어갈 수 있도록 잘 섞어서, 바닥이 콜라겐 또는 매트리젤로 덮인 PDMS 배양용기에 넣고 37℃ 세포배양기에서 30분 내지 1시간 동안 충분히 굳혀주고 배양하였다.
<1-3> 3차원 콜라겐 겔 환경에서 배양된 유방암 세포주에서 단백질의 변화 확인
상기 실시예 <1-1>의 방법으로 배양된 MDA-MB-231 세포주로 웨스턴 블랏을 수행하여 세포 내의 단백질 변화를 확인하였다.
구체적으로, 상기 실시예 <1-1>의 방법으로 PDMS 배양용기 안에서 배양된 MDA-MB-231 세포주와 섞였던 콜라겐 겔을 마이크로원심분리-튜브(microcentrifuge-tube)에 모아서 5000 rpm으로 1분 동안 원심분리하고 상층액을 제거한 후, 차가운 PBS(130 mM NaCl, 13 mM Na2HPO4, 3.5 mM NaH2PO4, pH 7.4)로 콜라겐 겔 및 세포 펠렛(pellet)을 2번 세척하였다. 여기에 일정량의 용해 용액(lysis buffer)[50 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 1% NP-40 및 0.25% 데옥시콜산 나트륨(sodium deoxycholate)]에 단백질 가수분해효소 억제제 칵테일(protease inhibitor cocktails, GenDepot)을 첨가하여 4℃에서 1시간 동안 용해시켰다. 상기 용해된 샘플(sample)을 13000 rpm으로 30분 동안 원심분리하고 상층액을 모아 4x 샘플 용액(sample buffer)[200 mM Tric-Cl(pH 6.8), 8% SDS, 0.4% 브로모페놀 블루(bromophenol blue), 40% 글리세롤]을 넣고 10 내지 12% SDS-PAGE 전기영동을 수행하였다. 그리고나서 Nitrocellulose Membranes Protran™ 니트로셀룰로오스 막(Whatman)에 이동시킨 후, 5% 탈지 우유(skim milk)로 1시간 동안 전처리하였고, 전처리 후, PBS(130 mM NaCl, 13 mM Na2HPO4, 3.5 mM NaH2PO4, pH 7.4)로 2번 세척하였으며, 항-E-카데린(anti-E-cadherin)(24E10), smad2, smad3, phospho-smad2, phospho-smad3, phospho-MAPKAPK-2(Thr222), phospho-Ser63-c-Jun, c-Jun, snail1(L70G2) 마우스 단일클론항체(Cell signaling, 미국), 및 코르탁틴, HIF1 알파(BD bioscience, 미국), 및 slug, JNK, PCNA(Santa Cruz Biotechnology, 미국), 마우스 단일클론 항-MT1-MMP(Millipore, 미국), 및 TGFβ(1,2,3)(R&D systems, 미국)의 1차 항체를 이용하여 4℃에서 15 시간 동안 반응시킨 후, 다음날 2차 항체를 반응시키고, ECL(Pierce, 미국)을 이용하여 엑스레이 필름에 현상하였다. 밴드의 세기(intensities)는 Image J를 통해 얻었으며, 일부 활성 단백질의 경우에는 총 단백질로서 α-튜블린(α-tubulin)으로 보정한 후 각 상대적인 비율값을 계산했다. 또한, 계산한 값은 스튜던트의 t-test(student`s t-test)를 통해 유의성(significance)을 구했으며, p-값(p-values) < 0.05의 값에 통계적 의미를 두었다.
그 결과, 도 1A에 나타난 바와 같이 배양기간이 길어질수록 c-Jun의 인산화, 코르탁틴 단백질의 발현이 감소하였고, snail1의 발현은 증가하는 것을 확인하였으나, E-카데린, Sanil2/Slug 및 c-Jun의 발현은 변화하지 않는 것을 확인하였다(도 1A). 또한, 암세포는 세포 주변의 미세환경을 이용하여 이동하거나 전이 능력을 갖게 되기 때문에 이러한 세포의 주변환경을 다양한 측면에서 조절해 주었을 때, 상기 결과가 재연되는지 확인하였다. 그 결과, 도 1B에 나타난 바와 같이 세포의 밀도를 조절하거나, 도 1C에 나타난 바와 같이 세포 배양액의 pH의 조절하여 2일간 배양하거나, 도 1D에 나타난 바와 같이 산소의 농도를 5% 이하로 조절하여 4 시간 동안 배양하였을 때, 상기 결과와 비슷하게 c-Jun 인산화 및 코르탁틴의 발현은 감소하고 snail1의 발현이 증가하는 것을 확인하였다(도 1B 내지 1D).
<1-4> 유방암 세포 조직에서 단백질 발현 확인
상기 실시예 <1-3>의 결과가 인간 유방암 세포 조직에서도 동일하게 나타나는지 여부를 확인하기 위하여, 유방암 환자의 암 조직을 이용하여 면역조직염색(immunohistochemical stain)을 수행하였다.
구체적으로, 두 명의 유방암 환자의 조직 2개(case#1 및 case#2)를 각각 4% 파라포름알데하이드(paraformaldehyde)에 고정시키고, 파라핀 블록을 4 ㎛의 두께로 박절하여 건조시켜 파라핀 절편을 제작하였다. 파라핀 포매 조직의 슬라이드는 탈파라핀(deparaffinized)하고 다시 함수(rehydrate)한 후, 3% 과산화수소(hydrogen peroxide)를 10분간 처리하였다. 상기 슬라이드의 한 단면을 10 mM 시트로산염 완충액(citrate buffer)(pH 6.0)에 넣은 후, 20분간 끓이고 pS63-c-Jun, snail1 및 코르탁틴에 대한 항체를 이용하여 4℃에서 18시간 이상 반응시켰다. 2차항체로는 스트렙타아비딘이 결합된 퍼옥시다제(Streptavidin-conjugated peroxidase)를 이용하여 면역염색을 수행하였다. 정상 거위(goat) 혈청 또는 서브타입(subtype)이 일치하는 정상 마우스 IgG를 음성 대조군으로 이용하였다. 상기 슬라이드 단면은 PBS(phosphate-buffered saline)로 수세한 후, 0.03%의 3,3′-디아미노벤지딘 테트라클로라이드(3,3′-diaminobenzidine tetrachloride; DAB)를 20분 동안 첨가함으로써, 관찰가능도록 하였으며, 동시에 마이어 헤마토자일린(Mayer's hematoxylin)으로 대조염색한 후 현미경으로 염색위치를 확인하였다.
그 결과, 도 1E에 나타난 바와 같이 암세포가 전이능력을 갖는 침윤성 종양 네스트(invasive tumor nest) 부분에 c-Jun의 활성을 나타내는 동시에 snail1이 불규칙적으로 분포되어 있는 것을 확인할 수 있었다(그림 1E, 위 Case 1). 그러나 다른 암조직의 경우 (case 2), snail1의 염색이 약화된 부위에서, 핵 내 pS63c-Jun과 세포질의 코르탁틴의 발현은 침윤성 종양의 가장자리(invasive tumor edges)에 더 명백히 나타나는 것을 볼 수 있었다(그림 1E, 아래 case 2).
따라서, 3차원 콜라겐 겔 환경 내에서 배양된 MDA-MB-231 세포주는 다양한 세포 미세환경의 영향을 받아 c-Jun 인산화, 코르탁틴의 발현이 감소하고, 동시에 snail1의 발현이 증가될 수 있음을 확인하였다.
< 실시예 2> 3차원 콜라겐 겔 환경에서 배양된 유방암 세포주에서 JNK 억제제에 의한 세포 모양 및 이동능력의 변화 확인
<2-1> JNK 억제제에 의한 세포 모양의 변화 확인
MDA-MB-231 세포주를 3차원 콜라겐 겔 환경에서 3일 동안 배양하였을 때, 세포는 2차원 배양에서와 달리 세포질 부분이 줄어들고 비교적 가늘고 긴 형태의 말단이 매우 역동적인 모습을 나타내는데, 여기에 JNK 억제제인 SP600125(LC Labs)을 처리한 후, 세포의 모양 및 이동능력의 변화를 확인하였다.
구체적으로, 상기 실시예 <1-1>의 방법으로 배양한 MDA-MB-231 세포주 및 콜라겐이 섞인 겔이 충분히 굳었을 때, 대조군으로 10% FBS가 포함된 배양액 및 실험군으로 SP600125 50 μM이 포함된 배양액을 겔 위에 얻어 3일 동안 배양한 후, 세포의 모양과 겔 속에서의 이동을 현미경으로 관찰하였다.
그 결과, 도 2A 및 2B에 나타난 바와 같이 JNK 억제제인 SP600125를 처리하였을 때, 대조군과 비교하여 세포의 길이가 2배 이상 길어지나, 대조군에서 보였던 세포 말단의 역동적인 모습은 약화되어 세포 및 세포외기질(extracellular matrix; ECM)이 접촉한 부분은 더 밋밋해지고 가늘어지는 것을 확인하였다(도 2A 및 2B).
<2-2> JNK 억제제에 의한 mRNA 및 단백질 발현 변화 확인
3차원 콜라겐 겔 환경에서 배양한 MDA-MB-231 세포주에 JNK 억제제를 처리하였을 때, mRNA 및 단백질의 발현 변화를 확인하기 위하여 RT-PCR 및 웨스턴 블랏을 수행하였다.
구체적으로, 상기 실시예 <2-1>에서 SP600125를 처리하여 배양한 세포주로부터 전체 RNA는 TRIzol®(invitrogen, 미국)을 이용하여 mRNA를 준비하고, AmfiRivert cDNA Synthesis Master Mix(GenDePot)를 사용하여 cDNA를 합성한 후, Thermo Scientific DreamTaq Green PCR Master Mix(Thermo Scientific)로 PCR을 수행하였다. PCR에 사용된 프라이머는 하기 표 1에 나타난 바와 같다. PCR 수행 후, 아가로즈 겔에서 전기영동하여 DNA 밴드를 확인하였고, 밴드의 세기(intensities)는 Image J를 통해 얻었으며, 총 mRNA으로서 GAPDH mRNA 수준을 기준으로 발현량을 보정한 후 각 상대적인 비율값을 계산했다. 또한, 계산한 값은 스튜던트의 t-test(student`s t-test)를 통해 유의성(significance)을 구했으며, p-값(p-values) < 0.05의 값에 통계적 의미를 두었다. 또한, 단백질 발현 변화를 확인하기 위해서는 상기 실시예 <1-3>의 방법을 사용하여 웨스턴 블랏을 수행하였다.
프라이머 서열 서열번호
Cortactin F CCTGGAAATTCCTCATTGGA 1
Cortactin R CACAAAATCAGGGTCGGTCT 2
JNK1 F TTGGAACACCATGTCCTGAA 3
JNK1 R ATGTACGGGTGTTGGAGAGC 4
Snail F GGTTCTTCTGCGCTACTGCT 5
Snail R TAGGGCTGCTGGAAGGTAAA 6
Smad2 F CGAAATGCCACGGTAGAAAT 7
Smad2 R CCAGAAGAGCAGCAAATTCC 8
Smad3 F CCCCAGAGCAATATTCCAGA 9
Smad3 R GGCTCGCAGTAGGTAACTGG 10
Twist F GGAGTCCGCAGTCTTACGAG 11
Twist R TCTGGAGGACCTGGTAGAGG 12
Slug F GGGGAGAAGCCTTTTTCTTG 13
Slug R TCCTCATGTTTGTGCAGGAG 14
GAPDH F GAGTCAACGGATTTGGTCGT 15
GAPDH R GACAAGCTTCCCGTTCTCAG 16
그 결과, 도 2C에 나타난 바와 같이 JNK 억제제의 처리 시간이 증가함에 따라, snail1 및 snail1과 같은 패밀리(family)로 알려진 다른 전사인자인 Twist의 mRNA는 증가하였고, 반면에 코르탁틴의 mRNA는 감소하였으며, Snail2/slug mRNA의 발현량은 변하지 않는 것을 확인하였다(도 2C). 더욱이 snail1의 mRNA levels은 E-cadherin(CDH1) mRNA 및 단백질의 발현 수준의 변화를 유발하지 않음으로써, snail1은 E-cadherin의 억제와 관계가 없음을 알 수 있었다 (그림 2C 및 D).
또한, 도 2D에 나타난 바와 같이 JNK 억제제의 농도를 다양하게 처리하였을 때, snail1의 증가 및 코르탁틴의 감소가 JNK 억제제 농도에 의존적으로 나타나고 있음을 확인하였다(도 2D). 아울러, 이러한 JNK 억제제가 다른 MAPK 계열의 단백질인 p38이나 ERK 인산화에는 영향을 미치지 않음을 확인하였다(도 2D). 이는 3차원 콜라겐 겔 환경에서 snail1 발현 증가를 위한 신호전달 체계는 MAPK들 간의 상호작용이 관련하는 것이 아니라 JNK의 역할에 의한 것임을 나타내고, 따라서 JNK의 억제가 snail1의 발현을 특이적으로 유도하는 것을 확인하였다.
*<2-4> JNK 억제제에 따른 코르탁틴 발현 감소 및 세포길이 변화의 관계성 확인
JNK 억제에 따라 나타난 코르탁틴 발현의 감소와 세포의 길이가 길어지는 관계성에 대해 확인하기 위하여, 코르탁틴 단백질을 과량 발현하여 JNK 억제제에 의한 세포모양의 변화를 확인하였다.
구체적으로, 상기 실시예 <2-1>에서 SP600125를 처리하여 배양한 세포주에서 코르탁틴의 과량발현을 유도하여 3일 동안 3차원적 콜라겐 겔 속에서 배양한 후, 세포의 모양과 겔 속에서의 이동을 현미경으로 관찰하였다.
그 결과, 도 2E에 나타난 바와 같이 JNK 억제제에 의해 길어졌던 세포의 모양변화는 코르탁틴의 과량발현으로 인해 억제되는 것을 확인하여(도 2E), JNK 억제에 의해 세포가 길어지면서 세포 이동/침윤에 중요한 코르탁틴의 발현이 억제되었음을 확인하였다.
<2-4> JNK 억제제에 의한 암세포의 이동 및 기질 분해능력 감소 확인
3차원 콜라겐 겔 내에서 자라는 세포의 역동적인 행동을 JNK 억제제인 SP600125가 방해하여 암세포의 이동 및 기질 분해능력이 감소되었음을 확인하기 위해서, 지속-촬영 영상(time-lapse imaging)을 통해 실시간으로 3차원 콜라겐 내에서 세포의 모양 변화와 이동능력을 추적하였다.
구체적으로, 상기 실시예 <1-1>의 방법으로 배양한 MDA-MB-231 세포주 및 콜라겐이 섞인 겔이 충분히 굳었을 때, 대조군으로 10% FBS가 포함된 배양액 및 실험군으로 SP600125 50 μM이 포함된 배양액을 겔 위에 얻어 3일 동안 배양하였다. 2일에 한 번씩 배양액을 교체해 주었으며, 지속-촬영 영상을 위하여 배양기에서 30분 내지 1시간 동안 굳혀진 대조군과 SP600125가 처리된 실험군을 올림푸스 IX81-ZDC 현미경으로 30분마다 한 장씩 20시간 동안 37℃, 5% CO2에서 촬영하여 결과 영상을 얻었다.
그 결과, 도 2F 및 2G에 나타난 바와 같이 JNK를 억제하였을 경우 세포의 이동이 현저히 감소하는 것을 특정 세포들의 이동을 통해 알 수 있었고(도 2F, 흰 화살 머리표시), 이때 세포의 이동경로와 이동량의 변화를 추적하여 그래프로 나타내었을 때 이동거리에 더욱 현저한 차이가 있음을 확인하였다(도 2G).
< 실시예 3> 3차원 매트리젤 ( matrigel ) 환경에서 배양된 유방암 세포주에서 JNK 억제제에 의한 영향 확인
상기 <실시예 2>의 결과가 다른 ECM인 매트리젤에서 배양되었을 때에도 동일한 효과를 나타내는지 확인하였다.
구체적으로, MDA-MB-231 세포주를 SP600125를 처리한 3차원 매트리젤 환경에서 배양하여 상기 실시예 <2-1>의 방법으로 세포의 모양 변화를 확인하였고, 또한, 상기 실시예 <1-3>의 방법으로 단백질 발현 변화를 확인하였다.
그 결과, 도 3A 및 3B에 나타난 바와 같이 JNK 억제제를 처리하여도 세포의 모양 변화가 나타나지 않았고(도 3A), 동시에 snail1 단백질 발현의 증가를 확인할 수 없었다(도 3B). 또한, 다른 MAPK인 p38이나 ERK 억제제가 JNK를 억제하였을 때와 비슷한 영향을 주는지 확인한 결과, ERK의 억제는 코르탁틴의 발현에는 영향을 주지 않았으나, snail1의 발현을 증가시키는 것을 확인하였다(도 3D). 그러나, ERK 억제제를 처리하였을 때, 세포의 정상적인 성장이 나타나지 않고 죽어가는 성향을 나타냈기 때문에 이때, snail1의 증가는 세포의 죽음과 연관되어 있으며, 또한 ERK 저해제 처리 시, 코르탁틴의 발현이 감소하지 않았기에, 이는 JNK 억제에 의해 나타나는 영향과 다른 것으로 확인되었다.
< 실시예 4> 3차원 콜라겐 겔 환경에서 배양된 유방암 세포주에서 JNK 억제제에 의한 코르탁틴의 발현 감소 확인
<4-1> 3차원 콜라겐 겔 환경에서 배양된 유방암 세포주에서 JNK 억제제에 의한 인바도포디아(invadopodia) 생성 확인
3차원 콜라겐 겔 환경에서 배양된 유방암 세포주에서 JNK 억제제에 의한 세포 모양 및 이동능력의 변화를 명확히 확인하고자, 면역형광염색(immunofluorescence)을 수행하여 인바도포디아의 형성을 세포와 콜라겐 ECM이 접한 부위의 세포막에서 확인하였다.
구체적으로, SP600125를 처리한 3차원 콜라겐 겔 환경에서 배양된 MDA-MB-231 세포주를 4% 포름알데하이드(formaldehyde, Sigma, 미국)로 30분 동안 고정한 후, 상기 포름알데하이드를 제거하고 100 mM PBS-글라이신(glycine) 용액으로 30분 동안 반응시켰다. 이에 0.5% 트리톤 X-100(triton X-100)을 이용하여 30분간 투과화(permeabilization)하고, 이 때, 콜라겐 겔 안에 있는 세포에 용액이 충분히 닿을 수 있도록 반응 시간을 적절히 조절하였다. 그리고나서 3% BSA 용액으로 2시간 동안 전처리하고, F-액틴(F-actin)에 로다민 팔로이딘(rhodamine palloidine, 적색)으로 상온에서 4시간 이상 염색한 후, 세척용액[PBS 용액(pH 7.4)에 0.2% 트라이톤 X-100, 0.1% BSA, 0.05% 트윈 20을 첨가하고 0.22 ㎛ 필터를 이용하여 살균]을 이용하여 세척하고, Alexa488®로 표지된 코르탁틴(녹색) 항체를 이용하여 4℃에서 18시간 이상 염색하였다. 그리고나서 마지막으로 핵의 형태를 보기위해 DAPI(4',6-diamidino-2-phenylindole; 청색, molecular Probe) 염색을 수행하였다. 이때, 염색 상태에 따라 항체를 넣고 반응하는 시간을 조절하였으며, 상기 염색된 세포는 올림푸스 FV1000 공초점 현미경 및 니콘 Eclipse Ti 공초점 현미경으로 관찰하여 촬영하였다. 촬영한 공초점 현미경의 Z-stack 영상은 일부 공초점현미경의 z-stacks 이미지는 IMARIS software의 Easy 3D modes 기능을 이용해서 3D 이미지로 재구성하였다. 재구성된 이미지의 정량적 동시위치(colocalization)는 ImarisColoc 및 surpass module을 이용해서 분석되하여 시각화(visualization)하였다.
그 결과, 도 4A, 4B 및 4C에서 나타난 바와 같이 대조군(도 4A) 및 실험군(도 4B)의 3차원 콜라겐 겔 안에서 배양된 세포를 공초점 현미경으로 관찰하여 각 채널별로 나타낸 단면을 도 4A 및 도 4B에 각각 나타내었으며, 이를 바탕으로 3차원으로 영상을 구성한 도를 도 4D에 재구성하여 나타내었고, 이때 특정 부분을 구획으로 나누어 형광 강도 프로파일(intensity profile)(아래 오른쪽)을 통해 대조군 및 실험군의 차이를 구분하여 나타내었다. 상기 결과와 동일한 맥락에서, 면역형광분석법을 통해 살펴본 결과, JNK 억제제를 처리한 세포주에서 세포가 길어지며 역동적인 모습이 약화되어 액틴뿐만 아니라 코르탁틴의 발현도 감소하고 있음을 관찰하였다(도 4D). 또한, 세포막 부근에 액틴-풍부한 스폿(actin-enriched spot) 및 코르탁틴이 동시에 발현되는 노란색(흰 화살머리 표시)을 나타내는 부분에서 기질(matrix)이 분해될 것이고, 상기 노란색 부분이 인바도포디아(invadopodia, 침투족)임을 확인하였다. 상기 침투족의 형성이 JNK 저해에 의해 감소함을 XZ 구획(section)을 통한 특정 위치에서의 선강도 프로파일(line intensity profile)을 통해 확인하였고, 대조군에서는 액틴-풍부한 스폿(적색) 및 코르탁틴(녹색)의 발현 위치와 발현 강도도 거의 유사하나, JNK 억제제가 처리된 실험군에서는 일부에서만 액틴-풍부한 스폿(적색)이 관찰되었다. 또한, 도 4C에서 나타난 바와 같이 액틴과 코르탁틴이 공존하는 인바도포디아를 통계화한 영상 및 그래프를 통해서 JNK 억제에 따라 인바도포디아가 감소함을 정량적으로 확인하였다(도 4C).
또한, JNK 억제제에 의한 코르탁틴의 발현 양상을 좀 더 정확히 확인하기 위하여 GFP-코르탁틴으로 공초점 현미경을 사용하여 3차원 콜라겐 겔 내에서 코르탁틴의 발현 양상 변화와 세포 형태변화를 실시간 촬영한 결과, 도 5에 나타난 바와 같이 대조군에서는 코르탁틴이 세포가 이동하고자 하는 방향의 세포막에 발현하여 역동적으로 발현위치가 바뀌며 움직이고 있는 것을 확인하였으며(흰 화살머리 표시), JNK 억제제를 처리하였을 때는 세포가 이동하지 못하고 코르탁틴의 발현이 감소하여 세포막에 위치하지 못하는 것을 확인하였다(도 5).
<4-2> 다양한 유방암 세포주에서 3차원 콜라겐 겔 배양에 따른 JNK 억제제에 의한 인바도포디아(invadopodia) 생성 확인
3차원 콜라겐 겔 환경에서 배양된 유방암 세포주에서 JNK 억제제에 의해 인바도포디아가 형성된 결과가 인간의 유방암 세포에서 나타나는 일반적인 현상인지 확인하기 위해, 기존에 3 차원 콜라겐 내에서 유방암세포를 배양하게 되면 구형(round), 거대(mass), 포도-형태(grape-like) 및 성상(stellate) 형태로 구분되는 4종류의 모양이 다른 세포그룹의 다양한 유방암 세포주를 3차원 콜라겐 겔 환경에서 배양했을때 JNK 억제제에 의해 인바도포디아의 형성이 나타나는지 확인하였으며, 단백질의 발현 변화를 확인하기 위하여 웨스턴 블랏을 수행하였다.
구체적으로, SP600125를 처리한 3차원 콜라겐 겔 환경에서 MDA-MB-436, MDA-MB-468, MDA-MB-453, T47D, BT549, Hs578T 및 MCF7 세포주를 배양한 후, 상기 실시예 <4-1>과 동일한 방법으로 면역형광분석하여 인바도포디아의 형성을 확인하였으며, 상기 실시예 <1-3>과 동일한 방법으로 웨스턴 블랏을 수행하여 세포 내 단백질의 발현 수준을 확인하였다.
그 결과, 도 4E 내지 도 4I에서 나타난 바와 같이, 동일한 조건으로 콜라겐에 포매(embedding)하였을 때 성상 형태 그룹인 MDA-MB-231 세포에서 나타나는 JNK 억제에 의한 세포의 모양변화와 코르탁틴 및 sanil1의 발현 양상을 거대 형태 그룹인 T-47D, MCF-7 세포주, 포도-형태인 MDA-MB-468 세포주, 및 성상 형태 그룹인 MBA-MB-436 세포주에서도 동일하게 나타내는 것을 확인하였다(도 4E 및 도 4F). 또한, 성상 그룹 형태인 기저(basal) 유방암 세포주 그룹인 BT-549, Hs578T 세포주의 세포 모양이 길어지고 액틴이 위치화된(colocalized) 스폿의 수가 감소하는 것을 확인하였다(도 4I).
아울러, 세포 내 단백질 수준의 변화에 있어서, 성상 형태 그룹인 MDA-MB-231 및 MDA-MB-436 세포주는 코르탁틴의 발현이 감소하고 snail1의 발현이 증가하는 것을 확인하였으나, 거대 그룹 및 포도-형태 그룹의 세포주에서는 나타나지 않았다(도 4E 내지 도 4G). 그러나 MDA-MB-231 과 MBA-MB-436 세포에서 JNK억제에 의해 snail1이 유도된 것과는 달리, E-cadherin, α-평활근 액틴(α-smooth muscle actin, α-SMA) 및 비멘틴(vimentin) 같은 EMT 마커의 발현은 변하지 않았다(그림 4H). 이를 통해 기저 유방암 세포주이면서 3 차원 배양에서 성상 형태로 자라는 일부 유방암 세포주에서 pS63c-Jun, Snail1 및 코르탁틴과 관련된 신호에 의해 낮은 침습성(invasive)을 나타내는 것을 확인하였다.
<4-3> 3차원 콜라겐 겔 환경에서 배양된 유방암 세포주에서 JNK 억제제에 의한 콜라겐 1 분해 확인
JNK 억제제를 3 차원 콜라겐 겔에서 배양된 유방암 세포에 처리하였을 때 세포에 의해 1형 콜라겐의 분해가 실제로 일어나는지 확인하였다.
구체적으로, SP600125를 처리한 3차원 콜라겐 겔 환경에서 배양된 MDA-MB-231 세포주에 DQTM-collagen I을 처리하여 세포를 실시간으로 모니터링하며 콜라겐 매트릭스가 액틴-풍부한 스폿 부분에서 분해되는 지를 확인했다.
그 결과, 도 4K에서 나타난 바와 같이 대조군에서는 세포가 이동하는 방향 쪽으로 콜라겐 분해(녹색 스폿 및 화살표시)가 나타나는 것을 확인한 반면, JNK가 억제된 세포에서는 콜라겐 매트릭스가 분해되지 못해 녹색 스폿이 나타나지 않는 것을 확인하였다(도 4K).
< 실시예 5> 3차원 콜라겐 겔 환경에서 배양된 유방암 세포주에서 JNK 억제제에 의한 snail1의 증가 및 코르탁틴의 발현 감소 매커니즘 확인
<5-1> JNK 억제제에 의한 단백질의 변화 매커니즘 확인
JNK 억제제에 의해 snail1의 증가 및 코르탁틴의 발현 감소가 전사인자인 c-Jun이 snail1의 프로모터 부위에 결합하여 snail1의 발현을 조절하는지, 그리고 snail1이 직접적으로 코르탁틴의 프로모터 부위에 결합하여 코르탁틴의 발현을 조절하는지 확인하기 위하여, 세포 내 단백질과 염색질(chromatin) 간의 상호 결합 및 활성화를 연구하기 위해 가장 흔히 사용되는 생체 내(in vivo) 방법 중 하나인 ChIP(chromatin immunoprecipitation) 분석을 수행하였다.
구체적으로, 3차원 콜라겐 겔 환경에서 배양한 MDA-MB-231 세포주를 4% 포름알데히드로 30분 동안 고정한 후, 1.5 M 글라이신으로 처리하였고, 단백질 가수분해효소 억제제가 들어가 있는 차가운 PBS로 세척하였으며, 상기 고정된 3차원 세포는 단백질 가수분해효소/인산화효소 억제제가 첨가된 SDS-용해 완충액을 넣고 음파처리(sonication)하여 용해시켰다. 상기 용해된 샘플을 13000 rpm으로 3분 동안 원심분리한 후, 마이크로원심분리-튜브로 옮기고 염색질 분열(chromatin fragmentation)을 위해 다시 한 번 음파처리한 뒤 원심분리하여 상층액만 취해 일부는 투입(input)으로 옮기고, 일부는 phospho-Ser63-c-Jun, snail1 및 smad 2/3/4(cell signaling technology, 미국) 항체를 첨가하여 4℃에서 18시간 이상 반응시켰다. 상기 반응시킨 튜브를 4℃에서 꺼낸 후, 단백질 A 및 G가 1:1의 비율로 코팅된 세파로스 비드(sepharose bead)를 넣고 4℃에서 4시간 반응시키고, RIPA/150 mM NaCl 용액으로 세척하였으며, RIPA/350 mM NaCl 용액으로 다시 한 번 세척하였다. 상기 세척한 샘플을 LiCl 세척 용액으로 세척 후, TE(Tris/EDTA) 용액으로 3회 더 세척하고, 여기에 TE 용액을 넣고 65℃에서 15시간 동안 반응시켰다. 반응 3일째 각각의 투입(input) 및 샘플에 RNase A를 넣고, 37℃에서 반응시켰으며, 단백질 분해효소(proteinase) K를 첨가하고 55℃에서 1시간 동안 반응시킨뒤, 1:1 비율의 페놀/클로로포름을 넣고 볼텍싱(voltexing) 후 원심분리하였다. 상기 원심분리한 상층액을 모아 TE/200 mM NaCl과 글리코겐(glycogen)을 넣고 한 번 더 원심분리하여 에탄올 침전(precipitation)을 수행하였다. 원심분리 후 수득된 DNA 펠렛은 자연건조시키고, 멸균된 증류수에 녹여 하기 표 2에 나타난 프라이머를 이용하여 PCR을 수행하였다.
프라이머 서열 서열번호
Snail1 p1F TCCAAACTCCTACGAGGC 17
Snail1 p1R GAAGAAGTGGCAACTGCT 18
Snail1 p2F AGCAGTTGCCACTTCTTC 19
Snail1 p2R GCAAAGGGAAGTGTGCTT 20
Snail1 p3F GGAGACGAGCCTCCGATT 21
Snail1 p3F CAGTAGCGCAGAAGAACCACT 22
Snail1 pnF CGTAAACACTGGATAAGGG 23
Snail1 pnR GGAAACGCACATCACTGG 24
Cortactin F1 CCTTCACATCTTGGCTAA 25
Cortactin R1 CTAGAAGGTGAGTCAAGC 26
Cortactin F2 GAGGGAGGATGGAGAGATGA 27
Cortactin R2 AGAGCTCGCCCGCAACTAG 28
Cortactin F3 TCTGCAGACTCGCCACAG 29
Cortactin R3 CAGGCACCAGGCTCTACTTC 30
Cortactin nF AGTGTTATGATTACAGGC 31
Cortactin nR ATAGAGCACAGCGAAGAC 32
Smad p1F AGCACACTTCCCTTTGCATT 33
Smad p1R CACCCGTTCCTTCCCTTATC 34
Smad p2F AATTTCCGCCCCCTCCCAA 35
Smad p2R ACTCCTCCGAGGCGGGGTT 36
Smad p3F GTCGGAAGGTCAGGTGTCC 37
Smad p3R GACGTCGAGCGAAGCGAG 38
Smad p4F GGAGACGAGCCTCCGATT 39
Smad p4R CAACTCCCTTAAGTACTC 40
그 결과, 도 6A 내지 6D에서 나타난 바와 같이 JNK 억제제를 처리하였을 때 암세포 내에서 snail1의 발현이 증가하며 동시에 코르탁틴의 발현이 감소하는 것을 확인하였으며(도 6B), 대조군에서 활성화된 c-Jun이 snail1 프로모터에 결합하였다가 JNK 억제제 처리해 의해 인산화된 c-Jun이 사라짐에 따라 결합이 사라지는 것을 확인하였다(도 6C). 이는 평상시 JNK 하위인자인 c-Jun의 인산화가 snail1의 전사에 영향을 미칠 수 있음을 나타내며, JNK 억제제 처리시 c-Jun이 snail1 프로모터 부위에 붙지 않음으로써, JNK 억제제 처리에 따른 snail1의 발현 유도는 c-Jun이 아닌 다른 인자들에 의한 형상일 수 있음을 나타낸다(도 5). 또한, JNK 억제에 의해서 증가한 snail1이 전사수준에서 코르탁틴을 조절할 것이라 예상하고 항-snail1 항체를 이용한 ChIP 분석을 수행한 결과 JNK 억제에 의해서 증가한 snail1이 코르탁틴 프로모터에 결합할 수 있음을 확인하였다(도 6D). 또한, snail1은 E-카데린(E-cadherin)의 프로모터 부위에 결합하여 E-카데린의 발현을 억제하는 것이 이미 공지되어 있고 snail1은 유전자 전사의 억제를 유도하는 전사 억제자 군으로 인식되기 때문에(Hemavathy K, Ashraf SI, Ip YT. Snail/slug family of repressors: slowly going into the fast lane of development and cancer. Gene. 2000;257:1-12.), 본 발명자들은 상기 결과를 통해서 JNK 억제에 의해 증가한 snail1이 코르탁틴 프로모터에 결합하여 코르탁틴의 발현을 억제한 것임을 확인하였다.
<5-2> 유방암 세포주에서 JNK 억제제에 의한 snail1 및 코르탁틴 프로모터의 단백질-DNA 복합체 형성 확인
상기 실시예 <5-1>의 결과를 snail1 및 코르탁틴 프로모터의 단백질-DNA 복합체 형성 확인을 통해 다시 한 번 명확히 확인하기 위해, 일반적으로 DNA 결합 단백질을 32P 방사성동위원소로 표지된 프로브(probe)를 사용하여 크기가 증가하는 것을 네이티브 아크릴아미드 겔(native acrylamide gel)에서 확인할 수 있는 EMSA(electrophoretic mobility shift assay)를 수행하였다.
구체적으로, 3차원 콜라겐 겔 환경에서 배양한 MDA-MB-231 세포주 펠렛(pellet)으로부터 50 mM HEPES pH 7.9, 50 mM KCl, 300 mM NaCl, 0.1 mM EDTA, 1 mM DTT, 0.1 mM PMSF 및 10% 글리세롤을 포함하는 완충용액 C를 이용해 핵 추출물(nulear extract)를 준비하였다. 그런 다음, 미리 32P를 표지한 프로브 2nM(서열 번호: 50; 28-mer, 5’-tagcgcttagccagctgcgggcggaccc-3’)를 준비된 핵 추출물 10 내지 15 ㎍과 반응하여 코르탁틴 프로모터 부위에 결합하는 것으로 확인한 snail1이 상기 프로브와 결합을 유도하였다. 유도 후, 6% 비-변성 폴리아크릴아미드 겔(nondenaturing polyacrylamide gel)에서 90 mM 트리스 염기, 90 mM 볼릭산, 및 0.5 mM EDTA를 포함하는 0.5×TBE(트리스/볼릭산/EDTA; Tris/borate/EDTA) 완충용액, pH 8.0을 이용하여 70 V에서 2 시간 동안 전개한 후, 겔을 2 시간 동안 건조하고 동위방사성을 X-레이 필름에 노출시켜 snail1-DNA 복합체를 확인하였다.
또한, 보다 정확한 확인을 위해서 프로브를 핵 추출물과 반응시키기 전에 snail1 항체(Cell Signaling Technology, Inc.)를 이용하여 단백질과 DNA의 복합체에 항체가 추가적으로 결합함으로써 겔 상에서 운동성을 덜 이동시키는 수퍼시프트(Supershift)를 사용하거나, 프로브와 같은 비표지된 이중-나선 올리고뉴클레오티드를 약 100배 정도 과량으로 반응시켜 경쟁적 결합을 통해 snail1의 밴드를 약화시키는 단계를 적절히 추가하였다.
그 결과, 도 6H에서 나타난 바와 같이 3차원 콜라겐 겔에서 배양된 세포에서 JNKs 억제에 의해서 증가된 snail1은 코르탁틴 프로모터에 직접 결합함으로써, 코르탁틴의 발현을 억제하는 것을 확인하였다(도 6H).
<5-3> JNK 억제제에 의한 mRNA 또는 단백질 수준조절 확인
상기 실시예 <5-1>의 결과가 추가적으로 mRNA 수준에서 조절되는지, 단백질 수준에서 조절되는지를 확인하기 위하여 웨스턴 블랏, RT-PCR 및 실시간 PCR(real time PCR)을 수행하였다.
구체적으로, 전사(transcription) 단계를 억제하도록 조절해주는 액티노마이신 D(actinomycin D; ActD)를 처리하여 새로운 mRNA의 합성을 억제하거나, 사이클로헥사마이드(cyclohexamide; CHX)를 처리하여 새로운 단백질의 합성을 억제한 후, 상기 실시예 <1-3> 및 <2-2>의 방법을 이용하여 웨스턴 블랏, RT-PCR 및 실시간 PCR을 수행하였고, 실시간 PCR은 SYBR Green PCR Master Mix(Applied Biosystems, 미국)을 사용하여 7900HT Fast real time system(Applied Biosystems, 미국)을 이용하여 수행하였다.
그 결과, 도 6E 내지 6G에 나타난 바와 같이 ActD를 처리하게 되면 코르탁틴의 수준이 JNK 억제에 의해서 더욱 현저히 감소하는 것을 RT-PCT(도 6E) 및 실시간 PCR(도 6F)로 확인하였고, CHX를 처리하여 새로운 단백질의 합성을 저해하였을 경우에는 JNK 억제제를 처리하여도 대조군과 비교하였을 때, 코르탁틴 단백질의 발현에 차이를 나타내지 않았다(도 6G). 즉, 상기 결과는 JNK 억제가 snail1 또는 코르탁틴 mRNA의 안정성이나 단백질의 안정성에 변화를 주어 궁극적으로 snail1이 증가하고, 코르탁틴이 증가하는 것은 아닌 것으로 확인되었다. 따라서, 3차원 콜라겐 겔 환경 내에서 배양된 MDA-MB-231 세포에서 JNK가 억제되었을 때 나타나는 코르탁틴의 감소는, 발현이 증가한 snail1이 전사단계에서 코르탁틴 프로모터에 결합하여 전사를 억제함으로써 코르탁틴 mRNA 수준을 감소시켜 결국에는 코르탁틴 단백질 수준까지 감소시킴을 확인하였다.
<5-4> JNK 억제제에 의한 snail1의 mRNA 또는 단백질 수준조절 확인
JNK를 억제하였을 때, snail1 mRNA가 증가하는 매커니즘을 확인하기 위하여, snail1을 조절하는 것으로 알려진 smad 2 및 3의 발현을 mRNA 및 단백질 발현 수준에서 변화를 확인하였다.
구체적으로, TGFβ1 경로(pathway)는 리간드(ligand)인 TGFβ1 및 그 수용체인 TGFβ1-수용체(receptor) I과 TGFβ1-수용체 II의 결합에 의해 유도된다. 상기 수용체들이 TGFβ1에 의해 활성화되면 smad2 또는 smad3를 인산화시켜 활성화되도록 하며, 이는 smad4와 복합체(complex)를 형성한 후, 핵 안으로 이동하여 전사인자(transcription factor)로서 작동하게 된다. 따라서, 본 발명자들은 5일에 걸쳐 세포를 배양하였을 때 나타나는 코르탁틴, smad 2 및 3, 및 snail1의 mRNA 수준을 상기 실시예 <2-2>의 방법으로 확인하였다. 또한, 단백질 발현 수준을 확인하기 위해 상기 실시예 <1-3>의 방법을 사용하였다.
그 결과, 도 7A에 나타난 바와 같이 5일에 걸쳐 세포를 배양하게 되면 코르탁틴 mRNA 수준은 점차 감소하며, snail1 mRNA 수준은 증가하다가 배양기간이 길어짐에 따라 다시 점차 감소하고 있음을 확인하였다(도 7A). 그러나 snail1의 발현을 조절할 것이라고 알려진 smad2 및 3의 mRNA 수준에는 변화가 없는 것으로 확인되어 snail1의 발현이 smad2 및 3의 mRNA 수준과는 무관한 것으로 확인되었다.
반면에 단백질 발현수준을 확인한 결과, 도 7B 내지 7D에 나타난 바와 같이 5일에 걸쳐 3차원 콜라겐 겔 환경에서 배양하였을 때 snail1의 발현이 증가하는 시기에 TGFβ1, smad2 및 3의 단백질 발현이 점차 증가하면서 smad2의 활성화(인산화)가 증가하는 것을 확인하였다(도 7B). 또한, 상기 결과는 JNK 억제와 세포 외부의 pH 조절에 의해서도 동일하게 관찰되었다(도 7C 및 7D). 따라서, snail1의 발현은 smad2 또는 smad3 단백질 양의 변화 및 smad2의 인산화와 상관관계가 있음을 확인하였고, 이는 도 7E에 나타난 바와 같이, smad2, 3 및 4 각각의 shRNA(short-hairpin RNA)를 이용하는 실험을 통해서 재확인되었다. 보다 상세하게는 각각의 smad 2, 3 및 4 shRNA를 처리한 결과, smad2 또는 smad4의 발현을 낮추었을 때만 snail1 발현의 증가 및 코르탁틴 발현의 감소와 같은 JNK 억제제 처리에 의한 현상이 억제되거나 더 이상 나타나지 않음을 확인하였다(도 7E).
따라서, 3차원 콜라겐 겔 환경내에서 JNK 억제가 TGFβ1의 증가를 유도하여 smad2의 양이 증가하고, 동시에 상기 smad2의 인산화도 증가하면서 snail1의 발현 양이 증가하는 것으로 확인되었다.
<5-5> JNK 억제제에 의한 snail1의 단백질 발현량 증가 매커니즘 확인
smad 2 및 4에 의한 snail1 단백질 발현양의 증가가 전사 수준에서 직접적으로 snail1의 전사 수준에 영향을 주는지 확인하기 위하여 smad 2, 3 및 4 각각의 항체를 이용하여 ChIP 분석법을 수행하였다.
구체적으로, 3차 콜라겐 겔 환경 내에서 smad는 "CAGA"라는 smad 결합 요소(binding element)(Dennler et al., 1998)가 공지되어 있기 때문에 snail1 프로모터 부위에 smad 결합 요소가 있는지 확인한 후, snail1 프로모터 부위에 smad 결합 요소로 추측되는 지역을 중심으로 프라이머를 디자인해서 ChIP 분석을 수행하였다. 프라이머는 상기 표 2에 나타낸 프라이머를 사용하여 ChIP 분석을 수행하였다.
그 결과, 도 7F에 나타난 바와 같이 JNK 억제에 의해서 smad2 및 4로 면역침강(immunoprecipitation)을 수행했을 때만 smad와 snail1 프로모터 부위의 결합하는 것이 확인되었다(도 7F). 이는 3차원 콜라겐 겔 환경 내에서 MDA-MB-231 세포가 JNK 억제에 의해 smad2 및 4의 발현을 증가 및 활성화시키며, 활성화된 smad 단백질들이 snail1의 프로모터 부위에 직접적으로 결합하여 snail1의 전사를 향상시켜 mRNA를 증가시킴을 확인하였다.
< 실시예 6> 3차원 콜라겐 겔 환경에서 배양된 유방암 세포주에서 JNK 활성 및 단백질 수준의 감소에 의한 인바도포디아(invadopodia) 형성저하 확인
3차원 콜라겐 겔 환경 내에서 세포의 기능을 확인하는 과정에서 우성음성(dominant negative) JNK1을 세포 내에 과다발현시켜 JNK 활성을 억제시키는 경우에도 JNK 억제제를 처리하였을 때와 동일하게 snail1 발현 증가 및 코르탁틴 발현 감소가 나타나는지 확인하기 위하여 실시예 <1-2>의 웨스턴 블랏 및 <실시예 4>의 면역형광염색을 수행하였다.
그 결과, 도 8A 및 8B에 나타난 바와 같이 우성음성 JNK1을 과다발현시켰을 때 snail1 발현이 증가하고, 코르탁틴의 발현이 감소하였으며(도 8A), 세포의 모양도 JNK 억제제를 처리하였을 때와 동일하게 길쭉해지는 것을 확인하였다. 또한, 세포 내에 적색 스폿(spot)으로 나타나는 부분은 액틴-풍부한 부분으로 인바도포디아로 여겨지며, 상기 부분에서 기질 및 세포의 연결(connection)이 주로 이루어질 것이고, 3차원 영상에서 나타나듯이 대조군에서는 이러한 액틴-풍부한 스폿이 많이 관찰되지만, 우성음성 JNK1이 과다발현된 세포에서는 적색 스폿의 수가 현저히 감소한 것을 선강도 프로필(line intensity profile)을 통해 확인하였다. 또한, 3차원 콜라겐 내에 세포 끝 부분의 역동적인 세포 모양이 JNK1 활성이 억제됨으로써 더욱 단순해지는 것을 확인하였다(도 8B).
상기 결과를 재확인하기 위하여 JNK1 siRNA를 이용하여 동일한 실험을 한 결과, 도 8C 내지 8E에 나타난 바와 같이 JNK1 mRNA 수준이 감소할 때, snail1의 mRNA 수준이 증가하고, 코르탁틴의 mRNA 수준이 감소하였으며(도 8C), JNK1 단백질 수준을 감소시켰을 때, 대조군과 비교하여 코르탁틴의 발현이 점차 감소하고, snail1의 발현이 증가하는 것을 확인하였다(도 8D). 또한, 3차원 콜라겐 겔 환경 내에서 GFP-결합된 대조군 siRNA와 동시에 JNK1 siRNA를 형질주입(transfection)하였을 때(흰 화살표 표시), JNK1의 발현이 감소하면서 대조군과 비교하여 세포가 가늘고 질어지며 표면이 단순해지고, JNK1 siRNA가 주입되지 않은 주변의 세포들에 비하여 액틴-풍부한 스폿(즉, 인바도포디아)의 수가 감소함을 확인하였다(도 8E).
< 실시예 7> 3차원 콜라겐 겔 환경에서 배양된 유방암 세포주에서 snail1의 발현 증가에 따른 세포의 모양 변화 확인
snail1의 발현을 조절하였을 때 코르탁틴의 발현과 세포의 모양 및 액틴-풍부한 스폿의 수가 조절되는지 확인하기 위하여 실시예 <1-3>의 웨스턴 블랏 및 <실시예 4>의 면역형광염색법을 수행하였다.
그 결과, 도 9A에 나타난 바와 같이 snail1이 과다발현 하였을 때 코르탁틴이 감소하고(도 9A), 이때 snail1의 발현을 조절하더라도 c-Jun의 인산화 수준은 조절되지 않은 것으로 보아 snail1은 c-Jun의 하위 신호로 작용하며, snail1이 코르탁틴의 상위 신호로 작용하여 조절하고 있음을 확인하였다. 이는 도 9B 및 9C에 나타난 바와 같이 코르탁틴의 면역형광염색 결과 snail1이 과다발현되는 경우 코르탁틴의 발현(녹색 스폿)이 현저히 감소하고, 대조군에서만 인바도포디아-성 구조(invadopodia-like structure, 흰 화살머리 표시)가 관찰되었으며(도 9B), 대조군과 비교해 snail1의 발현을 증가시켰을 때 코르탁틴 스폿의 수가 현저히 감소하는 것을 확인하였다(도 9C). 이는 JNK 억제에 의해 증가한 snail1이 인바도포디아 형성을 감소시킴을 나타낸다. 또한, 도 9D 및 도 9E에 나타난 바와 같이 JNK를 억제하였을 때 감소한 코르탁틴 mRNA 수준이 snail1 siRNA를 사용하여 snail1을 녹다운(knock-down)시켰을 때 더 이상 감소하지 않았고(도 9D), 이는 단백질 수준에서도 확인되었다(도 9E). 따라서, snail1의 발현이 코르탁틴의 발현억제에 중요하고, 인바도포디아 형성에 영향을 미침을 확인하였다.
< 실시예 8> 3차원 콜라겐 겔 환경에서 배양된 유방암 세포주에서 인바도포디아 마커(marker) 확인
인바도포디아에는 코르탁틴 이외에도 다양한 종류의 인테그린(integrin) 및 MMP(matrix metalloproteinases) 단백질들이 존재한다. 특히, 다양한 MMP들 가운데 MT1-MMP(MMP14)가 인바도포디아에서 기질을 분해시키는데 중요한 역할을 하고 있는 것으로 알려져 있다. 따라서, 본 발명의 3차원 콜라겐 겔 환경 내에서 코르탁틴 이외에도 MT1-MMP가 또 다른 인바도포디아 마커로 작용할 수 있는지 확인하기 위하여 면역형광염색을 수행하였다.
그 결과, 도 10A에서 보는 것처럼 3차원 콜라겐 겔 환경 내에서 녹색으로 염색된 콜라젠의 분해를 암시하는 공백이 대조군(노란색 화살표로 표시)에 대비하여 JNK 억제제를 처리하였을 때 그 공백이 하얀색화살표로 표시한 곳들에서처럼 생기지 않음을 확인하였고, 10B에 나타난 바와 같이 액틴(녹색 스폿) 및 MT1-MMP(적색 스폿)가 같은 곳에 위치(co-localization)하는 것을 확인하였고(황색 스폿), 일부에서는 막(membrane) 끝(edge) 부분에서 다수가 같은 곳에 위치(흰색 삼각형)하고 있는 것을 확인하였다(도 10A 및 10B). 따라서, 3차원 콜라겐 환경에서 JNK억제제가 처리될 경우, 콜라젠의 분해가 억제될 수 있음을 추정케하고 (도 10A), 코르탁틴 이외에도 MT1-MMP가 인바도포디아의 또 다른 마커로 사용될 수 있음을 확인하였다.
< 실시예 9> 3차원 콜라겐 겔 환경에서 배양된 유방암 세포주에서 JNK 활성에 의한 MT1-MMP의 발현위치 조절을 통한 세포 이동 조절 매커니즘 확인
JNK 억제제를 처리하였을 경우, 코르탁틴 외에 인바도포디아의 또 다른 마커로 확인된 MT1-MMP가 인바도포디아의 형성 및 역동성에 있어서 어떤 영향을 받는지 확인하였다.
구체적으로, MDA-MB-231 세포에 mcherry 발현벡터로 표지된 MT1-MMP cDNA를 48 시간동안 형질주입(transfection)한 후, 106 세포/㎖ 밀도로 2.5 ㎎/㎖ 제 1형 콜라겐 용액과 혼합하여 PDMS 용기에 70 ㎕를 넣고 1 시간 동안 37℃에서 굳혔다. 그런 다음, 실험군으로 JNK 억제제인 SP600125 50 μM을 배지에 처리하고, 대조군으로는 JNK 억제제를 처리하지 않은 10% FBS 배지를 첨가하여 24시간 동안 배양한 후, MT1-MMP의 위치 변화를 추적함으로써 MT1-MMP의 발현위치의 역동성에 어떤 변화가 있는지 니콘 T1 공초점 현미경을 이용하여 실시간으로 관찰하였다. 이때, MT1-MMP의 위치를 추적하기 위하여 각 시료당 5 곳에 위치를 정하고 7 장의 z-stack을 선택하여 5분에 한 번씩 4시간 동안 촬영하여 영상화 하였다.
그 결과, 도 10C에 나타난 바와 같이 대조군 세포는 촬영이 진행되는 4시간 동안 세포가 이동하고자 하는 이동방향으로 세포의 위치가 크게 변하며 움직였고, 또한, 세포 이동 방향의 앞부위에서 세포막의 다양한 모양변화가 있었으며, 또한, MT1-MMP가 막의 끝 부분에 자주 위치하다가 없어지고 다시 나타나는 역동성을 가지는 것을 확인하였다(도 10C). 이러한 역동적 세포모양의 변화와 MT1-MMP의 발현위치가 세포막에 따라 역동적으로 변하는 것은 세포 내 액틴의 분기(branching) 및 중합(polymerization)을 담당하는 코르탁틴의 역할이 뒷받침 되었을 것이며, 또한 3차원 콜라겐 겔 환경에서 코르탁틴 및 MT1-MMP가 축적된 인바도포디아의 왕성한 형성과 역할로 이동 및 침윤이 가능할 것으로 추정되었다. 반면, 도 10D에 나타난 바와 같이 JNK 억제제가 처리된 실험군 세포에서는 전체적인 MT1-MMP의 발현에 큰 차이가 없었으며, 세포의 위치변화도 나타나지 않았다. 또한 대조군과 비교하여 세포 진행방향의 앞에 위치하는 세포막 부분에 나타나는 MT1-MMP-양성 스폿(positive spot)의 수가 적었고, 크기도 대조군에 비해 현저히 큰 것으로 보여 역동성이 적음이 확인되었다(도 10D). 이는 JNK 억제제에 의해 MT1-MMP가 세포의 이동 및 침윤을 위해 적절히 세포막에 위치하지 못하고, 스폿이 크게 뭉쳐지면서 핵 주위의 영역이 안정화되어 나타남으로써 세포의 진행 방향에서 필요한 선두적인 역할을 해주지 못함을 나타낸다.
< 실시예 10> 3차원 콜라겐 겔 환경에서 배양된 유방암 세포주에서 코르탁틴 및 MT1-MMP의 동시발현에 의한 세포의 이동성 변화 확인
JNK의 억제는 3차원 콜라겐 겔 환경 내에서 MDA-MB-231 세포의 코르탁틴의 발현을 감소시키며 세포의 이동 및 침윤에 직접적인 영향을 주었으나, MT1-MMP의 발현에는 영향을 미치지 못하였는데, 이를 확인하기 위하여 GFP-코르탁틴 및 mCherry-MT1-MMP를 동시에 발현시켰을 때 JNK 억제제의 처리에 의해 각각의 단백질이 어떻게 영향을 받는지 상기 <실시예 9>의 방법을 통해 살펴보았다.
그 결과, 도 11에 나타난 바와 같이 대조군에서는 코르탁틴 및 MT1-MMP가 공존하는 인바도포디아 세포막 주변에 역동적으로 생겼다 없어졌다를 반복하면서 세포가 이동하고자 하는 방향으로 뻗어나가고 있음을 확인하였다(도 11A, 흰색 화살머리 표시). 그러나 도 11B에 나타난 바와 같이, 실험군에서는 세포막 주변에 스폿이 나타나지 않고, MT1-MMP 스폿의 수가 세포막 쪽보다는 핵 주위(perinuclear)의 지역에 방향성 없이 과량으로 분포하는 것을 확인하였다(도 11B). 이는 상기 <실시예 9>의 결과의 맥락에서, 코르탁틴과 달리 snail1에 의해 MT1-MMP의 발현이 감소하지는 않았지만, JNK 억제제가 MT1-MMP의 발현위치에 영향을 미쳐, 발현을 하더라도 MT1-MMP가 적절한 시점에 세포막의 끝에 위치하지 못해 침윤과 관련된 적절한 역할을 수행하지 못함을 나타낸다.
따라서, 3차원 콜라겐 겔 환경 내에서 배양된 MDA-MB-231 세포주에서 JNK의 억제가 TGFβ1/smad 발현 및 신호전달 활성을 통해 snail1의 발현을 증가시키고, 이를 통해 코르탁틴의 발현을 감소시키면서, 동시에 MT1-MMP의 위치 및 역할에 부정적 영향을 미쳐 인바도포디아 형성을 억제함으로써, 세포의 침윤 기능이 억제됨을 확인하였다.
< 실시예 11> 3차원 콜라겐 겔 환경에서 배양된 유방암 세포주에서 JNK 억제제에 의한 MT1-MMP 기능억제 및 제 1형 콜라겐 기질 분해 저해 확인
JNK 억제에 의한 MT1-MMP의 세포막주변에서의 기능 저하 및 핵 주위로의 위치 변동(그림 10D 및 11B)이 실제로 콜라겐의 분해 능력을 약화시키는지 확인하기 위해, DQTM-제 1형 콜라겐(DQTM-collagen I)을 이용해서 실시간으로 3차원적 콜라겐 겔 환경에서 MT1-MMP가 발현된 세포의 콜라겐 분해능력을 확인하였다.
구체적으로, mCherry가 표지된 MT1-MMP 또는 대조군 벡터의 유전자를 MDA-MB-231 세포에 형질주입하여 48 시간 배양한 후, 2.5 ㎎/㎖ 제 1형 3차원 콜라겐(3D collagen type I, PureCol) 및 2.5 ㎎/㎖ DQTM-제 1형 콜라겐(LifeTechnologies)을 10:1(w:w)의 비율로 혼합하여 콜라겐 겔을 준비하여, 1.5×106 세포/㎖의 밀도로 상기 배양한 세포를 포매(embedding)하였다. 그런 다음, 37℃에서 30 분 동안 겔을 굳인 후, 겔 위에 200 ㎖의 DMSO 또는 50 mM SP600125이 첨가된 10% FBS/RPMI-1640 배지를 추가하여 세포를 배양하였다. 포매 후 2 내지 4 시간부터 세포를 니콘 이클립스 Ti(Nikon eclipse Ti; Nikon Plan-Apochromat 60×/1.4 N.A) 공초점 현미경을 통해 총 4 내지 6 시간 동안 0.7 ㎛의 간격의 z-stack으로 5 장을 10 분마다 한번 씩 촬영하여 세포를 영상화하였다.
그 결과, 도 12에서 나타난 바와 같이 대조군에서는 mCherry(적색)로 표지된 MT1-MMP 및 분해된 제 1형 콜라겐(녹색)이 기저부분(base) 및 세포체(cell body) 주변에서 나타나는 것을 확인하였다(도 12A; 청색 화살표). 그러나 SP600125에 의해 JNKs가 억제되었을 때는 collagen I의 분해가 나타나지 않았다. 이를 통해 JNKs의 억제는 MT1-MMP의 기질 분해능을 저해하는 것을 확인하였다(도 12B).
<110> Medicinal Bioconvergence Research Center <120> Monitering method for metastasis of cancer using cancer cell cultured in 3-dimensional collagen gels environments <130> 13P-04-25 <150> KR 10-2013-0054262 <151> 2013-05-14 <160> 40 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Cortactin F <400> 1 cctggaaatt cctcattgga 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Cortactin R <400> 2 cacaaaatca gggtcggtct 20 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> JNK1 F <400> 3 ttggaacacc atgtcctgaa 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> JNK1 R <400> 4 atgtacgggt gttggagagc 20 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Snail F <400> 5 ggttcttctg cgctactgct 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Snail R <400> 6 tagggctgct ggaaggtaaa 20 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Smad2 F <400> 7 cgaaatgcca cggtagaaat 20 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Smad2 R <400> 8 ccagaagagc agcaaattcc 20 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Smad3 F <400> 9 ccccagagca atattccaga 20 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Smad3 R <400> 10 ggctcgcagt aggtaactgg 20 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Twist F <400> 11 ggagtccgca gtcttacgag 20 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Twist R <400> 12 tctggaggac ctggtagagg 20 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Slug F <400> 13 ggggagaagc ctttttcttg 20 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Slug R <400> 14 tcctcatgtt tgtgcaggag 20 <210> 15 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GAPDH F <400> 15 gagtcaacgg atttggtcgt 20 <210> 16 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GAPDH R <400> 16 gacaagcttc ccgttctcag 20 <210> 17 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Snail1 p1F <400> 17 tccaaactcc tacgaggc 18 <210> 18 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Snail1 p1R <400> 18 gaagaagtgg caactgct 18 <210> 19 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Snail1 p2F <400> 19 agcagttgcc acttcttc 18 <210> 20 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Snail1 p2R <400> 20 gcaaagggaa gtgtgctt 18 <210> 21 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Snail1 p3F <400> 21 ggagacgagc ctccgatt 18 <210> 22 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Snail1 p3F <400> 22 cagtagcgca gaagaaccac t 21 <210> 23 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Snail1 pnF <400> 23 cgtaaacact ggataaggg 19 <210> 24 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Snail1 pnR <400> 24 ggaaacgcac atcactgg 18 <210> 25 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Cortactin F1 <400> 25 ccttcacatc ttggctaa 18 <210> 26 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Cortactin R1 <400> 26 ctagaaggtg agtcaagc 18 <210> 27 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Cortactin F2 <400> 27 gagggaggat ggagagatga 20 <210> 28 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Cortactin R2 <400> 28 agagctcgcc cgcaactag 19 <210> 29 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Cortactin F3 <400> 29 tctgcagact cgccacag 18 <210> 30 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Cortactin R3 <400> 30 caggcaccag gctctacttc 20 <210> 31 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Cortactin nF <400> 31 agtgttatga ttacaggc 18 <210> 32 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Cortactin nR <400> 32 atagagcaca gcgaagac 18 <210> 33 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Smad p1F <400> 33 agcacacttc cctttgcatt 20 <210> 34 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Smad p1R <400> 34 cacccgttcc ttcccttatc 20 <210> 35 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Smad p2F <400> 35 aatttccgcc ccctcccaa 19 <210> 36 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Smad p2R <400> 36 actcctccga ggcggggtt 19 <210> 37 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Smad p3F <400> 37 gtcggaaggt caggtgtcc 19 <210> 38 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Smad p3R <400> 38 gacgtcgagc gaagcgag 18 <210> 39 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Smad p4F <400> 39 ggagacgagc ctccgatt 18 <210> 40 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Smad p4R <400> 40 caactccctt aagtactc 18

Claims (16)

1) 전이성 암 또는 전이성 유발 가능한 암 세포를 배양용기에서 세포외기질로 둘러싸인 3차원적 배양환경으로서 라미닌(laminin), 콜라겐(collagen), 파이브로넥틴(fibronectin), 엔탁틴(entactin) 및 히알루론산(hyaluronic acid)으로 이루어진 군으로부터 선택된 것을 이용하고, 세포의 배양 기간 혹은 세포의 숫자(밀도) 변화, 세포외 pH의 조절 또는 세포외부의 산소 농도 조절을 추가적으로 이용하여 배양하는 단계; 및
2) 상기 단계 1)의 배양된 암 세포의 모양변화로서 세포의 길이가 길어지고, 세포 및 세포의 기질이 접촉한 부분이 밋밋해지고 가늘어지는 것, 인바도포디아(invadopodia) 형성 및 분해, 이동 및 침윤으로서 세포의 이동거리, 방향 및 속도를 확인하는 것, 및 전이관련 단백질의 활성, 발현 및 발현 위치의 변화 또는 세포외기질의 분해 정도를 측정하는 단계를 포함하는 암 세포의 이동, 침윤, 전이성 및 전이 정도를 모니터링하는 방법.
제 1항에 있어서, 상기 전이성 암은 유방암, 간암, 위암, 결장암, 골암, 췌장암, 두부 또는 경부 암, 자궁암, 난소암, 직장암, 식도암, 소장암, 항문부근암, 결장암, 나팔관암종, 자궁내막암종, 자궁경부암종, 질암종, 음문암종, 호지킨병, 전립선암, 방광암, 신장암, 수뇨관암, 신장세포암종, 신장골반암종 및 중추신경계 종양으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 암 세포의 이동, 침윤, 전이성 및 전이 정도를 모니터링하는 방법.
제 1항에 있어서, 상기 단계 1)의 배양용기는 폴리디메틸실록산(polydimethylsiloxane; PDMS), 폴리메틸메타클릴레이드(polymethylmethacrylate; PMMA), 폴리아크리레이트(polyacrylates), 폴리카보네이트(polycarbonates), 폴리실릭 올레핀(polycyclic olefins), 폴리이미드(polyimides), 폴리우레탄(polyurethanes)으로 이루어진 군으로부터 선택된 것으로 제작한 것을 특징으로 하는 암 세포의 이동, 침윤, 전이성 및 전이 정도를 모니터링하는 방법.
제 1항에 있어서, 상기 콜라겐은 제 1형 콜라겐(type I collagen)인 것을 특징으로 하는 암 세포의 이동, 침윤, 전이성 및 전이 정도를 모니터링하는 방법.
제 1항에 있어서, 상기 콜라겐은 1 내지 5 ㎎/㎖의 콜라겐이 함유된 것을 특징으로 하는 암 세포의 이동, 침윤, 전이성 및 전이 정도를 모니터링하는 방법.
제 1항에 있어서, 상기 단계 2)의 모양변화는 액틴, 코르탁틴 또는 MT1-MMP의 발현 또는 그들의 공동발현으로 인지되는 인바도포디아(invadopodia)의 형성정도를 확인하는 것을 특징으로 하는 암 세포의 이동, 침윤, 전이성 및 전이 정도를 추가적으로 모니터링하는 방법.
제 1항에 있어서, 상기 단계 2)의 단백질 활성 변화는 c-Jun의 인산화 증가하는 것을 특징으로 하는 암 세포의 이동, 침윤, 전이성 및 전이 정도를 모니터링하는 방법.
제 1항에 있어서, 상기 단계 2)의 단백질 활성 변화는 JNK 활성 또는 c-Jun의 인산화가 TGFβ1, smad2 및 smad3의 발현 및 인산화 변화를 초래하는 것을 특징으로 하는 암 세포의 이동, 침윤, 전이성 및 전이 정도를 모니터링하는 방법.
제 1항에 있어서, 상기 단계 2)의 단백질 발현 변화는 c-Jun이 snail1의 프로모터 부위(promoter region)에 결합하여 snail1의 전사를 증가시키는 것을 특징으로 하는 암 세포의 이동, 침윤, 전이성 및 전이 정도를 모니터링하는 방법.
제 1항에 있어서, 상기 단계 2)의 단백질 발현 변화는 snail1이 코르탁틴(cortactin)의 프로모터 부위에 결합하여 코르탁틴의 전사가 감소하는 것을 특징으로 하는 암 세포의 이동, 침윤, 전이성 및 전이 정도를 모니터링하는 방법.
제 1항에 있어서, 상기 단계 2)의 단백질 발현 위치 변화는 코르탁틴 또는 MT1-MMP의 발현 위치가 세포 원형질막이 아니거나 세포질 및 핵주변에서 증가하는 것을 특징으로 하는 암 세포의 이동, 침윤, 전이성 및 전이 정도를 모니터링하는 방법.
제 1항에 있어서, 상기 단계 2)의 단백질 활성, 발현 및 발현 위치 변화는 웨스턴 블랏, RT-PCR, 실시간 PCR(real time PCR), 면역형광염색(immunofluorescence), ChIP(chromatin immunoprecipitation) 분석, EMSA(Electrophoric Mobility Shift Assay) 및 DQTM-collagen type I을 이용한 ECM 분해능 분석으로 이루어진 군으로부터 선택된 것으로 측정하는 것을 특징으로 하는 암 세포의 이동, 침윤, 전이성 및 전이 정도를 모니터링하는 방법.
1) 전이성 암 또는 전이성 유발가능 암 세포를 배양용기에서 세포외기질로 둘러싸인 3차원적 배양환경을 이용하여 배양하는 단계;
2) 상기 단계 1)의 암 세포에 피검물질을 처리하는 단계;
3) 상기 단계 2)의 암 세포의 인바도포디아 형성 및 분해, 이동 및 침윤으로서 콜라겐 겔 기질의 분해능을 확인하는 것, 및 전이관련 단백질의 활성, 발현 및 발현 위치 변화 또는 세포외기질의 분해 정도를 측정하는 단계;
4) 상기 단계 3)의 암 세포가 무처리 대조군에 비해서 인바도포디아 형성, 인바도포디아 마커 단백질 또는 전이관련 단백질로서 JNK, c-Jun, TGFββ1, smad2, smad3, 코르탁틴, snail1 및 MT1-MMP의 활성 및 발현을 억제하거나, 발현 위치 또는 세포외기질 분해에 부정적 영향을 미치는 피검물질을 선별하는 단계를 포함하는 암 전이억제제의 스크리닝 방법.
제 13항에 있어서, 상기 단계 3)의 전이관련 단백질의 발현 위치 변화는 코르탁틴 또는 MT1-MMP의 발현 위치가 세포 원형질막이 아니거나 세포질 및 핵주변에서 증가하는 것을 특징으로 하는 암 전이억제제의 스크리닝 방법.
제 13항에 있어서, 상기 단계 3)의 단백질 활성, 발현 및 발현 위치 변화는 웨스턴 블랏, RT-PCR, 실시간 PCR(real time PCR), 면역형광염색(immunofluorescence), CHIP(chromatin immunoprecipitation), EMSA(Electrophoric Mobility Shift Assay) 및 DQTM-collagen type I을 이용한 ECM 분해능 분석으로 이루어진 군으로부터 선택된 것으로 측정하는 것을 특징으로 하는 암 전이억제제의 스크리닝 방법.
제 13항에 있어서, 상기 단계 3)의 이동 및 침윤은 콜라겐 겔 기질의 분해능을 확인하는 것을 특징으로 하는 암 전이억제제의 스크리닝 방법.
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