KR20120140129A - 신규 엔도글루카나제 및 그의 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 엔도글루카나제, 상기 엔도글루카나제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현벡터, 상기 발현벡터가 도입된 형질전환체, 상기 형질전환체를 이용하여 상기 엔도글루카나제를 생산하는 방법 및 상기 형질전환체를 이용하여 바이오 에탄올을 생산하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 신규한 엔도글루카나제는 우수한 셀룰로오스 분해 활성을 나타내므로, 목질계 바이오매스로부터의 바이오 에탄올 제조 등의 산업공정에 널리 활용될 수 있다.

Description

신규 엔도글루카나제 및 그의 용도{Novel endoglucanase and the Use thereof}

본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 엔도글루카나제, 상기 엔도글루카나제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현벡터, 상기 발현벡터가 도입된 형질전환체, 상기 형질전환체를 이용하여 상기 엔도글루카나제를 생산하는 방법 및 상기 형질전환체를 이용하여 바이오 에탄올을 생산하는 방법에 관한 것이다.

최근 부각된 기후변화 및 에너지 위기 문제해결을 위하여 지속가능한 신재생에너지의 필요성이 대두되고 있다. 녹색연료로서 잠재적 가능성이 큰 바이오에탄올은 석유에너지에 대한 의존도를 줄이고, 지구 온난화와 같은 심각한 환경문제를 동시에 해결할 수 있는 대체 연료로서 활용되고 있다.

전세계적으로 약 800억 리터 정도의 바이오에탄올이 생산(바이오에너지 시장 분석 및 전망, 화학경제연구원, 2008)되고 있는데, 미국과 브라질이 대표적이다. 현재까지 바이오에탄올 생산은 주로 식량자원인 옥수수와 사탕수수 등에서 얻어지는 포도당을 발효시켜 얻은 알코올로서, 석유 유래의 가솔린을 부분적으로 대치함으로써 가솔린의 소비량을 줄이고, 환경오염물질의 배출량도 줄이고 있다. 이처럼 식량자원을 이용하여 생산되는 바이오에탄올을 일반적으로 1세대 바이오에탄올 연료라고 하는데, 급격한 수요증대로 인해 옥수수와 사탕수수와 같은 농작물의 가격이 폭등하고, 다른 곡물의 가격상승을 유발하여 에너지 문제의 해결을 위한 바이오에탄올이 또 다른 식량문제를 일으키는 원인이 되고 있다.

이러한 문제 때문에 2015년 이후부터는 1세대 바이오에탄올의 생산한계가 예상되며, 이에 대한 새로운 대안으로서 이른바 2세대 바이오 연료인 셀룰로오스 에탄올(cellulosic bioethanol)이 각광을 받고 있다. 셀룰로오스 에탄올이란 지구상에서 가장 풍부한 유기물인 식물 세포벽 주요 구성 물질인 셀룰로오스를 분해하여 포도당을 만들고, 이로부터 에탄올을 만드는 것이다. 따라서, 2세대 셀룰로오스 에탄올은 현재 옥수수 녹말을 발효시켜 에탄올을 뽑아내는 1세대 방법과는 달리, 방치되거나 태워버렸던 옥수수의 잎, 줄기, 뿌리 등 모든 조직을 사용해서 바이오에탄올을 생산하는 방법이다. 이 방법은 옥수수 껍질, 쌀겨, 목초, 갈대, 억새, 목재 폐기물 등 모든 식물의 조직으로부터 바이오에탄올을 생산할 수 있게 된다.

녹말로부터 에탄올을 생산하는 과정과 비교하여 셀룰로오스로부터 에탄올을 생산하는 과정의 큰 차이점은, 식물 세포벽의 주요 구성물질인 셀룰로오스를 셀룰라제(cellulase)라는 효소를 이용하여 가수분해하여 포도당을 생산하는 당화 과정이다. 그러나, 식물세포벽의 셀룰로오스는 쉽게 분해되지 않는 안정된 구조로 결합된 고분자 물질일 뿐 아니라 리그닌(lignin), 헤미셀룰로오스(hemicellulose), 펙틴(pectin) 등 다른 고분자들과 함께 결합된 복합 물질을 이루고 있기 때문에 이를 분해하기 위해서는 여러 가지 공정이 필요하다. 셀룰로오스로부터 바이오에탄올을 생산하는데 필요한 첫 번째 공정은 전처리(pretreatment) 공정으로 식물의 세포벽을 물리적, 화학적, 또는 생물학적 처리를 가하여 식물 자원으로부터 셀룰로오스 섬유소를 분리하는 공정이다. 두 번째 공정은 당화(saccharification) 공정이며 이는 분리된 셀룰로오스 섬유소를 화학적 또는 생물학적 처리를 가하여 포도당(glucose)을 생산하는 과정을 말한다.

셀룰로오스를 포도당과 같은 저분자 당으로 가수분해시키기 위해서는 셀룰라제라는 효소가 필요하며, 특히 단단한 식물의 섬유질 원료(셀룰로오스)를 효과적으로 분해하기 위해서는 활성이 높은 셀룰라제 효소가 필수적이다. 셀룰라제는 셀룰로오스를 분해하는 효소를 통칭하는 것으로 세 가지 효소로 분류할 수 있다. 셀룰로오스의 β-1,4 글리코시드 결합을 자르는 엔도글루카나제(endo-glucanase, EC 3.2.1.4), 셀룰로오스 사슬의 양 말단에 작용하여 글루코오스 이량체(glucose dimer)인 짧은 사슬의 셀로바이오스(cellobiose)를 만드는 엑소글루카나제(exo-glucanase, EC 3.2.1.91) 및 셀로바이오스를 분해하여 포도당을 만드는 β-글루코시다제(β-glucosidase, EC 3.2.1.21)가 있다.

상기 엔도글루카나제는 불용성의 섬유소를 효과적으로 분해하기 위해서는 매우 중요한 효소이다. 현재, 섬유소 분해를 통해 경제적으로 바이오에탄올을 생산하기 위해서는 활성이 높은 엔도글루카나제가 필요하므로, 이를 확보하기 위하여 기존에 클로닝된 유전자를 개량하여 활성을 증가시키는 연구(Percival Zhang 등, Biotechnol Adv. 24, 452, 2006) 등이 활발히 이루어지고 있으나, 아직까지 우수한 분해능을 가지는 셀룰라제의 개발은 더딘 실정이다.

이에, 본 발명자들은 고활성의 셀룰라제를 확보하기 위하여 섬유소 분해활성을 가지는 곰팡이, 포마 마크로스토마(Phoma macrostoma) Y4 균주를 썩은 감귤로부터 분리한 다음, 상기 균주로부터 엔도글루카나제 유전자를 클로닝한 후, 상기 유전자들을 효모 사카로마이세스 세레비지에(Saccharomyces cerevisiae) 균주에 재조합 발현하여 엔도글루카나제 활성이 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 엔도글루카나제를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 엔도글루카나제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현벡터를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 발현벡터가 도입되어 형질전환된 형질전환체를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 형질전환체를 이용하여 상기 엔도글루카나제를 생산하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 형질전환체를 이용하여 바이오 에탄올을 생산하는 방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 엔도글루카나제를 제공한다.

본 발명에서 용어, "엔도글루카나제(endo-1,4-β-glucanase, EC, 3.2.1.4)"는 셀룰로오스를 분해하는 효소인 셀룰라제 중 하나로서, 셀룰로오스 사슬의 중간에 작용하여 짧은 사슬의 글루코오스 폴리머 또는 글루코오스 이량체(glucose dimer)인 셀로바이오스(cellobiose)를 만드는 효소로서, 불용성의 섬유소를 효과적으로 분해하기 위하여 매우 중요한 효소이다.

본 발명의 엔도글루카나제는 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 엔도글루카나제 뿐만 아니라, 상기 엔도글루카나제의 기능적 동등물도 포함한다. 상기 "기능적 동등물"이란 아미노산의 부가, 치환 또는 결실의 결과, 상기 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 50% 이상, 바람직하게는 70% 이상, 보다 바람직하게는 90% 이상, 보다 더 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것으로, 본 발명의 엔도글루카나제와 실질적으로 동질의 생리활성을 나타내는 단백질을 말한다.

바람직하게, 본 발명의 엔도글루카나제는 포마 속 균주(Phoma sp.)로부터 발현된 엔도글루카나제일 수 있으며, 보다 바람직하게는 포마 마크로스토마 Y4(Phoma macrostoma Y4)로부터 발현된 엔도글루카나제일 수 있다.

본 발명의 엔도글루카나제는 최적의 활성을 나타내는 온도로서, 바람직하게는 45℃ ? 70℃, 보다 바람직하게는 50 ? 65℃, 가장 바람직하게는 60℃일 수 있다. 또한, 최적의 활성을 나타내는 pH로서, 바람직하게는 pH 2.0 ? 8.0의 산성 또는 중성의 pH, 보다 바람직하게는 pH 5.0일 수 있다.

본 발명의 일 실시예에서는, 셀룰라제 활성을 나타내는 신규의 포마 마크로스토마 Y4 균주를 분리 및 동정한 후(실시예 1), 상기 포마 마크로스토마 Y4 균주로부터 셀룰라제 활성을 나타내는 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 신규한 엔도글루카나제를 코딩하는 유전자를 확보하였으며(실시예 2 및 3), 상기 엔도글루카나제를 코딩하는 유전자를 사카로마이세스 세레비지아에 균주에 도입하여 발현시킨 결과, 엔도글루카나제 활성을 가지는 단백질이 세포 밖으로 분비됨을 확인하였다(실시예 4, 도 6, 7 및 표 2).

다른 하나의 양태로서, 본 발명은 본 발명의 엔도글루카나제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.

본 발명에서 용어, "폴리뉴클레오타이드"는 뉴클레오티드 단위체(monomer)가 공유결합에 의해 길게 사슬모양으로 이어진 뉴클레오티드의 중합체(polymer)로 일정한 길이 이상의 DNA(deoxyribonucleic acid) 또는 RNA(ribonucleic acid) 가닥으로서, 본 발명의 엔도글루카나제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드이다.

바람직하게, 상기 폴리뉴클레오티드는 서열번호 2의 염기서열로 표시되는 폴리뉴클레오티드 일 수 있다.

본 발명의 엔도글루카나제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 코돈의 축퇴성(degeneracy)으로 인하여 또는 상기 엔도글루카나제를 발현시키고자 하는 생물에서 선호되는 코돈을 고려하여, 코딩영역으로부터 발현되는 엔도글루카나제의 아미노산 서열을 변화시키지 않는 범위 내에서 코딩영역에 다양한 변형이 이루어질 수 있고, 코딩영역을 제외한 부분에서도 유전자의 발현에 영향을 미치지 않는 범위 내에서 다양한 변형 또는 수식이 이루어질 수 있으며, 그러한 변형 유전자 역시 본 발명의 범위에 포함됨을 당업자는 잘 이해할 수 있을 것이다. 즉, 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 이와 동등한 활성을 갖는 단백질을 코딩하는 한, 하나 이상의 핵산 염기가 치환, 결실, 삽입 또는 이들의 조합에 의해 변이될 수 있으며, 이들 또한 본 발명의 범위에 포함된다.

또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 본 발명의 엔도글루카나제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현벡터를 제공한다.

본 발명에서 용어, "벡터"란 연결되어 있는 다른 핵산을 운반할 수 있는 핵산 분자를 의미한다. 벡터의 하나의 유형인 "플라스미드"는 그 안에 추가적으로 DNA 조각을 연결시킬 수 있는 환형의 이중 가닥 DNA 루프를 의미한다.

본 발명의 벡터는 작동 가능하도록 연결된 목적 단백질을 코딩하는 유전자의 발현을 지시할 수 있는데, 이러한 벡터를 "발현벡터"라고 한다. 일반적으로, 재조합 DNA 기술의 사용에 있어서 발현 벡터는 플라스미드 형태이다.

바람직하게, 본 발명의 발현벡터는 도 8의 개열지도를 갖는 발현벡터일 수 있다.

상기 발현벡터는 숙주세포에 따라, 사용가능한 발현벡터의 종류가 결정될 수 있는데, 효모를 숙주로서 사용하는 경우는 발현벡터로서, 예를 들면 YEp13, YCp50, pRS계, pYEX계 벡터 등을 이용할 수 있다. 프로모터로서는, 예를 들면 GAL프로모터, AOD프로모터 등을 사용할 수 있다.

아울러, 상기 발현벡터에는, 목적 유전자의 발현의 억제 또는 증폭, 또는 유도를 위한 각종의 기능을 가진 발현억제용의 단편이나, 형질전환체의 선택을 위한 마커나 항생물질에 대한 내성유전자, 균체밖으로의 분비를 목적으로 한 시그널을 코딩하는 유전자, 난발현성 단백질에 적합한 맞춤형 융합인자 등을 추가로 포함할 수도 있다.

바람직하게, 상기 난발현성 단백질에 적합한 맞춤형 융합인자로서, 단백질융합인자(translational fusion partner : TFP)를 사용할 수 있다.

본 발명에서 용어, "단백질융합인자"란 발현율이 낮은 단백질을 코딩하는 유전자와 융합되어 발현율이 낮은 단백질의 분비생산을 유도하는 유전자를 의미하는데, 이러한 단백질융합인자는 박테리아(예를 들어, 대장균(Escherichia), 슈도모나스(Pseudomonas) 및 고초균(Bacillus) 종 등), 곰팡이(예를 들어, 효모, 아스퍼질러스(Aspergillus), 페니실리엄(Penicillium), 라이조퍼스(Rhizopus), 트리코더마(Trichoderma) 종 등), 식물(예를 들어, 애기장대, 옥수수, 담배, 감자 등) 및 동물(예를 들어, 인간, 토끼, 개, 고양이 및 원숭이 등)을 포함하는 모든 원핵 또는 진핵생물의 DNA로부터 선별될 수 있다.

바람직하게, 본 발명에서 사용가능한 단백질융합인자는 한국특허 제0626753호, 제0798894호, 제0975596호에 개시되어 있는 단백질융합인자를 사용할 수 있으며, 보다 바람직하게는 STFP4, STFP9 또는 STFP13의 단백질융합인자를 사용할 수 있다,

본 발명에 의하면, 상기 발현벡터에 삽입되는 유전자는 상술한 엔도글루카나제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드로서, 바람직하게는 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 엔도글루카나제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드일 수 있고, 보다 바람직하게는 포마 속 균주로부터 발현되는 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 엔도글루카나제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드일 수 있다.

또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 본 발명의 발현벡터가 숙주세포에 도입되어 형질전환된 형질전환체를 제공한다.

본 발명에서 용어, "형질전환"이란 DNA를 숙주세포로 도입하여 DNA가 염색체 외 인자로서 또는 염색체 통합완성에 의해 복제가능하게 되는 것을 의미한다.

본 발명에서 형질전환 방법은 본 발명의 발현벡터를 당업계에 공지된 방법, 예를 들어 이에 한정되지는 않으나, 일시적인 형질감염(transient transfection), 미세 주사, 형질 도입(transduction), 세포 융합, 칼슘 포스페이트 침전법, 리포좀 매개된 형질감염(liposem-mediated transfection), DEAE 덱스트란-매개된 형질 감염(DEAE Dextran-mediated transfection), 폴리브렌-매개된 형질 감염(polybrene-mediated transfection), 전기침공법(electroporation), 스페로플라스트법, 아세트산리튬법 등의 공지 방법으로 숙주세포에 도입하여 형질전환시킬 수 있다. 효모에의 재조합체 DNA의 도입방법으로서는, 예를 들면 전기침공법, 스페로플라스트법, 아세트산리튬법 등을 이용할 수 있다.

본 발명에 따른 형질전환에 사용되는 숙주 세포는 당업계에 널리 알려져 있는 숙주세포는 어떤 것이나 사용할 수 있으나, 본 발명의 엔도글루카나제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 도입효율이 우수하고, 도입된 폴리뉴클레오티드의 발현효율이 높은 숙주를 사용할 수 있는데, 예를 들면 박테리아, 곰팡이, 효모, 식물 또는 동물(예컨대, 포유동물 또는 곤충) 세포를 포함할 수 있다.

바람직하게, 상기 숙주세포는 에탄올 발효능을 가지는 세포를 사용할 수 있으며, 보다 바람직하게 상기 에탄올 발효능을 가지는 세포는 자이모모나스, 효모, 바실러스 일 수 있다.

상기 효모는 특별히 이에 제한되지 않으나, 캔디다(Candida), 디베리오마이세스(Debaryomyces), 한세눌라(Hansenula), 클루이베로마이세스(Kluyveromyces), 피키아(Pichia), 스키조사카로마이세스(Schizosaccharomyces), 야로이야(Yarrowia), 사카로마이세스(Saccharomyces), 사카로마이콥시스(Saccharomycopsis), 슈완니오마이세스(Schwanniomyces), 아르술라(Arxula) 종을 포함하고, 보다 바람직하게는 캔디다 유틸리스(Candida utilis), 캔디다 보이디니(Candida boidinii), 캔디다 알비칸스(Candida albicans), 클루이베로마이세스 락티스(Kluyveromyces lactis), 피키아 파스토리스(Pichia pastoris), 피키아스티피티스(Pichia stipitis), 스키조카로마이세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe), 사카로마이세스 세레비지에(Saccharomyces cerevisiae), 사카로마이콥시스 피브리게라(Saccharomycopsis fiburigera), 한세눌라 폴리모르파(Hansenula polymorpha), 야로이야 리포폴리티카(Yarrowia lipolytica), 슈완니오마이세스 옥시덴탈리스(Schwanniomyces occidentalis), 아르술라 아데니니모란스(Arxula adeninivorans) 등 일 수 있으며, 바람직하게는 클루이베로마이세스 마르시아누스(Kluyveromyces maxianus), 사카로마이세스 세레비지에(Saccharomyces cerevisiae) 또는 사카로마이콥시스 피브리게라(Saccharomycopsis fiburigera)일 수 있다.

본 발명의 일실시예에서는, 효모 사카로마이세스 세레비지에를 본 발명의 발현벡터를 사용하여 형질전환한 후, 상기 형질전환체로부터 본 발명의 엔도글루카나제가 생산되었음을 확인하였다(실시예 4, 도 6, 7 및 표 2).

또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 본 발명의 형질전환체를 배양하고, 이의 배양물 또는 배양상등액으로부터 엔도글루카나제를 회수하는 단계를 포함하는, 본 발명에 따른 엔도글루카나제의 생산방법을 제공한다.

본 발명의 형질전환체를 배양하기 위한 배지 및 배양조건은 숙주 세포에 따라 적절히 선택 이용할 수 있다. 영양배지는 숙주세포의 생육에 필요한 탄소원 무기질소원 또는 유기질소원을 포함하고 있는 것이 바람직하다. 탄소원으로는 글루코오스, 덱스트란, 가용성 전분, 수크로오스, 및 메탄올 등이 예시된다. 무기질소원 또는 유기질소원으로는 암모늄염류, 질산염류, 아미노산, 콘스팁 리쿼(corn steep liquer), 펩톤, 카제인, 소 추출물, 대두백, 및 감자추출물 등이 예시된다. 필요에 따라 다른 영양소, 예를 들어 염화나트륨, 염화칼슘, 인산이수소나트륨, 염화마그네슘 같은 무기염, 비타민류, 및 항생물질(테트라사이클린, 네오마신, 암피실린, 및 카나마이신)등을 포함할 수 있다. 배양시는 세포의 생육과 단백질의 대량 생산에 적합하도록 온도, 배지의 pH 및 배양 시간 등의 조건들을 적절하게 조절할 수 있다.

본 발명의 일실시예에서는, 엔도글루카나제를 발현시키기 위하여 GAL10 프로모터 및 GAL7 터미네이터를 가지는 일반적 효모 발현 벡터인 YEp352 유래의 벡터에 TFP를 사용하여 YGa-ST13-Y4EGL을 제작하였다. 각각의 벡터로 사카로마이세스 세레비지에 균주를 형질전환시킨 후, 30℃ YEPD 배지(효모추출액 1%, 펩톤 2%, 포도당 2%) 조건에서 배양하였다(실시예 4).

상기 엔도글루카나제를 회수하는 단계는 통상적인 생화학 분리 기술에 의하거나 단백질의 한 부분 또는 다른 부분에 대한 항체를 사용하는 면역친화적인 방법으로 엔도글루카나제를 분리, 정제할 수 있다. 또 다른 방법은 단백질 서열에 태그(tag)를 가하여, 항체 또는 이러한 태그에 대하여 적절하게 높은 친화성을 갖는 기타 물질을 이용하는 친화 방법에 의해 정제할 수도 있다. 통상적인 생화학 분리 기술로는 단백질 침전제의 의한 처리(염석법), 원심분리, 초음파파쇄, 한외여과, 투석법, 분자체 크로마토그래피(겔여과), 흡착크로마토그래피, 이온교환 크로마토그래피, 및 친화성 크로마토그래피 등의 각종 크로마토그래피 등이 있고, 통상적으로 이들을 조합, 사용하여 순도가 높은 단백질을 분리할 수 있다.

또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 엔도글루카나제 기질의 존재하에 상기 형질전환체를 배양하고, 이로부터 바이오 에탄올을 회수하는 단계를 포함하는, 바이오 에탄올의 생산방법을 제공한다.

구체적으로, 본 발명의 바이오 에탄올의 생산방법은 (ⅰ) 본 발명의 발현벡터를 에탄올 발효능을 가지는 숙주세포에 도입하여 형질전환된 형질전환체를 수득하는 단계; (ⅱ) 상기 수득한 형질전환체를 엔도글루카나제의 기질을 포함하는 배양액에서 배양하는 단계; 및 (ⅲ) 상기 단계 (ⅱ)에서 수득한 배양물 또는 배양상등액으로부터 바이오 에탄올을 회수하는 단계를 포함한다.

상기 에탄올 발효능을 가지는 숙주세포는 특별히 이에 제한되지 않으나, 바람직하게는 자이모모나스(Zymomonas Mobilis) 균주, 효모균주 또는 바실러스 균주를 사용할 수 있으며, 보다 바람직하게는 엑소글루카나제 또는 베타-글루코시다제를 각각 발현하거나 또는 동시에 발현하는 미생물을 사용할 수 있다.

상기 엔도글루카나제의 기질은 특별히 이에 제한되지 않으나, 바람직하게는 엔도글루카나제에 의해 분해될 수 있는 글루칸(glucan) 또는 다당류(polysaccharide)일 수 있으며, 보다 바람직하게는 녹말, 덱스트란, 풀룰란 및 셀룰로오스로 구성된 그룹으로부터 선택되는 1종 이상일 수 있고, 보다 더 바람직하게는 셀룰로오스일 수 있다.

상기 엔도글루카나제의 기질을 포함하는 배양액은 엑소글루카나제 또는 베타-글루코시다제 또는 이를 발현하는 미생물을 추가로 더 포함할 수 있다.

배양방법은 특별히 이에 제한되지 않으나, 배치(batch)식, 유동배치식, 연속배양, 리액터형식 등, 통상의 미생물의 배양에 사용하는 어떠한 방법도 사용할 수 있다.

본 발명의 신규한 엔도글루카나제는 우수한 셀룰로오스 분해 활성을 나타내므로, 목질계 바이오매스로부터의 바이오 에탄올 제조 등의 산업공정에 널리 활용될 수 있다.

도 1은 포마 마크로스토마 Y4(Phoma macrostoma Y4) 균주의 셀룰라제 활성을 보여주는 사진이다.
도 2는 디제너레이트 프라이머를 이용한 포마 마크로스토마 Y4 균주의 엔도글루카나제(EGL) 유전자의 부분 증폭(A) 및 서던블로팅(B)한 결과를 보여주는 사진이다.
도 3의 A는 포마 마크로스토마 Y4 균주 유래의 EGL 유전자를 클로닝하는 방법을 나타낸 계략도이고, 도 3의 B는 PCR 후 전기영동한 결과를 보여주는 사진이다. 레인1 : 크기 표지자, 레인 2: Y4-EGL 유전자의 5′부위를 증폭한 결과, 레인 3: Y4-BGL 유전자의 3′ 부위를 증폭한 결과를 나타낸다.
도 4는 포마 마크로스토마 Y4 균주 유래의 EGL 유전자와 아스파질루스 클라바투스 NRRL 1(Aspergillus clavatus NRRL 1), 트리코더마 비리디(Trichoderma viride), 페니실리엄 마나피(Penicillium marneffei), 파이레노포라 트리티시-리펜티스(Pyrenophora tritici-repentis) Pt-1C-BFP 엔도글루카나제 1 유래 엔도글루카나제 서열간의 상동성을 비교하여 나타낸 계략도이다.
도 5는 포마 마크로스토마 Y4 균주 유래의 EGL 유전자를 사카로마이세스 세레비지에 균주로 형질전환하는 방법을 나타내는 계략도이다.
도 6은 사카로마이세스 세레비지에 균주 24종에서 발현되어 세포 밖으로 분비된 엔도글루카나제를 SDS-PAGE로 분석한 결과를 나타내는 전기영동 사진이다.
도 7은 단백질의 당쇄 함유 여부 비교를 위해 엔도-에이치(Endo-H) 처리 전후를 SDS-PAGE로 분석한 결과를 나타내는 전기영동 사진이다.
도 8은 포마 마크로스토마 Y4 균주 유래의 EGL 유전자 발현 벡터 YGa-ST13-Y4EGL를 나타내는 계략도이다.
도 9는 포마 마크로스토마 Y4 균주 유래의 EGL 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 형질전환된 사카로마이세스 세레비지에 균주를 5L 발효조에서 유가식 발효하여 시간별로 취한 배지를 SDS-PAGE로 분석한 결과를 나타내는 전기영동사진(A) 및 각 시간별 세포 세포성장과 엔도글루카나제의 활성을 측정한 결과를 나타내는 그래프이다(B).
도 10은 재조합 EGL 정제를 위한 이온 교환 크로마토그래피를 통해 얻은 정제 분획에 대한 단백질을 SDS-PAGE로 분석한 결과를 나타내는 전기영동사진(A) 및 각 분획별 엔도글루카나제 활성의 측정 결과를 나타내는 그래프이다(B).
도 11은 재조합 EGL 정제를 위한 겔 여과 크로마토그래피를 통해 얻은 정제 분획에 대한 엔도-에이치(Endo-H) 처리 및 미처리 군을 SDS-PAGE로 분석한 결과를 나타내는 전기영동사진(A) 및 각 분획별 엔도글루카나제 활성의 측정 결과를 나타내는 그래프이다(B).
도 12는 정제한 재조합 EGL 단백질의 효소 특성을 분석하기 위해 최적 온도(A), 최적 pH(B) 및 열 안정성(C)을 분석한 결과를 나타내는 그래프이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.

실시예 1. 셀룰라제 활성을 나타내는 곰팡이 균주 선별 및 동정

셀룰라제를 생산하는 곰팡이 균주를 분리하기 위해 부식하고 있는 다양한 시료를 사용하여 감자한천배지(Potato Dextrose Agar, Difco)를 기본 배지로 7일간 배양하였고, 5 mm 직경으로 균사체를 잘라 100 ㎖의 YM(0.3% 효모추출물, 0.3% 맥아 추출물, 0.5% 펩톤, 1% 덱스트로스)에 아비셀(Avicel)과 하이드록시에틸셀룰로스(HEC)가 첨가된 배지에 접종하여 25℃에서 5일간 진탕 배양하였다. 배양을 마친 곰팡이 균사체를 필터페이퍼(Watman; 10μm)로 걸러 배지로 분비된 셀룰라제 활성을 분석하였다. 배양상등액 10 ㎕를 1% 카복시메틸셀룰로오스(CMC)가 함유되어 있는 YP(1% 효모추출물, 2% 펩톤) 평판 배지에 점적한 후 12시간 동안 배양하였다. 배양이 끝난 고체배지에 0.1% 콩고 레드(congo red) 용액으로 염색하고, 다시 1M NaCl 용액으로 탈색한 후 투명환(clear zone) 생성 유무를 확인하여 셀룰라제 활성이 우수한 곰팡이 균주를 선별하였다. 선별되어진 균주 중에서 가장 우수한 셀룰라제 활성을 나타낸 썩은 귤로부터 분리된 Y4 균주의 셀룰라제 활성을 도 1에 나타내었다.

가장 우수한 셀룰라제 활성을 갖는 Y4 균주의 동정을 위해서 염기서열 분석방법에 근거한 분자분류 방법을 통해 ITS 영역의 염기서열을 분석하여 Y4 균주로부터 총 501 bp 길이의 ITS 영역 염기서열(서열번호 3)을 확인하였고, 이러한 서열정보를 진뱅크(GenBank)에 수록된 다양한 곰팡이 균주의 염기서열 데이타베이스와 비교분석하였다. 그 결과, Phoma macrostoma var. incolorata 균주 CBS 300.36과 100% 일치하는 것을 확인하였다.

실시예 2. 포마 마크로스토마 Y4 유래 셀룰라제 유전자의 분리 및 동정

분리되어진 포마 마크로스토마 Y4(Phoma macrostoma Y4) 균주로부터 섬유소 분해효소 유전자를 확인하기 위해 탄수화물의 글리코시드 결합(Glycosidic bond)에 관련된 효소 유전자의 정보를 모아놓은 CAZy 데이터베이스(http//www.CAZy.org)에서 진핵세포 유래의 셀룰라제가 포함된 패밀리인 GH5, 6, 7, 9, 12 및 61로부터 보존성이 높은 아미노산 서열을 바탕으로 디제너레이트 프라이머를 제작하여 사용하였다. 제작되어진 디제너레이트 프라이머 서열은 표 1에 나타내었다.

동정된 포마 마크로스토마 Y4 균주의 염색체 DNA를 주형으로 11가지 프라이머 조합(GH5F1/GH5R1, GH5F1/GH5R2, GH5F2/GH5R1, GH5F2/GH5R2, GH6F/GH6R, GH7F1/GH7R1, GH7F1/GH5R2, GH7F2/GH7R1, GH7F2/GH5R2, GH9F/GH9R, GH12F/GH12R)으로 PCR을 수행하였다. PCR 조건은 95℃ 5분 반응 후 95 ℃ 30초, 50 ℃ 30초, 72 ℃ 30초 조건으로 30 사이클 반응하고, 72 ℃에서 10분간 추가 반응하였다. 포마 마크로스토마 Y4 균주의 염색체로부터 PCR한 결과와 기존에 알려진 셀룰라제 유전자 복합체를 프로브로 사용하여 서던 블로팅을 수행하여, 그 결과를 도 2에 나타내었다.

그 결과, 도 2에 나타난 바와 같이, GH7F1/GH7R2 프라이머 조합에서 500 bp 크기에 유전자 단편을 확인하였고, 이 위치에 증폭된 단편을 0.9% 아가로스 겔에서 분리하여 pGEM-T Easy 벡터에 클로닝하여 염기서열을 분석하였다. 염기서열 분석 결과, 포마 마크로스토마 Y4 유래 셀룰라제는 파이레노포라 트리티시(Pyrenophora tritici) 유래의 엔도글루카나제와 높은 유사성을 나타내었으나, 동일한 염기서열은 발표된 유전자 데이타베이스에서 발견할 수 없었다. 따라서, 상기 방법으로 부분 증폭된 셀룰라제 유전자 단편은 신규한 엔도글루카나제의 일부분임을 확인할 수 있었다.

실시예 3: 게놈워킹 기술(Template blocking PCR)을 이용한 본 발명에 따른 엔도글루카나제 유전자의 확보

실시예 2의 방법을 통해 밝혀진 염기 서열 정보를 바탕으로 전체 유전자를 확보하기 위해 게놈워킹 기술(한국특허출원 10-2009-0061895호)을 이용하였다. 게놈워킹 기술 방법을 이용하기 위해 먼저 카세트를 제조하였다. 카세트는 제한효소 처리된 게놈 DNA에 연결될 수 있도록 고안된 짧은 이중가닥 DNA를 의미한다.

포마 마크로스토마 Y4 균주의 게놈 DNA를 제한효소 BamHI으로 37℃에서 2시간 동안 처리하여 아가로스겔에서 전기영동하여 완전히 절단되었음을 확인한 후, 70℃ 항온 수조에서 20분간 처리하여 제한효소를 불활성화시키고, ddGTP를 0.2 mM이 되도록 첨가한 후, 8 유닛(unit)의 크레나우 단편(Klenow fragment; Takara)을 첨가하여 37℃에서 30분간 반응하였다. 반응산물을 PCR 정제 키트(Axygen)를 사용하여 정제한 후, 상기 제조한 40 pmol의 카세트와 DNA 라이게이션 키트(DNA ligation kit; Takara)를 사용하여 16℃에서 10시간 동안 반응하여 서로 연결하였다. 연결된 DNA를 다시 PCR 정제 키트를 사용하여 정제한 후, 20 ㎕의 증류수로 용출하여 BamHI 카세트 라이브러리를 제작하였다.

상기 BamHI 카세트 라이브러리를 이용하여 본 발명에 따른 엔도글루카나제 유전자를 확보하기 위해 상기 실시예 2를 통해 얻은 500 bp PCR 산물의 염기 서열을 바탕으로 엔도글루카나제 특이적인 프라이머 MJ 65 (서열번호 25) 및 MJ66 (서열번호 26)을 양방향으로 제작한 후, 각각의 카세트 라이브러리 1 ㎕를 주형으로 카세트 프라이머 CSF(서열번호 27) 및 CSR(서열번호 28)를 사용하여 하기와 같은 반응 조성과 반응 조건을 사용하여 PCR을 수행하였다.

엔도글루카나제 유전자의 5' 과 3' 부위를 증폭하기 위한 반응 조성은 다음과 같으며[게놈 카세트 라이브러리 1㎕, CSF 1 pmol or CSR 1 pmol MJ66 1 pmol or MJ65 1 pmol, EX taq buffer (Takara) 5㎕, 2.5 mM dNTP 5㎕, 증류수 37㎕, EX taq DNA polymerase (Takara) 1㎕], PCR 조건은 95℃ 5분 반응 후, 95 ℃ 30초, 60 ℃ 30초, 72 ℃ 3분으로 30 사이클 반응하고, 72℃에서 10분간 추가 반응하는 반응 조건을 사용하였다.

상기 PCR 반응 후 10㎕의 반응액을 아가로스 겔에서 전기영동하여 분석한 결과, 5' 부위 클로닝 반응에서는 2.5 kb 크기의 단편이 BamHI 카세트 라이브러리로부터 증폭되었고 3' 부위 클로닝 반응에서는 5.0 kb 크기의 단편이 증폭되었다(도 3).

각각의 PCR 산물을 pGEM-T Easy 벡터(Invitrogen)에 클로닝하여 염기서열을 분석한 결과, Y4 균주 유래의 엔도글루카나제 유전자의 클로닝하고자 하는 부위가 증폭되었음을 확인하였으며, 유전자의 전체서열(서열번호 2) 및 유추된 아미노산 서열(서열번호 1)을 확인할 수 있었다. 위 방법으로 클로닝된 Y4 유래의 엔도글루카나제 유전자(Y4-EGL)는 1227 bp 뉴클레오타이드로 구성되어 있고, 408개의 아미노산으로 구성된 단백질임이 확인되었다. N-말단 부위에서 최초 21개 아미노산 잔기들은 온라인 프로그램인 SignalP 분석(http://www/cbs/dtu/아/services/SignalP/)에 의해 시그널 펩타이드인 것으로 추정되었다.

본 발명에서 분리한 엔도글루카나제 아미노산 서열을 다른 단백질들의 서열과 비교분석하기 위해 BLASTX 데이터베이스를 검색하여, 결과를 도 4에 나타내었다.

도 4에 나타난 바와 같이, 본 발명에 따른 엔도글루카나제는 글리코실하이드롤라아제(glycosyl hydrolase, GH)7 패밀리에 속하는 것을 확인하였고, GH7 패밀리에 속하는 다른 균류 엔도글루카나제 중 파이레노포라 트리티시-리펜티스 Pt-1C-BFP 유래의 엔도글루카나제와 66%, 후미콜라 인솔렌스(Humicola insolens) 유래 엔도글루카나제와 55%, 후미콜라 그리세아 바 써모이데(Humicola grisea var. thermoidea) 유래 엔도글루카나제와 54% 아미노산 유사성을 나타내는 신규 엔도글루카나제인 것을 확인하였다.

실시예 4. 단백질융합인자(TFP) 도입을 통한 엔도글루카나제 분비 발현 및 활성 확인

실시예 3의 방법을 통해 얻어진 포마 마크로스토마 Y4 균주 유래의 EGL 유전자(Y4-EGL)를 사카로마이세스 세레비지에 균주에서 분비 발현시키기 위해 도 5에 나타낸 방법을 사용하여 하기와 같이 형질전환을 수행하였다.

분비시그널을 제외한 Y4-EGL 유전자를 MJ102(서열번호 29)와 MJ92(서열번호 30) 프라이머를 사용하여 94℃로 5분 반응 후, 94℃ 30초, 55℃ 30초, 72℃ 1분 10초 조건으로 25 사이클 후, 72℃에서 7분간 반응하여 1차 PCR을 수행하였다. 1차 PCR 후 만들어진 유전자를 주형으로 24개 STFP 벡터와 포워드(forward) 프라이머에 상보성을 갖는 LNK39(서열번호 31) 프라이머와 GT50R(서열번호 32) 프라이머를 사용하여 PCR을 통해 증폭하였다. LNK39와 GT50R 프라이머로 증폭한 PCR 산물은 40 bp 이상의 벡터와 동일한 서열을 포함하고 있기 때문에 선형화된 벡터와 함께 효모세포로 도입하면 세포 내에서 교차가 일어나서 원형의 플라스미드 벡터가 만들어지게 된다(도 5 참조). 증폭된 PCR 산물은 대장균을 거치지 않고, 바로 제작하고자 하는 벡터로 형질전환된 사카로마이세스 세레비지에 균주를 얻을 수 있는 장점을 갖는 In vivo 재조합 방법을 사용하여 단백질 분비 발현을 도와주는 24종의 단백질융합인자(한국특허 제0975596호) 벡터를 통해 Y2805(Mat a pep4::HIS3 prb1 can1 his3-200 ura3-52)균주 내로 도입하였다. 형질전환된 균주는 SC-URA(0.67% 아미노산이 결핍된 효모 기질, 2% 포도당 및 우라실을 제외한 각종 아미노산) 배지를 이용하여 선별하였다.

각각의 형질전환체를 YPDG배지(1% Yeast extract, 2% Peptone, 1% Glucose, 1% Galactose) 에서 40시간 동안 배양한 후, 원심분리하여 균체를 제거하고 남은 배양상등액 0.6 ㎖을 0.4 ㎖ 아세톤을 첨가하여 -20℃에서 2시간 방치 후, 단백질을 10,000g로 15분간 원심분리하여 회수하여 12% 글리신이 포함된 SDS-PAGE 겔을 사용하여 80V로 약 2시간정도 전개하여 전기영동한 후, Phastgel TMBlue R(GE healthcare)을 이용하여 제조된 염색 용액으로 한 시간 동안 염색 후 탈색 버퍼(10% Acetic acid, 30% Methanol)을 이용하여 탈색하여, 그 결과를 도 6에 나타내었다.

도 6에 나타난 바와 같이, SDS-PAGE 상에서 예상되는 단백질 크기보다 큰 분자량 부분에서도 단백질이 확인되는 다중-밴드(multi-band)의 형태로 분리되어지는 것을 확인하였다. 이러한 결과는 Y4-EGL 단백질 서열상에 포함되어진 3개의 N-글리코실화 유발 서열 부위에서 글리코실화가 발생하였음을 나타낸다. 따라서, N-글리코실화에 의해 단백질에 부가된 당을 제거할 수 있도록 각 단백질에 엔도에이치(Endo-H) 효소를 처리한 후 다시 SDS-PAGE 분석하여, 그 결과를 도 7에 나타내었다.

도 7에 나타난 바와 같이, 엔도에이치 처리 후 예상 분자량 부위에서 엔도글루카나제 단백질이 확인되었으며, 적용되어진 단백질분비융합인자의 종류에 따라 엔도글루카나제의 분비 정도가 상당한 차이를 나타내는 것을 확인하였고, 그 중에서도 단백질분비융합인자 4, 9 및 13번이 높은 분비율을 나타내는 것을 알 수 있었다.

따라서, 높은 분비율을 나타낸 단백질분비융합인자 4, 9 또는 13번이 적용된 형질전환체들을 시료로 엔도글루카나제 활성을 확인하였다. 활성을 분석하기 위해 DNS(dinitirosalicylic acid) 정량법 (Miller, Anal. Chem, 55: 952-959, 1959)을 사용하였다. 100 ㎕의 효소용액에 100㎕ 기질용액(1% 카복시메틸셀룰로오스가 포함된 100 mM 인산나트륨용액, pH 7.0)을 넣고, 50℃에서 10분간 반응 후, 700 ㎕의 DNS 용액을 첨가하여 100℃에서 5분간 처리한 뒤 찬물로 냉각시킨 후, 540nm에서 흡광도를 측정함으로써 엔도글루카나제 활성을 확인하여, 그 결과를 표 2에 나타내었다. 이때, 효소활성은 1분 동안 1 μmol의 환원당을 방출시키는 효소의 양을 1 유니트(unit)로 정하였다.

선별된 균주의 엔도글루카나제 활성 분석

단백질분비융합인자	엔도글루카나제 활성 (u/㎖)
4	2.11
9	2.55
13	2.92

표 2에 나타난 바와 같이, 단백질분비융합인자 13번이 적용된 형질전환체가 2.92 유니트/㎖로 가장 우수한 엔도글루카나제 활성을 나타내는 것을 확인하여 최종적으로 선별하였다.

실시예 5: 유가 배양식 발효를 통한 엔도글루카나제의 대량 생산

실시예 4를 통해 선별된 2805/YGa-ST13-Y4EGL(도 8)로 형질전환시킨 재조합 효모 균주를 이용하여 엔도글루카나제를 대량 생산하기 위해 5L 발효조에서 유가식 배양을 수행하였다. 본 배양에 들어가기 전에 50 ㎖의 최소 액체배지(0.67% 아미노산이 결여된 효모 질소원 기질, 0.5% 카사미노산, 2% 글루코오스)에 1단계 초기배양한 후, 다시 200 ㎖의 YPD 액체배지 (1% 효모추출물, 2% 펩톤, 2% 글루코오스)에서 배양하여 활성화시킨 후, 본 배양액에 접종하여 30℃에서 48시간 동안 배양하였다. 세포 성장 속도에 따라 유가 배양식 배지(15% 효모추출물, 30% 글루코오스)를 추가 공급하였다. 배양 48시간 후 세포농도가 OD₆₀₀을 기준으로 150에 도달하였다. 배지로 분비된 엔도글루카나제를 확인하기 위하여 시간별 배양상등액을 취하여 SDS-PAGE 분석을 하였고, 48시간 배양 후 약 28 유니트/㎖의 활성을 확인하였다(도 9). 발효를 통해 생산된 단백질은 50mM의 트리스 완충용액(pH7.5)으로 한외여과(분자량 cut off 30,000)를 이용하여 농축하였다.

실시예 6 : 엔도글루카나제의 정제

상기 실시예 5의 방법으로 얻어진 농축된 엔도글루카나제 효소를 이용하여 정제를 수행하였다. 첫 번째 단계로 DEAE-세파로스 컬럼을 이용하여 이온교환 크로마토그래피를 수행하였다. 10 mM 암모늄 아세테이트 완충용액(pH 7.0)으로 레진을 충분히 평행화시킨 후, 조효소액 5 ㎖를 로딩하여 0.2 ㎖/분의 유속으로 0에서 1M NaCl 농도구배를 주면서 단백질을 용출시켰다. 각 분획의 활성을 측정하여 활성이 나타나는 12, 13번 분획만을 회수하여 다음 정제 단계에 이용하기 위해 아미콘 울트라-4(Millipore, 10K NMWL 디바이스)를 이용하여 농축하였다 (도 10).

두 번째 단계로 10 mM 암모늄 아세테이트에 100 mM NaCl이 첨가된 완충용액으로 충분히 평형화시킨 슈퍼덱스 (1.6 X 61.5 cm) 컬럼에 전 단계에서 모아진 활성 분획 5 ㎖를 로딩하여 겔 여과 크로마토그래피를 수행하여 단백질 크기별로 분획하였다. 각 분획의 활성을 측정하여 최종적으로 활성을 나타내는 1 내지 8번 분획을 회수하였다. 회수된 분획에 단백질에 부가된 당을 제거하기 위한 엔도 에이치(Endo H) 효소를 처리 후, SDS-PAGE 분석한 결과 1 내지 3번 분획에서 단일 밴드의 순수한 엔도글루카나제 단백질이 정제되었음을 확인하였다(도 11).

실시예 7: 발현된 재조합 엔도글루카나제의 최적 온도, 열안정성 및 최적 pH 검정

실시예 6의 방법을 통해 정제된 엔도글루카나제의 특성을 조사하기 위해 정제된 조효소액을 사용하여 효소 활성에 미치는 pH와 온도의 영향을 조사하였다. 온도의 영향을 조사하기 위하여 20 내지 80℃의 범위에서 10℃ 간격으로 반응시킨 후 각각의 활성을 측정하였고, 활성이 가장 높은 온도를 기준으로 하여 상대적인 활성을 나타내었다. 그 결과, 최적 반응온도가 60℃ 임을 알 수 있었고, 45℃ 내지 70℃의 범위에서 높은 활성을 나타내는 것을 확인하였다(도 12의 A).

또한, 효소 활성에 미치는 pH의 영향을 조사하기 위하여 50 mM 시트레이트 완충액 (pH 2.0 내지 6.0), 50 mM 인산 완충액 (pH 6.0 내지 8.0), 50 mM 트리스-염산 완충액(pH 8.0 내지 10.0)을 사용하여 50℃에서 반응 시킨 후, 효소 활성을 측정하였다. 각 pH에서 상대적인 활성을 조사한 결과 pH 5.0 에서 최대 활성을 나타내었으며, pH 2.0 ? 8.0의 산성 및 중성의 pH에서도 비교적 안정한 것으로 확인되었다(도 12의 B).

추가적으로, 열에 대한 안정성을 조사하기 위하여 조효소액을 각 온도에서 시간별로 방치한 후, 남아있는 효소의 잔존활성을 측정하였다. 그 결과 50℃에서는 1시간 반응시 효소의 활성이 안정하게 유지되었으나, 60℃에서는 시간의 경과와 함께 효소 활성이 감소하는 것을 확인하였다(도 12의 C).

<110> Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology Korea Institute of Industrial Technology <120> Novel endoglucanase and the Use thereof <130> PA110443KR <160> 32 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 408 <212> PRT <213> amino acid sequence of endoglucanase derived from Phoma macrostoma Y4 <400> 1 Met Val His Tyr Arg Ile Ile Ser Tyr Ala Leu Leu Ala Val Ala Ser 1 5 10 15 Ala Gln Ser Leu Gly Glu Gly Gln Glu Glu Gln Pro Lys Leu Thr Thr 20 25 30 Tyr Gln Cys Thr Asn Asp Gly Gly Cys Lys Ala Gln Asp Ser Tyr Ile 35 40 45 Val Leu Asp Ser Ala Ser His Asn Ile His Gln Lys Asn Asp Thr Thr 50 55 60 Lys Gly Cys Gly Asn Gly Gly Thr Gly Val Asp Pro Ala Val Cys Pro 65 70 75 80 Asn Gln Glu Thr Cys Ala Gln Asn Cys Ile Leu Glu Pro Ile Ser Asn 85 90 95 Tyr Gln Asp Tyr Gly Ile Ser Thr Asp Gly Ala Ser Leu Arg Met Asp 100 105 110 Phe Phe Gly Thr Asp Lys Lys Phe Gln Ser Pro Arg Ala Tyr Leu Leu 115 120 125 Asn Glu Asp Lys Lys Asn Tyr Glu Met Leu Gln Leu Thr Gly Lys Glu 130 135 140 Phe Ala Phe Asp Val Asp Val Ser Lys Leu Pro Cys Gly Met Asn Gly 145 150 155 160 Ala Leu Tyr Leu Ser Glu Met Met Ala Asp Gly Gly Arg Ser Ala Leu 165 170 175 Asn Pro Gly Gly Ala Ser Val Gly Thr Gly Tyr Cys Asp Ala Gln Cys 180 185 190 Phe Val Thr Pro Trp Ile Asn Gly Gln Gly Asn Ile Asn Gly Thr Gly 195 200 205 Val Cys Cys Asn Glu Met Asp Ile Trp Glu Ala Asn Ser Glu Ser Thr 210 215 220 Gln Val Ala Pro His Thr Cys Ser Lys Pro Ser Leu Phe Thr Cys Gln 225 230 235 240 Gly Asp Glu Cys Gly Ala Thr Gly Leu Cys Asp Lys Asn Gly Cys Gly 245 250 255 Glu Asn Pro Tyr Arg Ser Gly Ala Lys Asp Phe Tyr Gly Pro Gly Leu 260 265 270 Lys Ile Asp Thr Gln Lys Pro Phe Thr Val Val Thr Gln Phe Pro Ala 275 280 285 Glu Asn Gly Val Leu Gln Ser Ile Gly Arg Lys Tyr Val Gln Asn Gly 290 295 300 Val Val Phe Glu Asp Gln Pro Lys Asn Ile Thr Leu Asn Asp Gln Phe 305 310 315 320 Cys Thr Ala Asn Asp Ala Thr Met Phe Met Asn Leu Gly Gly Met Lys 325 330 335 Gly Met Gly Asp Ala Leu Ser Arg Gly Met Val Leu Ala Leu Ser Val 340 345 350 Trp Trp Asp Glu Ser Lys Phe Met Asn Trp Leu Asp Ser Gly Asn Ala 355 360 365 Gly Pro Cys Asn Ala Thr Glu Gly Asp Pro Lys Asn Ile Val Lys Val 370 375 380 Gln Ala Ala Pro Ser Ala Thr Phe Ser Asn Ile Lys Trp Gly Glu Ile 385 390 395 400 Gly Ser Thr Phe Lys Gly Asn Met 405 <210> 2 <211> 1227 <212> DNA <213> nucleic acid sequence of endoglucanase derived from Phoma macrostoma Y4 <400> 2 atggtccact acagaattat ctcgtatgct cttttggctg ttgcttctgc tcagtcactc 60 ggcgagggcc aggaggaaca gcccaagttg accacctacc agtgcaccaa tgatggtggc 120 tgcaaggctc aagacagcta catcgttctc gactccgcta gccacaacat ccaccagaag 180 aacgatacca ccaagggctg cggcaatggg ggcactggag tggaccctgc tgtatgcccc 240 aatcaggaga cttgcgccca aaactgcatc ctcgagccca tcagcaacta ccaggactat 300 ggcatctcca ccgacggcgc aagcctacgc atggacttct tcggaacgga caagaaattc 360 cagagcccca gggcgtatct cctcaacgag gacaagaaga attatgagat gctccaattg 420 accggcaagg agttcgcttt cgacgtcgat gtctcgaagc tgccttgcgg catgaatggt 480 gctctgtacc tctctgagat gatggcggat ggtggccgct cagctttgaa cccaggaggt 540 gcgagcgttg gtaccggata ctgcgatgct cagtgcttcg ttactccttg gatcaacggt 600 cagggcaaca ttaatggcac cggtgtttgc tgcaacgaga tggacatctg ggaggccaac 660 agcgaatcta cccaagtcgc tccccacaca tgcagcaagc ccagcctctt cacatgccag 720 ggcgatgagt gcggcgctac cggtctttgc gataagaacg gctgcggcga gaacccctac 780 cgcagcggtg caaaggactt ctatggtcct ggcctcaaga ttgacaccca gaagcccttc 840 accgtcgtca cccagtttcc cgccgagaac ggtgtgcttc aatccattgg gcgcaagtac 900 gttcagaatg gcgttgtttt cgaggatcag cccaagaaca tcaccttaaa cgaccagttc 960 tgcaccgcca atgacgctac tatgttcatg aaccttggag gtatgaaggg catgggcgat 1020 gcgctaagcc gcggtatggt cctggctttg agtgtttggt gggacgagag taaattcatg 1080 aactggcttg acagcggtaa tgctggccca tgcaatgcta ctgagggcga ccccaagaac 1140 attgtcaagg tccaggctgc accttccgcg acgttctcca acatcaagtg gggtgaaatt 1200 ggctcgacct tcaagggcaa catgtga 1227 <210> 3 <211> 501 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Y4 ITS <400> 3 aaggatcatt acctagagtt gtaggctttg cctgctatct cttacccatg tcttttgagt 60 accttcgttt cctcggcggg tccgcccgcc gattggacaa tttaaaccat ttgcagttgc 120 aatcagcgtc tgaaaaaact taatagttac aactttcaac aacggatctc ttggttctgg 180 catcgatgaa gaacgcagcg aaatgcgata agtagtgtga attgcagaat tcagtgaatc 240 atcgaatctt tgaacgcaca ttgcgcccct tggtattcca tggggcatgc ctgttcgagc 300 gtcatttgta ccttcaagct ctgcttggtg ttgggtgttt gtctcgcctc tgcgcgtaga 360 ctcgcctcga aacaattggc agccggcgta ttgatttcgg agcgcagtac atctcgcgct 420 ctgcactcat aacgacgacg tccaaaagta catttttaca ctcttgacct cggatcaggt 480 agggataccc gctgaactta a 501 <210> 4 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GH5F1 primer <400> 4 ttcttcycyg gyaayga 17 <210> 5 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GH5F2 primer <400> 5 atyccwgtyg gytantc 17 <210> 6 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GH5R1-1 primer <400> 6 tcygartwng gytgyaa 17 <210> 7 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GH5R1-2 primer <400> 7 ttrcarccnw aytcrga 17 <210> 8 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GH5R2-1 primer <400> 8 tcyggyggyh tngtyta 17 <210> 9 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GH5R2-2 primer <400> 9 taracnadrc crccrga 17 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GH6F primer <400> 10 garccwgayw cyhtngsyaa 20 <210> 11 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GH6R-1 primer <400> 11 ggygarwgng ayggyrc 17 <210> 12 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GH6R-2 primer <400> 12 gyrccrtcnc sytcrcc 17 <210> 13 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GH7F1 primer <400> 13 garttcwcyt tcgaygt 17 <210> 14 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GH7F2 primer <400> 14 tanggyacyg gytantg 17 <210> 15 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GH7R1-1 primer <400> 15 tgygatscng ayggytg 17 <210> 16 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GH7R1-2 primer <400> 16 carccrtcng watcrca 17 <210> 17 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GH7R2-1 primer <400> 17 acygtygtya cycaatt 17 <210> 18 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GH7R2-2 primer <400> 18 aattgrgtra cracrgt 17 <210> 19 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GH9F primer <400> 19 ggytggtang atgcyga 17 <210> 20 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GH9R-1 primer <400> 20 tcytwnrtya cyggytangg 20 <210> 21 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GH9R-2 primer <400> 21 ccntarccrg traynsarga 20 <210> 22 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GH12F primer <400> 22 ggyatyaart cytancc 17 <210> 23 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GH12R-1 primer <400> 23 garatyacyt cytcyccwgg 20 <210> 24 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GH12R-2 primer <400> 24 ccsggrgarg argtratytc 20 <210> 25 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MJ65 primer <400> 25 tccttggatc aacggtgttg taagtag 27 <210> 26 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MJ66 primer <400> 26 cttgaggcca ggaccataga agtcc 25 <210> 27 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CSF primer <400> 27 gacgcgtaat acgactcact ataggga 27 <210> 28 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CSR primer <400> 28 atctccctat agtgagtcgt attacgcgtc 30 <210> 29 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MJ101 primer <400> 29 ctcgccttag ataaaagaca ggaggaacag cccaag 36 <210> 30 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MJ92 primer <400> 30 cactccgttc aagtcgactc acatgttgcc cttgaa 36 <210> 31 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LNK39 primer <400> 31 ggccgcctcg gcctctgctg gcctcgcctt agataaaaga 40 <210> 32 <211> 49 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GT50R primer <400> 32 tcattattaa atatatatat atatatattg tcactccgtt caagtcgac 49

Claims (13)

1. 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 엔도글루카나제.
   
2. 제1항에 있어서, 상기 엔도글루카나제는 포마(Phoma) 속 균주로부터 발현되는 것인 엔도글루카나제.
   
3. 제1항 또는 제2항의 엔도글루카나제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드.
   
4. 제3항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드는 서열번호 2의 염기서열로 표시되는 것인 폴리뉴클레오티드.
   
5. 제3항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현벡터.
   
6. 제5항에 있어서, 단백질융합인자(translational fusion partner: TFP)를 추가로 포함하는 것인 발현벡터.
   
7. 제5항의 발현벡터가 숙주세포에 도입되어 형질전환된 형질전환체.
   
8. 제7항에 있어서, 상기 숙주세포는 에탄올 발효능을 가지는 것인 형질전환체.
   
9. 제7항의 형질전환체를 배양하고, 이의 배양물 또는 배양상등액으로부터 엔도글루카나제를 회수하는 단계를 포함하는, 제1항 또는 제2항에 따른 엔도글루카나제의 생산방법.
   
10. (ｉ) 제5항의 발현벡터를 에탄올 발효능을 가지는 숙주세포에 도입하여 형질전환된 형질전환체를 수득하는 단계;
    (ⅱ) 상기 수득한 형질전환체를 엔도글루카나제의 기질을 포함하는 배양액에서 배양하는 단계; 및,
    (ⅲ) 상기 단계 (ⅱ)에서 수득한 배양물 또는 배양상등액으로부터 바이오 에탄올을 회수하는 단계를 포함하는, 바이오 에탄올의 생산방법.
    
11. 제10항에 있어서, 상기 에탄올 발효능을 가지는 숙주세포는 엑소글루카나제 또는 베타-글루코시다제를 각각 또는 동시발현하는 것인 바이오 에탄올의 생산방법.
    
12. 제10항에 있어서, 상기 기질은 글루칸(glucan) 또는 다당류(polysaccharide)인 것인 바이오 에탄올의 생산방법.
    
13. 제10항에 있어서, 상기 기질은 녹말, 덱스트란, 풀룰란 및 셀룰로오스로 구성된 그룹으로부터 선택되는 1종 이상인 것인 바이오 에탄올의 생산방법.

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