KR20120136035A - 바이오핀 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 바이오핀에 관한 것으로, 세포막 단백질을 중심으로 세포 침투 펩타이드와 점착 펩타이드가 결합된 형태의 융합 단백질로서, 세포 전달 및 치료, 세포의 추적, 특정 조직 및 세포의 표적화, 분자 영상 시스템, 의료도구 등에 사용할 수 있다.

Description

바이오핀{Biopin}
본 발명은 세포막 단백질을 중심으로 세포 침투 펩타이드와 점착 펩타이드가 결합된 형태의 융합 단백질로서, 세포 전달 및 치료, 세포의 추적, 특정 조직 및 세포의 표적화, 분자 영상 시스템, 의료도구 등에 사용할 수 있는 펩타이드성 바이오핀에 관한 것이다.
최근 줄기세포를 이용한 세포이식, 조직이식, 나노튜브(nanotubes), 나노선(nanowires), 마이크로 전기 기계장치(microelectromechanical systems, MEMS), 나노입자(nanoparticles), 바이오센서(biosensor), 바이오칩(biochip), 약물전달(drug delivery) 등의 분야에서 접착력 조절이 가능한 생체소재의 개발이 요구되고 있다(Nahar et al., 2006, Crit Rev Ther Drug Carrier Syst, 23, 259-318). 그러나 줄기세포 전달을 예로 들면, 심근경색 치료용 전달세포로 가능한 혈관전구세포(endothelial progenitor cells, EPCs)를 심근조직에 전달할 경우 전달 초기에 세포의 대부분 씻겨 나가고 전달된 세포의 3~5%만 대상 조직에 부착되어 있어 그 효율성이 매우 떨어진다(Aicher et al., 2003, Circulation, 107, 2134-2139). 대부분의 다른 전달 세포들도 비슷한 결과를 보여 이를 극복하기 위한 다양한 시도가 이루어지고 있으나 획기적인 방법은 전무하다. 특히 점착 단백질(adhesion protein)의 유전자 등을 세포에 전달하여 세포 부착(cell attachment) 효과를 증진시키고자 하는 연구가 함께 진행되고 있으나(Sheyn et al., 2010, Adv Drug Deliv Rev., 62, 683-698), 유전자 과발현(overexpression)된 세포는 유전적으로 변형된 세포(genetically modified cells)로 향후 임상 응용에 규제 대상이 될 가능성이 높아 이를 적용한 기술은 상용화되기 어렵다.
최근 다양한 분야에서 생체 친화적인 소재를 이용한 생체접착제(bioadhesives) 개발 연구를 진행하고 있다. 대표적으로 대두에서 채취한 접착제, Naturalock사의 우레탄폼 접착제(urethane-based foam adhesive), 전분계 접착제(starch-based adhesives), 섭조개(blue mussel. Mytilus Edulis) 유래 접착제, 홍합 유래 단백질 접착제 등이 공업용, 의료용으로 개발되고 있다(Ciannamea et al., 2010, Bioresour Technol, 101, 818-825; Luhrs and Geurtsen, 2009, Prog Mol Subcell Biol, 47, 359-380; Valenta, 2005, Adv Drug Deliv Rev, 57, 1692-1712; Silverman and Roberto, 2007, Mar Biotechnol, 9, 661-681). 그러나 이들 생체접착제는 에폭시나 페놀수지와 같은 다른 고분자 기반의 접착제에 비해 환경 친화적이지만 수술봉합용 또는 산업용 접착 용도의 훨씬 강력한 소재 개발에 주요 목적을 두고 있으며, 세포치료 및 이식용으로 전달하려는 세포에 직접 접착제를 발라 응용하기엔 부적합하다.
본 발명의 목적은 세포 점착 펩타이드를 이용하여 세포간 물리적 접착을 증가시킬 수 있는 펩타이드성 바이오핀, 이의 제조방법과 세포전달, 세포치료, 진단 및 치료 시스템 등의 나노 바이오 소재로서의 용도를 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 세포막 단백질;
상기 단백질에 결합된 하나 이상의 세포 침투 펩타이드(cell-penetrating peptide, CPP); 및
상기 단백질에 결합된 하나 이상의 세포 점착 펩타이드(cell adhesive peptide)를 포함하는 융합 단백질을 제공한다.
본 발명은 또한 본 발명에 따른 융합 단백질을 발현하는 재조합 벡터를 제공한다.
본 발명은 또한 본 발명에 따른 재조합 벡터로 형질도입된 형질전환체를 제공한다.
본 발명은 또한 본 발명에 따른 형질전환체의 배양물로부터 융합 단백질을 분리 정제하는 단계를 포함하는 본 발명의 융합 단백질의 제조방법을 제공한다.
본 발명은 또한 세포막 단백질;
상기 단백질에 결합된 하나 이상의 세포 침투 펩타이드(cell-penetrating peptide, CPP); 및
상기 단백질에 결합된 하나 이상의 세포 점착 펩타이드(cell adhesive peptide)를 포함하되,
상기 세포 침투 펩타이드에는 형광물질이 결합되어 있는 융합 단백질을 제공한다.
한 가지 실시예에 따르면, 상기 세포 침투 펩타이드에는 조직 특이적 결합성분 또는 약제학적 활성성분이 더 결합되어 있는 것을 특징으로 한다.
본 발명은 또한 형광물질이 결합된 본 발명에 따른 융합 단백질; 및
약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 조영제 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한 형광물질과 조직 특이적 결합성분이 결합된 본 발명에 따른 융합 단백질; 및
약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 표적 지향형 조영제 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한 형광물질과 약제학적 활성성분이 결합된 융합 단백질; 및
약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 진단 또는 치료용 조영제 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한 형광물질이 결합된 본 발명에 따른 융합 단백질; 및
진단 프로브를 포함하는 다중 진단 프로브를 제공한다.
본 발명은 또한 본 발명에 따른 융합 단백질; 및
줄기세포 또는 면역세포를 적어도 하나 포함하는 세포치료제를 제공한다.
본 발명은 또한 본 발명에 따른 융합 단백질; 및
내피세포 또는 혈관전구세포를 적어도 하나 포함하는 의료용 스텐트를 제공한다.
본 발명의 융합 단백질은 세포에 효과적으로 전달되고 세포간 물리적 결합을 증가시키는 바이오핀(biopin)으로서, 약물 또는 세포전달, 세포치료, 분자 영상, 의료도구 등에 응용 가능함으로써 진단이나 치료를 목적으로 하는 소재로서 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 세포막 단백질을 중심으로 N-말단과 C-말단에 RGD가 포함된 점착 펩타이드(adhesive peptide)와 세포 침투 펩타이드(cell-penetrating peptide)가 각각 융합되어 제조된 본 발명의 융합 단백질(도 1 상단 도면) 및 세포막 단백질을 중심으로 C-말단에 세포 침투 펩타이드가 융합되어 있어 세포간 결합이 이루어지지 않는 융합 단백질(하단 도면)을 도시한 것이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 융합 단백질(BPin-RGD)의 염기서열 및 아미노산 서열을 나타낸 것으로, 두 번째 줄의 네모 박스는 점착 펩타이드 RGD가 포함된 서열이고, 네 번째 줄의 네모 박스는 세포 침투 펩타이드의 일종인 TAT-CPP이고, 상기 박스 사이에 있는 서열은 오피오이드 수용체 델타의 트랜스멤스레인 도메인 1(opioid receptor delta transmembrane domain 1, OPRD)의 일부분이다.
도 3은 본 발명의 융합 단백질의 구조를 나타낸 것으로, BPin-RGD의 왼쪽 파란색 이탤릭체는 점착 펩타이드 RGD가 포함된 서열이고, 오른쪽 이탤릭체는 세포 침투 펩타이드이고 가운데 밑줄은 오피오이드 수용체 델타의 트랜스멤스레인 도메인 1의 일부이며, BPin-44은 C-말단에 세포 침투 펩타이드가 결합된 형태이다.
도 4는 본 발명의 융합 단백질(BPin-44 및 BPin-RGD)을 세포에 처리하여 얻은 공초점 현미경(confocal microscope) 사진도이다.
도 5 는 녹색 형광 염료(Green fluorescent dye, DiO)로 염색된 랫트의 중간엽 줄기세포(rat mesenchymal stem cells, MSCs)에 본 발명의 융합 단백질(BPin-RGD)을 처리하여 심장세포(cardiac cells H9c2)가 깔려 있는 배양 접시에 부착(adhesion)시켜 형광 분석기(fluorescent spectrometer)로 측정한 흡광/방출(484 nm/501 nm) 값을 계산하여 얻은 그래프이다.
이하, 본 발명의 구성을 구체적으로 설명한다.
본 발명은 세포내에서 생물학적인 변화를 예측하기 어렵고 부작용 우려가 있는 특정 유전자를 세포내로 전달하여 과발현시키는 방법이 아닌 단순한 세포간 물리적 결합을 증가시킬 수 있는 바이오핀(Biopin)을 개발하고자 하였다.
일반적으로, 세포전달 및 세포치료 기술에서 전달 세포가 대상 장기, 조직에 대해 초기에 얼마나 효과적으로 부착되느냐에 따라 치료 효과가 달라질 수 있다. 특정 유전자의 과발현 방법 또는 고분자 화합물을 이용해 전달 세포를 효율적으로 대상 조직에 전달하려는 다양한 시도는 이에 대한 반증이다. 따라서 종래의 유전자 조작 방법 혹은 고분자를 이용한 세포 전달 기술과 달리 전달 세포에 펩타이드성 핀을 꽂아 전달하려는 바이오핀의 개발은 세포전달 및 세포치료와 이를 응용한 나노 바이오 분야의 소재로서의 가능성을 제시한다고 하겠다.
따라서, 본 발명은 세포막 단백질;
상기 단백질에 결합된 하나 이상의 세포 침투 펩타이드(cell-penetrating peptide, CPP); 및
상기 단백질에 결합된 하나 이상의 세포 점착 펩타이드(cell adhesive peptide)를 포함하는 융합 단백질을 제공한다.
상기 융합 단백질은 세포막 단백질의 일 부분에 하나 이상의 세포 침투 펩타이드와 하나 이상의 세포 점착 펩타이드가 결합한 구조를 가지며, 보다 구체적으로 상기 세포 침투 펩타이드와 세포 점착 펩타이드는 각각 세포막 단백질의 양 말단에 결합될 수 있다.
본 명세서에서 "바이오핀, biopin"이란 생물학적 물질, 예를 들어, 세포를 고정하기 위한 융합 단백질을 말한다. 특히, 상기 바이오핀에 사용되는 세 가지 요소는 포유동물 세포의 특정 막단백질, 세포 침투 펩타이드 및 세포 점착 펩타이드로 이루어져 있고, 세포의 특정 막단백질이 머리부분을, 상기 막단백질의 양 말단에 결합된 세포 침투 펩타이드와 세포 점착 펩타이드는 각각 끝부분을 형성하는 핀 구조를 이루는 것이다. 보다 구체적으로, 세포의 특정 막단백질을 가운데 위치시키고, 이것의 세포 안쪽 부위(intracellular site)와 세포바깥쪽 부위(extracellular site) 양쪽에 세포 침투 펩타이드와 세포 점착 펩타이드가 융합(fusion) 되도록 하여 제작된 융합 단백질을 바이오핀으로 명명하였다. 상기 바이오핀을 세포에 전달하면 세포막에 위치하여 세포 안쪽 부위에 융합된 세포 침투 펩타이드는 세포 안쪽을 향하게 되고 바깥쪽 부위에 융합된 세포 점착 펩타이드는 세포 외부로 노출되어 대상 세포 또는 조직에 부착된다(도 1, 상단 도면 참조). 외부로 노출된 핀이 대상 세포 또는 조직에 부착되어 세포간 결합이 증가되는 것은 막단백질 세포 안쪽 도메인에만 세포 침투 펩타이드가 융합된 형태의 융합 단백질을 세포에 전달하면 세포막에 위치하게 되지만 세포 외부로 노출된 세포 점착 펩타이드가 없어 대상 세포 또는 조직에 꽂히지 않음을 통해 입증된다(도 1, 하단 도면 참조).
상기 세포막 단백질은 포유동물 세포의 막단백질이라면 특별히 제한하지는 않으나, 바람직하게는, 트랜스멤브레인 도메인이 좋다. 예를 들어, 오피오이드 수용체 델타의 트랜스멤브레인 도메인 1(opioid receptor delta transmembrane domain 1(OPRD TM1) 등을 포함한 세포 사멸 등에 영향을 주지 않는 세포막 단백질이라면 특별히 제한하지 않는다.
상기 세포 침투 펩타이드(cell-penetrating peptide(CPP) 또는 단백질 전달체(Protein Transduction Domain(PTD))는 이들과 화학적, 물리적 공유 또는 비공유 결합에 의하여 직접 또는 다른 매개체를 이용하여 간접적으로 연결된 특정 단백질, 바이러스, DNA, RNA, 지방, 탄수화물 또는 화학적 화합물을 진핵 또는 원핵 세포의 세포질 또는 핵내로 전달가능한 물질 펩타이드를 말한다.
상기 세포 침투 펩타이드는 특별히 제한하는 것은 아니나, 인간 면역결핍 바이러스 타입 I(HIV-1)에서 유래한 trans-activating transcriptional activator(Tat) 단백질, 초파리의 안테나페디아 호메오도메인(Antennapedia Homeodomain)인 Antp(Antennapedia 또는 penetratin) 펩타이드, 쥐의 전사인자의 Mph-1, HSV-1의 VP22 및 청어 프로타민의 HP4를 사용할 수 있다.
또한, 상기 세포 침투 펩타이드는 특정 세포 타입 또는 상태에 특이성을 갖는 세포-특이적 PTD를 포함할 수 있다. 이러한 세포-특이적 PTD의 한 예는 미국 특허공개 제2002-0102265호에 기재된 Hn1 합성 펩타이드이다.
또한, 상기 세포 침투 펩타이드는 합성 펩타이드일 수 있다. 이러한 합성 펩타이드의 한 예는 Ho 등이 HIV의 Tat 단백질이 단백질 전달 능력을 최적화하도록 Tat 단백질의 47-57 잔기를 변형한 펩타이드이다(Ho et al . (2001) Cancer Res 61(2):474-7).
본 발명의 구체적인 실시예에서, 세포 침투 펩타이드는 HIV의 Tat: YGRKKRRQRRR(서열번호 2)를 포함하고 있다.
상기 세포 점착 펩타이드는 조직 공학 및 상처 치료 분야에서 세포 성장 및 조직 형성을 위한 기계적 지지체로 스캐폴드를 이용할 때 세포 점착 또는 생체 특이 세포 점착을 향상시키기 위해 스캐폴드에 공유적으로 결합시켜 사용하는 생활성 리간드를 뜻하는 것으로, 서열번호 3(RGDS), 서열번호 4(KQAGDV), 서열번호 5(VAPG), 서열번호 6(YAVTGRGDSPAS, FIB1), 서열번호 7(ATLQLQEGRLHFXFDLGKGR, EF1zz), 서열번호 8(AGTFALRGDNPQG, A99) 또는 서열번호 9(GEFYFDLRLKGDKY, 531)에 기재된 아미노산 서열, 또는 상기 아미노산 서열을 적어도 하나 이상 포함하는 아미노산 서열, 예를 들어 서열번호 10(GRGDSP)의 아미노산 서열을 사용할 수 있으나, 이에 특별히 제한하는 것은 아니다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 본 발명의 융합 단백질은 세포 침투 펩타이드 및 세포 점착 펩타이드가 서열번호 1에 기재된 아미노산 서열을 갖는 세포막 단백질의 양 말단에 결합되어 있는 형태일 수 있다.
본 발명의 융합 단백질은 펩타이드를 합성하는 당해 분야의 공지된 방법에 의하여 제조할 수 있다. 예를 들어 유전자 재조합과 단백질 발현 시스템 또는 펩타이드 합성기 등을 통하여 시험관내에서 합성하는 방법에 의하여 제조할 수 있다.
따라서, 본 발명은 상기 융합 단백질을 발현하는 재조합 벡터를 제공한다.
본 발명에서 "재조합 벡터"란 적당한 숙주세포에서 목적 단백질을 발현할 수 있는 벡터로서, 유전자 삽입물이 발현되도록 작동가능하게 연결된 필수적인 조절 요소를 포함하는 유전자 작제물을 말한다.
상기 벡터는 플라스미드 벡터, 코즈미드 벡터, 박테리오파아지 벡터 및 바이러스 벡터 등을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 적합한 발현 벡터는 프로모터, 오퍼레이터, 개시코돈, 종결코돈, 폴리아데닐화 시그널 및 인핸서 같은 발현 조절 엘리먼트 외에도 막 표적화 또는 분비를 위한 시그널 서열 또는 리더 서열을 포함하며, 목적에 따라 다양하게 제조될 수 있다. 벡터의 프로모터는 구성적 또는 유도성일 수 있다. 또한, 발현벡터는 벡터를 함유하는 숙주세포를 선택하기 위한 선택마커를 포함하고, 복제가능한 발현벡터인 경우 복제 기원을 포함한다.
본 발명의 재조합 벡터는 바람직하게는 일반적인 대장균 균주 발현용 벡터, pHis/TAT에 세포막 단백질을 코딩하는 핵산을 삽입함으로써 제조될 수 있다. 본 발명의 바람직한 실시예에서는 대장균 발현용 벡터로 pHis/TAT를 사용하였지만 반드시 이에 한정되는 것은 아니며, 일반적으로 사용할 수 있는 모든 대장균주 발현용 벡터가 제한없이 사용될 수 있다.
본 발명의 바람직한 실시예에서는 대장균 균주 발현용 벡터인 pHis/TAT 벡터를 사용하여 본 발명의 OPRD TM1 도메인 코딩 유전자(서열번호 1), 세포 침투 펩타이드 코딩 유전자(서열번호 2) 및 세포 점착 펩타이드 코딩 유전자(서열번호 10)를 포함하는 DNA 절편을 삽입하여 재조합 벡터를 제조하였다(도 2 참조).
본 발명은 또한 본 발명의 융합 단백질을 발현하는 재조합 벡터로 형질도입된 형질전환체를 제공한다.
상기 형질전환은 핵산을 유기체, 세포, 조직 또는 기관에 도입하는 어떤 방법도 포함되며, 당 분야에서 공지된 바와 같이 숙주세포에 따라 적합한 표준 기술을 선택하여 수행할 수 있다. 이런 방법에는 전기충격유전자전달법(electroporation), 원형질 융합, 인산 칼슘(CaPO4) 침전, 염화 칼슘(CaCl2) 침전, 실리콘 카바이드 섬유 이용한 교반, 아그로박테리아 매개된 형질전환, PEG, 덱스트란 설페이트, 리포펙타민 등이 포함되나 이로 제한되지 않는다.
또한, 숙주세포에 따라서 단백질의 발현량과 수식 등이 다르게 나타나므로, 목적에 가장 적합한 숙주세포를 선택하여 사용하면 된다.
숙주세포로는 대장균(Escherichia coli), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 스트렙토마이세스(Streptomyces), 슈도모나스(Pseudomonas), 프로테우스 미라빌리스(Proteus mirabilis) 또는 스타필로코쿠스(Staphylococcus)와 같은 원핵 숙주 세포가 있으나 이로 제한되는 것은 아니다. 또한, 진균(예를 들어, 아스페르길러스(Aspergillus)), 효모(예를 들어, 피치아 파스토리스(Pichia pastoris), 사카로마이세스 세르비시애(Saccharomyces cerevisiae), 쉬조사카로마세스(Schizosaccharomyces), 뉴로스포라 크라사(Neurospora crassa))등과 같은 하등 진핵 세포, 곤충 세포, 식물 세포, 포유동물 등을 포함하는 고등 진핵생물 유래의 세포를 숙주세포로 사용할 수 있다.
상기 형질전환체는 상기 재조합 벡터를 임의의 숙주세포에 도입시킴으로써 용이하게 제조될 수 있다. 본 발명의 바람직한 실시예에서는 재조합 벡터 pHis/TAT를 대장균 균주 BL21(DE3)에 도입하여 형질전환체를 제조하였다.
본 발명은 또한 본 발명의 융합 단백질을 발현하는 재조합 벡터로 형질도입된 형질전환체의 배양물을 분리 정제하는 단계를 포함하는 융합 단백질의 제조방법을 제공한다.
상기 융합 단백질은 통상의 배양방법에 따라 형질전환체를 배양하여 정제하는 것이 바람직하다. 상기 융합 단백질은 재조합 벡터에 도입되는 인서트 즉, 코딩 유전자의 염기서열에 따라 사이토카인 생산능에 영향을 주지 않을 정도로 아미노산 서열의 일부에 얼마든지 변형이 있을 수 있다. 상기 변형은 결실, 삽입 또는 치환에 의한 변형을 의미한다.
본 발명은 또한 본 발명의 융합 단백질에 특이적으로 결합하는 다클론성 항체를 제공한다.
상기 다클론성 항체의 제조방법은 특별히 제한하지는 않으나, 다음의 방법에 따라 제조하는 것이 바람직하다.
본 발명의 융합 단백질을 SPF(specific pathogen free)동물에 1 내지 수회 주사하여 면역화시킨다. 최종 면역 후 일정 시간이 지난 뒤에 전혈하여 혈청만 취해 본 발명의 단백질에 대한 다클론성 항체를 얻는다.
상기 면역화 동물은 통상 면역화에 사용되는 동물이면 특별히 제한하지 않으나, 랫트인 것이 바람직하다. 상기 면역화를 위한 주사 횟수, 기간 및 투여방법은 당업자 수준에서 변형 또는 변경가능하므로 특별히 제한하지 않는다.
본 발명은 또한 세포막 단백질;
상기 단백질에 결합된 하나 이상의 세포 침투 펩타이드(cell-penetrating peptide, CPP); 및
상기 단백질에 결합된 하나 이상의 세포 점착 펩타이드(cell adhesive peptide)를 포함하되,
상기 세포 침투 펩타이드에는 형광물질이 결합되어 있는 융합 단백질에 관한 것이다.
상기 형광물질은 세포 침투 펩타이드와 화학적, 물리적 공유 또는 비공유 결합에 의하여 직접 또는 다른 매개체를 이용하여 간접적으로 연결될 수 있다.
상기 형광물질은 특별히 제한되지는 않으나, Dylight 488 NHE-ester dye, VybrantTM DiI, VybrantTM DiO, 양자점(quantum dots) 나노입자, 플루오로세인, 로다민, 루시퍼 엘로우, B-파이토에리쓰린, 9-아크리딘이소티오시아네이트, 루시퍼 엘로우 VS, 4-아세트아미도-4'-이소티오-시아나토스틸벤-2,2'-다이설폰산, 7-다이에틸아미노-3-(4'-이소티오시아토페닐)-4-메틸쿠마린, 석시니미딜-파이렌부티레이트, 4-아세트아미도-4'-이소티오시아나토스틸벤-2,2'-다이설폰산 유도체, LC™-Red 640, LC™-Red 705, Cy5, Cy5.5, 리사민, 이소티오시아네이트, 에리쓰로신 이소티오시아네이트, 다이에틸렌트리아민 펜타아세테이트, 1-다이메틸아미노나프틸-5-설포네이트, 1-아닐리노-8-나프탈렌 설포네이트, 2-소티토우이디닐-6-나프탈렌 설포네이트, 3-페닐-7-이소시아나토쿠마린, 9-이소티오시아나토아크리딘트, 크리딘 오렌지 9-이(소티(2-벤족사조일릴)페닐)멜레이미드 사디아졸, 스틸벤, 파이렌, 이벤도체, 형광 물질을 포함한 실리카, Ⅱ/Ⅳ족 반도체 양자점, Ⅲ/Ⅴ족 반도체 양자점, Ⅳ족 반도체 양자점, 또는 이다성분 혼성 구조체를 포함할 수 있으며, 바람직하게는 상기 형광물질은 양자점(quantum dots) 나노입자, Cy3.5, Cy5, Cy5.5, Cy7, ICG(indocyanine green), Cypate, ITCC, NIR820, NIR2, IRDye78, IRDye80, IRDye82, Cresy Violet, Nile Blue, Oxazine 750, Rhodamine800, 란탄나이드 계열 및 Texas Red로 구성되는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 사용할 수 있고, 상기 양자점(quantum dots) 나노입자인 경우에는 Ⅱ-Ⅵ 또는 Ⅲ-Ⅴ족 화합을 사용할 수 있다. 이 경우 상기 양자점 나노입자는 CdSe, CdSe/ZnS, CdTe/CdS, CdTe/CdTe, ZnSe/ZnS, ZnTe/ZnSe, PbSe,PbS InAs, InP, InGaP, InGaP/ZnS 및 HgTe로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나 이상인 것을 사용할 수 있다.
본 발명에 따른 융합 단백질은 세포 침투 펩타이드에 화학적, 물리적 공유 또는 비공유 결합에 의하여 직접 또는 다른 매개체를 이용하여 조직 특이적 결합성분을 도입함으로써 융합 단백질에 표적지향성을 제공할 수 있다.
상기 조직 특이적 결합성분은 특별히 제한하지는 않으나, 항원, 항체, RNA, DNA, 합텐(hapten), 아비딘(avidin), 스트렙타비딘(streptavidin), 뉴트라비딘(neutravidin), 프로테인 A, 프로테인 G, 렉틴(lectin), 셀렉틴(selectin), 방사선 동위원소 표지성분, 또는 종양 마커 등을 단독 또는 2종 이상 사용할 수 있다.
또는, 상기 세포 침투 펩타이드는 특정 세포 타입 또는 상태에 특이성을 갖는 세포-특이적 PTD, 예를 들어, 미국 특허공개 제2002-0102265호에 기재된 Hn1 합성 펩타이드를 포함하여 본 발명의 융합 단백질이 표적지향성을 가질 수 있다.
본 발명에 따른 융합 단백질은 세포 침투 펩타이드에 화학적, 물리적 공유 또는 비공유 결합에 의하여 직접 또는 다른 매개체를 이용하여 약제학적 활성성분을 도입함으로써 질병 치료에 사용할 수 있다.
상기 약제학적 활성성분은 특별히 제한하지는 않으나, siRNA, 안티센스, 항암제, 항생제, 호르몬, 호르몬길항제, 인터루킨, 인터페론, 성장 인자, 종양 괴사 인자, 엔도톡신, 림포톡시, 유로키나제, 스트렙토키나제, 조직 플라스미노겐 활성제, 프로테아제 저해제, 알킬포스포콜린, 방사선 동위원소로 표지된 성분, 심혈관계 약물, 위장관계 약물, 또는 신경계 약물 등을 단독 또는 2종 이상 사용할 수 있다.
상기 항암제로는 이에 특별히 제한하는 것은 아니나, 예를 들어, 에피루비신(Epirubicin), 도세탁셀(Docetaxel), 젬시타빈(Gemcitabine), 파클리탁셀(Paclitaxel), 시스플라틴(cisplatin), 카르보플라틴(carboplatin), 택솔(taxol), 프로카르바진(procarbazine), 시클로포스파미드(cyclophosphamide), 디악티노마이신(dactinomycin), 다우노루비신(daunorubicin), 에토포시드(etoposide), 탁목시펜(tamoxifen) 독소루비신(doxorubicin), 미토마이신(mitomycin), 블레오마이신(bleomycin), 플리코마이신(plicomycin), 트랜스플라티눔(transplatinum), 빈블라스틴(vinblastin), 또는 메토트렉세이트(methotrexate) 등을 사용할 수 있다.
본 발명은 또한 형광물질이 결합된 본 발명에 따른 융합 단백질; 및
약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 조영제 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 융합 단백질은 형광물질이 물리화학적으로 결합되어 있어 자기공명 및 광학 영상 장치 등을 통해 표적 부위의 이미징이 가능한 조영제로 사용할 수 있다.
상기 약제학적으로 허용가능한 담체는 의약 분야에서 통상 사용되는 담체 및 비히클을 포함하며, 구체적으로 이온 교환 수지, 알루미나, 알루미늄 스테아레이트, 레시틴, 혈청 단백질(예, 사람 혈청 알부민), 완충 물질(예, 각종 인산염, 글리신, 소르브산, 칼륨 소르베이트, 포화 식물성 지방산의 부분적인 글리세라이드 혼합물), 물, 염 또는 전해질(예, 프로타민 설페이트, 인산수소이나트륨, 인산수소캄륨, 염화나트륨 및 아연 염), 교질성 실리카, 마그네슘 트리실리케이트, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로즈계 기질, 폴리에틸렌 글리콜, 나트륨 카르복시메틸셀룰로즈, 폴리아릴레이트, 왁스, 폴리에틸렌 글리콜 또는 양모지 등을 포함하나 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명의 조영제 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 유화제, 현탁제, 또는 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다.
한 양태로서, 본 발명에 따른 조영제 조성물은 비경구 투여를 위한 수용성 용액으로 제조할 수 있으며, 바람직하게는 한스 용액(Hank's solution), 링거 용액(Ringer's solution) 또는 물리적으로 완충된 염수와 같은 완충 용액을 사용할 수 있다. 수용성 주입(injection) 현탁액은 소디움 카르복시메틸셀룰로즈, 솔비톨 또는 덱스트란과 같이 현탁액의 점도를 증가시킬 수 있는 기질을 첨가할 수 있다.
본 발명의 조영제 조성물의 다른 바람직한 양태는 멸균 주사용 수성 또는 유성 현탁액의 멸균 주사용 제제의 형태일 수 있다. 이러한 현탁액은 적합한 분산제 또는 습윤제(예를 들면 트윈 80) 및 현탁화제를 사용하여 본 분야에 공지된 기술에 따라 제형화할 수 있다.
또한, 상기 멸균 주사용 제제는 무독성의 비경구적으로 허용되는 희석제 또는 용매 중의 멸균 주사 용액 또는 현탁액(예를 들면 1,3-부탄디올 중의 용액)일 수 있다. 사용될 수 있는 비히클 및 용매로는 만니톨, 물, 링거 용액 및 등장성 염화나트륨 용액이 있다. 또한, 멸균 비휘발성 오일이 통상적으로 용매 또는 현탁화 매질로서 사용된다. 이러한 목적을 위해 합성 모노 또는 디글리세라이드를 포함하여 자극성이 적은 비휘발성 오일은 그 어느 것도 사용할 수 있다.
본 발명의 조영제 조성물은 진단 대상에서 분리한 조직 또는 세포에 투여하여 형광 융합 단백질이 발산하는 신호를 감지하여 영상을 수득하는데 이용될 수 있다.
상기 형광 융합 단백질에 의해 발산되는 신호를 감지하기 위해서는 자기공명영상장치(MRI)와 광학 이미징의 이용이 바람직하다.
자기공명영상장치는 강력한 자기장 속에 생체를 넣고 특정 주파수의 전파를 조사하여 생체조직에 있는 수소 등의 원자핵에 에너지를 흡수시켜 에너지가 높은 상태로 만든 후, 상기 전파를 중단하여 상기 수소 등의 원자핵 에너지가 방출되게 하고 이 에너지를 신호로 변환하여 컴퓨터로 처리하여 영상화한 장치이다. 자기 또는 전파는 골에 방해를 받지 않기 때문에 단단한 골 주위 또는 뇌나 골수의 종양에 대하여 종단, 횡단, 임의의 각도에서 선명한 입체적인 단층상을 얻을 수 있다. 특히 상기 자기공명영상장치는 T2 스핀-스핀 이완 자기공명영상장치인 것이 바람직하다.
본 발명은 또한 형광물질과 조직 특이적 결합성분이 결합된 본 발명에 따른 융합 단백질; 및
약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 표적 지향형 조영제 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 융합 단백질은 형광물질이 결합되어 있어 형광성을 가짐과 동시에 조직 특이적 결합성분이 상기 세포 침투 펩타이드에 결합되어 있어 표적지향이 가능하여 자기공명 및 광학 영상 장치 등을 통해 표적 부위의 이미징이 가능한 조영제로 사용할 수 있다.
본 발명은 또한 형광물질과 약제학적 활성성분이 결합된 융합 단백질; 및
약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 동시 진단 또는 치료용 조영제 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 융합 단백질은 약제학적 활성성분과 물리 화학적으로 결합하여 융합 단백질의 형광성을 동시에 포함하고 있어 자기공명 및 광학 영상 장치 등을 통해 생체 분자의 분리, 진단 또는 치료 등의 나노 프로브 및 약물 또는 유전자 전달체(delivery vehicle)등에 이용할 수 있다.
상기 융합 단백질을 이용한 생체 진단의 한 대표적인 예로서 분자 자기공명영상 진단 또는 자기 이완 센서(magnetic relaxation sensor)를 들 수 있다. 융합 단백질은 그 크기가 커짐에 따라 더 큰 T2 조영효과를 나타내는데, 이러한 성질을 이용하면 생체 분자를 검출하는 센서로 사용될 수 있다. 즉, 특정한 생체 분자가 융합 단백질의 엉김을 유도하게 되면 이에 의해 T2 자기 공명 영상 효과가 증대된다. 이러한 차이를 이용하여 생체 분자를 검출한다.
또한, 본 발명의 융합 단백질은 종양과 관련된 다양한 질병, 예를 들어 위암, 폐암, 유방암, 난소암, 간암, 기관지암, 비인두암, 후두암, 췌장암, 방광암, 결장암 및 자궁경부암을 진단 및/또는 치료하는데 이용될 수 있다.　
보다 구체적으로 설명하면, 종양 세포는 정상 세포에서는 거의 또는 전혀 생산되지 않는 특정 물질을 발현 및/또는 분비하는데 이들을 일반적으로 "종양 마커(tumor marker)"라 명명한다. 그러한 종양 마커와 특이적으로 결합할 수 있는 물질을 상기 융합 단백질의 세포 침투 펩타이드에 결합시켜 만든 융합 단백질은 종양 진단에 유용하게 이용될 수 있다.　당업계에는 다양한 종양 마커뿐만 아니라 이들과 특이적으로 결합할 수 있는 물질이 공지되어 있다.
또한 상기 종양 마커는 작용 기작에 따라 리간드, 항원, 수용체, 및 이들을 코딩하는 핵산으로 분류할 수 있다.
종양 마커가 "리간드"인 경우에는 상기 리간드와 특이적으로 결합할 수 있는 물질을 본 발명에 따른 융합 단백질에 도입할 수 있는데 상기 리간드와 특이적으로 결합할 수 있는 수용체 또는 항체가 적합할 것이다. 본 발명에서 이용 가능한 리간드 및 이와 특이적으로 결합할 수 있는 수용체의 예로는 시냅토타그민의 C2(synaptotagmin의 C2)와 포스파티딜세린, 아넥신 V(annexin V)와 포스파티딜세린, 인테그린(integrin)과 이의 수용체, VEGF(Vascular Endothelial Growth Factor)와 이의 수용체, 안지오포이에틴(angiopoietin)과 Tie2 수용체, 소마토스타틴(somatostatin)과 이의 수용체, 바소인테스티날 펩타이드(vasointestinal peptide)와 이의 수용체 등이 있지만 이에 제한되는 것은 아니다.
종양 마커가 "수용체"인 대표적인 예는 난소암 세포에서 발현되는 폴산 수용체가 있다. 상기 수용체와 특이적으로 결합할 수 있는 물질(폴산 수용체의 경우에는 폴산)이 본 발명에 따른 융합 단백질에 도입될 수 있는데 상기 수용체와 특이적으로 결합할 수 있는 리간드 또는 항체가 적합할 것이다.
종양 마커가 "항원"인 경우 상기 항원과 특이적으로 결합할 수 있는 물질을 본 발명에 따른 융합 단백질에 도입할 수 있는데 상기 항원과 특이적으로 결합할 수 있는 항체가 적합할 것이다. 본 발명에서 이용 가능한 항원 및 이와 특이적으로 결합하는 항체의 예로는 암성 태아성 항원(carcinoembryonic antigen - 대장암 표지 항원)과 허셉틴(Genentech, USA), HER2/neu 항원(HER2/neu antigen - 유방암 표지 항원)과 허셉틴, 전립선 특이 항원(prostate-specific membrane antigen - 전립선암 표지 항원)과 리툭산(IDCE/Genentech, USA) 등이 있다.
이러한 항체는 상업적으로 입수하거나 당업계에 공지된 방법에 따라 제조할 수 있다. 일반적으로 포유동물(예, 마우스, 랫트, 염소, 토끼, 말 또는 양)을 적절한 양의 항원으로 1회 이상 면역화시킨다.　 일정 시간 후 역가가 적정 수준에 이르렀을 때, 포유동물의 혈청으로부터 회수한다. 회수한 항체는 원하는 경우 공지된 공정을 이용하여 정제하고 사용 시까지 냉동 완충된 용액에 저장할 수 있다. 이러한 방법의 상세한 사항은 당업계에 잘 알려져 있다.
한편, 상기 "핵산"은 전술한 리간드, 항원, 수용체 또는 이의 일부분을 코딩하는 RNA 및 DNA를 포함한다. 핵산은 당업계에 알려진 바와 같이 상보적인 서열 간에 염기쌍(base pair)을 형성하는 특징을 갖고 있기 때문에 특정 염기서열을 갖는 핵산은 상기 염기서열에 상보적인 염기서열을 갖는 핵산을 이용하여 검출할 수 있다. 상기 효소, 리간드, 항원, 수용체를 코딩하는 핵산과 상보적인 염기서열을 갖는 핵산을 본 발명에 따른 융합 단백질에 도입할 수 있다.
또한, 핵산은 5'- 및 3'- 말단에 -NH2, -SH, -COOH 등의 작용기가 있어 세포 침투 펩타이드와 결합하는데 유용하게 이용될 수 있다.
이러한 핵산은 당업계에 공지된 표준 방법에 의해, 예를 들면 자동 DNA 합성기(예, 바이오써치, 어플라이드 바이오시스템스 등으로부터 구입할 수 있는 것)를 사용하여 합성할 수 있다. 예로서, 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오타이드는 문헌(Stein et al . Nucl . Acids Res. 1988, vol.16, p.3209)에 기술된 방법에 의해 합성할 수 있다. 메틸포스포네이트 올리고뉴클레오타이드는 조절된 유리 중합체 지지체를 사용하여 제조할 수 있다(Sarin et al . Proc . Natl . Acad . Sci . U.S.A. 1988, vol.85, p.7448).
본 발명은 또한 형광물질이 결합된 본 발명에 따른 융합 단백질; 및
진단 프로브를 포함하는 다중 진단 프로브에 관한 것이다.
상기 진단 프로브는 T1 자기공명 영상 진단 프로브, 광학 진단 프로브, CT 진단 프로브, 또는 방사선 동위원소 등을 사용할 수 있다.
상기 다중 진단 프로브는 예를 들면, 형광 융합 펩타이드에 T1 자기공명 영상 진단 프로브를 결합시키면 T2 자기공명영상 및 T1자기공명영상 진단을 동시에 진행할 수 있고, 광학 진단 프로브를 결합시키면 자기공명 영상과 광학 이미징을 동시에 할 수 있으며, CT 진단 프로브를 결합시키면 자기공명영상과 CT 진단을 동시에 할 수 있다. 또한 방사선 동위원소와 결합시키면 자기공명영상과 PET, SPECT 진단을 동시에 할 수 있다.
상기 T1 자기공명 영상 진단 프로브로는 Gd 화합물, 또는 Mn화합물 등을 포함하며, 광학 진단 프로브로는 유기 형광 염료(dye), 양자점, 또는 염료 표지(dye labelled) 무기 지지체(예 SiO2, Al2O3))를 포함하며, CT 진단 프로브로는 I(요오드) 화합물, 또는 금 나노 입자를 포함하고, 방사선 동위원소로는 In, Tc, 또는 F 등을 포함한다.
본 발명은 또한 본 발명에 따른 융합 단백질; 및
줄기세포 또는 면역세포를 적어도 하나 포함하는 세포치료제에 관한 것이다.
본 발명의 융합 단백질은 적어도 하나의 세포 침투 펩타이드에 의해 줄기세포 또는 면역세포 등과 결합되어 세포 내로 전달될 경우 표적 세포, 조직, 또는 장기의 세포막에 고정되어 상기 줄기세포 또는 면역세포 등이 장기간 고정됨으로써 세포치료제의 효율을 높이는 효과가 있다.
또한, 본 발명의 융합 단백질은 화학적, 물리적 공유 또는 비공유 결합에 의하여 직접 또는 다른 매개체를 이용하여 형광물질이 결합되어 세포 내로 전달될 경우 형광강도를 측정함으로써 세포추적이 가능하다.
또한, 본 발명의 융합 단백질은 화학적, 물리적 공유 또는 비공유 결합에 의하여 직접 또는 다른 매개체를 이용하여 조직 특이적 결합성분이 결합되어 세포 내로 전달될 경우 세포 표적지향성을 높일 수 있다.
또한, 본 발명의 융합 단백질은 화학적, 물리적 공유 또는 비공유 결합에 의하여 직접 또는 다른 매개체를 이용하여 약제학적 활성성분, 예를 들어, 심혈관 질환, 뇌질환 등의 억제 또는 치료용 약물이 결합되어 세포 내로 전달될 경우 세포의 치료적 효과를 높일 수 있다.
본 발명은 또한 본 발명에 따른 융합 단백질; 및
내피세포 또는 혈관전구세포를 적어도 하나 포함하는 의료용 스텐트에 관한 것이다.
본 발명의 융합 단백질은 적어도 하나의 세포 침투 펩타이드에 의해 내피세포 또는 혈관전구세포 등과 결합되어 세포 내로 전달될 경우 표적 세포, 조직, 또는 장기의 세포막에 고정되어 상기 내피세포 또는 혈관전구세포 등이 장기간 고정됨으로써 의료용 스텐트의 치료 효율을 높이는 효과가 있다.
또한, 본 발명의 융합 단백질은 화학적, 물리적 공유 또는 비공유 결합에 의하여 직접 또는 다른 매개체를 이용하여 형광물질이 결합되어 혈관 내로 전달될 경우 형광강도를 측정함으로써 스텐트 추적이 가능하다.
또한, 본 발명의 융합 단백질은 화학적, 물리적 공유 또는 비공유 결합에 의하여 직접 또는 다른 매개체를 이용하여 조직 특이적 결합성분이 결합되어 혈관 내로 전달될 경우 표적지향성을 높일 수 있다.
또한, 본 발명의 융합 단백질은 화학적, 물리적 공유 또는 비공유 결합에 의하여 직접 또는 다른 매개체를 이용하여 약제학적 활성성분, 예를 들어, 세포증식 억제 약물 등이 결합되어 혈관 내로 전달될 경우 스텐트의 치료적 효과를 높일 수 있다.
이하, 본 발명에 따르는 실시예 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하나, 본 발명의 범위가 하기 제시된 실시예에 의해 제한되는 것은 아니다.
<실시예 1> 재조합 방법에 따른 융합 단백질(바이오핀)의 제조
pHis/TAT 발현 벡터 (Kwon JH et al., 2007, Biochem Biophys Res Commun., 363, 399-404)를 이용하여 제조하였다. OPRD cDNA를 주형으로 하여 두 가지 프라이머, Primer-1, 5'-TCGTCCCATATG GGCCGCGGCGACAGCCCGGGATCCCTGGCAATCGCCATCACC-3' (밑줄 NdeI 부위) 및 Primer-2, 5'-AGGCATCTCGAGTTAGCGGCGGCGCTGGCGGCGTTTCTTGCGGCCGTAAGTGTACCGGACGATGCCGAA-3'(밑줄 XhoI 부위)를 이용하여 PCR 하여 DNA 단편을 얻고, 각각의 제한효소(BamHI/XhoI)로 잘라 pHis/TAT 발현 벡터에 넣어 대장균주 BL21(DE3)에서 발현한 후 Ni-NTA affinity chromatography를 사용하여 단백질을 분리 정제하였다. 이렇게 되면 372개의 아미노산으로 7개 트랜스멤브레인 도메인으로 구성된 OPRD 단백질의 첫 번째 도메인 부분인 48번째 아미노산(루신, L)부터 78번째 아미노산(트레오닌, T)까지 31개 아미노산으로 구성된 펩타이드를 중심으로 N-말단과 C-말단에 각각 점착 펩타이드(GRGDSP)와 TAT 세포 침투 펩타이드가 융합된 바이오핀(BPin-RGD)이 제조되었다(도 2 참조). 이때 대조군으로 31 아미노산으로 구성된 OPRD 펩타이드 한쪽에만 세포 침투 펩타이드가 위치하도록 제조하기 위해 Primer-1을 5'-TCGTCCCATATGGGATCCCTGGCAATCGCCATCACC-3'(밑줄 NdeI 부위)로 대신하여 PCR하여 같은 방법으로 제조하였다.
<실시예 2> 펩타이드 합성을 통한 융합 단백질(바이오핀)의 제조
본 발명의 융합 단백질은 펩타이드 합성기(peptide synthesizer)를 이용하여 제조할 수 있다. 도 3은 Bio-Synthesis 사(USA)에 의뢰하여 펩타이드 합성기로 합성된 것으로 OPRD 첫 번째 도메인 양쪽에 세포 점착 펩타이드와 세포 침투 펩타이드가 융합된 바이오핀(BPin-RGD)과 세포 침투 펩타이드가 한쪽에 융합된 BPin-44를 제조한 서열을 나타낸 것이다.
<실시예 3> 형광물질로 수식한 바이오핀의 세포로의 전달
DMEM 배지로 배양한 랫트 근아세포(rat cardiac myoblast) H9c2 세포를 마이크로튜브에 넣고 CellMask™ Plasma Membrane Stains(Invitrogen, USA)를 최종 5 ㎍/mL의 농도로 처리하여 37℃ CO2 배양기에서 30 분간 방치하였다. 이후 원심분리와 phosphate-buffered saline (PBS)로 3회 세척하고 다시 DMEM 배지 500 ㎕로 재현탁하여 준비하였다.
두 가지 펩타이드 (BPin-44, BPin-RGD)의 수식은 다음과 같이 시행하였다. DyLight405 NHS Ester(Thermo, USA)를 디메틸설포나마이드(dimethylformamide) 100 ㎕에 녹인 후 여기에 각각의 펩타이드 0.1 mg을 넣었다. 실온에서 1 시간 반응시킨 후 투석(Slide-A-Lyzer Mini Dialysis Units, Thermo, USA)을 실시하여 수식되지 않은 염료를 제거하였다.
위에서 염색으로 준비된 세포 (5×104 cells)에 수식된 각각의 펩타이드를 100 nM 처리한 후 37℃ CO2 배양기에서 1시간 방치하였다. 이후 원심분리와 PBS 세척을 3회 반복하였다.
공초점 현미경을 이용한 관찰을 위해, 세포 챔버에 마운팅 용액(mounting solution)(3 방울)을 처리한 후 LSM700 공초점 현미경(Carl Zeiss, Germany)을 사용하여 CellMask™ Plasma Membrane Stains(적색)(Abs 554/Em 567 nm), Dylight 405 NHE-ester(파란색)(Abs 400nm/Em420nm) 파장으로 관찰하였다.
도 4에 나타난 바와 같이, 두 가지 펩타이드 모두 세포막에 위치하는 것을 확인하였다.
<실시예 4> 바이오핀에 의한 세포간 결합 증가 효과
랫트의 심장 근아세포(Rat cardiac myoblast H9c2 세포)를 4-웰 챔버(Lab-Tek chamber slide)에 100% 차도록 배양하였다. CellMask™ Plasma Membrane Stains(Invitrogen, USA)를 최종 5 ㎍/mL의 농도로 처리하여 37℃ CO2 배양기에서 30 분간 반응시킨 후 PBS로 3회 세척하여 준비하였다.
랫트 중간엽 줄기세포(Rat mesenchymal stems cells, MSCs)는 MesenPRO(Gibco, USA) 배지로 배양 접시에서 배양한 후 트립신-EDTA와 트립신-중화 용액(trypsin-neutralizing solution)을 1:1 비율로 넣어 5분간 처리하여 세포를 떼어내서 세포 수식 염료(VybrantTM DiO, Invitrogen, USA)로 최종 2 ㎕/mL의 농도로 처리하여 37℃ CO2 배양기에서 30 분간 반응시킨 후 PBS로 3회 세척하고 1,200 rpm으로 3분간 원심분리하여 준비하였다.
여기에 상기 실시예 1에서 준비된 바이오핀을 최종 100 nM 농도로 처리한 후 37℃ CO2 배양기에서 1 시간 동안 좌우로 흔들면서 반응시킨 후 PBS로 3회 세척하고 원심분리하여 10% FBS가 포함된 DMEM 배지 400 ㎕ 처리하여 재현탁하였다. 이를 염색된 H9c2 세포 위에 뿌리고 37℃ CO2 배양기에서 10 분간 방치하였다. 이후 PBS로 여러 번 세척하여 H9c2에 부착되지 않은 MSCs를 제거하고 부착된 MSCs를 정량화하기 위해 0.1% 트리톤 X-100을 200 ㎕ 첨가한 후 5 분 후 걷어내 형광분석기 Victor3(Fluorescent Spectrometer Victor3, Perkin-Elmer, USA)를 사용해 Abs 484nm/Em 501nm 파장에서 측정하였다.
도 5에 나타난 바와 같이, 바이오핀 BPin-RGD가 전달된 실험군에서 세포간 결합이 현저히 증가되는 것을 확인하였다.
<110> Industry-Academic Cooperation Foundation, Yonsei University <120> Biopin <160> 10 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 31 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> DOMAIN <222> (1)..(31) <223> Human opioid receptor delta transmembrane 1 <400> 1 Leu Ala Ile Ala Ile Thr Ala Leu Tyr Ser Ala Val Cys Ala Val Gly 1 5 10 15 Leu Leu Gly Asn Val Leu Val Met Phe Gly Ile Val Arg Tyr Thr 20 25 30 <210> 2 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Tat peptide derived from HIV <400> 2 Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg 1 5 10 <210> 3 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> integrin ligand <400> 3 Arg Gly Asp Ser 1 <210> 4 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> adhesive peptide for vascular smooth muscle cells <400> 4 Lys Gln Ala Gly Asp Val 1 5 <210> 5 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> elastin-derived non-integrin ligand <400> 5 Val Ala Pro Gly 1 <210> 6 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> adhesive peptide from fibronectin <400> 6 Tyr Ala Val Thr Gly Arg Gly Asp Ser Pro Ala Ser 1 5 10 <210> 7 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> adhesive peptide from collagen alpha1 (IV) chain <400> 7 Ala Thr Leu Gln Leu Gln Glu Gly Arg Leu His Phe Xaa Phe Asp Leu 1 5 10 15 Gly Lys Gly Arg 20 <210> 8 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> adhesive peptide from collagen alpha1 (IV) chain <400> 8 Ala Gly Thr Phe Ala Leu Arg Gly Asp Asn Pro Gln Gly 1 5 10 <210> 9 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> adhesive peptide from collagen alpha1 (IV) chain <400> 9 Gly Glu Phe Tyr Phe Asp Leu Arg Leu Lys Gly Asp Lys Tyr 1 5 10 <210> 10 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> integrin ligand <400> 10 Gly Arg Gly Asp Ser Pro 1 5

Claims (20)

  1. 세포막 단백질;
    상기 단백질에 결합된 하나 이상의 세포 침투 펩타이드(cell-penetrating peptide, CPP); 및
    상기 단백질에 결합된 하나 이상의 세포 점착 펩타이드(cell adhesive peptide)를 포함하는 융합 단백질.
  2. 제1항에 있어서,
    세포막 단백질은 오피오이드 수용체 델타의 트랜스멤브레인 도메인 1(opioid receptor delta transmembrane domain 1(OPRD TM1)를 포함하는 융합 단백질.
  3. 제1항에 있어서,
    세포 침투 펩타이드는 trans-activating transcriptional activator(Tat), Antp, Mph-1, VP22 및 HP4로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상인 융합 단백질.
  4. 제1항에 있어서,
    세포 점착 펩타이드는 서열번호 3(RGDS), 서열번호 4(KQAGDV), 서열번호 5(VAPG), 서열번호 6(YAVTGRGDSPAS, FIB1), 서열번호 7(ATLQLQEGRLHFXFDLGKGR, EF1zz), 서열번호 8(AGTFALRGDNPQG, A99) 또는 서열번호 9(GEFYFDLRLKGDKY, 531)에 기재된 아미노산 서열, 또는 상기 아미노산 서열을 적어도 하나 이상 포함하는 아미노산 서열인 융합 단백질.
  5. 제1항에 있어서,
    융합 단백질은 세포 침투 펩타이드 및 세포 점착 펩타이드가 서열번호 1에 기재된 아미노산 서열을 갖는 세포막 단백질의 양 말단에 결합되어 있는 융합 단백질.
  6. 제1항에 따른 융합 단백질을 발현하는 재조합 벡터.
  7. 제6항에 따른 재조합 벡터로 형질도입된 형질전환체.
  8. 제7항에 따른 형질전환체의 배양물로부터 융합 단백질을 분리 정제하는 단계를 포함하는 제1항의 융합 단백질의 제조방법.
  9. 세포막 단백질;
    상기 단백질에 결합된 하나 이상의 세포 침투 펩타이드(cell-penetrating peptide, CPP); 및
    상기 단백질에 결합된 하나 이상의 세포 점착 펩타이드(cell adhesive peptide)를 포함하되,
    상기 세포 침투 펩타이드에는 형광물질이 결합되어 있는 융합 단백질.
  10. 제9항에 있어서,
    형광물질은 Dylight 488 NHE-ester dye, VybrantTM DiI, VybrantTM DiO, 양자점(quantum dots) 나노입자, Cy3.5, Cy5, Cy5.5, Cy7, ICG(indocyanine green), Cypate, ITCC, NIR820, NIR2, IRDye78, IRDye80, IRDye82, Cresy Violet, Nile Blue, Oxazine 750, 로다민 800, 란탄나이드 및 텍사스 레드로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상인 융합 단백질.
  11. 제9항에 있어서,
    세포 침투 펩타이드에는 조직 특이적 결합성분이 추가로 결합되어 있는 융합 단백질.
  12. 제11항에 있어서,
    조직 특이적 결합성분은 항원, 항체, RNA, DNA, 합텐(hapten), 아비딘(avidin), 스트렙타비딘(streptavidin), 뉴트라비딘(neutravidin), 프로테인 A, 프로테인 G, 렉틴(lectin), 셀렉틴(selectin), 방사선 동위원소 표지성분 및 종양 마커와 특이적으로 결합할 수 있는 물질로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상인 융합 단백질.
  13. 제9항에 있어서,
    세포 침투 펩타이드에는 약제학적 활성성분이 추가로 결합되어 있는 융합 단백질.
  14. 제13항에 있어서,
    약제학적 활성성분은 siRNA, 안티센스, 항암제, 항생제, 호르몬, 호르몬길항제, 인터루킨, 인터페론, 성장 인자, 종양 괴사 인자, 엔도톡신, 림포톡시, 유로키나제, 스트렙토키나제, 조직 플라스미노겐 활성제, 프로테아제 저해제, 알킬포스포콜린, 방사선 동위원소로 표지된 성분, 심혈관계 약물, 위장관계 약물 및 신경계 약물로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상인 융합 단백질.
  15. 제9항에 따른 융합 단백질; 및
    약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 조영제 조성물.
  16. 제11항에 따른 융합 단백질; 및
    약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 표적 지향형 조영제 조성물.
  17. 제13항에 따른 융합 단백질; 및
    약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 동시 진단 또는 치료용 조영제 조성물.
  18. 제9항에 따른 융합 단백질; 및
    진단 프로브를 포함하는 다중 진단 프로브.
  19. 제1항에 따른 융합 단백질; 및
    줄기세포 또는 면역세포를 적어도 하나 포함하는 세포치료제.
  20. 제1항에 따른 융합 단백질; 및
    내피세포 또는 혈관전구세포를 적어도 하나 포함하는 의료용 스텐트.
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