KR20120135122A - 비펩타이드성 중합체-인슐린 다량체 및 이의 제조방법 - Google Patents

비펩타이드성 중합체-인슐린 다량체 및 이의 제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 비펩타이드성 중합체와 인슐린이 공유결합으로 연결된 2개 이상의 비펩타이드성 중합체-인슐린 결합체가 코발트 이온에 의해 결합되어 다량체를 형성한, 비펩타이드성 중합체-인슐린 다량체, 상기 다량체를 제조하는 방법 및 제조용 키트, 상기 다량체를 유효성분으로 포함하는 당뇨병의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물 및 상기 조성물을 당뇨병이 발병한 또는 발병 가능성이 있는 개체에게 투여하여 당뇨병을 예방하거나 치료하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 다량체는 피하주사 후 자연 희석에 의해 단량체로 분리되기 전까지는 큰 용적으로 인해 혈중으로의 빠른 흡수가 일어나지 않아 약물의 1회 다량투여가 가능하며, 단량체로 서서히 분리되는 성질을 보이므로 지속형 인슐린 제형 개발에 유용하다.

Description

비펩타이드성 중합체-인슐린 다량체 및 이의 제조방법{Non-Peptidyl Polymer-Insulin Multimer and Method for Producing the Same}
본 발명은 비펩타이드성 중합체와 인슐린이 공유결합으로 연결된 2개 이상의 비펩타이드성 중합체-인슐린 결합체가 코발트 이온에 의해 결합되어 다량체를 형성한, 비펩타이드성 중합체-인슐린 다량체, 상기 다량체를 제조하는 방법 및 제조용 키트, 상기 다량체를 유효성분으로 포함하는 당뇨병 예방 또는 치료용 약제학적 조성물 및 상기 조성물을 개체에 투여하여 당뇨병을 예방하거나 치료하는 방법에 관한 것이다.
인슐린(insulin)은 51개의 아미노산으로 이루어져 있으며, 분자량은 5808 달톤(Da)이다. 인슐린은 췌장의 랑게르한스(islets of Langerhans) 베타세포에서 생산되며, 생물학적 활성을 지닌 단량체(monomer) 형태로 혈관에 흡수되기 전까지 육합체(hexamer)로 저장된다. 이러한 육합체의 형성은 아연(zinc) 이온의 배위결합 및 세 개의 이량체(dimer) 간의 소수적 결합 (hydrophobic interaction)에 의해 촉진된다. 육합체 내에는 두 곳의 금속이온 결합 부위가 존재하며, 각 부위는 세 개의 이량체로부터 유래하는 세 개의 히스티딘 잔기가 관여한다. 상기 결합 부위는 인슐린 육합체의 구조적 상태(T or R state)에 따라 육합체 양쪽 끝에 각각 존재하거나 표면에서 중심으로 이어지는 터널 구조의 바닥면에 존재한다.
현재 상용화된 대부분의 재조합 인슐린 및 인슐린 변이체(insulin analogue)는 육합체 제형을 이용하고 있다. 즉, 육합체 형성을 촉진하는 아연과 페놀(또는 크레솔)이 함유된 완충액에 인슐린 3 mg/㎖ 이상의 농도로 조제된다. 단량체에 비해 육합체 제형은 섬유화(fibrillation) 및 아미노기 이탈반응(deamination)에 대한 우수한 저항성을 제공함으로써 인슐린의 안정성을 높이고 유통기한을 연장한다. 더욱이, 육합체로 제형된 인슐린은 피하주사 시 단량체에 비해 상대적으로 느린 혈관흡수 양상을 보이기 때문에 지속형 약물학적 효과를 일으키는데 유리하다. 기존 연구에 따르면, 느린 흡수율은 주사 부위(depot)에서의 분자 크기와 모세혈관 투과율(capillary permeability) 간의 반비례 관계에 의해 설명된다(Kang et al., 1991). 육합체의 이러한 특성은 최근에 개발된 지속형 인슐린 변이체에도 적용되어 피하주사 후 인슐린의 흡수가 지연 또는 지속되는 효과를 유발하였다. 대표적인 예는 천연형 인슐린의 B 체인 29번 라이신(lysine)에 지방산 체인(fatty acid chain)이 부착된 인슐린 디터머(insulin detemir)이다(Havelund et al., 2004). 해당 연구에 따르면, 주사된 인슐린 디터머는 체내에서 이중 육합체(dihexamer)를 형성하는 한편 알부민(albumin)과의 소수성 결합을 통해 거대 분자 복합체(large molecular complex)를 형성하였다. 이에 따라, 피하 투여된 약물의 절반이 피하에서 모세혈관벽(capillary wall)을 통과하여 혈중으로 흡수되는 시간(subcutaneous half-life)이 천연형 인슐린 육합체에 비해 네 배 이상 길어졌다.
그러나, 육합체 제형은 인슐린 B 체인의 첫 번째 아미노산인 페닐알라닌이 변형된 인슐린 변이체에는 적용될 수 없는 한계를 지닌다. 이는 육합체 구조를 안정화시키는 데에 관여하는 페닐알라닌 잔기의 성질이 변형되었기 때문이다. 페길화된 인슐린(PEGylated insulin)을 사용한 기존 연구에 따르면(Hinds, et al., 2000), 750 Da 또는 2,000 Da 크기의 PEG가 인슐린 B 체인의 아미노 말단에 부착된 인슐린 변이체를 UV-원편광 이색성 분광 측정법(UV-circular dichroism)과 침강평형(sedimentation equilibrium)법을 사용하여 분석한 결과 0.1-1.0 mM 농도 범위에서 대부분 단량체로 존재함이 확인되었다. 반면, 해당 농도 범위에서 천연형 인슐린은 대개 육합체 형태로 존재한다. 즉, 페길화된 인슐린을 육합체로 제형화하여 피하주사 후 인슐린의 흡수가 지속되는 효과를 얻기가 어려워졌다. 이러한 인슐린 변이체의 또 다른 예로는 알부민-인슐린 결합체(albumin-insulin conjugate), 당화 인슐린(glycosylated insulin) 등이 있다. 따라서, 이러한 인슐린 변이체들의 안정성, 지속성 등의 약물학적 특성을 향상시키기 위한 인슐린 변이체의 다량체 형성을 유도하는 제형의 개발이 요구된다.
이에 본 발명자들은 코발트 이온을 사용하여 PEG-인슐린 육합체 형성을 유도한 후 이의 약물학적 특성을 검토한 결과, PEG-인슐린 육합체가 마이크로몰(M) 농도에서 나노몰(nM) 농도로 점진적 희석이 일어남에 따라 단량체로 서서히 분리되었으며, PEG-인슐린 결합체 및 인슐린 다량체에 비해 수력학적 용적이 크게 늘어나고, 상용화된 지속형 인슐린에 비해 안정한 육합체 형성이 가능함을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 비펩타이드성 중합체와 인슐린이 공유결합으로 연결된 2개 이상의 비펩타이드성 중합체-인슐린 결합체가 코발트 이온에 의해 결합되어 다량체를 형성한, 비펩타이드성 중합체-인슐린 다량체를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 비펩타이드성 중합체-인슐린 결합체들을 코발트 이온을 함유하는 용액과 반응시켜 비펩타이드성 중합체-인슐린 다량체를 생성하는 단계를 포함하는, 상기 비펩타이드성 중합체-인슐린 다량체의 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 비펩타이드성 중합체-인슐린 다량체를 유효성분으로 포함하는 당뇨병의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 약제학적 조성물을 당뇨병이 발병한 또는 발병 가능성이 있는 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 인간을 제외한 동물의 당뇨병의 예방 또는 치료방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 비펩타이드성 중합체와 인슐린이 공유결합으로 연결된 비펩타이드성 중합체-인슐린 결합체; 및 코발트 이온을 함유하는 용액을 포함하되, 상기 용액은 수용액 용해시 코발트 2가 이온을 해리하는 염 및 산화제; 수용액 용해시 코발트 2가 이온을 해리하는 염의 수화물 및 산화제; 또는 수용액 용해시 코발트 3가 이온을 해리하는 염 또는 이의 수화물을 포함하는 것인 상기 비펩타이드성 중합체-인슐린 다량체 제조용 키트를 제공하는 것이다.
하나의 양태로서, 본 발명은 비펩타이드성 중합체와 인슐린이 공유결합으로 연결된 2개 이상의 비펩타이드성 중합체-인슐린 결합체가 코발트 이온에 의해 결합되어 다량체를 형성한, 비펩타이드성 중합체-인슐린 다량체를 제공한다.
본 발명에서 용어, "비펩타이드성 중합체-인슐린 결합체"는 비펩타이드성 중합체와 인슐린이 공유결합으로 연결된 것을 의미하며, 본 발명에서 상기 비펩타이드성 중합체-인슐린 결합체는 비펩타이드성 중합체-인슐린 다량체의 구성요소인 단량체로서 역할을 한다. 바람직하게, 상기 비펩타이드성 중합체-인슐린 결합체는 인슐린의 A 체인 아미노 말단, B 체인 아미노 말단 또는 B 체인 29번 라이신과 비펩타이드성 중합체가 공유결합으로 연결된 결합체일 수 있으며, 보다 바람직하게는 인슐린의 B 체인 아미노 말단과 비펩타이드성 중합체가 공유결합으로 연결된 결합체일 수 있다.
본 발명에서 용어, "인슐린"은 체내의 혈당이 높을 때 췌장에서 분비되어 간, 근육, 지방 조직에서 당을 흡수하여 글리코겐으로 저장하며, 지방을 분해하여 에너지원으로 사용되는 것을 억제하여 혈당을 조절하는 기능을 가지는 펩타이드를 의미한다. 이러한 펩타이드는 천연형 인슐린, 인슐린 아고니스트(agonist), 전구물질(precursor), 유도체(derivatives), 단편(fragments), 변이체(variants) 등을 포함한다.
본 발명에서 용어, "천연형 인슐린"은 췌장에서 분비되는 호르몬으로서 일반적으로 세포 내 글루코스 흡수를 촉진하고 지방의 분해를 억제하여 체내의 혈당을 조절하는 역할을 한다. 인슐린은 혈당조절 기능이 없는 프로인슐린(Proinsulin) 전구체의 형태에서 프로세싱을 거쳐 혈당조절 기능을 가지는 인슐린이 된다. 인슐린 아미노산 서열은 아래와 같다 :
A 체인 :
Gly-Ile-Val-Glu-Gln-Cys-Cys-Thr-Ser-Ile-Cys-Ser-Leu-Tyr-Gln-Leu-Glu-Asn-Tyr-Cys-Asn (서열번호 1)
B 체인 :
Phe-Val-Asn-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala-Leu-Tyr-Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Pro-Lys-Thr (서열번호 2)
상기 천연형 인슐린은 A 체인과 B 체인이 두 개의 이황화 결합(inter-disulfide bond)으로 연결된 헤테로다이머(heterodimer)로서, A 체인의 6번 시스테인과 B 체인의 7번 시스테인, A 체인의 20번 시스테인과 B 체인의 19번 시스테인이 각각 이황화 결합을 이루고 있다.
본 발명에서 용어, "인슐린 아고니스트"는 인슐린의 구조와 상관없이 인슐린의 생체 내 수용체에 결합하여 인슐린과 동일한 생물학적 활성을 나타내는 물질을 의미한다.
본 발명에서 용어, "인슐린 변이체"는 천연형 인슐린과 아미노산 서열이 하나 이상 다른 펩타이드로서, 체내에서 혈당조절 기능을 보유한 펩타이드를 의미한다. 상기 인슐린 변이체는 천연형 인슐린에서 일부 아미노산이 치환(substitution), 추가(addition), 제거(deletion) 및 수식(modification) 중에 어느 하나의 방법 또는 이들 방법의 조합을 통해 제조될 수 있다.
본 발명에서 용어, "인슐린 유도체"는 천연형 인슐린과 비교시 최소한 80% 이상 아미노산 서열에서 상동성을 보이며, 아미노산 잔기의 일부 그룹이 화학적으로 치환(예; alpha-methylation, alpha-hydroxylation), 제거(예; deamination) 또는 수식(예; N-methylation)된 형태일 수 있고, 체내에서 혈당을 조절하는 기능을 보유한 펩타이드를 의미한다.
본 발명에서 용어, "인슐린 단편"은 인슐린의 아미노 말단 또는 카르복시 말단에 하나 또는 그 이상의 아미노산이 추가 또는 삭제된 형태를 의미하며 추가된 아미노산은 천연에 존재하지 않는 아미노산(예; D형 아미노산)도 가능할 수 있고, 이러한 인슐린 단편은 체내에서 혈당조절 기능을 보유한다.
본 발명에서 용어, "비펩타이드성 중합체"는 반복 단위가 2개 이상 결합된 생체 적합성 중합체를 의미하며, 상기 반복 단위들은 펩타이드 결합이 아닌 임의의 공유결합을 통해 서로 연결된다. 상기 비펩타이드성 중합체의 분자량은 1 내지 100 kDa 일 수 있으며, 바람직하게는 1 내지 20 kDa 일 수 있다.
또한, 상기 비펩타이드성 중합체는 단백질과 결합할 수 있는 단일 말단 또는 양 말단 반응기를 가질 수 있다. 바람직하게, 상기 반응기는 알데히드, 프로피온 알데히드, 부틸 알데히드, 말레이미드 및 석시니미드 유도체로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 특히, 상기 비펩타이드성 중합체가 양 말단에 반응 알데히드 그룹의 반응기를 갖는 경우, 비특이적 반응을 최소화하고, 비펩타이드성 중합체의 양 말단과 인슐린 및 면역글로불린과 각각 결합하는데 효과적이다. 알데히드 결합에 의한 환원성 알킬화로 생성된 최종 산물은 아미드 결합으로 연결된 것보다 훨씬 안정적이다. 알데히드 반응기는 낮은 pH에서 아미노 말단에 선택적으로 반응하며, 높은 pH, 예를 들어 pH 9.0 조건에서는 라이신 잔기와 공유결합을 형성할 수 있다.
바람직하게, 본 발명에서 사용가능한 비펩타이드성 중합체는 생분해성 고분자, 지질 중합체, 키틴류, 히아루론산 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택될 수 있으며, 보다 바람직하게 상기 생분해성 고분자는 폴리에틸렌 글리콜, 폴리프로필렌 글리콜, 에틸렌 글리콜과 프로필렌 글리콜의 공중합체, 폴리옥시 에틸화 폴리올, 폴리비닐 알콜, 폴리사카라이드, 덱스트란, 폴리비닐 에틸 에테르, 폴리락트산(PLA, polylactic acid) 또는 폴리락틱-글리콜산(PLGA, polylactic-glycolic acid)일 수 있고, 보다 더 바람직하게는 폴리에틸렌 글리콜(PEG)일 수 있다. 또한, 당해 분야에 이미 알려진 이들의 유도체 및 당해 분야의 기술 수준에서 용이하게 제조할 수 있는 유도체들도 본 발명의 범위에 포함될 수 있다. 예를 들어, L-gamma-glutamate가 결합된 비펩타이드성 중합체를 사용할 경우 L-gamma-glutamate 간의 상호 결합력으로 인해 고분자성 인슐린 집합체 형성에 유리하게 작용할 수 있다.
본 발명에서 용어, "비펩타이드성 중합체-인슐린 다량체" 또는 "코발트 비펩타이드성 중합체-인슐린 다량체"는 단량체인 비펩타이드성 중합체-인슐린 결합체들이 코발트 이온에 의해 결합되어 형성된 다량체로서, 코발트 이온이 비펩타이드성 중합체-인슐린 다량체 한 분자와 배위적 결합을 이룬 화합물을 포함한다.
바람직하게, 상기 비펩타이드성 중합체-인슐린 다량체는 이량체 내지 육량체 일 수 있으며, 바람직하게는 육량체(비펩타이드성 중합체-인슐린 육합체)일 수 있다.
상기 비펩타이드성 중합체-인슐린 다량체는 바람직하게는 3가의 양이온을 띤 코발트 이온에 의해 형성된 다량체일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 3가 양이온을 띤 코발트 이온은 배위결합을 형성하는 금속 이온으로서 사용되어 상기 인슐린 결합체를 다량체 형태로 만들 수 있다. 바람직하게는 3가 양이온을 띤 코발트 이온이 인슐린 B 체인의 10번 아미노산(B10His)에서 팔면체 배위(octahedral coordination)를 형성하여 인슐린 결합체를 연결시킬 수 있다.
본 발명의 구체적인 예로서, 비펩타이드성 중합체-인슐린 다량체 중 하나인 비펩타이드성 중합체-인슐린 육합체는 두 개 또는 그 이상의 코발트 3가 이온이 인슐린 육합체 한 분자와 배위적 결합을 이룬 화합물을 포함한다. 도넛형 단면을 지닌 원통형의 인슐린 육합체는 자연계에서 주로 아연 2가 이온의 배위결합과 세 개의 인슐린 이량체 사이의 소수성 결합 (hydrophobic interaction)에 의해 형성될 수 있다. 하나의 인슐린 육합체에는 두 곳의 금속 이온 결합 부위가 존재하며, 각각은 세 개의 이량체로부터 유래하는 세 개의 히스티딘 (B 체인의 10번 아미노산)이 관여할 수 있다. 상기 금속 이온 결합 부위에 코발트 3가 이온이 존재하여, 본 발명의 비펩타이드성 중합체-인슐린 육합체의 구조를 안정화시킬 수 있다.
이러한 본 발명의 비펩타이드성 중합체-인슐린 다량체는 비펩타이드성 중합체-인슐린 결합체 및 코발트 인슐린 다량체에 비해 수력학적 용적이 훨씬 크며, 단량체로 서서히 분리되는 특성을 가지고 있어 생체 지속성 및 안정성이 우수한 이점이 있으므로, 당뇨병 치료에 유용하다.
본 발명의 일 실시예에서는 인슐린 B 체인의 아미노 말단에 단일 페길화된 비펩타이드성 중합체-인슐린 결합체를 제조하였으며(실시예 1 및 2), 이의 in vitro 활성을 확인하였다(실시예 3).
또한, 상기 결합체와 코발트 이온을 이용하여 육합체(코발트 PEG-인슐린 육합체)를 제조하였을때, 수력학적 용적이 크게 증가하였다(실시예 4 및 5). 상기 코발트 PEG-인슐린 육합체는 0.04 μM의 낮은 농도에서도 20%의 육합체 비율을 보인 코발트 인슐린 육합체와 달리, 70% 이상의 육합체 비율을 보여 낮은 농도에서도 육합체 제형을 형성시킬 수 있어 안정할 뿐만 아니라(실시예 6), 인슐린 디터머로 구성된 레버머 및 인슐린 B 체인에 치환 및 삽입이 일어난 인슐린 글라긴(glargine)이 육합체로 존재하는 란투스(Lantus)와 같은 상용 지속형 인슐린에 비하여 짧은 용출 시간 및 낮은 분리계수를 보여 상기 상용 인슐린에 비해 피하 주사 후 큰 용적 및 안정한 육합체 결합을 유지할 수 있음을 나타내었다(실시예 7). 이러한 결과는 본 발명의 비펩타이드성 중합체-인슐린 다량체가 우수한 생체 지속성 및 안정성을 지녀, 상기 다량체 또는 이를 포함하는 조성물이 당뇨병의 치료에 있어 유용하게 사용될 수 있음을 뒷받침하는 것이다.
다른 하나의 양태로서, 본 발명은 비펩타이드성 중합체-인슐린 결합체들을 코발트 이온을 함유하는 용액과 반응시켜 비펩타이드성 중합체-인슐린 다량체를 생성하는 단계를 포함하는, 본 발명에 따른 비펩타이드성 중합체-인슐린 다량체의 제조방법을 제공한다.
본 발명은 제조된 비펩타이드성 중합체-인슐린 결합체들을 코발트 이온을 함유하는 용액과 반응시켜 본 발명에 따른 비펩타이드성 중합체-인슐린 다량체를 제조할 수 있는데, 상기 비펩타이드성 중합체-인슐린 결합체의 제조는 예컨대, 말단에 알데히드, 말레이미드 및 석시니미드 유도체 중에서 선택되는 반응기를 갖는 비펩타이드성 중합체를 인슐린과 공유결합으로 연결하고, 반응 혼합물로부터 비펩타이드성 중합체-인슐린 결합체를 분리하는 단계를 통하여 제조할 수 있다.
이때, 상기 비펩타이드성 중합체의 반응기 중 상기 석시니미드 유도체는 석시니미딜 프로피오네이트, 히드록시 석시니미딜, 석시니미딜 카르복시메틸 또는 석시니미딜 카보네이트일 수 있다.
상기 코발트 이온의 몰비는 비펩타이드성 중합체-인슐린 결합체 대비 0.1 내지 1일 수 있다.
상기 용액은 용액 내 코발트 이온을 함유하고 있으면 제한 없이 사용가능하며, 바람직하게 상기 용액은 수용액 용해시 코발트 2가 이온을 해리하는 염, 이의 수화물(hydrate), 수용액 용해시 코발트 2가 이온을 해리하는 염 및 산화제, 수용액 용해시 코발트 2가 이온을 해리하는 염의 수화물 및 산화제 또는 수용액 용해시 코발트 3가 이온을 해리하는 염 또는 이의 수화물을 포함할 수 있으며, 보다 바람직하게는 수용액 용해시 코발트 2가 이온을 해리하는 염 및 산화제, 수용액 용해시 코발트 2가 이온을 해리하는 염의 수화물 및 산화제, 또는 수용액 용해시 코발트 3가 이온을 해리하는 염 또는 이의 수화물을 포함할 수 있다.
상기 코발트 2가 이온을 해리하는 염은 염화코발트(Ⅱ)(CoCl2) 일 수 있고, 코발트 3가 이온을 해리하는 염은 염화코발트(Ⅲ)(CoCl3) 일 수 있다.
또한, 본 발명에서 사용가능한 산화제는 과산화수소 등과 같이 수용액 상의 코발트 2가 이온 및 비펩타이드성 중합체-인슐린 다량체 내에 결합된 코발트 2가 이온을 코발트 3가 이온으로 전환하는 산화력을 지닌 물질을 포함한다. 바람직하게, 상기 산화제의 몰비는 코발트 2가 이온 대비 0.5 내지 5일 수 있다.
바람직하게, 상기 반응은 pH 5 내지 9의 완충액 내에서 수행될 수 있으며, 보다 바람직하게는 pH 7.5 내지 8.5의 완충액 내에서 수행될 수 있다.
또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 본 발명의 비펩타이드성 중합체-인슐린 다량체를 유효성분으로 포함하는 당뇨병의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공한다.
또한, 또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 본 발명의 약제학적 조성물을 당뇨병이 발병한 또는 발병 가능성이 있는 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 당뇨병의 예방 또는 치료방법을 제공한다.
본 발명에서 용어, "당뇨병(Diabetes)"은 인슐린의 분비량이 부족하거나 정상적인 기능이 이루어지지 않는 등의 대사질환(metabolic disease)을 의미한다. 본 발명의 조성물을 개체에 투여함으로써 혈당을 조절하여 당뇨병을 치료할 수 있다.
본 발명에서 용어, "예방"이란 상기 조성물의 투여에 의해 당뇨병에 의한 증상을 억제시키거나 발병을 지연시키는 모든 행위를 의미하며, "치료"란 상기 조성물의 투여에 의해 당뇨병에 의한 증세가 호전되거나 이롭게 변경하는 모든 행위를 의미한다. 상기 당뇨병의 치료는 당뇨병이 발생할 수 있는 임의의 포유 동물에 적용이 가능하며, 그 예로 인간 및 영장류뿐만 아니라, 소, 돼지, 양, 말, 개 및 고양이 등 가축을 제한없이 포함하나, 바람직하게는 인간일 수 있다.
본 발명에서 용어, "투여"는 어떠한 적절한 방법으로 환자에게 소정의 물질을 도입하는 것을 의미하며, 상기 비펩타이드성 중합체-인슐린 다량체의 투여 경로는 약물이 목적 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여 투여될 수 있다. 복강 내 투여, 정맥 내 투여, 근육 내 투여, 피하 투여, 피 내 투여, 경구 투여, 국소 투여, 비 내 투여, 폐 내 투여 및 직장 내 투여 등이 될 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 그러나, 경구 투여시, 펩타이드는 소화가 되기 때문에 경구용 조성물은 활성 약제를 코팅하거나 위에서의 분해로부터 보호되도록 제형화 하는 것이 바람직하다. 바람직하게는 주사제 형태로 투여될 수 있다. 또한, 약제학적 조성물은 활성 물질이 표적 세포로 이동할 수 있는 임의의 장치에 의해 투여될 수 있다.
본 발명의 비펩타이드성 중합체-인슐린 다량체는 저농도 범위에서도 단량체로 분리되지 않고 유지되기 때문에 약제학적 조성물로서 우수한 저장성을 가지고 있다(도 4). 따라서, 본 발명의 약제학적 조성물은 0.01 μM 내지 100 μM, 바람직하게는 0.1 μM 내지 100 μM, 보다 바람직하게는 1 μM 내지 100 μM, 보다 더 바람직하게는 10 μM 내지 100 μM 농도의 본 발명에 따른 비펩타이드성 중합체-인슐린 다량체를 포함할 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함할 수 있다. 약제학적으로 허용되는 담체는 경구투여시에는 결합제, 활택제, 붕해제, 부형제, 가용화제, 분산제, 안정화제, 현탁화제, 색소 및 향료 등을 사용할 수 있으며, 주사제의 경우에는 완충제, 보존제, 무통화제, 가용화제, 등장화제 및 안정화제 등을 혼합하여 사용할 수 있으며, 국소투여용의 경우에는 기제, 부형제, 윤활제 및 보존제 등을 사용할 수 있다. 본 발명의 약제학적 조성물의 제형은 상술한 바와 같은 약제학적으로 허용되는 담체와 혼합하여 다양하게 제조될 수 있다. 예를 들어, 경구 투여시에는 정제, 트로키, 캡슐, 엘릭서, 서스펜션, 시럽 및 웨이퍼 등의 형태로 제조할 수 있으며, 주사제의 경우에는 단위 투약 앰플 또는 다수회 투약 형태로 제조할 수 있다. 기타, 용액, 현탁액, 정제, 환약, 캡슐 및 서방형 제제 등으로 제형화할 수 있다.
한편, 제제화에 적합한 담체, 부형제 및 희석제의 예로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 또는 광물유 등이 사용될 수 있다. 또한, 충진제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료 및 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다.
상기 본 발명의 조성물은 약제학적으로 유효한 양으로 투여한다.
본 발명에서 용어, "약제학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 개체 종류 및 중증도, 연령, 성별, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다.
본 발명에 따른 비펩타이드성 중합체-인슐린 다량체는 비펩타이드성 중합체-인슐린 결합체 및 인슐린 다량체에 비해 생체 지속성 및 안정성이 현저히 우수하므로 당뇨병의 예방 및 치료에 유용한바, 이를 포함하는 약제학적 조성물을 투여함으로써 상기 질환의 예방 및 치료를 도모할 수 있다.
또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 비펩타이드성 중합체와 인슐린이 공유결합으로 연결된 비펩타이드성 중합체-인슐린 결합체; 및 코발트 이온을 함유하는 용액을 포함하되, 상기 용액은 수용액 용해시 코발트 2가 이온을 해리하는 염 및 산화제; 수용액 용해시 코발트 2가 이온을 해리하는 염의 수화물 및 산화제; 또는 수용액 용해시 코발트 3가 이온을 해리하는 염 또는 이의 수화물을 포함하는 것인 본 발명에 따른 비펩타이드성 중합체-인슐린 다량체 제조용 키트를 제공한다.
본 발명의 키트는 상기 염 또는 이의 수화물과 산화제가 동일한 용기 또는 각각 별도의 용기에 보관된 본 발명의 비펩타이드성 중합체-인슐린 다량체 제조용 키트의 형태일 수 있다.
또한, 본 발명의 키트는 최적의 반응 수행 조건 등을 기재한 사용설명서, 약제학적으로 허용가능한 담체를 추가로 포함할 수 있다. 사용설명서는 팜플렛 또는 전단지 형태의 안내 책자, 키트에 부착된 라벨, 및 키트를 포함하는 패키지의 표면상에 설명을 포함한다. 또한, 안내서는 인터넷과 같이 전기 매체를 통해 공개되거나 제공되는 정보를 포함할 수 있다.
본 발명의 비펩타이드성 중합체-인슐린 다량체는 비펩타이드성 중합체-인슐린 결합체 및 인슐린 다량체에 비해 현저히 큰 수력학적 용적과 안정성을 지니는 이점이 있다. 따라서, 본 발명의 다량체는 피하주사 후 자연 희석에 의해 단량체로 분리되기 전까지는 큰 용적으로 인해 혈중으로의 빠른 흡수가 일어나지 않아 약물의 1회 다량투여가 가능하며, 단량체로 서서히 분리되는 성질을 보이므로 지속형 인슐린 제형 개발에 유용하다.
도 1 (A)는, 양이온 교환 크로마토그래피를 통해 B 체인의 아미노 말단에 PEG(5k)가 결합된 인슐린을 분리하는 크로마토그램 결과이며, (B)는 양이온 교환 크로마토그래피를 통해 B 체인의 아미노 말단에 PEG(20k)가 결합된 인슐린을 분리하는 크로마토그램 결과이다.
도 2는, Glu-C 펩타이드 맵핑에 의한 천연형 인간 인슐린 단편의 크로마토그램 (위)과 PEG-인슐린 결합체의 크로마토그램 (아래)을 비교함으로써 PEG의 부착 위치를 확인한 결과이다.
도 3은, 크기 배제 크로마토그래피를 이용하여 PEG-인슐린 결합체, 코발트 PEG-인슐린 육합체 등의 수력학적 용적을 표준 단백질(여섯 개의 흰 원, 왼쪽 상단에서부터 차례로 아프로티닌, 6.5 kDa; 리보뉴클리아제, 13.7 kDa; 콘알부민, 75 kDa; 이뮤노글로블린 G, 150 kDa; 페리틴, 443 kDa; 사이로글로블린, 669 kDa)의 용출 시간으로 형성된 회귀선에 피팅하여 대략적으로 측정한 결과이다.
도 4는 정제된 코발트 PEG (5K)-인슐린 육합체(▲), 코발트 PEG (20k)-인슐린 육합체(■), 코발트 인슐린 육합체(●)가 DPBS 희석에 의해 단량체로 분해되는 정도를 크기 배제 크로마토그램으로 평가한 결과이다.
하기 실시예에 의하여 본 발명을 보다 상세하게 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐 본 발명의 범위가 이들로 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. PEG-인슐린 결합체 합성과 분리
5k 또는 20k의 분자량을 갖는 mPEG-aldehyde(monomethoxypolyethylene glycol-aldehyde)를 천연형 인간 인슐린의 B 체인의 아미노 말단에 결합하기 위하여 인슐린과 mPEG-aldehyde의 몰비를 1 : 2, 인슐린 농도를 2 mg/㎖로 하여 4℃에서 12시간 동안 반응하였다. 이때, 반응은 pH 6.0인 100 mM 농도의 시트르산 나트륨(sodium citrate) 완충액 내에서 이루어졌으며, 환원제인 20 mM SCB(sodium cyanoborohydride)를 첨가하였다. HR 컬럼 (GE Healthcare)에 충진된 SOURCE 15S (GE Healthcare) 레진을 이용하여 위 반응액으로부터 인슐린 B 체인의 아미노 말단에 단일 페길화 (mono-PEGylated)된 인슐린을 분리하였다. 도 1에 나타난 바와 같이, PEG(5k 또는 20k)-인슐린 결합체는 메인 피크에서 발견되었다 (도 1).
컬럼(Column): Source 15S medium packed in HR column(GE Healthcare)
유속 : 1.8 ㎖/min
구배 : A 0 → 50% 100분 B (A: 20 mM 시트르산 나트륨(sodium citrate) pH 3.0 + 60% 에탄올(ethanol), B: A + 0.5M KCl)
실시예 2. PEG-인슐린 결합체의 펩타이드 맵핑
PEG-인슐린 결합체 또는 천연형 인간 인슐린을 Glu-C(Roche Applied Science)로 절단하였다. 반응조건은 20 mM HEPES pH 8.2 완충액에서 25℃의 온도로 12시간 동안 진행하였다. 반응물 분석은 역상 고효율액상크로마토그래피(Reversed phase high performance liquid chromatography) 방법을 사용하였다. Jupiter 5 micron C18 컬럼(Phenomenex, Inc.)을 Agilent 1200 Series 모듈에서 구동하였다. 도 2에 나타난 바와 같이, 대부분의 PEG가 인슐린 B 체인의 아미노 말단에 결합하고 있음을 확인하였다 (도 2).
컬럼(Column): Jupiter 5 micron C18(Phenomenex, Inc.)
유속 : 1 ㎖/min
구배 : A 10 → 30% 65분 B, A 30 → 40% 5분 B (A: 20 mM 황산나트륨(sodium sulfate) pH 2.0, B: A + 100% 아세토나이트릴(acetonitrile))
실시예 3. In vitro 효력 시험
Murine 3T3-L1 섬유아세포를 지방세포로 분화시키기 위하여 dexamethasone, IBMX, 인슐린이 포함된 10% FBS/DMEM 배지에서 웰 당 1.0X105 세포 밀도로 48-웰 플레이트에 접종하였다. 분화된 세포를 DPBS로 세 번 씻은 후 무혈청 DMEM으로 4시간 동안 배양하였다. 당이 함유된 DMEM에 천연형 인간 인슐린, PEG(5k)-인슐린 및 PEG(20k)-인슐린을 적정 농도 범위로 준비한 후 분화된 지방세포가 담긴 48-웰 플레이트에 각각 투여하였다. 37℃에서 24시간 동안 배양한 후 배지에 잔류하는 당의 농도를 D-Glucose assay kit(Megazyme)를 이용하여 측정하고, EC50값을 계산하여 표 1에 나타내었다.
단백질 EC50 (nM) 상대 활성 (%)
천연형 인간 인슐린 5.69±1.13 100
PEG (5k)-인슐린 9.48±2.77 60
PEG (20k)-인슐린 13.55±0.71 42
이러한 결과는 PEG-인슐린이 인슐린으로서의 활성을 가지고 있음을 나타내는 것이다.
실시예 4. 코발트 PEG-인슐린 육합체 제조 및 정제
20 mM HEPES pH 8.2 완충액 내의 PEG-인슐린 결합체 용액에 육합체 한 분자 당 3배수의 코발트 비율이 형성되도록 염화코발트 용액을 섞어 주었다. 코발트 2가 이온을 코발트 3가로 전환시키기 위하여 전체 코발트 2가 이온의 2배수에 해당하는 과산화수소를 첨가한 후 2시간 동안 실온에 방치하였다. 이후, 크기 배제 크로마토그래피(size exclusion chromatography)를 이용하여 코발트 PEG-인슐린 육합체를 분리하였다.
컬럼(Column): Superdex 200 16/60 prep grade(GE Healthcare)
유속 : 0.4 ㎖/min
완충액 : 20 mM HEPES pH 8.2 + 0.2 M NaCl
실시예 5. 코발트 PEG -인슐린 육합체의 수력학적 용적 ( hydrodynamic volume) 측정
PEG-인슐린 결합체 또는 코발트 PEG-인슐린 육합체의 수력학적 용적 측정은 실시예 4에 명시된 조건에 따라 수행하였다. 단, 컬럼은 Superdex 200 10/300 GL을 사용하였다. 회귀선(regression line)을 표준 단백질의 용출 부피로 계산하였다. 분리계수(partition coefficient, Kav)는 다음과 같이 정의된다.
Kav=(Ve-V0)/(Vt-V0)
Ve는 물질의 용출 부피(elution volume), V0은 Blue dextran으로 측정된 공 부피(void volume), Vt는 컬럼의 총 부피(bed volume)이다.
그 결과, 도 3에 나타난 바와 같이, 코발트 PEG(5k)-인슐린 육합체(300 kDa)는 단량체(60 kDa)에 비해 수력학적 용적이 약 5배 증가하였으며, 코발트 PEG (20k)-인슐린 육합체(1,600 kDa)는 단량체에 비해 약 10배 증가하였음을 확인할 수 있었다(도 3).
이러한 결과는 단량체에 비하여 코발트 PEG-인슐린 다량체가 현저히 큰 수력학적 용적을 지녀, 신장에서 제거 임계값(clearance threshold)을 낮추어 생체 지속성을 높일 수 있음을 나타내는 것이다.
실시예 6. 희석에 의한 코발트 PEG -인슐린 육합체의 분리 측정
100 μM 농도의 정제된 코발트 PEG-인슐린 육합체 및 코발트 인슐린 육합체를 DPBS로 각각 1 μM, 0.1 μM, 0.04 μM 까지 희석하였다. 실온에서 16시간 방치한 후 원심형 농축기(Vivaspin 20, Sartorius)를 이용하여 0.3 mM까지 농축한 후 실시예 5에 명시된 조건에 따라 분석을 실시하였다. 육합체와 단량체의 비율을 피크 면적으로부터 환산하였다. 그 결과, 도 4에 나타난 바와 같이, 코발트 인슐린 육합체(검은색 원)는 농도가 옅어 질수록 단량체로의 분리가 급속히 진행되어 0.04 μM 농도에서 육합체 비율이 20%로 낮아졌으나, 코발트 PEG (5k)-인슐린 육합체(검은색 세모) 및 코발트 PEG (20k)-인슐린 육합체(검은색 네모)는 같은 농도에서 육합체 비율이 70% 이상으로 유지되고 있음을 확인할 수 있었다(도 4).
이러한 결과는 코발트 PEG-인슐린 육합체가 코발트-인슐린 육합체에 비해 낮은 농도에서도 육합체를 형성하며 안정적으로 존재하고 단량체로 서서히 분리되는 성질을 보이므로, 지속형 인슐린 육합체 제형 개발에 유용하게 사용될 수 있음을 나타내는 것이다.
실시예 7. 크기 배제 크로마토그래피를 이용한 상용 지속형 인슐린과 코발트 PEG-인슐린 육합체의 분자 크기 비교
크기 배제 크로마토그래피를 사용하여 피하에 주사된 인슐린 제제의 분자크기 및 자연 희석에 따른 크기 변화를 간접적으로 예측할 수 있다(Havelund et al., 2004). 대표적인 상용 지속형 인슐린인 레버머(Levemir)와 란투스(Lantus)를 대조군으로 하여, 코발트 PEG-인슐린 육합체의 상대적 분자 크기를 비교하였다. 이를 위하여, 실시예 4에 명기된 조건 하에 크로마토그래피를 시행하였다. 단, 피하와 유사한 환경을 조성하기 위해 완충액은 DPBS를 사용하였다.
그 결과, 표 2에 나타난 바와 같이, 코발트 PEG-인슐린 육합체는 레버머와 란투스에 비해 짧은 용출 시간 및 낮은 분리계수를 보였다. 이러한 결과를 통하여 코발트 PEG-인슐린 육합체는 상기 두 지속형 인슐린에 비해 피하 주사 후 큰 용적 및 안정한 육합체 결합을 유지할 것이라 예측할 수 있었다(표 2).
단백질 용출시간 (min) 분리계수(Kav)
레버머 47.56 0.69
란투스 46.82 0.67
코발트 PEG (5k)-인슐린 육합체 27.63 0.20
코발트 PEG (20k)-인슐린 육합체 20.12 0.01
<110> Hanmi Science Co., Ltd <120> Non-Peptidyl Polymer-Insulin Multimer and Method for Producing the Same <130> PA120509KR <150> KR10-2011-0053487 <151> 2011-06-02 <160> 2 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> A chain of insulin <400> 1 Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu 1 5 10 15 Glu Asn Tyr Cys Asn 20 <210> 2 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> B chain of insulin <400> 2 Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr 1 5 10 15 Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr 20 25 30

Claims (20)

  1. 비펩타이드성 중합체와 인슐린이 공유결합으로 연결된 2개 이상의 비펩타이드성 중합체-인슐린 결합체가 코발트 이온에 의해 결합되어 다량체를 형성한, 비펩타이드성 중합체-인슐린 다량체.
  2. 제1항에 있어서, 상기 비펩타이드성 중합체-인슐린 결합체는 인슐린의 A 체인 아미노 말단, B 체인 아미노 말단 또는 B 체인 29번 라이신과 비펩타이드성 중합체가 공유결합으로 연결된 것인 다량체.
  3. 제1항에 있어서, 상기 인슐린은 천연형 인슐린, 천연형 인슐린에서 일부 아미노산이 치환(substitution), 추가(addition), 제거(deletion) 및 수식(modification) 중에 어느 하나의 방법 또는 이들 방법의 조합을 통해 제조된 변이체, 인슐린의 유도체 또는 이들의 단편인 것인 다량체.
  4. 제1항에 있어서, 상기 비펩타이드성 중합체는 생분해성 고분자, 지질 중합체, 키틴류, 히아루론산 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된 것인 다량체.
  5. 제4항에 있어서, 상기 생분해성 고분자는 폴리에틸렌 글리콜, 폴리프로필렌 글리콜, 에틸렌 글리콜과 프로필렌 글리콜의 공중합체, 폴리옥시 에틸화 폴리올, 폴리비닐 알콜, 폴리사카라이드, 덱스트란, 폴리비닐 에틸 에테르, 폴리락트산 및 폴리락틱-글리콜산으로 이루어진 군에서 선택된 것인 다량체.
  6. 제5항에 있어서, 상기 생분해성 고분자는 폴리에틸렌 글리콜인 것인 다량체.
  7. 제1항에 있어서, 인슐린과 공유결합하는 비펩타이드성 중합체의 반응기가 알데히드 그룹, 프로피온 알데히드 그룹, 부틸 알데히드 그룹, 말레이미드 그룹 및 석시니미드 유도체로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 다량체.
  8. 제1항에 있어서, 상기 비펩타이드성 중합체-인슐린 결합체들은 3가의 양이온을 띤 코발트 이온에 의해 다량체를 형성한 것인 다량체.
  9. 제1항에 있어서, 상기 비펩타이드성 중합체-인슐린 다량체는 비펩타이드성 중합체-인슐린 육량체인 것인 다량체.
  10. 비펩타이드성 중합체-인슐린 결합체들을 코발트 이온을 함유하는 용액과 반응시켜 비펩타이드성 중합체-인슐린 다량체를 생성하는 단계를 포함하는, 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 기재된 비펩타이드성 중합체-인슐린 다량체의 제조방법.
  11. 제10항에 있어서, 상기 용액은 수용액 용해시 코발트 2가 이온을 해리하는 염 및 산화제; 수용액 용해시 코발트 2가 이온을 해리하는 염의 수화물 및 산화제; 또는 수용액 용해시 코발트 3가 이온을 해리하는 염 또는 이의 수화물을 포함하는 것인 방법.
  12. 제11항에 있어서, 상기 코발트 2가 이온을 해리하는 염은 염화코발트(Ⅱ)이고, 코발트 3가 이온을 해리하는 염은 염화코발트(Ⅲ)인 것인 방법.
  13. 제11항에 있어서, 상기 산화제의 몰비는 코발트 2가 이온 대비 0.5 내지 5인 것인 방법.
  14. 제10항에 있어서, 상기 코발트 이온의 몰비가 비펩타이드성 중합체-인슐린 결합체 대비 0.1 내지 1인 것인 방법.
  15. 제10항에 있어서, 상기 반응이 pH 5 내지 9의 완충액 내에서 수행되는 것인 방법.
  16. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항의 비펩타이드성 중합체-인슐린 다량체를 유효성분으로 포함하는 당뇨병의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.
  17. 제16항에 있어서, 상기 비펩타이드성 중합체-인슐린 다량체는 0.01 μM 내지 100 μM로 포함된 것인 조성물.
  18. 제16항의 약제학적 조성물을 당뇨병이 발병한 또는 발병 가능성이 있는 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 인간을 제외한 동물의 당뇨병의 예방 또는 치료방법.
  19. 비펩타이드성 중합체와 인슐린이 공유결합으로 연결된 비펩타이드성 중합체-인슐린 결합체; 및 코발트 이온을 함유하는 용액을 포함하되, 상기 용액은 수용액 용해시 코발트 2가 이온을 해리하는 염 및 산화제; 수용액 용해시 코발트 2가 이온을 해리하는 염의 수화물 및 산화제; 또는 수용액 용해시 코발트 3가 이온을 해리하는 염 또는 이의 수화물을 포함하는 것인, 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 기재된 비펩타이드성 중합체-인슐린 다량체 제조용 키트.
  20. 제19항에 있어서, 상기 염 또는 이의 수화물과 산화제는 각각 별도의 용기에 보관된 것인 키트.
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