KR20130003268A

KR20130003268A - 천마 추출물로부터 분리된 바닐리 알코올 화합물을 유효성분으로 함유하는 퇴행성 신경질환 예방 및 치료용 조성물

Info

Publication number: KR20130003268A
Application number: KR1020110064474A
Authority: KR
Inventors: 김인수; 최동국; 정헌종
Original assignee: 건국대학교 산학협력단
Priority date: 2011-06-30
Filing date: 2011-06-30
Publication date: 2013-01-09

Abstract

본 발명은 천마 추출물로부터 분리된 바닐리 알코올 화합물을 유효성분으로 함유하는 퇴행성 신경질환 예방 및 치료용 조성물에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 천마(Gastrodia elata Blume) 추출물로부터 분리된 바닐리 알코올(vanillyl alcohol) 화합물은 도파민계 신경세포인 MN9D 세포에서 세포독성을 저해하고, 세포 생존능력을 향상시키는 효과를 나타내어 약제학적으로 제형이 용이하므로 이를 유효성분으로 함유하는 알츠하이머, 파킨슨병, 뇌졸중 및 다발성 경화증 등의 퇴행성 신경질환의 예방 및 치료용 조성물에 관한 것이다.

Description

천마 추출물로부터 분리된 바닐리 알코올 화합물을 유효성분으로 함유하는 퇴행성 신경질환 예방 및 치료용 조성물{Pharmaceutical composition and functional food for preventing or treating neurodegenerative disease by Gastrodia elata Blume extracts and vanillyl alcohol as effective component}

본 발명은 천마 추출물로부터 분리된 바닐리 알코올 화합물을 유효성분으로 함유하는 퇴행성 신경질환 예방 및 치료용 조성물에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 천마(Gastrodia elata Blume) 추출물로부터 분리된 바닐리 알코올(vanillyl alcohol) 화합물은 도파민계 신경세포인 MN9D 세포에서 세포독성을 저해하고, 세포 생존능력을 향상시키는 효과를 나타내어 약제학적으로 제형이 용이하므로 이를 유효성분으로 함유하는 알츠하이머, 파킨슨병, 뇌졸중 및 다발성 경화증 등의 퇴행성 신경질환의 예방 및 치료용 조성물에 관한 것이다.

파킨슨병은 가장 일반적인 신경퇴화질환 중 하나이다. 발병률은 연령, 성별, 인종에 따라 차이가 있지만 65세 이상 인구의 약 2%가 이 질병에 의해 영향을 받는다고 조사되고 있다.(Dick et al., Occup. Med. (Lond), 57, 50-56, 2007; Dorsey et al., Neurology, 68, 384-386, 2007; Elbaz et al., J. Clin. Epidemiol.,55, 25-31, 2002)

파킨슨병의 병리학적인 특징은 뇌의 흑질의 도파민작동성 뉴런의 손실과 선조체에서 도파민의 차후손실이다. 또한, 산화적 스트레스와 세포사 연쇄반응의 활성화가 파킨슨병과 관련된 신경퇴화에서 중심이 되는 역할을 하는 것으로 지지되는 증거가 늘어나고 있다. (Mattson M.P., Nat.Rev.Mol.Cell.Biol.,1, 120-129, 2000; Pieczenik S.R. and Neustadt J., Exp.Mol.Pathol.,83, 84-92, 2007; Szeto H.H. AAPSJ.,8, E521-E531, 2006)

따라서, 세포 내 반응산소종의 조절과 세포사 연쇄반응의 변이로 도파민으로 활성화되는 세포의 세포사의 억제는 신경퇴화의 진행을 경감시키는 치료효과를 나타낼 수 있다.

파킨슨병의 발명에 대한 이해는 MPTP의 활성 대사산물이며 신경독성물질인 MPP+를 실험적으로 사용하여 이루었다. MPP+는 미토콘드리아의 전자전달계 복합체 Ⅰ을 선택적이고 강력하게 억제하고, 파킨슨병의 세포, 동물 모델에서 파킨슨병과 매우 유사한 증상을 유도한다.

천마(Gastrodia elata Blume, GE)는 아시아에서 고대부터 수많은 치료적 적용과 전통 한방 의약품으로 사용되었다. 천마는 어지럼증, 일반적인 마비, 간질 그리고 파상풍에 효과적으로 항경련제, 진통제와 진정제로 사용되어지며, 천마 추출물은 amyloid b-peptide가 존재함으로써 뉴런의 보호작용을 하며 이것은 도파민의 농도를 증가시키는 것과 연관되었고, 선조체에서 도파민의 회전율을 감소시킨다.

또한, 천마는 글루탄산염으로 유도된 뉴런의 세포사를 억제하고 카이나이트에 의해 유도된 발작에서 신경손상을 억제, SH-SY5Y 세포에서 MPP+로 유도된 신경독성을 억제, 그리고 일시적인 뇌의 국소빈혈 후 신경세포손상을 보호한다.

천마의 주요 구성요소는 바닐리 알코올(vanillyl alcohol), 페놀 화합물, 유기산, 포도당, 베타-시토스테롤(beta-sitosterol), 하이드록시벤질 알코올(hydroxybenzyl alcohol), vaniiln(바닐린), 게스트로딘(gastrodin) 및 히드록시벤즈알데히드(hydroxybenzaldehyde)이다.

따라서, 본 발명자들은 천연물을 이용한 퇴행성 신경 질환 예방 및 치료용 조성물을 개발하기 위하여 노력해온 결과, 천마를 이용하여 얻은 추출물과 이로부터 분리한 바닐리 알코올을 이용하여 도파민계 신경세포인 MN9D에서 MPP+에 의하여 유도된 세포사 관련 인자들의 생산물, 유전자 및 단백질의 발현에 관련한 분자 생화학적 실험 분석법을 바탕으로 퇴행성 신경질환에 효능이 있음을 확인하고 본 발명을 성공적으로 완성하였다.

본 발명의 목적은, 천마 추출물로부터 분리된 바닐리 알코올을 유효성분으로 함유하는 퇴행성 신경질환 예방 및 치료용 조성물을 제공함에 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 천마 추출물로부터 분리된 하기 화학식 1로 표시되는 바닐리 알코올을 유효성분으로 함유하는 퇴행성 신경질환 예방 및 치료용 조성물을 제공한다.

상기 천마 추출물은 물 및 에탄올, 메탄올과 같은 탄소수 1 내지 4의 저급알코올 또는 이들의 혼합용매로부터 가용한 추출물을 포함한다.

또한 상기 유기용매 가용 추출물은 아세톤, 디에틸에테르, 에틸아세테이트, 클로로포름, 디클로로메탄 또는 이들의 혼합용매로부터 가용한 추출물을 포함한다.

상기 퇴행성 신경질환은 알츠하이머, 파킨슨병, 뇌졸중 및 다발성 경화증임을 특징으로 한다.

상기와 같은 본 발명에 따르면, 천마 추출물로부터 분리된 바닐리 알코올 화합물은 도파민계 신경세포인 MN9D 세포에서 세포독성을 저해하고, 세포 생존능력을 향상시키는 효과를 가짐으로서, 천마 추출물로부터 분리된 바닐리 알코올 화합물을 유효성분으로 함유하는 알츠하이머, 파킨슨병, 뇌졸중 및 다발성 경화증 등의 퇴행성 신경질환의 예방 및 치료용 조성물로 이용될 수 있다.

도 1은 도파민계 신경세포 MN9D에서 MPP+에 의한 신경세포사에 대한 천마의 항신경세포사 효능 분석에 관한 것이다.
도 2은 MPP+에 의한 신경세포사에서 바닐리 알코올에 의한 세포생존능 분석에 관한 것이다.
도 3은 유세포측정기를 이용한 MPP+에 의한 신경세포사에서 바닐리 알코올에 의한 DNA 함량 변화 분석에 관한 것이다.
도 4은 바닐리 알코올의 DPPH라디칼 및 알킬라디칼 소거능 분석에 관한 것이다.
도 5은 바닐리 알코올에 의해 MPP+에 의한 신경세포사에서 발현되는 Bax, Bcl-2 유전자의 발현억제 분석에 관한 것이다.
도 6은 바닐리알콜에 의해 MPP+에 의한 신경세포사에서 발현되는 PARP 단백질 가수분해 억제 분석에 관한 것이다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

먼저, 본 발명의 천마 추출물을 수득하는 방법을 설명하면, 본 발명의 천마 추출물은 천마 시료 중량의 약 1 내지 10배 부피의, 바람직하게는 약 1 내지 5배 부피의 물, 탄소수 1~4의 저급 알코올 또는 이들의 혼합용매, 바람직하게는 알코올을 첨가하여 냉침추출, 열수추출, 초음파추출, 환류냉각추출등의 추출방법으로, 바람직하게는 음파추출방법으로 추출한 후 여과하고, 여과한 추출물은 20 내지 100℃, 바람직하게는 30 내지 70℃에서 진공농축하여 수득할 수 있다.

또한, 상기 조추출물을 증류수에 현탁한 후, 디에틸에테르를 가하여 혼합한 후, 3 내지 6차례 분획하여 수가용성 분획물 및 디에틸에테르 가용성 분획물을 얻은 후, 디에틸에테르 가용성 분획물을 건조하여 본 발명의 천마 유기용매 가용 추출물을 수득할 수 있다.

상기 천마 유기용매 가용 추출물을 전개용매로서 헥산: 에틸아세테이트의 100 : 1의 혼합용매를 사용하고, 고정상으로는 실리카겔 60(Silica gel 60, 70-230 mesh)을 사용하여, 실리카겔 칼럼 크로마토그래피를 수행하여 하부 분획물로 나눈 후, 분획물을 전개용매로서 헥산 : 디클로로메탄의 3:1의 혼합용매를 사용하여 실리카겔 칼럼 크로마토그래피를 수행하여, 본 발명의 바닐리 알코올 화합물을 수득할 수 있다.

본 발명은 상기 제조방법으로 수득된 추출물로부터 분리된 바닐리 알코올 화합물을 유효성분으로 함유하는 퇴행성 신경질환의 예방 및 치료를 위한 약학조성물을 제공한다.

본 발명의 천마로부터 분리된 바닐리 알코올 화합물은 당해 기술 분야에서 통상적인 방법에 따라 약학적으로 허용 가능한 염 및 용매화물로 제조될 수 있다.

본 발명의 퇴행성 신경질환 예방 및 치료용 조성물은 조성물 총 중량에 대하여 천마 추출물로부터 분리된 바닐리 알코올 화합물을 0.1 내지 50중량%로 포함한다.

본 발명의 천마 추출물로부터 분리된 바닐리 알코올 화합물을 포함하는 약학 조성물은 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다.

본 발명의 천마 추출물로부터 분리된 바닐리 알코올 화합물의 약학적 투여 형태는 이들의 약학적 허용 가능한 염의 형태로도 사용될 수 있고, 또한 단독으로 또는 타 약학적 활성 화합물과 결합 뿐만 아니라 적당한 집합으로 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 천마 추출물로부터 분리된 바닐리 알코올 화합물을 유효성분으로 함유하는 약학조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있으며, 화합물을 포함하는 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 중량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 추출물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌 글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 천마 추출물로부터 분리된 바닐리 알코올 화합물의 바람직하나 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 그러나 바람직한 효과를 위해서, 본 발명의 추출물로부터 분리된 바닐리 알코올 화합물은 1일 0.0001 내지 100mg/kg으로, 바람직하게는 0.001 내지 10mg/kg으로 투여하는 것이 좋다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

본 발명의 약학 조성물은 쥐, 생쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁 내 경막 또는 뇌혈관 내(intracerebroventricular) 주사에 의해 투여될 수 있다.

본 발명은 또한, 바닐리 알코올 화합물을 유효성분으로 함유하는 퇴행성 신경질환의 예방 및 개선을 위한 건강기능식품을 제공한다.

본 발명의 건강기능식품은 바닐리 알코올 화합물 이외에 식품학적으로 허용 가능한 식품 보조 첨가제를 더 포함할 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있으며, 유효성분의 혼합양은 그의 사용목적, 예를 들면, 예방, 건강 또는 치료적 처치에 따라 적합하게 결정될 수 있다.

상기 건강기능식품에 포함되는 바닐리 알코올 화합물의 유효량은 상기 약학 조성물의 유효량에 준해서 사용할 수 있으나, 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간 섭취의 경우에는 상기 범위 이하일 수 있으며, 유효성분은 안정성 면에서는 아무런 문제가 없기 때문에 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있음은 확실하다.

또한, 상기 건강기능식품의 종류에는 특별한 제한이 없고, 예를 들면, 육류, 소시지, 빵, 쵸콜렛, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알코올음료 및 비타민 복합제, 건강 기능성 식품류 등을 들 수 있다.

또한, 퇴행성 신경질환의 예방 효과를 목적으로 식품 또는 음료에 첨가될 수 있다. 이때, 식품 또는 음료 중의 상기 바닐리 알코올 화합물의 양은 전체 식품 중량의 0.01~30중량%, 바람직하게는 0.3~15중량%로 가할 수 있으며, 건강음료조성물은 100㎖를 기준으로 0.01~5g, 바람직하게는 0.03~1g의 비율로 가할 수 있다.

본 발명의 건강기능식품은 퇴행성 신경질환의 예방 및 개선을 위한 목적으로 정제, 캅셀, 분말, 과립, 액상, 환 등의 형태인 건강기능식품으로 제조 및 가공이 가능하다.

본 발명의 건강 기능성 음료 조성물은 지시된 비율로 필수 성분으로 상기 바닐리 알코올 화합물을 함유하는 외에는 다른 성분에는 특별한 제한이 없으며 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 더 포함할 수 있다. 이때, 상기 천연 탄수화물은 예를 들어, 포도당, 과당 등의 모노사카라이드; 말토오스, 수크로오스 등의 디사카라이드; 및 덱스트린, 시클로덱스트린 등의 폴리사카라이드 등과 같은 통상적인 당, 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알코올 등이 있다. 또한, 향미제로는 천연 향미제(타우마틴, 스테비아 추출물, 예를 들어, 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율을 본 발명의 조성물 100 ㎖당 일반적으로 약 1 내지 20g, 바람직하게는 약 5 내지 12g이다.

상기 외에 본 발명의 바닐리 알코올 화합물은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 증진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그밖에 본 발명의 바닐리 알코올 화합물은 천연 과일 주스 및 과일 주스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있으며, 이러한 성분을 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 또한, 상기 첨가제의 비율은 그렇게 중요하진 않지만 본 발명의 바닐리 알코올 화합물 100중량부 당 0.1 내지 약 20중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예 1. 바닐리 알코올 화합물의 제조

본 발명에 따른 바닐리 알코올 화합물을 제조하기 위하여, 천마로부터 하기와 같이 바닐리 알코올 화합물을 제조하였다.

1-1. 천마 조추출물의 제조

본 발명에 따른 천마 추출물은 천마시료 40g을 가속화용매추출기(ASE300, DIONEX Corporation, USA)로 에탄올 200ml을 첨가하여 추출한 후 여과하고, 여과한 추출물은 50℃에서 1500psi 압력으로 진공농축 20분간 하여 수득하였다. 또한, 당성분이 많은 천마뿌리는 시료 100g을 초음파분쇄기(Ultrasonic cleaner, BRANSON Ultrasonics corporation, USA)로 파쇄하여 에탄올 1L을 첨가 한 후 50℃에서 3~7일 진공농축하여 수득하였다.

1-2. 천마 유기용매 가용 추출물의 제조

상기 실시예 1-1에서 얻은 천마 에탄올 가용 추출물 1kg을 물에 현탁시키고 디에틸에테르를 가하여 혼합한 후, 2 내지 3 차례 분획하여 수가용성 분획물 및 디에틸에테르 가용성 분획물을 얻은 후, 디에틸에테르 가용성 분획물을 건조하여 디에틸에테르 가용 추출물 30g을 수득하였다.

1-3. 바닐리 알코올 화합물의 분리

상기 실시예 1-2의 디에틸에테르 가용 추출물 30g을 실리카겔 칼럼 크로마토그래피를 수행하였으며, 이 때 전기용매로서 헥산 : 에틸아세테이트의 100 : 1의 혼합용매를 사용하였고, 고정상으로는 실리카겔 60(Sillica gel 60, 70-230 mesh)을 사용하여 분획을 수행하여 하부 분획물로 나눈 후, 분획물을 전개용매로서 헥산 : 디클로로메탄의 3 : 1의 혼합용매를 사용하여 실리카겔 칼럼 크로마토그래피를 수행하여 바닐리 알코올(vanillyl alcohol) 화합물을 2g 얻었다.

실험예 1. 세포 배양

쥐 도파민계 신경세포인 MN9D 세포는 열불활성화(heat inactivation) 된 소태아혈청(fetal bovine serum) 10% 첨가된 Dulbeco's Modified Eagle's Medium(DMEM; Gibco-BRL Technologies, CA, USA) 배지에서 온도 37℃, 습도 10% CO₂, 공기 95%의 조건으로 배양하였다.

실험예 2. MN9D 세포의 생존율에 관한 천마의 효과

MPP+로 유도된 MN9D 세포에서 천마의 효과는 MTT 분석으로 확인하였다.

MTT 용액은 3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-2,5-디페닐-테트라졸리움 브로마이드(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl-tetrazolium bromide, MTT)를 PBS(phosphate buffer saline)에 5 ㎎/㎖의 농도로 충분히 잘 녹인 후 0.22 μM 필터로 여과하여 4℃에서 보관하면서 사용하였다.

상기 실시예 1의 바닐리 알코올과 25μM MPP+을 48시간 동안 반응시킨 96웰 플레이트에서 배지를 제거하고, MTT 용액 30 ㎕를 첨가하여 빛을 차단한 상태로 37℃에서 4시간 반응시켰다.

이때 살아있는 세포는 MTT와 반응하여 보라색의 포마잔(formazan)을 형성하는데, 반응이 완료되면 DMSO를 100 ㎕를 첨가하여 포마잔을 잘 녹인 다음 미량 역사 판독기(microtiter plate reader)를 이용하여 550 ㎚ 파장에서 흡광도를 측정하였다.

그 결과, 천마를 처리한 것은 최고농도인 200ug/ml의 농도까지 세포 생존에 독성을 유발하지 않았다. 그러나 48시간 동안 25μM MPP+에 노출된 MN9D세포의 세포 생존율은 50.5% ± 1.4%로 상당히 감소했다. 천마 추출물을 10, 100, 200 /mL로 전처리 한 후 4시간 뒤 MPP+를 첨가한 것은 MPP+로 유도된 세포 생존율의 감소가 51.7% ± 3.2%, 62.07% ± 2.3% and 76.3% ± 4.6% 로 농도 의존적으로 나타났다(도 1A).

또한, 천마 추출물이 MPP+로 유도된 MN9D세포에서 Bcl-2 및 Bax의 발현과 Poly (ADP-ribose) polymerase proteolysis에 영향을 확인하였다(도 1B). 천마 추출물은 농도 의존적 Bax/Bcl-2 비율과 PARP의 단백질분해의 증가를 모두 효과적으로 저해하였다(도 1C).

즉, 천마는 MN9D 세포에서 MPP+로 유도된 세포 독성에 대한 보호 효과를 나타낸다.

실험예 3. MN9D 세포의 생존율에 관한 바닐리 알코올의 효과

MPP+로 유도된 MN9D 세포에서 바닐리 알코올의 효과는 실험예 1과 동일하게 MTT 분석으로 확인하였다.

각각 1, 10, 20 의 농도로 바닐리 알코올을 전처리 한 세포에서 51.5 ± 1.4%, 57.5 ± 2.8%, 69.1 ± 3.1% 의 세포 생존력이 증가함을 보였다(도 2).

또한, MPP+로 유도된 MN9D 세포에 바닐리 알코올의 저해 효과를 확인하기 위해 세포를 propidium iodide(PI)로 표지하고 유세포분석기를 통해 정량적으로 분석하였다.

구체적으로, 천마를 4시간 동안 농도별로 전처리 후 천마와 MPP+을 함께 처리하였다. 72시간 동안 배양 후, 차가운(ice-cool) PBS로 한번 세척하고, 차가운(ice-cold) PBS 300 ㎕를 넣어 세포를 떼어낸 후 새로운 1.5 ㎖ 마이크로원심분리 튜브에 옮겼다. 4℃에서 300g로 5분 동안 원심분리하여 상등액은 버리고, 70% 에탄올(0.5% 트윈 20 in PBS)을 첨가하여 재현탁시킨 후 4℃에서 밤새 두었다.

동일한 조건으로 원심분리 후 차가운(ice-cold) PBS에 두 번 세척하고, 요오드화 프로피디움(propidium iodide(PI), 3 ㎕/㎖)과 RNase A(100 ㎕/㎖)를 포함한 차가운(ice-cold) PBS 300 ㎕에 재현탁하여 30분간 실온에서 배양한 다음 유세포측정기(Becton Dickins, San Jose, Calif)로 세포주기를 측정하였다.

세포를 배지만으로 배양한 경우, diploid DNA가 함유된 전형적인 세포핵의 single peak가 확인 되었고, 2~3% 정도의 세포사가 존재하였다. 25 MPP+를 처리한 것은 hypodiploid DNA 함량 peak가 특징이며, 이것은 sub-G0-G1의 세포사 함량을 나타낸다. 25 MPP+를 처리한 결과 세포사 함량이 37.6% ± 1.2% 였다(도 3B).

또한, 1, 10, 20 로 바닐리 알코올을 함께 처리한 것은 각각 농도 의존적으로 세포사 함량이 35.4% ± 1.9%, 27.6% ± 2.1%, 16.8% ± 2.8%로 감소하였다(도 3D-F).

실험예 4. 전자감응분광분석기를 이용한 바닐리 알코올의 활성산소소거능분석

바닐리 알코올의 DPPH radical과 알킬 radical 소거능은 전자감응분광분석기로 측정하였고, 결과는 도 4에 나타내었다.

DDPPH radical scavenging activity는 Nanjo et al.)에 기술된 방법을 사용하였다(Nanjo, F 등, Free radical biology and medicine 21; 895-902. 1996). 각기 다른 함량을 조제된 바닐라 알코올 60ul에 DPPH 60ul (60uM, in methanol solution)를 넣어준 후 10초간 섞고, 100ul 테플론 모세관에 옮겼다. 2분 후 ESR 스펙트로미터로 측정하였다.

그 결과, 다양한 농도(0.031, 0.06, 0.12, 0.25, 0.5 및 1 mg/mL)의 바닐리 알코올의 DPPH radical 소거능은 각각 38.42%, 76.08%, 77.95%, 78.16%, 80.29%, 81.10%,이었으며, IC50은 0.04 mg/mL이었다(도 4A) .

AAPH를 37℃ 30분간 incubation하면 4-POBN/free radical의 알킬 라디칼 스핀 생성물이 발생되며, 천마의 농도가 증가할수록 전자감응분광분석기의 신호는 농도 의존적으로 감소되는 것이 관찰되었다. 바닐리 알코올의 0.001, 0.003, 0.007, 0.015, 0.031 및 0.062 mg/ml 농도에서 알킬 라디칼의 소거능은 각각 25.66%, 41.25%, 53.81%, 78.88%, 83.15%, 90.72%이고, IC50은 0.006 mg/mL이었다(도 4B).

실험예 5. MPP +가 처리된 세포에서 Bcl -2와 Bax 발현에 미치는 바닐리 알코올의 효과

MPP+를 처리한 도파민계 신경세포인 MN9D 세포에서 바닐리 알코올이 Bcl-2와 Bax의 발현의 어떠한 영향을 미치는지를 조사하였다.

그 결과, 25 μm의 MPP +를 처리한 경우 상당히 뚜렷하게 Bax의 발현을 증가시키고 부수적으로 Bcl-2의 발현의 감소를 보였다. 그러나, 바닐리 알코올을 처리한 경우 대체로 Bax의 mRNA 발현이 억제되고 Bcl-2의 발현이 농도 의존적으로 복구되었다. 세포에 Bax/Bcl-2 비율은 25 μM의 MPP+를 처리한 대조군에서 보다 7배 높았고, 1, 10, 20 의 바닐리 알코올을 전처리 한 세포는 농도 의존적으로 Bax는 감소하였고 (도 5A), Bcl-2는 증가하며 Bax/Bcl-2 비가 감소함을 확인 하였다(도 5B).

실험예 6. 바닐리 알코올에 의한 MPP +로 유도된 PARP 단백 가수분해의 억제

MPP+로 유도된 MN9D 세포에서 PARP의 분해를 조사하였다.

MPP+는 대조군과 비교해서 PARP의 분해 증가를 유도하였다. 분해중인 PARP는 분해된 PARP(85 kDa)와 비교하여 다중클론항체를 이용하여 감지되었다. 25 MPP+를 처리한 세포는 PARP 분해가 251.14% ± 17.39%로 증가하였고, 바닐리 알코올을 1, 10, 20로 처리한 세포의 PARP의 분해는 246.28% ± 17.33%, 196.34% ± 26.80%, 143.24% ± 7.97%로 농도 의존적으로 감소하였다(도 6B).

바닐리 알코올의 처리는 농도에 의존적으로 MPP+로 유발된 PARP의 분해를 효과적으로 감소시키고, 이것은 PARP의 분해 활성화를 막기 위해 바닐리 알코올의 보호 효과가 하류 apoptotic 신호 경로의 억제와 관련된 것을 나타낸다.

이상, 본 발명의 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의해 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims

천마 추출물로부터 분리된 하기 화학식 1로 표시되는 바닐리 알코올을 유효성분으로 함유하는 퇴행성 신경질환 예방 및 치료용 조성물.
[화학식 1]
제 1항에 있어서,
상기 천마 추출물은 조추출물 또는 유기용매 가용 추출물임을 특징으로 하는 퇴행성 신경질환 예방 및 치료용 조성물.
제 2항에 있어서,
상기 조추출물은 정제수를 포함한 물, 탄소수 1 내지 4의 저급알코올 또는 이들의 혼합용매에 가용한 추출물을 포함함을 특징으로 하는 퇴행성 신경질환 예방 및 치료용 조성물.
제 2항에 있어서,
상기 유기용매 가용 추출물은 아세톤, 디에틸에테르, 에틸아세테이트, 클로로포름, 디클로로메탄 또는 이들의 혼합용매로부터 가용한 추출물을 포함함을 특징으로 하는 퇴행성 신경질환 예방 및 치료용 조성물.
제 1항에 있어서,
상기 퇴행성 신경질환은 알츠하이머, 파킨슨병, 뇌졸중 및 다발성 경화증으로부터 선택된 하나 이상의 질환을 포함하는 것을 특징으로 하는 퇴행성 신경질환 예방 및 치료용 조성물.
천마 추출물로부터 분리된 바닐리 알코올을 유효성분으로 함유하는 퇴행성 신경질환 예방 및 개선용 건강기능식품.
제 6항에 있어서,
상기 건강기능식품은 분말, 과립, 정제, 캡슐 또는 음료형태인 것을 특징으로 하는 퇴행성 신경질환 예방 및 개선용 건강기능식품.