KR20240032223A - 전이암 세포에 특이적으로 결합하는 단분자력 센서 및 이것의 용도 - Google Patents
전이암 세포에 특이적으로 결합하는 단분자력 센서 및 이것의 용도 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 암 세포의 인테그린과 결합하는 단분자력 센서 및 이것의 용도로서 침습성 또는 전이성 암의 진단, 모니터링 또는 예후 예측 방법에 대한 것이다.
본 발명의 단분자력 센서를 이용하는 경우 시료에 대한 전처리 없이도 암 세포의 α5β1 인테그린에 결합시켜 센서의 파열(rupture) 패턴을 확인함으로써 침입촉수을 발현하는 전이성 암 세포를 신속하고 효과적으로 진단할 수 있다. 이 경우 상기 α5β1 인테그린의 장력은 40 pN 이상이었다. 따라서, 본 발명의 단분자력 센서는 암 진단, 모니터링 또는 예후 예측용 조성물 내지 방법에 효과적으로 사용될 수 있다.
본 발명의 단분자력 센서를 이용하는 경우 시료에 대한 전처리 없이도 암 세포의 α5β1 인테그린에 결합시켜 센서의 파열(rupture) 패턴을 확인함으로써 침입촉수을 발현하는 전이성 암 세포를 신속하고 효과적으로 진단할 수 있다. 이 경우 상기 α5β1 인테그린의 장력은 40 pN 이상이었다. 따라서, 본 발명의 단분자력 센서는 암 진단, 모니터링 또는 예후 예측용 조성물 내지 방법에 효과적으로 사용될 수 있다.
Description
본 발명은 암 세포의 인테그린과 결합하는 단분자력 센서 및 이것의 용도로서 침습성 및/또는 전이성 암의 진단, 모니터링 또는 예후 예측 방법에 대한 것이다.
암 세포의 기계적 자극은 암 진행, 침습 및 전이에 중요한 역할을 한다. 세포와 세포를 둘러싼 미세 환경의 고유한 기계적 특성과 세포가 경험하거나 가하는 물리적 힘은 세포의 형태와 운동성의 변화를 포괄적으로 조절하여 암세포가 이웃 조직으로 이동하거나 침투하도록 하는 책임이 있다. 다양한 암세포에서 발견되는 침입촉수(Invadopodia)는 세포 침범에 관여하는 액틴이 풍부한 돌출형 미세 구조이다. 성숙한 침입촉수는 액틴 중합에 의해 기계적 힘을 생성하고 단백질 분해 활성이 있는 효소를 분비하여 주변 세포외기질(ECM)을 분해한다. 이것은 암 침습 및 후속 암 전이를 촉진한다. 따라서 암 침습 및 전이의 생물물리학적 메커니즘에 대한 이해를 높이려면 침입촉수의 형성 및 활성화를 연구하는 것이 필수적이다.
최근 연구에 따르면 침입촉수 발달은 개시, 조립 및 성숙의 3단계로 발생한다. 막에 발현된 인테그린 수용체와 ECM의 리간드 사이의 결합을 통한 안정적인 세포 접착은 침입촉수 형성에 필요한 전구체 단백질의 초기 조립을 수용한다. 기본 액틴 필라멘트 외에도 액틴 조절 단백질, 신호 단백질 및 코르택틴, 파신, MyoX 및 Tks5(tyrosine kinase substrates 5) 및 Tks4를 포함한 어댑터 단백질이 모집되어 견고한 액틴리치(actin-rich) 돌출부를 구축한다. 결과적으로 너비 0.5~2μm, 길이 > 2μm인 성숙한 침입촉수가 발달하며, 이는 기질 메탈로프로테아제(MMP)의 분비와 돌출부 끝에 있는 막 유형 1-MMP(MT1-MMP) 의 제시에 의해 주변 ECM의 분해를 촉진했다.
인테그린을 통한 유착에서 암세포에서 침입촉수의 돌출 활성에 이르기까지 물리적인 힘은 혈관내 매개 암 침습의 진행과 깊이 관련되어 있다. α 및 β 소단위로 구성된 이종이량체인 인테그린은 피코뉴턴(pN) 규모의 장력 하에서 활성화될 때 안정적인 세포 접착을 촉진한다. α5β1 및 αvβ3 인테그린은 침입촉수 형성과 밀접하게 연관되어 있는 것으로 보고되었다. 인테그린 그룹 전반에 걸쳐 β1 인테그린은 침입촉수 형성에 중요한 것으로 간주되었다. 이는 α5β1 의 활성화가 침입촉수 형성의 핵심 업스트림 스위치가 될 수 있음을 설명하였다. 침입촉수 물리력(Invadopodia force)는 개별 침입촉수가 기질로 돌출되어 액틴 역학의 결과로 진동 방식으로 움직이기 때문에 해명을 위한 추가적인 중요한 요소이다. 견인력 현미경(Traction force microscopy), 원자력 현미경(Atomic force microscopy) 및 탄성 공진기 간섭 응력 현미경(elastic resonator interference stress microscopy)은 침입촉수의 액틴 중합과 액토미오신(actomyosin) 수축에 의해 생성된 동적 수직력이 세포 벤트럴(ventral) 위치의 표면에 국한되어 있음을 보여주었다. 그러나 이러한 측정은 인테그린 유형을 고려하지 않고 인테그린 그룹에 대해 수행되어 단일 분자 정밀도로 특정 인테그린에 의해 생성된 침입력을 입증하는 기술의 능력을 제한한다. 따라서 단일 분자 수준에서 인테그린 장력, 특히 α5β1 인테그린 장력과 침입촉수 물리력과의 상관관계에 대한 연구가 필요한 실정이다.
"텐션 게이지 테더"(Tension gauge tether, TGT)라고 하는 엔지니어링된 데옥시리보핵산(DNA) 기반 힘 센서(force sensor)는 인테그린 장력 의존성 침입촉수 형성 및 성숙을 연구하는 데 사용할 수 있다. 표적 인테그린 수용체에 대한 리간드는 파열 가능한 DNA 이중 고리를 통해 표면에 고정되었다. 단일 인테그린-리간드 결합에 가해지는 힘이 DNA 테더의 장력 허용오차(Ttol)보다 크면 리간드-컨쥬게이션된 이중 가닥 DNA가 파손된다. 이전에는 고리형 RGDfK 리간드를 사용한 TGT 분석이 세포 접착 및 국소 접착 형성에서 인테그린 장력을 광범위하게 특성화하는 데 사용되었다. 분석은 단일 인테그린 장력을 통해 세포 접착을 활성화하기 위해 40pN의 보편적인 인테그린 장력이 필요함을 보여주었다. 인테그린 및 > 54pN의 장력은 액토미오신의 활성을 통해 성숙한 초점 접착(FA)에서 클러스터된 인테그린을 통해 전달되었다. 그러나 α5β1 인테그린에 특별히 적용된 장력을 측정하기 위한 전통적인 TGT 설정의 사용은 제한적이었다. 고리형 RGD 펩타이드는 αvβ3 인테그린의 고친화성 리간드(IC50 ≒ 2.25 × 10-9 m)와 α5β1 인테그린에 대한 친화력이 상대적으로 약하지만 무시할 수 없는 리간드(IC50 ≒ 141 × 10-9 m)이기 때문이다.
이에 본 발명자들은 암 세포의 침입촉수 형성과 인테그린 결합과의 상관관계를 확인하고 이를 암 진단 분야에 적용하고자 예의 노력한 결과, 본 발명의 ATN 리간드를 포함하는 단분자력 센서(Single molecule force sensor)는 단일 분자 수준에서 암 세포와 결합한 후 센서의 파열 패턴을 확인하거나 그 장력을 측정할 수 있으며, 이를 이용하여 암 세포의 침습성 내지 전이성을 진단할 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 암 세포의 인테그린과 결합하는 단분자력 센서를 제공하여 침습성 또는 전이성 암을 진단하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명은 이중가닥의 핵산을 포함하는 단분자력 센서(single molecule force sensor)로써,
i) 상기 이중가닥 중 일 가닥에 ATN 리간드 및 형광염료가 부착되어 있고, 다른상보적인 가닥에 표면결합물질이 부착되어 있거나,
ii) 상기 이중가닥 중 일 가닥에 ATN 리간드 및 표면결합물질이 부착되어 있고, 다른 상보적인 가닥에 형광물질이 부착되어 있는 센서를 제공한다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 센서의 ATN 리간드가 암 세포의 α5β1 인테그린과 결합하는 것이다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 센서는 40 pN 이상 ~ 200 pN 이하 장력에서 이중가닥이 단일 가닥으로 분리되는 것이다.
또한, 본 발명은 상기 단분자력 센서를 포함하는 침습성 및/또는 전이성 암 진단용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 단분자력 센서를 포함하는 침습성 및/또는 전이성 암 모니터링용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 단분자력 센서를 포함하는 침습성 및/또는 전이성 암 예후 예측용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 i) 상기 센서가 고정된 플레이트에 개체로부터 분리된 시료를 로딩하여 상기 센서와 상기 시료를 결합시키는 단계;
ii) 상기 결합된 센서와 시료를 방치하는 단계; 및
iii) 상기 센서가 파열(rupture)된 형태를 이미징하는 단계;
를 포함하는 침습성 및/또는 전이성 암 진단을 위한 정보제공 방법을 제공한다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 단계 i)의 플레이트는 칩(chip) 또는 디쉬(dish) 인 것이다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 정보제공 방법은
iv) 상기 이미징 결과가 벤트럴 파열(ventral rupture) 패턴인 경우 침습성 및/또는 전이성 암으로 분류하는 단계;
를 추가적으로 포함하는 것이다.
또한, 본 발명은 i) 상기 센서가 고정된 플레이트에 개체로부터 분리된 시료를 로딩하여 상기 센서와 상기 시료를 결합시키는 단계;
ii) 상기 결합된 센서와 시료를 방치하는 단계; 및
iii) 상기 센서가 파열(rupture)된 형태를 이미징하는 단계;
를 포함하는 침습성 및/또는 전이성 암 모니터링 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 i) 상기 센서가 고정된 플레이트에 개체로부터 분리된 시료를 로딩하여 상기 센서와 상기 시료를 결합시키는 단계;
ii) 상기 결합된 센서와 시료를 방치하는 단계; 및
iii) 상기 센서가 파열(rupture)된 형태를 이미징하는 단계;
를 포함하는 침습성 및/또는 전이성 암 예후 예측 방법을 제공한다.
본 발명의 단분자력 센서를 이용하는 경우 시료에 대한 전처리 없이도 암 세포의 α5β1 인테그린에 결합시켜 센서의 파열 패턴을 확인함으로써 침입촉수을 발현하는 전이성 암 세포를 신속하고 효과적으로 진단할 수 있다. 이 경우 상기 α5β1 인테그린의 장력은 40 pN 이상이었다. 따라서, 본 발명의 단분자력 센서는 암 진단, 모니터링 또는 예후 예측용 조성물 내지 방법에 효과적으로 사용될 수 있다.
도 1 는 α5β1 및 αvβ3 인테그린 장력을 특성화하기 위한 DNA 기반 단일 분자 힘 센서의 개발을 나타낸다. a) 장력 게이지 테더(TGT) 시스템의 개략도. Cyclic-RGDfK 리간드-접합 DNA 테더(RGD-TGT)는 αvβ3 및 α5β1 인테그린 결합 모두에 대해 설계되었다. ATN-161 리간드 결합 DNA 테더(ATN-TGT)는 α5β1 인테그린 결합을 위해 설계되었다. b) TGT 구조 및 c) 세포 접착 동안 인테그린 장력 측정의 작동 원리.
도 2 는 ATN-161 리간드 접합된 단일 가닥 DNA의 합성을 나타낸다. ATN-161 리간드는 Sulfo-SMCC(hetero-bifunctional crosslinker)를 사용하여 형광 염료로 thiol-modified 18 base pair long single strand DNA(ssDNA)에 접합되었다.
도 3 은 분석물(α5β1 또는 αvβ3 인테그린) 쌍에 대한 TGT(ATN-TGT 또는 RGD-TGT)의 대표적인 결합 센소그램(sensograms)을 나타낸다. (a) TGT 인테그린 결합에 대한 BLI 측정의 개략도. (b-c) 스트렙타비딘 기반 바이오센서에 고정된 ATN-TGT 및 RGD-TGT에 대한 α5β1 인테그린의 용량 의존적 연관 및 해리 곡선. (d-e) ATN-TGT 및 RGD-TGT에 대한 αvβ3 인테그린의 실시간 모니터링. 각 플롯은 다양한 농도에서 연관 및 해리 프로파일을 표시했다. 점선은 1:1 Langmuir 바인딩 모델을 피팅하여 생성된 전역 피팅을 나타낸다.
도 4 는 침습성 암세포에 의해 형성된 벤트럴(ventral) TGT 파열 패턴을 나타낸다. 암세포를 54pN RGD-TGT 표면에 로딩했다. A375SM(침습성 인간 흑색종), A375P(비침습성 인간 흑색종), U87(침습성 인간 교모세포종) 및 4T1(침습성 마우스 유방암 세포)과 같은 세포 유형 및 종에 관계없이 침습성 암세포의 벤트럴 쪽에서 독특한 TGT 파열 패턴이 관찰되었다. 스케일 바, 100μm.
도 5 는 α5β1 및 αvβ3 인테그린 장력을 특성화하기 위한 DNA 기반 단일 분자 힘 센서의 개발을 나타낸다. 3개의 유방 상피 세포주의 접착: 2개의 인간 유방암 세포주, MDA-MB-231(고침습성) 및 MCF7(비침습성) 및 정상 세포주 MCF10A를 대조군으로 사용했다. 그들은 Ttol이 43, 54 및 >100pN(인큐베이션 시간, t = 2h)인 서로 다른 TGT 표면에 부착되었다. 세포 접착 및 퍼짐은 세포 및 리간드 유형 및 피크 인테그린 장력의 크기에 따라 다양했다. 스케일 바, 20μm.
도 6 은 α5β1 및 αvβ3 인테그린 장력을 특성화하기 위한 DNA 기반 단일 분자 힘 센서의 개발을 나타낸다. e) 단위 면적당 부착성 MDA-MB-231 세포의 총 수(n = 5, 3, 5, 3, 3, 및 3), f) 원형도, g) 예상 세포 면적(n = 232, 176, 240 , 140, 206 및 105) 각 TGT 표면에 있다. 원형도는 매우 불규칙한 모양의 경우 0에서 완전한 원형 모양의 경우 1까지 다양했다. h-j) 부착된 MCF7 세포의 총 수(n = 4, 3, 4, 3, 4 및 3), 원형도 및 예상 면적(n = 188, 162, 169, 139, 180 및 45) TGT 표면. k-m) 부착된 MCF10A 세포의 총 수(n = 3, 3, 3, 3, 3, 3), 원형도 및 예상 면적(n = 137, 96, 98, 95, 133 및 105) TGT 표면. 모든 실험은 적어도 세 번 반복되었다. 샘플 번호가 표시된다. 데이터는 평균 ± SE로 표시된다.
도 7a 는 세포 유형(MDA-MB-231), 인테그린 유형(αvβ3 및 α5β1 인테그린) 및 인장 내성(43, 54 및 > 100 pN)에 따른 고유한 TGT 파열 패턴을 나타낸다. 핵, 초점 접착(focal adhesion) 및 F-액틴은 DAPI, TRITC 접합 팔로이딘(phalloidin) 및 항-빈쿨린 항체를 사용하여 시각화되었다. 스케일 바, 20μm.
도 7b 는 세포 유형(MCF7), 인테그린 유형(αvβ3 및 α5β1 인테그린) 및 인장 내성(43, 54 및 > 100 pN)에 따른 고유한 TGT 파열 패턴을 나타낸다. 핵, 초점 접착(focal adhesion) 및 F -액틴은 DAPI, TRITC 접합 팔로이딘(phalloidin) 및 항-빈쿨린 항체를 사용하여 시각화되었다. 스케일 바, 20μm.
도 7c 는 세포 유형(MCF10A), 인테그린 유형(αvβ3 및 α5β1 인테그린) 및 인장 내성(43, 54 및 > 100 pN)에 따른 고유한 TGT 파열 패턴을 나타낸다. 핵, 초점 접착(focal adhesion) 및 F -액틴은 DAPI, TRITC 접합 팔로이딘(phalloidin) 및 항-빈쿨린 항체를 사용하여 시각화되었다. 스케일 바, 20μm.
도 8 은 세포 접착 중 인테그린 장력 매핑을 나타낸다. a) 세포에 의한 TGT 파열의 개략도. 다른 TGT 표면에 대한 세포 접착은 독특한 파열 패턴을 유도했다. αvβ3 인테그린 장력은 고리 모양의 "엣지 파열(edge rupture)” 를 일으킨 반면, α5β1 인테그린 장력은 세포 배쪽 표면에 "벤트럴 파열(ventral rupture)" 를 일으켰다. b) 세포 유형(MDA-MB-231, MCF7 및 MCF10A), 인테그린 유형(αvβ3 및 α5β1 인테그린) 및 인장 내성(43, 54 및 >100 pN)에 따른 고유한 TGT 파열 패턴. 스케일 바, 20μm. 노란색 점선은 세포 주변을 나타낸다. 파열 패턴의 비율은 세포 유형 및 인장 허용오차에 따라 다르다.
도 9 는 Ttol이 12, 23 및 33 pN인 ATN-TGT 표면에 MDA-MB-231 세포 접착을 나타낸다. 세포가 표면에 안정적으로 부착되지 않았으며 모든 조건에서 TGT 파열이 관찰되지 않았다. 스케일 바, 100μm.
도 10 은 세포 접착 중 인테그린 장력 매핑을 나타낸다. c) RGD-TGT(n = 154, 158, 93, 64, 65, 39, 89, 82 및 72) 또는 d) ATN-TGT(n = 324, 284, 177, 180, 150, 112, 266, 190 및 162).
도 11 은 세포 접착 중 인테그린 장력 매핑을 나타낸다. e) 인장 허용오차 및 셀 유형에 따른 파열 백분율의 빈도(n = 94, 86, 95, 69 및 77). f) 54 pN 다중화된 TGT 표면(0.5 × 10-6 M RGD-TGT 및 0.5 × 10-6 M ATN-TGT의 혼합물)에서 MDA-MB-231 세포의 접착으로 인한 파열 패턴. g) 항-α5β1 인테그린 항체로 α5β1 인테그린을 차단하거나 항-αvβ3 인테그린 항체로 αvβ3 인테그린을 차단한 후 부착성 MDA-MB-231 세포에 의해 형성된 54 pN 다중화 TGT 표면의 파열 패턴. 스케일 바, 20μm. 모든 실험은 적어도 세 번 반복되었다. 샘플 번호가 표시된다. 데이터는 평균 ± SE로 표시된다.
도 12 는 인간 유방 세포주의 표면에서 αvβ3 또는 α5β1 인테그린의 발현 수준의 정량적 분석 결과를 나타낸다. (a-c) α5β1 또는 αvβ3 인테그린에 대한 항체로 염색한 후 단일 세포(MDA-MB-231, MCF7 및 MCF10A)의 형광 강도 히스토그램. (d-f) MDA-MB-231, MCF7 및 MCF10A 세포의 평균 형광 강도 값은 3개 또는 4개의 독립적인 실험에서 획득되었다. 데이터는 평균 ± SE로 표시된다.
도 13 은 피브로넥틴이 있거나 없는 코팅된 54 pN ATN-TGT 표면에 대한 MDA-MB-231 세포 접착을 나타낸다. ATN-TGT 단독 표면에서 반점 파열이 관찰되었다. 이에 비해 피브로넥틴과 ATN-TGT가 동시에 코팅된 표면에서는 산호와 같은 파열이 발견되었다. 두 조건 모두에서 Dnase X와 벤트럴 파열(ventral rupture)의 명백한 공동 국소화는 없었다. 스케일 바, 20μm.
도 14 는 RGD-TGT 및 ATN-TGT의 벤트럴 파열(ventral rupture)를 사용하여 침습성 세포와 비암성 세포의 혼합물에서 침습성 암세포를 검출했다. Lifeact-GFP를 발현하는 정상 MCF10A 세포와 전이성 암세포(MDA-MB-231)를 RGD-TGT 또는 ATN-TGT 표면에 동시에 로딩했다. 침습성 세포는 벤트럴 파열 패턴의 분석을 사용하여 구별할 수 있었다. 스케일 바, 20μm.
도 15 는 ATN-qTGT를 사용한 침입촉수의 기본 구조 및 침입촉수의 장력 감지에 대한 개략도를 나타낸다.
도 16 은 침입촉수는 ATN-qTGT 표면의 벤트럴 파열(ventral rupture)를 야기하는 것을 나타낸다. 침입촉수 마커(Fascin, MyoX 및 Cortactin)와 ATN-qTGT 파열은 공동 국소화되었다.
도 17 은 침입촉수 마커 및 TGT 파열의 시간 경과 이미지를 나타낸다. 침입촉수 마커(Fascin, MyoX 및 Cortactin) 및 ATN-qTGT 파열이 공동 국소화되었다. 스케일 바, 10μm.
도 18 은 침입촉수는 ATN-qTGT 표면의 벤트럴 파열(ventral rupture)를 야기하는 것을 나타낸다. e) MDA-MB-231 세포에 의해 유도된 ATN-TGT 파열의 대표적인 이미지. f) Fascin 억제제의 첨가로 ATN-TGT 파열이 현저히 감소됨. g) GM6001(MT1-MMP 억제제)을 추가하면 ATN-TGT가 파열됨. ATN-TGT 파열은 크게 감소하지 않았다. 와이드 뷰 이미지의 스케일 바 = 60 μm, 확대 이미지의 경우 = 10 μm.
도 19a 는 액틴 중합 및 세포 수축과 관내 힘의 상관 관계를 확인하기 위해Y27632(ROCK 억제제) 또는 블레비스타틴(미오신 II 억제제)으로 처리된 MDA-MB-231 세포에 의해 형성된 ATN-TGT 파열을 모니터링했다.
도 19b 는 액틴 중합 및 세포 수축과 관내 힘의 상관 관계를 나타낸다. 단일 세포당 측정된 총 파열 면적의 빈도를 표시하고 각 조건에서 DIC 및 ATN 파열의 대표적인 이미지를 표시했다. 억제제가 있거나 없는 MDA-MB-231 세포는 Ttol이 > 100(n = 94, 93 및 68), 54(n = 86, 64 및 54) 및 43 pN(n = 85, 70, 59). 모든 실험은 3~4회 반복되었다. 샘플 번호가 표시된다.
도 20a 는 세포 부착의 초기 단계에서 인테그린 α5 및 β1 소단위 및 축적된 TGT 파열의 공동 국소화 분석을 나타낸다. a) MDA-MB-231 세포의 접착 중 β1 인테그린 및 축적된 ATN-qTGT 파열의 시간 경과 이미지. b) 시간 경과에 따른 β1 인테그린 및 ATN-qTGT 파열의 형광 강도 변화. ATN-qTGT 파열 신호는 β1 인테그린이 ATN-qTGT 표면에 결합한 후 몇 분 후에 β1 인테그린 영역에서 감지되었다.
도 20b 는 세포 부착의 초기 단계에서 인테그린 α5 및 β1 소단위 및 축적된 TGT 파열의 공동 국소화 분석을 나타낸다. c) α5 인테그린 및 축적된 ATN-TGT 파열의 시간 경과 이미지. d) 검은색 점선을 가로지르는 형광 강도 프로파일. t = 0분에서 α5 인테그린의 형광 강도 및 시간 경과에 따른 α5 인테그린의 해당 영역에서 ATN-TGT의 형광 강도 변화. 활성화된 α5β1 인테그린을 통한 접착은 100pN보다 큰 침입촉수 형성 및 침입촉수력를 유발했다. 스케일 바 = 10 μm.
도 21 은 전이성 암세포에서 시간 경과에 따른 α5β1 인테그린 장력과 후속 침입자 형성 및 성숙 사이의 기계생물학적 관계 요약을 나타낸다.
도 2 는 ATN-161 리간드 접합된 단일 가닥 DNA의 합성을 나타낸다. ATN-161 리간드는 Sulfo-SMCC(hetero-bifunctional crosslinker)를 사용하여 형광 염료로 thiol-modified 18 base pair long single strand DNA(ssDNA)에 접합되었다.
도 3 은 분석물(α5β1 또는 αvβ3 인테그린) 쌍에 대한 TGT(ATN-TGT 또는 RGD-TGT)의 대표적인 결합 센소그램(sensograms)을 나타낸다. (a) TGT 인테그린 결합에 대한 BLI 측정의 개략도. (b-c) 스트렙타비딘 기반 바이오센서에 고정된 ATN-TGT 및 RGD-TGT에 대한 α5β1 인테그린의 용량 의존적 연관 및 해리 곡선. (d-e) ATN-TGT 및 RGD-TGT에 대한 αvβ3 인테그린의 실시간 모니터링. 각 플롯은 다양한 농도에서 연관 및 해리 프로파일을 표시했다. 점선은 1:1 Langmuir 바인딩 모델을 피팅하여 생성된 전역 피팅을 나타낸다.
도 4 는 침습성 암세포에 의해 형성된 벤트럴(ventral) TGT 파열 패턴을 나타낸다. 암세포를 54pN RGD-TGT 표면에 로딩했다. A375SM(침습성 인간 흑색종), A375P(비침습성 인간 흑색종), U87(침습성 인간 교모세포종) 및 4T1(침습성 마우스 유방암 세포)과 같은 세포 유형 및 종에 관계없이 침습성 암세포의 벤트럴 쪽에서 독특한 TGT 파열 패턴이 관찰되었다. 스케일 바, 100μm.
도 5 는 α5β1 및 αvβ3 인테그린 장력을 특성화하기 위한 DNA 기반 단일 분자 힘 센서의 개발을 나타낸다. 3개의 유방 상피 세포주의 접착: 2개의 인간 유방암 세포주, MDA-MB-231(고침습성) 및 MCF7(비침습성) 및 정상 세포주 MCF10A를 대조군으로 사용했다. 그들은 Ttol이 43, 54 및 >100pN(인큐베이션 시간, t = 2h)인 서로 다른 TGT 표면에 부착되었다. 세포 접착 및 퍼짐은 세포 및 리간드 유형 및 피크 인테그린 장력의 크기에 따라 다양했다. 스케일 바, 20μm.
도 6 은 α5β1 및 αvβ3 인테그린 장력을 특성화하기 위한 DNA 기반 단일 분자 힘 센서의 개발을 나타낸다. e) 단위 면적당 부착성 MDA-MB-231 세포의 총 수(n = 5, 3, 5, 3, 3, 및 3), f) 원형도, g) 예상 세포 면적(n = 232, 176, 240 , 140, 206 및 105) 각 TGT 표면에 있다. 원형도는 매우 불규칙한 모양의 경우 0에서 완전한 원형 모양의 경우 1까지 다양했다. h-j) 부착된 MCF7 세포의 총 수(n = 4, 3, 4, 3, 4 및 3), 원형도 및 예상 면적(n = 188, 162, 169, 139, 180 및 45) TGT 표면. k-m) 부착된 MCF10A 세포의 총 수(n = 3, 3, 3, 3, 3, 3), 원형도 및 예상 면적(n = 137, 96, 98, 95, 133 및 105) TGT 표면. 모든 실험은 적어도 세 번 반복되었다. 샘플 번호가 표시된다. 데이터는 평균 ± SE로 표시된다.
도 7a 는 세포 유형(MDA-MB-231), 인테그린 유형(αvβ3 및 α5β1 인테그린) 및 인장 내성(43, 54 및 > 100 pN)에 따른 고유한 TGT 파열 패턴을 나타낸다. 핵, 초점 접착(focal adhesion) 및 F-액틴은 DAPI, TRITC 접합 팔로이딘(phalloidin) 및 항-빈쿨린 항체를 사용하여 시각화되었다. 스케일 바, 20μm.
도 7b 는 세포 유형(MCF7), 인테그린 유형(αvβ3 및 α5β1 인테그린) 및 인장 내성(43, 54 및 > 100 pN)에 따른 고유한 TGT 파열 패턴을 나타낸다. 핵, 초점 접착(focal adhesion) 및 F -액틴은 DAPI, TRITC 접합 팔로이딘(phalloidin) 및 항-빈쿨린 항체를 사용하여 시각화되었다. 스케일 바, 20μm.
도 7c 는 세포 유형(MCF10A), 인테그린 유형(αvβ3 및 α5β1 인테그린) 및 인장 내성(43, 54 및 > 100 pN)에 따른 고유한 TGT 파열 패턴을 나타낸다. 핵, 초점 접착(focal adhesion) 및 F -액틴은 DAPI, TRITC 접합 팔로이딘(phalloidin) 및 항-빈쿨린 항체를 사용하여 시각화되었다. 스케일 바, 20μm.
도 8 은 세포 접착 중 인테그린 장력 매핑을 나타낸다. a) 세포에 의한 TGT 파열의 개략도. 다른 TGT 표면에 대한 세포 접착은 독특한 파열 패턴을 유도했다. αvβ3 인테그린 장력은 고리 모양의 "엣지 파열(edge rupture)” 를 일으킨 반면, α5β1 인테그린 장력은 세포 배쪽 표면에 "벤트럴 파열(ventral rupture)" 를 일으켰다. b) 세포 유형(MDA-MB-231, MCF7 및 MCF10A), 인테그린 유형(αvβ3 및 α5β1 인테그린) 및 인장 내성(43, 54 및 >100 pN)에 따른 고유한 TGT 파열 패턴. 스케일 바, 20μm. 노란색 점선은 세포 주변을 나타낸다. 파열 패턴의 비율은 세포 유형 및 인장 허용오차에 따라 다르다.
도 9 는 Ttol이 12, 23 및 33 pN인 ATN-TGT 표면에 MDA-MB-231 세포 접착을 나타낸다. 세포가 표면에 안정적으로 부착되지 않았으며 모든 조건에서 TGT 파열이 관찰되지 않았다. 스케일 바, 100μm.
도 10 은 세포 접착 중 인테그린 장력 매핑을 나타낸다. c) RGD-TGT(n = 154, 158, 93, 64, 65, 39, 89, 82 및 72) 또는 d) ATN-TGT(n = 324, 284, 177, 180, 150, 112, 266, 190 및 162).
도 11 은 세포 접착 중 인테그린 장력 매핑을 나타낸다. e) 인장 허용오차 및 셀 유형에 따른 파열 백분율의 빈도(n = 94, 86, 95, 69 및 77). f) 54 pN 다중화된 TGT 표면(0.5 × 10-6 M RGD-TGT 및 0.5 × 10-6 M ATN-TGT의 혼합물)에서 MDA-MB-231 세포의 접착으로 인한 파열 패턴. g) 항-α5β1 인테그린 항체로 α5β1 인테그린을 차단하거나 항-αvβ3 인테그린 항체로 αvβ3 인테그린을 차단한 후 부착성 MDA-MB-231 세포에 의해 형성된 54 pN 다중화 TGT 표면의 파열 패턴. 스케일 바, 20μm. 모든 실험은 적어도 세 번 반복되었다. 샘플 번호가 표시된다. 데이터는 평균 ± SE로 표시된다.
도 12 는 인간 유방 세포주의 표면에서 αvβ3 또는 α5β1 인테그린의 발현 수준의 정량적 분석 결과를 나타낸다. (a-c) α5β1 또는 αvβ3 인테그린에 대한 항체로 염색한 후 단일 세포(MDA-MB-231, MCF7 및 MCF10A)의 형광 강도 히스토그램. (d-f) MDA-MB-231, MCF7 및 MCF10A 세포의 평균 형광 강도 값은 3개 또는 4개의 독립적인 실험에서 획득되었다. 데이터는 평균 ± SE로 표시된다.
도 13 은 피브로넥틴이 있거나 없는 코팅된 54 pN ATN-TGT 표면에 대한 MDA-MB-231 세포 접착을 나타낸다. ATN-TGT 단독 표면에서 반점 파열이 관찰되었다. 이에 비해 피브로넥틴과 ATN-TGT가 동시에 코팅된 표면에서는 산호와 같은 파열이 발견되었다. 두 조건 모두에서 Dnase X와 벤트럴 파열(ventral rupture)의 명백한 공동 국소화는 없었다. 스케일 바, 20μm.
도 14 는 RGD-TGT 및 ATN-TGT의 벤트럴 파열(ventral rupture)를 사용하여 침습성 세포와 비암성 세포의 혼합물에서 침습성 암세포를 검출했다. Lifeact-GFP를 발현하는 정상 MCF10A 세포와 전이성 암세포(MDA-MB-231)를 RGD-TGT 또는 ATN-TGT 표면에 동시에 로딩했다. 침습성 세포는 벤트럴 파열 패턴의 분석을 사용하여 구별할 수 있었다. 스케일 바, 20μm.
도 15 는 ATN-qTGT를 사용한 침입촉수의 기본 구조 및 침입촉수의 장력 감지에 대한 개략도를 나타낸다.
도 16 은 침입촉수는 ATN-qTGT 표면의 벤트럴 파열(ventral rupture)를 야기하는 것을 나타낸다. 침입촉수 마커(Fascin, MyoX 및 Cortactin)와 ATN-qTGT 파열은 공동 국소화되었다.
도 17 은 침입촉수 마커 및 TGT 파열의 시간 경과 이미지를 나타낸다. 침입촉수 마커(Fascin, MyoX 및 Cortactin) 및 ATN-qTGT 파열이 공동 국소화되었다. 스케일 바, 10μm.
도 18 은 침입촉수는 ATN-qTGT 표면의 벤트럴 파열(ventral rupture)를 야기하는 것을 나타낸다. e) MDA-MB-231 세포에 의해 유도된 ATN-TGT 파열의 대표적인 이미지. f) Fascin 억제제의 첨가로 ATN-TGT 파열이 현저히 감소됨. g) GM6001(MT1-MMP 억제제)을 추가하면 ATN-TGT가 파열됨. ATN-TGT 파열은 크게 감소하지 않았다. 와이드 뷰 이미지의 스케일 바 = 60 μm, 확대 이미지의 경우 = 10 μm.
도 19a 는 액틴 중합 및 세포 수축과 관내 힘의 상관 관계를 확인하기 위해Y27632(ROCK 억제제) 또는 블레비스타틴(미오신 II 억제제)으로 처리된 MDA-MB-231 세포에 의해 형성된 ATN-TGT 파열을 모니터링했다.
도 19b 는 액틴 중합 및 세포 수축과 관내 힘의 상관 관계를 나타낸다. 단일 세포당 측정된 총 파열 면적의 빈도를 표시하고 각 조건에서 DIC 및 ATN 파열의 대표적인 이미지를 표시했다. 억제제가 있거나 없는 MDA-MB-231 세포는 Ttol이 > 100(n = 94, 93 및 68), 54(n = 86, 64 및 54) 및 43 pN(n = 85, 70, 59). 모든 실험은 3~4회 반복되었다. 샘플 번호가 표시된다.
도 20a 는 세포 부착의 초기 단계에서 인테그린 α5 및 β1 소단위 및 축적된 TGT 파열의 공동 국소화 분석을 나타낸다. a) MDA-MB-231 세포의 접착 중 β1 인테그린 및 축적된 ATN-qTGT 파열의 시간 경과 이미지. b) 시간 경과에 따른 β1 인테그린 및 ATN-qTGT 파열의 형광 강도 변화. ATN-qTGT 파열 신호는 β1 인테그린이 ATN-qTGT 표면에 결합한 후 몇 분 후에 β1 인테그린 영역에서 감지되었다.
도 20b 는 세포 부착의 초기 단계에서 인테그린 α5 및 β1 소단위 및 축적된 TGT 파열의 공동 국소화 분석을 나타낸다. c) α5 인테그린 및 축적된 ATN-TGT 파열의 시간 경과 이미지. d) 검은색 점선을 가로지르는 형광 강도 프로파일. t = 0분에서 α5 인테그린의 형광 강도 및 시간 경과에 따른 α5 인테그린의 해당 영역에서 ATN-TGT의 형광 강도 변화. 활성화된 α5β1 인테그린을 통한 접착은 100pN보다 큰 침입촉수 형성 및 침입촉수력를 유발했다. 스케일 바 = 10 μm.
도 21 은 전이성 암세포에서 시간 경과에 따른 α5β1 인테그린 장력과 후속 침입자 형성 및 성숙 사이의 기계생물학적 관계 요약을 나타낸다.
이하, 본 발명을 보다 상세히 설명한다.
본 발명에서 '파열' 또는 '럽쳐(rupture)' 는 본 발명의 센서가 시료와 결합한 후 센서의 이중가닥 형태의 핵산 또는 핵산 전구체가 단일가닥으로 분리되는 것을 의미할 수 있다. 분리된 핵산 및 핵산 전구체에 부착되어 있는 형광염료를 확인함으로써, '파열' 또는 '럽쳐' 여부를 확인할 수 있다.
침입촉수(Invadopodia)는 기계적 힘을 생성하고 단백질 분해 효소를 분비하여 암 침범에 관여한다. 인테그린(Integrin), 특히 α5β1 인테그린에 가해지는 물리적인 힘은 침입촉수 물리력의 생성 및 침입촉수의 돌출 활동과 밀접하게 관련되어 있다고 가정되었다. 그러나 그들의 기계적 관계는 여전히 파악하기 어렵다. 본 발명에서 단일 분자 정밀도로 α5β1 인테그린 장력을 매핑하기 위해 새로운 데옥시리보핵산 기반 힘 센서를 완성하였다. 이 프로브를 사용하여 인테그린 유형 및 장력에 따른 침입촉수의 형성 및 성숙을 조사하였다. 또한, 인테그린 장력 지도의 시공간 분석을 수행하여 인테그린 장력 및 인테그린 장력의 변화를 침입촉수 발달의 각 단계에서 측정하였다. 결과적으로, 40pN 이상의 α5β1 인테그린 장력은 유착뿐만 아니라 침입촉수의 성숙에도 중요하며, 결국 액토미오신(actomyosin) 수축성을 갖는 α5β1 인테그린-리간드 복합체를 통해 100pN보다 큰 강력한 침입촉수의 생성을 초래하는 것을 확인할 수 있었다. 즉, 본 발명의 단분자력 센서 ATN-TGT는 전이성 암세포를 특이적으로 탐지할 수 있는 것이다(도 14).
RGD-TGT에 대한 이전 연구에서는 일반적으로 전체 세포 접촉 영역에 걸쳐 큰 반점과 같은 전체 파열(rupture)를 유도하는 인테그린 장력과 세포 주변을 따라 FA 지점에서 고리 모양의 엣지 파열(edge rupture)를 설명했다. RGD-TGT 표면의 파열은 주로 강한 αvβ3 인테그린 장력을 통해 발생한다. 본 발명의 TGT 분석은 α5β1 인테그린 장력이 1) 점상 벤트럴 파열(ventral rupture, ATN-TGT에서) 및 2) 산호와 같은 벤트럴 파열(ventral rupture, RGD-TGT에서)의 두 가지 별개 그룹으로 추가 분류될 수 있는 독특한 벤트럴 파열(ventral rupture) 패턴을 초래함을 보여주었다. 이러한 벤트럴 파열은 다른 메커니즘을 통해 생성되었다. 점상 파열은 α5β1 인테그린을 통해 위쪽으로 침입하는 힘이 가해질 때 생성된 반면, 산호와 같은 파열은 αvβ3 인테그린 접착을 사용하여 세포 주변을 확장하여 끌리는 힘을 생성함으로써 세포가 바깥쪽으로 퍼질 때 형성되었다. 흥미롭게도, 43pN RGD-TGT 및 다중화된 43pN 표면에서 전체 파열만 관찰되었지만 벤트럴 파열(ventral rupture)는 관찰되지 않았으며, 이는 αvβ3 인테그린을 통해 전달되는 힘이 43pN 보다 큰 반면 힘이 없거나 43pN 미만인 힘이 α5β1 인테그린을 통해 전달된 것을 나타낸다. 이는 αvβ3 인테그린이 접착력 및 힘 전달에 대해 α5β1 인테그린을 능가했기 때문에, αvβ3 인테그린이 있는 상태에서 피크 α5β1 인테그린 장력이 43pN으로 제한적으로 증가하면 침입촉수 구축이 불가능할 수 있다.
[도 8] ~ [도 11] 에서 볼 수 있듯이 암세포가 54 및 > 100pN RGD-TGT 표면에 부착되었을 때 산호 모양의 파열이 때때로 관찰되었다. 전이성 암세포가 피브로넥틴과 본 발명의 >100pN TGT 구조와 유사하지만 리간드가 없는 다른 유형의 DNA 테더로 코팅된 표면에 부착되었을 때 유사한 산호 모양의 파열이 보고되었다. 산호 모양의 파열은 인테그린 장력보다는 전이암 세포에 발현되는 막 결합 Dnase의 활성으로 인해 발생하는 것으로 알려져 있다. 본 발명자들은 TIRF 현미경을 사용하여 ATN-TGT의 세포에서 발견되는 Dnase X와 벤트럴 파열(ventral rupture) 사이의 직접적인 관계 가능성을 조사했다. 전이성 암세포는 피브로넥틴이 포함된 54pN ATN-TGT 표면에 시딩되어 산호와 같은 파열과 반점 파열이 모두 발생했다(도 13). 흥미롭게도, 형광 이미지에서 벤트럴 파열과 Dnase X의 명백한 공동 국소화는 없었다. 이것은 ATN-TGT의 벤트럴 파열이 막 결합 Dnase의 단백질 분해 활성에 의해 생성된 것이 아니라 물리적 접촉과 침입촉수의 끝에서 α5β1 인테그린을 통한 힘 전달에 의해 생성되었음을 증명했다.
본 발명은 침입촉수 형성에서 α5β1 인테그린의 역할을 재정의했다. β1 인테그린은 관내 성숙에 관여하지만 관내 전구체의 초기 형성에는 관여하지 않는 것으로 알려져 있다. 그러나, 본 발명의 결과는 40pN보다 큰 힘에 의한 α5β1 인테그린의 활성화가 침입촉수의 개시 및 성숙을 위한 전제 조건임을 밝히고, α5β1 인테그린에 적용된 분자 장력이 침입촉수 형성 및 성숙에 어떻게 영향을 미치는지에 대한 생물물리학적 모델을 제안하도록 이끌었다(도 21). >40 pN의 단일 분자 장력은 α5β1 인테그린의 활성화에 필요하며, 결과적으로 침입촉수 내의 기본 세포골격 구조의 구성을 위한 액틴 중합을 허용했다. 침입촉수 구조가 더 성숙함에 따라 100pN 이상의 수직 장력은 액토미오신 세포 골격의 동적 수축으로 인해 α5β1 인테그린을 통해 전달된다.
따라서, 본 발명은 이중가닥의 핵산을 포함하는 단분자력 센서(single molecule force sensor)로서,
i) 상기 이중가닥 중 일 가닥에 ATN 리간드 및 형광염료가 부착되어 있고, 다른상보적인 가닥에 표면결합물질이 부착되어 있거나,
ii) 상기 이중가닥 중 일 가닥에 ATN 리간드 및 표면결합물질이 부착되어 있고, 다른 상보적인 가닥에 형광물질이 부착되어 있는 센서를 제공한다.
상기 형광염료는 Cy3, Cy5, FITC(poly L-lysine-fluorescein isothiocyanate), RITC(rhodamine-B-isothiocyanate) 또는 로다민(rhodamine) 일 수 있으나 형광염료(Fluorescent dye), 퀀텀닷(Quantum Dot) 또는 형광단백질 등 핵산에 표지 가능한 물질이라면 제한없이 해당할 수 있다.
상기 단분자력 센서는 핵산 이외에 LNA(Locked nucleic acid) 등 DNA 단일 가닥에 수소 결합을 통해 이중가닥을 형성 가능한 핵산 전구체를 포함하는 것일 수 있다.
구체적으로, 상기 핵산은 센스 또는 안티센스 가닥을 나타낼 수 있는, 게놈이나 합성 기원 중 어느 하나인 DNA 또는 RNA일 수 있다. 따라서, 핵산 서열은 dsDNA, ssDNA, 혼합 ssDNA, 혼합 dsDNA, ssDNA(예컨대, 융해, 변성, 헬리케이즈 등에 의해)로 만들어진 dsDNA, A-, B-, 또는 Z-DNA, 삼중-가닥 DNA, RNA, ssRNA, dsRNA, 섞인 ssRNA 및 dsRNA, ssRNA(예컨대, 융해, 변성, 헬리케이즈 등을 통해)로 만들어진 dsRNA, 메신저 RNA(mRNA), 리보솜 RNA(rRNA), 전달 RNA(tRNA), 촉매 RNA, snRNA, 마이크로RNA, 또는 단백질 핵산(PNA)일 수 있다.
상기 핵산은 10 bp ~ 30 bp 일 수 있고, 보다 바람직하게는 상기 핵산은 17 bp ~ 24 bp 일 수 있다.
상기 표면부착물질은 상기 센서를 칩(chip) 또는 디쉬(dish) 의 표면에 고정시키기 위한 물질을 의미하며, 비오틴 작용기 일 수 있으며, 이외에 표면에 흡착 혹은 공유결합을 통한 부착을 일으키는 작용기 또는 물질이라면 제한없이 사용가능하다.
상기 표면부착물질은 핵산에 결합할 수 있으며, 결합 시 그 결합위치는 변동 가능할 수 있다. 핵산에 부착된 표면부착물질의 위치에 따라, 물리력이 가해지는 위치가 바뀌므로, 파열을 일으키는데 필요한 힘의 크기 (12pN ~ 200 pN)가 달라질 수 있다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 센서의 ATN 리간드가 암 세포의 α5β1 인테그린과 결합하는 것일 수 있다.
상기 센서는 암 세포의 α5β1 인테그린과 결합함으로써 암 세포의 α5β1 인테그린의 장력(tension)을 측정할 수 있으며, 또는, 상기 센서가 암 세포의 α5β1 인테그린과 결합 후 그 센서가 파열(rupture)된 결과를 이미징하여 파열 형태를 확인함으로써 암 진단 등에 활용할 수 있다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 센서는 40 pN 이상 ~ 200 pN 이하 장력에서 이중가닥이 단일 가닥으로 분리되는 것일 수 있다.
상기 암은 침습성 또는 전이성을 나타낼 수 있는 암을 모두 포함하는 의미일 수 있으며, 보다 바람직하게는 육종, 상피암 또는 흑색종일 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 센서를 포함하는 침습성 및/또는 전이성 암 진단용 조성물을 제공할 수 있다.
본 발명의 “진단(diagnosis)”은 넓은 의미로는 환자의 병의 실태를 모든 면에 걸쳐서 판단하는 것을 의미한다. 판단의 내용은 병명, 병인, 병형, 경중, 병상의 상세한 양태, 및 합병증의 유무 등이다. 본 발명에서 진단은 바람직하게는 침습성 및/또는 전이성 암 및 이의 발병 위험성을 판단하는 것이다.
또한, 본 발명은 상기 센서를 포함하는 침습성 및/또는 전이성 암 모니터링용 조성물을 제공할 수 있다.
상기 암 모니터링은 암의 진행 및/또는 외과적 및/또는 치료적 치료의 효능을 결정하는 것, 예를 들어 암의 차도가 있는지 여부; 또는 반대로 암 진행이나 재발이 있는지 여부를 결정하는 것을 의미할 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 센서를 포함하는 침습성 및/또는 전이성 암 예후 예측용 조성물을 제공할 수 있다.
본 발명의 “예후(prognosis)”는 병세의 의학적 결과에 대한 전망 내지 예비적 평가를 말하는데, 예를 들면, 좋지 않은 또는 좋은 결과(예를 들면, 장기간 생존의 가능성)를 예측하는 것을 의미한다. 음성 예후 내지 좋지 않은 결과는 재발, 질병의 진행(예를 들면, 암 성장 또는 전이, 또는 약물 내성), 또는 사망할 가능성의 예측을 포함하고, 양성 예후 또는 좋은 결과는 질병 완치(예를 들면, 질병이 없는 상태), 완화(예를 들면, 암의 퇴치) 또는 안정화의 예측을 포함한다. 본 발명에서 예후는 침습성 및/또는 전이성 암의 재발, 생존(overall survival), 또는 무병생존(disease-free survival)을 의미한다. 예후의 예측(또는 예후의 진단)은 특히 초기 암 환자의 화학치료 여부를 비롯하여 향후 암 치료에 대한 단서를 제시할 수 있다. 예후 예측은 암 치료제에 대한 환자의 반응, 치료 경과에 대한 예측도 포함한다.
또한, 본 발명은 i) 상기 센서가 고정된 플레이트에 개체로부터 분리된 시료를 로딩하여 상기 센서와 상기 시료를 결합시키는 단계;
ii) 상기 결합된 센서와 시료를 방치하는 단계; 및
iii) 상기 센서가 파열(rupture)된 형태를 이미징하는 단계;
를 포함하는 침습성 및/또는 전이성 암 진단을 위한 정보제공 방법을 제공할 수 있다.
상기 단계 i) 의 상기 고정은, BSA (bovine serum albumin)로 코팅되어 있는 플레이트에 상기 표면부착물질(비오틴 등)과 결합할 수 있는 물질(뉴트라비딘 등)을 결합시킨 후, 상기 물질과 본 발명의 센서를 결합시켜 고정하는 것일 수 있다(실시예 2-2).
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 단계 i)의 플레이트(plate)는 바닥이 존재하는 기구를 모두 포함할 수 있으나, 바람직하게는 칩(chip) 또는 디쉬(dish) 인 것일 수 있다.
상기 단계 i) 의 시료는 소변, 대변, 모발, 땀, 타액, 체액, 혈액, 세포 또는 조직일 수 있다.
상기 단계 iii)의 이미징은 단분자력 센서의 파열이 일어날 때 소실되는 형광 염료를 현미경 등 장비를 사용하여 이미징하여 확인하는 것일 수 있다.
상기 센서는 상기 단분자력 센서와 동일하므로 설명은 그 기재로 대신한다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 정보제공 방법은
iv) 상기 이미징 결과가 벤트럴 파열(ventral rupture) 패턴인 경우 침습성 및/또는 전이성 암으로 분류하는 단계;
를 추가적으로 포함하는 것일 수 있다.
상기 '벤트럴 파열(ventral rupture)' 은 시료 내 존재하는 암 세포의 α5β1 인테그린과 상기 센서가 결합한 후 암 세포가 퍼지는 과정에서 침입촉수가 형성되고, 형성된 침입촉수가 센서를 잡아당겨 파열되어, 상기 센서 내 형광염료가 소실된 위치가 암 세포의 중앙, 즉 복부(ventral) 위치인 것을 의미할 수 있다(도 8 등). 이 경우 상기 시료 내 존재하는 암 세포의 α5β1 인테그린의 장력(tension)은 40 pN 이상 ~ 200 pN 이하일 수 있다.
반대로, 이미징 결과가 '엣지 파열(edge rupture)' 패턴인 것은 시료 내 존재하는 암 세포의 다양한 종류의 인테그린 특히, αvβ3 인테그린과 상기 센서가 결합한 후 암 세포가 퍼지는 과정에서, 세포 가장자리 (edge)에 힘을 가함으로써, 세포 가장자리 부분에서 형광염료가 소실되는 것을 의미한다(도 8 등).
상기 암은 침습성 또는 전이성을 나타낼 수 있는 암을 모두 포함하는 의미일 수 있으며, 보다 바람직하게는 육종, 상피암 또는 흑색종일 수 있다.
또한, 본 발명은 i) 상기 센서가 고정된 플레이트에 개체로부터 분리된 시료를 로딩하여 상기 센서와 상기 시료를 결합시키는 단계;
ii) 상기 결합된 센서와 시료를 방치하는 단계; 및
iii) 상기 센서가 파열(rupture)된 형태를 이미징하는 단계;
를 포함하는 침습성 및/또는 전이성 암 모니터링 방법을 제공할 수 있다.
상기 단계 i) 의 상기 고정은, BSA (bovine serum albumin)로 코팅되어 있는 플레이트에 상기 표면부착물질(비오틴 등)과 결합할 수 있는 물질(뉴트라비딘 등)을 결합시킨 후, 상기 물질과 본 발명의 센서를 결합시켜 고정하는 것일 수 있다(실시예 2-2).
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 단계 i)의 플레이트(plate)는 바닥이 존재하는 기구를 모두 포함할 수 있으나, 바람직하게는 칩(chip) 또는 디쉬(dish) 인 것일 수 있다.
상기 단계 i) 의 시료는 소변, 대변, 모발, 땀, 타액, 체액, 혈액, 세포 또는 조직일 수 있다.
상기 단계 iii)의 이미징은 단분자력 센서의 파열이 일어날 때 소실되는 형광 염료를 현미경 등 장비를 사용하여 이미징하여 확인하는 것일 수 있다.
상기 센서는 상기 단분자력 센서와 동일하므로 설명은 그 기재로 대신한다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 암 모니터링 방법은
iv) 상기 이미징 결과가 벤트럴 파열(ventral rupture) 패턴인 경우 침습성 및/또는 전이성 암으로 분류하는 단계;
를 추가적으로 포함하는 것일 수 있다.
상기 '벤트럴 파열(ventral rupture)' 은 시료 내 존재하는 암 세포의 α5β1 인테그린과 상기 센서가 결합한 후 암 세포가 퍼지는 과정에서 침입촉수가 형성되고, 형성된 침입촉수가 센서를 잡아당겨 파열되어, 상기 센서 내 형광염료가 소실된 위치가 암 세포의 중앙, 즉 복부(ventral) 위치인 것을 의미할 수 있다(도 8 등). 이 경우 상기 시료 내 존재하는 암 세포의 α5β1 인테그린의 장력(tension)은 40 pN 이상 ~ 200 pN 이하일 수 있다.
반대로, 이미징 결과가 '엣지 파열(edge rupture)' 패턴인 것은 시료 내 존재하는 암 세포의 다양한 종류의 인테그린 특히, αvβ3 인테그린과 상기 센서가 결합한 후 암 세포가 퍼지는 과정에서, 세포 가장자리 (edge)에 힘을 가함으로써, 세포 가장자리 부분에서 형광염료가 소실되는 것을 의미한다(도 8 등).
상기 암은 침습성 또는 전이성을 나타낼 수 있는 암을 모두 포함하는 의미일 수 있으며, 보다 바람직하게는 육종, 상피암 또는 흑색종일 수 있다.
또한, 본 발명은 i) 상기 센서가 고정된 플레이트에 개체로부터 분리된 시료를 로딩하여 상기 센서와 상기 시료를 결합시키는 단계;
ii) 상기 결합된 센서와 시료를 방치하는 단계; 및
iii) 상기 센서가 파열(rupture)된 형태를 이미징하는 단계;
를 포함하는 침습성 및/또는 전이성 암 예후 예측 방법을 제공할 수 있다.
상기 단계 i) 의 상기 고정은, BSA (bovine serum albumin)로 코팅되어 있는 플레이트에 상기 표면부착물질(비오틴 등)과 결합할 수 있는 물질(뉴트라비딘 등)을 결합시킨 후, 상기 물질과 본 발명의 센서를 결합시켜 고정하는 것일 수 있다(실시예 2-2).
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 단계 i)의 플레이트(plate)는 바닥이 존재하는 기구를 모두 포함할 수 있으나, 바람직하게는 칩(chip) 또는 디쉬(dish) 인 것일 수 있다.
상기 단계 i) 의 시료는 소변, 대변, 모발, 땀, 타액, 체액, 혈액, 세포 또는 조직일 수 있다.
상기 단계 iii)의 이미징은 단분자력 센서의 파열이 일어날 때 소실되는 형광 염료를 현미경 등 장비를 사용하여 이미징하여 확인하는 것일 수 있다.
상기 센서는 상기 단분자력 센서와 동일하므로 설명은 그 기재로 대신한다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 암 예후 예측 방법은
iv) 상기 이미징 결과가 벤트럴 파열(ventral rupture) 패턴인 경우 침습성 및/또는 전이성 암으로 분류하는 단계;
를 추가적으로 포함하는 것일 수 있다.
상기 '벤트럴 파열(ventral rupture)' 은 시료 내 존재하는 암 세포의 α5β1 인테그린과 상기 센서가 결합한 후 암 세포가 퍼지는 과정에서 침입촉수가 형성되고, 형성된 침입촉수가 센서를 잡아당겨 파열되어, 상기 센서 내 형광염료가 소실된 위치가 암 세포의 중앙, 즉 복부(ventral) 위치인 것을 의미할 수 있다(도 8 등). 이 경우 상기 시료 내 존재하는 암 세포의 α5β1 인테그린의 장력(tension)은 40 pN 이상 ~ 200 pN 이하일 수 있다.
반대로, 이미징 결과가 '엣지 파열(edge rupture)' 패턴인 것은 시료 내 존재하는 암 세포의 다양한 종류의 인테그린 특히, αvβ3 인테그린과 상기 센서가 결합한 후 암 세포가 퍼지는 과정에서, 세포 가장자리 (edge)에 힘을 가함으로써, 세포 가장자리 부분에서 형광염료가 소실되는 것을 의미한다(도 8 등).
상기 암은 침습성 또는 전이성을 나타낼 수 있는 암을 모두 포함하는 의미일 수 있으며, 보다 바람직하게는 육종, 상피암 또는 흑색종일 수 있다.
한편, 본 발명은 삼성미래기술육성재단의 지원을 받아 수행한 연구결과에 해당한다(과제 번호 SSTF-BA2001-05).
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의하여 제한되는 것으로 해석하지 않는 것은 해당 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명한 것이다.
<1-1> 장력 게이지 테더의 합성
장력 게이지 테더(TGT, Tension gauge tether) 제작을 위해, 고리형 RGDfK 리간드(고리형 RGDfK-NH2, Peptides International, PCI-3696-PI) 또는 ATN-161 리간드(Ac-PHSCN-NH2, Sigma-Aldrich, SML2079)는 형광 염료(Cy3 또는 Cy5)와 이종 이중 기능 교차 링커(Sulfo-SMCC, Thermo Fisher Scientific, 22 622)를 사용하여 티올로 변형된 18 염기쌍 길이의 단일 가닥 DNA(ssDNA)에 접합되었다. Sulfo-SMCC의 말레이미드 그룹은 ssDNA의 티올 그룹과 반응하고 Sulfo-SMCC의 NHS 에스테르 그룹은 리간드의 아민 그룹과 반응하여 cRGDfK 또는 ATN-161 접합 ssDNA를 생성하였다. 미반응 SMCC-올리고는 폴리아크릴아미드 겔 전기영동(PAGE)에 의해 제거되었다. ATN161 결합 올리고머는 MALDI-TOF 질량분석기(Axima Assurance, Shimadzu Biotech, 분석 서비스 제공: COSMOgenetech, Inc, South Korea)로 분석하였다.
다음으로, 장력 내성(Ttol = 43 및 54 pN)을 결정하는 다양한 위치에서 비오틴이 있는 상보적인 ssDNA를 리간드 접합 ssDNA에 어닐링했다. qTGT의 합성을 위해 상보적인 ssDNA 가닥을 NHS-PEG12-Biotin(Thermo Fisher Scientific, 21 312) 링커를 사용하여 비오틴화하고 qTGT에 대한 리간드-접합 ssDNA로 어닐링했다. > 100 pN TGT의 경우, cRGDfK 리간드 또는 ATN-161 리간드를 바이오틴화된 ssDNA에 접합시키고, 형광 염료로 상보적인 ssDNA와 어닐링하였다. 모든 DNA 올리고머는 IDT Inc.에서 구입했다. 특정 시퀀스 정보는 하기 [표 1]에 나와 있다.
| 리간드 결합된 ssDNA 가닥 서열 | 서열번호 | |
| ssDNA strand for 43 and 54 pN TGT | 5'-/5Cy3(or Cy5)/GGC CCG CAG CGA CCA CCC/3ThioMC3-D/-3' | 1 |
| ssDNA strand for >100 pN TGT | 5'-/5ThioMC6-D/GGG TGG TCG CTG CGG GCC T/3Bio/-3' | 2 |
| ssDNA strand for qTGT | 5'-/BHQ-2/GGC CCG CAG CGA CCA CCC/3ThioMC3-D/-3' | 3 |
| 43 및 54 pN TGT 의 ssDNA 가닥 상보적 서열 | ||
| 43 pN | 5'-GGG TGG TCG C/iBioT/G CGG GCC -3' | 4 |
| 54 pN | 5'-GGG TGG TCG CTG CGG GCC/3Bio/-3' | 5 |
| >100 pN TGT 의 ssDNA 가닥 상보적 서열 | ||
| >100 pN | 5'-/5Cy3(or Cy5)/GGC CCG CAG CGA CCA CCC/-3' | 6 |
| qTGT 의 ssDNA 가닥 상보적 서열 | ||
| 54 pN | 5'-GGG TGG TCG CTG CGG GCC/iAmMC6T/TT TTT/3Bio/-3' | 7 |
<1-2> 세포 배양
인간 유방암 세포주(MDAMB-231 및 MCF7 세포)를 10%(v/v) 태아 소 혈청(FBS, Gibco, 16 000 044) 및 1%(v/v) 페니실린/스트렙토마이신(Gibco, 15140-122) 이 보충된 Dulbecco's modified eagle's medium (DMEM, Gibco, 11965-092)에서 배양했다. MCF10A 세포는 5% 말 혈청(Gibco, 16 050 122), 20ng mL-1 인간 표피 성장 인자(EGF, Sino Biological, 10605-HNAY), 0.5㎍/mL-1 하이드로코르티손(Sigma-Aldrich, H0888), 100ng/mL-1 콜레라 독소(List labs, #100B), 10㎍/mL-1 인슐린(Thermo Fisher Scientific, 12585-014) 및 1% 페니실린 /스트렙토마이신(Gibco, 15140-122) 가 보충된 DMEM/F-12(Sigma-Aldrich, D8437)에서 배양되었다. 모든 세포는 표준 배양 조건(가습 환경에서 37°C에서 5% CO2)에서 배양되었다.
αvβ3 및 α5β1 인테그린을 통한 세포 접착 활성화에 필요한 인테그린 장력 측정
<2-1> 인테그린 결합 친화도 측정
αvβ3 또는 α5β1 인테그린의 장력이 세포 접착을 조절하는 방식을 구별하기 위해 본 발명자들은 α5β1 인테그린에 높은 친화도로 결합하는 ATN-161 리간드를 사용하여 새로운 TGT 변이체(ATN-TGT)를 생성했다(도 1a, 도 2). 피브로넥틴(PHSRN)의 시너지 영역은 α5β1 인테그린에 결합하고 α5β1 인테그린 매개 세포 결합에 대한 기계적 지지를 제공하는 것으로 알려져 있다. ATN-161은 α5β1 인테그린에 대한 친화력이 향상된 시너지 영역에서 유래한 아세틸화 및 아미드화 5-아미노산 펩타이드(Ac-PHSCN-NH2)이다. 따라서, 이 ATN-TGT가 높은 선택성으로 αvβ3 인테그린에 결합하지만 여전히 낮은 선택성으로 α5β1 인테그린에 결합하는 cRGDfK 리간드(RGD-TGT)를 사용하여 전통적인 TGT 분석의 단점을 수정할 것이다. α5β1 인테그린에 대한 ATN-TGT의 선택적 결합은 생물층 간섭계(BLI) 실험에 의해 검증되었다(도 3).
결합 친화도는, 리간드(cRGDfK 또는 ATN-161)-접합된 ssDNA와 αvβ3 또는 α5β1 인테그린 사이의 결합 친화도는 생물층 간섭계(BLI, Octet R8 instrument, Sartorius, Germany)로 측정하였다. αvβ3 인테그린(3050-AV-050) 및 α5β1 인테그린(3230-A5-050)은 R&D Systems Inc.에서 구입했다. 동역학 적정 분석의 모든 센소그램은 제조업체의 지시에 따라 수행되었다. 간단히 말해서, 리간드-접합 ssDNA 분자는 바이오틴-스트렙타비딘 결합을 통해 바이오센서(18-5019, Sartorius)의 표면에 고정화되었고, 고정된 DNA에 대한 다양한 농도의 인테그린의 결합은 30°C 및 1000rpm 진탕 조건에서 기록되었다. 사용 전에 streptavidin(SA) 바이오센서를 1X Kinetics 버퍼(Sartorius, Inc)에서 10분 동안 미리 수화했다. 바닥이 평평한 96웰 분석 플레이트는 컬럼 1(기준선 평형을 위한 버퍼), 컬럼 2(리간드 용액), 컬럼 3(세척을 위한 버퍼) 및 컬럼 4(분석물 용액)와 같이 준비되었다. 모든 희석은 1X Kinetics 버퍼에서 수행되었다. 역학 분석은 다른 속도 상수, 오염, 비특이적 상호 작용 및 기존 결합 분석물의 해리로 인한 의도하지 않은 편향을 피하기 위해 다른 바이오센서를 사용하여 수행되었다. 분석 시간은 평형을 위한 120초, 로딩을 위한 600초, 결합을 위한 600초, 해리를 위한 600초로 최적화되었다. 데이터 분석은 KD 값을 얻기 위해 1:1 모델을 사용하는 Savitzky-Golay 필터링 및 전역 피팅과 함께 참조의 센소그램을 빼서 Octet 소프트웨어를 사용하여 수행되었다.
그 결과, αvβ3 및 α5β1 인테그린에 대한 ATN-TGT의 측정된 평형 해리 상수(KD) 값은 187 × 10-9 및 1.33 × 10-9 M인 반면, αvβ3 및 α5β1 인테그린에 대한 RGD-TGT의 Kd 값은 3.96 × 10-9 M 및 69 × 10-9 M 이었다(표 2). 이러한 결과는 ATN-TGT가 α5β1 인테그린 결합에 대해 고도로 선택적인 반면 RGD-TGT는 αvβ3 인테그린 결합에 대해 선택적이지만 α5β1 인테그린에 대한 결합은 무시할 수 없음을 시사했다. 따라서 ATN-TGT의 이러한 고유한 특성을 통해 α5β1 인테그린에 가해지는 장력 수준을 관리하고 α5β1 인테그린 장력을 측정할 수 있었다.
| TGT 및 인테그린 결합 쌍 | k a [Ms 1 ] | k d [s 1 ] | K D [10 6 M] | R 2 |
| ATN-TGT : α5β1 인테그린 | 5.34 × 105 | 7.07 × 10-4 | 1.33 | 0.96 |
| RGD-TGT : α5β1 인테그린 | 9.95 × 103 | 6.86 × 10-4 | 69 | 0.9888 |
| ATN-TGT : αvβ3 인테그린 | 8.16 × 102 | 1.52 × 10-4 | 187 | 0.9809 |
| RGD-TGT : αvβ3 인테그린 | 1.01 × 105 | 3.99 × 10-4 | 3.96 | 0.9833 |
43, 54 및 > 100pN의 다른 Ttol 값을 갖는 리간드 결합 TGT가 설정되었다(도 1 의 b). 간단히 말해서, 기계적 용융으로 이어지는 역치 힘으로 정의된 Ttol은 bottom DNA 가닥(43 및 54pN)의 비오틴 위치에 의해 제어되었다. 2초 동안 일정한 힘을 가하는 것과 관련하여 de Gennes 모델과 자기 핀셋 실험을 사용하여 추정했다. 또한, 비오틴-뉴트라비딘 결합을 통해 묶인 단일 가닥 DNA는 Ttol이 더 높을 것으로 예측되었다. 100pN보다 크므로 ">100pN"으로 표시했다.
<2-2> 세포 접착 활성화 측정
모든 TGT는 뉴트라비딘-비오틴 결합을 통해 유리 표면에 고정되었다. 유리 바닥 디쉬(SPL, 100 350)를 실온에서 2시간 동안 PBS에서 400μg/mL BSA-비오틴(Sigma-Aldrich, A8549)으로 코팅하고 철저히 세척했다. PBS 중 뉴트라비딘(200 μg/mL)을 실온에서 10분 동안 인큐베이션하고 PBS로 3회 철저히 헹구었다. 1 마이크로리터의 TGT 또는 qTGT 용액(단일 TGT 분석의 경우 1 x 10-6 M 또는 다중 TGT 분석의 경우 각각 0.5 x 10-6 M)을 BSA 코팅된 유리 표면에 놓고 습도 챔버에서 30분 동안 배양했다. 지저분한 이미징 배경을 방지하기 위해 TGT 표면은 항상 건조되지 않은 상태로 유지되었다.
본 발명자들은 암 침윤 및 전이 연구를 위해 일반적으로 사용되는 두 가지 인간 유방암 세포주 MDA-MB-231(고침습성) 및 MCF7(비침습성)과 정상 세포주 MCF10A를 대조군으로 사용했다. 유방암 세포주 이외에 다른 암 세포 유형에서도 유사한 결과를 확인할 수 있었다(도 4). 각 세포주는 TGT 코팅된 표면에 로딩되었다. 구체적으로, 각 세포주를 배양 디쉬에서 수확하고 무혈청 배지에 재현탁했다. 세포는 105 세포/mL의 밀도로 TGT 표면에 접종되었다. 2시간 인큐베이션 후, 형광 이미징을 위해 세포를 4% 파라포름알데히드 용액으로 고정시켰다.
TGT 코팅된 표면은 소 혈청 알부민(BSA) 또는 폴리에틸렌 글리콜(PEG)로 부동태화되었기 때문에 세포 접착은 전적으로 인테그린-리간드-TGT 결합을 통해 매개되었다. 2시간의 배양 후, 세포는 40pN 이상의 Ttol로 RGD-TGT 및 ATN-TGT 표면에 부착되었지만 세포 퍼짐은 세포 및 인테그린 유형에 따라 다양했다(도 1 의 c, 도 6, 도 7a~도 7c). RGD-TGT 표면에서 Ttol = 43pN의 경우 모든 세포가 부착되어 둥근 모양을 유지했다. 반면 Ttol > 54 pN의 경우 각 세포가 더 퍼졌고 FA 복합체를 형성하여 분극화되었다(도 7a~도 7c 에서 vinculin, 지원 정보에서 보편적인 FA 마커로 표시됨). 대조적으로, ATN-TGT 표면에서 부착 세포는 모든 테스트 조건에서 FA 복합체가 없는 둥근 모양을 유지했다(도 7a~도 7c). 이러한 결과는 40pN보다 큰 기계적 힘이 두 가지 인테그린 유형을 모두 활성화하여 결과적으로 다른 세포 거동을 유발할 수 있음을 나타냈다. αvβ3 인테그린은 주로 세포 확산과 판코니빈혈 형성에 관여하는 반면, α5β1 인테그린은 부착 기능은 있지만 확산 기능은 없다.
α5β1 인테그린 장력이 유도하는 독특한 벤트럴 파열 패턴
TGT 분석은 인테그린 장력이 인테그린 및 세포 유형에 의해 어떻게 영향을 받는지 조사하기 위해 사용되었다(도 8 ~ 도 11).
Cy3 또는 Cy5의 형광 염료가 DNA 위쪽 가닥의 한쪽 끝에 접합되었기 때문에 Ttol보다 큰 인테그린 장력에 의한 DNA 파열은 형광 신호의 손실을 유발하여 궁극적으로 인테그린 장력을 세포내 수준으로 매핑할 수 있도록 했다. 본 발명자들은 αvβ3 인테그린 장력이 고리 모양의 "엣지 파열(edge rupture)" 또는 전체 세포 접촉 영역 "전체 파열(entire rupture)"에 파열을 일으키는 반면 α5β1 인테그린 장력은 세포의 복부(ventral) 위치의 표면에 파열을 일으키므로 "벤트럴 파열(ventral ruptures)” 이라고 이름붙였다. Ttol = 54pN에서 RGD-TGT 표면의 MDA-MB-231 세포 접착의 경우 "산호 같은(coral-like)" 벤트럴 파열이 엣지 파열과 동시에 관찰되었다.
각 세포주의 빈쿨린(Vinculin)과 액틴은 제조업체의 프로토콜에 따라 초점 접착 염색 키트(Sigma-Aldrich, FAK100) 및 SiR 액틴 키트(Cytoskeleton inc, CY-SC001)를 사용하여 시각화되었다. 간단히 말해서, 세포를 4% 파라포름알데히드 용액으로 10분 동안 고정하고 PBS로 부드럽게 세척했다. 세포를 0.5% Triton-X 용액으로 투과시키고 항-빈쿨린 항체 및 F-액틴 염색을 위한 SiR 염료와 함께 인큐베이션하였다. PBS로 세척한 후 Alexa 488 염료(BioActs, RSA1145) 및 Hoechst 33 342(Thermo Fisher Scientific, 62 249)가 있는 염소-항-마우스 IgG 2차 항체를 빈쿨린 및 핵의 형광 영상화에 사용했다. 병행하여 Dnase X의 면역염색은 제조사의 지시에 따라 anti-Dnase X 항체(Abnova, H00001774-M02)를 사용하여 수행하였다.
엣지 파열은 Ttol > 100pN에서 발견되지 않았으며, 이는 세포가 세포 주변에서 성숙한 FA를 통해 54에서 >100pN 범위의 인테그린 장력을 적용할 수 있음을 나타냈다(도 8, 도 7a ~ 도 7c). 40pN보다 높은 Ttol의 ATN-TGT 표면에서 세포 복부(ventral) 위치의 표면에서 반점 파열이 발견되었다(도 8 의 b, 도 9). 벤트럴 파열(ventral rupture)는 비침습성 세포(MCF7)에서도 관찰되었지만 파열의 크기와 빈도는 크게 감소했다(도 10). 대조적으로, 비암성 MCF10A 세포의 부착 동안 벤트럴 파열은 관찰되지 않았다. 또한, 벤트럴 파열된 영역에서 신호 손실의 정량화는 세포의 침습성과 α5β1 인테그린 장력 수준이 ATN-TGT 파열을 강화한다는 것을 보여주었다(도 11 의 e). 유세포 분석에 의해 확인된 전이성 암세포에서 α5β1 인테그린의 현저하게 높은 발현 수준과 αvβ3 인테그린의 극적으로 낮은 발현과 관련하여(도 12), MDA-MB-231 세포에서 발견되는 독특한 벤트럴 파열 패턴은 αvβ3 인테그린 대비 상당히 높은 비율의 α5β1 인테그린 및 장력에 의한 기계적 활성화 상태 각각에 의해 유래할 수 있다.
유세포 분석은, 유세포 분석기(Gallios, Beckman Coulter)를 사용하여 인간 유방 세포주 표면의 αvβ3 및 α5β1 인테그린의 발현 수준을 분석하였다. 각 세포주는 위에서 설명한 대로 배양 디쉬에서 수확하고 세포 수를 200 μL의 얼음처럼 차가운 FACS 완충액(인산염 완충 식염수(PBS) 중 1% BSA 및 0.1% 아지드화나트륨)에서 105 개 세포로 조정했다. 세포는 항-α5β1 항체-FITC(SinoBiological, CT014-MM05-F) 또는 1차 항-αvβ3 항체(BD Pharmingen, 555 504)와 Alexa 488로 태그가 지정된 이차 항체(Thermo Fisher Scientific, A-11001). 모든 표적 인테그린 분자의 염색에 과도한 항체를 사용했다. 세포를 각 염색 단계에서 3회 세척하고 유세포 분석 측정을 위해 200μL의 얼음처럼 차가운 FACS 완충액에 재현탁했다. 히스토그램 프로파일 및 평균 형광 신호 값은 번들 소프트웨어 CytExpert(Beckman Coulter)를 사용하여 분석되었다.
파열 형성과 인테그린 유형 사이의 연관성을 확인하기 위해 RGD-TGT 및 ATN-TGT 세트를 사용하여 다중 TGT 분석을 수행했다. Ttol = 54pN의 경우 엣지 파열(edge rupture)는 RGD-TGT 영상 채널에서만 발견된 반면 벤트럴 파열(ventral rupture)는 두 채널에서 모두 발견되었다. Ttol = 43pN의 경우 전체 파열만 기록되었다(도 11 의 f). 본 발명자들은 벤트럴 파열이 α5β1 인테그린 장력의 산물이라고 가정하고, 항 α5β1 인테그린 항체로 α5β1 인테그린을 차단하거나 항 αvβ3 인테그린 항체로 αvβ3 인테그린을 차단한 후 다중 TGT 분석을 수행했다. 놀랍게도, 벤트럴 파열은 α5β1 인테그린 매개 접착이 방해받았을 때 더 이상 관찰되지 않은 반면, 벤트럴 파열은 αvβ3 인테그린 매개 접착만 중단되었을 때 여전히 발견되었다(도 11 의 g). 종합하면, 이러한 일련의 TGT 분석은 벤트럴 파열의 형성이 암세포의 α5β1 인테그린에 적용된 강력한 인테그린 장력의 결과임을 입증했다(도 13, 도 14).
침입촉수 물리력에 기인하는 벤트럴 파열
본 발명자들은 점상 벤트럴 파열(ventral rupture)가 침입촉수 전구체 단백질의 국소화와 세포 부착의 초기 단계에서 벤트럴 파열 형성을 모니터링하여 침입촉수와 연관되었는지 여부를 평가했다(도 15 ~ 도 18).
타임랩스 이미징을 수행하기 전에 먼저 ATN-qTGT(ATN-quenched TGT)를 개발했다. 소광제와 형광 염료를 사용하여 qTGT는 TGT가 힘에 의해 해리될 때 형광 신호를 방출하도록 설계되었으며, 이에 따라 본 발명자들이 침입촉수의 기계적 활동의 시간적 역학을 모니터링하는데 도움이 되었다. 또한 1) Fasin-mEmerald, 2) MyoX-EGFP 또는 3) Cortactin-GFP 중 하나를 포함하는 형광성 단백질로 태깅된 침입촉수 관련 단백질을 일시적으로 발현하는 MDA-MB-231 세포주를 준비했다. ATN-qTGT 및 조작된 세포주를 사용하여 54 pN보다 높은 α5β1 인테그린 장력의 동적 이력이 침입촉수가 생성됨에 따라 기록되었다.
구체적으로, 제조사의 지시에 따라 형질감염 시약(Lipofectamine 3000, Invitrogen, L300015)을 사용하여 Fascin, MyoX, Cortactin, β1 integrin, β3 또는 Lifeact를 암호화하는 플라스미드로 세포를 형질감염시켰다. 연구에 사용된 모든 플라스미드는 Addgene에서 구입했다 (α5 인테그린-GFP(#15 238), β1 인테그린-Cherry 플라스미드(#55 064), β3 인테그린-YFP 플라스미드(#26 653), Fascin-mEmerald 플라스미드(#54 094), MyoX-8#E47GFP, GFP-코르택틴(#26 722) 및 Lifeact-mNeoGreen(#98 877)). 항체 블로킹은 세포를 항-α5β1 항체(Sigma-Aldrich, MAB1969) 또는 항-αvβ3 항체(BD Pharmingen, 555 504)와 30분 동안 배양하여 수행하였다. 세포를 PBS로 두 번 헹군 다음 TGT 표면에 접종했다.
TGT 파열은 침입촉수 마커가 나타난 후 몇 분 후에 시작되어 결과적으로 마커와 공동 국소화되었다(도 16, 도 17). 이러한 결과는 조립된 침입촉수 구조에 의해 강한 α5β1 인테그린 장력이 벤트럴 파열을 유발하였다고 해석할 수 있었다.
또한, 파신 억제제(Fascin inhibitor) 또는 GM6001(MMP inhibitor)을 처리한 세포를 사용하여 ATN-TGT 파열의 형성을 추가로 분석하였다. 각각의 약물은 침입촉수 형성을 각각 방지하고 성숙한 침입촉수에서 방출된 MMP의 활성을 방해하는 데 사용되었다.
구체적으로, 모든 억제제를 70% 세포 컨플루언시(cell confluency)로 각 세포 배양 디쉬에 첨가했다. TGT 분석 전 12시간 동안 세포의 파신 또는 매트릭스 메탈로프로테아제(MMP)의 억제를 위해, 희석된 파신 억제제(Fascin-G2 억제제, Xcessbio, M60269-2S; 10 × 10-6 M) 또는 광범위 MMP 억제제(GM6001, Sigma Aldrich, 444 250; 10 × 10-6 M)를 사전 배양에 사용했다.
그 결과, ATN-TGT 파열의 수는 침입촉수 형성이 제한되었을 때 극적으로 감소한 반면(도 18 의 f), MMP만 방해되었을 때 ATN-TGT 파열의 중요한 변화는 감지되지 않았다(도 18 의 g). 이는 벤트럴 파열이 MMP 활성에 의한 것이 아니라 α5β1 인테그린을 통해 매개되는 침입촉수 힘에 의해 유발되었음을 입증했다.
액틴 중합 및 수축에 의해 조절되는 침입촉수 장력
액틴 필라멘트는 기계적 지지와 힘의 전달을 제공하는 다양한 세포내 구조의 네트워크를 형성하기 때문에, 본 발명자들은 액틴이 침입족에서 힘의 형성과 전달을 매개할 수 있다고 추측했다. 침입촉수에서 확립된 액틴 스트레스 섬유가 침입촉수 물리력에 미치는 기계적 영향을 조사하기 위해 Y27632(Rho-associated protein kinase [ROCK] inhibitor) 또는 블레비스타틴(미오신 II 억제제, 도 19a)로 처리된 MDA-MB-231 세포에서 ATN-TGT 파열을 조사했다.
구체적으로, 모든 억제제를 70% 세포 컨플루언시(cell confluency)로 각 세포 배양 디쉬에 첨가했다. ROCK 또는 비근육 미오신 II의 억제를 위해, 순수 배양 배지에 희석된 ROCK 억제제(Y27632, Thermo Fisher Scientific, A60198; 10 × 10-6 M) 또는 비근육 미오신 II 억제제(Blebbistatin, Abcam, ab120425; 50 × 10-6 M)를 배양 디쉬에 첨가하고 TGT 분석 전 2시간 동안 인큐베이션하였다.
실험은 α5β1 인테그린 장력이 높을수록 세포당 더 큰 총 파열 면적을 초래하는 것으로 나타났으며, 이는 아마도 침입촉수의 향상된 성숙으로 인한 것으로 추정된다(도 19b). 이 경향은 α5β1 인테그린에 적용된 장력이 >54pN일 때 더욱 두드러졌다. Y27632 및 blebbistatin으로 처리된 세포 그룹에서 α5β1 인테그린 장력의 크기에 관계없이 파열의 형성이 급격히 감소했다(도 4b-d). 대조 실험의 결과는 비슷했지만 다른 이유 때문이었다. ROCK 억제제에 의한 액틴 중합의 교란은 침입촉수 형성 및 성숙을 방해했다. 그러나 미오신 II의 억제는 침입촉수 형성을 방해하지 않고 액토미오신(actomyosin)에 의해 생성된 수축을 방지했다. 액틴 중합 및 동적 수축의 제한적인 발달은 침입촉수에 단단한 액틴이 풍부한 돌출 구조의 형성 실패 및 진동 방식으로 성숙한 침입촉수에 의한 기계적 힘의 적용을 초래할 수 있다. 따라서 α5β1 인테그린-ATN 리간드 결합에 전달되는 기계적 힘은 ATN-TGT를 파괴하기에 충분하지 않을 수 있다.
43pN 표면에서 훨씬 더 낮은 파열 백분율과 더 높은 Ttol을 갖는 표면에서 강화된 파열 백분율이 [도 8], [도 10], [도 11], [도 19a] 및 [도 19b] 에 나타난 사실을 감안할 때, 억제제를 사용한 ATN-TGT 분석 결과는 또한 침입촉수 형성 및 성숙이 실제로 작용과 반응의 단순한 원리에 의한 과정으로 mechano-sensitive하다는 것을 의미하였다. 침입촉수 구조가 성장함에 따라 고정된 ATN-TGT에 대한 액틴 역학의 결과로 더 강한 진동력을 발휘할 수 있다. 따라서 피크 α5β1 인테그린 장력이 낮은 경우 미성숙한 침입촉수 구조가 생성될 수 있는 반면 성숙한 침입촉수는 강한 ATNTGT 표면에서 생성되어 심각한 파열이 발생했다.
종합하면, 상기 결과는 침입촉수 물리력이 액토미오신 장치에 작용하는 장력이며 기계적 힘의 발휘가 α5β1 인테그린-리간드 복합체를 통해 전달된다는 것을 보여주었다.
α5β1 인테그린 및 침입촉수 유발 파열 형성의 역학
침입촉수 장력 유발 파열에서 α5β1 인테그린의 역할에 대한 시공간적 세부 사항을 해결하기 위해 GFP로 태그가 지정된 α5 또는 β1 인테그린을 발현하는 MDA-MB-231 세포를 Ttol = 54 pN 또는 ATNTGT가 있는 ATN-qTGT 표면에 로딩했다. Ttol > 100 pN, 그리고 세포-기질 계면에서 각 인테그린의 위치 변화 및 축적된 TGT 파열은 내부 전반사 형광(TIRF) 현미경을 사용하여 1시간 동안 기록되었다(도 20a, 도 20b).
구체적으로, 고정된 세포의 DIC(Differential Interference Contrast) 영상과 TGT 파열 패턴 및 표적 단백질의 형광 영상을 형광현미경(Nikon Ti-2, Nikon Inc.)으로 촬영하였다. 세포 이미징을 위해 10X 대물렌즈(CFI Plan Fluor) 및 60X 대물렌즈(CFI Plan Apochromat Lambda 60X)가 사용되었으며 모든 이미지는 전자 증배 전하 결합 장치(EMCCD, Andor iXon Life 888)로 기록되었다. 살아있는 세포 이미징을 위해 스테이지 상단 챔버(Oko lab)를 사용하여 세포 배양에 필요한 최적의 온도와 CO2 농도를 유지했다. 내부 전반사 형광(TIRF) 현미경(H-TIRF 모듈 및 60x TIRF 대물렌즈가 있는 Nikon Ti-2)을 사용하여 세포-기질 계면에서 형광 분자를 모니터링했다. 또한 공초점 현미경(FV3000, Olympus)과 현미경 생세포 이미징 챔버(LCI bio)를 공초점 이미징에 활용했다.
세포 형태 인자의 정량화는, ImageJ 소프트웨어(National Institutes of Health)를 사용하여 원형도, 종횡비 및 개별 세포의 투영 면적을 포함한 형상 요인을 측정했다. 각 형상 인자는 DIC 이미지에 수동으로 셀 경계를 그린 후 계산되었다.
TGT 파열의 정량화는, 단일 부착 세포 아래의 형광 신호 손실로 표시된 TGT 파열은 ImageJ를 사용하여 분석되었다. 먼저 각 TGT 파열 패턴의 면적을 정의하고 파열 부위(MFcell)의 평균 형광 강도와 단일 세포 아래의 전체 파열 면적을 측정했다. 또한, 각 세포의 외부 영역에서 평균 형광 강도를 측정하였다(MFsurface). 두 개의 측정된 형광 강도와 TGT 코팅(MFbackground) 외부 영역의 형광 강도를 비교하여 하기 [수학식 1]로 파열 백분율을 계산했다(MF: 평균 형광 강도).
[수학식 1]
파열 백분율(Rupture percentage, %)=(MFsurface - MFcell) / (MFsurface-MFbackground) (1)
ATN-qTGT 표면에서 세포는 α5β1 인테그린을 통해 부착되었지만 시간이 지남에 따라 퍼지지 않았다. β1 인테그린은 세포의 복부(ventral) 위치의 표면에서 발견되었고(도 20a 의 a), β1 인테그린이 ATN-qTGT 표면에 결합한 후 몇 분 후에 β1 인테그린 영역에서 TGT 파열 신호가 감지되었다(도 20a 의 b). 이 결과는 β1 인테그린이 TGT 파열과 강하게 연관되어 있음을 암시했다. 또한, 세포가 Ttol > 100pN에서 ATN-TGT 표면에 부착되었을 때 유사한 파열 패턴이 발견되었다. α5β1 인테그린 매개 세포 부착 동안 α5 인테그린의 위치에서 벤트럴 파열(ventral rupture)가 몇 분 간격으로 발견되었고 ATN-TGT 신호 손실이 시간이 지남에 따라 강화되었다(도 20b). α5 인테그린 소단위는 β1 인테그린 소단위와만 이종이량체를 형성하기 때문에 α5 인테그린의 추적은 α5β1 인테그린의 위치와 기능을 예측하는데 더 관련이 있다는 점에 유의해야 한다. 사실에 기초하여, 본 발명의 TGT 결과는 α5β1 인테그린을 통한 접착 후 100pN보다 큰 강한 힘이 발생한다고 해석될 수 있으며, 아마도 [도 15], [도 16], [도 18], [도 19a] 및 [도 19b]에 설명된 바와 같이 조립된 침입촉수에 의해 가해지는 위쪽의 침입촉수 힘과 수축성일 것이다.
종합하면, α5 및 β1 인테그린과 TGT 파열의 위치에 대한 시공간 분석은 α5β1 인테그린의 활성화가 침입촉수 형성 및 결과적으로 침입촉수 힘의 발휘에 중요한 역할을 한다는 것을 보여준다.
[통계 분석]
셀의 수(n)와 반복은 각 도 캡션에 표시되었다. Graphpad Prism(Graphpad 소프트웨어)을 사용하여 표준 오차 및 기타 통계 분석을 사용한 평균값을 얻었다. 유의성을 추정하기 위해 쌍을 이루지 않은 t-검정을 수행했다. p-값은 도면에 표시되었다. ***p < 0.001, **p < 0.01, *p < 0.05.
Claims (11)
- 이중가닥의 핵산을 포함하는 단분자력 센서(single molecule force sensor)로써,
i) 상기 이중가닥 중 일 가닥에 ATN 리간드 및 형광염료가 부착되어 있고, 다른 상보적인 가닥에 표면결합물질이 부착되어 있거나,
ii) 상기 이중가닥 중 일 가닥에 ATN 리간드 및 표면결합물질이 부착되어 있고, 다른 상보적인 가닥에 형광물질이 부착되어 있는 센서.
- 제1항에 있어서, 상기 센서의 ATN 리간드가 암 세포의 α5β1 인테그린과 결합하는 것을 특징으로 하는 센서.
- 제1항에 있어서, 상기 센서는 40 pN 이상 ~ 200 pN 이하 장력에서 이중가닥이 단일 가닥으로 분리되는 것을 특징으로 하는 단분자력 센서.
- 제1항의 센서를 포함하는 침습성 및/또는 전이성 암 진단용 조성물.
- 제1항의 센서를 포함하는 침습성 및/또는 전이성 암 모니터링용 조성물.
- 제1항의 센서를 포함하는 침습성 및/또는 전이성 암 예후 예측용 조성물.
- i) 제1항의 센서가 고정된 플레이트에 개체로부터 분리된 시료를 로딩하여 상기 센서와 상기 시료를 결합시키는 단계;
ii) 상기 결합된 센서와 시료를 방치하는 단계; 및
iii) 상기 센서가 파열(rupture)된 형태를 이미징하는 단계;
를 포함하는 침습성 및/또는 전이성 암 진단을 위한 정보제공 방법.
- 제7항에 있어서, 상기 단계 i)의 플레이트는 칩(chip) 또는 디쉬(dish) 인 것을 특징으로 하는 정보제공 방법.
- 제7항에 있어서, 상기 정보제공 방법은
iv) 상기 이미징 결과가 벤트럴 파열(ventral rupture) 패턴인 경우 침습성 및/또는 전이성 암으로 분류하는 단계;
를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 정보제공 방법.
- i) 제1항의 센서가 고정된 플레이트에 개체로부터 분리된 시료를 로딩하여 상기 센서와 상기 시료를 결합시키는 단계;
ii) 상기 결합된 센서와 시료를 방치하는 단계; 및
iii) 상기 센서가 파열(rupture)된 형태를 이미징하는 단계;
를 포함하는 침습성 및/또는 전이성 암 모니터링 방법.
- i) 제1항의 센서가 고정된 플레이트에 개체로부터 분리된 시료를 로딩하여 상기 센서와 상기 시료를 결합시키는 단계;
ii) 상기 결합된 센서와 시료를 방치하는 단계; 및
iii) 상기 센서가 파열(rupture)된 형태를 이미징하는 단계;
를 포함하는 침습성 및/또는 전이성 암 예후 예측 방법.
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|---|---|---|---|
| KR1020220110175A KR20240032223A (ko) | 2022-08-31 | 2022-08-31 | 전이암 세포에 특이적으로 결합하는 단분자력 센서 및 이것의 용도 |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20160083828A (ko) | 2016-06-27 | 2016-07-12 | 재단법인 의약바이오컨버젼스연구단 | ３차원 콜라겐 겔 환경 내에서 배양된 세포를 이용한 암 세포의 전이성 모니터링 방법 |
-
2022
- 2022-08-31 KR KR1020220110175A patent/KR20240032223A/ko not_active Application Discontinuation
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